FI91085B - Menetelmä gram-negatiivisten bakteerien määrittämiseksi ja erottamiseksi - Google Patents
Menetelmä gram-negatiivisten bakteerien määrittämiseksi ja erottamiseksi Download PDFInfo
- Publication number
- FI91085B FI91085B FI910359A FI910359A FI91085B FI 91085 B FI91085 B FI 91085B FI 910359 A FI910359 A FI 910359A FI 910359 A FI910359 A FI 910359A FI 91085 B FI91085 B FI 91085B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- gram
- bacteria
- filter
- sample
- negative bacteria
- Prior art date
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/52—Use of compounds or compositions for colorimetric, spectrophotometric or fluorometric investigation, e.g. use of reagent paper and including single- and multilayer analytical elements
- G01N33/528—Atypical element structures, e.g. gloves, rods, tampons, toilet paper
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
- C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
- C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
- C12Q1/14—Streptococcus; Staphylococcus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
- C12Q1/32—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving dehydrogenase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2304/00—Chemical means of detecting microorganisms
- C12Q2304/20—Redox indicators
- C12Q2304/24—Tetrazolium; Formazan
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2326/00—Chromogens for determinations of oxidoreductase enzymes
- C12Q2326/90—Developer
- C12Q2326/92—Nitro blue tetrazolium chloride, i.e. NBT
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Hematology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Description
91085
MENETELMÄ GRAM-NEGATIIVISTEN BAKTEERIEN. MÄÄRITTÄMISEKSI JA EROTTAMISEKSI
Keksinnön kohteena on menetelmä, jolla voidaan nopeasti 5 osoittaa gram-negatiivisten bakteerien kokonaismäärä nestemäisestä näytteestä. Keksinnölle on tunnusomaista se, mikä esitetään patenttivaatimuksissa.
Mikro-organismit voidaan jakaa kahteen luokkaan gram-10 värjäyksellä: joko gram-positiiviset tai gram-negatiivi- set. Niiden erilainen värjääntyvyys perdStuu eroavuuksiin pintarakenteessa ja gram-värjäys on täten avain mikrobien identifioinnissa. Erityisesti infektoivan organismin gram-reaktion tietäminen on tärkeää valittaessa välittömästi 15 sopivaa hoitomuotoa lääkinnässä tai tor juntamuotoa ympäristöhygieniassa. Gram-värjäys tehdään perinteisesti näytteestä, joka on kuivattu objektilasille. Kuiva näyte värjätään ensin kristallivioletilla ja sitten safraniinilla, jolloin gram-positiiviset bakteerit näkyvät mikroskoopissa tarkas-20 teltaessa sinisinä ja gram-negatiiviset bakteerit punaisina. Bakteerien kokonaismäärä, ilman gram-erottelua ja ilman mikroskooppia, voidaan myös osoittaa suoraan näytteestä. Tällöin näyte kerätään suodattimelle, värjätään safraniinilla ja liika väri huuhdotaan pois, jolloin bakteerit 25 näkyvät punertavana täplänä kuten EP patentissa 288621 on esitetty.
Bakteerien nopeaan tunnistamiseen biologisista näytteistä voidaan myös käyttää biokemiallisia reaktioita kuten entsy-30 maattisia osoituksia ja sokerien käyttökykyyn perustuvia menetelmiä. Entsymaattisista reaktioista ovat erityisen nopeita sytokromien ja entsyymien, kuten dehydrogenaasien katalysoimat hapetus-pelkistysreaktiot, joita esiintyy kaikissa soluissa, sekä eläinsoluissa, että bakteereissa.
35 Dehydrogenaasit ovat mitattavissa bakteereja hajottamatta ennestään tunnetulla histokemiallisella menetelmällä, jota on käytetty dehydrogenaasien paikantamiseen mm. leuko- 2 syyteistä ja histologisista kudosleikkeistä (Michel, G. et ai., Methods of Enzymatic Analysis, p. 197-232, voi. 1, 1983). Tällöin luonnollinen vetyakseptori dehydrogenaasi-reaktiossa korvataan esim. tetratsoliumsuolalla, joka vetyä 5 vastaanottaessaan pelkistyy värilliseksi sinisenvioletiksi ja samalla saostuu liukenemattomaksi. Dehydrogenaasien määritysseokseen voidaan lisätä myös välittäjä, elekt-roninsiirtäjä, kuten fenatsiinimetosulfaatti (PMS), joka nopeuttaa ja vahvistaa reaktiota. PMS välittää NAD:lta 10 vedyn tetratsoliumsuolalle, joka puolestaan saostuu värilliseksi formatsaaniksi. PMS voidaan myös korvata muilla vetyakseptoreilla kuten menadionilla, meldola bluella (C.1.51175; Basic blue 6), tai metoksifenatsiinimetosulfaa-tilla.
15
Edellä kuvattua menetelmää on käytetty myös bakteerien osoittamisessa. Kun bakteeripitoiseen näytteeseen lisätään hapetus-pelkistysreaktiota mittaava yhdiste kuten trifenyy-litetratsoliumkloridi (TTC) se pelkistyy ja yhdiste muuttuu 20 värittömästä punaiseksi, mikä voidaan todeta visuaalisesti tai kolorimetrisesti mittaamalla. TTC:n lisäksi voidaan käyttää myös muita, nopeampia, tetratsoliumsuoloja kuten jodonitrotetratsoliumia (INT) ja neotetratsoliumkloridia (NTC), sekä siniseksi muuttuvia: blue tetratsoliumia (BT) 25 ja nitroblue tetratsoliumia (NBT) (Histological and His-tochemical Methods, Theory and Practice, Chapter 16, p. 258, second edition 1990).
Bakteerit eroavat toisistaan gram-reaktionsa perusteella 30 ja erilainen värjääntyvyys johtuu eroista bakteerien pintarakenteessa. Johtuen eroista pintarakenteessa bakteerit ovat myös eri tavoin herkkiä detergenteille. Tätä ominaisuutta onkin hyödynnetty gram negatiivisten bakteerien tunnistamisessa yhdistettynä edellä, esitettyyn baktee-35 rien osoittamiseen tetratsoliumvärjäyksellä.
Sopiva määrä anionista detergenttiä, kuten Tergitol-7,
II
91085 3 estää selektiivisesti gram-positiivisten bakteerien hengityksen eli hapen oton ja vastaavasti tetratsoliumin pelkistymisen värilliseksi. Kationiset detergentit estävät molempien, sekä gram-negatiivisten että gram-positiivisten 5 bakteerien hengityksen, kun taas neutraaleilla ei-ionisilla detergenteillä ei todettu olevan vaikutusta (Baker et ai.
J. Exp. Med. 73, 249-271, 1941).
Bakteerien hengityksen lisäksi myös dehydrogenaasiaktiivi-10 suus estyy samalla tavoin TTC:llä mitattaessa (Dakay et ai. Zentralblatt Bakt. Hyg. I Abt. Orig. B: 174, p. 121-124, 1981). Tämä todettiin neljällä eri bakteerikannalla. Näitä havaintoja on sovellettu bakteerien tunnistamiseen liuos-näytteistä (EP 107594), missä havaittiin, että hengitystä 15 estävät anioniset detergentit estävät myös dehydrogenaasien aiheuttaman värin muodostuksen, kun taas eräillä antibiooteilla ja niiden kaltaisilla kasvua estävillä aineilla ei ollut vaikutusta samassa ajassa. Liuokseen muodostunut väri voidaan mitata spektrofotometrisesti ja myös liuskalla, 20 johon on esikuivattu kemikaalit. Liuska kastetaan bakteeria sisältävään liuokseen ja siihen tarttuu bakteereja samassa suhteessa kuin niitä on liuoksessa. Jos bakteereja on riittävästi liuska värjääntyy ja antaa visuaalisen tuloksen. Menetelmässä bakteereja ei voida konsentroida liuskal-25 le, mikä olisi välttämätöntä riittävän herkkyyden saavutta miseksi bakteereja määritettäessä suoraan biologisista nesteistä.
Näihin havaintoihin perustuen on bakteerien osoitusmenetel-30 mää suoraan biologisista näytteistä kehitetty edelleen.
Dehydrogenaasien aiheuttama värin pelkistyminen, joka toimii mikro-organismien osoittajana näytteestä, voidaan mitata näytteestä suoraan hajoittamatta bakteereja. Lisäksi voidaan gram-negatiiviset bakteerit erottaa mikrobien 35 kokonaismäärästä detergenttiyhdistelmän avulla, joka on ei- ionisen alkyyyliglukosidityyppinen detergentti tai kao-trooppisen aineen kuten guanidiinin tai niiden yhdistelmä.
4
Muilla ei-ionisilla detergenteillä, jotka ovat polyoksiety-leenityyppisiä, kuten Triton X-100 tai Tween 80, ei ole vaikutusta samoissa olosuhteissa, kuten Dakay et ai. 1981 olivat jo aikaisemmin todenneet. Menetelmä toimii huoneen-5 lämmössä ja on erityisen sovelias, kun biologinen näyte suodatetaan filtterille tai imeytetään filtterille johon bakteerit jäävät. Bakteerit värjätään filtterillä välittömästi vaaleankeltaisella NBT:liuoksella, joka pelkisty-essään muodostaa filtterille näkyvän liukenemattoman 10 sinisen saostuman. NBT:n muodostama sininen väri muodostuu huomattavasti nopeammin ja on helpompi erottaa hemoglobiinia sisältävistä näytteistä kuin punainen TTC. NBT ja MTT ovat yhtä nopeita värinmuodostuksen kannalta, mutta MTT:iin verrattuna NBT:n etuna on se, että väri voidaan muodostaa 15 filtterille rajatulle alueelle, koska se saostuu liukenemattomaksi siihen kohtaan, missä dehydrogenaasit ovat. Jos bakteereja ei hajoiteta paikantuu formatsaani bakteerien ympärille. Ylimäärä NBT:a ei liuota muodostunutta sinistä formatsaania, kun taas MTT on vesiliukoinen ja soveltuu 20 spektrometrisi in määrityksiin. NBT: n avulla saadaan bakteerit osoitettua paitsi riittävän nopeasti myös ilman erillistä mittalaitetta pelkästään visuaalisesti tarkasteltuna biologisisista näytteistä kuten virtsasta, maidosta, vedestä, prosessiliemistä sopivaa hoito- tai ehkäisymuotoa 25 valittaessa. Tällöin hiivat, joita ei luokitella gram-tyypin mukaan värjääntyvät kokonaismikrobimäärityksessä ja jäävät värjääntymättä gram-negatiivisia bakteereja osoitettaessa.
Menetelmä on erityisen sovelias käytettäväksi laitteessa, 30 jossa bakteerit määritetään suoraan biologista näytteistä huokoisen suotimen avulla. Bakteereja on rikastettu huokoiselle suotimelle imulaitteella ja osoitettu suoraan suotimelta bakteereihin tarttuvan värin avulla (US-A-4336337). Väri ei kuitenkaan erota eläviä ja kuolleita bak-35 teereja toisistaan, mikä olisi tarkoituksenmukaista kun bakteerien kokonaismäärän määrittämisellä on merkitystä, esimerkiksi hygienian tason seurannassa. Sensijaan baktee- 91085 5 rien dehydrogenaasiaktiivisuutta määrittämällä tässä hakemuksessa esitetyn NBT:n avulla saadaan selville elävien bakteerien määrä biologisista näytteistä.
Imulaitteen käytöltä vältytään asettamalla bakteereja lä-5 päisemättömän suotimen alle imukykyinen toinen suodin kuten julkaisussa US-A-3741877 on esitetty. Esitetyssä menetelmässä bakteerit eivät kuitenkaan suoraan näy suotimelta vaan ne on kasvatettava pesäkkeiksi ja tämä vaatii inku-boinnin ainakin yön yli, lisäksi ne ovat välittömässä 10 kosketuksessa mahdollisen häiritsevän aineen kanssa inku-boinnin ajan.
Hakemuksessamme käytetyllä laitteella bakteerit konsentroidaan suoraan osoitussuotimelle suotimen alla olevan imu-kykyisen materiaalin avulla, jolloin elävät mikro-organis-15 mit voidaan todeta välittömästi, ilman imulaitetta ja ilman esi-inkubointia, hapetus-pelkistysreaktiota mittaavan värin avulla. Vastaavasti gram-negatiivisten bakteerien määrä voidaan osoittaa samalla tavoin sopivan detergenttiyhdis-telmän avulla. Tällöin muut eri partikkelikoon omaavat 20 solut, kuten bakteereja suuremmat leukosyytit voidaan ensin erottaa eri suotimelle ja määrittää erikseen kuten mm. julkaisussa WO-A-89/1966 on esitetty.
Näytteessä mahdollisesti vapaana olevat väriä pelkistävät aineet kuten liukoiset entsyymit, askorbinihappo, lääkeai-25 neet, pienimolekyyliset sulfhydryyliryhmiä sisältävät aineet, kuten glutationi ja muut mahdolliset pelkistävät aineet menevät sen suotimen läpi, jolle bakteerit jäävät.
Seuraavassa keksintöä kuvataan yksityiskohtaisesti viittaa-30 maila oheisiin piirustuksiin, joissa kuva 1 esittää laitetta, jossa näyte kerätään suotimelle ja kuva 2 toista laitetta, jossa näyte imeytetään suotimeen. Molemmilta laitteilta gram-negatiivisten bakteerien määrä voidaan todeta suoraan dehydrogenaasien aktiivisuutta mittaavan 35 värin avulla, kun muiden kuin gram-negatiivisten bakteerien pelkistysreaktio estetään sopivalla detergentillä, tai detergenteillä.
6
Kuvassa 1 on esitetty lohkokaavio laitteesta, jossa nestemäinen näyte pipetoidaan esisuotimen 1 päälle, jos näyte on rakeinen, tai sisältää runsaasti leukosyyttejä, muuten esisuodinta 1 ei tarvita. Keruuosa 2 keskittää näytteen 5 mikro-organismit suotimelle 3, jolle ne jäävät. Näyte voi olla etukäteen puskuroitu ja siihen on lisätty muiden kuin gram-negatiivisten bakteerien pelkistymisen estävää deter-genttiä tai detergenttejä, tai bakteerit voidaan suotimella 3 pestä detergenttiä tai detergenttejä sisältävällä pusku-10 riliuoksella ja välittömästi värjätä dehydrogenaasien osoitusseoksella, jolloin bakteerien ympärille muodostuu sinistä formatsaania. Suotimen 3 alla on imukykyistä materiaalia 4, johon näytteen nesteylimäärä imeytyy. Kaikki osat voidaan liittää pohja-osaan 5, jolloin laitteesta 15 muodostuu koottu rasia.
Kuvassa 2 on näytteen kiinteät osat sitova esisuodatin 1 ja suodin 3, jota bakteerit eivät läpäise, sekä nestettä imevä materiaali 4 asetettu kaikki tukialustalle 2, joka 20 voi olla esimerkiksi muovia. Suotimet 1 ja 3 ja imevä materiaali 4 voidaan kiinnittää esimerkiksi kaksipuolisella teipillä tukilaustaan 2. Näyte, johon on lisätty puskuria ja detergenttiä tai detergenttejä imeytetään esisuotimeen 1 ja bakteerit kerääntyvät sen ja suotimen 3 rajakohtaan, 25 josta ne voidaan todeta imeyttämällä esisuotimeen 1 dehydrogenaasien osoitusseoksella, jolloin gram-negatiivisten bakteerien ympärille muodostuu sinistä formatsaania.
30 ESIMERKKI 1
Bakteerit olivat virtsatieinfektioissa esiintyviä joko ATCC:n tyyppikantoja tai kliinisiä kantoja saatu Helsingin yliopiston serobakteriologian laitokselta. Gram-negatiivi-35 siä bakteereja: Escherichia coli (ATCC 25922) ja useita kliinisiä kantoja, Klebsiella aerogenes (ATCC 13883), Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter 91085 7 aerogenes (ATCC 13048). Gram-positiivisia bakteereja: Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Staphylococcus sap-rophyticus, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus agalactiae, Streptococcus faecium (ATCC 9790), beta-hemo-5 lyyttinen Streptococcus, B-ryhmä, Enterococcus sp., Co-rynebcterium sp. Hiivoja oli: Candida albicans (ATCC 28367 ja 36802). Bakteerit kasvatettiin yli yön BHI:ssa (Brain Heart Infusion, Difco, Detroit), 37 eC ja bakteeritiheys säädettiin BHI:sta laimentamalla 10* kpl/ml steriilillä 0.9 10 % NaCl, joka vastasi optista tiheyttä 0.400, 650 nm mitat taessa (Perkin Elmer Spectrophotometer, Norwalk). Pesäkkeiden määrä/ml tarkistettiin tekemällä laimennussarja ja viljelemällä verimaljoilla. Hiivoja kasvatettiin kaksi vuorokautta 37 °C Sabouraud-maljoilla ja maljalta kerätyis-15 tä pesäkkeistä tehtiin suspensio 10* kpl/ml kuten edellä.
Näiden lisäksi kerättiin 100 kpl virtsanäytteitä, joiden bakteeripitoisuus määritettiin bakteeriviljelyllä (UricultR,
Orion Diagnostics). Mahdolliset näytteiden leukosyytit kerättiin leukosyyttisuotimelle (Pali BioSupport Company, 20 Glen Cove).
Määrityksessä 100 μΐ bakteereja lisättiin 100 μΐ 0.2 M Tris-HCl puskuria, pH 6.5, pH 7.2, pH 8.5 (Sigma, St.Louis) , johon lisättiin 1 % :ksi glukoosia (BDH, Poole), tai fruktoosia (BDH, Poole), tai asetaattia (Merck, Darmstadt), 25 tai glutamiinihappoa (Merck, Darmstadt). Lisäksi joihinkin määrityksiin lisättiin eri määriä oktyyliglukosidia (Sigma,
St. Louis) tai guanidiinihydrokloridia (BDH, Poole) ja inkuboitiin eri aikoja 96-paikkaisella kuoppalevyllä. Näyte siirrettiin pipetillä suodatuslaitteistolle, johon baktee-30 rit keskittyivät noin halkaisijaltaan 3 mm: n alueelle suotimen päälle (Schleicher & Schuell lasikuitusuodatin No 8,), tai suodatin (leukosyyttifiltteri, Pali BioSupport Company, Glen Cove) kastettiin näytteeseen ja bakteerit imeytyivät siihen ja kulkeutuivat suodattimena rajakoh-35 taan, jossa on toinen suodatin (Schleicher & Schuell No 8). Bakteerit osoitettiin lisäämällä 100 μΐ NBT-liuosta (1 mg/ml, Sigma, St Louis), johon oli lisätty 10 μΐ PMS
8 (lmg/ml, Sigma, St.Louis).
Värin muodostuminen luettiin visuaalisesti eri aikojen kuluttua seuraavasti: 0= väritön, 1= heikko väri, 2- selvä väri, 3= hyvä väri, 4= tumma väri, 5= hyvin tumma väri.
5 ESIMERKKI 2.
Eri kliinisten Escherichia coli kantojen osoitus suotimelta 10 eri pitoisuuksissa. Bakteereja inkuboitiin 30 sekuntia 0.2 M Tris-HCl, pH 7.2 puskurissa, jossa oli 1 % glukoosia, siirrettiin suotimelle ja lisättiin NBT-PMS-liuos ja luettiin sinisen formatsaanin intensiteetti 30 min kuluttua.
15
Bakeerikanta Bakteerimäärä/ml 109 10* 107 1 06 105 E.coli a 55420 E.coli b 54320 20 E.coli 2956 443 10 E.coli 3338 555 20 E.coli 110515 443 00 25 ESIMERKKI 3.
Gram-positiivisen bakteerin, Staphylokokin formatsaanin muodostumisen esto guanidiinilla verrattuna gram-negatiivi-seen bakteeriin E. coliin. Suoritus oli muuten samanlainen 30 kuin esimerkissä 1, mutta useammassa pH:ssa ja lisänä oli 0.5 M guanidiini.
35 9 91085
Escherichia coli Staphylococcus (ATCC 25922) saprophyticus ei lisäystä guanidiini ei lisäystä guanidiini 5 _ _ _ _ pH 6.5 7.2 8.5 6.5 7.2 8.5 6.5 7.2 8.5 6.5 7.2 8.5 bakt.
1ml 10 1 07 2 3 3 2 3 3 4 4 4 0 01 106 2 2 2 2 2 2 0 2 3 0 0 0 10s 000 000 000 000 15 ESIMERKKI 4.
Eri bakteerien formatsaanin muodostumisen esto 0.5 M gua-nidiinilla, pH 7.2, mukana oli myös eri substraatteja: l % 20 glukoosi, 1% fruktoosi, 1% glutamiinihappo, tai 1 % ase-taatti. Muuten suoritus oli samanlainen kuin esimerkissä 1.
GRAM - GRAM + 25 _ _ _ BAKT. Escherichia coli a Streptococcus, groupB,102 /ml - _ _ gluk. fruk. glut. aset. gluk. fruk. glut. aset.
30 107 5 5 4 3 5 5 5 106 4 4 3 2 2 2 1 35 10 GRAM - GRAM + BAKT. Klebsiella aerogenes Streptococcus faecium /ml ATCC 13883_ ATCC 9790_ 5 gluk. fruk. glut. aset. gluk. fruk. glut. aset.
107 5 5 5 4 4 2 106 4 4 4 0 0 0 10 BAKT. Enterobacter sp Staphylococcus epidermidis /ml__ gluk. fruk. glut. aset. gluk. fruk. glut. aset. 15 ________ 107 5 5 5 3 3 3 106 4 4 3 0 0 0 20 _ _ _ BAKT. Proteus mirabilis Enterococcus sp /ml _ _ gluk. fruk. glut. aset. gluk. fruk. glut. aset.
25 107 5 5 5 5 5 2 106 3 3 3 0 0 0 30 BAKT. Pseudomonas aeruginosa Staphylococcus aureus /ml _ gluk. fruk. glut. aset. gluk. fruk. glut. aset.
107 0030 5535 35 106 0 0 2 0 1 1 3 2 91085 11 GRAM - GRAM + BAKT. Staphylococcus saprophyticus 1ml _ 5 gluk. fruk. glut. aset.
107 3 3 0 2 106 0 0 0 0 10 ESIMERKKI 5
Eri bakteerien formatsaanin muodostumisen esto eri öktyyli-15 glukosidimäärien kanssa. Muuten suoritus oli samanlainen kuin esimerkissä 1, mutta bakteeripitoisuus oli vakio 107/ ml.
Oktyyliglukosidin määrä (g/1) 20 GRAM - 4 6 8 10
Escherichia coli a 4544
Klebsiella aerogenes 5555
Enterobacter aerogenes 5553 25 Proteus mirabilis 5222
Pseudomonas aeruginosa 0000 GRAM + 30 Staphylococcus aureus 5000
Enterococcus sp. 4000
Staphylococcus epidermidis 3300
Staphylococcus saprophyticus 3222 Streptococcus agalactiae 4000 35 Streptococcus £aecium 3000
Streptococcus sp. B 5000 12 ESIMERKKI 6.
Eri bakteerien formatsaanin muodostumisen esto 0.5 M guani-diinilla ja oktyyliglukosidilla (10 g/1), tai ilman oktyy-5 liglukosidia. Muuten suoritus oli samanlainen kuin esimerkissä 1.
10 GRAM - mukana oktyyli- ilman oktyyli- glukosidi glukosidia
Escherichia coli a 4 5
Klebsiella aerogenes 4 5 15 Enterobacter aerogenes 4 5
Proteus mirabilis 5 5
Pseudomonas aeruginosa 4 0 GRAM + 20 _
Staphylococcus aureus 0 5
Enterococcus sp. 0 5
Staphylococcus epidermidis 0 4
Staphylococcus saprophyticus 0 4 25 Streptococcus agalactiae 0 5
Streptococcus faecium 0 4
Streptococcus sp. B 1 5
Corynebacterium sp. 0 5 30 Candida albicans 0 4
Candida albicans BO 3 35 13 91085 ESIMERKKI 7
Sadan virtsanäytteen viljely Uricultilla* ja vertailu esimerkin 2 mukaiseen menetelmään, jossa bakteerit todetaan 5 formatsaanin avulla. Positiivinen (+) Uricult* tulos merkitsee, että näytteessä on 105 bakteeria/ml tai enemmän ja tämän alle olevat tulokset ovat negatiivisia- + tulos formatsaanin avulla oli, kun värin intensiteetti oli 2 tai sitä voimakkaampi ja - tulos oli, kun näytteen väri oli 0 10 tai 1.
formatsaanin muodostus 15 _ +
Kokonaisbakteerimäärä, Uricult + 21 0 0 79 20 GRAM - osoitus, Uricult +12 1 0 87 GRAM + osoitus, Uricult +6 2 25 0 92 30 35
Claims (8)
1. Menetelmä gram-negatiivisten bakteerien osoittamiseksi nestemäisestä näytteestä tunnettu siitä, että 5 a) mikro-organismit erotetaan suspensiosta suodatinma-teriaalin (3) avulla, jonka huokoskoko on sellainen, että mikrobien läpäisy estyy jolloin ne konsentroitu-vat optimaalisen herkkyyden saavuttamiseksi, mutta 10 riittävä häiritsevien vapaana olevien pelkistävien yhdisteiden poistamiseksi, ja b) osoitetaan gram-negatiivisten bakteerien dehydro-genaasientsyymien läsnäolo organismeja hajoittamatta 15 käyttämällä dehydrogenaasientsyymin substraattina vä rittömästä värillisiksi muuttuvia saostuvia redox-yhdisteitä suoraan siltä suotimelta, jolle mikro-organismit suodatettaessa jäävät, ja 20 c) muiden mikrobien kuin gram-negatiivisten bakteerien pelkistysreaktio estetään joko kaotrooppisella tai ei-ionisella detergentillä tai niiden yhdistelmällä.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä tunnet- 25. u siitä, että nestemäinen näyte on virtsa tai pro- sessineste.
3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä tunnet-t u siitä, että nestemäinen näyte on virtsa. 30
4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä tunnet-t u siitä, että redox-yhdiste on saostuva trifenyyli-tetratsoliumkloridi (TTC), jodonitrotetratsolium (INT), neotetratsoliumkloridi (NTC), blue tetratsolium 35 (BT) tai nitroblue tetratsolium (NBT).
5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä tunnet- |j 91085 t u siitä, että suotimen (3) huokoskoko on 0.75 - 1.2 Mm.
6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä tunnet- 5. u siitä, että kaotrooppinen yhdiste on guanidiini tai urea.
7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä tunnet-t u siitä, että ei-ioninen alkyyliglukosidityyppinen 10 detergentti on oktyyliglukosidi tai oktyylimaltosidi.
8. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä tunnet-t u siitä, että käytetty suodatin on kiinnitetty laitteeseen siten, että se rajoittuu imukykyiseen 15 adsorbenttiin joka imee näytteen nesteylimäärän sekä liukoiset häiritsevät tekijät. 20 25 30 35
Priority Applications (7)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FI910359A FI91085C (fi) | 1991-01-24 | 1991-01-24 | Menetelmä gram-negatiivisten bakteerien määrittämiseksi ja erottamiseksi |
| US07/740,320 US5420017A (en) | 1991-01-24 | 1991-08-05 | Method and kit for the detection of microorganisms |
| EP92101132A EP0496409B1 (en) | 1991-01-24 | 1992-01-24 | A method for the detection of gram-negative bacteria |
| AT92101132T ATE144288T1 (de) | 1991-01-24 | 1992-01-24 | Ein verfahren zum nachweis gramnegativer bakterien |
| JP4032904A JPH078292A (ja) | 1991-01-24 | 1992-01-24 | グラム陰性細菌の検出方法 |
| DE69214473T DE69214473T2 (de) | 1991-01-24 | 1992-01-24 | Ein Verfahren zum Nachweis gramnegativer Bakterien |
| US08/450,630 US5714343A (en) | 1991-01-24 | 1995-07-31 | Method and kit for the detection of microorganisms |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FI910359 | 1991-01-24 | ||
| FI910359A FI91085C (fi) | 1991-01-24 | 1991-01-24 | Menetelmä gram-negatiivisten bakteerien määrittämiseksi ja erottamiseksi |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI910359A0 FI910359A0 (fi) | 1991-01-24 |
| FI910359A FI910359A (fi) | 1992-07-25 |
| FI91085B true FI91085B (fi) | 1994-01-31 |
| FI91085C FI91085C (fi) | 1994-05-10 |
Family
ID=8531792
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI910359A FI91085C (fi) | 1991-01-24 | 1991-01-24 | Menetelmä gram-negatiivisten bakteerien määrittämiseksi ja erottamiseksi |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0496409B1 (fi) |
| JP (1) | JPH078292A (fi) |
| AT (1) | ATE144288T1 (fi) |
| DE (1) | DE69214473T2 (fi) |
| FI (1) | FI91085C (fi) |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE4220653A1 (de) * | 1992-06-26 | 1994-01-13 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren und Mittel zum Nachweis eines Analyten enthaltend glykosidische Tenside |
| FR2732037B1 (fr) * | 1995-03-20 | 1997-05-30 | Dbv | Procede de detection de microorganismes par separation et culture sur un systeme gelifie, systeme gelifie et necessaire de dosage pour mettre en oeuvre ce procede, utilisation en microbiologie |
| JP3825501B2 (ja) | 1996-06-10 | 2006-09-27 | 吉郎 岡見 | 微小物質保持担体、その懸濁系、微小物質操作装置及び微小物質位置制御方法 |
| US6790661B1 (en) | 1999-07-16 | 2004-09-14 | Verax Biomedical, Inc. | System for detecting bacteria in blood, blood products, and fluids of tissues |
| JP5054194B2 (ja) * | 2007-08-01 | 2012-10-24 | 日立化成工業株式会社 | 大容量微粒子サンプル中の病原体検出 |
| WO2013046995A1 (ja) * | 2011-09-30 | 2013-04-04 | ライオン株式会社 | 酸化還元指示薬の色調変化を測定する方法 |
| JP6135700B2 (ja) | 2015-03-11 | 2017-05-31 | トヨタ自動車株式会社 | 車体前部構造 |
| US20230167480A1 (en) * | 2020-05-12 | 2023-06-01 | Hitachi High-Tech Corporation | Automatic analyzer and automatic analysis method |
| CN112080547A (zh) * | 2020-09-04 | 2020-12-15 | 斯微(上海)生物科技有限公司 | 一种快速的无菌检查方法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4525453A (en) * | 1982-10-26 | 1985-06-25 | Eastman Kodak Company | Process for rapidly differentiating between gram-negative and gram-positive microorganisms |
-
1991
- 1991-01-24 FI FI910359A patent/FI91085C/fi active IP Right Grant
-
1992
- 1992-01-24 JP JP4032904A patent/JPH078292A/ja active Pending
- 1992-01-24 EP EP92101132A patent/EP0496409B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-01-24 AT AT92101132T patent/ATE144288T1/de not_active IP Right Cessation
- 1992-01-24 DE DE69214473T patent/DE69214473T2/de not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0496409A1 (en) | 1992-07-29 |
| FI910359A (fi) | 1992-07-25 |
| DE69214473T2 (de) | 1997-05-22 |
| FI910359A0 (fi) | 1991-01-24 |
| DE69214473D1 (de) | 1996-11-21 |
| FI91085C (fi) | 1994-05-10 |
| ATE144288T1 (de) | 1996-11-15 |
| EP0496409B1 (en) | 1996-10-16 |
| JPH078292A (ja) | 1995-01-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5420017A (en) | Method and kit for the detection of microorganisms | |
| JP3095833B2 (ja) | 微生物代謝を検出する方法及びキット | |
| US6599715B1 (en) | Real time viability detection of bacterial spores | |
| US4336337A (en) | Detection of bacteria | |
| CA2305789C (en) | Detection of pathogenic microorganisms and their antimicrobial susceptibility | |
| FI96434B (fi) | Laite fluoresenssin vahvistamiseksi ja kinetiikka ja menetelmiä laitteen käyttämiseksi | |
| JPS6054698A (ja) | 細菌の感受性の試験方法および試験薬剤 | |
| FI91085B (fi) | Menetelmä gram-negatiivisten bakteerien määrittämiseksi ja erottamiseksi | |
| US6387648B1 (en) | Method for adjusting and disinfecting liquids | |
| EP0322591A2 (en) | Antibiotic resistance testing assay | |
| FI91977B (fi) | Menetelmä mikro-organismien määrittämiseksi ja erottamiseksi | |
| Schifman et al. | Bacteriuria screening by direct bioluminescence assay of ATP | |
| Learoyd et al. | An investigation of dye reduction by food‐borne bacteria | |
| CN101914612A (zh) | β-内酰胺酶检测试剂盒及其检测方法 | |
| EP0286434A2 (en) | Method for the detection of bacteria and fungi | |
| CA1311178C (en) | Use of substituted ortho-quinones as electron transfer agents in analytical determinations | |
| EP0255679B1 (en) | Composition and method using substituted ortho-quinones as electron transfer agents in analytical determinations | |
| Reynolds et al. | Development of a rapid method for the enumeration of bacteria in potable water | |
| JP3380956B2 (ja) | 黄色ブドウ球菌の検出培地 | |
| EP2804954A1 (fr) | Detection in vitro de microorganismes presentant une activite azoreductase | |
| WO1995014105A2 (en) | Antibiotic sensitivity profile | |
| Inatomi | Application of Amido black staining to enumerating bacteria grown on membrane filters | |
| JP4414176B2 (ja) | カンジダ鑑別用発色培地 | |
| Tsai et al. | Rapid separation and quantitation of mixed microorganisms by filtration and bioluminescence | |
| ES2364561T3 (es) | Medida de la contaminación |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FG | Patent granted |
Owner name: ORION-YHTYMAE OY |
|
| BB | Publication of examined application |