KR20070046939A - 마이크로 챔버 어레이를 이용한 스크리닝 방법 및 스크리닝장치 - Google Patents

마이크로 챔버 어레이를 이용한 스크리닝 방법 및 스크리닝장치 Download PDF

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KR20070046939A
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마사히로 나카오
마키 아사미
미사 오치아이
하루카즈 후카미
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산또리 가부시키가이샤
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Abstract

마이크로 챔버 어레이를 이용하여 유용한 기능을 갖는 미생물이나 단백질을 스크리닝하는 방법 및 장치를 제공하는 것을 과제로 한다. 본 발명의 스크리닝 방법 및 스크리닝 장치는, 어레이상으로 배치된 복수의 마이크로 챔버를 갖는 기판을 이용하여, 스크리닝 대상이 되는 시료로부터, 목적으로 하는 효소 활성을 갖는 단백질 또는 당해 단백질을 생산하는 미생물을 스크리닝한다는 것이다. 이 방법 및 장치에서는, 효소 활성을 갖는 단백질과 형광 기질의 효소 반응에 의해 발생하는 형광을 검출함으로써, 마이크로 챔버 내에 존재하는 효소 활성을 갖는 단백질 또는 그 단백질을 생산하는 미생물을 검출한다.

Description

마이크로 챔버 어레이를 이용한 스크리닝 방법 및 스크리닝 장치{SCREENING METHOD USING MICROCHAMBER ARRAY AND SCREENING APPARATUS}
본 발명은, 마이크로 챔버 어레이를 이용하여, 효소 활성을 갖는 단백질이나, 효소 활성을 갖는 단백질을 생산하고 있는 미생물을 스크리닝하는 방법, 및, 이러한 미생물의 스크리닝에 이용하는 장치에 관한 것이다. 또, 본 발명은, 미생물이 효소 활성을 갖는 단백질을 세포막의 표층에서 발현하거나 효소 활성을 갖는 단백질을 분비 발현하고 있는 것을 확인하는 방법 및 장치에 관한 것이다.
종래, 유용한 기능을 갖는 미생물 (예를 들어, 유용한 단백질을 생산하는 미생물) 을 스크리닝한다는 기술에 관해서는, 한천 플레이트에 미생물을 산포하고, 어떤 종류의 선택압을 가하여 증식하는지 여부를 확인하는, 또는 기질을 추가하여, 예를 들어, 할로를 형성하는지 여부를 확인하는 등의 방법이 정법으로 되어 있다. 이러한 방법에 따라, 목적에 맞는 미생물이 스크리닝 되어 있다. 그러나, 이러한 방법에서는 수많은 한천 플레이트가 필요하고, 한천 플레이트를 작성하거나 균을 살포하는데 많은 노력과 시간과 코스트가 걸린다는 문제를 안고 있다.
또, 요즈음, 게노믹스나 프로테오믹스로 수많은 유전자나 단백질의 기능을 해석하는 데에 있어서, 미량의 샘플을 이용하고, 고속의 해석을 실시하는 것이 필 요하게 되었다. 이러한 요구에 대응하기 위해서, 미량 또한 고속의 해석용의 DNA 칩이나 프로테오칩 등의 개발이 진행되고 있다. 그리고, 미세 가공 기술의 진보로부터 극미소인 챔버 (웰) 를 작성하는 것이 가능하게 되었다. 또한, CCD 카메라 및 컴퓨터 처리를 이용하여, 정성적, 반정량적으로 해석하는 것도 가능하게 되었다.
비특허 문헌 1 에는, 실제로 이러한 마이크로 챔버 어레이 기술을 이용하여, 1 세포로 PCR 을 실시하거나, 무세포계 단백 합성을 실시하거나, 세포를 넣어 형광 발색하는 세포를 검출하는 등의 기술이 보고되어 있다. 또, 이 비특허 문헌 1 에는, 망라적으로 변환된 유전자를 대장균이나 효모에 도입하여, 발현된 단백의 기능을 해석할 수 있게 되어 있는 것이 보고되어 있다.
이러한 기술의 진보에 수반하여, 다수의 유전자 또는 단백질을 한번에 스크리닝할 수 있고, 단시간에 기능 해석할 수 있는 하이 스루풋 스크리닝이 주목되고 있다. 현재의 하이 스루풋 스크리닝은, 수많은 화합물을, 96 웰이나 386 웰의 플레이트를 이용하여, 자동화된 장치를 이용하여 스크리닝한다는 방법으로 실시되고 있다. 또, 비특허 문헌 2 에는, 무세포 단백질 합성계를 이용하여 합성된 단백질의 하이 스루풋 스크리닝 기술에 대해서 기재되어 있다.
비특허 문헌 1: 「특집: 콤비나토리얼·바이오엔지니어링」, 바이오인더스트리, 2001년, 18권, 6월호, 7 ∼ 17페이지, 56 ∼ 72페이지
비특허 문헌 2: Nippon Nogeikagaku Kaishi, Vol.78, No.5,27 ∼ 30 (2004년 5월 1일 발행)
발명의 개시
발명이 해결하고자 하는 과제
그러나, 이 96 웰이나 386 웰의 플레이트에 존재하는 각 챔버의 용적은, 96 웰의 것에서 약 300㎕ 이고, 384 웰의 것에서 약 100㎕ 이다. 이러한 플레이트를 이용하여 스크리닝을 실시하는 경우, 적어도 각 챔버의 용적의 3 분의 1 정도의 용매가 필요해짐과 함께, 거기에 알맞은 양의 시약 등이 필요해진다. 그리고, 스크리닝의 횟수가 많아지면 코스트도 그 만큼 상승한다.
더구나, 최근에는, 더욱 대량의 라이브러리로부터, 리파아제 활성 등의 효소 활성을 갖는 단백질이나 미생물을, 미량으로, 또한, 단시간에 저렴하게 스크리닝하는 것이 필요해지고 있다. 상기와 같은 한천 플레이트로 스크리닝하면, 다대한 노력과 코스트를 들여야 하고, 이러한 요구에 부응하기는 어렵다. 또, 96 웰이나 384 웰의 플레이트를 이용하여 효소 반응을 실시하고, 저해제를 하이 스루풋으로 스크리닝하는 것은 실제로 실시되고 있는데, 더욱 대량으로 처리하는 경우는 코스트도 포함하여 많은 문제가 발생된다.
한편, 예를 들어, 내경이 100㎛ 정도, 깊이가 10㎛ 정도의 마이크로 챔버이면, 그 용적은 약 80pl 이 되어, 상기 기술한 96 웰이나 386 웰의 플레이트에 설치된 챔버의 10 만분의 1 의 용적으로 끝난다. 또, 상기의 용적을 갖는 마이크로 챔버이면, 면적 1㎠ 의 플레이트 상에 5000 ∼ 100000 개 정도 배치할 수 있다. 그 때문에, 마이크로 챔버가 어레이상으로 배치된 플레이트를 이용하여 미생물이나 단백질의 스크리닝을 실시하면, 고속이고 저비용의 기능 해석을 실현할 수 있다고 기대된다.
그러나, 마이크로 챔버 내에서 여러 가지의 반응을 일으키게 하는 것은 가능해지고 있지만, 효소 반응을 실시해, 하이 스루풋으로 스크리닝하는 것은 아직 실시되지 않은 것이 현 상황이다.
즉, 지금까지의 96 웰이나 384 웰의 플레이트는, 의약 용도의 효소 저해제의 스크리닝을 목적으로 하는 것이었다. 효소 저해제는 저분자 화합물이기 때문에, 케미컬 라이브러리는 많아야 100 만개 정도까지로 한정되어 있어, 마이크로 챔버 어레이의 수요가 그다지 높지는 않았다. 그러나, 최근의 더욱 대량의 라이브러리로부터의 스크리닝의 필요성과 함께, 마이크로 챔버 어레이를 이용하여 스크리닝을 실시하는 것이 요망되고 있다.
그래서, 본 발명에서는, 상기의 마이크로 챔버 어레이를 이용하여 유용한 기능을 갖는 미생물이나 단백질을 스크리닝하는 방법 및 장치를 제공한다. 또, 본 발명은, 유전자 재조합에 의해, 효모 등의 미생물이나 세포에 있어서, 효소 활성을 갖는 단백질이, 세포막의 표층에서 발현하고 있는 것, 또는, 분비 발현하고 있는 것을 확인할 수 있는 방법 및 장치를 제공하는 것이기도 하다.
과제를 해결하기 위한 수단
본 발명에 관련된 스크리닝 방법은, 상기의 과제를 해결하기 위해서, 어레이상으로 배치된 복수의 마이크로 챔버를 갖는 기판 상에, 분해함으로써 형광을 발하는 형광 기질을 첨가하는 공정과, 단백질 또는 미생물을 함유하는 시료를 상기 기판 상에 적하하는 공정과, 단백질 또는 미생물과 상기 형광 기질의 효소 반응에 의해 발생하는 형광을 검출함으로써, 상기 마이크로 챔버 내에 존재하는 효소 활성을 갖는 단백질 또는 그 단백질을 생산하는 미생물을 검출하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 것이다.
본 발명의 단백질 또는 미생물의 스크리닝 방법은, 어떠한 효소 활성을 갖는 단백질 또는 그 단백질을 생산하는 미생물을, 어레이상으로 배치된 복수의 마이크로 챔버를 갖는 기판을 이용하여 스크리닝한다는 것이다.
이 스크리닝 방법에 의하면, 그 용량이 pl 단위의 매우 작은 마이크로 챔버를 갖는 기판을 이용함으로써, 대량의 라이브러리를 포함하는 시료로부터, 단시간에 저렴하게 스크리닝할 수 있다. 또한, 각 마이크로 챔버가 매우 작기 때문에, 시료 중으로부터 목적으로 하는 단백질이나 미생물을 함유하는 용액을 미량으로 적출할 수 있다. 그 결과, 미생물의 경우는 1 개 내지 수 개를 취출할 수 있고, 그것을 증식시킬 수도 있다. 이에 의해, 스크리닝의 다음의 단계에 실시되는, 예를 들어 기능 해석 등에 그대로의 상태 또는 증식시킨 상태에서 이용할 수 있다. 여기서 라이브러리란, 시료 중에 함유되어 있는, 전체 단백질 또는 전체 미생물 (목적으로 하는 단백질 또는 미생물 이외의 단백질이나 미생물도 포함한다) 을 의미한다.
또한,「단백질 또는 미생물을 함유하는 시료」에는, 어느 특정의 효소 활성을 갖는 단백질 또는 미생물을 함유하고 있을 가능성이 있는 시료도 포함된다. 즉, 상기 시료란, 목적으로 하는 단백질 또는 미생물의 스크리닝 대상이 되는 것을 의미한다. 상기 시료의 구체예로서는, 토양 또는 해양 등의 자연 환경 중에서 채취한 시료, 종래 공지된 유전자 공학 기술에 의한 형질 전환법에 따라 제작한 변이 단백질 또는 미생물의 변이체를 포함하는 시료 등을 들 수 있다.
상기 시료로서 토양 또는 해양 등의 자연 환경 중에서 채취한 시료를 이용하여, 본 발명의 스크리닝을 실시했을 경우에는, 자연계로부터 특정의 효소 활성을 갖는 유용한 미생물을 스크리닝할 수 있다. 또, 상기 시료로서 변이 단백질 또는 미생물의 변이체를 포함하는 시료를 이용하여, 방대한 라이브러리로부터 제작한 변이 단백질 또는 변이체를 용이하게 단리할 수 있다.
본 발명의 스크리닝 방법에 있어서, 상기 단백질은, 미생물의 세포막의 표층에 발현하고 있는 단백질이고, 상기의 검출하는 공정에서는, 상기 복수의 마이크로 챔버 가운데, 형광을 발하는 마이크로 챔버를 검출함으로써, 효소 활성을 갖는 단백질을 세포막의 표층에 발현하고 있는 미생물을 검출하는 것이 바람직하다.
즉, 상기의 스크리닝 방법에서는, 스크리닝 대상이 되는 단백질은, 효모 등의 미생물의 세포막의 표층에 발현하고 있는 단백질이다. 또, 이 경우, 세포막의 표층에서 효소 활성을 갖는 단백질을 발현하고 있는 미생물 자체도 스크리닝 대상에 포함된다.
이 세포막의 표층에서 단백질을 발현하고 있는 미생물을 함유하는 시료를 기판 상에 적하하면, 상기 미생물은 기판 상에 형성된 복수의 마이크로 챔버의 몇 개에 흩어져서 존재하게 된다. 그러므로, 상기의 스크리닝 방법에 의하면, 어느 마이크로 챔버로 형광을 발하고 있는지를 검출함으로써, 어느 마이크로 챔버 내에 목적으로 하는 단백질이 함유되어 있는지를 확인할 수 있다.
또한, 본 발명의 스크리닝 방법에 있어서, 기질을 세포 내에 도입하여 효소 반응을 실시하면, 세포 외에 분비 발현하거나 세포막의 표층에서 발현하고 있는 단백질뿐만 아니라, 세포 내에 있어서 발현하고 있는 단백질을 스크리닝할 수도 있다.
본 발명의 스크리닝 방법에 있어서, 상기 마이크로 챔버의 내경은, 5 ∼ 500㎛ 인 것이 바람직하다.
상기와 같이, 마이크로 챔버의 내경이 5 ∼ 500㎛ 의 범위 내이면, 마이크로 챔버의 용량을 pl 단위의 매우 작은 용량으로 할 수 있다.
본 발명의 스크리닝 방법에서는, 상기의 검출하는 공정의 뒤에, 상기 단백질이 함유되어 있는 마이크로 챔버 내의 내용물을 취출하는 공정을 추가로 포함하는 것이 바람직하다.
상기의 취출 공정을 포함함으로써, 목적으로 하는 단백질 또는 미생물을 함유하는 미량의 용액을 얻을 수 있다. 이 용액은, 매우 미량이면서 확실하게 목적의 단백질이나 미생물을 함유하고 있기 때문에, 스크리닝 후에 실시되는 기능 해석 등에 그대로 증식시켜 이용할 수 있다.
본 발명에 관련된 스크리닝 장치는, 상기의 과제를 해결하기 위해서, 시료 중으로부터 효소 활성을 갖는 단백질 또는 그 단백질을 생산하고 있는 미생물을 스크리닝하는 장치로서, 어레이상으로 배치된 복수의 마이크로 챔버를 갖는 기판과, 상기 기판 상에서 발생하는 형광을 검출하는 형광 검출기를 구비하고, 상기 형광 검출기는, 효소 활성을 갖는 단백질과 형광 기질의 효소 반응에 의해 발생하는 형광을 검출함으로써, 상기 마이크로 챔버 내에 존재하는 효소 활성을 갖는 단백질 또는 그 단백질을 생산하는 미생물을 검출하는 것을 특징으로 하는 것이다.
상기의 단백질 또는 미생물의 스크리닝 장치는, 어떠한 효소 활성을 갖는 단백질 또는 그 단백질을 생산하는 미생물을, 어레이상으로 배치된 복수의 마이크로 챔버를 갖는 기판 (마이크로 챔버 어레이) 을 이용하여 스크리닝한다는 것이다.
즉, 본 발명의 스크리닝 장치에서는, 어레이상으로 배치된 복수의 마이크로 챔버를 갖는 기판 상에, 효소 활성을 갖는 단백질 또는 당해 단백질을 생산하는 미생물을 함유하고 있을 가능성이 있는 시료, 및, 분해함으로써 형광을 발하는 형광 기질을 첨가하고, 마이크로 챔버 내에서 효소 활성을 갖는 단백질과 형광 기질을 효소 반응시킨다. 그리고, 형광 검출기가, 기판 상에 설치된 마이크로 챔버에 있어서 형광을 발하고 있는지 여부를 검출함으로써, 마이크로 챔버 내에 있어서의 효소 반응의 유무, 나아가서는, 효소 활성을 갖는 단백질 또는 당해 단백질을 생산하는 미생물의 유무를 판정한다.
이 스크리닝 장치에 의하면, 그 용량이 pl 단위의 매우 작은 마이크로 챔버를 갖는 기판을 이용함으로써, 대량의 라이브러리로부터, 단시간에 저렴하게 스크리닝할 수 있다. 또한, 각 마이크로 챔버가 매우 작기 때문에, 시료 중으로부터 목적으로 하는 단백질이나 미생물을 함유하는 용액을 미량으로 적출할 수 있다. 그 결과, 미생물의 경우는 1 개 내지 수 개를 취출할 수 있고, 그것을 증식시킬 수도 있다. 이에 의해, 스크리닝의 다음의 단계에 실시되는, 예를 들어 기능 해석 등에 그대로의 상태 또는 증식시킨 상태에서 이용할 수 있다. 또한, 여기서 라이브러리란, 시료 중에 포함되어 있는, 전체 단백질 또는 전체 미생물 (목적으로 하는 단백질 또는 미생물 이외의 단백질이나 미생물도 포함한다) 을 의미한다.
이와 같이, 상기 시료는, 스크리닝의 대상이 되는 것이고, 구체적으로는, 토양 또는 해양 등의 자연 환경 중에서 채취한 시료, 종래 공지된 유전자 공학 기술에 의한 형질 전환법에 따라 제작한 변이 단백질 또는 미생물의 변이체를 포함하는 시료 등을 들 수 있다.
상기 시료로서 토양 또는 해양 등의 자연 환경 중에서 채취한 시료를 이용하여, 본 발명의 스크리닝을 실시했을 경우에는, 자연계로부터 특정의 효소 활성을 갖는 유용한 미생물을 스크리닝할 수 있다. 또, 상기 시료로서 변이 단백질 또는 미생물의 변이체를 포함하는 시료를 이용하여, 스크리닝을 실시했을 경우에는, 제작한 변이 단백질 또는 변이체를 용이하게 단리할 수 있다.
본 발명의 스크리닝 장치에 있어서, 상기 단백질은, 미생물의 세포막의 표층에 발현하고 있는 단백질이고, 상기 형광 검출기는, 상기 복수의 마이크로 챔버 가운데, 형광을 발하는 마이크로 챔버를 검출함으로써, 효소 활성을 갖는 단백질을 세포막의 표층에 발현하고 있는 미생물을 검출하는 것이 바람직하다.
즉, 상기의 스크리닝 장치에서는, 스크리닝 대상이 되는 단백질은, 효모 등의 미생물의 세포막의 표층에서 발현하고 있는 단백질이다. 또, 이 경우, 세포막의 표층에 효소 활성을 갖는 단백질을 발현하고 있는 미생물 자체도 스크리닝 대상에 포함된다.
이 세포막의 표층에 단백질을 발현하고 있는 미생물을 함유하는 시료를 기판 상에 적하하면, 상기 미생물은 기판 상에 형성된 복수의 마이크로 챔버의 몇 개에흩어져서 존재하게 된다. 그러므로, 형광 검출기가, 기판 상에 설치된 복수의 마이크로 챔버 가운데, 어느 마이크로 챔버에 있어서 형광을 발하고 있는지를 검출함으로써, 어느 마이크로 챔버 내에 목적으로 하는 단백질이 함유되어 있는지를 확인할 수 있다.
본 발명의 스크리닝 장치는, 형광을 발하는 마이크로 챔버 내의 내용물을 취출하는 마이크로 매니플레이터를 추가로 구비하고 있는 것이 바람직하다.
상기의 구성에 의하면, 목적으로 하는 단백질 또는 미생물을 함유하는 미량의 용액을 얻을 수 있다. 이 용액은, 매우 미량이면서 확실하게 목적의 단백질이나 미생물을 함유하고 있기 때문에, 스크리닝 후에 실시되는 기능 해석 등에 그대로 이용할 수 있다.
본 발명의 스크리닝 장치에 있어서, 상기 마이크로 챔버의 내경은, 5 ∼ 500㎛ 인 것이 바람직하다.
상기와 같이, 마이크로 챔버의 내경이 5 ∼ 500㎛ 의 범위 내이면, 마이크로 챔버의 용량을 pl 단위의 매우 작은 용량으로 할 수 있다. 이에 의하면, 1 개의 마이크로 챔버 내에 함유되는 단백질 또는 미생물을 함유하는 용액을, 그대로 다음에 실시되는 기능 해석 등에 이용할 수 있다.
또, 본 발명의 방법 및 장치를 이용하면, 간편하게 효모 등의 미생물이나 세포에 있어서, 효소 활성을 갖는 단백질이 세포막의 표층에서 발현하고 있는 것, 또는, 분비 발현하고 있는 것을 확인할 수 있다. 종래, 미생물이나 세포에 목적으로 하는 단백을 발현하는 유전자가 도입되었는지 여부를 조사하기 위해서, 벡터에 항생 물질 내성 유전자를 도입하고, 항생 물질 첨가 배지에서 생육하는지 여부를 확인한다는 수법이 이용된다. 이 경우, 여분의 유전자를 벡터에 결합시킬 필요가 있고, 경우에 따라서는 그 유전자를 제거할 필요도 생긴다.
한편, 본 발명 방법으로 확인하는 경우에는, 소량의 샘플로부터 도입된 변이체를 대량 또한 동시에 선발할 수 있다. 또, 여분의 유전자를 벡터에 도입할 필요도 없다. 나아가, GFP 등의 발광 단백질의 유전자를 벡터에 도입하여 발현을 확인하는 것이 통상적인 방법으로서 실시되는데, 이 경우도 여분의 유전자를 결합시킬 필요가 있어, 이에 의해 벡터도 길어져 버린다. 벡터가 길어지면, 유전자가 도입되기 어렵거나, 도입되었다고 해도 발현하지 않는 등의 문제가 발생한다.
발명의 효과
본 발명의 스크리닝 방법 및 스크리닝 장치는, 이상과 같이, 그 용량이 pl 단위의 매우 작은 마이크로 챔버를 갖는 기판을 이용함으로써, 대량의 라이브러리를 포함하는 시료로부터, 단시간에 저렴하게 스크리닝할 수 있다. 또한, 각 마이크로 챔버가 매우 작기 때문에, 시료 중으로부터 목적으로 하는 단백질이나 미생물을 함유하는 용액을 미량으로 적출할 수 있다. 이에 의해, 스크리닝의 다음의 단계에 실시되는, 예를 들어 기능 해석 등에 그대로의 상태로 이용할 수 있다.
이와 같이, 본 발명에 관련된 스크리닝 방법 및 스크리닝 장치는, 고속이고 저비용으로 실시할 수 있음과 함께, 목적으로 하는 단백질이나 미생물을 다음 단계에 이용하기 쉬운 상태로 얻을 수 있기 때문에, 편리성이 높은 방법 및 장치라고 할 수 있다. 또, 본 발명의 방법 및 장치에 의하면, 미생물이 효소 활성을 갖는 단백질을 세포막의 표층에서 발현하거나 효소 활성을 갖는 단백질을 분비 발현하고 있는 것을 확인할 수도 있다.
도 1 은, 본 발명의 스크리닝 장치의 일례의 구성을 나타내는 모식도이다.
도 2(a) 는, 마이크로 챔버를 갖는 기판의 일례를 나타내는 모식도이다. 도 2(b), 도 2(c) 는, 도 2(a) 에 나타내는 기판 상에 배치된 마이크로 챔버의 패턴을 나타내는 모식도이다.
도 3(a) 는 실시예 1 의 결과를 나타내는 모식도이고, 도 3(b) 는 실시예 2 의 결과를 나타내는 모식도이며, 도 3(c) 는 실시예 3 의 결과를 나타내는 모식도이다.
부호의 설명
1 마이크로 챔버를 갖는 기판
2 전동 스테이지
3 CCD 카메라
4 PC
10 스크리닝 장치
발명을 실시하기 위한 최선의 형태
이하, 본 발명에 대해서 보다 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이 기재에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 단백질 또는 미생물의 스크리닝에서는, 내경 20 ∼ 500㎛ 의 마이크로 챔버가 어레이상으로 배열된 슬라이드 글라스 (기판) 를 이용한다. 그리고, 그 마이크로 챔버에 효모나 미생물 등을 함유하는 시료, 및, 형광 기질을 넣음으로써 효소 반응을 일으키게 하고, 발생하는 형광을 형광 현미경으로 관찰하거나 현미경에 장착된 CCD 카메라로 촬영함으로써, 효소 반응이 일어나고 있는 마이크로 챔버를 검출한다는 수법을 이용한다.
본 발명의 스크리닝 방법, 및, 본 발명의 스크리닝 장치에 대해서, 이하에 각각 설명한다.
(1) 본 발명의 스크리닝 방법에 대해서
본 발명의 스크리닝 방법은, 어레이상으로 배치된 복수의 마이크로 챔버를 갖는 기판 상에 형광 기질을 첨가하는 공정과, 단백질 또는 미생물을 함유하는 시료를 상기 기판 상에 적하하는 공정과, 단백질 또는 미생물과 상기 형광 기질의 효소 반응에 의해 발생하는 형광을 검출함으로써, 상기 마이크로 챔버 내에 존재하는 효소 활성을 갖는 단백질 또는 그 단백질을 생산하는 미생물을 검출하는 공정을 포함하는 것이다.
이 스크리닝 방법에서는, 어레이상으로 배치된 복수의 마이크로 챔버를 갖는 기판을 이용한다. 이 기판은, 마이크로 챔버 어레이라고도 불리고, 슬라이드 글라스 상에, 용량이 1 ∼ 2000pl 정도 (예를 들어, 마이크로 챔버의 내경이 500㎛ 인 경우의 용량은 2㎕, 내경이 100㎛ 인 경우의 용량은 80pl) 의 매우 작은 오목형 형상의 챔버가 어레이상으로 배열한 것이다. 이 기판은, 본 발명의 스크리닝 장치에 구비된 복수의 마이크로 챔버를 갖는 기판과 동일한 것이기 때문에, 스크리닝 장치의 설명 중에서 상세하게 기술한다.
그리고, 상기 기판의 마이크로 챔버 내에, 형광 기질을 첨가함과 함께, 단백질 또는 미생물을 함유하는 시료를 적하한다. 이 형광 기질을 첨가하는 공정과, 단백질 또는 미생물을 함유하는 시료를 적하하는 공정은, 순서가 동일하지 않으며, 어느 쪽을 먼저 실시해도 되고, 또한,「단백질 또는 미생물을 함유하는 시료」란, 스크리닝 대상이 되는 시료를 의미함과 함께, 본 발명의 스크리닝 방법에서는, 그 효소 활성을 갖는 단백질 또는 당해 단백질을 생산하는 미생물을 스크리닝하는 것을 의미한다.
「형광 기질을 첨가하는 공정」, 및「단백질 또는 미생물을 함유하는 시료를 적하하는 공정」의 뒤에,「마이크로 챔버 내에 존재하는 효소 활성을 갖는 단백질 또는 그 단백질을 생산하는 미생물을 검출하는 공정」이 실시된다. 이 검출하는 공정에서는, 어레이상으로 배치된 복수의 마이크로 챔버 중 어느 마이크로 챔버에서 효소 반응이 일어나고 있는지를 검출한다. 그리고, 효소 반응이 일어나고 있는 마이크로 챔버에는, 목적으로 하는 단백질 또는 미생물이 함유되어 있고, 효소 반응이 일어나지 않은 마이크로 챔버에는, 목적으로 하는 단백질 또는 미생물이 함유되지 않았다고 판정한다.
본 발명의 스크리닝 방법에서는, 효소 반응의 유무를 확인하기 위한 효소 반 응 기질로서 형광 기질을 이용한다. 그 때문에, 상기의 검출하는 공정에서는, 마이크로 챔버마다 형광을 발하는지 여부를 검출함으로써, 효소 반응이 일어나고 있는지 여부를 용이하게 확인할 수 있다. 그러므로, 마이크로 챔버 내에 목적으로 하는 단백질 또는 미생물이 함유되어 있는지 여부를 용이하게 판정할 수 있다.
본 발명의 스크리닝 방법에 의하면, 그 용량이 pl 단위의 매우 작은 마이크로 챔버를 갖는 기판을 이용함으로써, 대량의 라이브러리를 포함하는 시료로부터, 단시간에 저렴하게 스크리닝할 수 있다. 또한, 각 마이크로 챔버가 매우 작기 때문에, 시료 중으로부터 목적으로 하는 단백질이나 미생물을 함유하는 용액을 미량으로 적출할 수 있다. 그 결과, 미생물의 경우는 1 개 내지 수 개를 취출할 수 있고, 그것을 증식시킬 수도 있다. 이에 의해, 스크리닝의 다음의 단계에 실시되는, 예를 들어, 기능 해석 등에 그대로의 상태 또는 증식시킨 상태에서 사용할 수 있다.
또, 본 발명의 스크리닝 방법에서는, 상기 검출 공정의 뒤에, 목적으로 하는 단백질이 함유되어 있는 마이크로 챔버 내의 내용물을 취출하는 공정을 더 추가해도 된다. 이 취출 공정은, 마이크로 매니플레이터 등을 이용하여 실시할 수 있다. 이러한 취출 공정을 포함함으로써, 목적으로 하는 단백질 또는 미생물을 함유하는 미량의 용액을 얻을 수 있다. 이 용액은, 매우 미량이면서 확실히 목적으로 하는 단백질이나 미생물이 함유되어 있기 때문에, 스크리닝 후에 실시되는 기능 해석 등에 그대로 이용할 수 있다.
(2) 본 발명의 스크리닝 장치에 대해서
본 발명의 스크리닝 장치는, 시료 중으로부터 효소 활성을 갖는 단백질 또는 그 단백질을 생산하고 있는 미생물을 스크리닝하는 장치이다. 이 스크리닝 장치는, 어레이상으로 배치된 복수의 마이크로 챔버를 갖는 기판과, 상기 기판 상에서 발생하는 형광을 검출하는 형광 검출기를 구비하고 있고, 상기 형광 검출기가, 효소 활성을 갖는 단백질과 형광 기질의 효소 반응에 의해 발생하는 형광을 검출함으로써, 상기 마이크로 챔버 내에 존재하는 효소 활성을 갖는 단백질 또는 그 단백질을 생산하는 미생물을 검출한다.
도 1 에는, 본 발명의 스크리닝 장치의 구성 예를 나타낸다. 도 1 에 나타내는 스크리닝 장치 (10) 는, 마이크로 챔버를 갖는 기판 (1) 과, 상기 기판 (1) 을 탑재하여 이동시키기 위한 전동 스테이지 (2) 와, 기판 (1) 상에서 발생하는 형광을 검출하기 위한 형광 검출기로 구성되어 있다. 기판 (1) 상에는, 내경 5 ∼ 500㎛ 정도의 마이크로 챔버가 어레이상으로 배열되어 있다. 또한, 도 1 의 A 에는, 기판 (1) 상에 배치되어 있는 챔버 어레이를 나타낸다. 그리고, 형광 검출기는, CCD 카메라 (3) 와 CCD 카메라가 잡은 영상을 비추기 위한 PC (4) 로 구성되어 있다. 이하에, 스크리닝 장치를 구성하는 각 부분에 대해서 설명한다.
먼저, 상기 스크리닝 장치에 설치된 복수의 마이크로 챔버를 갖는 기판에 대해서 설명한다.
기판의 재질로는, 유리나 폴리카보네이트 등을 이용할 수 있다. 그리고, 이 기판 상에 직접 가공을 실시함으로써, 마이크로 챔버를 형성해도 되고, 이 기판 상에 웰 (구멍) 을 뚫은 상태의 폴리디메틸실록산, 폴리이미드 등의 필름을 부착해도 된다. 이러한 필름을 부착하는 경우에는, 필름에 뚫린 웰이 마이크로 챔버가 된다. 또는, 유리제의 기판 상에 필름을 코팅한 뒤에, 필름 면에 가공을 실시하여 마이크로 챔버를 형성해도 된다.
또한, 이 스크리닝 장치에서는, 목적으로 하는 단백질과 기질의 효소 반응을 형광으로 검출하기 때문에, 기판 및 필름은 가능한 한 형광을 갖지 않는 것이 바람직하다. 이러한 마이크로 챔버 어레이는 현재 시판도 되고 있어, 입수 가능하다.
기판 상에 형성되는 마이크로 챔버는, 챔버 내의 용량을 적절한 것으로 하기 위해서, 그 내경이 5 ∼ 500㎛ 인 것이 바람직하고, 10∼100㎛ 인 것이 보다 바람직하다. 또, 마이크로 챔버의 깊이는, 5 ∼ 50㎛ 인 것이 바람직하고, 7 ∼ 20㎛ 인 것이 보다 바람직하다. 상기와 같이, 마이크로 챔버의 내경이 5 ∼ 500㎛ 의 범위 내이면, 그 용량을 1 ∼ 2000pl 정도로 할 수 있다. 스크리닝 뒤에 실시되는 단백질의 기능 해석에서는, 이 정도의 미량의 용액을 사용한다. 그 때문에, 마이크로 챔버의 용량을 상기의 범위 내로 하면, 1 개의 마이크로 챔버 내에 함유되는 단백질 또는 미생물을 함유하는 용액을, 그대로 이어서 실시되는 기능 해석 등에 이용할 수 있다.
또, 상기 마이크로 챔버는, 그 세로·가로의 길이가 5 ∼ 20㎜, 바람직하게는 5 ∼ 10㎜ 범위의 기판 상에 배열되어 있다. 1 개의 기판 상에 형성되는 마이크로 챔버의 수로는 1000 ∼ 100000 이 바람직하고, 5000 ∼ 100000 이 보다 바 람직하다.
마이크로 챔버의 형상은, 오목형이면 특별히 한정되지 않고, 예를 들어, 비특허 문헌 1 에 나타내는 것과 같은 사각뿔, 또는, 사각기둥, 원주, 반구, 원뿔 등이면 된다. 또한, 마이크로 챔버의 형상이 사각뿔 또는 사각기둥인 경우, 상기「내경」이란, 기판 표면에 있어서의 마이크로 챔버의 한 변의 길이를 의미한다. 또, 마이크로 챔버의 형상이 원주, 반구, 또는 원뿔인 경우, 상기「내경」이란, 기판 표면에 있어서의 마이크로 챔버의 직경을 의미한다.
도 2(a) 는, 복수의 마이크로 챔버를 갖는 기판의 일례를 나타내는 모식도이다. 도 2(a) 의 상부에 나타내는 도면은, 상기 기판의 전체를 나타내는 것이고, 하부에 나타내는 도면은 기판 상에 배치된 마이크로 챔버를 확대하여 나타내는 것이다. 이 도면에 나타내는 기판에는, 그 거의 중앙부에 80 × 80 개의 마이크로 챔버가 간격 80㎛ 로 어레이상으로 배치되어 있다. 그리고, 이 마이크로 챔버의 크기는, 내경 50㎛, 깊이 10㎛ 이고, 그 형상은 반구형이다.
도 2(b), (c) 에는, 상기 기판 상에 배치되어 있는 마이크로 챔버의 어레이 패턴의 일례를 나타낸다. 도 2(b) 에 나타내는 패턴 1 에서는, 80 × 80 개의 마이크로 챔버가 한 변 10.32㎜ 의 범위 내에 동일한 간격으로 배치되어 있다. 도 2(c) 에 나타내는 패턴 2 에서는, 40 × 40 개의 마이크로 챔버의 부분 배열이 한 변에 2 개씩, 합계 4 개, 한 변 11.24㎜ 의 범위 내에 배치되어 있다.
이어서, 상기 스크리닝 장치에 설치된 형광 검출기에 대해서 설명한다.
상기 형광 검출기로서는, 검출 대상물로부터 발생된 형광을 검출하는 것이 가능한 종래 공지된 모든 기기를 이용할 수 있다. 그 구체예로서는, 형광 현미경, 광원 및 CCD 카메라가 부착된 화상 표시 장치 등을 들 수 있다. 도 2 에 나타내는 스크리닝 장치에 있어서의 형광 검출기는, CCD 카메라 (3) 와 PC (4) 로 구성되는 것이다.
또, 본 발명의 스크리닝 장치에는, 상기 기술한 마이크로 챔버를 갖는 기판 및 형광 검출기가 적어도 구비되어 있으면 되지만, 이 2 개의 구성 부재 외에, 형광을 발하는 마이크로 챔버 내의 내용물을 취출하기 위한 마이크로 매니플레이터가 추가로 구비되어 있어도 된다.
마이크로 매니플레이터가 설치되어 있으면, 목적으로 하는 단백질 또는 미생물을 함유하는 미량의 용액을 얻을 수 있고, 이 미량의 용액을, 이어서 실시되는 단백질의 기능 해석 등에 그대로 이용할 수 있다.
계속하여, 본 발명의 스크리닝 장치를 이용하여, 목적으로 하는 단백질 또는 미생물을 스크리닝하는 순서를 설명한다.
상기의 스크리닝 장치를 이용하여 스크리닝을 실시하는 경우에는, 먼저, 상기의 마이크로 챔버가 형성된 기판 상에, 스크리닝 대상이 되는 단백질 또는 미생물을 함유하고 있을 가능성이 있는 시료를 적하한다.
시료를 적하할 때에는, 1 개의 마이크로 챔버 내에, 미생물이 1 ∼ 100 개, 바람직하게는 1 ∼ 10 개 정도 들어가도록 살포한다. 그러기 위해서는, 효모의 변이주나 미생물로 이루어지는 라이브러리를 물, 또는 버퍼에 탁도가 0.01 ∼ 1.0 이 되도록 현탁하여 시료를 조제하는 것이 바람직하다. 그리고, 챔버 내에 미 생물을 1 개 ∼ 수 개 넣기 위해서는 0.5 정도의 탁도가 적합하고, 더욱 많은 미생물을 넣는 경우에는 보다 높은 탁도로 한다. 미생물이 챔버 내에 들어가는 수는, 시료 중에 함유되는 미생물의 농도와 상관하고 있어, 푸아송 분포식에 따른다고 여겨진다.
이어서, 이 기판 상에 형광 기질을 포함하는 용액을 첨가한다.
형광 기질로서는 예를 들어, 리파아제 활성을 검출하는 경우는, 움벨리페논의 지방산 에스테르, 플루오레세인의 지방산 에스테르 등을 들 수 있다. 이들의 기질은 에스테르가 가수 분해됨으로써 형광을 발하게 된다. 글루코시다아제 활성을 검출하는 경우는, 움벨리페론의 글루코시드 유도체나, 플루오레세인의 글루코시드 유도체, 레소르핀의 글루코시드 유도체 등을 들 수 있다. 또, 갈락토시다아제나 글루쿠로니다아제 등도 동일한 갈락토시드 유도체나 글루쿠로나이드 유도체를 이용하여 검출할 수 있다.
또한, 펩티다아제를 함유하는 프로테아제 등은, 그들의 기질의 아미노산 배열을 갖는 올리고펩티드의 C 말단에 아미노크로만 유도체 등의 아미노기를 갖는 형광 프로브를 아미드 결합시킨 기질을 이용함으로써 검출할 수 있다. 예를 들어, 카스페이스는 C 말측에 아스파라길크로만을, 트리프신 등의 염기성 아미노산을 인식하는 프로테아제는, C 말측에 리질크로만이나 알기닐크로만을, 키모트리프신 등의 지용성 아미노산을 인식하는 프로테아제는, C 말측에 페닐아라닐크로만, 로이실크로만 등을 갖는 올리고펩티드를 이용할 수 있다.
이들의 형광 기질은, 각 효소의 촉매 작용에 의해 분해하면 형광을 발하는 성질을 갖게 된다. 형광 검출기는, 이 형광을 검출함으로써, 상기 시료 중에 효소 활성 (예를 들어, 리파아제 활성, 글루코시다아제 활성, 프로테아제 활성 등) 을 갖는 단백질 또는 그것을 생산하는 미생물이 함유되는지 여부를 판별할 수 있음과 함께, 어레이상으로 배치된 어느 마이크로 챔버에 상기 단백질 또는 상기 미생물이 함유되어 있는지를 판별할 수 있다.
또한, 이 형광 기질을 포함하는 용액 중의 당해 기질 농도는, 10㎛ ∼ 1m㏖/d㎥ (10μmM ∼ 1mM) 인 것이 바람직하다. 이 정도의 농도이면, 시료 중에 함유되는 단백질의 효소 활성을 충분히 검출할 수 있다.
이상과 같이, 기판 상에 시료 및 형광 기질을 포함하는 용액을 첨가하면, 시료 중에 함유되는 효소 활성을 갖는 단백질과 형광 기질이 효소 반응을 일으켜, 형광 기질이 분해한다. 그리고, 기판 상에서 발생하는 형광을 검출하기 위해서 구비된 형광 현미경 (형광 검출기) 에서는, 형광 기질이 분해하여 생긴 물질의 형광을 관찰함으로써, 어느 마이크로 챔버가 효소 활성을 가지고 있는지를 검출할 수 있다. 이에 의해, 어느 마이크로 챔버에 목적으로 하는 단백질 또는 미생물이 함유되어 있는지를 검출할 수 있다. 또, 형광 검출기가 광원 및 CCD 카메라가 부착된 PC 인 경우에는, 광원으로부터 여기 파장을 기판 상에 조사하고, 당해 기판 상으로부터 발생하는 형광을 CCD 카메라를 통해 PC 에 가져오고, PC 에 설치된 화상 표시 장치에 형광을 발하는 기판을 비춘다. 그리고, 이용자는, 화상 표시 장치 상에서 관찰함으로써, 형광을 발하는 마이크로 챔버를 인식할 수 있다.
또한, 상기의 장치를 이용하여 스크리닝을 실시하는 경우, 시료의 적하와 형 광 기질의 첨가는, 어느 쪽을 먼저 해도 상관없다. 즉, 상기 기술한 바와 같이 시료를 먼저 적하하는 것이 아니라, 형광 기질 용액을 먼저 첨가한 후, 시료를 적하하여 효소 활성을 검출할 수도 있다.
상기 스크리닝 장치에 마이크로 매니플레이터가 구비되어 있는 경우에는, 형광을 발하는 마이크로 챔버로부터 내용물을 취출함으로써, 목적으로 하는 효소 활성을 갖는 미생물이나 단백질을 미량으로 얻을 수 있다. 그 결과, 미생물의 경우는 1 개 내지 수 개를 취출할 수 있고, 그것을 증식시킬 수도 있다. 그리고, 이 목적으로 하는 미생물은, 기능 해석 등에 그대로 이용할 수 있다.
본 발명은 상기 기술한 실시 형태에 한정되는 것이 아니고, 청구항에 나타낸 범위에서 각종 변경이 가능하다. 즉, 청구항에 나타낸 범위에서 적절하게 변경한 기술적 수단을 조합하여 얻어지는 실시 형태에 대해서도 본 발명의 기술적 범위에 포함된다.
이어서, 실시예에 의해, 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다. 그러나, 본 발명은 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1] 리파아제 분비 발현 효모에 있어서의 마이크로 챔버 어레이 중에서의 형광 기질을 이용한 가수 분해 반응의 검출
본 실시예에서는, 먼저, 리파아제 분비 발현 효모를 이하의 순서로 제작했다.
(1) 리파아제 분비 발현 효모의 제작
Geotrichum candidum lipase lip1 유전자의 5' 측에 EcoRI, 3' 측에 SalI 의 사이트가 생기는 프라이머를 이용하여, polymerase chain reaction (PCR) 을 실시했다. 얻어진 PCR 산물을 EcoRI, SalI 로 절단 한 후, 마찬가지로 EcoRI, SalI 로 처리한 효모용 분비용 벡터 pYE22m 과 연결함으로써, Geotrichum candidum lipase 분비 발현 플라스미드 pYEGCL1 을 구축했다. 구축한 pYEGCL1 의 Geotrichum candidum lipase 유전자 부분의 염기 서열은 데옥시터미네이터법에 의해 에러가 없는 것을 확인했다. pYEGCL1 에서 Sacch aromyces cerevisiae EH1315 주를 형질 전환하고, 리파아제 분비 발현 효모를 제작했다. 플라스미드 도입의 확인은, 형질 전환주로부터 추출한 유전자를 주형으로서 Geotrichum candidum lipase 유전자의 양단의 프라이머를 이용하여 PCR 를 실시하고, Geotrichum candidum lipase 유전자 사이즈 1.6kb 부근에서의 밴드의 증폭으로 확인했다.
(2) 마이크로 챔버 어레이 중에서의 형광 기질을 이용한 가수 분해 반응의 검출
상기의 순서로 조제된 Geotrichum candidum lipase 분비 발현 효모를 합성 배지 10mL 에서 2 일간, 30℃ 에서 진탕 배양 후, 배양액을 3000rpm, 4℃, 10 분에서 원심 분리하고, 집균했다. 얻어진 균체는 PBS 10mL 에서 현탁 후, 동일한 조건의 원심 분리로 집균했다. 균체의 세정을 한번 더 실시하고, 세정 균체는 PBS 1mL 로 현탁했다. 탁도를 OD600 에서 측정했다. 4℃ 로 유지한 상태의 마이크로 챔버 어레이 (내경 20㎛) 상에, 현탁 효모 40㎕ (OD600=0.6 상당) 를 산포하고, 4℃ 에서 10 분간 방치했다. 또한 그 액면을 따르게 하도록 기질 (0.1m㏖/l (0.1mM) MU-C18/1％DMF/50m㏖ (50mM) 인산 완충액 (pH 7.0)) 360㎕ 를첨가하고, 4℃ 에서 10 분간 방치했다. 미끄러지도록 커버 유리를 올려 수분을 압출하고, 그 후 플레이트를 습도 100％ 의 인큐베이터 (실온) 내에서 1 시간 반응시킨 후, 형광 현미경으로 관찰했다 (여기 파장 320㎚, 검출 파장 450㎚).
그 결과를 도 3(a) 에 나타낸다. 이 도면은, 배율 400 배의 현미경 사진이다. 이 도면에 나타내는 바와 같이, 기판 상의 각 마이크로 챔버에 있어서 형광이 관찰되고, Geotrichum candidum lipase 분비 발현 효모가 각 마이크로 챔버 내에 존재하는 것을 확인할 수 있었다.
[실시예 2] 리파아제 표층 발현 효모에 있어서의 마이크로 챔버 어레이 중에서의 형광 기질을 이용한 가수 분해 반응의 검출
본 실시예에서는, 먼저, 리파아제 표층 발현 효모를 이하의 순서로 제작했다.
(1) 리파아제 (Geotrichum candidum lipase) 표층 발현 효모의 제작
Geotrichum candidum lipase lip1 유전자의 5' 측에 EcoRI, 3' 측에 XhoI 의 사이트가 생기는 프라이머를 이용하여 polymerase chain reaction (PCR) 을 실시했다. 얻어진 PCR 산물을 EcoRI, XhoI 로 절단한 후, 마찬가지로 EcoRI, XhoI 로 처리한 효모용 분비용 벡터 pCASS25 와 연결함으로써, Geotrichum candidum lipase 표층 발현 플라스미드 pCASS25GCL1 을 구축했다. 구축한 pCASS25GCL1 의 Geotrichum candidum lipase 유전자 부분의 염기 서열은 데옥시터미네이터법에 의해 에러가 없는 것을 확인했다. PCASS25GCL1 로 Saccharomyces cerevisiae EH1315 주를 형질 전환하고, 리파아제 표층 발현 효모를 제작했다. 프라스미드 유전자 도입의 확인은, 형질 전환주로부터 추출한 유전자를 주형으로서 Geotrichum candidum lipasc 유전자의 양단의 프라이머를 이용하여 PCR 을 실시하고, Geotrichum candidum lipase 유전자 사이즈 1.6kb 부근에서의 밴드의 증폭으로 확인했다.
(2) 마이크로 챔버 어레이 중에서의 형광 기질을 이용한 가수 분해 반응의 검출
상기의 순서로 조제된 Geotrichum candidum lipase 표층 발현 효모를 합성 배지 10mL 에서 2 일간, 30℃ 에서 진탕 배양 후, 배양액을 3000rpm, 4℃, 10 분에서 원심 분리하고, 집균했다. 얻어진 균체는 PBS 10mL 에서 현탁 후, 동일한 조건의 원심 분리로 집균했다. 균체의 세정을 한번 더 실시하고, 세정 균체는 PBS 1mL 로 현탁했다. 탁도를 OD600 에서 측정했다. 4℃ 로 유지한 상태의 마이크로 챔버 어레이 (내경 20㎛) 상에, 현탁 효모 40㎕ (OD600=0.6 상당) 를 산포하고, 4℃ 에서 10 분간 방치했다. 또한 그 액면을 따르게 하도록 기질 (0.1mM MU-C18/1％DMF/50mM 인산 완충액 (pH 7.0)) 360㎕ 를 첨가하고, 4℃ 에서 10 분간 방치했다. 미끄러지도록 커버 유리를 올려 수분을 압출하고, 그 후 플레이트를 습도 100％ 의 인큐베이터 (실온) 내에서 1 시간 반응시켜, 형광 현미경으로 관찰했다 (여기 파장 320㎚, 검출 파장 450㎚).
그 결과를 도 3(b) 에 나타낸다. 이 도면은, 배율 400 배의 현미경 사진이다. 이 도면에 나타내는 바와 같이, 기판 상의 각 마이크로 챔버에 있어서 형광이 관찰되고, Geotrichum candidum lipase 표층 발현 효모가 각 마이크로 챔버 내에 존재하는 것을 확인할 수 있었다.
[실시예 3] 해양성 미생물에 있어서의 마이크로 챔버 어레이 중에서의 형광 기질을 이용한 가수 분해 반응의 검출
해저로부터 채취한 Terrabacter 족의 해양 미생물 (문헌: J.Bacteriol. 179, 53-62, 1997: 에 기재된「Terrabacter 족의 세균의 16SrRNA 와 상동성이 100％ 인 균) 을 시판되는 marine broth (Difco, cat no. 279110) 10mL 에서 5 일간, 25℃ 에서 진탕 배양 후, 배양액을 8000rpm, 4℃, 5 분에서 원심 분리하고, 집균했다. 얻어진 균체는 PBS 10mL 에서 현탁 후, 동일한 조건의 원심 분리에서 집균했다. 균체의 세정을 한번 더 실시하고, 세정 균체는 PBS 1mL 로 현탁했다. 탁도를 OD600 에서 측정했다. 4℃ 로 유지한 상태의 마이크로 챔버 어레이 (내경 100㎛) 상에, 현탁 효모 40㎕ (OD600=0.6 상당) 를 산포하고, 4℃ 에서 10 분간 방치했다. 또한 그 액면을 따르게 하도록 기질 (0.1mM Fluorescein-diC 18/1％DMF/50mM 인산 완충액 (pH 7.0)) 360㎕ 를 첨가하고, 4℃ 에서 10 분간 방치했다. 미끄러지도록 커버 유리를 올려 수분을 압출하고, 그 후 플레이트를 습도 100％ 의 인큐베이터 (실온) 내에서 1 시간 반응시켜, 시판되는 마이크로 어레이 스캐너 (CRBIOTMIIe-FIPC) 로 검출했다 (여기 파장 473㎚, 검출 파장 532㎚).
그 결과를 도 3(c) 에 나타낸다. 이 도면에 나타내는 바와 같이, 기판 상의 각 마이크로 챔버에 있어서 형광이 관찰되고, 리파아제 활성을 갖는 단백질을 생산하는 해양 미생물이 마이크로 챔버 내에 존재하는 것을 확인할 수 있었다.
본 발명에 의하면, 단시간에 코스트가 들지 않는 스크리닝을 미량의 단위로 실시할 수 있다. 그 때문에, 게노믹스나 프로테오믹스에 있어서의 수많은 유전자나 단백질의 기능 해석에 유효하게 이용할 수 있다.

Claims (8)

  1. 어레이상으로 배치된 복수의 마이크로 챔버를 갖는 기판 상에, 분해함으로써 형광을 발하는 형광 기질을 첨가하는 공정과,
    단백질 또는 미생물을 함유하는 시료를 상기 기판 상에 적하하는 공정과,
    단백질 또는 미생물과 상기 형광 기질의 효소 반응에 의해 발생하는 형광을 검출함으로써, 상기 마이크로 챔버 내에 존재하는 효소 활성을 갖는 단백질 또는 그 단백질을 생산하는 미생물을 검출하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질 또는 미생물의 스크리닝 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 단백질은, 미생물의 세포막의 표층에 발현하고 있는 단백질이고,
    상기의 검출하는 공정에서는, 상기 복수의 마이크로 챔버 가운데, 형광을 발하는 마이크로 챔버를 검출함으로써, 효소 활성을 갖는 단백질을 세포막의 표층에 발현하고 있는 미생물을 검출하는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 마이크로 챔버의 내경은, 5 ∼ 500㎛ 인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기의 검출하는 공정 후에,
    상기 단백질이 함유되어 있는 마이크로 챔버 내의 내용물을 취출하는 공정을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
  5. 시료 중으로부터 효소 활성을 갖는 단백질 또는 그 단백질을 생산하고 있는 미생물을 스크리닝하는 장치로서,
    어레이상으로 배치된 복수의 마이크로 챔버를 갖는 기판과,
    상기 기판 상에서 발생하는 형광을 검출하는 형광 검출기를 구비하고,
    상기 형광 검출기는, 효소 활성을 갖는 단백질과 형광 기질의 효소 반응에 의해 발생하는 형광을 검출함으로써, 상기 마이크로 챔버 내에 존재하는 효소 활성을 갖는 단백질 또는 그 단백질을 생산하는 미생물을 검출하는 것을 특징으로 하는 단백질 또는 미생물의 스크리닝 장치.
  6. 제 5 항에 있어서,
    상기 단백질은, 미생물의 세포막의 표층에 발현하고 있는 단백질이고,
    상기 형광 검출기는, 상기 복수의 마이크로 챔버 가운데, 형광을 발하는 마이크로 챔버를 검출함으로써, 효소 활성을 갖는 단백질을 세포막의 표층에 발현하고 있는 미생물을 검출하는 것을 특징으로 하는 스크리닝 장치.
  7. 제 5 항 또는 제 6 항에 있어서,
    형광을 발하는 마이크로 챔버 내의 내용물을 취출하는 마이크로 매니플레이터를 추가로 구비하고 있는 것을 특징으로 하는 스크리닝 장치.
  8. 제 5 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 마이크로 챔버의 내경은, 5 ∼ 500㎛ 인 것을 특징으로 하는 스크리닝 장치.
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