JP2006516006A - 細ゲージのマイクロカニューレを用いる皮内細胞の送達 - Google Patents

Abstract

マイクロニードルによって被験体の皮膚の皮内空間の中へ細胞を投与することによって、被験体の中へ細胞を送達するための方法。細胞は、細胞に基づく治療物質およびワクチンに関連し、およびマイクロニードルの垂直挿入によって送達される。マイクロニードルは、約０と１ｍｍとの間の露出した高さ、約０．３ｍｍから２．５ｍｍまでの間の合計の長さ、および３０ゲージと等しいかまたはそれ未満であるサイズを有する中空の針である。また、マイクロニードルの配列を使用することもできる。

Description

本願は、特許文献１、および特許文献２に対して優先権を主張し、それらの各々は参照によって本明細書中に組み込まれる（特許文献１、２参照）。

本発明は、被験体の中へ細胞に基づく治療物質およびワクチンを送達するための方法、具体的には、マイクロニードルによって、被験体の皮膚の皮内空間の中へ、樹状細胞または関連細胞型に基づく治療物質、島細胞、およびワクチンを送達するための方法に関する。

細胞に基づく治療法およびワクチンは、細胞および組織を治療薬として使用して、傷害または疾病を治療する治療を言う。細胞に基づく治療法の例は、造血細胞治療法、間葉幹細胞に基づく治療法、免疫療法、樹状細胞および関連細胞型に基づく治療法、および島細胞療法を含むが、しかしそれらに限定されない。島細胞療法は、インシュリンを生成するこの細胞の機能に基づいて、糖尿病を治療する。樹状細胞および関連細胞型療法は、樹状細胞の抗原提示細胞としての機能に基づく。

樹状細胞は、骨髄の中で発生し、そして胸腺の中へ移動し、およびその表面上に主要組織適合抗原複合体（ＭＨＣ）分子のクラスＩおよびクラスＩＩの両方を有する。樹状細胞は、感染症および腫瘍性疾病に対する効果的な免疫応答の誘導において、重要なベクターかつ抗原提示細胞である。抗原単独では、たとえ抗原提示ＭＨＣのクラスＩおよびＩＩの分子に対して結合するように前処理されたものでさえ、効果的なＴ細胞性免疫を調節するためには不十分である。活性化された樹状細胞は、本タスクにとって本質的である。異物抗原は、これらの特殊化された抗原提示細胞の表面上に表示され、およびリンパ節に入る。１つの型（嵌合樹状細胞）は、リンパ節の傍皮質領域におけるＴ細胞に対する抗原を提示し、他の型（濾胞状樹状細胞）は、リンパ濾胞の活性化された中心（胚芽中心）における記憶Ｂ細胞を活性化することに関与すると思われる。

ランゲルハンス細胞は、皮膚の免疫応答において中心的な役割を担う、皮膚の樹状細胞に関連する。ランゲルハンス細胞は、皮膚の中の樹状前駆体細胞であり、および外部刺激に対して見張りに立つセンチネルとみなされている。ランゲルハンス細胞は、表皮の基底層および基底上層（suprabasal layers）の中に存在し、および樹状突起のネットワークを形成し、それを通じて、隣接するケラチノサイトおよび神経と相互作用する。ランゲルハンス細胞は可動性であり、リンパ節のＴ細胞依存領域へ移動する。マクロファージと同様に、それらもまた、骨髄由来性であり、構造的にＭＨＣ−ＩＩを表し、および強い抗原提示能を有する。しかしながら、マクロファージとは異なり、ランゲルハンス細胞は、ナイーブＴ細胞を感作させる能力を有する。

樹状細胞に基づく療法およびワクチンおよび関連細胞型に基づく治療法およびワクチンは、通常、患者の外側（エクスビボ）での樹状細胞の培養および活性化を必要とする。しかしながら、最初に、同一の患者から自己由来的に、樹状細胞を得てもよい。次いで、表面区域上に所望の抗原を有する活性化された樹状細胞を患者の体の中へ再導入して、体の免疫応答を調節する。

皮膚は、細胞に基づく治療法およびワクチンの送達のための標的である。皮膚は、人体のための究極の容器である：皮膚は、体の要求に従って、受け取りおよび輸送し、受け入れおよび放出する。皮膚は、コンテナ、ディフェンダ、レギュレータ、ブリーザ、フィーラー、およびアダプタである。皮膚は、体の最大の器官であり、および体の他の主要器官と同様に不可欠である。皮膚は、機能、厚さ、および強さの点で異なる２つの主要な層で構成されている。外側から内側にかけて、それらは表皮およびその下層と真皮とであり、それらの後に、皮下組織すなわち下皮がある。表皮および真皮は、毛包、色素沈着、細胞形成、構成される腺、および血液供給のそれぞれの量によって、さらに差別化される。皮膚の合計の厚さは、人によって異なり、かつ個人においても体の上の皮膚の位置に従って変化するが、しかし、典型的にはおよそ２〜３ｍｍである。

表皮層は、皮膚の最外層であり、および５層を有する。これらの層は、角質層、透明層、顆粒層、有棘層、および胚芽層である。その人の年齢および性別および体の上の皮膚の位置に依存するが、表皮層は５〜３０細胞層の厚さであることができる。表皮の合計の厚さは、典型的には、約５０から約１５０ミクロンの間である。

表皮層の下の真皮層は、体温を調節し、および表皮に栄養素で飽和された血液を供給する役割を有する。真皮層は、繊維芽細胞で構成されており、繊維芽細胞は、コラーゲン結合組織を生成し、および皮膚に対して弾性および支持性を与える。真皮は、毛包、神経終末、および圧力レセプタの所在地であり、および、薄い表皮を通過することができる感染性侵入物から体を防御する。また、真皮層は、２つの区分：乳頭状真皮および網状層に細分される。乳頭状真皮は、表皮の選択される層に対する栄養素の供給および体温の調節に関する真皮の機能において、主な主体である。体全体にわたる脈管系のように働く、薄いがしかし広範囲にわたる脈管系によって、両機能は実現される。網状層は、乳頭状真皮よりもはるかに高密度である；網状層は、皮膚を強固にして、構造と弾性とを提供する。網状層は、基礎として、毛包、汗腺、および皮脂腺のような皮膚の他の構成要素を支える。

細胞に基づく治療物質およびワクチン、具体的には、樹状細胞および関連細胞型に基づく治療物質およびワクチンを、患者の中へ投与するための方法は、十分に研究されてきていない。投与の１つの方法は、静脈内注入による。特許文献３、特許文献４、特許文献５および特許文献６参照のこと。細胞に基づく治療物質およびワクチン、特に、リンパ節を含む免疫機構を標的とするこれらの治療物質およびワクチンの静脈内注入の方法は、不利点を有した。第１に、これらの細胞に基づく治療物質およびワクチンは、リンパ系に達する前に血液中を循環しているので、免疫機構に対して直接的な接近方法を有さない。第２に、効果的な療法を提供するためには、非常に多数の細胞を必要とする。第３に、いくつかの場合では、静脈内送達は、活性化よりむしろ免疫寛容の状態を誘導する可能性がある。

癌および伝染性疾病の免疫療法のための樹状細胞（ＤＣ）の使用は、成長している分野である。癌療法のために、典型的には、白血球除去法によって患者から自己由来のＤＣを精製し、次いで、定義された腫瘍抗原、腫瘍ペプチド、溶解された腫瘍細胞または腫瘍由来ＲＮＡのような腫瘍材料をロードする（非特許文献１参照）。次いで、腫瘍に対して特異的な免疫応答を刺激するために、これらの「ロードされたＤＣ」を患者の中へ再導入する。

患者に対してＤＣを再導入する方法は、最近、相当な興味の的となっている。前臨床動物実験および人間の臨床試験において、皮下（ＳＣ）、皮内（ＩＤ）、静脈内（ＩＶ）、腹腔内（ＩＰ）、リンパ内（ＩＬ）、および上記経路の組み合わせを含む多数の送達経路が調査されてきている。これらの研究にもかかわらず、癌を予防または治療することにおいて、どの経路(単数または複数）が最も効果的であるかについては、依然として不明確である。免疫応答の特性および性質は経路間で異なるとはいえ、ＩＤ、ＩＬまたはＩＶ経路を介して抗原パルスされたＤＣで免疫化された患者はみな、特異的な免疫応答を引き起こしたことを、Ｆｏｎｇらは示した（非特許文献２参照）。特に、Ｔ細胞応答を生成するインターフェロン（ＩＦＮ）−γは、ＩＤおよびＩＬ送達の後に観察されたが、しかしＩＶ送達の後には観察されず、それに対して、ＩＶ注射された患者は、腫瘍特異的な抗体を生み出す傾向がより大きかった。この研究において、効力（例えば、腫瘍の低減および／または予防）は評価されなかった。同一グループによる他の研究において、ＩＶ送達は、進行性の結腸直腸癌または非小細胞肺癌のある患者の一部において、臨床的に効能のあることが示されたが、しかしながら、代替の経路は調査されなかった（非特許文献３参照）。

多数の研究者達は、癌療法のためにＤＣのＩＤ送達を実施してきている（例えば、非特許文献４、非特許文献５、非特許文献６、非特許文献７、非特許文献８参照）。これらの研究において、ＩＤ送達の方法は、明記されていなかったか、または標準的な針およびシリンジを用いるマントー技術（Mantoux-technique）に従って実施されていたかのいずれかであった。マントー技術によるＩＤ注射は、皮表に対して浅い角度で針（典型的には、およそ２７Ｇａ）を挿入することによって実施される（非特許文献９参照）。この方法は、高度に訓練された開業医の手をもってしても実施することが非常に難しく、および、しばしば痛みを伴う。加えて、この方法に従って送達深さを制御することは非常に難しく、従って、投与される用量の少なくとも一部分のＳＣ組織中への「漏出」をもたらす。上掲された先行技術の研究において、これらの研究の一部における限定された数の被験体にのみ、完全または部分的な臨床反応が観察された（非特許文献７、非特許文献８参照）。

改善されたＩＤ送達（すなわち、ＳＣ組織に対する用量の「漏出」を低減または排除すること、および、被験体全体にわたって、より再現性が高い深さ制御を提供すること）が臨床的な効力を改善するかどうかについては、不明確である。限定された数の人間の被験体における輸送（trafficking）の研究を通じて、Ｍｏｒｓｅらは、ＩＶ注射されたＤＣは、肺に、および次いで、肝臓、脾臓および骨髄に局在するが、しかしリンパ節または腫瘍には局在しないことを示唆する（非特許文献１０参照）。同様に、ＳＣ注射されたＤＣは、リンパ節に輸送されなかった。対照的に、本研究におけるＩＤ注射されたＤＣのうちの数パーセントは、リンパ節に対して急速に移動した。より良いリンパ節標的化が、人間におけるＤＣワクチンの効力を改善するかどうかは不明確であるが、しかしながら、マウスにおける研究は、癌を予防または治療することにおいて、リンパ管を標的とする送達経路は、そうでないものよりも効果的であることを示唆している（非特許文献１１、非特許文献１２参照）。

送達経路は、相当な研究および議論の対象となってきているが、そうはいっても、細胞療法に関する他の送達パラメーター（例えば：細胞濃度、流量、送達容量、または針の形状寸法（例えば、ゲージのサイズおよび針の長さ）を含む）の潜在的な効果を調査している報告された研究はない。これらのパラメーターは、先行の研究において幅広く変動し、従って、細胞送達におけるそのようなパラメーターの潜在的な役割を確かめることを不可能にしていた。

従って、効果的かつ、より効率的な治療および細胞に基づく治療法およびワクチンの投与を開発する必要がある。

米国仮出願第６０／４４０，３４８号 米国仮出願第６０／５０４，４８８号 米国特許第６，０７７，５１９号明細書 米国特許第５，８４６，８２７号明細書 米国特許第４，８４４，８９３号明細書 米国特許第４，６９０，９１５号明細書 米国特許第４，３９３，１３３号明細書 米国特許第５，６４８，２１９号明細書 米国特許第５，８３０，６８２号明細書 Surg Oncol Clin N Am 11:645-660(2002)、M. Onaitisら概説 J. Immunol. 166:4254-4259(2001)、L. Fongら Proc Natl Acad Sci, USA、 98:8809-8814(2001)、L. Fongら Cancer Res 61:842-847(2001)、JS Yuら J. Immunotherapy 25:500-508(2002)、Oosterwick-Wakkaら Int J Urology 9:340-346(2002)、T Azumaら Clin Cancer Res 8:1021-1032(2002)、AE Changら Cancer Immunol Immunother 52:41-52(2002)、M Smithersら Chest 106:1463-1465(1994)、Flynnら Cancer Res 59:56-58(1999)、M Morseら Cancer Res 59:3340-3345(1999)、AAO Eggertら British J of Cancer 84:1564-1570(2001)、N Okadaら Cell. Immunol. 9:60-66(1973)、Lundak、RL & Raidt、DJ In Vitro 16:212(1980)、Jessop、NW & Hay、RJ

本発明は、被験体の中へ細胞を送達するための方法を提供する。

被験体は、人間の患者または動物であることができる。本方法は、マイクロニードルによって被験体の皮膚の皮内空間の中へ細胞を投与する工程を含む。細胞は、細胞に基づく治療物質およびワクチンに関連する。細胞に基づく治療物質およびワクチンは、造血細胞治療物質、間葉幹細胞に基づく治療物質、免疫療法、樹状細胞および関連細胞型に基づく治療物質およびワクチン、および島細胞に基づく治療物質を含む。皮膚の皮内空間の中に対するマイクロニードルの垂直挿入によって、細胞に基づく治療物質およびワクチンを送達する。

本発明の方法において、マイクロニードルは、約０ｍｍと１ｍｍとの間の露出した高さ、および約０．３ｍｍから約２．５ｍｍの間の合計の長さを有する中空の針である。好ましくは、マイクロニードルは、約２．５ｍｍ未満の長さを有する中空の針である。最も好ましくは、マイクロニードルは、約１．７ｍｍ未満の長さを有する中空の針である。マイクロニードルによって皮膚の中へ、少なくとも約０．３ｍｍ、および約２．５ｍｍを超えない深さに、細胞に基づく治療物質およびワクチンを送達する。

本発明の方法において使用されるマイクロニードルは、好ましくは２７ゲージ未満、およびより好ましくは、５０ゲージと３０ゲージとの間である。最も好ましくは、マイクロニードルは、３４ゲージと３０ゲージとの間である。また、本発明において、単独のマイクロニードルに加えて、マイクロニードルの配列を使用することもできる。

また、本発明は、マイクロニードルによって被験体の皮膚の皮内空間の中へ細胞に基づく治療物質およびワクチンを投与することによって疾病を治癒または予防するための方法を提供する。細胞に基づく治療物質およびワクチンを、造血細胞治療物質、間葉幹細胞に基づく治療物質、免疫療法、樹状細胞および関連細胞型に基づく治療物質およびワクチン、および島細胞に基づく治療物質からなる群から選択する。細胞に基づく治療物質およびワクチンが、皮膚の中へ、少なくとも約０．３ｍｍ、および約２．５ｍｍを越えない深さに送達されるように、皮膚の皮内空間の中に対するマイクロニードルの垂直挿入によって、細胞に基づく治療物質およびワクチンを送達する。

本発明の方法において使用される樹状細胞および他の細胞を、当業者にとってなじみの任意の適当な手段によって入手および培養することができる。例えば、樹状細胞を、末梢血の白血球除去法および密度勾配遠心法によって入手してもよい。採取の前に樹状細胞を動員するようにＦｌｔ３Ｌで処置した被験体から、樹状細胞を入手してもよい。樹状細胞を、被験体への投与前にサイトカイン（例えば、ＧＭ-ＣＳＦ、ＩＬ-４、ＩＦＮ-γ、ＴＮＦ-α）を用いて生体外で成熟および活性化させてもよく、または、未成熟および非活性化細胞として投与してもよい。

本明細書中に提示される研究は、ＤＣ細胞系の生存度と、ＤＣ機能にとって重要な細胞表面マーカーの発現とに対する、細胞濃度、針のゲージ、針の長さおよび流量の効果を試験した。

本発明は、マイクロニードルによって被験体の皮膚の皮内層の中へ細胞を送達することによって、疾病を治癒または予防するための方法を提供する。被験体は、一般に哺乳動物、より具体的には人間を含む。細胞は、細胞に基づく治療物質およびワクチンに関連し、および、完全な細胞または形質転換細胞、または細胞構成要素（例えば、膜断片、小胞、エキソソーム、デキソソーム（dexosomes））のいずれかであることができる。

皮膚の皮内層は、細胞に基づく治療物質およびワクチンの送達にとって理想的な標的である。皮内層は、リンパの排出流路と密集した毛細管床との両方に富み、血液循環への接近を可能にする。リンパ系および血液を標的にする細胞に基づく治療物質およびワクチンは、皮内層の中への適切な送達の恩恵を受けるであろう。例えば、樹状細胞に基づく治療物質およびワクチンは、抗原特異的な免疫応答を開始することができるリンパ組織への接近方法を有する必要がある。皮内層の中のリンパの排出系への直接的な接近は、慣用の筋肉内または皮下組織を通じるよりも効果的な、樹状細胞ベースの治療物質およびワクチンを投与する方法である。

さらに、皮内層において、神経末端は、皮内層の内側のより深い層に位置する。従って、マイクロカニューレ／マイクロニードルの先端が神経末端と接触を有さず、および結果として、患者が痛みを感じないように、本発明において、皮内層の上部の層の中への治療物質およびワクチンの最初の挿入および送達が好ましい。効果的であるために、樹状細胞を基礎とする治療物質およびワクチンの多くは、脈管系よりもむしろリンパ節に対する接近方法を有することを必要とする。本発明では、皮膚の表面下、少なくとも約０．３ｍｍから約２．５ｍｍ以下までの中へ、細胞に基づく治療物質およびワクチンを送達する。好ましくは、皮膚の表面下０．５ｍｍから２ｍｍまで、細胞に基づく治療物質およびワクチンを送達する。治療物質およびワクチンの静脈内（Ｉ．Ｖ．）送達は、皮内組織の中への送達ほど効果的および効率的ではない。いくつかの場合では、Ｉ．Ｖ．送達は、活性化よりむしろ患者の中の免疫寛容を誘導する可能性がある。

その上、樹状細胞治療法およびワクチンの皮内送達は、特殊化された微環境の中に樹状細胞を置く。そのような送達方法は、適切なサイトカイン、ケモカイン、および他の関連因子を有する微環境の中に樹状細胞を置いて、リンパ節の効果的な標的化を保証し、および、記憶Ｔ細胞を再活性化するだけでなくナイーブ休止Ｔ細胞を刺激するために、樹状細胞が活性化されたままであることを可能にした。

本発明の方法は、リンパ系および脈管系を標的とする細胞に基づく治療物質およびワクチンために有用である。なぜなら、皮内送達は、リンパ排出系および毛細管系への接近方法を提供するからである。本発明の方法において使用することができる細胞に基づく治療物質およびワクチンは、造血細胞治療物質、間葉幹細胞に基づく治療物質、免疫療法、樹状細胞および関連細胞型に基づく治療物質およびワクチン、および島細胞に基づく治療物質を含むが、しかしそれらに限定されない。

治療物質およびワクチンの皮内送達は、マイクロカニューレの形態の、および好ましくは、所定の組織深さへの送達を制限する深さを限定する特徴部を用いるマイクロニードルの垂直挿入によって成し遂げられる。該送達方法は、慣用のマントー技術よりも実施が容易であり、および送達の深さに関するより良い制御を有する、より再現性が高い皮内送達を提供する。

治療物質およびワクチンの垂直挿入および皮内送達のためのマイクロニードルは、慣用の針と比べて、低減された直径、短縮された斜角面長さ、および短縮された全体的な針長さを有する。本発明の送達方法において使用されるマイクロニードルは、約０ｍｍと１ｍｍとの間の露出した高さ、および約０．３ｍｍと約２．５ｍｍとの間の全長を有する中空の針である。好ましくは、針は、約２．０ｍｍ未満である。より好ましくは、長さは約１．７ｍｍ未満である。マイクロニードルは、単独の３０ゲージの針であることができる。好ましくは、マイクロニードルは、５０ゲージと３０ゲージとの間である。より好ましくは、マイクロニードルは、３４ゲージと３０ゲージとの間である。同一サイズまたはいろいろなサイズのマイクロニードルの配列を使用してもよい。適当に設計されたマイクロニードルの配列は、生体内における皮内送達に付随する高い圧力を克服することを可能にするであろう。マイクロニードルの各々は、上記の記述に従う配置を有するであろう。

送達前または送達の間、マイクロニードルに接続される貯蔵器の中に、細胞に基づく治療物質およびワクチンを貯蔵することができる。また、細胞に基づく治療物質およびワクチンを、所望の時間にわたって生きたままおよび活性化されたまま保つために、貯蔵器の中に好適な媒体（medium）を含んでもよい。

マイクロニードルを通じて細胞に基づく治療物質およびワクチンをポンプ送液（pumping）するための慣用手段を使用してもよい。例えば、医療産業において一般的に使用され、適当な直径を有するシリンジをマイクロニードルに密閉接続してもよく、またはこの目的のために小型ポンプを使用してもよい。あるいはまた、細胞に基づく治療物質およびワクチンを貯蔵器中に密閉封止してもよく、および貯蔵器に圧力を加える任意のものによってポンプ送液することができる。マイクロニードルとポンプ送液するための手段とを、直接的に接続してもよく、またはカテーテル管のような何らかの接続手段を通じて接続してもよい。任意選択的に、マイクロニードルおよびカテーテルの配管をポリマーまたは他の物質、例えば血清タンパクで被覆して、特に、低速の長期間にわたる送達の間、表面に粘着することを予防または粘着する細胞の数を低減してもよい。

細胞に基づく治療物質およびワクチンの皮内送達のための本発明は、多数の利点を有する：
第１に、本発明は、皮内送達を通じたリンパの排出系の改善された標的化を提供する。このことから、治療を、より少ない細胞で実施することができ、および用量低減が可能になる。加えて、所望の療法に依存して、細胞の局在化される送達または全身性の送達を達成することができる。

第２に、本発明の方法は、自己由来的に得られる樹状細胞のための精製工程である白血球除去法の必要性を、排除または低減する。典型的には、白血球除去法は、自己由来の樹状細胞を精製するために、患者からの全血に関して実施される。樹状細胞の成熟および活性化にとって適切な微環境への送達と組み合わされるリンパの排出系のよりよい標的化は、そのような精製工程を不必要にする可能性がある。自己由来の療法の全体を、大いに単純化することができる。

第３に、本発明の方法は、治療効果のあるタンパク質を生成する細胞のＩＤ送達を介する全身性の薬物療法を提供する；例えば、インシュリンを生成する島細胞を皮内空間へ送達して、糖尿病患者を治療してもよい。

本発明の１つの好ましい実施形態において、送達速度および他の生体力学的因子を制御する微量注入器（microinfusor）または同様の装置を介して、治療効果のある細胞を送達する。再現性のあるＩＤ送達のために、該装置は、針の長さと深さ限定性のハブの場所とによって決定される深さまで皮表に対して垂直に挿入される細ゲージのカニューレ（例えば、３０Ｇａから３４Ｇａ）を含むべきである。

以下の例は、説明的であるが、しかし本発明の範囲を限定しない。本発明の範囲から逸脱することなしに、本発明において当業者に思いつくような妥当な変形を行うことができる。

［実施例１］マイクロニードル送達の後の細胞生存度
目的：
皮内送達のために設計されたマイクロニードルを通じて生体外に細胞を送達し、およびそのような送達の後の生存度に関してテストした。
方法:
１．実験材料
ａ．マイクロニードル。１ｍｍ長の長さを有する３４ゲージのマイクロニードルを使用した。
ｂ．細胞系。Ｐ８１５細胞系は、抗原提示の研究のためのモデル系としてしばしば用いられるマウスの肥満細胞腫由来の細胞系である（非特許文献１３参照）。特に、Ｐ８１５細胞を、伝染性疾病または癌のためのワクチンの中に用いられるような特異的な抗原をコード化する遺伝物質でトランスフェクトすることができ、または、直接的に、そのような抗原をロードすることができる。次いで、これらのＰ８１５細胞を用いて、生体外でＴ細胞を刺激することができる。

この実験のためのＰ８１５細胞は、樹状細胞および関連ランゲルハンス細胞と同様のサイズである非付着性円形細胞（non-adherent rounded cells）上で直径１０〜１５μｍのサイズを有した。この例では、Ｐ８１５細胞を、生体外の研究のためのモデル細胞治療物質として用いた。

２.実験工程
本実験において、以下の工程を続けた：
（１）多くの臨床的な設定において使用される濃度を模する様々な濃度で、Ｐ８１５細胞の浮遊液を作製した。第１表を参照のこと。
（２）約３インチ長のカテーテル管に接続される３４ゲージ１ｍｍ長のステンレス鋼製マイクロニードルに接続された１ｃｃのシリンジの中へ、細胞浮遊液を装填した。
（３）１００μｌと２００μｌとの間の細胞浮遊液を、急速なボーラススタイルの注射にとって典型的な速度で、約５から１０秒で送達し、およびマイクロニードルを通じて流した。

３．結果の記録および評価
ビデオマイクロスコピーによってマイクロニードルを監視した。送達前後に、トリパンブルー染色によって細胞生存度を評価した。トリパンブルー染色の結果に基づいて、生存度のパーセンテージを計算した。
結果：
１．取り込まれたビデオマイクロスコピーにおいて表示されるように、送達の間に、細胞集塊またはマイクロニードルの閉塞はなかった。
２．送達前後の細胞の生存度を表１に示す。

第１表に示されるように、細胞がマイクロニードルを通過した前後で、細胞生存度に有意な変化はなかった。

結論：
本発明の方法に従って、生体外において、細胞生存度を乱すことおよび細胞集塊またはマイクロニードルの閉塞を起こすことなく、効果的に、モデル細胞に基づく治療物質およびワクチンを、マイクロニードルを通過させることができた；生体内において、同様の結果が予想される。また、例えば、不死化樹状細胞系（以下の実施例２を参照のこと）、肝細胞癌細胞系（ＨｅｐＧ２、特許文献７に記載される）、および膵臓腫瘍細胞系（ＡＲ４２Ｊ、非特許文献１４に記載される）を含む他の細胞型についても同様の結果が得られている。従って、当業者は、本発明が多様な特徴を持つ様々な細胞型に対して適用可能であることを、正しく認識するであろう。

［実施例２］マイクロニードル送達の後の樹状細胞生存度
目的：
皮内送達用に設計された２つの異なる型のマイクロニードル（３０Ｇａおよび３４Ｇａの針)を通じて、樹状細胞系（ＪＡＷＳ−ＩＩ、特許文献８および特許文献９に記載される）を送達し、およびそのような送達の後の生存度および機能細胞表面マーカーの発現に関してテストした。比較のために、標準的な２７Ｇａの針を通じた送達を含めた。
方法：
１．実験材料
ａ．針およびマイクロニードル：細胞を、ａ）標準的な２７Ｇａの針、ｂ）３０Ｇａ、１．５ｍｍ長のステンレス鋼製マイクロニードル、またはｃ）３４Ｇａ、１．０ｍｍ長のステンレス鋼製マイクロニードルを通じて送達した。
ｂ．細胞系。これらの研究のために、マウスのＪＡＷＳ−ＩＩ細胞系（特許文献８および特許文献９に記載される）を使用した。送達に先立って、特許文献８および特許文献９に記載されるように、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＴＮＦ−αおよびＧＭ−ＣＳＦで２４時間にわたって細胞を活性化した。

２．実験工程
本実験において、以下の工程を続けた：
（１）多くの臨床的な設定において使用される濃度を模した様々な濃度（２０、４０または８０×１０⁶細胞／ｍｌ）で、ＪＡＷＳ細胞の浮遊液を作製した。第２表参照のこと。
（２）約３インチ長のカテーテル管に接続されるａ）標準的な２７Ｇａの針、ｂ）３０Ｇａ、１．５ｍｍ長のステンレス鋼製マイクロニードル、またはｃ）３４Ｇａ、１．０ｍｍ長のステンレス鋼製マイクロニードルに接続された１ｃｃのシリンジの中へ、細胞浮遊液を装填した。
（３）３つの異なる流量：ａ）手動のボーラス送達（２７Ｇａおよび３０Ｇａの針に関して約３０００〜６０００μｌ/分、および３４Ｇａのマイクロニードルに関して約７００〜１０００μｌ／分に及ぶ)、ｂ）ハーバードシリンジポンプによって制御される１００μｌ／分の流量、またはｃ）ハーバードシリンジポンプによって制御される４００μｌ／分の流量のうちの１つで、約２００μｌの細胞浮遊液を送達した。

３．結果の記録および評価
送達前後に、トリパンブルー染色と７−アミノ-アクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ）に関するフローサイトメトリー染色とによって、細胞生存度を評価した。
結果：
送達前後の細胞の生存度を第２表に示す。

^*単独の点の値。他の値は全てｎ＝２。
^**培養：培養から直の、すなわち、カニューレを通じた通過がなく、および氷上での保管がない細胞生存度を示す。
^***コントロール：送達の研究の長さにわたって氷上で保存されたが、しかしカニューレを通じて送達されなかった細胞に関する細胞生存度を示す。
ｎｄ：未試験（not done）。

これらの研究では、カニューレの閉塞が観察されることなく、２７Ｇａおよび３０Ｇａの針を通じて全３濃度のＪＡＷＳ細胞が全３送達速度で送達された。加えて、２７Ｇａおよび３０Ｇａのカニューレを通じた送達の後の、トリパンブルー染色と７−ＡＡＤ染色との両方に基づく細胞生存度に、差異はなかった。さらに、２７Ｇａおよび３０Ｇａのカニューレを通じた送達の後の、ＤＣの機能に関与する細胞表面マーカー（ＣＤ５４およびＣＤ１１ｃ）の発現に、差異はなかった。従って、細胞の送達において、本発明において記載されるような３０Ｇａのマイクロニードルは、標準的な２７Ｇａの針と同じくらい効果的である。２７ゲージの針は、マントー技術に従う皮内注射のために一般的に使用されるが、しかし、長い斜角面の長さおよび付随する皮膚からの用量の漏れにより、皮表に対して垂直に針を挿入する皮内送達の方法に従って用いることができない。加えて、２７Ｇａの針を用いるマントー技術に従う皮内送達は、しばしば、ＳＣ組織の中への薬用量の漏出および患者の痛みを付随する。患者の痛み知覚を伴わない深さを限定するハブ特徴部のカニューレの長さおよび場所によって制御される再現性のある皮内送達のために、本発明の３０Ｇａの針を設計する。

３４Ｇａのマイクロニードルに関して、一定の条件下で、細胞生存度にいくらかの低減が観察された。一般に、細胞生存度に低減が観察された３つの細胞濃度の全てにおいて、瞬間的なマイクロニードルの閉塞があった；２０×１０⁶細胞／ｍｌにおいて、４００μｌ／分の送達速度で１／２のマイクロニードルが閉塞した。４０×１０⁶細胞／ｍｌにおいて、１００μｌ／分および４００μｌ／分の流量の両方で２／２のマイクロニードルが閉塞した。８０×１０⁶細胞／ｍｌにおいて、送達を手によって実施した群において１／２のマイクロニードルが閉塞し、一方、テストした４００μｌ／分の速度では、閉塞が観察されなかった。１００μｌ／分の速度において、２／２のマイクロニードルが閉塞し、および約１００μｌのみが送達された。このように、３４Ｇａのマイクロニードルを通じて投与した場合、細胞の濃度が２０〜８０×１０⁶細胞／ｍｌまで増加したとき、全ての送達速度に関して％生存度が減少した。

結論：
樹状細胞由来の細胞系、ＪＡＷＳ ＩＩは、３０Ｇａのマイクロニードルを通じて効果的に送達され、細胞生存度または細胞表面マーカーの発現に結果として生じる損失がなく、慣用の２７Ｇａの針を用いて得られる結果と同様の結果を有した。３４Ｇａのマイクロニードルを通じて投与する場合、これらの細胞の生存度は細胞濃度に依存し、それによって、細胞濃度を２０〜８０×１０⁶細胞／ｍｌまで増加させる場合、細胞生存度の低減が観察される。

［実施例３］生体内における皮内送達の後の細胞分布
目的：
マイクロニードルを用いて生体内において投与される細胞の分布パターンを特徴付ける。
方法：
１．使用したモデル系
皮内注射のためにブタを使用した。ブタの皮膚は、人間の皮膚として十分に受け入れられるモデルを代表する。モデル細胞系として、実施例１に記載されるＰ８１５細胞を使用した。

２．実験工程
３４ゲージのマイクロニードル（長さ１ｍｍ）によって、Ｐ８１５細胞を皮内送達した。細胞を４０×１０⁶細胞／ｍｌの濃度に浮遊させた。ボーラス注射を介して、約１分間の時間をかけて、合計０．１ｍｌ（４×１０⁶細胞）を投与した。

３．結果の評価
ブレブを消散させた直後に、全厚さの皮膚の生検材料を採集し、および組織切片化およびヘマトキシリン・エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色のために処理をした。光学顕微鏡の観察にて写真を撮影した。

４.結果
図１は、マイクロニードルによる皮内送達の後のＰ８１５細胞の分布パターンを表示する。Ｈ＆Ｅ染色された画像において、その高い濃度および局在化される送達のために、Ｐ８１５細胞は、組織の中の常在細胞よりも濃くおよび密に詰められているように見える。分布パターンは、約０．３ｍｍの深さから約１.０ｍｍの深さまでの送達を説明する（図１ａ)。加えて、細胞は、ボーラス注射の位置から放射状に間隔を空けた排出流路であると思われるものの中に顕著であった（図１ｂにおける矢印を参照のこと)。

５．結論：
本発明の皮内送達の方法は、生体内において細胞を送達するのに効果的であった。細胞は、マイクロニードルを通じて効果的に送達され、および集塊も破裂もせず、かつマイクロニードルを閉塞しなかった。本発明のＩＤ送達の方法は、浅いＩＤ組織に局在化される細胞をもたらし、および送達部位からの細胞の急速な排出およびクリアランスに関する証拠があった。マイクロニードル送達によって提供される皮膚の内部の細胞の浅い分布は、２７Ｇａの針およびマントー技術を使用して再現可能的に達成することができない。

［実施例４］リンパの排出経路の直接的な標的
目的：
送達効率および皮膚の中のリンパの排出経路の直接的な標的に関して、本発明の細胞に基づく治療物質およびワクチンの皮内送達を、生体内においてテストした。
方法：
１．使用したモデル系
皮内注射のためにブタを使用した。皮内送達に関して、様々なサイズ（０．０２７〜１５μｍの範囲）の蛍光ビーズを使用し、および顕微鏡下での観察を容易にした。様々なサイズの細胞または細胞由来の構成要素（例えば、膜断片、小胞、エキソソーム、デキソソーム）のための代理マーカーとして、様々なサイズの蛍光ビーズを使用した。ＤＣのような治療用細胞は、典型的には、直径約１０〜５０μｍの範囲内である一方、膜断片、小胞、エキソソームおよびデキソソームのような治療効果のある細胞由来の構成要素は、典型的には遙かに小さく、および直径約０．０５〜２．０μｍの範囲内である。

２．実験工程
３４ゲージのマイクロニードル（長さ１ｍｍ）によって蛍光ビーズを皮内送達した。３インチのカテーテルラインおよび１ｃｃのシリンジに対して取り付けられたマイクロニードルを使用して、約１０から２０秒の間をかけて、１００μｌの容量の送達をおこなった。

３．結果の評価
送達後３０分、全厚さの皮膚の生検を実施し、および送達部位から採集し、およびＨ＆Ｅ染色および蛍光顕微鏡検査法のための処理をした。光学顕微鏡の観察にて写真を撮影した。

結果：
図２〜７に結果を示す。
図２では、推定される針挿入点および推定される針跡に沿ったビーズの跡を、ビーズおよび矢印によって示す。ビーズ直径は２．０μｍである；倍率は２０倍である。約２００，０００個の細胞を投与した。

図３は、典型的なブレブ、およびブレブから外側に放射状に広がるビーズの直線状の跡におけるビーズの濃度示す。ビーズ直径は２．０μｍである；倍率は４０倍である。

図４は、図３よりさらに詳細に、左側に見える皮内流体ブレブを示し、一方、ビーズの直線状の跡は、実質的に皮内ブレブ部位から離れた右側に存在する。ビーズ直径は２．０μｍである；倍率は６０倍である。

図５ａおよび５ｂは、送達後の皮内層におけるビーズの分布を示す。図５ｂは、皮内層内部の毛細血管系およびリンパ排出系の適切な標的をビーズによって示す。ビーズ直径は２．０μｍである；倍率は２０倍である。

図６は、皮膚の真皮層の上部の層、リンパ排出系および毛細血管系のための標的区域におけるビーズの分布を示す。表皮層は、より濃く染色された最上部の薄い層によって明確に区別される。ビーズ直径は０．０２７μｍである；倍率は１０倍である。約５００，０００個のビーズを投与した。

図７は、皮膚の真皮層の上部の層、リンパ排出系および毛細血管系のための標的区域におけるビーズの分布をさらに詳細に示す。ビーズ直径は０．０２７μｍである；倍率は２０倍である。

また、より大きなビーズ（１０〜１５μｍ）で同様の結果が観察され、このサイズ範囲内の細胞型は同様の分布パターンを呈するであろうことが示唆された。

蛍光ビーズが、マイクロニードルを介する皮内送達の後に、排出性リンパ節（ＤＬＮ）を標的とすることを実証するために、様々なサイズのビーズをマウスに注射した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスの下部背側領域の中に対して、３４Ｇａ、露出長さ１ｍｍの針を用いて、ＦＩＴＣ標識されたビーズをＩＤ注射した。２つのサイズ（０．０５μｍおよび０．１μｍ）の５００，０００個のビーズを、下部背側領域の両側面の中へ注射した（側面あたり３０μｌすなわちマウスあたり合計６０μｌ（時点あたりマウス２匹すなわち４ＤＬＮ））。指定された時点において、ＤＬＮを切除し、および単独の細胞浮遊液を調製し、および、１．０ｍｌのＤＬＮ浮遊液を分類することによって、ＦＡＣＳＶａｎｔａｇｅ上のＦＩＴＣ陽性シグナルに関して分類した。ビーズの合計の数は、ＤＬＮあたりに基づく。各ビーズサイズに関して、連続的に希釈されるビーズ数と混合されるナイーブＤＬＮで構成される標準的な曲線を生成し、バックグラウンド／自己蛍光を超えて検出可能な最小シグナルを測定した。０．０５μｍおよび０．１μｍのビーズの両方が、ＩＤ注射から数分以内にＤＬＮの中に観察され、約１５分以内に最大数に達した（図８）。

別個の研究において、より大きなサイズのビーズを試験した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスの下部背側領域の中に対して、３４Ｇａ、露出長さ１ｍｍの針を用いて、ＦＩＴＣ標識されたビーズをＩＤ注射した。２サイズ（１．０μｍおよび１０μｍ）の１，０００，０００個のビーズを、下部背側領域の両側面の中へ注射した（側面あたり３０μｌすなわちマウスあたり合計６０μｌ（時点あたりマウス２匹すなわち４ＤＬＮ））。指定された時点において、ＤＬＮを切除し、および単独の細胞浮遊液を調製し、および、１．０ｍｌのＤＬＮ浮遊液を分類することによって、ＦＡＣＳＶａｎｔａｇｅ上のＦＩＴＣ陽性シグナルに関して分類した。ビーズの合計の数は、ＤＬＮあたりに基づく。各ビーズサイズに関して、連続的に希釈されるビーズ数と混合されるナイーブＤＬＮで構成される標準的な曲線を生成し、バックグラウンド／自己蛍光を超えて検出可能な最小シグナルを測定した。１．０μｍおよび１０μｍのビーズの両方が、ＩＤ注射から数分以内にＤＬＮの中に観察され、約３０分以内に最大数に達した。より小さいサイズのビーズから１５分のシフトがあり、ビーズサイズが増大するにつれてＤＬＮへの移動時間が増加することを示す。

前実施例は、本発明の皮内送達方法が、生体内において、分布を容易にするように、細胞の治療物質およびワクチン、および細胞由来の治療物質およびワクチン（例えば、膜断片、小胞、エキソソーム、デキソソーム）と同様のサイズのビーズを送達するのに効果的であり、およびビーズの集塊も破裂も起きず、かつマイクロニードルの閉塞も起きなかったことを実証する。さらに、本発明の皮内送達方法は、リンパの排出経路およびＤＬＮを含む標的区域に対してマイクロビーズを送達することに効果的である。加えて、マイクロビーズの実験は、薬物およびワクチン調合物の中に一般に使用されるもののようなミクロ粒子およびナノ粒子を用いて、同様の分布およびクリアランスのパターンを達成することができることを実証する。

［実施例５］マイクロニードルを通じた細胞送達に付随する圧力プロファイル
本発明は、流量、細胞濃度および送達容量のようなパラメーターを制御する様々なサイズのカニューレを通じた細胞療法のための細胞送達方法を説明する。現行のＤＣ療法の限定された成功は、少なくとも部分的に、人間の臨床試験におけるこれらのパラメーターの考慮の不足のためである可能性がある。本発明は、流量、細胞濃度、送達容量、およびカニューレサイズを操作して、細胞生存度および免疫学的機能を改善するための方法を説明する。

ＤＣのような細胞治療物質は、典型的には、サイズが約１０μｍから約５０μｍまで及ぶが、しかしながら、実際のサイズは、実質的に、細胞の成熟/活性化の状態、および細胞間の細胞凝集の程度によって変動することがあり得る。細胞療法のために使用される標準的なカニューレは、典型的には、およそ２３〜２７Ｇａであり、第３表に提示されるような内径を有する。

以下の実施例では、生体外において、ＤＣ系の送達に付随する圧力プロファイルに関して、表３に表示される様々な針を試験した。マウスのＤＣ系（上記のように、ＪＡＷＳ ＩＩ、ＣＲＬ１１９０４、ＡＴＣＣ）を、標準的な組織培養条件の中に保持し、および、次いで、ハーバードシリンジポンプを介して制御される流量および容量でのカニューレを通じた送達に先立って、３つの細胞濃度（８０、４０、２０×１０⁶細胞／ｍｌ)とした。インライン圧力変換器中を、細胞溶液を通過させた。

１００μｌ／分の流量に関する圧力プロファイル
１００μｌ／分の流量において、圧力は、カニューレ直径が減少するにつれて増大した。ピーク圧力は、１６Ｇａのカニューレに関して約５ｍｍＨｇ程度と低く、および３４Ｇａのカニューレに関して約１００ｍｍＨｇ程度と高かった（図１０）。全３細胞濃度の全体にわたって、同様の結果が観察された。

４００μｌ／分の流量に関する圧力プロファイル
また、４００μｌ／分の流量においても、圧力は、カニューレ直径が減少するにつれて増大した。１６Ｇａおよび２３Ｇａのカニューレに関しては、１００μｌ／分と比べて、４００μｌ／分において観察された圧力に大きな差異はなかった。しかしながら、２７Ｇａ、３０Ｇａおよび３４Ｇａのカニューレに関しては、大きい方の流量において、送達に付随する圧力に著しい増大があった（図１１）；概して、大きい方の流量は、細胞濃度に関わらず、これらのカニューレに関するピーク圧力に３倍に近い増大を伴った。ピーク圧力は、３４Ｇａのカニューレに関して約４５０ｍｍＨｇ程度と高かった。３４Ｇａのマイクロニードルを通じた細胞の送達に付随する高い圧力は、これらのカニューレ（第２表）を使用する一定の送達条件下で観察される細胞生存度の減少に少なくとも部分的に関連する可能性がある。

図１ａは、蛍光顕微鏡によって撮影された、ブタの皮膚における皮内送達の後のＰ８１５細胞の分布を示す写真（倍率１０倍）である。 図１ｂは、蛍光顕微鏡によって撮影された、ブタの皮膚における皮内送達の後のＰ８１５細胞の分布を示す写真（倍率２０倍）である。 図２は、蛍光顕微鏡によって撮影された、ブタの皮膚における皮内送達の後の蛍光ビーズの分布を示す写真（ビーズ直径２．０μｍ；倍率２０倍）である。 図３は、蛍光顕微鏡によって撮影された、ブタの皮膚における皮内送達の後の蛍光ビーズの分布および移動を示す写真（ビーズ直径２．０μｍ；倍率４０倍）である。 図４は、蛍光顕微鏡によって撮影された、ブタの皮膚における皮内送達の後の蛍光ビーズの分布および移動をさらに詳細に示す写真（ビーズ直径２．０μｍ；倍率６０倍）である。 図５ａは、蛍光顕微鏡によって撮影された、ブタの皮膚における皮内送達の後の蛍光ビーズの分布を示す写真（ビーズ直径２．０μｍ；倍率２０倍）である。 図５ｂは、蛍光顕微鏡によって撮影された、ブタの皮膚における皮内送達の後の蛍光ビーズの分布を示す写真（画像は、図５ａ中に提示されたもののすぐ下、および部分的に重なり合う組織を表す。ビーズ直径２．０μｍ；倍率２０倍）である。 図６は、蛍光顕微鏡によって撮影された、ブタの皮膚における皮内送達の後の蛍光ビーズの分布および移動を示す写真（ビーズ直径０．０２７μｍ；倍率１０倍）である。 図７は、蛍光顕微鏡によって撮影された、ブタの皮膚における皮内送達の後の蛍光ビーズの分布および移動をさらに詳細に示す写真（ビーズ直径０．０２７μｍ；倍率２０倍）である。 図８は、マウスの皮膚における皮内送達の後の、排出性リンパ節における蛍光ビーズの取り込みを、送達後の様々な時間において示すグラフ（ビーズ直径０．０５μｍおよび０．１μｍ。排出性リンパ節において、フローサイトメトリーによって蛍光ビーズを検出した）である。 図９は、マウスの皮膚における皮内送達の後の、排出性リンパ節における蛍光ビーズの取り込みを、送達後の様々な時間において示すグラフ（ビーズ直径１μｍおよび１０μｍ。排出性リンパ節において、フローサイトメトリーによって蛍光ビーズを検出した）である。 図１０は、１００μｌ／分の流量において、様々な針を通じて送達された、異なる濃度でのＪＡＷＳ ＤＣ細胞系の送達に付随する圧力プロファイルを示すグラフである。 図１１は、４００μｌ／分の流量において、様々な針を通じて送達された、異なる濃度でのＪＡＷＳ ＤＣ細胞系の送達に付随する圧力プロファイルを示すグラフである。

Claims (30)

1. 人間または動物に対して細胞を送達するための方法であって、前記方法は少なくとも１つの小ゲージのカニューレまたは針を通じて前記細胞を皮内投与することを含み、前記カニューレまたは針は３０ゲージと３４ゲージとの間であり、該細胞は２０〜１００×１０⁶細胞／ｍｌの濃度で投与されることを特徴とする方法。
2. 前記カニューレまたは針が３０ゲージであることを特徴とする請求項１に記載の方法
3. 前記カニューレまたは針が３４ゲージであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
4. 前記細胞が樹状細胞であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
5. 前記細胞が嵌合樹状細胞であることを特徴とする請求項４に記載の方法。
6. 前記細胞が未成熟樹状細胞であることを特徴とする請求項４に記載の方法。
7. 前記細胞が成熟樹状細胞であることを特徴とする請求項４に記載の方法。
8. 前記細胞が０．３から２．５ｍｍの深さにおいて皮膚の中へ送達されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
9. 前記細胞が１００μｌ／分と４００μｌ／分との間の流量で送達されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
10. 前記細胞が１００μｌ／分未満の流量で送達されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
11. 前記細胞が４００μｌ／分超の流量で送達されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
12. 前記細胞が８０×１０⁶細胞／ｍｌ未満の濃度で投与されることを特徴とする請求項３に記載の方法。
13. 前記細胞が４０×１０⁶細胞／ｍｌ未満の濃度で投与されることを特徴とする請求項３に記載の方法。
14. 前記細胞が２０×１０⁶細胞／ｍｌの濃度で投与されることを特徴とする請求項３に記載の方法。
15. 前記動物が哺乳動物であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
16. 哺乳動物における疾病または障害の治療または予防のための方法であって、前記方法は少なくとも１つの小ゲージのカニューレまたは針を通じた細胞の皮内送達を含み、該細胞は２０〜１００×１０⁶細胞／ｍｌの濃度で投与されることを特徴とする方法。
17. 前記カニューレまたは針が３０ゲージと３４ゲージとの間であることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
18. 前記カニューレまたは針が３０ゲージであることを特徴とする請求項１７に記載の方法。
19. 前記カニューレまたは針が３４ゲージであることを特徴とする請求項１７に記載の方法。
20. 前記細胞が樹状細胞であることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
21. 前記細胞が嵌合樹状細胞であることを特徴とする請求項２０に記載の方法。
22. 前記細胞が未成熟樹状細胞であることを特徴とする請求項２０に記載の方法。
23. 前記細胞が成熟樹状細胞であることを特徴とする請求項２０に記載の方法。
24. 前記細胞が０．３から２．５ｍｍの深さにおいて皮膚の中へ送達されることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
25. 前記細胞が１００μｌ／分と４００μｌ／分との間の流量で送達されることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
26. 前記細胞が１００μｌ／分未満の流量で送達されることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
27. 前記細胞が４００μｌ／分超の流量で送達されることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
28. 前記細胞が８０×１０⁶細胞／ｍｌ未満の濃度で投与されることを特徴とする請求項１９に記載の方法。
29. 前記細胞が４０×１０⁶細胞／ｍｌ未満の濃度で投与されることを特徴とする請求項１９に記載の方法。
30. 前記細胞が２０×１０⁶細胞／ｍｌの濃度で投与されることを特徴とする請求項１９に記載の方法。
    

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