JPWO2015034011A1 - マイクロアレイチップ、及び該チップを用いた細胞解析方法 - Google Patents
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Abstract
Description
このことから、例えば前述のマラリア原虫感染症をはじめとする種々の感染症に感染した細胞、また、これ以外の種々の標的細胞(特定の細胞)を迅速、簡便かつ高感度に検出可能な新しい検出手段が求められている。また、ベッドサイド等でも容易に使用可能な新しい検出手段が求められている。
項1.
複数のマイクロチャンバーを備えており、該マイクロチャンバー1つあたりに複数の細胞を単層に格納可能であり、表面の水接触角が10°以下であり、該マイクロチャンバーの(内径:深さ)の比が(1:0.35〜1)であり、以下の(i)(ii)の条件のいずれか一方又は両方を満たす、マイクロアレイチップ。
(i)最外部に存在するマイクロチャンバーの開口部の中心を直線でつないで囲った領域の面積を100%とし、その領域におけるマイクロチャンバー開口部以外の部分が占める面積比率を間隙率としたとき、間隙率が0%より大きく45%以下である。
(ii)マイクロチャンバーとマイクロチャンバーとの間隔が、35μm以下である。
項2.
前記マイクロチャンバーが、内径が20〜500μm、深さが20μm以上である、項1に記載のマイクロアレイチップ。
項3.
複数の細胞を含む試料から、該試料に含まれる特定の細胞を検出するための検出方法であって、
(1)複数のマイクロチャンバーを備えたマイクロアレイチップであって、該マイクロチャンバー1つあたりに複数の細胞を格納可能であるマイクロアレイチップに、該試料中の細胞を保持させる工程、及び
(2)該マイクロアレイチップに保持された細胞において、特定の細胞の有無を検出する工程
を含み、
前記マイクロアレイチップの表面の水接触角が10°以下であり、
前記マイクロチャンバーの(内径:深さ)の比が(1:0.35〜1)であり、
さらに前記マイクロアレイチップが、以下の(i)(ii)の条件のいずれか一方又は両方を満たす、
検出方法。
(i)前記マイクロアレイチップの最外部に存在するマイクロチャンバーの開口部の中心を直線でつないで囲った領域の面積を100%とし、その領域におけるマイクロチャンバー開口部以外の部分が占める面積比率を間隙率としたとき、前記マイクロアレイチップの間隙率が0%より大きく45%以下である。
(ii)前記マイクロアレイチップの、マイクロチャンバーとマイクロチャンバーとの間隔が、35μm以下である。
項4.
前記マイクロチャンバーが、内径が20〜500μm、深さが20μm以上である、項3に記載の検出方法。
項5.
前記特定の細胞が動物由来細胞である、項3又は4に記載の検出方法。
項6.
前記複数の細胞を含む試料の細胞濃度が1×106〜1×108cells/mlである、項3〜5のいずれかに記載の検出方法。
本発明の検出方法によれば、従来の検出方法と比較して、複数の細胞を含む試料から、細胞を無駄に消費することを抑えつつ、該試料に含まれる特定の細胞を迅速、簡便かつ高感度に検出することができる。
検出用キット
本発明の検出用キットによれば、複数の細胞を含む試料から、細胞を無駄に消費することを抑えつつ、標的とする特定の細胞を迅速、高感度かつより簡便に検出することができる。
本発明のマイクロアレイチップによれば、複数の細胞を含む試料から、細胞を無駄にすることを抑えつつ、標的とする特定の細胞を迅速、高感度かつより簡便に検出することができる。
本発明の薬剤候補物質のスクリーニング方法により、種々の薬剤候補物質が細胞に与える影響を簡便かつ迅速に測定し、所望の活性を示す物質を効率よく選択することができる。
あるいはまた、例えば、癌細胞群中に存在する癌幹細胞を探索するにあたっても、好ましく用いることができる。例えば、体液(血液やリンパ液等が例示される)中に存在する癌細胞中に存在する癌幹細胞や、腫瘍を各細胞へと解離させた後にそれらの細胞中に存在する癌幹細胞を探索するために用いることができる。
(i)最外部に存在するマイクロチャンバーの開口部の中心を直線でつないで囲った領域の面積を100%とし、その領域におけるマイクロチャンバー開口部以外の部分が占める面積比率を間隙率としたとき、間隙率が0%より大きく45%以下である。
(ii)マイクロチャンバーとマイクロチャンバーとの間隔が、35μm以下である。
以下、さらに詳細に説明する。
(1):直線でつながれる中心の数が最小になるようにする。
(2):直線でつないで囲った領域内に、全ての開口部の中心が含まれるようにする。
例えば、図1aに記載の10個の開口部があった場合には、図1bのように各開口部を直線でつなぐ。図1cのようにつないだ場合には、全ての中心が囲まれた領域に存在するものの、条件(1)を満たしておらず、また、図1dのようにつないだ場合には、条件(1)も(2)も満たしていない。
すなわち、マイクロチャンバーとマイクロチャンバーとの間隔は、出来るだけ等間隔であることが好ましい。また、用いる細胞種や、マイクロチャンバーの内径及び深さ等にもよるが、当該間隔は35μm以下であることが好ましく、30μm以下であることがより好ましい。
本発明の検出用キットに含有されるマイクロアレイチップ以外のものとしては限定されないが、以下のものが例示される。
<マイクロアレイチップ>
次のマイクロアレイチップを使用した。
マイクロアレイチップの基板:ポリスチレン
マイクロアレイチップの表面処理:酸素プラズマ処理
マイクロチャンバーの形成:LIGAプロセス
マイクロチャンバーの形状:正六角柱形
マイクロチャンバーの寸法:内径100μm、深さ50μm
マイクロチャンバー同士の距離:チャンバーの開口部(正六角形)の中心間距離200μm(等間隔で配置されている)
マイクロアレイチップの表面の水接触角:10°
該マイクロアレイチップを図5に示す。
LIGAプロセスによって作製されたスターライト工業株式会社製のマイクロアレイチップを使用した。具体的には、該マイクロアレイチップは、X線リソグラフィー法によって、PMMA基板にパターニングし、エッチングによってPMMAの鋳型を作り、そこで電鋳(メッキ)を行い、作製されたニッケルの金型にポリスチレンを流し込んで成型されたものである。
次のようにして赤血球を検出した。
まず、ヒトから採血、遠心分離(4℃、1500g、30min)することにより得た赤血球を培地(RPMI1640)で懸濁することにより、ヒト由来の赤血球細胞懸濁液(懸濁液中の赤血球濃度1×108cells/ml)を得た。得られた赤血球細胞懸濁液200μlを、マイクロピペットを用いてマイクロアレイチップ上に添加することにより、マイクロアレイチップに赤血球を接触、展開させ、さらにマイクロピペットにより培養液(RPMI1640)1mlで洗浄を行った後、顕微鏡下で赤血球が格納されているマイクロチャンバーを測定した。結果を図6に示す。図6から、マイクロチャンバーの底に細胞(赤血球)を均一に一層(単層)として保持させ得ることが確認できた。
<水接触角の検討>
水接触角と細胞の展開効率について、以下のようにして比較した。ただし、当該検討で用いたマイクロアレイチップは、前記マイクロアレイチップにおいて、以下のように変更を加えて製造したものを使用した。
マイクロチャンバーの形状:円筒形
マイクロチャンバーの寸法:内径100μm、深さ100μm
水接触角80°のマイクロアレイチップ:RIE装置(サムコ株式会社製)を用いて、出力200W、3秒の処理時間で表面処理を行った。
水接触角25°のマイクロアレイチップ:RIE装置を用いて、出力200W、5秒の処理時間で表面処理を行った。
水接触角10°のマイクロアレイチップ:RIE装置を用いて、出力200W、20秒の処理時間で表面処理を行った。
<各マイクロチャンバーによる赤血球細胞の保持能力の検討>
マイクロアレイチップが備えるマイクロチャンバーの内径及び深さを変えたとき、マイクロチャンバー内に格納される細胞に違いが見られるかを検討した。
<マイクロアレイチップの製造>
下記の内径及び深さの円筒形マイクロチャンバーを備えるマイクロアレイチップを3種(マイクロアレイチップA〜C)製造した。
上記実施例1で用いたマイクロアレイチップを用いて、白血球を検出した。
上記実施例1で製造したマイクロアレイチップと同様の製造方法にて、チャンバーの開口部(正六角形)の中心間距離を200μmとするかわりに、マイクロチャンバー間の間隔を30μm又は40μm(いずれも等間隔)としたマイクロアレイチップを製造した。なお、これらのマイクロアレイチップの他の構成は、実施例1で製造したマイクロアレイチップと同じとした。なお、これらのチップの間隙率を算出したところ、マイクロチャンバー間の間隔を30μmとしたマイクロアレイチップは約40%、マイクロチャンバー間の間隔を40μmとしたマイクロアレイチップは約50%であった。
Claims (6)
- 複数のマイクロチャンバーを備えており、該マイクロチャンバー1つあたりに複数の細胞を単層に格納可能であり、表面の水接触角が10°以下であり、該マイクロチャンバーの(内径:深さ)の比が(1:0.35〜1)であり、以下の(i)(ii)の条件のいずれか一方又は両方を満たす、マイクロアレイチップ。
(i)最外部に存在するマイクロチャンバーの開口部の中心を直線でつないで囲った領域の面積を100%とし、その領域におけるマイクロチャンバー開口部以外の部分が占める面積比率を間隙率としたとき、間隙率が0%より大きく45%以下である。
(ii)マイクロチャンバーとマイクロチャンバーとの間隔が、35μm以下である。 - 前記マイクロチャンバーが、内径が20〜500μm、深さが20μm以上である、請求項1に記載のマイクロアレイチップ。
- 複数の細胞を含む試料から、該試料に含まれる特定の細胞を検出するための検出方法であって、
(1)複数のマイクロチャンバーを備えたマイクロアレイチップであって、該マイクロチャンバー1つあたりに複数の細胞を格納可能であるマイクロアレイチップに、該試料中の細胞を保持させる工程、及び
(2)該マイクロアレイチップに保持された細胞において、特定の細胞の有無を検出する工程
を含み、
前記マイクロアレイチップの表面の水接触角が10°以下であり、
前記マイクロチャンバーの(内径:深さ)の比が(1:0.35〜1)であり、
さらに前記マイクロアレイチップが、以下の(i)(ii)の条件のいずれか一方又は両方を満たす、
検出方法。
(i)前記マイクロアレイチップの最外部に存在するマイクロチャンバーの開口部の中心を直線でつないで囲った領域の面積を100%とし、その領域におけるマイクロチャンバー開口部以外の部分が占める面積比率を間隙率としたとき、前記マイクロアレイチップの間隙率が0%より大きく45%以下である。
(ii)前記マイクロアレイチップの、マイクロチャンバーとマイクロチャンバーとの間隔が、35μm以下である。 - 前記マイクロチャンバーが、内径が20〜500μm、深さが20μm以上である、請求項3に記載の検出方法。
- 前記特定の細胞が動物由来細胞である、請求項3又は4に記載の検出方法。
- 前記複数の細胞を含む試料の細胞濃度が1×106〜1×108cells/mlである、請求項3〜5のいずれかに記載の検出方法。
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