FI96434C - Laite fluoresenssin vahvistamiseksi ja kinetiikka ja menetelmiä laitteen käyttämiseksi - Google Patents

Description

1 96434

Laite fluoresenssin vahvistamiseksi ja kinetiikka ja menetelmiä laitteen käyttämiseksi 5 Tämä keksintö koskee yleisesti laitetta fluoresenssin havaitsemiseksi. Laitetta voidaan käyttää bakteereiden ja muiden organismien nopeaksi tunnistamiseksi ja muiden biologisten näytteiden entsyymiprofiilien määrittämiseksi.

10 Fluorogeenisten substraattien entsyymihydrolyysin havaittavan fluoresoivan lajin tuottamiseksi tiedetään olevan hyödyllinen lukuisissa diagnostisissa käytöissä. Esimerkiksi lukuisat tutkijat ovat tutkineet mahdollisuutta käyttää fluorogeenisten substraattien levyä sen määrittämiseksi, mitkä entsyy-15 mit ovat läsnä näytteessä, joka sisältää tunnistamatonta mikro-organismia ja verrata profiilia tunnettuihin profiileihin tuntemattoman mikro-organismin tunnistamiseksi. Tämän fluorogeenisen havainnointijärjestelmän käytön haluttavuudesta huolimatta sen laajaa käyttöä ei ole omaksuttu lukuisis-20 ta syistä, jotka tekevät sen epäkäytännölliseksi.

Kun laboratoriot tunnistavat organismeja kliinisistä eristeistä, on tärkeä päämäärä nopea tunnistaminen. Useimmat kaupalliset bakteereiden tunnistusjärjestelmät vaativat 18-25 24 tunnin tai pitemmän ajan organismin eristämisen jälkeen tunnistuksen aikaansaamiseksi. Jotkut nykyisistä "nopeista" järjestelmistä vievät 3-13 tuntia. Nämä järjestelmät yleisesti luottavat organismin kasvua seuraavan jakson tuottamien sokeri- ja aminohappoaineenvaihdunnan happamien tai emäksis-30 ten sivutuotteiden havaitsemiseen.

'· Yksi menetelmä erityisten bakteerilajien tunnistamiseksi käyttäen substraattien entsymaattista lohkaisua on kuvattu Bascomb’in US patentissa No 4,603,108. Bascomb’in patentti 35 kuvaa välinesarjaa, mikä sisältää kokeet 26:lie perusentsyy-mille. Kussakin kokeessa entsyymi määritetään kykynsä mukaan reagoida erityisen substraatin kanssa. Koekortissa tai muussa 96434 2 laitteessa on lukuisia syvennyksiä tai osastoja, jotka erikseen sisältävät erityisiä substraattiliuoksia kutakin entsyy-mikoetta varten yhdessä muiden kokeita varten olevan reagens-sien kanssa. Käytössä lisätään bakteerisuspensiota kuhunkin 5 osastoon ja havaittava tuote kehittyy suhteellisen lyhyen inkubaatioajan kuluttua. Kussakin näytteessä olevan vastaavan entsyymin määrä määritetään sitten spektrometrisellä analyysillä käyttäen joko kolorimetriaa tai fluorometriaa.

10 Toinen patentissa kuvattu menetelmä käyttää 7 testiä yleisesti tavattujen bakteeriryhmien nopeaksi erottamiseksi. Bascomb opettaa, että joko 26 kokeen analyysi tai 7 kokeen analyysi antaa ainutkertaisen "sormenjäljen" lajeille tai ryhmälle lajeja. Kunkin ryhmän tai lajin entsyymiaktiivisuuden kvan-15 titatiivista määrittämistä voidaan käyttää ryhmän tai lajin tunnistamiseksi vertaamalla aikaisemmin tunnistettujen bakteerien aktiivisuusprofiileihin. Kuvatut erityiset kokeet määrittelevät aktiivisuuden havaitsemalla absorbanssin vir-tauskyvetissä. Voidaan käyttää erillistä näyteanalyysiä ja 20 jatkuvaa virtausanalyysiä. Bascomb’in patentin menetelmä vaatii suuren biomassan ja suuren nestetilavuuden ja lisäksi suhteellisen pitkän inkubaatioajan.

Muut tiedemiehet ovat käyttäneet fluorogeenisiä substraatteja 25 mikro-organismien tunnistamiseksi. Westley, J.W. et ai keskustelevat α-aminohappo-B-naftyyliamidisubstraattien käytöstä *: 24 bakteerikannan tunnistambiseksi ("Aminopeptidase Profiles of Various Bacteria"; Appi. Micro.. 15:822-825, 1967). Bakteerit suspendoitiin liuokseen ja niitä inkuboitiin subs-30 traattiliuosten kanssa. Vapautuneen B-naftyyliamiinin fluoresenssi mitattiin neljän tunnin inkubaation jälkeen.

. Toinen paperi, joka kuvaa fluorometrisen analyysin käyttöä 19 L-aminohappo-B-naftyyliamidin entsyymihydrolyysin mit-35 taamiseksi on Peterson, E.W. et ai., "Rapid Detection of

Selected Gram-Negative Bacteria by Aminopeptidase Profiles"; J. Food Sci.. 43:1853-1856 (1978). Kunkin viljelmän profiili saatiin 4-6 tunnissa.

Il 3 96434

Kirjallisuuskatsaus liittyen fluorogeenisten substraattien käyttöön mikrobien entsyymiaktiivisuuden profiloimiseksi sisältyy julkaisuun Godsey, J.H. et ai., "Rapid Identifica-5 tion of Enterobacteriaceae with Microbial Enzyme Activity Profiles"; J. Clin. Micro.. 13:483-490 (1981 ). Godseyn ryhmä ilmoittaa kahdeksantoista fluorogeenisen substraatin käytön tutkielmassa 539:stä Enterobacteriaceae-perheen kannasta. Hydrolyvsinopeuksia tarkkailtiin ensimmäisten 30 minuutin 10 ajan 2 ml:ssa puskuria sisältävää substraattia 37*C:ssa.

Ureaa lukuunottamatta kaikki substraatit olivat B-metyylium-belliferonin, B-naftyyliamiinin tai 7-amino-4-metyylikumarii-nin johdannaisia.

15 Koumara et al:n US-patentissa No 4,591,554 kuvataan fluore-senssianalyysiä käyttäen umbelliferonijohdannaisia menetelmänä havaita ja määrittää pienen mikro-organismimäärän lukumäärä. Menetelmässä umbelliferonijohdannainen lisätään näyte-liuokseen ja seosliuosta inkuboidaan. Sen jälkeen poistetaan 20 liukenemattomat jäännökset (esimerkiksi solut) ja fluoresenssi luetaan tavanomaiselta detektorilta. Fluoresenssin määrä suhteutetaan sitten mikro-organismien lukumäärään. Esimerkit kuvaavat kokeita, joissa substraattia sisältävä liuos sekoitetaan bakteereita sisältävän liuoksen kanssa. Inkuboinnin 25 jälkeen pH säädetään ja seos sentrifugoidaan liukenemattomien solujen poistamiseksi. Sen jälkeen vapautuneen 4-metyylium-.* belliferonin fluoresenssi määritetään. Joissakin tapauksissa käytetään koentsyymejä. Toisissa tapauksissa solut rikotaan vapautuneiden entsyymien määrän lisäämiseksi.

30

Fluorogeenisten substraattien tiedetään myös olevan hyödyllisiä elävissä organismeissa olevien solun ulkoisten entsyy-·. mien analysoimiseksi (Snyder, A. et ai., "Pattern Recognition

Analysis of In-Vivo Enzyme-Substrate Fluorescence Velocities 35 in Microorganism Detection and Identification"; App. & Enviro Micro, 51:969-977 (1986)). Reaktioajat olivat viisitoista minuuttia tai alle. Analyysit suoritettiin 2 ml:n puskurissa. Tämä työ muodostaa myös pohjan kansainväliselle patenttiha- 96434 4 kemukselle, jonka nimitys on "Viable Microorganism Detection by Induced Fluorescence" ja hakija on University of Cincinnati (PCT- julkaisu No. WO 86/05206, päivämäärällä 12 syyskuuta 1986).

5

Vielä yksi tekniikka bakteerien "sormenjälkien" saamiseksi perustuen entsyymisisällön ja aktiivisuuden eroihin on kuvattu julkaisussa Chou-Pong Pau et ai, "A Rapid Enzymatic Procedure for ’Fingerprinting’ Bacteria by Using Pattern Recog-10 nition of Two-Dimensional Fluorescence Data"; Clin. Chem. 32:987-991 (1986). Siinä järjestelmässä käytetään kuuden fluorogeenisen substraatin seosta, joista kullakin on erilainen fluoresenssiosa. Fluoresenssin lisääntymisiä tarkkaillaan 30 minuutin jakson ajan. Fluoresenssitiedon Fourier-muunnosta 15 käytetään tuottamaan kaksidimensionaalinen ryhmä, joka on tunnusomainen kullekin koeorganismille. Tämä menetelmä vaatii monimutkaisen ja kalliin laitteiston käyttöä mittausten suorittamiseksi ja matemaattisen muunnoksen suorittamiseksi .

20

Vapaiden fluoresoivien aineiden käyttö diagnostiikassa on hyvin tunnettua. Monien vapaiden fluoresoivien aineiden tiedetään heikentyvän tai voimistuvan ympäristön olosuhteiden, kuten pH:n, redox-potentiaalin tai hapen osapaineen vaih-25 teluiden takia. Tällaisia fluoresoivia aineita käytetään havainnoimaan tai tarkkailemaan sitä ympäristötilaa, joka vaikuttaa niiden fluoresenssiin.

Kukin ylläkuvatuista menetelmistä näytteessä olevan analyytin 30 määrän tunnistamiseksi tai määrittämiseksi havainnoimalla tai tarkkailemalla fluorogeenisen substraatin entsyymihydro-lyysiä vaatii vesipitoisen ympäristön. Samoin, kun käytetään *. vapaita fluoresoivia aineita tarkkailemaan ympäristön muu toksia biologisessa koejärjestelmässä, vaaditaan vesipitoinen 35 ympäristö. Ongelmia tulee suunniteltaessa vesipitoisia koejärjestelmiä, joissa käytetään vapaita fluoresoivia aineita tai fluorogeenisia substraatteja ja joilla on hyväksyttävät varastoinnin kestävyydet, koska vapaat fluoresoivat aineet il 96434 5 ja fluorogeeniset substraatit tarvitsevat kuivia olosuhteita pitääkseen parhaiten pysyvyytensä. Täten yksi suunnittelun haaste on ongelma saada aikaan vapaa fluoresoiva aine tai fluorogeeninen substraatti kuivassa tilassa.

5

Kun fluorogeenisia substraatteja varastoidaan kuivana, niiden tarvitsee olla saatavilla reagoidakseen entsyymin kanssa niin, että ne saavuttavat nopeasti tasapainoreaktion, mikä seuraa vesipitoisen koesuspension tai -liuoksen lisäämistä.

10 Tätä haastetta ei ratkaista helposti, koska fluorogeenisilla substraateilla on erilaisia liukoisuuksia veteen. Vähiten veteen liukenevat ovat yleisesti lipaasisubstraatteja. Tämä haaste on erityisen vaikea niillä substraateilla, joiden vesiliukoisuus on alhainen.

15

Yksi fluoresoivien materiaalien kantajana käytetty materiaali on selluloosasuodatinpaperi. Whatman No. 4-paperia käytti pyreenin, benzo[a]pyreenin, kryseenin ja liuotinpuhdistetun hiilen analyysissä lämpötilassa 4* K Tuan Vo-Dinh julkaisussa 20 "Fluorescence Line-Narrowing Spectrometry of Polycyclic

Compounds on Filter Paper Substrates", Anal. Chem. 58:3135-3139 (1986).

Eräs herkkyyden mittauksen tuotelinja käyttää suodatinpaperia 25 fluorogeenisten substraattien varastointiin. Sensititre™- herkkyyspaneeleissa (Radiometer of Copenhagen, Inc., Kööpenhamina, Tanska) fluorogeenisiä substraatteja on toimitettu kuivana suodatinpaperilla. Käytössä suodatinpaperikaistaleet asetetaan liemeen ja fluorogeeninen substraatti eluoidaan 30 liuokseen. Sen jälkeen liemi annostellaan mikrokuoppiin, joissa 1iuosherkkyyskoe suoritetaan.

Eräs toinen ongelma, joka kohdataan, kun kuvataan entsyymi-profiilia mikro-organismin tai patologisen tilan tunnistami-35 seksi, on riittämättömän biomassan ongelma. Mikro-organismin tunnistuskokeissa tunnistettava mikro-organismi saadaan mielellään eristetystä bakteeripesäkkeestä yli yön seisoneelta sivelylevyltä, joka on valmistettu kliinisestä näytteestä • · 96434' 6 tai suoraan positiivisesta veriviljelyputkesta. Näissä molemmissa olosuhteissa saatavilla olevien mikro-organismien lukumäärä on rajoitettu. Samoin kun biologista näytettä analysoidaan endogeenisen entsyymipitoisuuden suhteen, voi 5 analyysiä varten saatavilla olevan biologisen nesteen tai kudoksen määrä olla rajoitettu. Täten kuvaamisen suorittamiseen tarvittavan biomassan määrä tulisi minimoida. Nopeiden tuloksien saamiseksi on tarpeen korkea biomassapitoisuus. Näiden kahden kriteerin tyydyttämiseksi analyysijärjestelmä 10 tulisi tehdä siinä määrin pieneksi kuin se on järkevästi mahdollista. Pieneksi tekeminen pienen biomassan käytön sallimiseksi aiheuttaa toisen ongelman. Fluorogeenisen substraatin ja saatavilla olevan entsyymin pitoisuuden annetuilla määrillä järjestelmän pieneksi tekeminen vähentää aikayk-15 sikköä kohti hydrolysoituneen substraatin määrää. Aikayksikköä kohti oleva kokonaisfluoresenssin muutos vähenee myös.

Täten on olemassa tarvetta pieneksi tehdystä järjestelmästä, jolla on hyväksyttävä säilyvyysaika, joka vaatii pienen 20 näytteen biomassan, aikaansaa nopean tasapainottumisen vakioiseen kinetiikkaan näytteen lisäyksen jälkeen ja antaa tuloksena vahvistuneen fluoresenssisignaalin.

Tämän keksinnön mukaisessa laitteessa on kantaja, jossa on 25 ainakin yksi kinetiikkaa ja fluoresenssia vahvistava alusta asennettuna sille tai siihen. Kinetiikkaan ja fluoresenssia * vahvistavalle alustalle on levitetty kuiva-aine, joka on valittu ryhmästä, joka käsittää fluorogeenisia substraatteja; B-metyyliumbelliferoni, 7-amino-4-metyylikumariini, B-naf- 30 tyyliamiini, fluoreseiini ja resorufiini. Kinetiikkaa ja fluoresenssia vahvistavan alustan pinta-ala on riittävän suuri kuiva-aineen tehokkaan määrän pidättämiseksi.

Laitteessa on mieluummin lukuisia kinetiikkaa ja fluoresens-35 siä vahvistavia alustoja ja kuiva-aine on fluorogeeninen substraatti. Erityisen hyvänä pidetyssä suoritusmuodossa kinetiikkaa ja fluoresenssia vahvistavat alustat ovat tehtyjä aineesta, jolla on korkea pinta-alan ja tilavuuden suhde.

• «

II

96434 7

Kaikkein mieluimmin pinta-alan ja huokostilavuuden tulisi olla riittävät tehokkaan kuiva-aineen määrän kannattamiseksi, mikä määrä on saatavilla kostutettavaksi vesipitoisella näytteellä, jonka alustan huokostilavuus vastaanottaa.

5

Kuiva-aine levitetään sopivasti sen kinetiikkaa ja fluoresenssia vahvistavalle alustalle liuottamalla se sopivaan vedettömään liuottimeen ja levittämällä liuos sen kinetiikkaa ja fluoresenssia vahvistavalle alustalle. Liuotin poistetaan 10 sopivalla tavalla, kuten vakuumikuivauksen avulla. Vaihtoehtoisesti aineen liuos voidaan absorboida sen kinetiikkaa ja fluoresenssia vahvistavalle alustalle ja kinetiikkaa ja fluoresenssia vahvistavan alustan pinta-alan ja tilavuuden suhde on riittävä jättämään sellaisen huokostilavuuden, joka 15 vastaanottaa analysoitavan näytteen. Kinetiikkaa ja fluoresenssia vahvistavaa alustaa, jolle kuiva-aine on kuivattu, voidaan sitten varastoida, mieluummin alhaisen kosteuden ja alhaisen lämpötilan ympäristössä pitkiä aikoja.

20 Tämän keksinnön entsyyminkuvausmenetelmä käyttää kuiva-ainetta, joka on valittu fluorogeenisten substraattien ryhmästä; B-metyyliumbelliferoni, 7-amino-4-metyylikumariini, B-naf-tyyliamiini, fluoreseiini ja resorufiini yhden tai useamman entsyymin tason nopeaksi määrittämiseksi tai biologisessa 25 näytteessä olevien entsyymien profiilin määrittämiseksi.

Menetelmä on hyödyllinen tautitilojen seulonnassa (esimerkiksi liiallinen alkaalinen fosfataasi siemennesteessä on merkki eturauhassyövästä) ja näytteessä olevan organismin tunnistamiseksi. Useimmissa tapauksissa määritettävät organismit 30 ovat bakteereja. Kuitenkin muitakin mikro-organismeja, kuten sieniä voidaan myös määrittää. Keksinnön menetelmä voi olla hyödyllinen myös lukuisien biologisten näytteiden, mukaanlukien mikro-organismien ja ruumiin nesteiden suspensiot tai dispergoidut kudosnäytteet, entsyymiprofiil ien kuvaami-35 sessa. Sitä voidaan käyttää antibioottiherkkyyden ja pienimmän estävän lääkeainepitoisuuden havainnoimisesa valituille organismeille käyttäen fluorogeenisia substraatteja, vapaita fluoresoivia aineita tai molempia yhdistelmänä valittujen an- • · 8 96434 tibioottien vaihtelevina pitoisuuksina organismin aineenvaihdunnan tai kasvun läsnäolon tai poissaolon havainnoimiseksi.

Tämän keksinnön entsyyminkuvausmenetelmässä nestenäyte lisä-5 tään yhteen tai useampaan lukuisista kinetiikkaa ja fluoresenssia vahvistavista alustoista. Kullekin kinetiikkaa ja fluoresenssia vahvistavista alustoista on kuivattu fluorogee-ninen substraatti tai fluoresoiva aine, joka on valittu ryhmästä, joka käsittää B-metyyliumbelliferonin, 7-amino-4-10 metyylikumariinin, B-naftyyliamiinin, fluoreseiinin ja reso-rufiinin. Näytteessä läsnäolevat entsyymit hydrolysoivat substraattinsa. Jos substraatit ovat fluorogeenisia, määritetään hydrolyysinopeudet mittaamalla fluoresoivan tuotteen syntymisnopeus. Jos substraatti ei ole fluorogeeninen, kine-15 tilkkaa ja fluoresenssia vahvistavalle alustalle on levitetty entsyymisubstraatti ja kuiva, vapaa fluoresoiva aine, joka vahvistuu tai tukahtuu hydrolyysituotteen läsnäollessa (Esimerkiksi happo, emäs, 02). Tällä tavalla havaitaan erityistä substraattia hydrolysoivan entsyymin läsnäolo ja haluttaessa 20 näytteen yhden tai useamman entsyymin reaktionopeusprofiili todetaan. Näytteen entsyymin reaktionopeusprofiili analysoidaan sitten.

Tunnistettaessa mikro-organismeja reaktionopeusprofiilia 25 verrataan tunnettujen mikro-organismien reaktionopeusprofii-leihin tuntemattoman mikro-organismin tunnistamiseksi. Mitat-- taessa antibioottiherkkyyttä ja pienintä estävää pitoisuutta, on entsyymiaktiivisuuden poissaolo antibiootin läsnäollessa verrattuna vertailunäytteen entsyymiaktiivisuuden läsnäoloon 30 merkki antibiootin tehokkuudesta.

Kun tämän keksinnön kinetiikkaa ja fluoresenssia vahvistavia ’ alustoja käytetään kuivattujen fluorogeenisten substraattien kanssa, jotka on saatettu kosketuksiin entsyymiensä kanssa 35 nestenäytteessä, havaitaan entsyymin ja substraatin välisen vuorovaikutuksen olennainen voimistuminen. Entsyymin ja substraatin välisen vuorovaikutuksen kinetiikkaa voimistetaan siinä, että havaitaan nopea tasapainottuminen vakioiseksi

II

9 96454 kinetiikaksi. Helposti vesiliukoiset substraatit liukenevat nopeasti. Nämä substraatit saavuttavat samalla nopeasti vakioisen kinetiikan. Yllättävästi myös ne fluorogeeniset substraatit, joilla on katsottu olevan mariginaalinen vesi-5 liukoisuus, nopeasti saavuttavat vakioiset reaktio-olosuhteet. Substraatit, joilla on alhainen liukoisuus, näyttävät korkeaa entsyymispesifistä reaktionopeutta tuotaessa kosketuksiin nestemäisen biologisen näytteen kanssa, jos ne on levitetty sopivan luonteiselle kinetiikkaa ja fluoresenssia 10 vahvistavalle alustalle.

Keksinnön kinetiikkaa ja fluoresenssia vahvistavien alustojen toinen etu on siinä, että ne vahvistavat suuresti fluoresenssia verrattuna saman fluoresoivan aineen fluoresenssiin, 15 kun se mitataan puhtaasti nesteympäristössä. Yllättävästi fluoresoivan aineen ja alustan välinen vuorovaikutus aiheuttaa huomattavaa fluoresenssin voimistumista. Tämä havainto on vastoin odotettuja tuloksia, koska hajonnan ja absorption tulisi alentaa sen virityssäteilyn voimakkuutta, mikä saavut-20 taa fluoresoivan aineen millä tahansa kiinteän alustan syvyydellä. Samoin sen emittoituvan fluoresoivan valon voimakkuuden, mikä tuotetaan millä tahansa kiinteän alustan syvyydellä, tulisi myös vähentyä alustan hajonnan ja absorption takia. Kiinteään alustaan absorboidun ja virityssäteilyn 25 annetulla voimakkuudella viritetyn fluoresoivan aineen kirkkaasta liuoksesta saadun ulkoisen fluoresoivan signaalin ; tulisi olla vähemmän voimakas kuin sen signaalin, joka on saatu valaisemalla kirkasta liuosta yksin samanlaisella viritysenergialla. Tässä keksinnössä sopivalla kinetiikkaa 30 ja fluoresenssia vahvistavan alustan materiaalin valinnalla tulee fluoresoiva signaali monta kertaa suuremmaksi, kun fluoresoivan aineen liuos absorboidaan kiinteään alustaan.

Kuvio 1 esittää tämän keksinnön laitteen parhaana pidetyn 35 rakenteen, jossa kinetiikkaa ja fluoresenssia vahvistavat alustat on kiinnitetty tasomaiselle alustalle; 10 9643 4

Kuvio 2 esittää tämän keksinnön laitteen vaihtoehtoisen rakenteen, jossa kinetiikkaa ja fluoresenssia vahvistavat alustat ovat koekuopissa; 5 Kuvio 3 esittää E.Colia käyttäen hydrolyysinopeudet 4-metyy_ liumbelliferoni-B-D-galaktosidille tämän keksinnön mukaisiHe kinetiikkaa ja fluoresenssia vahvistaville alustoille levitettynä (Esimerkki 2); 10 Kuvio 4 esittää hydrolyysinopeudet P. aeruginosaa käyttäen 4-metyyliumbelliferonipalmitaatille levitettynä mikrokuoppiin ja levitettynä tämän keksinnön mukaisille kinetiikkaa ja fluoresenssia vahvistaville alustoille (Esimerkki 4); 15 Kuvio 5 esittää hydrolyysinopeudet K. pneumoniaea käyttäen 4-metyyliumbelliferonifosfaatille levitettynä mikrokuoppiin ja levitettynä tämän keksinnön mukaisille kinetiikkaa ja fluoresenssia vahvistaville alustoille (Esimerkki 4); 20 Kuvio 6 esittää nopeuden, jolla S. Marcescens hydrolysoi L-leusiini-7-amido-4-metyylikumariinia (Esimerkki 5);

Kuvio 7 esittää nopeuden, jolla S. Marcescens hydrolysoi L-fenyylialaniini-7-amido-4-metyylikumariinia (Esimerkki 5); 25

Kuvio 8 esittää nopeuden, jolla S. Marcescens hydrolysoi L-’ alaniini-7-amido-4-metyylikumariinia (Esimerkki 5); ja

Kuvio 9 esittää pH:n vaikutuksen B-metyyliumbelliferonin 30 fluoresenssisignaaliin (Esimerkki 8).

. Kuten on esitetty kuviossa 1, parhaana pidetty tämän keksin nön koelaite 10 valmistetaan kiinnittämällä sopiva lukumäärä ja ryhmä kinetiikkaa ja fluoresenssia vahvistavia alustoja 35 li kantajalle 12, kuten kortille tai muulle pinta-alustalle. Kantaja on edullisesti (muttei välttämättä) jäykkä ja tasomainen. Sopivat materiaalit sisältävät polyeteenin, polypropeenin, polyvinyylikloridin, akrylonitriili-butadieeni-sty-

II

n 96434 reenin, fluoropolymeerit, polykarbonaatit, ja akryylit. Polypropeenia pidetään parhaimpana.

Vaihtoehtoisesti kantaja voi olla tarjotin 13 tai liuska, 5 jossa on lukuisia koekuoppia 14, so. tavanomainen mikrokuop-palevy tai -liuska. Tässä tapauksessa laite asennetaan asettamalla kinetiikkaa ja fluoresenssia vahvistavat alustat 15 yksilöllisiin koekuoppiin 14 sopivana ryhmänä ja lukumääränä aiottua käyttöä varten.

10

Sopivan materiaalin valinta kinetiikkaa ja fluoresenssia vahvistavaa alustaa varten käsittää useita harkittavia seikkoja. Yleisesti kinetiikkaa ja fluoresenssia vahvistavan alustan ei tulisi olla reaktiokykyinen kuivan fluorogeenisen 15 substraatin tai sille levitetyn vapaan fluoresoivan aineen kanssa; kinetiikkaa ja fluoresenssia vahvistavalla alustalla tulisi mielellään olla ominaisuuksia, jotka vahvistavat fluoresenssia ja sillä itsellä ei tulisi olla olennaista fluoresenssia; kinetiikkaa ja fluoresenssia vahvistavalla 20 alustalla tulisi olla pinta-alan ja tilavuuden suhde, joka on riittävä kuiva-aineen tai vapaan fluoresoivan aineen tehokkaan määrän pidättämiseksi ja mielellään näytesuspension tai -liuoksen vastaanottamiseksi; kinetiikkaa ja fluoresenssia vahvistavan alustan tulisi olla riittävän hydrofiilinen 25 tullakseen kostutetuksi nestenäytteellä; ja kinetiikkaa ja fluoresenssia vahvistavalla alustalla tulisi olla suuri 4 : lukumäärä paikkoja, jotka kykenevät pidättämään hydrofobisia materiaaleja. Sopivat materiaalit käytettäväksi tämän keksinnön kinetiikkaa ja fluoresenssia vahvistavana alustana sisäl-30 tävät alfaselluloosan ja pH-neutraloidun lasikuidun. Erityisen parhaana pidettyjä ovat alfaselluloosa puuvillanöyhtäpa-perin muodossa (esimerkiksi paperit numerot 740-E ja 903, ; jotka ovat saatavilla yrityksestä Schleicher & Schuell,

Keene, NH) ja alustamatriisi, joka on saatavilla tutkimus-35 ja tuotekehitysmäärissä varustettuna merkinnällä Hydrophilic HDC™ (Pali BioSupport Corp., Glen Cove, NY).

12 9643 4

Yleisesti kinetiikkaa ja fluoresenssia vahvistavan alustan paksuus ja pinta-ala ovat vaikuttavia kriteerejä optimoitaessa keksinnön menetelmiä. Missä kinetiikkaa ja fluoresenssia vahvistavalla alustalla on sille levitetty substraatti, 5 kinetiikkaa ja fluoresenssia vahvistavan alustan paksuuden tulisi olla riittävä kantamaan tehokas määrä substraattia reaktiota varten saatavilla olevan entsyymin tai entsyymien, jotka ovat läsnä näytteessä, kanssa. Samoin, missä alusta on varustettu vain kuivalla, vapaalla fluoresoivalla aineella 10 sille levitettynä, paksuus on mieluiten riittävä vastaanottamaan aiotun reaktiojärjestelmän loput komponentit menetelmän aikana. Yleisesti 0,1 - 0,2 ismin paksuus on sopiva. 0,2 -1,0 mm:n paksuutta voidaan mukavasti käyttää ja 0,5 - n.0,9 mm:n paksuutta pidetään parempana. Paksuus yhteistoiminnassa 15 pinta-alan kanssa määrittää sen nesteen tilavuuden, mikä tarvitaan kostuttamaan kokonaan kinetiikkaa ja fluoresenssia vahvistava alusta.

Kinetiikkaa ja fluoresenssia vahvistavan alustan muoto ei 20 ole kriittinen. Mukavasti kinetiikkaa ja fluoresenssia vahvistava alusta muodostetaan täysin ympyrämäisenä sylinterinä (levy), jonka halkaisija on noin 1,0 mm - noin 10 mm, mikä vastaa noin 0,8 mm2 - 80 mm2:n pinta-alaa, mikä on saatavilla kuivan substraatin, vapaan fluoresoivan aineen tai molempien 25 pidättämiseksi. Kinetiikkaa ja fluoresenssia vahvistavan alustan huokostilavuus 1 μΐ - 100 μΐ on sopiva. Välillä 1 μΐ - 75 μΐ olevia huokostilavuuksia voidaan käyttää. Huokostilavuus on edullisesti noin 1 mikrolitraa (0,001 cm3) -noin 25 mikrolitraa (0,025 cm3).

30 Tässä keksinnössä käyttökelpoisia substraatteja ovat ne fluorogeeniset ja ei-fluorogeeniset substraatit, joiden on • havaittu olevan reaktiokykyisiä näytteessä läsnä olevien entsyymien kanssa. Fluorogeeniset substraatit valitaan taval-35 lisesti orgaanisten ja epäorgaanisten happojen, glykosidien ja peptidien fluorogeenisista analogeista.

• ·

II

13 96434

Kun keksinnön entsyyminkuvausmenetelmää käytetään mikro-organismien tunnistamiseen, pidetään parempana saman fluoresoivan aineen käyttöä kunkin fluorogeenisen substraatin valmistamiseksi, vaikkakin erilaisia fluoresoivia aineita 5 voidaan käyttää eri substraatteja varten. Fluoresoiva aine kytketään luonnolliseen substraattipuoliskoon millä tahansa sopivalla tavalla, tavallisesti kovalenttisidoksella. Sopivat fluoresoivat aineet voivat sisältää, mutta eivät ole välttämättä rajoitettuja niihin, B-metyyliumbelliferonin, 7-amino-10 4-metyylikumariinin ja muut senkaltaiset kumariinijohdokset, B-naftyyliamiinijohdokset ja senkaltaiset resorufiinin ja fluoreseiinin additiotuotteet.

Keksinnön kinetiikkaa ja fluoresenssia vahvistavat alustat 15 ovat edullisesti valmistettuja liuottamalla fluorogeeninen substraatti tai vapaa fluoresoiva aine sopivaan liuottimeen, kuten dimetyylisulfoksidiin tai kloroformiin. Liuotettu substraatti tai vapaa fluoresoiva aine levitetään kinetiikkaa ja fluoresenssia vahvistavalle alustalleen. Sen jälkeen, 20 kun liuos on levitetty kinetiikkaa ja fluoresenssia vahvistavalle alustalle, voidaan liuotin poistaa sopivalla tavalla, kuten vakuumikuivauksella. Tällä tavalla substraatti pysyy kinetiikkaa ja fluoresenssia vahvistavalla alustalla. Kinetiikkaa ja fluoresenssia vahvistavia alustoja voidaan 25 sitten varastoida pitkiä aikoja mieluiten matalan lämpötilan ja alhaisen kosteuden tilassa.

Parhaana pidetyssä laitteessa on kinetiikkaa ja fluoresenssia vahvistavat alustat asennettu kortille. Tämä suoritusmuoto 30 tekee tarpeettomaksi nesteen asettamisen kuoppaan tai säiliöön. Eräässä parhaana pidetyssä keksinnön muodossa selluloosa-arkit päällystetään liimalla toiselta puolelta ja stans-sataan meistin läpi tasomaiselle muoviselle polypropeenikan-tajalle jättäen erilliset selluloosakiekot kiinnitettyinä 35 muovipinnalle. Sen jälkeen kun kiekot on päällystetty fluo-rogeenisella substraatilla tai vapaalla fluoresoivalla aineella ja kuivattu, nesteliuos tai -suspensio voidaan sitten asettaa suoraan kullekin kiekolle ja fluoresenssi lukea 96434' 14 laitteella. Kun käytetty nestetilavuus on vähemmän tai suurinpiirtein yhtä suuri kuin se nestemäärä, mikä on tarpeen kiekon kyllästämiseksi, ei tarvita mitään kuoppaa tai säiliötä nesteen sisältämiseksi.

5 Tämän keksinnön entsyyminkuvausmenetelmä sallii kliinisistä näytteistä eristettyjen mikro-organismien nopean tunnistamisen. Sellaiset kliiniset näytteet voivat sisältää virtsan, ulosteen, haava-, kurkku-, sukupuolielinnäytteet tai nor-10 maalisti steriilit ruumiin nesteet, kuten veren tai selkäydinnesteen. Mikro-organismit on tavallisesti eristetty näytteestä ennen tunnistamista.

Bakteeriviljelmäpesäkkeet, kun ne valmistetaan biologisista 15 näytteistä, kerätään riittävän kasvukauden jälkeen (tavallisesti noin 18 tuntia). Kerätty pesäke suspendoidaan sopivaan vesipitoiseen nesteeseen keksinnön menetelmällä tunnistamista varten. Mikro-organismien tai biologisen näytteen valmistettu suspensio levitetään suoraan kinetiikkaa ja 20 fluoresenssia vahvistavalle alustalle. Vaikka analyysi voidaan suorittaa koskemattomilla soluilla, jonkinlainen solujen käsittely entsyymin saatavuuden lisäämiseksi voi olla toivottavaa. Esimerkiksi voidaan käyttää alhaisia tasoja deter-genttejä solukalvon läpäisevyyden lisäämiseksi. Äärimmäisenä 25 esimerkkinä voi olla toivottavaa solukalvon täydellinen rikkominen. Mitä tahansa tunnettua käsittelyä voidaan käyttää vaikuttamaan solukalvoon halutulla tavalla.

Kinetiikkaa ja fluoresenssia vahvistavien alustojen lukumää-30 rä, mikä vaaditaan tietyn mikro-organismin tunnistamiseksi riippuu mikro-organismista. Joissakin tapauksissa yksi alusta voi olla tarpeeksi. Toisissa tapauksissa neljäkymmentä tai ] enemmänkin alustoja voidaan vaatia yhden mikro-organismin erottamiseksi toisesta, jolla on hyvin samanlainen profiili. 35

Entsyyminkuvausmenetelmässä nestenäyte, riippumatta sen valmistusmenetelmästä, levitetään kullekin kinetiikkaa ja fluoresenssia vahvistavalle alustalle. Kuten esitettiin,

II

96434' 15 kukin kinetiikkaa ja fluoresenssia vahvistava alusta eroaa muista joko fluorogeenisen substraatin (tai vapaan fluoresoivan aineen) tai sen pitoisuuden suhteen. Mieluummin kinetiikkaa ja fluoresenssia vahvistava alusta on kyllästetty näyt-5 teellä samalla kun kinetiikkaa ja fluoresenssia vahvistavan alustan pinnalla oleva vapaa neste on minimoitu. Tyypilliset kinetiikkaa ja fluoresenssia vahvistavien alustojen kylläs-tymistilavuudet ovat parhaana pidetyllä kokoalueella noin 3 μΐ - noin 25 μΐ.

10

Sopivan ajanjakson kuluttua, tavallisesti noin 2 minuuttia -noin 30 minuuttia, määritetään entsyymin reaktion aste kunkin substraatin kanssa tutkimalla kukin kinetiikkaa ja fluoresenssia vahvistavista alustoista fluorometrin avulla käyttäen 15 sopivia viritys- ja emissioaallonpituuksia erityistä fluoresoivaa ainetta varten.

Sitten määritetään entsyymien ja lukuisien fluorogeenisten substraattien välisten reaktioiden nopeuksien profiili ja 20 tuloksena olevaa profiilia verrataan tunnettujen mikro-organismien vertailunopeusprofiileihin niiden erityisten mikro-organismien tunnistamiseksi, joita varten profiili luotiin.

Ensimmäinen fluoresenssilukema otetaan niin pian lisäyksen 25 jälkeen kuin sopivaa kutakin kinetiikkaa ja fluoresenssia vahvistavaa alustaa varten käyttäen epifluoresenssitekniik-kaa, jolloin viritys- ja emissioaallonpituudet on valittu sopivasti erityistä fluoresoivaa ainetta varten. Sen jälkeisiä lukemia otetaan sitten valituin aikavälein. Käytetään 30 yhden minuutin aikavälejä tai jotakin muuta sopivaa aikaväliä fluoresenssilukemien keräämiseksi inkubaatiojakson aikana, mikä jakso voi mukavasti olla 2-30 minuuttia.

Reaktionopeudet voidaan sitten määrittää kullekin kinetiik-35 kaa ja fluoresenssia vahvistavalle alustalle. Nämä nopeudet voidaan normaloida näytesuspension sameuden suhteen. Johtuen sellaisista reaktioista havaittujen, tuloksena olevien fluo-resenssivoimakkuuksien laajasta skaalasta, pidetään parhaana 96434 16 joitakin käytettyjä substraatteja varten vaihtelevaa fotometrin detektointiherkkyyttä. Eräs väline tämän vaihtelevan herkkyyden saamiseksi on muuttaa fluoresoivaa emissiota tarkkailevan fotomonistinputken korkeajännitettä. Tämä säätö 5 voi olla joko käsin tai automaattisesti säädetty. Reaktionopeuksien normalisointia sen herkkyyden suhteen, mitä käytetään tarkkailemaan reaktiota, pidetään myös parhaana tapana.

Kun menetelmää käytetään tuntemattoman mikro-organismin 10 tunnistamiseen, luodaan nopeusprofiili kaikille kinetiikkaa ja fluoresenssia vahvistaville alustoille ja sitten niitä verrataan aikaisemmin julkaistuihin nopeusprofiileihin tunnettujen organismien tietokannasta. Sitten voidaan käyttää sopivaa algoritmia tuntemattoman mikro-organismin parhaiten 15 sopivan tunnisteen määrittämiseksi. Esimerkiksi yhdessä tunnistamismenetelmässä määritetään todennäköisyys sille, että tietty vertailukanta aikaansaa substraatin hydrolyysi-nopeuden, joka on tietyllä nopeusalueella, kullekin substraatille lukuisien substraattien joukosta. Sitten tuntemattoman 20 organismin todellisia hydrolyysinopeuksia verrataan tietokantaan, joka sisältää kunkin vertailukannan todennäköisyydet sen todennäköisyyden määrittämiseksi, että tuntematon on kunkin erityisen vertailukannan jäsen. Täten määritetyt todennäköisyydet normalisoidaan sitten tuntematonta varten 25 jakamalla se todennäköisyys, että tuntematon on samaa kantaa kuin vertailukanta kaikkien vertailukantojen todennäköisyyk- 9 .· sien summalla. Nämä normalisoidut todennäköisyydet kerrotaan sitten sadalla niiden esittämiseksi prosentteina. Se vertailukanta, jonka prosentuaalinen todennäköisyys on suurin, 30 on se kanta, joka tuntematon on kaikkein todennäköisimmin. Kaikki tiedon hankkiminen ja analyysi suoritetaan toivottavasti tietokoneella.

Tämän keksinnön kinetiikkaa ja fluoresenssia vahvistavien 35 alustojen käytön lisäetu on nestefluoresenssin toistettavam-pi välineellinen mittaus. Kun määritetään mikrokuopissa olevien pienten nestetilavuuksien fluoresenssia, aiheuttaa kuopan pinnan hydrofobisuus vaihteluita mittauksen tarkkuu-

II

17 96434 teen vaikuttavan linssin muodossa. Nestepisaran asema kuopassa tulee myös kriittiseksi, koska hyvin pienet nestetilavuu-det eivät peitä tasaisesti kuopan pohjaa. Nämä ongelmat voidaan välttää osittain lisäämällä pinta-aktiiviaineita 5 laimennusnesteeseen tai muovikuoppien pinnan esikäsittelyllä, mutta nämä käsittelyt luovat lisähankaluuksia järjestelmälle (esimerkiksi pinta-aktiiviaineet vaikuttavat organismin solukalvoihin).

10 Hyvin sameiden bakteerisuspensioiden käyttö konventionaalisissa järjestelmissä vaikuttaa myös fluoresenssin mittaukseen. Pelkässä nestejärjestelmässä nämä sameat suspensiot (noin MacFarland No. 4 pitoisuus) häiritsevät fluoresenssilu-kemaa hajottamalla suoraan ja absorboimalla paljon viritys- 15 energiasta. Kun käytetään tämän keksinnön kinetiikkaa ja fluoresenssia vahvistavia alustoja, kinetiikkaa ja fluoresenssia vahvistavat alustat ottavat sisäänsä bakteerit. Tämän keksinnön järjestelmässä hyvin sameilla suspensioilla on vähän vaikutusta haluttuun fluoresenssimittaukseen.

20

Seuraavat esimerkit kuvaavat lisää keksinnön eri piirteitä, mutta niiden ei ole aiottu millään tavalla rajoittavan keksinnön suojapiiriä, mikä on määritelty oheisissa patenttivaatimuksissa .

25 ESIMERKKI 1 Käytettiin fluorometria, joka oli muotoiltu lukemaan mik-rokuoppalevyille asetettua metyyliumbelliferonia 30 (MicroFLUOR™ Reader, Dynatech Laboratories, Inc., Chantilly, VA 22021), tutkiakseen vapaiden fluoresoivien aineiden; B-metyyliumbelliferoni (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO ·_ 63178) ja 7-amino-4-metyylikumariini (Polysciences, Inc.,

Warrington, PA 18976) fluoresenssiominaisuuksia.

Pitoisuuden ja tilavuuden suhdetta fluoresenssiin tutkittiin B-metyyliumbelliferonilla. Fluoresoiva aine annosteltiin mustille polystyreenisille mikrokuoppalevyille (MicroFLUOR™ 35 96434' 18 "B" Plates, Luettelonumero 011-010-780, Dynatech Laboratories, Inc., Chantilly, VA 22021)· Havaittiin seuraa-vat asiat: 25 μΐ fluoresoivaa ainetta liuotettuna reagenssi-alkoholiin annosteltiin kuhunkin koekuoppaan; alkoholin 5 annettiin haihtua 35°C inkubaattorissa kuivaksi; fluoresoiva aine saatettiin uudelleen liuokseen pH-arvoon 8 säädetyn 0,1 M HEPPS-puskurin avulla (United States Biochemical Corporation); levy luettiin ja tulokset annetaan alla Taulukossa 1 suhteellisina fluoresenssiyksikköinä.

10 TAULUKKO 1

B-METYYLIUMBELLIFERGNIN SUHTEELLINEN FLUORESENSSI LÄSNÄOLEVAN FLUORESOIVAN AINEEN KOKONAISMÄÄRÄN JA LIUOKSEENSAATTAVAN PUS-15 KURIN TILAVUUDEN FUNKTIONA

B-metyyli- Liuokseensaattavan puskurin tilavuus (μΐ) umbelliferoni (pg) 50 100 150 200 250 20 0,0 6 10 15 28 29 0,0156 54 69 75 84 98 0,0313 111 135 118 174 174 0,0625 229 274 254 317 327 0,125 440 536 541 620 640 25 Tämä tieto näyttää, että fluoresenssisignaali on suoraan verrannollinen kuopassa läsnäolevan fluoresoivan aineen määrään. Annettuna mille tahansa fluoresoivan aineen pitoisuudelle havaitaan kasvava signaalin suunta tilavuuden kas-30 väessä.

Suoritettiin hyvin yllä kuvatun kaltainen koe ja käyttäen samaa menettelytapaa lukuunottamatta sitä, että B-metyylium-belliferoni levitettiin selluloosasuodatinpaperista (Luet-35 telonumero 740-E, Schleicher & Schuell, Inc., Keene, NH

03431) stanssatulle kiekolle, mikä asetettiin mustan mikro-kuoppalevyn (Dynatech*in MicroFLUOR™ "B" Levy) kuopan pohjalle. Tämän kokeen tieto esitetään Taulukossa 2.

Il 19 96434 TAULUKKO 2

B-METYYLIUMBELLIFERONIN SUHTEELLINEN FLUORESENSSI LÄSNÄOLEVAN 5 FLUORESOIVAN AINEEN KOKONAISMÄÄRÄN JA LIUOKSEENSAATTAVAN PUSKURIN TILAVUUDEN FUNKTIONA PAPERIKIEKKOJEN OLLESSA ASETETTUINA KUHUNKIN KUOPPAAN

B-metyylium- Liuokseensaattavan puskurin tilavuus (μΐ) 10 belliferoni (pg) 25 50 75 100 0,0 207 130 78 90 0,0156 245 146 169 131 0,0313 529 304 243 193 15 0,0625 1045 579 478 413 0,125 2109 1231 965 857 HUOMAUTUS: Ylläolevista arvoista kuopille, jotka sisältävät kiekot ja fluoresoivaa ainetta, on vähennetty fluoresenssi-20 arvot, jotka oli mitattu käyttäen kuoppia, joissa oli blankot selluloosakiekot ja vastaava määrä puskuria ennen lukemaa.

Kuten tapauksessa, jossa käytettiin B-metyyliumbelliferonia kuopissa, joissa ei ollut kiekkoja, on fluoresenssi kuopissa, 25 jotka sisältävät selluloosakiekot, suoraan verranollinen fluoresoivan aineen määrään, joka lisättiin kuhunkin kokoon-saattavan puskurin annettuun tilavuuteen. Kuitenkin fluoresenssi selluloosakiekkojen läsnäollessa vähenee liuokseensaattavan puskurin lisääntyvien tilavuuksien myötä. Todel-30 lisuudessa havaittu fluoresenssi on melkein verrannollinen fluoresoivan aineen lopulliseen pitoisuuteen (pg/ml). Tämä vaikutus on vastakkainen sille, mikä nähtiin, kun identtisen levyn kuopissa ei ollut läsnä mitään kiekkoja. Nämä samat suunnat fluoresenssikäyttäytymisessä kiekkojen läsnäollessa 35 pantiin merkille muissakin kokeissa, vaikkakin 1iuokseensaat-tavaa puskuria lisättiin niinkin pienissä tilavuuksissa kuin 4, 8, 16 ja 24 μΐ levyä kohti. Keskimäärin 25 μΐ nestettä 96434 20 vaaditaan halkaisijaltaan 6,4 mm:n selluloosakiekon kyllästämiseen.

Samanlainen koe toistettiin käyttäen fluoresoivaa 7-amino-4-5 metyylikumariinia. Käytetty menettelytapa oli identtinen sen kanssa, mitä käytettiin aikaisemmin kuvatuissa kokeissa. Tiedot on esitetty Taulukossa 3.

TAULUKKO 3 10 7-AMINO-4-METYYLIKUMARIININ SUHTEELLINEN FLUORESENSSI MIK-ROKUOPISSA, JOISSA ON SELLULOOSAKIEKOT JA JOISSA EI OLE, FLUORESOIVAN AINEEN KOKONAISMÄÄRÄN JA LIUOKSEENSAATTAVAN PUSKURIN TILAVUUDEN FUNKTIONA 15

Matriisi Kokonaiskumariini Liuokseensaattava puskuri (μΐ) (/xg) 25 50 100 0,0 145 99 85 20 0,125 362 226 170 KIEKKO 0,250 548 299 241 0,500 881 528 357 0,0 12 3 25 0,125 5 8 10 EI KIEKKOA 0,250 8 13 18 0,500 17 23 29

Kuten on aikaisemmin esitetty B-metyyliumbelliferonin koh-30 dalla kiekkojen läsnäollessa, aikaansaa 7-amino-4-metyyli-kumariini myös suhteellisia fluoresenssiarvoja, jotka ovat : suoraan verrannollisia läsnäolevan fluoresoivan aineen koko naismäärään liuokseensaattavan puskurin millä tahansa tilavuudella. Selluloosakiekkojen läsnäollessa suhteellinen 35 fluoresenssi myös vähenee lisättäessä liuokseensaattavaa puskuria annettua fluoresoivan aineen kokonaismäärää varten.

Il 96434 21

Havaittu fluoresenssin vahvistuminen, mikä on tuloksena vapaan fluoresoivan aineen lisäyksestä selluloosa-alustoille on selvästi ilmeistä, kun verrataan tietoja kiekkojen kanssa ja ilman niitä.

5 ESIMERKKI 2 Tämä esimerkki havainnollistaa sen, että kuopat tai säiliöt eivät ole välttämättömiä reaktioiden tapahtumiseksi substraa-10 tin ja lisättävän aineen välillä, kun substraatti kuivataan substraatin kinetiikkaa ja fluoresenssia vahvistavalle alustalle .

Lisättiin 20 mikrolitran eriä 0,5 %:sta 4-metyyliumbel1 ife-15 ronista kytkettynä B-D-galaktosidiin liuotettuna dimetyyli-sulfoksidiin (DMSO) kullekin kahdeksasta selluloosakiekosta {Luettelonumero 740-E, Schleicher & Schuell, Inc., Keene, NH 03431). DMSO poistettiin vakuumikuivauksen avulla. Neljä kuivatuista kiekoista kiinnitettiin kaksipuolisen teipin 20 avulla 96-kuoppaisen mustan polystyreenisen mikrokuoppalevyn päälle. Neljä jäljelle jäävää kiekkoa asetettiin kukin levyn neljän kuopan pohjalle. Kahteen teipillä kiinnitetyistä kiekoista ja kahteen levyn kuopissa olevista kiekoista lisättiin kuhunkin 25 μΐ Escherichia colin (ATCC 25922) suspen-25 siota 0,1 missä TRIS-suolapuskurissa, jonka pH oli 7,8.

Lisätyn suspension optinen tiheys 16 mmm halkaisijäisessä • lasiputkessa oli 1,8 600 nm:n aallonpituudella mitattuna

Spectronic 88- spektrofotometrilla (Bausch and Lomb, Rochester, NY 14692). Jäljelle jääneisiin neljään kiekkoon 30 lisättiin vain puskuria toimiakseen vertailuna. Fluoresens-sinopeuden lisääntyminen kaikille levyille mitattiin yhden minuutin välein käyttäen Dynatech MicroFLUOR™-lukijaa. Kuten ·. on esitetty kuviossa 3, havaitut nopeudet, jotka on saatu kiekoilta, jotka oli teipattu levylle, olivat verrattavissa 35 niihin, jotka saatiin kuopissa olevilta kiekoilta. Täten ei tarvita mitään kuoppia tai säiliöitä aikaansaamaan substraatin ja lisättävän aineen välisestä reaktiosta johtuvan fluoresenssin lisääntymisnopeuden tyydyttäväksi määrittämiseksi.

22 96434

Poistamalla kuoppien tai säiliöiden tarve, fyysisen järjestelmän kokoa voidaan suuresti vähentää, samoin kuin voidaan vähentää kokeen suorittamiseksi tarvittavan lisättävän aineen tilavuuttakin.

5 ESIMERKKI 3

Lukuisia alustamateriaaleja testattiin niiden kyvyn suhteen vahvistaa fluoresenssia ja kinetiikkaa. Kunkin alustan tes-10 taamiseksi stanssattiin kiekkoja, joiden halkaisija oli 6,4 mm (0,250 tuumaa) kustakin taulukossa 4 luetelluista arkki-maisista materiaaleista. Kuhunkin kiekkoon lisättiin 20 μΐ:n näyte fluorogeenisen substraatin 0,5 % liuosta. Testatut substraatit olivat 4-metyyliumbelliferyylifosfaatti (pus-15 kuriliukoinen substraatti) ja 4-metyyliumbelliferyylipal- mitaatti (puskuriin liukenematon substraatti). Substraattia sisältävät kiekot kuivattiin vakuumikuivauksella ja sitten ne asetettiin 96-kuoppaisen mustaa polystyreeniä olevan mikrokuoppalevyn (Dynatech MicroFLUOR™ "B") kuoppiin· Kuhun-20 kin kiekkoon lisättiin Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853 ):n suspensiota 0,1 M:ssa TRIS-suolapuskurissa, jonka pH oli 7,8. Organismisuspension solutiheys mitattuna halkaisijaltaan 16 mm:n putkessa säädettiin tiheyteen 1,8 600nm:n aallonpituudella. Kontrollikiekkoihin lisättiin vain puskuria.

25 Fluoresenssin lisääntymisen nopeuksia tarkkailtiin yhden minuutin välein MicroFLUOR™-lukijalla.

Kaikilla alustoilla saadut tulokset on summattu taulukossa 4. Synteettiset alustat antoivat tuloksena huonoja reaktioita 30 hydrofobisen palmitaattisubstraatin kanssa. Nailonsubstraatit pyrkivät saattamaan palmitaatin epästabiiliksi. Lasikuitua-lustat joko estivät reaktioita tai aiheuttivat substraatin : hajoamista. Selluloosasubstraatit saivat aikaan parhaan organisminopeuksien erottamisen kontrollireaktionopeuksista. 35 Organismeilla saadut 4-metyyliumbelliferyylipalmitaatin hydrolyysinopeudet pyrkivät myös olemaan korkeampia ja yhdenmukaisempia käytettäessä selluloosa-alustoja kuin muita

II

96434 11 23 alustoja, eikä selluloosa-alusta tehnyt tätä substraattia epästabiiliksi.

TAULUKKO 4 5

ALUSTAKOKEIDEN TULOKSET

Alusta Kuvaus Koetulos 10 Durapore® Polyvinylideeni- Ei palmitaattinopeuksia difluoridi

Pdt. 8-Sb Nonvowen Ei painii taattinopeuksia

Synteettinen

Pdt. 5-Sb Nonvowen Ei palmitaattinopeuksia 15 Synteettinen

Selluloosa0 Syvyyssuodatin Liuotettu DMSOriin

Ultrapored Kalvo Ei palmitaattinopeuksia

Carboxydyned Kalvo Korkeita palmitaattikontr.

Nylon 66d Kalvo Korkeita palmitaattikontr.

20 Magna Nylon* Nylon 66-poly- Korkeita palmitaattikontr.

esteri GD120f Ei orgaaninen Epäyhtenäisiä tuloksia

Lasisuodatind Ei orgaaninen Ei fosfaatti- tai palmi taattinopeuksia 25 MicrofiberS Ei orgaaninen Korkeita kontrolleja

Glass A/E

! Extra Thicks Sideaineita Korkeita kontrolleja

No.27f Esisuodatin Yhtenäisiä nopeuksia 740Eb Puuvillalintteri Yhtenäisiä nopeuksia 30 RC60b Uusio Yhtenäisiä nopeuksia TL Chromato- Selluloosa Yhtenäisiä nopeuksia graphy1* Estar-poh jalla a. Millipore (Bedford, MA) 35 b. Schleicher & Schuell (Keene, N.H.) c. American Filtrona (Richmond, VA) d. Pali BioSupport (Glen Cove, NY) e. Fisher Scientific (Pittsburgh, PA) 24 96434 f. MicroFiltration Systems (Dublin, GA) g. Gelman Sciences (Ann Arbor, MI) h. Eastman Kodak (Rochester, NY).

5 ESIMERKKI 4 Tämä esimerkki esittää, että fluorogeenisten substraattien havaitut hydrolyysinopeudet ovat suurempia substraateilla, jotka on kuivattu tämän keksinnön kinetiikkaa ja fluoresens-10 siä vahvistaville alustoille kuin substraateilla, jotka on kuivattu mikrokuoppien pohjille.

20 mikrolitran näytteitä 4-metyyliumbelliferyylipalmitaatin 0,5%:sta liuoksesta puhtaassa DMSO.'ssa lisättiin kuhunkin 15 kahdestatoista selluloosakiekosta (Luettelonumero 740-E, Schleicher & Schuell) ja kuhunkin kahdestatoista tyhjästä kuopasta mustalla polystyreenisellä 96-kuoppaisella mikro-kuoppalevyllä (Dynatech MicroFLUORTM "B"). DMSO poistettiin kiekoista ja levystä vakuumikuivauksen avulla. Substraatin 20 sisältävät kiekot asetettiin kuhunkin levyn 12:sta tyhjästä kuopasta. Kahdeksaan kuopista, joissa oli substraattia sisältävä kiekko ja kahdeksaan kuopista, jotka sisälsivät vain kuivattua substraattia, lisättiin 100 μΐ Pseudomonas aeruginosa (ATCC 35032):n suspensiota 0,1 M:ssa TRIS-suola-25 puskurissa, pH 7,8. Lisättävän aineen solutiheys säädettiin arvoon 1,76 600 nm:n aallonpituudella mitattuna halkaisijal-• taan 16 mm:n putkessa. Loput kuopista, joissa oli kiekkoja ja kuopista, jotka sisälsivät substraattia, saivat puskuria ilman organismia toimiakseen kontrolleina.

30

Substraatin hydrolyysinopeudet määritettiin tarkkailemalla fluoresenssin lisäystä yhden minuutin välein MicroFLUOR™-v lukijan avulla (Dynatech). Kuten on esitetty kuviossa 4, nopeudet, jotka saatiin substraatit kuivattuina selluloosa-35 kiekoille, olivat huomattavasti korkeampia kuin ne tulokset, jotka saatiin substraatti kuivattuna suoraan kuoppiin. Aikomatta sitoutua mihinkään teoriaan, yksi syy tähän voimistuneeseen fluoresenssiin voi olla kiekon substraatin levit-

II

96434 25 tämistä varten oleva suurempi pinta-ala ja sen jälkeinen substraatin ja lisätyn aineen vuorovaikutus, koska 4-metyy-liumbelliferyylipalmitaatti on liukenematon puskuriin ja täten voitaisiin odottaa sen läpikäyvän entsymaattisen hyd-5 rolyysin ensisijaisesti rajapinnallaan substraatin kanssa alustan ja nestemäisen lisättävän aineen pinnalla.

Samanlaisessa kokeessa kuin on esitetty yllä ja käyttäen samaa menettelytapaa, saadaan myös todisteita fluoresenssin 10 vahvistumisesta seiluloosakiekoi1la reaktioissa, jotka koskevat puskuriliukoista substraattia, 4-metyyliumbelliferyy-lifosfaattia. Kiekkoihin ja kuoppiin, jotka sisälsivät substraatin lisättiin organismia Klebsiella Pneumoniae (ATCC 33495). Kuten on esitetty kuviossa 5, havaittiin nopeuksien, 15 jotka havaittiin selluloosakiekoille kuivatun substraatin tapauksessa, olevan paljon korkeampia kuin kun substraatti kuivattiin suoraan levyn kuoppiin.

Tämä esimerkki antaa suoran todisteen siitä, että kinetiikkaa 20 ja fluoresenssia vahvistavat alustat parantavat olennaisesti reaktionopeuksia sekä puskuriliukoisilla että puskuriin liukenemattomilla fluorogeenisilla substraateilla. Täten selluloosakiekkojen käyttö antaa kyvyn saavuttaa nopeasti ja sitten ylläpitää vakioisia reaktioita tämän keksinnön 25 kanssa.

ESIMERKKI 5

Seuraava esimerkki kuvaa lukuisia nopeuskinetiikkoja, joita 30 on havaittu käyttäen tämän keksinnön entsyyminkuvausmenetel-mää. Paperikiekkoihin (Luettelonumero 740-E, Schleicher & Schuell), joka sisälsi 0,1 mg fluorogeenista substraattia, : lisättiin 25 μΐ Seratia Marcescens (ATCC 1343):n suspensiota.

Suspension solutiheys säädettiin optiseen tiheyteen 1,76 35 600 nm:n aallonpituudella luettuna halkaisijaltaan 16 mm:n putkessa. Kuten on esitetty kuviossa 6, fluoresenssikäyrän nousu ajan funktiona, havainnoituna L-leusiini-7-amido-4-metyylikumariinilla, oli melkein lineaarinen koko 10 minuutin 96434' 26 koeajan. Samanlainen kineettinen käyrä, kuvio 7, joka saatiin substraatilla L-fenyylialaniini-7-amido-4-metyylikumariini (Sigma), oli muodoltaan melkein hyperbolinen, jossa ensimmäistä hidasta vaihetta seuraa nopeampi fluoresenssin lisäys.

5 Kineettinen käyrä, joka on saatu, kuvio 8, L-alaniini-7-amido-4-metyylikumariinilla, oli muodoltaan parabolinen, jossa oli ensimmäinen nopean reaktion faasi, jota seurasi lisääntyvän ajan mukana progressiivinen nopeuden lasku. Täten erilaiset substraatti/organismi-yhdistelmät aikaansaavat 10 kineettisiltä ominaisuuksiltaan erilaisia nopeuksia. Tapauksissa, joissa kinetiikka on lineaarista, tai lähellä lineaarista, voidaan reaktionopeus arvioida lineaarisen regressioanalyysin avulla tai kahden pisteen laskennasta, mikä käyttää ensimmäistä ja viimeistä fluoresenssin mittausta.

15 Ei-1ineaarista kineettistä tietoa voidaan käsitellä korkeamman asteen regressiokaavojen avulla; tietoa, joka esittää ensimmäisen hitaan faasin, jota seuraa lineaarisen vasteen jakso, jota seuraa lopun stationäärisen faasin sigmoidivaste, voidaan analysoida käsittelemällä käyrän lineaarista kes-20 kiosaa.

ESIMERKKI 6 Tämä esimerkki osoittaa, että erilaisia mikro-organismilajeja 25 voidaan erottaa toisistaan niiden nopeuksien erojen suhteen, joilla ne hydrolysoivat erilaisia fluorogeenisia substraat-• teja.

Selluloosakiekot (Luettelonumero 740-E, Schleicher & 30 Schuell), jotka sisälsivät 0,1 mg fluorogeenista substraattia kiekkoa kohti, asetettiin mustaa polystyreeniä olevien mik-rokuoppalevyjen kuoppiin ja niihin lisättiin 50 μΐ organis-·. misuspensiota 0,1 M:ssa TRIS-suolapuskurissa, pH 7,8. Suspen sion optinen tiheys säädettiin arvoon 1,76 600 nm:n aallon-35 pituudella. Testatut substraatit sisälsivät palmitiinihapon, B-D-glukosidin, fosfaatin ja galaktosidin 4-metyyliumbel-liferonijohdannaiset, ja L-alaniini-7-amido-4-metyylikumarii-nin. Testatut organismit sisälsivät Staphylococcus aureus

II

96434 27 (SA), Pseudomonas aeruginosa ( PA ), Escherichia coli ( EC ), Morganella morganii (MM) ja Enterobacter aerogenes (EA) . Kontrollireaktiot (C) suoritettiin käyttäen vain puskurin lisäystä. Substraatin hydrolyysinopeudet (vapautunut nano-5 gramma fluoresoivaa ainetta/minuutti) määritettiin lukemalla fluoresenssin lisäys joka minuutti kymmenen minuutin ajan käyttäen MicroFLUOR™-lukijaa (Dvnatech) sellaisten tietojen aikaansaamiseksi, jotka olivat verrannollisia näytteen fluoresenssiin ja sitten laskemalla kunkin kineettisen käyrän 10 lineaarisen osan kulmakerroin lineaarisen regression avulla. Tulokset taulukossa 5 esittävät keskimääräiset hydrolyysino-peudet plus tai miinus yksi standardipoikkeama kullekin laji/substraattiyhdistelmälle. Kukin keskiarvo edustaa 50 nopeuskokeen keskiarvoa; viisi kantaa lajia kohti, 10 näytet-15 tä kantaa kohti. Taulukko 5 sisältää myös erottelumatriisin, joka osoittaa, mitkä parit on erotettu milläkin substraatilla. Jos keskimääräiset nopeudet (+/- yksi standardipoikkeama) kahdelle lajille eivät menneet päällekkäin, nopeudet olivat merkittävästi erilaisia ja kaksi lajia katsottiin erotetuksi 20 toisistaan tuolla substraatilla. Erotetut parit on merkitty merkillä (+). Lajiparit, joita ei erotettu substraatilla, on merkitty välilyönnillä. Kaikki kymmenen lajia erotettiin toisistaan viidellä substraatilla käyttäen tätä menetelmää.

25 TAULUKKO 5 • LAJIPARIEN EROTTAMINEN TOISISTAAN FLUOROGEENISEN SUBSTRAAT-

TIN HYDROLYYSIN MUKAAN

30 4-Metyyliumbelliferyyli fosfaatti

Ka +1STD -1STD SA PA EC MM EA

19,96 33,37 5,76 SA

1,78 3,01 0,54 PA + 35 13,06 22,07 4,06 EC + 36,16 44,27 28,04 MM + + 40,20 47,69 32,69 EA + 0,55 0,69 0,42 C + + + + 28 964 3'4

4-Metyyliurabel1i feryylipalmitaatti Ka +1 STD -1 STD SA PA EC MM EA

5 5,06 7,25 2,87 SA

20,98 27,87 14,09 PA + 1,14 2,61 -0,32 EC + 2,04 3,39 0,70 MM + 2,07 3,71 0,43 EA + 10 2,70 5,91 -0,52 C + 4-Metyyliumbel1iferyyli a-, D-galaktosidi

Ka +1 STD -1 STD SA PA EC MM EA

15 ---- ........— - ------- ......

0,03 0,20 -0,12 SA

-0,16 0,10 -0,43 PA

2,53 4,38 0,68 EC + + 0,21 0,19 -0,14 MM + 20 5,97 8,40 3,53 EA + + + 0,12 0,67 -0,44 C ++ 4-Metyyliumbelliferyli b-, D-glukosidi

25 Ka +1STD -1STD SA PA EC MM EA

0,29 0,98 -0,40 SA

17,03 53,23 -19,10 PA

0,00 0,94 -0,95 EC

30 0,56 0,94 -0,83 MM

14,65 19,08 10,22 EA + ++ 0,13 1,53 -1,26 C + ii 96434' 29 L-Alaniini-7-amido-4-metyylikumariini

Ka +1STD -1STD SA PA EC MM EA

5 -- -— —

-0,10 0,02 -0,23 SA

17,54 25,02 10,06 PA +

35.49 47,75 23,23 EC

42.49 48,78 36,19 MM + + 10 50,36 61,18 39,52 EA + + — 0.06 0,07 -0,19 C + + + + ESIMERKKI 7 15 Tämä koe suunniteltiin testaamaan lajien välistä erottumista ja lajien sisäistä toistettavuutta aikaansaatuna bakteerien entsyyminopeusanalyysillä 25 bakteerille, jotka tavallisimmin eristetään veriviljelypulloista. Testatut bakteerit luetteloidaan taulukossa 6.

20 TAULUKKO 6

LAJILUETTELO - LUOKITTAIN

25 ANAEROBISET

• Bacteroides fragilis

Bacteroides intermedius Peptostreptococcus anaerobius 30 Peptococcus magnus

Clostridium perfringens

GRAMNEGATIIVISET

35 ENTEROBAKTEERIT

Citrobacter freundii Enterobacter aerogenes 30 96434

Enterobacter cloacae Escherichia coli Klebsiella Pneumoniae Morganella morganii 5 Proteus mirabilis

Seratia Marcescens

EI-FERMENTATIIVISET

10 Pseudomonas aeruginosa

VAIKEASTI TYYDYTETTÄVÄT ORGANISMIT

Haemophilus influenzae 15 Haemophilus parainfluenzae

Neisseria gonorrhoeae

GRAMPOSITIIVISET

20 STAFYLOKOKIT

Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis

25 STREPTOKOKIT

Streptococcus mutans Streptococcus pyogenes Streptococcus agalactiae B 30 Streptococcus faecalis D

Streptococcus pneumoniae

HIIVAT

35 Candida albicans

Neljäkymmentäkuusi erilaista fluorogeenista substraattia testattiin. Nämä substraatit olivat fluoresoivasti leimattuja ii 31 96434 joko B-metyyliumbelliferonilla tai 7-amino-4-metyylikumarii-nilla. Kokeet mittasivat fluoresenssin vapautumasnopeuksia katalysoituna bakteerientsyymeillä yleisesti ottaen seuraa-vista luokista; aminopeptidaasit, lipaasit tai glykosidaasit. 5

Tietoa otettiin joka minuutti kymmenen minuutin kuluessa erityisesti tätä tarkoitusta varten rakennettua välinettä käyttäen. Siinä oli elohopeapurkauslamppu välolähteenä, jota lamppua tarkkailtiin sisäisesti normalisointia varten. Tässä 10 kokeessa käytetty viritysaaltopituus oli 365 nanometriä.

440 nanometrin emissiota tarkkailtiin vahvistukseltaan ohjelmoitavan fotomonistinputken avulla. Laitetta valvottiin Ziatech (San Luis Obispo, CA)-mikroprosessorilia, mikä myös valvoi näytteen X-Y-siirtymää ja suoritti tietojenkäsittelyn. 15 Näytteen lisäys oli automaattista, jolloin 25 μΐ bakteerisus-pensiota vietiin jokaiseen substraattipaikkaan.

Levyt valmisti erityisesti näitä kokeita varten yhtiöt Strouse ja Apogee (molemmat Baitimoresta, MD). Levyt tehtiin 20 tasaisista mustista polypropyleenilevyistä, joista kunkin pituus ja leveys oli standardin mikrokuoppalevyn suuruinen. Schleicher & Schuell 740-E absorboiva paperi (Keene, NH 03431) stanssattiin 6 mm:n halkaisijäiseksi ja kiinnitettiin liimataustan (Strouse V-23) avulla muovikantajalle. Kiekkojen 25 väli oli sama kuin standardin mikrokuoppalevyn kuopilla.

Substraatit valmistettiin liuottamalla ne dimetyylisulfok-sidiin (DMSO) ja levittämällä 20 μΐ liuoksia levyn sopiville kiekoille. Levyjä kuivattiin sitten vakuumihaihduttamalla 30 kolmen tunnin ajan, ne pakattiin saumattuihin kalvopusseihin, joissa oli kuivausainetta ja ne varastoitiin -20°C:ssa. Juuri ennen lisäysaineella testaamista levyjen annettiin lämmetä • huoneen lämpötilaan. Taulukko 7 luettelee käytetyt substraat- tiliuokset ja taulukko 8 luettelee standardiliuokset.

35 32 96434 TAULUKKO 7 SUBSTRAATTILIUOKSET JA LYHENTEET 5 SUBSTRAATIT PITOISUUS (pg/kiekko) 4MU-a-D-galaktosidi 100 4MU-a-D-glukosidi 100 10 4MU-a-D-mannosidi 100 4MU-a-L-arabinosidi 100 4MU-a-L-arabinofuranosidi 100 4MU-B-D-sellopvranosidi 100 4MU-B-D-fukosidi 100 15 4MU-B-L-fukosidi 100 4MU-B-D-galaktosidi 25 4MU-B-D-glukosidi 25 4MU-B-D-glukuronidi 25 4MU-B-D-mannosidi 6,25 20 4MU-B-D-ksylosidi 25 4MU-N-asetyyli-B-D-glukosaminidi 100 4MU-N-asetyyli-B-D-galaktosaminidi 100 4MU-a-D-N-asetyylineurami inihappo 1,6 4MU-asetaatti 2 25 6,25 4MU-butyraatti 2,5 25 4MU-kaprylaatti 0,4 6,25 30 4MU-eliadaatti 25 4MU-P-guanobentsoaatti 25 4MU-heptanoaatti 6,25 25 4MU-lauraatti 10 35 100 4MU-nonanoaatti 5 100 4MU-oleaatti 8

II

96434 33 4MU-palmitaatti 25 4MU-propionaatti 1,56 4MU-stearaatti 25 4MU-sulfaatti 25 5 4MU-fosfaatti 25 4MU-pyrofosfaatt i 2 5 4MU-myristaatti 25

Argini ini-AMC 6,25

Seriini-AMC 6,25 10 Glutamaatti-AMC 2,5

Glysiini-AMC 0,8

Isoleusiini-AMC 6,25 L-alaniini-AMC 6,25 25 15 Leusiini-AMC 6,25

Fenyylialaniini-AMC 25

Proliini-AMC 25

Pyroglutaraaatti-AMC 5

Metioniini-AMC 6,25 20 Tyrosi ini-AMC 100

Valiini-AMC 6,25

Ornitiini-AMC 6,25 TAULUKKO 8 25

STANDARDILIUOKS ET

LIUOS LYHENNE PITOISUUS (pg/kiekko) 30 B-metyyliumbelliferoni 4-MU 0,012 0,8 7-amino-4-metyyli- AMC 0,012 *· kumariini 0,8 35 Kokeen bakteeriviljelmät valmistettiin pesäkkeistä, joita inkuboitiin yön yli tryptinen soija-agarissa 5%:sen lampaan-veren kanssa tai suklaa-agarissa vaikeasti tyydytettävillä organismeilla. Organismisuspensiot valmistettiin l,76:n 96434 34 optiseen tiheyteen 610 nm:n aallonpituudella kierteistetyillä tulpilla varustetuissa 16 mm x 125 mm lasiputkissa. Laimennin oli 0,85 % NaCl, 0,02 % Triton X100 ja 0,1 M Tris, joka titrattiin pH-arvoon 8,0. Kustakin lajista testattiin viisi 5 kantaa lukuunottamatta lajeja P. magnus ja C. albicans.

joista testattiin vain neljä kantaa ja E. coli, josta testattiin viisi kantaa kahdesti.

Laitteen elohopeapurkauslampun säde hajotettiin optisesti 10 ja lähtötehoa tarkkailtiin fotomonist imen avulla. Tieto normalisoitiin sisäisesti laitteessa lähteen vaihteluiden vuoksi. Tieto normalisoitiin edelleen ulkoisesti jakamalla substraattien fluoresenssitieto sopivien vapaiden fluoresoivien aineiden standardien, joko B-metyyliumbelliferonin tai 15 7-amino-4-metyylikumariinin, fluoresenssilla. Entsyyminopeu-det on täten ilmaistu nanogrammoina minuuttia kohti vapautunutta vapaata fluoresoivaa ainetta.

Kynnysarvot kullekin substraatille määritettiin tutkimalla 20 spontaaneja hydrolyysinopeuksia kontrolli levyiltä, joihin oli lisätty vain puskuria. Näitä verrattiin kaikille testatuille organismeille olevan tietokannan nopeuksiin. Kynnys-nopeus, joka merkitsisi merkittävää eroa kontrol1inopeuteen, määritett i in.

25

Syntynyt tieto analysoitiin lähimmän naapurin analyysillä käyttäen yksikköalaprojektiota. Tästä seurasi seuraavia vaiheita: 30 1) Nopeus määritettiin perustuen 1 ja 5 minuutin tietopis teisiin tai käyttämällä oletusarvonopeuden arvioijaa lukemille, jotka ylittivät laitteen dynaamisen alueen.

2) Nopeutta verrattiin kullekin substraatille valittuun 35 kynnysarvoon. Jos nopeus oli pienempi kuin kynnysarvo, sitten suhde asetettiin l:ksi, muuten nopeuden ja kynnysarvon suhde tälle substraatille laskettiin.

33 96434 3) Otettiin edellisen suhteen logaritmi.

4) Kunkin substraatin logaritminen suhdearvo korotettiin neliöön ja sitten nuo arvot laskettiin yhteen.

5 5) Sitten laskettiin summan neliöjuuri (tämä on substraatin nopeusvektorin suuruus ) .

6) Kunkin substraatin logaritminen suhde jaettiin yllä koh-10 dasta 5 johdetulla suuruudella.

Substraattiarvot normalisoitiin samalla yksikkövektoriksi. Tämän menetelmän huomattiin sallivan bakteeri 1isäyksen eri solutiheyksien suoran vertailun ilman tietoa todellisista 15 solutiheyksistä.

Lähin naapuri kullekin 128:sta testatusta kannasta laskettiin ottamalla absoluuttinen ero kullekin substraatille kutakin lajiparia varten epäjärjestysmatriisissa. Näiden absoluuttis-20 ten erojen summa lajiparien kaikille substraateille määritettiin. Minimiero "tuntemattoman" ja "vertailu"-kannan välillä määritti lähimmän naapurin tai tuntemattoman parhaimman tunn i stami sen.

25 Tätä tekniikkaa käyttäen kukin testattu kanta tunnisti saman lajin toisen kannan lähimpänä naapurina 95%.ssa kokeista.

.* Seuraavien lajien virhetunnistuksia tapahtui:

TODELLINEN TUNNISTUS VIRHETUNNISTUS

30 K. pneumoniae P. mirabi1 is H. influenzae H. parainfluenzae . E_;_ aerogenes K. pneumoniae E. coli C. f reundi i 35 E^_ coli C. f reundii

Kuitenkin 95%:n tarkkuus on hyvinkin kaupallisesti saatavien koesarjojen odotetun suorituskyvyn sisällä.

36 96434 ESIMERKKI 8

Fluorogeenisia substraatteja ja vapaita fluoresoivia aineita voidaan käyttää määrittämään biologisten näytteiden entsyy-5 mitasoja. Joidenkin entsyymien aktiivisuus on määritetty perinteisesti testaamalla entsyymin katalysoimien reaktioiden happamia ja emäksisiä sivutuotteita. Fluoresoivat pH-indi-kaattorit, kuten B-metyyliumbel 1iferoni, voivat olla käyttökelpoisia tähän tarkoitukseen kunnolla puskuroiduissa 10 järjestelmissä. B-metyyliumbelliferonin fluoresenssiin vaikuttaa pH noin pH 6,2 - 8,6 alueella. Kun tämä fluoresenssin muutos mitataan tämän keksinnön fluoresenssia vahvistavilla alustoilla mikrokuoppien sijasta, herkkyys lisääntyy suures-t i .

15 Tässä esimerkissä 500 ng B-metyyliumbelliferonia liuotettuna reagenssialkoholiin levitettiin 6 mm:n kiekolle Schleicher & Schuellin 740-E suodatinpaperia (Keene, NH) ja kuiviin mikrokuoppiin (MicroFLUOR "B"™, Dynatech, Chantilly, Va.).

20 Liuottimen annettiin kuivaa haihtumalla. Fluoresoiva aine saatettiin uudelleen kokoon 25 mikrolitralla BIS-TRIS Propane-puskuria, jonka pH säädettiin 0,2 :n lisäyksillä 6,2:n ja 8,6:n välille. Fluoresenssi luettiin fluorometrillä (Dynatech). Kuten voidaan nähdä tiedoista, jotka on esitetty 25 kuviossa 9, fluoresenssi selluloosa-alustalla on suuresti vahvistunut verrattuna mikrokuoppien fluoresenssiin.

Perinteinen bakteerien tunnistusjärjestelmä käyttää biologisten materiaalien analyysiä, joita materiaaleja inkuboidaan 30 tuntemattomien bakteerilajien kanssa. Jos bakteeri reagoi materiaalin kanssa, sivutuote on usein emäksinen tai hapan. Nämä sivutuotteet voidaan havaita sopivilla pH-indikaatto-·' reillä, kuten fenolipunaisella tai bromotymolisinisellä.

Täten sellaisten reaktioiden tulkitaan olevan joko positii-35 visia tai negatiivisia ja bakteerit jaetaan ryhmiin ja läjitetään näiden positiivisten tai negatiivisten reaktioden kuvioiden mukaan.

Il 37 96434

Fluoresoivaa ainetta, kuten B-metyyliumbelliferonia, johon pH vaikuttaa, kun se levitetään tämän keksinnön kinetiikkaa ja fluoresenssia vahvistaville alustoille, voidaan käyttää aikaansaamaan bakteereiden tunnistamisia paljon vähäisemmässä δ ajassa kuin tavanomaisessa testaamisessa.

Ureaasin läsnäollessa tapahtuva testaaminen on yleistä ja hyödyllistä bakteereiden tunnistamisessa. Jos ureaasia on läsnä, urea hydrolysoituu muodostaakseen ammoniakkia, hiili-10 dioksidia ja vettä. Liuoksessa lopputuote on ammoniumkar-bonaatti, mikä nostaa liuoksen pH:ta.

Tämän keksinnön laitetta käytettiin ureaasin läsnäolon testaamiseen. Liuos, joka sisälsi ureaa (10 paino-%), B-metyy-15 liumbelliferonia (500 ng) ja fosfaattipuskuria (1,25 mM, pH 7,4) levitettiin seiluloosakiekol1 e ( 740-E Schleicher & Schuell, Keene, N.H.) ja niiden annettiin kuivua. Sen jälkeen kiekot saatettiin uudelleen kokoon 25 piillä organismisuspen-sioita normaalissa suolaliuoksessa (0,85% NaCl). Organis-20 misuspensiot valmistettiin 2,0 McFarland-yksikön tiheyteen. Fluoresenssi luettiin välittömästi bakteeritisäyksen jälkeen ja jälleen 15 minuuttia huoneen lämmössä tapahtuneen inkubaa-tion jälkeen. Havaittu fluoresenssiyksikköjen lisäys esitetään taulukossa 10.

25 TAULUKKO 10

KOEORGANISMI FLUORESENSSTYKSIKKÖJEN LISÄYS

Pj. mirabilis (ATCC 2011) 86 30 Mj. morganii (ATCC 434) 957

Vain laimennin 35 l Testatut kannat; Mj. morganii on hyvin voimakas ureaasin tuot taja ja Pj. mirabilis on heikko ureaasin tuottaja.

• · 35 38 96434 ESIMERKKI 11

Organismit, jotka ilmentävät betalaktamaasientsyymiä ovat 5 resistenttejä penisilliineille ja kefalosporiiniantibioo- teille, jotka sisältävät betalaktaamirenkaita, joita entsyymi hydrolysoi. Kuten esitetään alla, yksiemäksisen hapon, penisilliini G:n betalaktaamirenkaan hydrolyysi aikaansaa kak-siemäksisen hapon.

10 S CHo /\/ R - C - NH - CH - CH C - CH3

I I I

15 0 == C — N-----CH - C = O

OH

hydrolysoituu betalaktamaasin ja veden läsnäollessa seuraa-vaksi: 20 S CHq / \ / R - C - NH - CH - CH C - CH3

I I

25 0 == C N----- CH - C = O

I I

OH OH

Tätä ilmiötä käytettiin analysoimaan betalaktamaasin läsnä-30 oloa käyttäen tämän keksinnön kinetiikkaa ja fluoresenssia vahvistavaa laitetta. Tätä koetta varten valmistettiin sel-luloosakiekkoja, jotka sisälsivät 600 pg penisilliini G:tä ja 5 pg B-metyyliumbelliferonia, jonka pH oli säädetty vesi-, liuoksena ollessaan arvoon 8,0. Kiekkoja kuivattiin yli yön 35 35°C:ssa.

Valmistettiin organismisuspensioita ja ne säädettiin 3,0:n McFarland-yksikön tiheyteen 25 nM:ssa fosfaattipuskurissa, joka oli titrattu pH-arvoon 8,0. Suspensioeriä (25 pl) lisät- »

II

39 96434 tiin kullekin kiekolle ja otettiin ensimmäinen fluoresenssi-lukema. Viimeinen fluoresenssi lukema otettiin 15 minuuttia myöhemmin. Määritettiin fluoresenssisignaalin muutos. Organismit testattiin myös käyttäen standardia betalaktamaasi-5 testiä (Nitrocefin disk, Becton Dickinson Microbiology Systems, Cockeysville, MD). Kuten voidaan nähdä taulukossa 11 annetuista tiedoista, organismit, jotka testattiin bctalak-tamaasipositiivisiksi kaupallisessa kokeessa näyttivät olennaisesti suurempaa fluoresenssin alenemista kuin ne organis-10 mit, jotka testattiin negatiivisiksi. Lisäksi testatun B.

catarrhali s-kannan tiedetään tuottavan enemmän betalaktamaa-sia kuin testatun aureus-kannan.

TAULUKKO 11 15 TESTATTU STANDAR- FLUORESENSSIN MUUTOS-

KANTA DIKOE ALENEMA X

S.enidermidi s neg 255 92 20 ATCC 154 N. meningitidis neg 337 122 ATCC 425 S. aureus pos 530 192 ATCC 29213 25 B.catarrhalis pos 779 282 ATCC 2907

Negatiiv.kontrolli ei mitt. 276 ei mitt.

- «

Claims (11)

96434

1. Kinetiikkaa ja fluoresenssia vahvistava koelaite, joka käsittää: kantajan, 5 ainakin yhden alustan, joka on kinetiikkaa ja fluore senssia vahvistava, joka alusta on valittu ryhmästä, joka koostuu alfaselluloosasta ja pH-neutraloiduista lasikuiduista, ja kuiva-aineen, joka on valittu ryhmästä, joka koostuu 10 fluorogeenisista substraateista levitettynä alustalle, jossa alustan pinta-alan ja huokostilavuuden suhde on 0,8-80 mm2/0,001 cm3-0,025 cm3.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen koelaite, tunnettu 15 siitä, että siinä on lukuisia alustoja.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen koelaite, tunnettu siitä, että ainakin jotkin useiden alustojen joukossa eroavat toisista useiden alustojen joukossa fluorogeenisen 20 substraatin tai sen pitoisuuden suhteen.

4. Patenttivaatimuksen 2 mukainen koelaite, tunnettu siitä, että fluorogeeniset substraatit on valittu ryhmästä, joka koostuu 4-metyyliumbelliferonin, 7-amino-4-metyylikuma- 25 riinin, B-naftyyliamiinin, fluoreseiinin ja resorufiinin johdannaisista.

5. Patenttivaatimuksen 2 mukainen koelaite, tunnettu siitä, että fluorogeeniset substraatit ovat kumariinijohdan- 30 naisia.

6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen koelaite, tunnettu siitä, että kuiva-aine on B-metyyliumbelliferoni, resorufii-ni tai fluoreseiini. 35

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen koelaite, tunnettu siitä, että se käsittää lisäksi ei-fluorogeenisen substraatin levitettynä alustalle. Il 96434'

8. Patenttivaatimuksen 2 mukainen koelaite, tunnettu siitä, että kantaja on mikrokuoppalevy, jossa on lukuisia koekuoppia, ja että alustat ovat koekuopissa.

9. Patenttivaatimuksen 2 mukainen koelaite, tunnettu siitä, että kantaja on tasomainen kortti ja että alustat on kiinnitetty korttiin.

10. Menetelmä nestenäytteessä läsnäolevien entsyymien kuvaa-10 miseksi, tunnettu siitä, että: varustetaan patenttivaatimuksen 2 mukainen laite; lisätään nestenäyte kullekin alustalle; testataan kukin alusta fluoresenssin hydrolyysituotteiden havaitsemiseksi näytteen entsyymipitoisuusprofiilin 15 kehittämiseksi.

11. Menetelmä nestenäytteessä läsnäolevan tuntemattoman mikro-organismin tunnistamiseksi, tunnettu siitä, että kuvataan mikro-organismien ilmentämät entsyymit seuraavalla 20 tavalla: käytetään patenttivaatimuksen 3 mukaista laitetta; lisätään näytesuspensiota kullekin alustalle; tutkitaan jokainen alusta fluoresoivien hydro-lyysituotteiden havaitsemiseksi, jolloin saadaan kehitettyä 25 entsyymipitoisuusprofiili; ja • tunnistetaan mikro-organismi vertaamalla havaittua entsyymipitoisuusprofiilia vastaaviin vertailumikro-organismien entsyymipitoisuusprofiileihin. 42 96434