CN104473703A - 一种输尿管结扎诱导的非人灵长类动物肾纤维化模型的建立和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种输尿管结扎诱导非人灵长类动物肾纤维化模型的建立方法及应用。具体技术方案为：用麻醉剂麻醉实验猴，并维持手术麻醉；实验猴腹部消毒后沿腹中线切开，打开腹腔；暴露手术视野,顺沿单侧输尿管，在单侧肾下缘处以手术丝线于输尿管结扎两道，完全阻断该单侧输尿管；保留另一侧肾脏不结扎，作为自体对照；消毒手术切口后分层缝合伤口；在结扎后不同时间点，采取生物样品测量肾纤维化的指标；或取下左肾和右肾，于中性甲醛溶液中固定；甲醛固定肾样本进行组织切片和病理检查。本发明的动物模型具有现有啮齿类和兔动物模型无法实现的应用价值，本发明建立的非人灵长类动物模型在纤维化的各相关领域有广泛的用途。

Description

一种输尿管结扎诱导的非人灵长类动物肾纤维化模型的建立和应用

技术领域

本发明涉及疾病的动物模型建立，具体涉及一种输尿管结扎诱导非人灵长类动物肾纤维化模型的建立方法及应用。

背景技术

肾脏纤维化是一种病理生理改变，特征包括细胞外基质(ECM)的异常沉积、肾小球硬化和间质纤维化，是所有肾病的终末期表现。肾脏由于受到创伤、感染、炎症、血循环障碍、以及免疫反应等各种致病因素刺激，造成细胞受损，引起肾实质巨噬细胞浸润。巨噬细胞释放细胞因子促使肾小管凋亡和成纤维细胞活化增殖，而肾小管细胞凋亡和坏死造成肾小管坏死和形成无小管肾小球。继而引起肾实质细胞表型变化，产生大量肌成纤维细胞，造成大量胶原沉积和积聚，使得肾实质逐渐硬化，形成瘢痕，直至肾脏完全丧失功能。肾纤维化通常是一个长期的过程，发病可以见于任何年龄阶段，成年人肾纤维化的主要原因是肥胖，糖尿病和高血压，其他原因包括肾毒性药物和感染等等。

目前肾纤维化的动物模型通常建立在啮齿类和兔实验动物上，但是，由于这些实验动物在进化关系、肾脏的组织结构和生化、以及造成的肾纤维化病变等与人类相距甚远，以其为研究对象所获得的实验数据对现实指导意义不大。实践表明，使用啮齿类动物和兔肾纤维化模型产生的实验结果在临床实验中很难得到验证，以此模型数据为基础进行药物开发的成功率亦较低。非人灵长类的解剖特点、各系统生理生化功能、病理变化、疾病症状、以及对治疗药物的反应性等与人类极为相近，是进行肾纤维化相关疾病研究、治疗、和进行药物临床前有效性和安全性评价的敏感动物。

随着肾纤维化发病分子细胞机制研究的不断深入，已经发现并确认多种抗肾纤维化的新药靶点。非人灵长类动物和人类的亲缘相近，靶点的结构和生物系统相似，可以提供很好的交叉反应性。因此建立非人灵长类肾纤维化模型可以满足肾纤维化治疗药物临床前评价的迫切需要，利用模型对肾纤维化研究的数据、对肾纤维化疾病诊断和治疗方案的评估等具有重要的临床应用指导意义。

发明内容

本发明建立了一种单侧输尿管结扎诱导的非人灵长类动物肾纤维化模型的方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：

a、麻醉实验猴，局部手术消毒后沿腹中线切开，打开腹腔，暴露手术视野；

b、顺沿单侧输尿管，在单侧肾下缘处以手术丝线于输尿管结扎两道，完全阻断该侧输尿管；

c、消毒手术切口后分层缝合伤口；

d、在不同时间点，采取样品(血液、尿液、组织等)测量肾纤维化的指标；

e、或取下左肾和右肾，于中性甲醛溶液中固定，进行组织切片和病理检查；

本发明的模型建立方法是利用猴子，结扎其单侧输尿管来诱导肾纤维化过程，同时保留另一侧肾脏的正常功能，作为自体对照，提供了正常肾脏纤维化水平的基础数据。同啮齿类动物以及兔相比，猴输尿管结扎后诱导的肾脏纤维化病变较为缓慢，其病理改变同人肾纤维化的病理特征相似，更符合人类肾纤维化病变过程。由于本方法诱导产生的肾病病变随时间慢性发展，该猴模型可以在不同病程时建立观察点，以利于纤维化病的研究和评估抗纤维化药物的效果。另外，该诱导的猴模型在建立单侧肾脏纤维化的不同病程时，可以手术摘除另一侧肾，使该猴依靠单侧纤维化的肾脏功能，则该模型可以直接用于肾纤维化病、肾功能缺失补偿及替代、以及抗纤维化药物的研究和评估。

本发明结合中国实验猕猴动物大量存栏的现状，在反复研究积累经验的基础上，创新使用食蟹猴(Macaca fascicularis)作为非人灵长类实验动物，经单侧输尿管结扎成功诱导产生肾纤维化病变。经病理切片检查验证，本方法可重复性地在实验猴肾中诱导出与人相似的典型的肾纤维化病变。

本发明所提供的一种非人灵长类动物单侧输尿管结扎诱导肾纤维化模型的建立方法，优选的是：创新的使用食蟹猴(Macaca fascicularis)作为非人灵长类实验动物。

本发明的优点是：

本发明的动物模型具有现有啮齿类和兔动物模型无法实现的应用价值：

a、非人灵长类动物在解剖特点、各大生理功能和生化系统、以及病理变化等方面与人类极为相近；

b、非人灵长类动物的生物靶点的结构和生物调控与人类相似，可为药物特异性(如抗体，核酸，蛋白类药物技术等)作用靶点提供很好的交叉反应性；

c、本模型产生的肾纤维化与人类肾纤维化在病程、病理改变等诸方面有高度的相似性；

d、采用中国猴场大量繁育的实验用猴，质量控制严格，遗传背景清楚，来源丰富。

本发明建立的非人灵长类动物模型在肾纤维化的各相关领域有广泛的用途，例如：

a、在肾纤维化疾病研究领域，可利用模型进行肾纤维化疾病的发生、发病机制、诊断、生物识别、病理变化、和转化医学研究；

b、在纤维化疾病研究领域，可利用模型进行纤维化疾病的发病机制、病程进展、预后、生物识别、病理特征、和药物靶标研究；

c、在肾纤维化疾病的干预方法研究和开发以及电子媒介领域，可利用模型的发病率、发病程度、和发病特征，进行肾纤维化疾病的预防、治疗、护理等各类方法、技术、装置等进行可行性研究；

d、在纤维化疾病的药物研究和开发领域，可利用模型的发病率、发病程度、和发病特征，对新药进行评价和药效评估等；

e、利用模型的材料(如组织、血样、基因、数据等)建立肾纤维化疾病研究相关的数据库、基因库、材料库等。

附图说明

图1输尿管结扎后不同时间点的肾脏病理切片。

图2计算机辅助分析纤维化组织在整张肾脏病理切片中所占面积的比例。

图3通过质谱法测定肾脏中羟脯氨酸含量(ug/mg肾脏蛋白)。

以下通过具体实施方式对本发明作进一步的详细描述，但并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变和变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。

具体实施方式

为了可以使本专业技术人员更全面地理解本发明,下面结合实施例进一步阐述本发明，但不以任何方式限制本发明。

实验动物：选取3只食蟹猴(Macaca fascicularis，雄性，3岁，体重3-4千克)；

实验方法：

a.选取3只7周岁左右、体重5kg左右的雄性实验猴用于模型；

b.用氯胺酮注射液按3ml/kg剂量肌注麻醉实验猴，以5％-10％异氟烷吸入维持麻醉；

c.实验猴腹部剃毛消毒后沿腹中线切开，打开腹腔，暴露手术视野后；

d.顺沿左侧输尿管，在左肾下缘处以手术丝线于左侧输尿管结扎2道，完全阻断左侧输尿管；

e.消毒手术切口后，分层缝合伤口；

f.手术后第1、2、4周，取左肾和右肾部分组织样本，测定肾脏组织中的羟脯氨酸含量：

首先测定肾脏组织的蛋白含量，取含有1mg蛋白量的肾脏组织，以6M的盐酸95度水解过夜，离心去除沉淀后，取上清液用质谱法测定羟脯氨酸含量：

实验结果：与右肾比较，结扎的左肾脏组织中的羟脯氨酸的含量(ug/mg肾脏蛋白)在4周时明显增高，标示纤维化含量增加：

g.取左肾和右肾部分组织样本，于中性甲醛溶液中固定，固定组织样本进行组织切片病理检查。

实验结果：

1、手术后第1周起可见左肾小管扩张，左肾小管上皮细胞形态扁平化，左肾间质组织中细胞浸润增加。

2、手术后第2周可见左肾间质胞外基质和临近肾小管区域胞外基质增加，胶原纤维着色区域明显增多。

3、手术后第4周可见左肾明显的胶原沉积，纤维化组织形成。

4、计算机辅助图像分析结果：

纤维化区域占整个切片面积百分比(％)

模型成功率：

本模型的成功率为100％。

Claims (12)

1.建立一种单侧输尿管结扎诱导的非人灵长类动物肾纤维化模型的方法，所述模型建立方法为：用麻醉剂麻醉实验猴，并维持麻醉，实验猴腹部消毒后沿腹中线切开，打开腹腔暴露手术视野,顺沿单侧输尿管，在单侧肾下缘输尿管处以手术丝线结扎两道，完全阻断该侧输尿管，消毒手术切口后分层缝合伤口，在术后不同时间点，采取生物样品和组织样品测量肾纤维化的指标，或取左肾和右肾进行组织切片和病理检查。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：使用食蟹猴(Macaca fascicularis)作为非人灵长类实验动物。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：使用单侧输尿管结扎诱导建立非人灵长类肾纤维化。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：在单侧输尿管结扎后的不同时间点测量评估肾纤维化的程度。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于：在单侧输尿管结扎后的不同时间点，摘除另一侧肾脏，以测量评估单侧纤维化肾脏的功能。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述动物是非人灵长类实验动物，如恒河猴(Macacamulatta)和狨猴(Marmoset)。

7.如权利要求1所述的方法在肾纤维化研究和实验性干预中的应用。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于：使用生物和组织采样测量、影像学检查、病理检查方法评估肾疾病程度以及发病、恢复、和复发等各期的标准。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于：评估疾病程度的电子存储媒介中的应用。

10.如权利要求7所述的应用，其特征在于：评价任何一种技术、方法、装置在诊断或干预肾纤维化疾病中的应用。

11.如权利要求10所述的应用，其特征在于：所述的技术、方法、装置是肾功能缺失补偿和维护技术或装置、诊断指标、生物标示物、化合物、治疗或预防药物。

12.如权利要求7所述的应用，其特征在于：利用模型的材料(如组织、血样、基因、数据等)建立肾纤维化疾病研究相关的数据库、基因库、材料库。