JPH078292A - グラム陰性細菌の検出方法 - Google Patents
グラム陰性細菌の検出方法Info
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- JPH078292A JPH078292A JP4032904A JP3290492A JPH078292A JP H078292 A JPH078292 A JP H078292A JP 4032904 A JP4032904 A JP 4032904A JP 3290492 A JP3290492 A JP 3290492A JP H078292 A JPH078292 A JP H078292A
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- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/52—Use of compounds or compositions for colorimetric, spectrophotometric or fluorometric investigation, e.g. use of reagent paper and including single- and multilayer analytical elements
- G01N33/528—Atypical element structures, e.g. gloves, rods, tampons, toilet paper
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
- C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
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- C12Q1/32—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving dehydrogenase
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2304/00—Chemical means of detecting microorganisms
- C12Q2304/20—Redox indicators
- C12Q2304/24—Tetrazolium; Formazan
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2326/00—Chromogens for determinations of oxidoreductase enzymes
- C12Q2326/90—Developer
- C12Q2326/92—Nitro blue tetrazolium chloride, i.e. NBT
Abstract
(57)【要約】
【目的】 細菌の検出及びグラム陽性細菌とグラム陰性
細菌との識別に関して本方法は、細菌を生物学的試料か
ら直接測定する器具として用いるのに特に適している。 【構成】 多孔性フィルター、又は異なる孔径のいくつ
かのフィルターで構成され、そこに試料を移し、細菌の
デヒドロゲナーゼ活性による変色に基づいて、細菌を捕
捉しているフィルター表面から直接、総細菌数を測定す
る。グラム陰性細菌数は、カオトロピック化合物又は非
イオン性アルキルグルコシド型洗浄によりグラム陽性細
菌のデヒドロゲナーゼ阻害後に、同様に測定する。同一
の条件下で還元される白血球のような大きい粒子の細胞
は異なるフィルター上で分離される。試料中に存在する
遊離の還元性化合物は細菌よりも小さく、細菌が止めら
れているフィルターを通り抜ける。
細菌との識別に関して本方法は、細菌を生物学的試料か
ら直接測定する器具として用いるのに特に適している。 【構成】 多孔性フィルター、又は異なる孔径のいくつ
かのフィルターで構成され、そこに試料を移し、細菌の
デヒドロゲナーゼ活性による変色に基づいて、細菌を捕
捉しているフィルター表面から直接、総細菌数を測定す
る。グラム陰性細菌数は、カオトロピック化合物又は非
イオン性アルキルグルコシド型洗浄によりグラム陽性細
菌のデヒドロゲナーゼ阻害後に、同様に測定する。同一
の条件下で還元される白血球のような大きい粒子の細胞
は異なるフィルター上で分離される。試料中に存在する
遊離の還元性化合物は細菌よりも小さく、細菌が止めら
れているフィルターを通り抜ける。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、液体試料中のグラム陰
性細菌の総数の迅速な検出方法に関する。
性細菌の総数の迅速な検出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】微生物は、グラム染色試験に基づいて２
群に分類される：即ちグラム陽性か又はグラム陰性であ
る。それらの異なる染色特性は表面構造の差異に基づい
ており、したがってグラム染色試験は細菌の同定におけ
る重要な判定基準である。特に感染性微生物の場合には
薬物治療の直接の作用経路、又は環境衛生の場合には駆
除剤の種類を選択するのに、グラム染色反応の知識は重
要である。グラム染色は伝統的に、対物レンズ上で乾燥
された試料で実施する。次に乾燥試料を先ずクリスタル
バイオレットで、次いでサフラニンで染色すると、その
結果、グラム陽性細菌は顕微鏡観察で青色に、グラム陰
性細菌は赤色に見える。総細菌数は、顕微鏡を用いず
に、試料から直接測定することもできる。このために
は、既知の容量の試料をフィルター表面に集め、サフラ
ニンで染色して余分な染料をすすぎ落し、その後、グラ
ム陽性及びグラム陰性細菌の両方の全細菌を、欧州特許
第２８８，６２１号に記載されているように赤色スポッ
トとして現わす。
群に分類される：即ちグラム陽性か又はグラム陰性であ
る。それらの異なる染色特性は表面構造の差異に基づい
ており、したがってグラム染色試験は細菌の同定におけ
る重要な判定基準である。特に感染性微生物の場合には
薬物治療の直接の作用経路、又は環境衛生の場合には駆
除剤の種類を選択するのに、グラム染色反応の知識は重
要である。グラム染色は伝統的に、対物レンズ上で乾燥
された試料で実施する。次に乾燥試料を先ずクリスタル
バイオレットで、次いでサフラニンで染色すると、その
結果、グラム陽性細菌は顕微鏡観察で青色に、グラム陰
性細菌は赤色に見える。総細菌数は、顕微鏡を用いず
に、試料から直接測定することもできる。このために
は、既知の容量の試料をフィルター表面に集め、サフラ
ニンで染色して余分な染料をすすぎ落し、その後、グラ
ム陽性及びグラム陰性細菌の両方の全細菌を、欧州特許
第２８８，６２１号に記載されているように赤色スポッ
トとして現わす。
【０００３】生物試料からのある属又は種の細菌の迅速
な同定は、酵素的同定及び炭水化物利用に基づく方法の
場合のように、生化学的反応を用いても達成される。酵
素反応のうち、特に迅速なのは、チトクロームにより及
びデヒドロゲナーゼのような酵素により触媒される酸化
還元反応である。これらの反応は、動物及び細菌の双方
の全ての生細胞で起こる。デヒドロゲナーゼは、確立さ
れた組織化学的方法により細胞を害うことなく生細菌か
ら検定されるが、この方法は、例えば白血球及び組織細
胞切片中に存在するデヒドロゲナーゼ類のために用いら
れてきた（Michel,G.et al.,Methods of Enzymatic Ana
lysis,pp.197-232,vol.1,1983 ）。この方法では、デヒ
ドロゲナーゼ反応における天然水素受容体は、例えばテ
トラゾリウム塩によって置き換えられ、この塩は水素で
還元された場合に青紫色に変わり、また不溶性になる。
電子移動の媒体をデヒドロゲナーゼ反応混合物に添加し
てもよい。このような媒体、例えばフェナジンメトスル
フェート（ＰＭＳ）は、反応を加速及び増幅するために
役立つ。ＰＭＳは水素をＮＡＤからテトラゾリウム塩に
伝達するが、これは有色化合物ホルマザンとして析出す
る。ＰＭＳは、メナジオン、メルドラブルー（C ．I ．
51175; Basic blue ６）又はメトキシフェナジンメトス
ルフェートのような他の水素受容体で代替されてもよ
い。
な同定は、酵素的同定及び炭水化物利用に基づく方法の
場合のように、生化学的反応を用いても達成される。酵
素反応のうち、特に迅速なのは、チトクロームにより及
びデヒドロゲナーゼのような酵素により触媒される酸化
還元反応である。これらの反応は、動物及び細菌の双方
の全ての生細胞で起こる。デヒドロゲナーゼは、確立さ
れた組織化学的方法により細胞を害うことなく生細菌か
ら検定されるが、この方法は、例えば白血球及び組織細
胞切片中に存在するデヒドロゲナーゼ類のために用いら
れてきた（Michel,G.et al.,Methods of Enzymatic Ana
lysis,pp.197-232,vol.1,1983 ）。この方法では、デヒ
ドロゲナーゼ反応における天然水素受容体は、例えばテ
トラゾリウム塩によって置き換えられ、この塩は水素で
還元された場合に青紫色に変わり、また不溶性になる。
電子移動の媒体をデヒドロゲナーゼ反応混合物に添加し
てもよい。このような媒体、例えばフェナジンメトスル
フェート（ＰＭＳ）は、反応を加速及び増幅するために
役立つ。ＰＭＳは水素をＮＡＤからテトラゾリウム塩に
伝達するが、これは有色化合物ホルマザンとして析出す
る。ＰＭＳは、メナジオン、メルドラブルー（C ．I ．
51175; Basic blue ６）又はメトキシフェナジンメトス
ルフェートのような他の水素受容体で代替されてもよ
い。
【０００４】上記の方法は、細菌の同定にも用いられて
きた。トリフェニルテトラゾリウムクロリド（ＴＴＣ）
のような酸化還元反応の測定に用いられる化学的化合物
を、細菌を含有する試料に添加すると、それは還元され
て、無色から赤色に変わる。この変化は、肉眼的に又は
比色定量測定によって測定し得る。ＴＴＣに加えて、他
のさらに迅速なテトラゾリウム塩、例えばヨードニトロ
テトラゾリウム（ＩＮＴ）及びネオテトラゾリウムクロ
リド（ＮＴＣ）、あるいは青色になる塩、例えばブルー
テトラゾリウム（ＢＴ）及びニトロブルーテトラゾリウ
ム（ＮＢＴ）を用い得る（Histological and Histochem
ical Methods,Theory and Practice, Chapter 16,p.25
8,second edition 1990）。
きた。トリフェニルテトラゾリウムクロリド（ＴＴＣ）
のような酸化還元反応の測定に用いられる化学的化合物
を、細菌を含有する試料に添加すると、それは還元され
て、無色から赤色に変わる。この変化は、肉眼的に又は
比色定量測定によって測定し得る。ＴＴＣに加えて、他
のさらに迅速なテトラゾリウム塩、例えばヨードニトロ
テトラゾリウム（ＩＮＴ）及びネオテトラゾリウムクロ
リド（ＮＴＣ）、あるいは青色になる塩、例えばブルー
テトラゾリウム（ＢＴ）及びニトロブルーテトラゾリウ
ム（ＮＢＴ）を用い得る（Histological and Histochem
ical Methods,Theory and Practice, Chapter 16,p.25
8,second edition 1990）。
【０００５】異なるグループの細菌は、グラム染色試験
におけるそれらの反応に基づいて識別される。染色特性
間の差異は、細菌の表面構造の差の結果として生じる。
これらの構造的差異はまた、洗剤に対する異なる細菌の
感受性に影響を及ぼす。この特性は、次いで、上記のよ
うなテトラゾリウム染色による検出と組み合わせて、グ
ラム陰性細菌の同定に利用されてきた。
におけるそれらの反応に基づいて識別される。染色特性
間の差異は、細菌の表面構造の差の結果として生じる。
これらの構造的差異はまた、洗剤に対する異なる細菌の
感受性に影響を及ぼす。この特性は、次いで、上記のよ
うなテトラゾリウム染色による検出と組み合わせて、グ
ラム陰性細菌の同定に利用されてきた。
【０００６】好適な濃度のテルギトール（Tergitol) −
７のような陰イオン洗剤はグラム陰性細菌の呼吸、即ち
酸素摂取を選択的に阻害し、その結果、テトラゾリウム
を着色化合物に還元するのも阻害する。陽イオン洗剤
は、グラム陰性及びグラム陽性細菌の呼吸をともに阻害
するが、一方中性、非イオン洗剤は作用を及ぼさない
（Baker et al.,J.Exp.Med. 73,249-271,1941 ）。
７のような陰イオン洗剤はグラム陰性細菌の呼吸、即ち
酸素摂取を選択的に阻害し、その結果、テトラゾリウム
を着色化合物に還元するのも阻害する。陽イオン洗剤
は、グラム陰性及びグラム陽性細菌の呼吸をともに阻害
するが、一方中性、非イオン洗剤は作用を及ぼさない
（Baker et al.,J.Exp.Med. 73,249-271,1941 ）。
【０００７】細菌の呼吸に加えて、ＴＴＣにより測定さ
れる、デヒドロゲナーゼ活性も同様に阻害される（Dake
y et al.,Zentralblatt Bakt.Hyg.I.Abt.Orig.B;174 p
p.121-124,1981 ）。これは、４つの異なる細菌株を用
いて立証された。これらの観察は、液体試料からの細菌
の同定に用いられた（欧州特許第１０７，５９４号）。
呼吸を阻害する陰イオン洗剤はまた、デヒドロゲナーゼ
の作用による発色を阻止するが、一方ある種の抗生物質
及び他の成長阻害化合物は同時に作用を及ぼさないこと
が判明した。
れる、デヒドロゲナーゼ活性も同様に阻害される（Dake
y et al.,Zentralblatt Bakt.Hyg.I.Abt.Orig.B;174 p
p.121-124,1981 ）。これは、４つの異なる細菌株を用
いて立証された。これらの観察は、液体試料からの細菌
の同定に用いられた（欧州特許第１０７，５９４号）。
呼吸を阻害する陰イオン洗剤はまた、デヒドロゲナーゼ
の作用による発色を阻止するが、一方ある種の抗生物質
及び他の成長阻害化合物は同時に作用を及ぼさないこと
が判明した。
【０００８】上記の観察を基礎として、生物試料から直
接細菌を検出する方法がさらに開発されてきた。デヒド
ロゲナーゼの作用によって引き起こされる発色は試料中
の細菌の存在を示すために役立ち、細菌を破壊せずに直
接試料から検出される。さらに、グラム陰性細菌は、非
イオン性アルキルグルコシド型洗剤を含有する洗剤とグ
アニジンのようなカオトロピック（caotropic)化合物と
の組み合わせを用いて全体の細菌数から区別して検出し
得る。ポリオキシエチレン化合物であるTritonＸ−１０
０及びTween ８０のようなその他の非イオン性洗剤は、
Dakay ら(1941)がもっと早い時期に報告したのと同一条
件下で作用を示さなかった。本方法は室温で実施し、細
菌がフィルター膜上に残存するように生物試料を濾過す
る場合に特に適している。還元されるとフィルター上に
目に見える青色析出物を形成する淡黄色ＮＢＴ溶液を用
いて、フィルター上で細菌を直ちに染色する。還元ＮＢ
Ｔの青色はＴＴＣの赤色よりもかなり迅速に形成され、
ヘモグロビンを含有する試料の赤色と識別するのが容易
である。ＮＢＴ及びＭＴＴは発色の観点から等しく迅速
であるが、しかしＭＴＴと比較した場合のＮＢＴの利点
は、デヒドロゲナーゼが存在する点で色が析出するため
に、フィルターの局限された領域上に付着するという点
である。もし細菌が破壊されない場合は、ホルマザンは
細菌の周囲に存在する。余分なＮＢＴは青色ホルマザン
を溶解しないが、一方ＭＴＴは水溶性であり、分光測光
法に用い得る。適当な手段又は予防法を選べば、ＮＢＴ
を用いて簡単に目視による検査により、十分に迅速なだ
けでなく、なんら別の測定装置も用いずに尿、乳、水及
び処理液のような生物学的試料から細菌を同定し得る。
「処理液」とは、たとえば、化学的木材産業、甜菜：サ
トウキビ産業、廃水処理等における、産業処理液を意味
する。この場合、グラム染色型で分類されない酵母菌
は、総微生物測定では染色されるが、しかしグラム細菌
の評価では染色されない。
接細菌を検出する方法がさらに開発されてきた。デヒド
ロゲナーゼの作用によって引き起こされる発色は試料中
の細菌の存在を示すために役立ち、細菌を破壊せずに直
接試料から検出される。さらに、グラム陰性細菌は、非
イオン性アルキルグルコシド型洗剤を含有する洗剤とグ
アニジンのようなカオトロピック（caotropic)化合物と
の組み合わせを用いて全体の細菌数から区別して検出し
得る。ポリオキシエチレン化合物であるTritonＸ−１０
０及びTween ８０のようなその他の非イオン性洗剤は、
Dakay ら(1941)がもっと早い時期に報告したのと同一条
件下で作用を示さなかった。本方法は室温で実施し、細
菌がフィルター膜上に残存するように生物試料を濾過す
る場合に特に適している。還元されるとフィルター上に
目に見える青色析出物を形成する淡黄色ＮＢＴ溶液を用
いて、フィルター上で細菌を直ちに染色する。還元ＮＢ
Ｔの青色はＴＴＣの赤色よりもかなり迅速に形成され、
ヘモグロビンを含有する試料の赤色と識別するのが容易
である。ＮＢＴ及びＭＴＴは発色の観点から等しく迅速
であるが、しかしＭＴＴと比較した場合のＮＢＴの利点
は、デヒドロゲナーゼが存在する点で色が析出するため
に、フィルターの局限された領域上に付着するという点
である。もし細菌が破壊されない場合は、ホルマザンは
細菌の周囲に存在する。余分なＮＢＴは青色ホルマザン
を溶解しないが、一方ＭＴＴは水溶性であり、分光測光
法に用い得る。適当な手段又は予防法を選べば、ＮＢＴ
を用いて簡単に目視による検査により、十分に迅速なだ
けでなく、なんら別の測定装置も用いずに尿、乳、水及
び処理液のような生物学的試料から細菌を同定し得る。
「処理液」とは、たとえば、化学的木材産業、甜菜：サ
トウキビ産業、廃水処理等における、産業処理液を意味
する。この場合、グラム染色型で分類されない酵母菌
は、総微生物測定では染色されるが、しかしグラム細菌
の評価では染色されない。
【０００９】本方法は、細菌を生物学的試料から直接検
定する装置に用いるのに特に適している。本器具は、多
孔性フィルター、又は異なる孔径を有するいくつかのユ
ニットで構成されるフィルターから成り、試料は吸引に
よってその上に移される。細菌を捕捉したフィルター表
面での酸化還元反応に起因する変色に基づいて、微生物
を直ちに検出する。それと対応して、グラム陰性細菌の
量は、洗剤の好適な組み合わせを用いてグラム陽性菌の
デヒドロゲナーゼを阻害し、同様の方法で測定し得る。
同じ条件下で還元される異なる粒子サイズの細胞、例え
ば白血球も、異なるフィルター上で又はいくつかのフィ
ルターを用いて分離し、各フィルターから個別に検定し
得る。試料中に存在し得る遊離の還元性化合物、例えば
可溶性酵素、アスコルビン酸、薬学的化合物、グルタチ
オンのような低分子量スルフヒドリル基含有分子及び他
の還元性化合物は、細菌が捕捉されるフィルターを通り
抜けてしまう。
定する装置に用いるのに特に適している。本器具は、多
孔性フィルター、又は異なる孔径を有するいくつかのユ
ニットで構成されるフィルターから成り、試料は吸引に
よってその上に移される。細菌を捕捉したフィルター表
面での酸化還元反応に起因する変色に基づいて、微生物
を直ちに検出する。それと対応して、グラム陰性細菌の
量は、洗剤の好適な組み合わせを用いてグラム陽性菌の
デヒドロゲナーゼを阻害し、同様の方法で測定し得る。
同じ条件下で還元される異なる粒子サイズの細胞、例え
ば白血球も、異なるフィルター上で又はいくつかのフィ
ルターを用いて分離し、各フィルターから個別に検定し
得る。試料中に存在し得る遊離の還元性化合物、例えば
可溶性酵素、アスコルビン酸、薬学的化合物、グルタチ
オンのような低分子量スルフヒドリル基含有分子及び他
の還元性化合物は、細菌が捕捉されるフィルターを通り
抜けてしまう。
【００１０】添付の図面を参照しながら以下に本発明を
詳細に説明する。図１は、フィルター上で試料から細菌
を採集するのに用いる器具を示し、図２は試料をフィル
ター中に吸引する器具を示す。グラム陰性細菌の量は、
デヒドロゲナーゼ活性を測定する色変化に基づいて両方
の器具で直接に測定し得るし、一方グラム陰性細菌以外
の微生物の還元反応は好適な洗剤の選択によって妨害し
得る。
詳細に説明する。図１は、フィルター上で試料から細菌
を採集するのに用いる器具を示し、図２は試料をフィル
ター中に吸引する器具を示す。グラム陰性細菌の量は、
デヒドロゲナーゼ活性を測定する色変化に基づいて両方
の器具で直接に測定し得るし、一方グラム陰性細菌以外
の微生物の還元反応は好適な洗剤の選択によって妨害し
得る。
【００１１】図１は、試料が多数の白血球を含有する微
粒子状である場合に、プレフィルター１上に液体試料を
ピペットで移す（他の場合には前濾過は必要ない）器具
の分解図である。収集室２において、試料中の微生物は
フィルター３上に捕捉される。試料を、洗剤含有溶液を
用いて、グラム陰性細菌以外の他の全ての細菌の還元反
応を予備処理してもよい。あるいは、フィルター３の表
面上に止められた細菌を洗剤又は洗剤を含有する緩衝液
で洗浄後、直ちにデヒドロゲナーゼ検出のための混合物
で染色する。その結果、ホルマザンの析出による青色域
が細菌周囲に形成される。フィルター３の下は吸収材４
で、これは試料液を吸収する。器具の全部品は基箱５中
に収納されて、器具は小箱の形態をとる。
粒子状である場合に、プレフィルター１上に液体試料を
ピペットで移す（他の場合には前濾過は必要ない）器具
の分解図である。収集室２において、試料中の微生物は
フィルター３上に捕捉される。試料を、洗剤含有溶液を
用いて、グラム陰性細菌以外の他の全ての細菌の還元反
応を予備処理してもよい。あるいは、フィルター３の表
面上に止められた細菌を洗剤又は洗剤を含有する緩衝液
で洗浄後、直ちにデヒドロゲナーゼ検出のための混合物
で染色する。その結果、ホルマザンの析出による青色域
が細菌周囲に形成される。フィルター３の下は吸収材４
で、これは試料液を吸収する。器具の全部品は基箱５中
に収納されて、器具は小箱の形態をとる。
【００１２】図２に示す器具は、試料から粒子を除去す
るためのプレフィルター１、そこで細菌を捕捉するフィ
ルター３、及び吸収材４を包含し、それらは全て、例え
ばプラスチック製であってもよい基板６上に組み立てら
れる。フィルター１及び３、並びに吸収材４は、例えば
両面テープを用いて基板６に取り付けられてもよい。洗
剤を含有する溶液で処理された試料をプレフィルター１
に通し、そして試料中に存在する細菌をプレフィルター
１とフィルター３の間の界面に収集し、デヒドロゲナー
ゼ測定のための混合物をプレフィルター１に通すことに
よってそれらが立証され、その時青色のホルマザンがグ
ラム陰性細菌の周囲に生成される。
るためのプレフィルター１、そこで細菌を捕捉するフィ
ルター３、及び吸収材４を包含し、それらは全て、例え
ばプラスチック製であってもよい基板６上に組み立てら
れる。フィルター１及び３、並びに吸収材４は、例えば
両面テープを用いて基板６に取り付けられてもよい。洗
剤を含有する溶液で処理された試料をプレフィルター１
に通し、そして試料中に存在する細菌をプレフィルター
１とフィルター３の間の界面に収集し、デヒドロゲナー
ゼ測定のための混合物をプレフィルター１に通すことに
よってそれらが立証され、その時青色のホルマザンがグ
ラム陰性細菌の周囲に生成される。
【００１３】
実施例１ 試験細菌は、尿路感染症患者から単離された株、即ちヘ
ルシンキ大学血液生物学科から入手したＡＴＣＣ型株又
は臨床株であった。グラム陰性細菌としては、Escheric
hia coli(ATCC 25922)、及びいくつかの臨床株：Klebsie
lla aerogenes(AECC 13833)、Proteus mirabilis、 Pseu
domonas aeruginosa 及びEnterobacteraerogenes(ATCC
13048)であった。グラム陽性細菌としては、 Staphyloc
occusaureus(ATCC 25923)、 Staphylococcus saprophyt
icus、 Staphylococcus epidermidis 、Streptococcus a
galactiae、Streptococcus faecium (ATCC 9790) 、β-
hemolytic Streptococcus Ｂ群、 Enterococcus sp、
及びCorynebacterium spが含まれていた。酵母菌株は、
Candida albicans ATCC 28367 及び36802 であった。
細菌をＢＨＩブイヨン（Brain-Heart Infusion, Difco,
Detroit）中で３７℃で一晩培養し、滅菌０．９％塩化
ナトリウム溶液で６５０ｍｍで０．４００の光学密度
（Perkinn Elmer 分光光度計,Norwalk）に希釈すること
によってブイヨン中の細菌数を約１０8 ＣＦＵ／ｍｌ
（コロニー形成単位／ｍｌ）に調節した。細菌集団は希
釈して血液寒天上に平板培養してチェックした。酵母菌
株をSabouraud 寒天平板上で３７℃で２日間培養し、微
少量を滅菌塩溶液で上記のように０．４００の光学密度
になるまで希釈して、１０8 ＣＦＵ／ｍｌの懸濁液を作
った。これらの試料に加えて、１００個の尿試料を採取
した。これらの試料の細菌含量は、細菌培養（Uricult
R, Orion Diagnostica）によって検定した。試料中に存
在する可能性のある白血球は、白血球フィルター（Pall
Biosupport Company,Glen Cove ）上に収集した。
ルシンキ大学血液生物学科から入手したＡＴＣＣ型株又
は臨床株であった。グラム陰性細菌としては、Escheric
hia coli(ATCC 25922)、及びいくつかの臨床株：Klebsie
lla aerogenes(AECC 13833)、Proteus mirabilis、 Pseu
domonas aeruginosa 及びEnterobacteraerogenes(ATCC
13048)であった。グラム陽性細菌としては、 Staphyloc
occusaureus(ATCC 25923)、 Staphylococcus saprophyt
icus、 Staphylococcus epidermidis 、Streptococcus a
galactiae、Streptococcus faecium (ATCC 9790) 、β-
hemolytic Streptococcus Ｂ群、 Enterococcus sp、
及びCorynebacterium spが含まれていた。酵母菌株は、
Candida albicans ATCC 28367 及び36802 であった。
細菌をＢＨＩブイヨン（Brain-Heart Infusion, Difco,
Detroit）中で３７℃で一晩培養し、滅菌０．９％塩化
ナトリウム溶液で６５０ｍｍで０．４００の光学密度
（Perkinn Elmer 分光光度計,Norwalk）に希釈すること
によってブイヨン中の細菌数を約１０8 ＣＦＵ／ｍｌ
（コロニー形成単位／ｍｌ）に調節した。細菌集団は希
釈して血液寒天上に平板培養してチェックした。酵母菌
株をSabouraud 寒天平板上で３７℃で２日間培養し、微
少量を滅菌塩溶液で上記のように０．４００の光学密度
になるまで希釈して、１０8 ＣＦＵ／ｍｌの懸濁液を作
った。これらの試料に加えて、１００個の尿試料を採取
した。これらの試料の細菌含量は、細菌培養（Uricult
R, Orion Diagnostica）によって検定した。試料中に存
在する可能性のある白血球は、白血球フィルター（Pall
Biosupport Company,Glen Cove ）上に収集した。
【００１４】本検定においては、１００μｌの細菌懸濁
液を、１．０％グルコース（BDH, Poole）又はフラクト
ース（BDH, Poole）、酢酸塩（Merck, Darmstadt）又は
グルタミン酸塩（Merck, Darmstadt）を含有する１００
μｌの０．２M トリス塩酸緩衝液（ｐＨ６．５、７．２
又は８．５、Sigma, St. Louis）に添加した。いくつか
の検定のために、種々の量のオクチルグルコシド（Sigm
a, St. Louis）、又は塩酸グアニジン（BDH, Poole）も
混合物に加え、それを９６穴プレート上で種々の時間、
インキュベートした。試料を濾過装置にピペットで移
し、フィルター（Schleicher and Schuell glass fiber
filter No.8）の表面上の直径約３ｍｍの領域内に細菌
を収集した。又は白血球フィルター（Pall BioSupport
Company,Glen Cove ）を試料中に浸して、細菌を通過さ
せ、別のフィルター（Schleicher and Schuell No.8 ）
を配置したフィルター界面に移した。１０μｌ ＰＭＳ
（１ｍｇ／ｍｌ，Sigma, St. Louis）を含有する１００
μｌ ＮＢＴ溶液（１ｍｇ／ｍｌ，Sigma, St. Louis）
をフィルターに添加することによって、細菌を検出し
た。
液を、１．０％グルコース（BDH, Poole）又はフラクト
ース（BDH, Poole）、酢酸塩（Merck, Darmstadt）又は
グルタミン酸塩（Merck, Darmstadt）を含有する１００
μｌの０．２M トリス塩酸緩衝液（ｐＨ６．５、７．２
又は８．５、Sigma, St. Louis）に添加した。いくつか
の検定のために、種々の量のオクチルグルコシド（Sigm
a, St. Louis）、又は塩酸グアニジン（BDH, Poole）も
混合物に加え、それを９６穴プレート上で種々の時間、
インキュベートした。試料を濾過装置にピペットで移
し、フィルター（Schleicher and Schuell glass fiber
filter No.8）の表面上の直径約３ｍｍの領域内に細菌
を収集した。又は白血球フィルター（Pall BioSupport
Company,Glen Cove ）を試料中に浸して、細菌を通過さ
せ、別のフィルター（Schleicher and Schuell No.8 ）
を配置したフィルター界面に移した。１０μｌ ＰＭＳ
（１ｍｇ／ｍｌ，Sigma, St. Louis）を含有する１００
μｌ ＮＢＴ溶液（１ｍｇ／ｍｌ，Sigma, St. Louis）
をフィルターに添加することによって、細菌を検出し
た。
【００１５】発色は、以下のスケールによって、異なる
時間毎に肉眼で評価した：０＝無色； １＝弱く発色；
２＝明確に検出可能な色； ３＝はっきりと発色；４＝
濃く発色； ５＝非常に濃く発色。
時間毎に肉眼で評価した：０＝無色； １＝弱く発色；
２＝明確に検出可能な色； ３＝はっきりと発色；４＝
濃く発色； ５＝非常に濃く発色。
【００１６】実施例２ 種々の濃度の Escherichia coli の異なる臨床株のフィ
ルター上での検出を行った。細菌を、１．０％グルコー
スを含有する、ｐＨ７．２の０．２M トリス塩酸緩衝液
中で３０秒間インキュベートし、フィルターに移して、
それにＮＢＴ−ＰＭＳ溶液を添加し、ホルマザンの青色
の強度を３０分後に調べた。
ルター上での検出を行った。細菌を、１．０％グルコー
スを含有する、ｐＨ７．２の０．２M トリス塩酸緩衝液
中で３０秒間インキュベートし、フィルターに移して、
それにＮＢＴ−ＰＭＳ溶液を添加し、ホルマザンの青色
の強度を３０分後に調べた。
【００１７】 ──────────────────────────────────── 細菌株 細菌数／ｍｌ ──────────────────────── 109 108 107 106 105 ──────────────────────────────────── E. coli a 5 5 4 2 0 E. coli b 5 4 3 2 0 E. coli 2956 4 4 3 1 0 E. coli 3338 5 5 5 2 0 E. coli 110515 4 4 3 0 0 ────────────────────────────────────
【００１８】実施例３ グアニジンにより、グラム陽性細菌 Staphylococcus に
よるホルマザン産生が阻止されること及びグラム陰性細
菌 E. coli に及ぼす効果を示す。試験は評価の場合と
同様に実施し、０．５M グアニジンを添加した。
よるホルマザン産生が阻止されること及びグラム陰性細
菌 E. coli に及ぼす効果を示す。試験は評価の場合と
同様に実施し、０．５M グアニジンを添加した。
【００１９】 ─────────────────────────────────── Escherichia coli Staphylococcus （ATCC 25922） saprofyticus ────────────────── ──────────────── 添加剤なし グアニジン 添加剤なし グアニジン ─────── ─────── ─────── ──────── ｐＨ 6.5 7.2 8.5 6.5 7.2 8.5 6.5 7.2 8.5 6.5 7.2 8.5 ─────────────────────────────────── 細菌／ｍｌ ───── 10 7 2 3 3 2 3 3 4 4 4 0 0 1 10 6 2 2 2 2 2 2 0 2 3 0 0 0 10 5 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 ───────────────────────────────────
【００２０】実施例４ 異なる基質：１％グルコース；１％フラクトース；１％
グルタミン酸塩；１％酢酸塩の存在下で０．５M グアニ
ジンにより、ｐＨ７．２で、種々の細菌によるホルマザ
ン産生が阻止されることを示す。他の点では、実施例１
の場合と同様に試験を実施した。その結果を表１に示
す。
グルタミン酸塩；１％酢酸塩の存在下で０．５M グアニ
ジンにより、ｐＨ７．２で、種々の細菌によるホルマザ
ン産生が阻止されることを示す。他の点では、実施例１
の場合と同様に試験を実施した。その結果を表１に示
す。
【００２１】
【表１】
【００２２】実施例５ 異なる濃度のオクチルグルコシドにより、種々の細菌に
よるホルマザン産生の阻止を示す。細菌濃度を１０7 Ｃ
ＦＵ／ｍｌとした以外は、実施例１の場合と同様に試験
を実施した。その結果を表２に示す。
よるホルマザン産生の阻止を示す。細菌濃度を１０7 Ｃ
ＦＵ／ｍｌとした以外は、実施例１の場合と同様に試験
を実施した。その結果を表２に示す。
【００２３】
【表２】
【００２４】実施例６ １０ｇ／ｌのオクチルグルコシドを含有する場合及び含
有しない場合の、０．５M グアニジンを用いた種々の細
菌によるホルマザン産生の阻止を示す。他の点では、実
施例１の場合と同様に試験を実施した。その結果を表３
に示す。
有しない場合の、０．５M グアニジンを用いた種々の細
菌によるホルマザン産生の阻止を示す。他の点では、実
施例１の場合と同様に試験を実施した。その結果を表３
に示す。
【００２５】
【表３】
【００２６】実施例７ Uricult R を用いた１００個の尿試料を培養し、及び実
施例２に記載の方法により比較した。この場合、ホルマ
ザンの産生によって細菌を検出した。UricultR 試験の
正（＋）の結果は、試料が少なくとも１０5 ＣＦＵ／ｍ
ｌの細菌を含有することを示す。１０5 ＣＦＵ／ｍｌ未
満の細菌数は、負（−）の結果で示す。発色強度が２又
はそれ以上である場合はホルマザン生成が正の結果を記
録し、負の結果は０又は１の発色強度であるものを示し
た。
施例２に記載の方法により比較した。この場合、ホルマ
ザンの産生によって細菌を検出した。UricultR 試験の
正（＋）の結果は、試料が少なくとも１０5 ＣＦＵ／ｍ
ｌの細菌を含有することを示す。１０5 ＣＦＵ／ｍｌ未
満の細菌数は、負（−）の結果で示す。発色強度が２又
はそれ以上である場合はホルマザン生成が正の結果を記
録し、負の結果は０又は１の発色強度であるものを示し
た。
【００２７】 ───────────────────────────────── ホルマザン産生 ────────────── ＋ − ───────────────────────────────── 総細菌数， Uricult ＋ 21 0 − 0 79 グラム陰性反応， Uricult ＋ 12 1 − 0 87 グラム陽性反応， Uricult ＋ 6 2 − 0 92 ─────────────────────────────────
【図１】本発明の微生物検出器具の分解図である。
【図２】本発明の別の微生物検出器具の斜視図である。
１……予備フィルター ２……収集室 ３……フィルター ４……吸収材 ５……基箱 ６……基板
Claims (14)
- 【請求項１】 無色から有色状態に変化するデヒドロゲ
ナーゼ酵素酸化還元化合物を基質として用いて、グラム
陰性細菌を害うことなくデヒドロゲナーゼ酵素の存在を
検出することによって、液体試料中のグラム陰性細菌を
検出するための方法であって、最適感度を得るため、グ
ラム陰性細菌を通過させるには十分小さいが、しかし遊
離の還元性化合物を通過させるには十分な大きさの孔径
を有するフィルター材を用いて、懸濁液からグラム陰性
細菌を分離し、そしてグラム陰性細菌以外の細菌の還元
反応をカオトロピック化合物又は非イオン性アルキルグ
ルコシド型洗浄剤あるいはそれらの混合物を用いて阻止
する方法。 - 【請求項２】 液体試料が、尿又は処理液である請求項
１記載の方法。 - 【請求項３】 液体試料が、尿である請求項２記載の方
法。 - 【請求項４】 酸化還元化合物が、ジクロロインドフェ
ノール、レゾアズリン、トリフェニルテトラゾリウムク
ロリド（ＴＴＣ）、ヨードニトロテトラゾリウム（ＩＮ
Ｔ）、ネオテトラゾリウムクロリド（ＮＴＣ）、ブルー
テトラゾリウム（ＢＴ）又はニトロブルーテトラゾリウ
ム（ＮＢＴ）である請求項１記載の方法。 - 【請求項５】 フィルター材の孔径が、０．７５〜１．
２μｍである請求項１記載の方法。 - 【請求項６】 カオトロピック化合物が、グアニジン又
は尿素である請求項１記載の方法。 - 【請求項７】 非イオン性アルキルグルコシド型洗剤
が、オクチルグルコシド又はオクチルマルトシドである
請求項１記載の方法。 - 【請求項８】 無色から有色状態に変化するデヒドロゲ
ナーゼ酵素酸化還元化合物を基質として用いて、グラム
陰性細菌を害うことなくデヒドロゲナーゼ酵素の存在を
検出することによって、液体試料中のグラム陰性細菌を
検出するための器具であって、最適感度を得るため、グ
ラム陰性細菌を通過させるには十分小さいが、しかし遊
離の還元性化合物を通過させるには十分な大きさの孔径
を有するフィルター材を用いて、懸濁液からグラム陰性
細菌を分離し、そしてグラム陰性細菌以外の細菌の還元
反応をカオトロピック化合物又は非イオン性アルキルグ
ルコシド型洗剤あるいはそれらの混合物を用いて阻止
し、そして器具中のフィルター材が吸収材と直接接触す
るように設置されており、それによって該吸収材が液体
のフィルター通過を容易にするか又はそれを助けるよう
にした器具。 - 【請求項９】 液体試料が、尿又は処理液である請求項
８記載の器具。 - 【請求項１０】 液体試料が、尿である請求項９記載の
器具。 - 【請求項１１】 酸化還元化合物が、メチレンブルー、
ジクロロインドフェノール、レサズリン、トリフェニル
テトラゾリウムクロリド（ＴＴＣ）、ヨードニトロテト
ラゾリウム（ＩＮＴ）、ネオテトラゾリウムクロリド
（ＮＴＣ）、ブルーテトラゾリウム（ＢＴ）又はニトロ
ブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）である請求項８記載の
器具。 - 【請求項１２】 フィルターの孔径が、０．７５〜１．
２μｍである請求項８記載の器具。 - 【請求項１３】 カオトロピック化合物が、グアニジン
又は尿素である請求項８記載の器具。 - 【請求項１４】 非イオン性アルキルグルコシド型洗剤
が、オクチルグルコシド又はオクチルマルトシドである
請求項８記載の器具。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FI910359 | 1991-01-24 | ||
| FI910359A FI91085C (fi) | 1991-01-24 | 1991-01-24 | Menetelmä gram-negatiivisten bakteerien määrittämiseksi ja erottamiseksi |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH078292A true JPH078292A (ja) | 1995-01-13 |
Family
ID=8531792
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4032904A Pending JPH078292A (ja) | 1991-01-24 | 1992-01-24 | グラム陰性細菌の検出方法 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0496409B1 (ja) |
| JP (1) | JPH078292A (ja) |
| AT (1) | ATE144288T1 (ja) |
| DE (1) | DE69214473T2 (ja) |
| FI (1) | FI91085C (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1997047969A1 (en) * | 1996-06-10 | 1997-12-18 | Precision System Science Co., Ltd. | Fine substance hold-back carrier, suspension system for the same, fine substance manipulating apparatus and method of controlling position of fine substance |
| JP2010535341A (ja) * | 2007-08-01 | 2010-11-18 | 日立化成工業株式会社 | 大容量微粒子サンプル中の病原体検出 |
| WO2021229667A1 (ja) * | 2020-05-12 | 2021-11-18 | 株式会社日立ハイテク | 自動分析装置、自動分析方法 |
| DE102016203459B4 (de) | 2015-03-11 | 2023-02-09 | Toyota Jidosha Kabushiki Kaisha | Fahrzeugaufbau-frontabschnittstruktur |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE4220653A1 (de) * | 1992-06-26 | 1994-01-13 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren und Mittel zum Nachweis eines Analyten enthaltend glykosidische Tenside |
| FR2732037B1 (fr) * | 1995-03-20 | 1997-05-30 | Dbv | Procede de detection de microorganismes par separation et culture sur un systeme gelifie, systeme gelifie et necessaire de dosage pour mettre en oeuvre ce procede, utilisation en microbiologie |
| US6790661B1 (en) | 1999-07-16 | 2004-09-14 | Verax Biomedical, Inc. | System for detecting bacteria in blood, blood products, and fluids of tissues |
| US9598715B2 (en) * | 2011-09-30 | 2017-03-21 | Arkray, Inc. | Method for measuring color change of oxidation-reduction indicator |
| CN112080547A (zh) * | 2020-09-04 | 2020-12-15 | 斯微(上海)生物科技有限公司 | 一种快速的无菌检查方法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4525453A (en) * | 1982-10-26 | 1985-06-25 | Eastman Kodak Company | Process for rapidly differentiating between gram-negative and gram-positive microorganisms |
-
1991
- 1991-01-24 FI FI910359A patent/FI91085C/fi active IP Right Grant
-
1992
- 1992-01-24 EP EP92101132A patent/EP0496409B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-01-24 DE DE69214473T patent/DE69214473T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1992-01-24 JP JP4032904A patent/JPH078292A/ja active Pending
- 1992-01-24 AT AT92101132T patent/ATE144288T1/de not_active IP Right Cessation
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1997047969A1 (en) * | 1996-06-10 | 1997-12-18 | Precision System Science Co., Ltd. | Fine substance hold-back carrier, suspension system for the same, fine substance manipulating apparatus and method of controlling position of fine substance |
| US7071006B2 (en) | 1996-06-10 | 2006-07-04 | Precision System Science Co., Ltd. | Carrier holding micro-substances, system suspending such carriers apparatus for manipulating such carriers and method of controlling positions of such carriers |
| JP2010535341A (ja) * | 2007-08-01 | 2010-11-18 | 日立化成工業株式会社 | 大容量微粒子サンプル中の病原体検出 |
| DE102016203459B4 (de) | 2015-03-11 | 2023-02-09 | Toyota Jidosha Kabushiki Kaisha | Fahrzeugaufbau-frontabschnittstruktur |
| WO2021229667A1 (ja) * | 2020-05-12 | 2021-11-18 | 株式会社日立ハイテク | 自動分析装置、自動分析方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0496409B1 (en) | 1996-10-16 |
| FI91085B (fi) | 1994-01-31 |
| EP0496409A1 (en) | 1992-07-29 |
| DE69214473T2 (de) | 1997-05-22 |
| ATE144288T1 (de) | 1996-11-15 |
| FI910359A (fi) | 1992-07-25 |
| FI91085C (fi) | 1994-05-10 |
| DE69214473D1 (de) | 1996-11-21 |
| FI910359A0 (fi) | 1991-01-24 |
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