JP2004525712A - 高分子量物質の送出のための方法および装置 - Google Patents

Abstract

皮内空間に対する高分子量タンパク質の投与のための方法および装置。

Description

【技術分野】
【０００１】
本発明は皮内空間中への高分子量のタンパク質の投与のための方法および装置を構成する。
【背景技術】
【０００２】
診断剤および薬物のような薬剤物質を効率的かつ安全に投与することの重要性は、長い間にわたって認識されてきた。全ての薬剤物質に関する重要な考慮対象であるにもかかわらず、最近では、バイオテクノロジー産業から発生するタンパク質のような高分子の適切な生物学的利用率を得ることが、効率的かつ再現性のある吸収を得るためのこの必要性を強調してきている（非特許文献１参照）。慣用の針の使用が、皮膚を通した投与によるヒトおよび動物に対する薬剤物質の送出のための１つのアプローチを長く提供してきた。慣用の針を用いる際の注入の容易さを向上させ、かつ患者の不安および／または痛みを減少させると同時に、皮膚を通した再現性が高くかつ有効である送出を達成するために相当な努力がなされてきた。さらに、特定の送出システムは針を完全に排除し、皮膚の最外層である角質層を突破して皮膚の表面を通して物質を送出するために、化学的伝達物質、あるいはイオン導入電流または電気穿孔法または熱的穿孔法(thermal poration)またはソノフォレシスのような外因性の駆動力に依存する。しかし、そのような送出システムは、高い再現性を持って、皮膚の障壁を突破することも、薬剤物質を皮膚表面から所与の深さまで送出することもしないので、臨床結果は変動性である恐れがある。そのように、針を用いることなどによる角質層の機械的突破が、皮膚の表面を通した物質の投与の最も再現性の高い方法を与え、投与される物質の位置の制御および信頼性を提供すると信じられている。
【０００３】
皮膚の表面の直下に物質を送出するためのアプローチは、ほぼ独占的に、経皮投与、すなわち皮膚を通した皮膚の直下への物質の送出を伴う。経皮送出は、皮下、筋肉内または静脈内のルートを含み、そして筋肉内（ＩＭ）注射および皮下（ＳＣ）注射が最も一般的に用いられてきている。
【０００４】
解剖学的には、肉体の外側表面は２つの主要な組織層、外側の表皮およびその下にある真皮から形成され、それらは一緒になって皮膚を構成する（総説については、非特許文献２参照）。表皮は、７５μｍと１５０μｍの間の総厚さを有する５つの層または層へとさらに分割することができる。表皮の直下には真皮が存在し、それは２つの層、乳頭層と呼ばれる最外層と、網状層と呼ばれるより深い層を含む。乳頭層は、膨大な微小循環の血液およびリンパ管叢を包含する。対照的に、網状層は、比較的に無細胞および無血管であり、密度の高い膠原性および弾性の結合組織から形成されている。表皮および真皮の直下は、下皮とも呼ばれる皮下組織であり、それらは結合組織および脂肪組織で構成される。皮下組織の直下に、筋肉組織がある。
【０００５】
前述のように、薬剤物質の投与のための部位として、皮下組織および筋肉組織の両方が一般的に用いられてきている。しかし、真皮は、物質の投与のための部位として標的とされることは稀であり、およびこれは、少なくとも部分的には、皮内空間中への正確な針の配置の困難性に起因する可能性がある。さらに、真皮、特に乳頭層が高度の血管分布を有することが知られているにもかかわらず、投与される物質の向上した吸収プロフィルを得るためにこの高度の血管分布の利点を活用できることが理解されていなかった。これは、真皮を標的とするよりも遥かに容易かつ予想可能に標的とされてきた皮下組織に対する投与の後、小さい薬剤分子が概して速やかに吸収されるためである。一方、タンパク質のような大きな分子は、血管分布の程度にかかわらず、概して毛細血管上皮を通して良好には吸収されないので、大きな分子に関してさえも、より実施するのが困難な皮内投与によって、皮下投与を上回る著しい吸収の利点を実現できるとは予期されていなかった。
【０００６】
皮膚の表面の直下で皮内空間の領域内への投与に対する１つのアプローチは、マントー・ツベルクリン試験において慣行的に用いられてきている。この手順においては、２７または３０ゲージの針を用い、皮膚表面に対して浅い角度にて、精製したタンパク質誘導体を注射する（非特許文献３参照）。しかしながら、注射の位置の不確実性の程度は、いくらかの偽陰性の試験結果をもたらす可能性がある。さらに、その試験は注射部位における応答を引き出すための局所的注射を伴い、マントーのアプローチは、物質の全身的投与に関する皮内注射の使用を導くものではなかった。
【０００７】
いくつかのグループが、「皮内」注射と特徴づけられたものによる全身的投与を報告している。そのような報告の１つにおいて、皮下注射と「皮内」注射と記載されているものとの比較研究が実施された（非特許文献４参照）。試験された薬剤物質は、約３６００の分子量を有するタンパク質であるカルシトニンであった。薬剤は皮内に注射されると明言してはいるが、その注射は基部に対して６０゜の角度で押し付けられる４ｍｍの針を用いた。これは約３．５ｍｍの深さに、および血管化された乳頭層中というよりは、網状層の下部中または皮下組織中への注射物の配置をもたらすであろう。実際、このグループが皮下組織中ではなく網状層の下部中に注射をしたならば、物質は、比較的により血管の少ない網状層においてゆっくりと吸収されるか、あるいは皮下領域中へと拡散して、皮下投与および吸収と機能的には同一であるものをもたらすかのいずれかであろうと予測される。そのような実際のまたは機能的な皮下投与は、最大血漿濃度に到達した時点において、皮下投与と皮内投与と説明されている投与との間の差異の欠落、すなわちそれぞれの評価時間における濃度およびその曲線下の面積を説明するであろう。
【０００８】
同様に、Bressolleらは、４ｍｍの針を用いる「皮内注射」と特徴づけられたものにおいて、ナトリウムセフタジダイムを投与した（非特許文献５参照）。これは、実際のまたは機能的な皮下注射を生じさせる皮膚の下４ｍｍの深さに対する注射をもたらしたであろう。この例においては良好な皮下吸収が予想されているが、それはナトリウムセフタジダイムが親水性でかつ比較的低い分子量を有するからである。
【０００９】
もう１つのグループが皮内薬剤送出装置として記載されるものを報告した（特許文献１参照）。注射は低速においてであると示され、および注射部位は、表皮の下のある領域、すなわち、表皮および真皮の間の界面または真皮もしくは皮下組織の内部であると示されている。しかし、この文献は、真皮に対する選択的投与を示唆する教示を与えていないし、そのような選択的投与からもたらされるであろう可能性のある薬物動態学上の利点も何ら示唆していない。
【００１０】
現在までのところ、多くの治療効果のあるタンパク質および低分子量の化合物が皮内に投与されてきており、かつ薬物動態学的に有益な応答を有効に引き出すために用いられてきている。大抵のこれまでの化合物（たとえば、インスリン、ニューポゲン(Neupogen)、ｈＧＨ、カルシトニン）はホルモン性タンパク質であり、人工の受容体または抗体ではなかった。現在までのところ、全ての投与されるタンパク質は、（ＳＣに比べて）より迅速な吸収および分配の開始およびいくつかの場合における増大した生物学的利用率を含むＩＤ投与に関連するいくつかの効果を示してきた。皮内に投与される際に高分子量物質（たとえば、＞４０ｋＤ）の挙動に関しては、ほとんどまたは全く情報が知られていない。
【００１１】
【特許文献１】
米国特許第５，９９７，５０１号明細書
【特許文献２】
米国特許出願第０９／５９０，６０２号明細書（２０００年６月８日出願）
【特許文献３】
米国特許出願第０９／６１７，３５５号明細書（２０００年６月１７日出願）
【非特許文献１】
Cleland et al., Curr. Opin. Biotechnol. 12:212-219, 2001
【非特許文献２】
Physiology, Biochemistry, and Molecular Biology of the Skin, Second Edition, L.A. Goldsmith, Ed., Oxford University Press, New York, 1991
【非特許文献３】
Flynn et al., Chest 106:1463-5, 1994
【非特許文献４】
Autret et al., Therapie 46:5-8, 1991
【非特許文献５】
Bressolle et al., J. Pharm. Sci. 82:1175-1178, 1993
【非特許文献６】
Hwang et al., Ann Plastic Surg 46:327-331, 2001
【非特許文献７】
Southwood, Plast. Reconstr. Surg 15:423-429, 1955
【非特許文献８】
Rushmer et al., Science 154:343-348, 1966
【非特許文献９】
Arildsson et al., Microvascular Res. 59:122-123, 2000
【非特許文献１０】
Wilhem, Rev. Can. Biol. 30:153-172, 1971
【非特許文献１１】
Skobe et al., J. Investig. Dermatol. Symp. Proc. 5:14-19, 2000
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本開示は、真皮空間を直接的に標的とする新規の非経口投与方法に関し、それによって該方法は投与される物質の薬剤動態学的（ＰＫ）パラメータおよび薬力学（ＰＤ）パラメータを劇的に変化させる。以後真皮に到達する手段（または皮内空間を正確に標的とすることができる他の手段）と呼ぶ直接皮内（ＩＤ）投与の使用は、たとえばマイクロニードルに基づく注射および輸液システムを用いることにより、皮下および静脈内送出の伝統的非経口投与方法に比較して、薬剤および診断用物質、特に高分子量タンパク質を含む多くの物質の薬剤動態を変化させることができる。これらの知見は、微小装置に基づく注射手段のみならず、ＩＤ空間中への流体または粉体の無針すなわち針のない衝撃注射、マントー型ＩＤ注射、微小装置による強化型イオン浸透療法、および皮膚中への流体、固体または他の投薬形態の直接的付着（そのような送出手段を正確に制御して、薬剤投与物を皮内空間内に付着させることができる場合）も関係がある。開示されているものは、ＩＶ経路を必要とすることなしに、非経口投与される薬剤の吸収の速度を向上させる方法である。この送出方法の１つの重要な有益な効果は、より短いＴ_max（薬剤の最大血中濃度を実現するための時間）を提供することである。潜在的な付随する利点は、所与の単位投薬量におけるより高い最大濃度（Ｃ_max）、より高い生物学的利用率、より迅速な取り込み速度、薬剤動態または生物学的効果のより迅速な開始、および低減される薬剤蓄積効果を含む。本発明によれば、改善された薬剤動態学とは、薬物送出の皮下、筋肉または他の非ＩＶ非経口投与手段に比較して、向上した生物学的利用率、減少した遅延時間（Ｔ_lag）、減少したＴ_max、より迅速な取り込み速度、より迅速な開始および／または増大したＣ_maxを意味する。Ｔ_lagおよびＴ_maxの減少、ならびにより迅速な取り込み速度は、薬剤の治療活性のより早い開始を表し、一方、増大したＣ_maxおよび生物学的利用率は、より多くの薬剤が体循環中に存在することを表し、および一般的に治療効果の損失なしに投薬量の著しい減少の可能性を表す。
【００１３】
生物学的利用率とは、血液区画に到達した、与えられ離投薬の全量を意味する。これは、一般的に、時間に対する濃度のプロットの曲線下の面積として測定される。「遅延時間」とは、化合物の投与と測定可能または検出可能な血中濃度または血漿中濃度との間の遅延を意味する。Ｔ_maxは、化合物の最大血中濃度が達成されるための時間を表す値であり、およびＣ_maxは、所与の投薬量および投与方法を用いて到達される最大血中濃度である。開始のための時間は、Ｔ_lag、Ｔ_maxおよびＣ_maxの関数である。なぜなら、これらのパラメータ全てが生物学的効果を実現するために必要な血（または目的組織）中濃度を実現するために必要な時間に影響を与えるからである。Ｔ_maxおよびＣ_maxは、グラフで表される結果の視覚的検査によって測定することができ、および多くの場合、化合物の２つの投与方法を比較するために充分な情報を提供することができる。しかしながら、数値は、動態モデル（以下に記載する）を用いる分析および／または当業者に知られている他の手段によって、より正確に決定することができる。
【００１４】
本発明に教示されるように真皮空間を直接的に標的とすることは、薬剤および診断用物質の効果のより迅速な開始を提供する。本発明者らは、真皮の毛細血管および毛細リンパ管に選択的に到達する制御されたＩＤ投与により物質を迅速に吸収および全身に分配することが可能であり、それゆえ該物質はＳＣ投与よりも迅速にその有益な効果を発揮することができることを見出した。これは、血中グルコースを減少させるインスリン、癌の痛みを克服するためのような鎮痛剤、偏頭痛緩和剤、またはアドレナリンまたは解毒剤のような緊急救助用薬剤のような、迅速な開始を必要とする薬剤にとって格別な重要性を有する。また、天然のホルモン類は、迅速な開始噴出と引き続く迅速なクリアランスを伴い、脈動的に放出される。例は、生物学的刺激（たとえば高いグルコース濃度）に応答して放出されるインスリンを含む。別の例は女性生殖ホルモンであり、それは脈動的な時間間隔において放出される。ヒト成長ホルモンも、正常な患者内で、睡眠中に脈動的に放出される。この利点は、合成薬剤化合物によって自然な肉体のリズムを模倣することによって良好な治療を可能にする。同様に、インスリン送出による血中グルコース制御のようないくつかの現在の治療をより良好に促進させる可能性がある。「閉ループ」のインスリンポンプを調整する多くの現在の試みは、インスリンの投与と生物学的効果が発生するまでの待機との間の遅延期間によって妨害されている。これは、過剰調整および低血糖症の危険を冒すことなしに、充分なインスリンが与えられているかどうかを、実時間で確認することを困難にする。ＩＤ送出のより迅速なＰＫ／ＰＤは、この種の問題点の大部分を排除する。
【００１５】
前述のように、哺乳類の皮膚は、２つの層、具体的には表皮および真皮を含む。表皮は、角質層、淡明層、顆粒層、有棘層および胚芽層から作成され、および真皮は２つの層、上部の乳頭層および深部の網状層から作成される。真皮および表皮の厚さは、個人間で、および個人内の肉体の別個の部分において変化する。たとえば、個々の研究報告に依存して、表皮は厚さ約４０から約９０μｍまで変化し、および真皮は表皮の直下から肉体のある部位では約１ｍｍ未満の深さまで、肉体の他の部位では直下２から約４ｍｍまでの範囲内で厚さが変化すると報告されている（非特許文献６〜８参照）。
【００１６】
本明細書において用いられる際に、皮内とは、物質が血管豊富な乳頭層に到達し、そして毛細血管および／またはリンパ管に迅速に吸収されて全身で生物学的に利用可能になるような方法における物質の真皮中への投与を意味することを意図している。そのようなことは、真皮の上部部分（すなわち、乳頭層）中への物質の配置、または物質が乳頭層中へ容易に拡散するように、比較的血管の少ない網状層の上部部分中への物質の配置によって起こすことができる。少なくとも約０．３ｍｍ、より好ましくは少なくとも約０．４ｍｍおよび最も好ましくは少なくとも約０．５ｍｍの深さから、約２．５ｍｍ以下、より好ましくは約２．０ｍｍ以下および最も好ましくは１．７ｍｍ以下の深さまでにおいて物質を主として配置することが、高分子および／または疎水性物質の迅速な吸収をもたらすと信じられる。より大きな深さにおいて、および／または網状層のより低い部分中に物質を主として配置することは、より血管の少ない網状層または皮下領域（そのいずれもが高分子および／または疎水性物質の減少した吸収をもたらすであろう）において物質がゆっくりと吸収されることをもたらすと信じられる。乳頭層より下の網状層中であるが、真皮および皮下組織の界面よりも充分に高いこの皮内空間における物質の制御された送出は、（かく乱されていない）毛細血管および毛細リンパ管の層への物質の（外へ向かう）移動を可能にし、該毛細血管および毛細リンパ管の層においては、他の皮膚組織の区画による輸送において隔離されることなしにこれらの毛細管を経由して体循環へと物質を吸収することができる。
【００１７】
本発明の別の利点は、薬剤または診断剤のより迅速な全身への分配およびオフセットを達成することである。また、これは体内で脈動的に分泌される多くのホルモンに関連がある。多くの副作用が、投与される物質が連続的な循環レベルを有することに関連する。非常に適切な例は、血中に連続的に存在する際に逆効果（不妊症を起こす）を実際に有する女性生殖ホルモンである。
【００１８】
本発明の別の利点は、薬剤または診断剤のより高い生物学的利用率を実現することである。この効果は、高分子量物質、特にタンパク質のＩＤ投与において最も劇的である。直接的な利点は、向上した生物学的利用率を有するＩＤ投与が、より少ない活性剤を用いる都道時に、同等の生物学的効果を可能にすることである。これは、特に高価なタンパク質治療法および診断用の薬剤製造業者およびおそらく消費者に対して直接的な経済的効果をもたらす。同様に、より高い生物学的利用率は、総投薬量を減少させること、およびより高い投薬量に伴う患者の副作用を軽減することを可能にする。
【００１９】
本発明の別の利点は、薬剤および診断物質のより高い最大濃度の達成である。本発明者らは、より高い初期濃度をもたらすボーラス投与を用いて、ＩＤ投与された物質がより迅速に吸収されることを見出した。これは、その効能が最大濃度に関連する物質に関して最も有益である。より迅速な開始は、より少ない量の物質を用いてより高いＣ_maxに到達することを可能にする。したがって、投薬量を減少させて、経済的利点も生理学的利点（なぜなら、より少ない量の薬剤および診断剤を肉体が取り除く必要があるからである）も提供することができる。
【００２０】
本発明の別の利点は、薬剤または診断薬の全身的排泄速度または固有のクリアランス機構に変化がないことである。本出願人による現在までの全ての研究において、ＩＶまたはＳＣ投薬経路を用いて試験される物質における全身的排泄速度を維持した。これは、この投薬方法が全身的クリアランスの生物学的機構に変化をもたらさないことを表す。これは、法的観点から有利である。なぜなら、ＦＤＡの承認を提出する前に分解およびクリアランスの経路を再調査する必要がないからである。また、これは薬剤動態の観点からも有利である。なぜなら、投薬処方の予測可能性を与えるからである。いくつかの物質は、それらのクリアランス機構が濃度依存性である場合、より迅速に肉体から排出される。ＩＤ送出はより高いＣ_maxをもたらすので、内因性機構が変化しないままであるにもかかわらず、クリアランス速度は上昇するであろう。
【００２１】
本発明の別の利点は、薬力学的機構または生物学的応答機構の変化がないことである。前述のように、本出願人によって教示される方法によって投与された薬剤は、他の送出手段に固有のものと同一の生物学的経路によって、それらの効果を依然として発揮するからである。いかなる薬力学的変化も、出現の差分パターン、消失、および生物学系中に存在する薬剤および診断剤の濃度にのみ関連する。
【００２２】
本発明の方法を用いて、医薬化合物を、ボーラスとして、または輸液により投与してもよい。本明細書において用いられる際に、術語「ボーラス」とは、１０分未満の時間以内で送出される量を意味することを意図する。「輸液」とは、１０分を超える時間にわたる物質の送出を意味することを意図する。ボーラス投与または送出を速度制御手段（たとえばポンプ）を用いて実施することもできるし、あるいは具体的な速度制御手段を持たなくてもよい（たとえば使用者の自己注射）ことは理解される。
【００２３】
本発明の別の利点は、薬剤が皮下組織区画を通過し、全身的吸収の前に皮下組織区画中に捕捉された状態になる際に発動される物理的または動態的障壁の除去である。そのような障壁の除去は、種々の種類の薬剤に対する極度に広い適用可能性に通ずる。皮下的に投与される多くの薬剤は、この蓄積効果を示す。すなわち、脂肪組織に対する親和性または脂肪組織を通る低速な拡散に起因して、全身的吸収に先立つ律速段階として、薬剤が捕捉されているＳＣ空間からゆっくりと放出される。この蓄積効果は、ＩＤに比較してより低いＣ_maxおよびより長いＴ_maxをもたらし、および吸収の高い個人間変動性をもたらす恐れがある。また、この効果は、経皮送出方法（受動的パッチ技術（浸透を強化することを伴うまたは伴わない）、イオン浸透技術、ソノフォレシス、または角質の剥離または破壊方法を含む）に対する比較にも関連がある。経皮パッチ技術は、高度に非透過性である角質および表皮の障壁を通した薬剤の分配に依存する。高度に親油性である化合物を除くわずかな薬剤がこの障壁を突破することができ、そして、多くの場合、突破したものは、薬剤の組織飽和および捕捉に起因して、長期間にわたりオフセットされる動態を示す。多くの場合に受動的移動手段よりも速い能動的経皮手段は、依然として、電荷反発または他の電子的または静電的手段により移動させることができるか、あるいは音波の適用中の組織のキャビテーションにより発生する一時的孔隙を通して受動的に運搬される種類の化合物に限定される。角質および表皮は、依然として、この輸送を妨害する有効な手段を提供する。熱的またはレーザによるアブレーション、剥脱手段、または別の方法による角質の除去は、依然として、薬剤の浸透または取り込みを促進する推進力を欠いている。機械的手段による直接的ＩＤ投与は、皮膚の動態的障壁特性を克服し、かつ薬剤またはその配合添加物の薬学的または物理化学的特性によって限定されない。
【００２４】
本発明の別の利点は、高度に制御可能な投薬処方計画である。本出願人は、ＩＤ輸液研究が、この経路により送出される薬剤または診断剤の迅速に開始され、かつオフセットされる動態に起因して、高度に制御可能かつ予測可能である投薬プロフィルを示すことを確認した。これは、肉体への薬剤または診断薬の計量供給を調整する流体制御手段または別の制御システムとＩＤ送出を組み合わせる際に、所望される投薬処方計画にわたるほぼ完全な制御を可能にする。この単一の利点のみでも、多くの薬剤または診断剤の送出方法の主要な目標の１つである。前述に定義されるボーラスのＩＤ物質投与は、ＩＶ注射に最も類似した動態をもたらし、および鎮痛性化合物、食事時間のインスリン、救急薬剤、勃起不全化合物または迅速な開始を必要とする他の薬剤について最も望ましい。同様に、単独または相乗的に機能することができる組合せも含まれる。輸液によってＩＤ投与の持続時間を延長することは、より良好な予測可能性を除いて、ＳＣ取り込みパラメータを有効に模倣することができる。このプロフィルは、成長ホルモンまたは鎮痛剤のような物質について特に良好である。典型的にはより低い輸液速度におけるより長い持続時間の輸液は、抗凝固剤、基礎インスリンおよび慢性痛の治療に所望される継続的な低い基礎濃度の薬剤をもたらすことができる。これらの動態プロフィルを組み合わせて、所望されるほぼ全ての動態プロフィルを示すことができる。１つの例は、受胎誘導のための稔性ホルモン（ＬＨＲＨ）の脈動的送出であり、それは、パルス間の完全なクリアランスとともに、９０分毎の間欠的ピークを必要とする。他の例は、偏頭痛の緩和のための薬剤の迅速なピーク開始、それに引き続く痛みの予防のための低濃度である。
【００２５】
本発明の別の利点は、薬剤および診断剤の分解および／または望ましくない免疫活性の減少である。化学的増強剤を用いる経皮方法またはイオン浸透法または電気穿孔法もしくは熱的穿孔法は、高度な代謝的および免疫的活性を有する成長可能な表皮層を薬剤が通過することを必要とする。表皮における物質の代謝的変換または免疫グロブリンによる隔離は、吸収に利用可能な薬剤の量を減少させる。ＩＤ投与は、薬剤を直接的に真皮内に配置し、それによって表皮を完全に迂回することにより、この問題点を回避する。
【００２６】
本発明のさらなる利点は、高分子量物質が皮内的に送出される際に実現される。「高分子量物質」とは、４０ｋＤ以上の分子量を有する１つまたは複数の化合物を含む物質を意味する。そのような化合物は好ましくは４０ｋＤと３００ｋＤとの間の分子量を有するが、５００ｋＤ、１０００ｋＤまたはさらに２０００ｋＤ以上までの分子量を有してもよい。高分子量物質の投与に関する本発明の方法の利点は：
【００２７】
ａ） 患者に対する投薬量（薬剤の量）の減少；
ｂ） 同等数の投薬物を得るために必要とされる製造能力の減少；および
ｃ） 患者の集団を横断する、より予測可能な投薬
を含む。本発明の１つの方法に従ってそのような高分子量物質が投与される際に、投与された物質の皮内蓄積を形成できることが見出された。前述のように、蓄積の形成は多くの場合に望ましくない。しかし特定の場合においては、局所的治療、薬物動態学的制御または免疫学的治療のための利点を与える。「皮内蓄積」とは、直接ＩＶ経路、時間をかけてＳＣまたはＩＤ的に投与されるより希薄な溶液、または同一の経路で投与されるより低分子量の類似物により得られる速度と比較して減少した速度において、周囲の組織および血流またはリンパ系中へと放出される、真皮内部への投与された物質の局所的濃縮を意味する。そのような蓄積の形成は皮内空間において有用である。なぜなら、本発明のエンブレル(Enbrel)の場合に例示されるように、ＳＣ注射によって得られる血中濃度よりも高い血中濃度を数時間にわたって得られること、薬剤のの生物学的利用率または効能を高めることまたはその両方であるからである。ワクチンの場合においては、そのようなＩＤ蓄積の形成は、皮膚中のランゲルハンス細胞または他の樹枝状細胞によるワクチンの取り込みを向上させる可能性があり、かつ皮内空間中のリンパ管による抗原の直接的取り込みを向上させる可能性がある。そのような効果は、より速やかなセロコンバージョン、より高い抗体の力価、およびより強い細胞の免疫応答（細胞障害性Ｔ細胞、サイトカイン生成および細胞の増殖を含む）、加えて皮下投与に比較してこれらの効果のために必要な投薬量の低下をもたらす可能性がある。同様に、いくつかの局所的な真皮の医学的症状（皮膚癌、湿疹、乾癬、いぼ、あざのようなもの）の治療において、蓄積の形成は有用である。また、局所的な感染（真菌性、細菌性または別のもの）の治療にとって重要である可能性があり、および整形外科的外傷または神経ブロックにおいて必要とされるような、長期間にわたる局所的痛みの緩和に関して有効である可能性がある。また、蓄積の形成は、抗しわ剤の投与のような美容学的目的のための潜在的利点を有する。
【００２８】
本発明のこれらおよび他の目的は、乳頭層による吸収を直接的に標的とすること、および皮膚の真皮空間に対する薬剤、診断剤および他の物質の制御された送出によって実現される。皮内空間を特異的に標的とすることおよび送出の速度およびパターンを制御することによって、特定の薬剤によって示される薬剤動態を予測不可能なほど改善することができ、および多くの状況において変化させて臨床的利点をもたらすことができることを見出した。そのような薬剤動態は、ＩＶ経路を除く他の非経口投与経路によっては、容易に得ることも制御することもできない。
【００２９】
本発明は、ヒトまたは動物に対する薬剤、診断薬および他の物質のＩＤ送出の臨床的有用性を改善する。該方法は、真皮到達手段（たとえば小ゲージの針、特にマイクロニードル）を用い、皮内空間を直接的に標的とし、およびボーラスとしてまたは輸液により皮内空間に対して物質を送出する。真皮到達手段の真皮内部への配置が、活性物質の有効な送出および薬剤動態の制御を与えることを発見した。真皮到達手段は、皮膚からの物質の漏洩を防止し、皮内空間内部の吸着を向上させるように設計される。本発明の方法に従って送出されるホルモン薬剤の薬剤動態は、該薬剤の慣用のＳＣ送出の薬剤動態とは非常に異なることが見出され、本発明の方法によるＩＤ投与が改善された臨床結果を与えることを示す。真皮到達手段を皮内空間の適切な深さに配置し、かつ流体送出の体積および速度を制御する送出装置が、漏洩なしに所望の位置への物質の正確な送出を与える。
【００３０】
ＩＶ経路を必要とすることなしに、非傾向的に投与される薬剤の取り込みの速度を増大させる方法を開示する。この効果は、より短いＴ_maxを提供する。潜在的な付随する利点は、所与の単位投薬量におけるより高い最大濃度（Ｃ_max）、より高い生物学的利用率、薬力学または生物学的効果のより迅速な開始、および低減された薬剤蓄積効果を含む。
【００３１】
また、所望されるならば、皮内空間内部における真皮到達手段の適切な深さの制御により、本発明の方法によって送出されるホルモン薬剤の薬剤動態が、該薬剤の慣用のＳＣ送出の臨床結果と類似の臨床結果を生じさせることも見出された。
【００３２】
別個の化合物の薬剤動態学的プロフィルは、該化合物の化学的性質によって変化し得る。たとえば、比較的大きく、少なくとも１０００ダルトンの分子量を有する化合物は、少なくとも２０００ダルトン、少なくとも４０００ダルトン、少なくとも１０，０００ダルトン以上を有するより大きな化合物および／または疎水性化合物と同様に、筋肉注射、皮下または真皮下(subdermal)注射のような伝統的な非経口的投与方法に比較して、最も顕著な変化を示すことが期待される。概して、小さい親水性物質は、ＩＤ送出において、他の方法と比較して同様の動態を示すことが期待される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
本発明は、皮内空間を直接的に標的とすることによる、ヒトまたは動物の対象に対して薬剤または他の物質の送出による、治療処置のための方法を提供し、該方法においては薬剤または物質は、装置内部に組み込まれる１つまたは複数の真皮到達手段を通して皮内空間へと投与される。本発明の方法によって輸液される物質が、ＳＣ注射によって投与される同一の物質について観察されるものより優れており、かつ臨床的により望ましい薬剤動態を示すことを見出した。
【００３４】
本発明によるＩＤ投与に用いられる真皮到達手段は、対象の皮膚を皮内空間を通過することなく皮内空間内部の所望される目標とされる深さまで侵入する限りにおいて、決定的に重要ではない。大抵の場合、その装置は、皮膚に侵入し、約０．５〜２ｍｍの深さまで侵入する。真皮到達手段は、全ての知られている種類の慣用の注射針、カテーテルまたはマイクロニードルを含んでもよく、および、単数で用いてもよく、または多数のニードルアレイとして用いてもよい。真皮到達手段は、衝撃注射装置を含む無針装置を含んでもよい。本明細書中で用いられる術語「針」（単数または複数）は、全てのそのような針状構造を含むことを意図する。本明細書で用いられる術語マイクロニードルは、約３０ゲージ以下、典型的には約３１〜５０ゲージの構造を包含すること（そのような構造が事実上円筒形である場合）を意図する。したがって、術語マイクロニードルに包含される非円筒形状の構造は、同等の径を有し、および角錐、矩形、八辺形、楔形および他の幾何形状を含む。また、真皮到達手段は、皮膚に直接的に侵入して送出のための経路を提供するか、あるいは真皮空間内部の標的とされる位置に対して物質を直接的に送出する、衝撃流体注入装置、粉体ジェット送出装置、圧電的、電動的、電磁気的に補助される送出装置、ガスに補助される送出装置を含む。真皮到達手段による物質の送出の標的とされる深さを変化させることにより、所望される臨床用途に対して、薬剤または物質の薬剤動態学的および薬力学的（ＰＫ／ＰＤ）挙動を、個々の患者の症状に最も適切に適応させることが可能である。真皮到達手段による物質の送出の標的とされる深さは、所望される深さに到達した際に指示するための計器の補助を用いてまたは用いることなく、従事者により手動で制御してもよい。しかし、好ましくは、装置が、皮膚侵入を皮内空間内の所望される深さに制御するための構造的手段を有する。これは、最も典型的には、針が取り付けられる支持構造またはプラットホームの形態を採ってもよい、真皮到達手段のシャフトと関連づけられる広げられた区域またはハブを用いて達成される。真皮到達手段としてのマイクロニードルの長さは、製作プロセス中に容易に変化させることができ、および慣行的には２ｍｍ未満の長さで製造される。また、マイクロニードルは非常に鋭利であり、かつ非常に小さいゲージを有するので、注射または輸液中の痛みおよび他の感覚をさらに減少させる。本発明において、それらマイクロニードルを独立した単一内腔のマイクロニードルとして用いてもよいし、あるいは複数のマイクロニードルを直線配列または２次元配列に組立または製作して、送出の速度または所与の時間内に送出される物質の量を増大させてもよい。マイクロニードルは、侵入の深さを制限するのにも役に立つホルダーおよびハウジングのような種々の装置中に組み込まれてもよい。また、本発明の真皮到達手段は、送出に先立って物質を収容する容器、または薬剤もしくは他の物質を圧力下で送出するためのポンプまたは他の手段を包含してもよい。あるいはまた、真皮到達手段を収容する装置を、そのような付加的部品と外部的に接続してもよい。
【００３５】
毛細血管微小循環系またはリンパ微小循環系と密接に接触している真皮区画中に薬剤を投与することによって、ＩＶ様の薬剤動態が達成される。術語の微小毛細管(microcapillaries)または微小毛細管層は、真皮区域内部の毛細血管またはリンパ排液通路のいずれをも意味することは理解されるべきである。
【００３６】
作用のいかなる理論的機構にも束縛されることを意図するものではないが、真皮中への投与時に観測される迅速な吸収は、真皮内の血管およびリンパ管の豊富にある叢の結果として実現されると信じられる。しかし、真皮中の血管叢およびリンパ叢の存在は、それ自身としては、高分子の高められた吸収を生じさせるとは期待されない。これは、毛細管の内皮は、通常、タンパク質、多糖類、核酸ポリマー類、ＰＥＧ化されたタンパク質などのようなポリマーと結合した物質のような高分子に対して、低い透過性を有するかあるいは非透過性であるからである。そのような高分子は少なくとも１０００ダルトンの分子量を有するか、あるいは、少なくとも２０００ダルトン、少なくとも４０００ダルトン、少なくとも１０，０００ダルトンまたはさらに高いより大きな分子量を有する。さらに、同様に、間隙から血管区画への比較的遅いリンパ排液が、真皮中への薬剤物質の配置時に血漿中濃度の迅速な上昇を生じさせるとは期待されないであろう。
【００３７】
本明細書中に報告される予測されない向上した吸収の１つの可能性のある説明は、物質の注射時に、それら物質が容易に乳頭層に到達し、血流および毛細管透過性の増大をもたらすことである。たとえば、３ｍｍの深さへの刺針の挿入が血流の増加を生じさせることが知られており、そしてこれは痛みの刺激とは独立的であり、およびヒスタミンの組織放出に起因すると主張されている（非特許文献９参照）これは、皮膚の損傷に応答して引き起こされる激しい炎症応答が血流および毛細管透過性の一時的増大をもたらすという観察と一致する（非特許文献２の第１０６０頁、および非特許文献１０参照）。同時に、皮内層への注射は、間隙圧を増大させると予想される。（「通常範囲」を越える）約−７から＋２ｍｍＨｇの値の間隙圧の増大はリンパ管を拡張させ、そしてリンパ流を増大させることが知られている（非特許文献１１参照）。そのように、皮内層中への注射により誘導される増大した間隙圧が、増大したリンパ流および真皮内に注射された物質の吸収の増大を引き起こすものと信じられる。
【００３８】
「改善された薬剤動態」とは、たとえば、最大血漿中濃度までの時間（Ｔ_max）、最大血漿中濃度の大きさ（Ｃ_max）または最小限の検出可能な血中または血漿中濃度を引き起こすための時間（Ｔ_lag）のような標準的な薬剤動態学的パラメタによって測定されるように、薬剤動態学的プロフィルの強化が達成されることを意味する。強化された吸収プロフィルとは、そのような薬剤動態学的パラメタによって測定される際に吸収が向上またはより大きくなることを意味する。薬剤動態学的パラメタの測定および最小限の有効濃度の決定は、当該技術において慣行的に実施されている。得られる値は、たとえば皮下投与または筋肉内投与のような標準的経路の投与との比較によって、強化されているとみなされる。そのような比較において、必ずしも本質的ではないが、皮内層中への投与と、皮下投与のような規準部位中への投与が、同一の投薬レベル（すなわち、同一のキャリアビヒクルおよび単位時間当たりの量および体積の観点からの同一の投与速度に加えて、同一の量および濃度の薬剤）を伴うことが好ましい。そのように、たとえば、５分間の期間にわたる毎分１００μＬの速度および１００μｇ／ｍＬのような濃度における真皮中への所与の薬剤物質の投与は、好ましくは５分間の期間にわたる毎分１００μＬの速度および１００μｇ／ｍＬの同一濃度における皮下空間中への同一の薬剤物質の投与と比較される。
【００３９】
強化された吸収プロフィルは、たとえば、高分子および／または疎水性物質のような皮下に注射される際に良好には吸収されない材料に関して、特に明白であると信じられる。一般的に、高分子は皮下において良好には吸収されず、および、これは、毛細管の細孔の大きさに比較したそれらの大きさに起因するのみならず、それら高分子の大きさの理由で間隙を通したそれら高分子の遅い拡散にも起因する可能性がある。高分子は、疎水性の特質および／または親水性の特質を有する別個のドメインを有することができることは理解される。対照的に、親水性である低分子は皮下に投与される際に一般的に良好に吸収され、皮下投与に続く吸収と比較して、真皮中への注射時に強化された吸収プロフィルを見出すことはできない。本明細書における疎水性物質の言及は、低い水溶性を有するかあるいは実質的に不溶性である、低分子量物質（たとえば１０００ダルトン未満の分子量を有する物質）を意味することを意図している。
【００４０】
前述のＰＫおよびＰＤの利点は、真皮の毛細管層を正確に直接的に標的とすることによって、最も良好に実現される。これは、たとえば、外径約２５０μｍ未満かつ露出長２ｍｍ未満の多針システムを用いることによって達成される。そのようなシステムは、鋼、シリコン、セラミックおよび他の金属類、プラスチック、ポリマー、糖、生物学的およびまたは生分解性材料、および／またはそれらの組合せを含む種々の材料を用い、知られている方法を用いて構築することができる。
【００４１】
皮内投与方法のある種の特徴が臨床的に有用なＰＫ／ＰＤおよび投薬量の正確性を提供することが見出された。たとえば、皮膚内部の針の放出口の配置がＰＫ／ＰＤパラメタに顕著な影響を及ぼすことが見出された。慣用すなわち標準ゲージの針は、比較的大きな露出高（放出口の垂直方向の高さ）を有する斜面を有する。針の先端を皮内空間の所望される深さに配置したとしても、針放出口の大きな露出高は、送出される物質を皮膚表面により近い遥かに浅い深さに配置させる。結果として、物質は皮膚自身によって発揮される背圧および注射または輸液から蓄積される流体によって高められる圧力によって、物質を皮膚から外へ放出する傾向がある。すなわち、より大きな深さにおいては、より大きな露出高を有する針放出口が依然として有効に封止されるのに対して、皮内空間内部のより浅い深さに配置される際に同一の露出高を有する放出口が有効に封止されない。典型的には、針放出口の露出高は０〜約１ｍｍである。０ｍｍの露出高を有する針放出口は斜面を持たず、および針の先端に位置する。この場合には、放出口の深さは、針の侵入の深さと同一である。斜面あるいは針の側部を貫く開口部のいずれによって形成される針放出口も、測定可能な露出高を有する。単一の針が、真皮空間への物質の送出に適当である２つ以上の開口部または放出口を有してもよいことは理解される。
【００４２】
また、注射または輸液の圧力を制御することにより、ＩＤ投与中に及ぼされる高い背圧を回避してもよいことを見出した。液体界面に直接的に一定の圧力を作用させることにより、より一定の送出速度を達成することができ、それは吸収を最適化し、かつ改善された薬剤動態を得ることができる。同様に、送出速度および体積を制御して、送出部位における腫れを防止し、皮膚の外へ真皮到達手段を押す背圧を防止することができる。選択される物質に関して、これらの効果を得るために適切な送出速度および体積を、通常の知識のみを用いて実験的に決定してもよい。多針間の増大された間隔は、より広い流体分布および増大された送出速度すなわちより大きな流体体積を可能にする。加えて、多くの場合、特に、生体内での分解またはクリアランスを受けやすい薬剤、またはＳＣ脂肪組織に対する親和性を有する物質、あるいはＳＣマトリクス中を通してゆっくりと拡散する高分子に関して、ＩＤ輸液または注射が、慣用のＳＣ投与に比べて薬剤のより高い初期血漿中レベルを生じさせることが見出された。多くの場合、これは、ＩＤ経路によって投与される物質のより少ない投薬量を可能にする。
【００４３】
本発明を実施するのに有用な投与方法は、ヒトまたは動物の対象に対する薬剤および他の物質のボーラスおよび輸液送出の両方を含む。ボーラス投薬は、比較的短い時間（典型的には約１０分未満）をかけて単一の体積単位において送出される単一の投薬である。輸液投与は、比較的より長い時間（典型的には１０分を超える）をかけて、一定または可変であってもよい選択された速度において流体を投与することを含む。物質を送出するために、真皮到達手段は対象の皮膚に隣接して配置され、皮内空間内部に直接的に標的とされた通路を提供し、そして皮内空間中に物質（単数または複数）が送出すなわち投与され、そこでは、該物質が局所的に作用してもよいし、あるいは血流によって吸収され全身に分配されてもよい。真皮到達手段は、送出される物質（単数または複数）を収容する容器と接続されてもよい。送出すなわち投与される物質（単数または複数）の形態は、薬学的に許容される希釈剤または溶媒中のそれらの溶液、乳化物、分散物、ゲル、それらのためのビヒクルのその場で形成することに加えて、懸濁されているかまたは分散されているかのいずれかであるミクロ粒子およびナノ粒子のような微粒子を含む。容器から皮内空間中への送出は、送出される物質（単数または複数）に対する外圧または他の駆動手段の適用を伴わずに受動的に行ってもよく、および／または圧力または他の駆動手段の適用を伴って能動的に行ってもよい。好ましい圧力発生手段の例は、ポンプ、シリンジ、エラストマー膜、ガス圧、圧電ポンピング、電動(electomotive)ポンピング、電磁ポンピング、またはベルビルスプリングまたはワッシャまたはそれらの組合せを含む。所望されるならば、圧力発生手段により、物質の送出を可変制御してもよい。結果として、物質が皮内空間中に入り、そして臨床的に有効な結果を生じさせるのに充分な量および速度において吸収される。
【００４４】
本明細書において用いられる際に、「臨床的に有効な結果」とは、物質（単数または複数）の投与によってもたらされる臨床的に有用な生物学的応答を意味し、診断的に有用な応答および治療的に有用な応答の両方を含む。たとえば、疾病または症状を試験する診断またはそれらの予防もしくは治療が、臨床的に有効な結果である。そのような臨床的に有効な結果は、イヌリンの注射後の糸球体濾過圧力の測定、ＡＣＴＨ注射後の小児の副腎皮質機能の診断、コレシストキニンの注射時に胆嚢に収縮および胆汁の排出を起こさせることなどのような診断的効果に加えて、インスリンの注射時の臨床的に適切な血糖の制御、副甲状腺ホルモンまたは成長ホルモンのようなホルモン注射後のホルモン欠損の臨床的に適切な管理、抗毒素などの注射時の臨床的に適切な毒性の治療のような治療的効果を含む。
【００４５】
本発明とともに用いることができる治療効果のある物質は、モノクローナル抗体、ＰＥＧ化された抗体、ＰＥＧ化されたタンパク質または親水性もしくは疎水性のポリマーまたは追加の官能基によって修飾された任意のタンパク質、融合タンパク質、単一鎖抗体フラグメントまたは結合されるタンパク質、高分子、またはそれらの追加の官能基の任意の組合せを有する該フラグメント、抗炎症剤、組換型可溶性受容体、血栓溶解剤、組織プラスミノゲン活性化剤、ＴＮＦ−、およびＴＮＦ−アンタゴニスト、たとえば抗感染物質、抗アレルギー剤、抗関節炎剤、抗喘息剤、抗炎症剤、タンパク質、抗感染剤および他の高分子のような主要な治療の全てを含む他の物質を含む。
【００４６】
Enbrel送出に関する薬剤動態分析を、当該技術において知られている方法および技術を用い、非区分法により算出した。
【００４７】
本発明を一般的に説明したが、以下の具体的だが非制限的な例および添付の図面への参照は、真皮に到達し、直接的に目標づける薬剤投与方法を実施するための種々の例、および改善されたＰＫおよびＰＤ効果を提供する真皮に投与される薬剤物質の例を説明する。
【００４８】
単一の針を含む真皮到達微小装置の代表例は、３４ゲージの鋼材（MicroGroup Inc. (Medway, MA)）から調製され、および単一の２８゜の斜面を８００グリットのカーボランダム研磨ホイールを用いて研磨した。針は、アセトンおよび蒸留水中での順次的超音波洗浄によりクリーニングされ、そして蒸留水を用いて流れを検査された。マイクロニードルを小ゲージのカテーテル管（Maersk Medical）中にＵＶ硬化されるエポキシ樹脂を用いて固定した。機械的割り出しプレートを用いて針の長さを設定し、カテーテル管のハブを深さ制御として機能させ、光学顕微法により確認した。種々の長さの針を用いる実験において、割り出しプレートを用いて、露出される針の長さを０．５、０．８、１、２または３ｍｍに調整した。ポンプまたはシリンジのいずれかである流体計量装置との接続は、カテーテル注入口の一体型ルアーアダプタによる。注射中は、針は皮膚表面に対して垂直に挿入され、そしてボーラス送出においては穏やかな手の圧力によって保持されるか、あるいはより長い輸液においては医療用粘着テープによって垂直に保持されるかのいずれかであった。装置は、注射の直前および直後の両方において機能および流体の流れを確認した。以後、このルアーロック単一針カテーテルの設計を、ＳＳ１＿３４と称する。
【００４９】
中心注入口から個々の針のそれぞれに分枝する小体積の流体経路を伴う、アクリルポリマーから機械加工された１インチ径の円板から構成される、さらに別の真皮到達アレイ形微小装置を準備した。流体の入力は、ハミルトンマイクロシリンジに接続される小体積のカテーテルラインを経由し、および送出速度をシリンジポンプにより制御した。針は、１５ｍｍ径の円形パターンを有して円板内に配列された。それぞれ１２ｍｍおよび７ｍｍの針と針との間隔を有して、３本針のアレイおよび６本針のアレイを構築した。全てのアレイの設計において、長さ１ｍｍの単一ベベルの３４Ｇステンレス鋼マイクロニードルを用いた。以後、３本針の１２ｍｍ間隔のカテーテル設計をＳＳ３＿３４Ｂと称し、６本針の７ｍｍ間隔のカテーテル設計をＳＳ６＿３４Ａと称する。
【００５０】
中心注入口からそれぞれの個々の針に分枝する小体積の流体経路を伴う、アクリルポリマーから機械加工された１１ｍｍ径の円板から構成される、さらに別の真皮到達アレイ形微小装置を準備した。流体の入力は、ハミルトンマイクロシリンジに接続される小体積のカテーテルラインを経由し、および送出速度をシリンジポンプにより制御した。針は、約５ｍｍ径の円形パターンを有して円板内に配列された。前述のようにカテーテルに接続される約４ｍｍ間隔を有する３本針のアレイを構築した。以後、これらの設計を、１ｍｍ、２ｍｍおよび３ｍｍの針長さのそれぞれに関して、ＳＳ３Ｓ＿３４＿１、ＳＳ３Ｓ＿３４＿２およびＳＳ３Ｓ＿３４＿３と称する。装置コード番号ＳＳ３＿３４Ｂを、Enbrelの送出に用いた。他の微小装置を用いてはいないが、これらの変形の多くは潜在的に有用である。
【００５１】
皮膚の侵入に利用可能な長さが１〜２ｍｍであるように先端近傍で９０゜の角度で曲げられたステンレス鋼の３０ゲージ針を用いて、さらに別の真皮到達ＩＤ輸液装置を構築した。針が挿入され、および針放出口の全露出高が１．０〜１．２ｍｍである際に、針の放出口（針の先端）は皮膚内１．７〜２．０ｍｍの深さにあった。以後、この設計をＳＳＢ１＿３０と称する。
【実施例１】
【００５２】
Enbrel（登録商標）（エタネルセプト(etanercept)）は、関節炎の治療に用いられる、約１５０ｋＤの分子量を有する腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）アンタゴニストである。慣行的にＳＣ注射により投与されるEnbrel（登録商標）の活性剤は、ヒトＩｇＧ１のＦｃ部位に結合される７５ｋＤの腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）から構成される設計された融合タンパク質である。ＩＤ空間中へ高分子量の可溶性受容体タンパク質および免疫グロブリンを投与することの実現可能性を例示するための例示物質として、Enbrel（登録商標）を試験した。
【００５３】
２０頭のユカタン・ミニブタに、静脈的（ＩＶ、７頭）に、皮下的（ＳＣ、６頭）に、および皮内的（ＩＤ、７頭）に、ＴＮＲＦ：Ｆｃを投薬した。公称値の全投与投薬量は、体積２５０マイクロリットル中の２０ｍｇであった。３本のマイクロニードルのアレイを用いてＩＤ投与を実施した。装置は、３本の針のアレイであり、約１２ｍｍの針間隔であり、３４Ｇａであり、１ｍｍ長さの針であり、２０マイクロリットル／分の体積輸液速度において、１２．５分の全投薬持続時間を用いた。ＳＣ投薬は、数分間にわたる標準的２５ゲージのシリンジニードルによった。投与後１０日管にわたって、血液試料を定期的に抜き取り（０．５、１、１．５、２、３、４、６、８、１２、２４、３６、４８、７２、９６、１４４、１９２および２４０時間において）、そしてEnbrel（登録商標）含有量を分析した。
【００５４】
その結果（図１）は、ＩＤ投与後のEnbrel（登録商標）吸収は、より早く発生し、かつ３倍を越える大きな濃度ピークを有し、標準のＳＣ経路によるよりも遥かに迅速であることを示す。加えて、ＳＣ蓄積からの吸収は、投与の実施のかなりの時間の後に発生する二次的濃度ピークを伴い、濃度−時間プロフィルにおいてより大きな変動性をもたらす。
【００５５】
平均濃度プロフィルに関して、非区分的ＰＫ分析を実施し、結果を第１表にまとめる。
【００５６】
【表１】

【００５７】
ＳＣに対するｔ_maxおよびＣ_maxによって実証されるように、薬剤濃度の迅速な開始が発生する。ＩＤ経路の相対的生物学的利用率は、ＳＣ投与の現在の標準を越えて、劇的に５０％向上する。同様に、繰り返し間の変動性も低減される。（２種の生物学的利用率に注意されたい：絶対的生物学的利用率は、ＩＶプロフィルに対して計算され、相対的生物学的利用率は、別の非ＩＶ経路に対して計算される。）
【００５８】
３つの投与の経路全てに関する末端フェーズ半減期(terminal phase half-life)は２０％以内であり、このことから、異なる経路の投与によって排出フェーズは変化しないと結論づけることができる。
【００５９】
該結果は、皮下的と比較して皮内的に投与される際に、ＴＮＲＦ：Ｆｃの絶対的生物学的利用率が２５％増大することを示す。得られる投薬量を補償する効果は、当該技術の標準的な皮下注射方法において可能であったものよりも２０％少ない投薬量の投与を可能にし、製薬業者および消費者に対して大きな費用低減をもたらす。
【００６０】
Enbrel（登録商標）の分子量は、天然または人工の免疫グロブリンの分子量を良好に代表するものである。また、この高分子量は、大きなオリゴ糖部分によるグリコシル化を伴う融合タンパク質の典型であり、およびオリゴ糖、ＰＥＧ、アルブミンまたは他の部分によって化学的に修飾されて、増大した循環半減期または免疫ないしクリアランス系の「ステルス」回避のような所望される薬理学的特性を与えるタンパク質（または別の化合物）の典型でもある。ＩＤ投与される薬剤の取り込みの仮定されている機構は、引き続く全身的分布を伴う、毛細血管または毛細リンパ管への分配である。これらの脈管壁の毛細管管壁細胞は、細胞壁を横断するかまたは緻密な連結部を通した制限された分配に起因して、高分子量化合物の有効な吸収を制限する恐れがあった。これは、これまで低分子量を有する他のタンパク質では検出されていなかった。しかしながら、今回の結果は、推測することができなかった、高分子量種の有効な吸収のためのＩＤ空間の利用をまさに示すものである。微粒子物質および乳化物がＩＤ空間から除去されることは以前に実証されている。しかしこれらの多くはワクチンまたは関連する種であったので、そのような種の取り込みの効率および全身的分布の定量的測定を推断することができなかった。
【００６１】
送出されるEnbrel（登録商標）の高い濃度（８０ｍｇ／ｍＬ）もまた、これまでに研究されてきた化合物（＜１５ｍｇ／ｍＬ）よりも著しく高い。繰り返しになるが、この独特の処方の提供が、必然的に、効率的な取り込み、分布および生物学的応答を可能にすると推論することはできなかった。等張であるにもかかわらず、ＩＤ注射時のそのように高いタンパク質濃度が、局所化された高張区域をもたらし、極度に濃厚なタンパク質溶液に起因する変化した取り込み動態または他の潜在的機能不全モード（局所化された薬剤の析出および／または局所化された組織の損傷を含む）を伴い、血液または細胞間流体の流れの変化をもたらす可能性があった。前述のＰＫの結果は、これが真相ではないことを示す。
【００６２】
また、Enbrel（登録商標）の充分に薬学的に効率的な投薬量を送出するために、前述の高い濃度は、以前に確立されたものよりも増大した送出体積（２５０μＬ）を使用する必要がある。しかしながら、増大した体積およびより粘性の高いタンパク質溶液は、変化した投薬処方をを必要とする。
【００６３】
典型的には、低濃度タンパク質およびビヒクルを、漏れることなしに、１分間当たり約３０〜６０μＬ／分の速度、３４Ｇａカニューレにおいて、ブタに送出することができる。これらの速度は、所与の微小装置に関して、速度にマイクロカニューレの数を乗ずることによって、容易に上方に外挿することができる。この場合に、著しく低速の針当たりの速度を用いて、漏れなしに送出を達成することが必要である。Enbrel（登録商標）の全２５０μＬの体積は、６０μＬ／分の速度において１２．５分間の全送出時間をかけて３本針のアレイ（１２ｍｍの針対針間隔）により送出される。慣例的にこの速度を超える増大は、これらのより高い速度においても溶液はカニューレを通して容易に流れるが、決まって、許容できない「湿潤」注射をもたらす。同様に、より高い速度は、おそらく張性すなわち浸透圧の局所的変化に起因して、注射部位からの局所的出血を周期的にもたらす。同様に、その外壁がEnbrel（登録商標）溶液によって汚染されるカニューレは組織内に固定されるが、しかし輸液時に漏出することが観察される。高度に濃厚で粘性のタンパク質溶液は潤滑剤として機能し、かつニードルカニューレ周囲の有効な封止を妨害すると仮定される。単一の部位における組織の膨張を最小限にするために、３本針のアレイを用いて輸液される全体積を分散させた。また、そのような処方物の粘弾性をこれまで試験されたものから高度に変化させ、変化したミクロ流動プロセスを示すことも可能である。同様に、高度に濃厚なEnbrel（登録商標）溶液は、マイクロカニューレ中に存在する短い期間において、カニューレ孔内で速やかに析出ないし結晶化し、流れの閉塞を起こすであろう。これは、流体を用いて外部的に溶液を再湿潤させて閉塞を溶解させることにより、回復させることができる。
【００６４】
粘稠で高度に濃厚な溶液の有効な送出は、
ａ）漏出を最小限とし、かつ組織の損傷を最小限とするための、予測されるよりも遅い針当たりの輸液速度、
ｂ）適切な組織の封止を行うための、徹底的に清浄な外部カニューレ壁、
ｃ）増大した体積を分散させるための多数の滴注点、および
ｄ）析出およびカニューレの閉塞を防止するための充分に水を含む環境（たとえば、間隙空間）における流動の活性化
を必要とする。
【００６５】
Enbrel（登録商標）のＩＤ投与は薬剤動態学的観点からＳＣ標準経路に比べてより有効であったが、かなりの寿命を有する薬剤溶液の皮内蓄積の形成の顕著な徴候があった。これは、ＩＤ投与部位から速やかに除去される全ての他のタンパク質または薬剤に関して、これまで観察されておらず、および典型的には２時間以内のピーク血漿時間を示す。ＩＤのEnbrel（登録商標）について観察されるｔ_maxは、約９時間であった。また、これは、試験動物において視覚的に評価される真皮の腫れ／水疱の持続時間にも相関する。通常の場合、真皮の腫れは、有効な消炎が起こり始める前に、８〜１２時間の寿命（ドレイズ水腫採点によって視覚的に測定される）を有した。同様に、ＩＤ注射後１時間において切除された投与部位の組織病理学は、局所的水腫、および標準的エオシン着色において桃色に着色される間隙空間を示し、真皮細胞層中のタンパク質の溶液の存在を示した。この着色は、他のタンパク質について、これまでは発生しなかった。同様に、注射後６〜９日に、多くの試験動物において接触皮膚炎に類似する局所的組織応答に気づいた。これらの部位は、組織病理学により、真皮中への炎症性細胞湿潤に関して陽性であると検査された。これは、おそらく、ヒトタンパク質に対するブタの種特異的な免疫学的応答であるが、いくらかのタンパク質またはタンパク質分解生成物の局所化が発生したことを示す。
【００６６】
これらの結果は、ＩＤ投与されるタンパク質について以前には実証されておらず、Enbrel（登録商標）、ほかの受容体抗体、または高分子量で高粘度の溶液に関する以下の関連を有する：
１．皮内蓄積の形成を
ａ） ワクチンをベースとする実体に対する所望される免疫学的応答の増大
ｂ） 黒腫、いぼ、母斑などの局所皮膚領域または部位を、細胞障害性物質、抗腫瘍性抗体または他の剤によって治療処理すること、および
ｃ） リンパ性排液、ラジオイメージング、または他の有益な診断目的のために皮膚の部位をマッピングする有効な手段を創造する
ために有効に利用することができる。
２．皮内蓄積の形成を
ａ） 高度に濃厚な溶液、
ｂ） 高分子量を有する溶液、
ｃ） 剤の滲出の可能性を最小限にするためのボーラス滴注、
ｄ） 長期にわたる寿命を与えるための高体積の滴注、および
ｅ） 高い溶液粘度
によって促進することができる。
投与される物質の粘度は、当業者にとって普通の手段によって測定することができ、および、所望される場合には、治療的に活性物質に化学的結合しない、すなわち共有結合しない物質（たとえばＰＥＧ、ＰＶＰ、ＰＶＡ、糖類、その場でゲルを形成する溶液）を用いて修飾することができる。
【００６７】
以上の観察および結果に基づいて、Enbrel（登録商標）または他の高分子量化合物または粘稠な溶液のＩＤ投与に最適化された装置プラットホームは、以下の特徴を示す：
ａ） 粘度または他の処方特性に起因する装置の漏洩、および組織損傷の可能性を最小限にするための遅い輸液速度（＜２０μＬ／分／カニューレ）；
ｂ） 有効な滴注を可能にし、および滴注速度に対して生物学的取り込みを良好に調和させ、蓄積形成を最小限にするための長期間にわたる輸液持続時間（１２分〜２４時間）；
ｃ） 組織部位の反応を防止し、漏出を防止し、蓄積を防止するための減少した溶液濃度（≦８０ｍｇ／ｍＬ）；
ｄ） 漏出または薬剤の析出を防止するための、マイクロカニューレ固定後の流動開始を可能にする機構；
ｅ） より広範な組織空間中へ投薬量を分散させるための多数のマイクロカニューレ。
【００６８】
上記の観察に基づいて、皮内蓄積を発生させるために最適化されたプラットホームは以下の特徴を包含する：
ａ） 粘度修飾剤または高分子量添加剤または遅い吸収のための化学的誘導体；
ｂ） 高分子量種を除去する皮内層の能力を無力化するための減少した輸液期間（＜１時間）；および
ｃ） その場での蓄積の形成を促進するための高い薬剤濃度。
【００６９】
１つの好ましい送出装置は、
ａ） 粘度または他の処方特性に起因する装置の漏洩、および組織損傷の可能性を最小限にするための遅い輸液速度（＜２０μＬ／分／カニューレ）；
ｂ） 有効な滴注を可能にし、および滴注速度に対して生物学的取り込みを良好に調和させ、蓄積形成を最小限にするための長期間にわたる輸液持続時間（１２分〜２４時間）；
ｃ） 組織部位の反応を防止し、漏出を防止し、蓄積を防止するための減少した溶液濃度（≦８０ｍｇ／ｍＬ）；
ｄ） 漏出または薬剤の析出を防止するための、マイクロカニューレ固定後の流動開始を可能にする機構；および
ｅ） より広範な組織空間へ投薬量を分散させるための多数のマイクロカニューレ
を提供することができる機械的輸液プラットホームである。
【００７０】
上記の観察に基づいて、皮内蓄積を発生させるために最適化されたプラットホームは以下の特徴を包含する：
ａ） 粘度修飾剤または高分子量添加剤または遅い吸収のための化学的誘導体；
ｂ） 高分子量種を除去する皮内層の能力を無力化するための減少した輸液期間（＜１時間）；および
ｃ） その場での蓄積の形成を促進するための高い薬剤濃度。
また、この装置は、１つまたは複数の皮内マイクロカニューレ（≦３１Ｇ）を含む。適当な装置は、特に特許文献２および特許文献３に記載されている。
【００７１】
治療的または診断的関連のための人工または天然に存在する抗体、受容体タンパク質、高度にグリコシル化された低分子量タンパク質または化学的に修飾されたタンパク質（たとえば、ＰＥＧ化、アルブミン・コンジュゲートなど）を含む、他の高分子量の薬学的化合物についても、同様の利点が期待される。
【００７２】
一般的に、真皮到達マイクロニードル装置による、本明細書に記載される方法によって教示されるＩＤ送出は、装置の輸液パラメタを調整することにより血漿のプロフィルを調節する能力に加えて、高い生物学的利用率を有する、容易に利用可能で再現性の高い非経口送出経路を提供する。なぜなら、取り込みが生物学的取り込みパラメタによって律速されないからである。
【００７３】
前述の実施例において、本発明によって実施される方法は、大いに改善された薬学的に適切な速度において生体内に薬剤を送出する能力を実証する。このデータは、本発明の方法によれば、ヒトにおける他の薬剤のＩＤ投与（記載される方法によって教示される）に関して、改善された薬学的結果が期待されることを示す。
【００７４】
本明細書中に記載される全ての引用文献は、参照により本明細書の一部をなすものとする。本明細書中でのそれら文献の解説は、それら文献の著者によってなされた主張をまとめることのみを意図しており、任意の文献が特許性に関連する先行技術を構成することを自認するものではない。本出願人は、引用された文献の正確性および妥当性に対して異議を申し立てる権利を留保する。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】皮内（ＩＤ）投与、皮下（ＳＣ）投与および静脈内（ＩＶ）投与後のEnbrel（登録商標）の濃度−時間プロフィルを示すグラフである。

Claims (88)

1. 哺乳類の皮膚内部の皮内空間中に高分子量物質を直接的に送出する方法であって、０と１ｍｍとの間の露出高を有する放出口を有する少なくとも１つの中空針を通して該物質を投与する工程を含み、該放出口は０．３ｍｍと２ｍｍとの間の深さまで該皮膚中に挿入され、該物質の送出が０．３ｍｍと２ｍｍとの間の深さにおいて発生することを特徴とする、哺乳類の皮膚内部の皮内空間中に高分子量物質を直接的に送出する方法。
2. 放出された物質が、皮下注射後の薬剤動態と比較して改善される薬剤動態を有することを特徴とする請求項１に記載の方法。
3. 投与は少なくとも１つの小ゲージの中空針を通すことを特徴とする請求項１に記載の方法。
4. 針が０と１ｍｍとの間の露出高を有することを特徴とする請求項１に記載の方法。
5. 注射工程が、該物質を送出する針を少なくとも皮膚表面下０．３ｍｍから該表面下２ｍｍ以下の深さに挿入する工程を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
6. 投与工程が、針を少なくとも０．３ｍｍかつ２ｍｍ以下の深さまで皮膚に挿入する工程を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
7. 改善される薬剤動態が、該物質の増大した生物学的利用率であることを特徴とする請求項２に記載の方法。
8. 改善される薬剤動態がＴ_maxの減少であることを特徴とする請求項２に記載の方法。
9. 改善される薬剤動態がＣ_maxの増大であることを特徴とする請求項２に記載の方法。
10. 改善される薬剤動態がＴ_lagの減少であることを特徴とする請求項２に記載の方法。
11. 改善される薬剤動態が向上した吸収速度であることを特徴とする請求項２に記載の方法。
12. 該物質が１０分以下の期間をかけて投与されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
13. 該物質が１０分を越える期間をかけて投与されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
14. 該物質がタンパク質であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
15. 該物質が１ｎＬ／分と２００ｍＬ／分との間の速度において投与されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
16. 該物質がホルモンであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
17. 前記タンパク質が受容体タンパク質または抗体であることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
18. 前記タンパク質がエタネルセプトであることを特徴とする請求項１７に記載の方法。
19. 前記タンパク質が融合タンパク質であることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
20. 前記物質が少なくとも４０，０００ｋＤの分子量を有することを特徴とする請求項１に記載の方法。
21. 前記物質が少なくとも１００，０００ｋＤの分子量を有することを特徴とする請求項２０に記載の方法。
22. 前記物質が少なくとも１５０，０００ｋＤの分子量を有することを特徴とする請求項２１に記載の方法。
23. 前記物質が核酸であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
24. 前記物質が疎水性であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
25. 前記物質が親水性であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
26. 針が皮膚に対して実質的に垂直に挿入されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
27. 投与が、前記物質を含む皮内蓄積が形成されるような条件で実施されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
28. 薬剤物質を投与する方法であって、真皮中に物質を選択的に送出するのに適当な長さおよび放出口を有する１つまたは複数のマイクロニードルを通して、物質を皮内に注射または輸液して、真皮における該物質の吸収を得る工程を含むことを特徴とする薬剤物質を投与する方法。
29. 真皮における該物質の吸収が、皮下投与に比べて改善される全身的薬剤動態を与えることを特徴とする請求項２８に記載の方法。
30. 改善される薬剤動態が増大した生物学的利用率であることを特徴とする請求項２９に記載の方法。
31. 改善される薬剤動態がＴ_maxの減少であることを特徴とする請求項２９に記載の方法。
32. 改善される薬剤動態がＣ_maxの増大であることを特徴とする請求項２９に記載の方法。
33. 改善される薬剤動態がＴ_lagの減少であることを特徴とする請求項２９に記載の方法。
34. 改善される薬剤動態が向上した吸収速度であることを特徴とする請求項２９に記載の方法。
35. マイクロニードルの長さが約０．５ｍｍから約１．７ｍｍまでであることを特徴とする請求項２９に記載の方法。
36. マイクロニードルが３０ゲージまたはそれより細いことを特徴とする請求項２９に記載の方法。
37. マイクロニードルが、０から１ｍｍまでの放出口を有することを特徴とする請求項２８に記載の方法。
38. マイクロニードルが、該マイクロニードルを皮膚表面に対して垂直に配置する送出装置内に配置されることを特徴とする請求項２８に記載の方法。
39. マイクロニードルのニードルが、マイクロニードルのニードルのアレイ中に含まれることを特徴とする請求項２８に記載の方法。
40. 該アレイが３本のマイクロニードルを含むことを特徴とする請求項３９に記載の方法。
41. 該アレイが６本のマイクロニードルを含むことを特徴とする請求項３９に記載の方法。
42. 該物質が少なくとも４０ｋＤの分子量を有することを特徴とする請求項２８に記載の方法。
43. 該物質がタンパク質であることを特徴とする請求項４２に記載の方法。
44. 前記タンパク質が受容体タンパク質または抗体であることを特徴とする請求項４３に記載の方法。
45. 前記タンパク質がエタネルセプトであることを特徴とする請求項４４に記載の方法。
46. 投与が、前記物質を含む皮内蓄積が形成されるような条件で実施されることを特徴とする請求項２８に記載の方法。
47. 高分子量薬剤物質の皮内注射のためのマイクロニードルであって、該マイクロニードルが、真皮中への物質の特異的に送出することに対する適合性のために選択される長さおよび放出口を有することを特徴とするマイクロニードル。
48. マイクロニードルの長さが約０．５ｍｍから約１．７ｍｍまでであることを特徴とする請求項４７に記載のマイクロニードル。
49. ３０ゲージまたはそれより細いことを特徴とする請求項４７に記載のマイクロニードル。
50. ０から１ｍｍまでの放出口を有することを特徴とする請求項４７に記載のマイクロニードル。
51. 該マイクロニードルを皮膚表面に対して垂直に配置する送出装置内に配置されていることを特徴とする請求項４７に記載のマイクロニードル。
52. マイクロニードルのニードルのアレイ内にあることを特徴とする請求項４７に記載のマイクロニードル。
53. 該アレイが３本のマイクロニードルを含むことを特徴とする請求項５２に記載のマイクロニードル。
54. 該アレイが６本のマイクロニードルを含むことを特徴とする請求項５２に記載のマイクロニードル。
55. 対象に対して生物活性物質を送出する方法であって、
    該対象の皮膚に、有効量の該生物活性物質を用いて該対象の真皮空間を正確に標的とするための真皮到達手段を有する装置を接触させる工程
    を含むことを特徴とする対象に対して生物活性物質を送出する方法。
56. 該生物活性物質の薬剤動態が、皮下に投与される際の該物質の薬剤動態に比べて改善されることを特徴とする請求項５５に記載の方法。
57. 改善される薬剤動態が生物学的利用率の増大であることを特徴とする請求項５６に記載の方法。
58. 改善される薬剤動態がＴ_maxの減少であることを特徴とする請求項５６に記載の方法。
59. 改善される薬剤動態が、皮下注射と比較したＣ_maxの増大を含むことを特徴とする請求項５６に記載の方法。
60. 改善される薬剤動態がＴ_lagの減少であることを特徴とする請求項５６に記載の方法。
61. 改善される薬剤動態が向上した吸収速度であることを特徴とする請求項５６に記載の方法。
62. 該装置が、シリンジ、輸液ポンプ、圧電ポンプ、電動ポンプ、電磁ポンプまたはベルビルスプリングを含む流体駆動手段を有することを特徴とする請求項５５に記載の方法。
63. 該真皮到達手段が、約０．５から約１．７ｍｍまでの長さを有する１つまたは複数の中空マイクロカニューレを含むことを特徴とする請求項５５に記載の方法。
64. 該真皮到達手段が、０と１ｍｍとの間の露出高を有する放出口を有する１つまたは複数の中空マイクロカニューレを含むことを特徴とする請求項５５に記載の方法。
65. 該物質が少なくとも４０ｋＤの分子量を有することを特徴とする請求項５５に記載の方法。
66. 該物質がタンパク質であることを特徴とする請求項５５に記載の方法。
67. 前記タンパク質が受容体タンパク質または抗体であることを特徴とする請求項６６に記載の方法。
68. 前記タンパク質がエタネルセプトであることを特徴とする請求項６７に記載の方法。
69. 投与が、前記物質を含む皮内蓄積が形成されるような条件で実施されることを特徴とする請求項５５に記載の方法。
70. 対象に対して高分子量の生物活性物質を送出するための方法であって、
    該対象の皮膚に、１ｎＬ／分から２００ｍＬ／分までの速度において有効量の該生物活性物質を用いて該対象の真皮空間を正確に標的とするための真皮到達手段を有する装置を接触させる工程
    を含むことを特徴とする対象に対して高分子量の生物活性物質を送出するための方法。
71. 該生物活性物質の薬剤動態の迅速な開始が、皮下注射に比較して著しく改善されることを特徴とする請求項７０に記載の方法。
72. 生物学的利用率が増大することを特徴とする請求項７１に記載の方法。
73. 該薬剤動態が減少したＴ_maxであることを特徴とする請求項７１に記載の方法。
74. 該薬剤動態が増大したＣ_maxであることを特徴とする請求項７１に記載の方法。
75. 該薬剤動態が減少したＴ_lagであることを特徴とする請求項７１に記載の方法。
76. 該薬剤動態が向上した吸収速度であることを特徴とする請求項７１に記載の方法。
77. 該真皮到達手段が、前記対象の皮膚中に約０．５から約２．０ｍｍまでの深さまで挿入される１つまたは複数の中空マイクロカニューレを含むことを特徴とする請求項７０に記載の方法。
78. 該真皮到達手段が、０と１ｍｍとの間の露出高を有する放出口を有する１つまたは複数の中空マイクロカニューレを含むことを特徴とする請求項７０に記載の方法。
79. 前記物質は少なくとも４０ｋＤの分子量を有することを特徴とする請求項７０に記載の方法。
80. 前記物質がタンパク質であることを特徴とする請求項７０に記載の方法。
81. 前記タンパク質が受容体タンパク質または抗体であることを特徴とする請求項８０に記載の方法。
82. 前記タンパク質がエタネルセプトであることを特徴とする請求項８０に記載の方法。
83. 投与が、前記物質を含む皮内蓄積が形成されるような条件で実施されることを特徴とする請求項７０に記載の方法。
84. 前記タンパク質が融合タンパク質であることを特徴とする請求項８０に記載の方法。
85. 前記物質は少なくとも１００，０００ｋＤの分子量を有することを特徴とする請求項７０に記載の方法。
86. 前記物質がタンパク質であることを特徴とする請求項８５に記載の方法。
87. 前記物質は少なくとも１５０ｋＤの分子量を有することを特徴とする請求項８５に記載の方法。
88. 前記物質がタンパク質であることを特徴とする請求項８７に記載の方法。

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