RO135083A2 - Metodă rapidă de diagnostic microbiologic şi de determinare a sensibilităţii la antibiotice a bacililor gram-negativi uropatogeni cu ajutorul citometriei in flux - Google Patents
Metodă rapidă de diagnostic microbiologic şi de determinare a sensibilităţii la antibiotice a bacililor gram-negativi uropatogeni cu ajutorul citometriei in flux Download PDFInfo
- Publication number
- RO135083A2 RO135083A2 RO201900831A RO201900831A RO135083A2 RO 135083 A2 RO135083 A2 RO 135083A2 RO 201900831 A RO201900831 A RO 201900831A RO 201900831 A RO201900831 A RO 201900831A RO 135083 A2 RO135083 A2 RO 135083A2
- Authority
- RO
- Romania
- Prior art keywords
- antibiotic
- coli
- urine samples
- flow cytometry
- urine
- Prior art date
Links
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 title claims abstract description 32
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 30
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 title claims abstract description 15
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 title description 4
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 title description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims abstract description 45
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 claims abstract description 41
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 7
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims abstract description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 27
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 claims description 12
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 9
- 208000019206 urinary tract infection Diseases 0.000 claims description 9
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 6
- 230000006872 improvement Effects 0.000 claims description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 claims description 2
- MYSWGUAQZAJSOK-UHFFFAOYSA-N ciprofloxacin Chemical compound C12=CC(N3CCNCC3)=C(F)C=C2C(=O)C(C(=O)O)=CN1C1CC1 MYSWGUAQZAJSOK-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 26
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 abstract description 19
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 abstract description 19
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 abstract description 19
- NXFQHRVNIOXGAQ-YCRREMRBSA-N nitrofurantoin Chemical compound O1C([N+](=O)[O-])=CC=C1\C=N\N1C(=O)NC(=O)C1 NXFQHRVNIOXGAQ-YCRREMRBSA-N 0.000 abstract description 14
- 229960003405 ciprofloxacin Drugs 0.000 abstract description 13
- 229960000564 nitrofurantoin Drugs 0.000 abstract description 13
- 229960004755 ceftriaxone Drugs 0.000 abstract description 9
- VAAUVRVFOQPIGI-SPQHTLEESA-N ceftriaxone Chemical compound S([C@@H]1[C@@H](C(N1C=1C(O)=O)=O)NC(=O)\C(=N/OC)C=2N=C(N)SC=2)CC=1CSC1=NC(=O)C(=O)NN1C VAAUVRVFOQPIGI-SPQHTLEESA-N 0.000 abstract description 9
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 abstract description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 abstract description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 29
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 9
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 7
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 6
- WZRJTRPJURQBRM-UHFFFAOYSA-N 4-amino-n-(5-methyl-1,2-oxazol-3-yl)benzenesulfonamide;5-[(3,4,5-trimethoxyphenyl)methyl]pyrimidine-2,4-diamine Chemical compound O1C(C)=CC(NS(=O)(=O)C=2C=CC(N)=CC=2)=N1.COC1=C(OC)C(OC)=CC(CC=2C(=NC(N)=NC=2)N)=C1 WZRJTRPJURQBRM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000009635 antibiotic susceptibility testing Methods 0.000 description 5
- HQMRIBYCTLBDAK-UHFFFAOYSA-M bis(2-methylpropyl)alumanylium;chloride Chemical compound CC(C)C[Al](Cl)CC(C)C HQMRIBYCTLBDAK-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 5
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 4
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 4
- 229960005404 sulfamethoxazole Drugs 0.000 description 4
- 238000009535 clinical urine test Methods 0.000 description 3
- 229940047766 co-trimoxazole Drugs 0.000 description 3
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 3
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 3
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 241001360526 Escherichia coli ATCC 25922 Species 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 2
- 238000004163 cytometry Methods 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L disodium;(2',7'-dibromo-3',6'-dioxido-3-oxospiro[2-benzofuran-1,9'-xanthene]-4'-yl)mercury;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Na+].O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(Br)=C([O-])C([Hg])=C1OC1=C2C=C(Br)C([O-])=C1 BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 239000006916 nutrient agar Substances 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 2
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000007832 Na2SO4 Substances 0.000 description 1
- 241000233805 Phoenix Species 0.000 description 1
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LEHOTFFKMJEONL-UHFFFAOYSA-N Uric Acid Chemical compound N1C(=O)NC(=O)C2=C1NC(=O)N2 LEHOTFFKMJEONL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TVWHNULVHGKJHS-UHFFFAOYSA-N Uric acid Natural products N1C(=O)NC(=O)C2NC(=O)NC21 TVWHNULVHGKJHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002924 anti-infective effect Effects 0.000 description 1
- 239000012984 antibiotic solution Substances 0.000 description 1
- 239000004599 antimicrobial Substances 0.000 description 1
- 238000011203 antimicrobial therapy Methods 0.000 description 1
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000003385 bacteriostatic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000006806 disease prevention Effects 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009036 growth inhibition Effects 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000007430 reference method Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 229940116269 uric acid Drugs 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- 238000012070 whole genome sequencing analysis Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Invenţia se referă la o metodă de detectare a tulpinilor de Escherichia coli uropatogene şi a sensibilităţii acestora la antibiotice în matrici artificiale şi în probe clinice de urină. Metoda, conform invenţiei, constă în aplicarea analizei de citometrie în flux (CF) pe medii de cultură cu o compoziţie similară unei probe de urină tratate cu diferite antibiotice, incubate la 37°C, timp de 4 h şi apoi marcate cu iodură de propidiu, la o concentraţie finalp de 5 μg/ml, respectiv, probe de urină de la donatori sănătoşi contaminate artificial, tratate cu diferite antibiotice, marcate cu DiBAC4, la o concentraţie finală de 0,5 μg/ml şi incubate la întuneric, la 37°C, timp de 4 h, într-un timp de analiză a probelor de 2...6 h, cu valori ale sensibilităţii şi specificităţii metodei CF de 100% pentru nitrofurantoin, 91,6% şi 94,1% pentru ceftriaxon, 93,7 şi 100% pentru ciprofloxacin şi 85,7% şi 100% pentru trimetroprim-sulfametoxazol.
Description
DESCRIEREA BREVETULUI: METODĂ RAPIDĂ DE DIAGNOSTIC MICROBIOLOGIC ȘI DE DETERMINARE A SENSIBILITĂȚII LA ANTIBIOTICE A BACILILOR GRAM NEGATIVI UROPATOGENI CU AJUTORUL CITOMETRIEI ÎN FLUX.
Prezenta invenție se referă la elaborarea și optimizarea unei metode rapide bazate pe citometria în flux pentru detectarea tulpinilor de Escherichia coli uropatogene și a sensibilității acestora la antibiotice, în matrici biologice artificiale (urină artificială, urină infectată artificial) și în probe clinice de urină. O astfel de metodă ar putea fi pusă în aplicare cu ușurință în spitale, fiind deja utilizată pentru alte determinări în imunologie și hemotologie, conbtribuind semnificativ la îmbunătățirea terapiei antiinfecțioase empirice, și consecutiv, la reducerea ratelor de morbiditate și mortalitate asociate infecțiilor severe precum și la limitarea apariției și răspândirii fenomenului de rezistență la antibiotice.
Metoda citometriei în flux (CF) a fost introdusă în anul 1940, iar aplicațiile în microbiologic au fost dezvoltate în anii 1980, odată cu progresele tehnologice și s-au extins în deceniile următoare, ca urmare a îmbunătățirii rezoluției echipamentului (Benjamin și colab., 2017). Spre deosebire de alte tehnici care implică studiul populațiilor microbiene după cultivare, CF oferă posibilitatea de a analiza rapid și individual mai mulți parametri ai unei populații de microorganisme, reușind să detecteze și să cuantifice diferențele structurale și funcționale individuale ale celulelor unei populații bacteriene. Semnalele optice colectate (lumina împrăștiată și fluorescența) și analizate se corelează cu diferite caracteristici ale celulelor analizate, structurale (mărime, granularitate) și funcționale (conținutul în acizi nucleici, expresia de proteine intracelulare și de suprafață celulară, potențialul de membrană, activitate enzimatică, expresia de pompe de eflux, integritatea membranei).
Metodele standard de testare a sensibilității la antibiotice se bazează pe evaluarea inhibiției creșterii patogenului și includ metode manuale (metoda disc difuzimetrică, metoda microdiluțiilor în mediu lichid) și automate, precum Microscan Walkaway (Beckman Coulter), Phoenix Automated Microbiology System (BD) și Vitek 2 (bioMerieux). Diferite metode bazate pe tehnica PCR, tehnicile de microarray și whole-genome sequencing au fost dezvoltate pentru detectarea rezistenței la antibiotice, însă acuratețea acestora rămâne inferioară testelor fenotipice convenționale. Timpul de analiză al metodelor standard utilizate pentru determinarea spectrului de sensibilitate la antibiotice este în general cuprins între 24 și 48 de ore, și se bazează pe creșterea agentului patogen. Informații preliminare privind spectrul de sensibilitate la antibiotice, înaintea rezultatelor testelor 1 standard, pot contribui la îmbunătățirea primei și celei mai importante etape a diagnosticului microbiologic al infecțiilor.
Problema pe care invenția actuală o rezolvă este scurtarea timpului de prelucrare a probei biologice și furnizarea raportului preliminar de analiză, care va permite alegerea tratamentului de urgență, în aproximativ 5 ore de la primirea probei în laborator. Bolile infecțioase reprezintă o problemă majoră de sănătate publică la nivel mondial din cauza emergenței rapide a rezistenței la antibiotice, amplificată, în cazul infecțiilor microbiene, de formarea biofilmelor microbiene și de numărul foarte limitat de noii agenți antimicrobieni [Anderson, 2006; Boucher, 2009; Coastes, 2011; European Centre for Disease Prevention and Control (ECDC) 2005 - 2014],
Infecțiile tractului urinar (ITU) sunt printre cele mai frecvente infecții bacteriene, atât în sectorul clinic, cât și în comunitate (Flores-Mireles et al., 2015). Tratamentul de urgență al ITU cu antibiotice la care bacteriile uropatogene sunt deja rezistente crește semnificativ selecția și diseminarea bacteriilor rezistente la antibiotice. în plus, practicile de prescripție empirică contribuie la creșterea rezistenței la antibiotice de ultimă elecție a bacililor Gram-negativi, amenințând eficiența acestors în tratamentul infecțiilor severe. Prin urmare, a devenit esențial ca antibioticele să fie utilizate în mod judicios și specific în tratamentul UTI (Schmiemann et al., 2010).
Soluția pe care o propune prezenta invenție este îmbunătățirea acurateții terapiei antimicrobiene de urgență în cazul ITU și reducerea semnificativă a timpului de analiză (a probelor până la 2-6 ore), comparativ cu metodele convenționale, bazate pe cultivarea agentului patogen.
Avantajele invenției:
Φ analiza rapidă a numeroase celule bacteriene;
❖ detectarea simultană a mai multor parametri la nivel de celulă individuală, precum și posibilitatea corelării diferiților parametri analizați, ceea ce permite detectarea și diferențierea mai multor populații și subpopulații de celule în proba analizată;
❖ reducerea semnificativă a timpului de analiză a probelor de urină comparativ cu metodele convenționale;
❖ eficiență cost-beneficiu în comparație cu metodele fenotipice și genotipice disponibile pentru testarea sensibilității la antibiotic și screemng-u]/conf\rmarca mecanismelor de rezistență la antibiotice.
RO 135083 Α2
Se prezintă în continuare 6 exemple ale invenției în legătură cu figurile:
Fig. 1. Curba de creștere pentru identificarea timpului minim de incubare - reprezentarea grafică a densității optice care indică timpul minim de incubare pentru a obține creștere bacteriană și varianta experimentală optima selectată.
Fig. 2. Schema de lucru pentru prepararea probelor cu scopul de a valida protocolul de detectare a viabilității tulpinilor analizate.
Fig. 3. Cuantificarea valorilor MFI obținute prin 3 experimente independente folosind 30 tulpini de E.coli 1-30, expuse tratamentului cu ciprofloxacin.
Fig. 4. Reprezentarea grafică a raportului dintre intensitatea fluorescenței celulelor tratate cu nitrofurantoin (150 pg/ml), ceftriaxonă (4 pg/ml), ciprofloxacin (4 pg/ml), trimetroprimsulfametoxazol (100 pg/ml) și celulele netratate cu antibiotic- Stain index (SI).
Fig. 5. Distribuția fluorescenței pentru tulpinile de E.coli 2559 și E. coli 3616 tratate cu antibiotice la diferite concentrații. Conturul negru indică controlul pozitiv (tulpina netratată cu antibiotic), iar conturul albastru indică populația bacteriană expusă la antibiotic.
Fig. 6. Reprezentarea grafică a procentului parametrilor de performanță obținuți pentru analiza prin CF a probelor de urină.
Se prezintă în continuare câteva exemple care descriu metoda propusă și eficența acesteia pentru detectarea tulpinilor de E. coli uropatogene în urină artificială, urină provenită de la donatori sănătoși contaminată artificial și în probe clinice de urină.
EXEMPLUL NR. 1 PROCEDEU PENTRU DETECTAREA ȘI DETERMINAREA SENSIBILITĂȚII LA ANTIBIOTICE A TULPINILOR DE ESCHERICHIA COLI UROPATOGENE ÎN URINĂ ARTIFICIALĂ PRIN CITOMETRIE ÎN FLUX
Pentru optimizarea protocolului de detectare a microorganismelor si de testare a sensibilității la antibiotice, a fost elaborat un mediu de cultură cu o compoziție similară unei probe de urină, denumit în continuare urină artificială (AUM) (Tabelul 1).
Tabelul 1 .Compoziția și caractersticile fizico-chimice ale mediului AUM utilizat.
| Parametri/ Compoziție | Concentrația componentelor | Unitate de măsură |
| pH | 6.2 | |
| Densitate | 1.008 | șj cm3 |
| Osmolaritate | 446 | (mOsm/kg) |
| Uree | 200 | (mM) |
| Acid uric | 1 | (Mm) |
| NajCâHsO? | 5 | (mM) |
| NaCl | 54 | (mM) |
| KC1 | 30 | (mM) |
| NH4C1 | 15 | (mM) |
| CaCl2 | 3 | (mM) |
| MgSO4 | 2 | (mM) |
| NaHCO3 | 2 | (mM) |
| Na2C2O4 | 0.1. | (mM) |
| Na2SO4 | 9 | (mM) |
| NaH2PO4 | 3.6 | (mM) |
| Na2HPO4 | 0.4 | (mM) |
Pentru detectarea viabilității tulpinilor cu ajutorul CF, s-au selectat inițial fluorocromii care pot indica diferențe privind integritatea membranei celulare sau potențialul membranar. Pentru evaluarea integrității membranare a fost utilizată iodura de propidiu (PI), care poate pătrunde numai în celulele cu membrană citoplasmatică permeabilizată, în timp ce potențialul membranar a fost evaluat prin utilizarea DiBAC4(3) sau bis-oxonol (BOX), o moleculă hidrofobă, încărcată negativ (Miiller și Nebe, 2010). Controlul de celule viabile a fost reprezentat de o suspensia bacteriană de E. coli ATCC 25922 preparată în AUM dintr-o cultură solidă de 18-24 de ore obținută pe agar nutritiv cu o densitate de 1,5 X 108 UFC/ml corespunzătoare standardului nephelometric 0,5 McFarland. Controlul de celule moarte a fost obținut prin inactivarea termică la 100°C timp de 30 minute a unei suspensii bacteriene de E. coli ATCC25922 preparată la fel ca mai sus.
Citirea probelor s-a realizat cu ajutorul unui citometru Accuri C6 plus (Becton Dickinson, Biosciences) în canalul de fluorescență pentru FL3 (filtre 620/30 nm). Pentru analiza populației bacteriene, au fost achiziționate 10000 de evenimente în poarta specifică populației bacteriene. Achiziția și analiza datelor au fost efectuate cu software-u\ BD Accuri C6 plus și FlowJo (Fig. 1).
Pentru testarea sensibilității la antibiotice cu ajutorul CF în AUM, suspensiile bacteriene preparate din culturi proaspete de 29 de tulpini de E. coli uropatogene au fost inoculate în AUM: LM (mediu Luria Broth) (7:5) pentru a obține densitatea celulară finală de 105 CFU/ml, valoare prag de pozitivitate pentru o probă de urină contaminată, respectiv pentru diagnosticul de infecție urinară. Următoarele antibiotice (discuri) au fost adăugate ciprofloxacin (5 pg), cotrimoxazol (25 pg) și nitrofurantoin (50 pg) (Oxoid), într-un volum final de 1 ml. După 4 ore de incubare, probele au fost centrifugate la 7000 rpm timp de 3 minute și resuspendate în 500 pl de soluție sterilă de tampon fosfat salin (PBS). Pentru controlul metodei a fost folosită tulpina de E. coli ATCC 21925, sensibilă la cele 3 antibiotice testate. Tulpina bacteriană sensibilă și izolatele clinice au fost prelucrate urmând protocolul descris mai sus, în același timp. Pentru fiecare test s-au folosit controale de celule viabile și celule inactivate termic de E. coli ATCC 21925, incubate cu și fără antibiotic. Analiza medianei de fluorescență (MFI) s-a realizat după marcarea cu PI a probelor și a martorilor (concentrație finală de 1 pg/ml PI), după 10 minute de incubare la temperatura camerei, în întuneric (Fig. 2). Pentru validarea rezultatelor s-au efectuat trei experimente independente pentru antibioticul ciprofloxacin, iar valorile MFI pentru toate cele 3 experimente au fost calculate cu deviație standard și au arătat că nu există o diferență semnificativ statistică între cele ele. în fig. 3 sunt prezentate rezultatele pentru cedle 30 de tulpini bacteriene tratate cu ciprofloxacin. Calculul scorului Z pentru fiecare tulpină testată a arătat valori cuprinse între +2 σ: - 2 σ. Acest lucru confirmă faptul că valorile observate se situează în intervalul -2σ și + 2σ față de medie, în proporție de 95%. Rezultatele obținute au fost comparate cu cele obținute prin analiza Vitek®2 (bioMerieux) și disc difuzimetrică a tulpinilor testate.
EXEMPLU NR. 2. PROCEDEU DE CITOMETRIE ÎN FLUX PENTRU TESTAREA SENSIBILITĂȚII LA ANTIBIOTICE A TULPINILOR DE E. COLI UROPATOGENE ÎN PROBE DE URINĂ DE LA DONATORI SĂNĂTOȘI CONTAMINATE ARTIFICIAL
Pentru testarea sensibilității la antibiotic în probe de urină contaminate artificial s-au utilizat suspensii bacteriene preparate din culturi de 18-24 de ore dezvoltate pe mediu solid (agar nutritiv), care au fost inoculate în probele de urină naturală la o densitate celulară finală de 105UFC/ml, în prezența a diferite concentrații de antibiotice solubilizate în prealabil în mediu LB (Tabelul 2).
Tabelul 2. Concentrațiile de antibiotice selectate pentru testele de determinare a sensibilității la antibiotice prin metoda CF a unor tulpini bacteriene în probe de urină contaminate artificial.
| Antibiotic | Abreviere | Concentrație 1 | Concentrație 2 | Concentrație 3 |
| Nitrofurantoin | F | 150 pg/ml | 75 pg/ml | 18 pg/ml |
| Ceftriaxonă | CRO | 4 pg/ml | 2 pg/ml | 1 pg/ml |
| Cotrimoxazol | SXT | 100 pg/ml | 50 pg/ml | 25 pg/ml |
| Ciprofloxacin | CIP | 4 pg/ml | 2 pg/ml | 1 pg/ml |
Controlul negativ de fluorescență care corespunde populației bacteriene nefluorescente a fost reprezentat de suspensia bacteriană preparată în proba de urină și colorată cu fluorocromul DiBAC4(3). Colorantul nu pătrunde în celulele viabile, cu potențial membranar neafectat. Au fost de asemnenea preparate controale negative reprezentate de medii de cultură neinoculate, respectiv 100 μΐ urină, respectiv 100 μΐ LB.
Probele de urină inoculate cu diferite tulpini bacteriene uropatogene au fost incubate la întuneric la 37 °C timp de 4 ore și apoi evaluate spectrofotometric la 620 nm. Cea mai scăzută concentrație de antibiotic care a inhibat complet creșterea microbiană confirmată prin citirea spectrofotometrică a fost înregistrată ca valoarea concentrației minime inhibitorii (CMI).
După marcare cu DiBAC4(3), la o concentrație finală de 0,5 pg/ml, timp de 30 de minute la 37 °C, la întuneric, atât probele de urină inoculate cu diferite tulpini bacteriene uropatogene, cât și controalele pregătite au fost analizate prin CF (BD Accuri C6 Plus) pentru stabilirea valorilor CMI pentru fiecare antibiotic selectat. Analiza citometrică a evaluat fluorescență verde în canalul de fluorescență FITC (filtre 530/30 nm). Pentru analiza populației bacteriene, au fost achiziționate un total de 10000 de evenimente în poarta corespunzătoare populației bacteriene. Pentru fiecare tulpină au fost analizate, de asemenea, celulele netratate cu antibiotic și necolorate pentru a evalua autofluorescența celulelor native și pentru a defini setările de achiziție. Achiziția și analiza datelor au fost efectuate cu software-ul BD Accuri C6 plus și FlowJo.
Analiza acestor rezultate ne-a permis să stabilim că pentru procente mai mari de 20% de celule depolarizate, tulpinile au fost evaluate ca sensibile, în timp ce pentru procente mai mici de 20% celule depolarizate, au fost evaluate ca rezistente.
Rezultatele obținute prin CF pot fi reprezentate fie sub forma procentului de celule depolarizate, fie sub forma unui indice de marcare denumit stain index (SI) (Fig. 4), ce a fost calculat pentru fiecare concentrație de antibiotic în parte, și a fost definit ca raportul dintre valorile medianei de fluorescență a celulelor bacteriene tratate cu antibiotic și a celulelor netratate. S-a constatat că o valoare a SI mai mare de 2 este asociată tulpinilor sensibile, iar o valoare mai mică de 2 este asociată tulpinilor rezistente.
Analiza comparativă a rezultatelor de CF și a ceior obținute prin metodele standard (antibiogramă) a relevat un număr redus de discrepanțe majore, pentru ceftriaxonă, trimetroprimsulfametoxazol și ciprofloxacin (Tabelul 3). Valorile sensibilității și specificității metodei CF aplicată probelor de urină de la donatori sănătoși artificial contaminate cu tulpini de E. coli uropatogene au fost de 100%/l 00% pentru nitrofurantoin, de 85,7%/95.6% pentru trimetroprimsulfametoxazol, de 91,6%/94,1 % pentru ceftriaxonă și de 93,7%/ 100% pentru ciprofloxacin.
Sensibilitatea și specificitatea au fost calculate după formulele din Tabelul 3, unde (a=tulpini rezistente, rezultate pozitive; b=rezultate fals-positive; c=rezultate fals-negative; d=4ulpini sensibile, rezultate negative).
Tabelul 3: Compararea rezultatelor obținute prin citometrie în flux cu cele obținute prin metodele standard de determinare a sensibilității la antibiotice
| Tulpini | NstrnfBranîojis | Trimetoprins· ssîifafiîeinxazsd | Ceftriaxonă | CiproRoxActn | ||||
| FC | Standard | FC | Standard | FC S | Standard S | FC R | Standard R | |
| E.coli 428 | S | S | S | S | ||||
| E. colii 27 | s | S | s | S | ||||
| E.coli 956 | s | s | R | R | R | R | R | R |
| E.coli 4493 | s | s | S | S | R | R | R | R |
| E.coli 451 | s | s | s | S | R | R | R | R |
| E.coli 424 | s | s | s | s. | R | R | R | R |
| E.coli 547 | s | s | IHHHU | S | S | S | s | |
| E.coli 491 | s | s | R | R | R | s | s | s |
| E.coli 3894 | s | s | S | s | S | s | s | s |
| E.coli 3830 | s | s | R | R | R | R | R | R |
| E.coli 213 | s | s | R | R | S | S | R | R |
| E.coli 3812 | s | s | R | R | S | s | R | R |
| E.coli 220 | s | s | S | s | s | s | R | R |
| E.coli 253 | s | s | S | S | s | s | R | R |
| E.coli 214 | s | s | S | s | s | s | s | s |
| E.coli 8426 | s | s | S | s | s | s | s | S |
| E.coli 130 | s | s | s | S | s | s | s | S |
| E.coli 429 | s | s | s | s | s | s | s | S |
| E.coli 3865 | s | s | s | s | R | R | R | R |
| E.coli 27 | s | s | s | s | R | R | R | R |
| E.coli 102 | s | s | R | R | R | R | R | R |
| E.coli 2448 | s | s | s | s | R | R | S | S |
| E.coli 3906 | s | s | s | s | S | s | S | S |
| E.coli 2498 | s | s | s | s | R | R | R | R |
| E.coli 2416 | s | s | s | S | s | s | s | S |
| E.coli 218 | s | s | s R | s s | R | R | R | R |
| E.coli 2432 | s | s | s | S | s | S | ||
| E.coli 439 | s | s | s | s | s | S | s | s |
| E.coli 2415 | s | s | s | s | s | s | s | s |
| Sensibilitate a/(a+c) | 100% | 85,7% | 91,6% | 93,7% | ||||
| Specificitate d/(b+d) | 100% | 95,6% | 94,1% | 100% | ||||
| 0% | 4,5% | 5,8% | 0% | |||||
| i | 0% | 14,2% | 83% | 6,25% |
EXEMPLUL NR. 3. VALIDAREA METODEI DE DETECȚIE ȘI TESTARE A SENSIBILITĂȚII LA ANTIBIOTICE PRIN CITOMETRIE În’ FLUX, DIRECT DIN PROBE DE URINĂ CU SEMNIFICAȚIE PATOLOGICĂ
Pentru a valida metoda bazată pe citometria în flux, au fost analizate un total de 117 de probe clinice de urină, prelucrate simultan și prin metodele convenționale de microbiologic clasică, respectiv urocultura și realizarea antibiogramei.
Probelor de urină au fost însămânțate pe mediu geloză-sânge și mediu lactozat (Drigalski sau MacConkey) și incubate timp de 24 ore la 37°C. în cazul uroculturilor pozitive s-au izolat tulpinile de interes și s-a realizat antibiograma pentru cele 4 antibiotice testate.
în 4 tuburi Eppendorf a fost adăugat un volum de 50 μΐ din fiecare probă de urină supusă examenului microbiologic, peste care s-au adăugat 50 μΐ soluție de antibiotic de diferite concentrații (nitrofurantoin 150 pg/ml, ceftrîaxonă 4 μg/ml, ciprofloxacin 4 gg/ml, cotrimoxazol 100 pg/ml), utilizând ca martori, probe de urină necontaminată, respectiv urină: mediu LB 1:1. Toate probele au fost marcate cu 1 μΐ DiBAC(4)3 ( 0,5 pg/ml), urmată de incubare timp de 4 ore, la întuneric, la 37°C; Citirea probelor s-a realizat cu ajutorul unui citometru Accuri C6 plus (Becton Dickinson, Biosciences) în canalul de fluorescență pentru F1TC (filtre 530/30 nm). Pentru analiza populației bacteriene, au fost achiziționate 10000 de evenimente în poarta specifică populației bacteriene. Achiziția și analiza datelor au fost efectuate cu software-xA BD Accuri C6 plus și FlowJo.
Analiza diagramelor în puncte și histogramelor pe poarta specifică populației bacteriene, a evidențiat faptul că un total de 77 de probe de urină (65,8%) au fost negative (nu s-a detectat populație bacteriană) și 40 pozitive (34,18%) (s-a detectat o populație bacteriană viabilă). Procentul mare de probe negative rezultat în urma cultivării pe medii de cultură demonstrează utilitatea 8 tehnicii CF ca metodă eficientă și rapidă de screening al probelor de urină înainte de cultivarea acestora.
Rezultatele citometrice pot fi reprezentate sub forma histogramelor din care se poate observa dacă se suprapune sau nu peste controlul de celule netratate cu antibiotic (celule viabile). Astfel histogramele probelor de urină pozitive cu tulpinile E.coli 2559 și E.coli 3616 expuse la antibiotic sunt reprezentate în Fig. 5. Citirea s-a realizat pe canalul de fluorescență F1TC-H, histogramele indicând după 4 ore, o fluorescență mărită în cazul tulpinilor sensibile la antibiotic ca urmare a pătrunderii fluorocromului DiBAC(4)3. Tulpina E.coli 2559 a înregistrat 2 rezultate fals-pozitive pentru nitrofurantoin (150 pg/ml) și trimetroprim-sulfametoxazol (100 pg/ml) acestea prezentând o fluorescență scăzută, asemănătoare cu controlul de celule viabile netratate cu antibiotic. Prin metoda standard aceasta tulpină a fost evaluată ca sensibilă la cele 2 antibiotice, pe când prin CF a fost clasificată ca rezistentă. Rezultatul obținut poate fi consecința unui timp scurt de incubare în prezența antibioticului (4 ore comparativ cu 24 de ore). în ceea ce privește ceftriaxona și ciprofloxacinul, date obținute prin citometrie au coincis cu cele din antibiogramă.
Tulpina de E.coli 3616 a prezentat un nivel ridicat al fluorescenței pentru toate antibioticele testate, aceasta fiind evaluată ca sensibilă și prin metoda sandard. Deși pentru nitrofurantoin și trimetroprim-sulfametoxazol se observă un procent al celulelor depolarizate scăzut (26,2%, respectiv 33,6%) comparativ cu cefriaxona (77,4%) și ciprofloxacinul (65%), tulpina a fost totuși considerată sensibilă, intensitatea fluorescenței depășind pragul de 20% celule depolarizate. Probabil, antibioticele nitrofurantoin si trimetroprim-sulfametoxazol necesită un timp mai îndelungat de incubare pentru a distruge celulele bacteriene, antibiograma oferind rezultatele corecte în 24 ore.
EXEMPLUL 4. CALCULAREA PARAMETRILOR DE PERFORMANȚĂ AI CITOMETRIEI ÎN FLUX PENTRU ANALIZA PROBELOR DE URINĂ
Analiza comparativă a rezultatelor protocolului de testare a sensibilității la antibiotice bazat pe citometrie în flux direct în probe de urină cu rezultatele metodei de referință, bazate pe cultivare, a relevat valori diferite ale parametrilor de performanță deoarece s-a înregistrat un număr relativ crescut de rezultate fals-pozitive și fals-negative în special pentru nitrofurantoin și trimetroprin-sulfametoxazol. Rezultatele pentru nitrofurantoin în cazul contaminării artificiale a probei de urină provenită de la voluntari sănătoși, au fost 100% sensibilitate și specificitate,
RO 135083 Α2 neînregistrându-se niciun rezultat fals-pozitiv. în cazul unei infecții urinare, proba de urină prezintă un pH diferit, fiind mai alcalin, dar și numeroase cristale și diferite celule (leucocite, hematii, etc) comparativ cu o proba de urină provenită de la voluntari sănătoși, deci cauza posibilă pentru rezultatele false, poate fi explicată fie de faptul că nitrofurantoinul este un antibiotic bacteriostatic și necesită un tratament mai îndelungat pentru a elimina infecția, fie de reacția lui cu pH-ul urinei care este alcalin în cazul unei infecții urinare. Valorile specificității și sensibilității metodei în funcție de antibioticul testat au fost 90,1% / 62% pentru nitrofurantoin, 84,2% / 57,1% pentru trimetroprimsulfametoxazol, de 75% / 92,8% pentru ceftriaxonă și 94,1% / 78,2% pentru ciprofloxacin (Fig. 6).
Claims (4)
- REVENDICARE1. Protocol de citometrie în flux care să permită discriminare rapidă a probelor de urină pozitive microbiologic, precum și determinarea profilului de sensibilitate la antibioticele utilizate în schemele de terapie de urgență a infecțiilor de tract urinar, facilitând îmbunătățirea tratamentului empiric cu antibiotice.
- 2. Protocolul rapid propus în această cerere de brevet scurtează timpul de procesare a probelor de urină cu 24-48 ore în cazurile de infecție monomicrobiană, comparativ cu metodele clasice de identificare și de testare a sensibilității la antibiotice, facilitând instituirea unui tratament empiric adecvat.
- 3. Procedeul poate oferi informații precise si rapide pentru probele de urină negative, înainte de cultivarea acestora, crescând astfel eficacitatea laboratorului clinic de rutină din punct de vedere economic, prin reducerea costurilor medilor de cultură.
- 4. Protocolul de citometrie în flux propus în acest brevet reprezintă o abordare convenabilă, rapidă și fiabilă (sensibilitate și specificitate de 100%) pentru detectarea rapidă a populației bacteriene și pentru testarea sensibilității la antibiotice a tulpinilor de E.coli direct în probele de urină.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RO201900831A RO135083A2 (ro) | 2019-12-02 | 2019-12-02 | Metodă rapidă de diagnostic microbiologic şi de determinare a sensibilităţii la antibiotice a bacililor gram-negativi uropatogeni cu ajutorul citometriei in flux |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RO201900831A RO135083A2 (ro) | 2019-12-02 | 2019-12-02 | Metodă rapidă de diagnostic microbiologic şi de determinare a sensibilităţii la antibiotice a bacililor gram-negativi uropatogeni cu ajutorul citometriei in flux |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RO135083A2 true RO135083A2 (ro) | 2021-06-30 |
Family
ID=76527568
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RO201900831A RO135083A2 (ro) | 2019-12-02 | 2019-12-02 | Metodă rapidă de diagnostic microbiologic şi de determinare a sensibilităţii la antibiotice a bacililor gram-negativi uropatogeni cu ajutorul citometriei in flux |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RO (1) | RO135083A2 (ro) |
-
2019
- 2019-12-02 RO RO201900831A patent/RO135083A2/ro unknown
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0149165B1 (en) | Method for rapid detection of microorganisms in clinical samples | |
| Jepras et al. | Development of a robust flow cytometric assay for determining numbers of viable bacteria | |
| Brussaard et al. | Flow cytometric analysis of phytoplankton viability following viral infection | |
| EP2821499B1 (en) | Method for the rapid determination of susceptibility or resistance of bacteria to antibiotics | |
| Buysschaert et al. | Reevaluating multicolor flow cytometry to assess microbial viability | |
| EP2893344B1 (en) | Same-day blood culture with digital microscopy | |
| Holm et al. | A flow cytometric technique for quantification and differentiation of bacteria in bulk tank milk | |
| US12241113B2 (en) | Method for determining the concentration of intact microorganisms in a sample | |
| US20020098531A1 (en) | Rapid methods for microbial typing and enumeration | |
| US20130130290A1 (en) | Distinguishing cells in a sample by inactivating extracellular enzyme before releasing intracellular enzyme | |
| US6803208B2 (en) | Automated epifluorescence microscopy for detection of bacterial contamination in platelets | |
| CN111684074A (zh) | 用于确定微生物浓度的方法 | |
| Fallon et al. | A comparison of the performance of cystine lactose electrolyte deficient (CLED) agar with Oxoid chromogenic urinary tract infection (CUTI) medium for the isolation and presumptive identification of organisms from urine | |
| JP2022002547A (ja) | インフルエンザ菌のスクリーニング方法およびスクリーニング用培地 | |
| Dalet et al. | Evaluation of a new agar in Uricult-Trio for rapid detection of Escherichia coli in urine | |
| Rotman et al. | Application of a real-time biosensor to detect bacteria in platelet concentrates | |
| RO135083A2 (ro) | Metodă rapidă de diagnostic microbiologic şi de determinare a sensibilităţii la antibiotice a bacililor gram-negativi uropatogeni cu ajutorul citometriei in flux | |
| JP5647114B2 (ja) | 胞子発芽を抑制または遅延する化合物を含む培養培地 | |
| EP0286434A2 (en) | Method for the detection of bacteria and fungi | |
| Biji et al. | A study on evaluation of different culture media for the isolation of routine urinary pathogens | |
| JP4510222B2 (ja) | 細菌の鑑別方法 | |
| Pfaller et al. | Improved urine screening using a combination of leukocyte esterase and the Lumac system | |
| Blondeau et al. | Evaluation of the Cult-Dip Plus dip slide method for urinary tract infection. | |
| Rippin et al. | Clinical evaluation of the slide centrifuge (cytospin) Gram’s stained smear for the detection of bacteriuria and comparison with the FiltraCheck-UTI and UTIscreen | |
| Bhat et al. | Comparison of Use of Concentrated Saliva with Serial Dilution Method in Determination of Candida Colonies in Oral Samples |