FR2855529A1 - Procede pour mesurer des profils de reactivite d'echantillons par leur action sur des melanges de composes chimiques, et leur utilisation - Google Patents

Abstract

L'invention a pour objet un procédé pour générer un profil de réactivité d'un échantillon, caractérisé en ce qu'on met l'échantillon en contact avec un ou plusieurs mélanges d'au moins trois substrats chacun, on quantifie dans chaque mélange la disparition des substrats et/ou la formation de produits à partir de ces substrats au cours du temps par une analyse séparatrice, et on combine les vitesses de réactions ou les taux de conversion de chaque substrat ainsi obtenus.

Description

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PROCEDE POUR MESURER DES PROFILS DE REACTIVITE D'ECHANTILLONS PAR LEUR ACTION SUR DES MELANGES DE COMPOSES CHIMIQUES, ET LEUR UTILISATION.

1. Domaine de la technique
La présente invention concerne un procédé permettant de générer le profil de réactivité d'un échantillon en mesurant son activité catalytique sur un ou plusieurs mélanges d'une pluralité de composés chimiques ainsi que l'utilisation de ces profils.

2. Etat de la technique 2. 1. Les enzymes
Les enzymes sont des protéines possédant des activités catalytiques pour des transformations chimiques spécifiques. Ces catalyseurs sont classés suivant leur source et les réactions qu'ils catalysent. Des enzymes ou mélanges d'enzymes sont utilisés dans l'industrie agro-alimentaire (additifs alimentaires, transformation de la bière, fabrication de fromages), l'industrie des détergents (additifs pour lessives), et dans le domaine de la chimie fine, ainsi que dans le domaine médical (agent thérapeutique et diagnostiques).

2. 2. Titration d'enzyme
Afin de controler les procédés industriels, il est nécessaire de posséder une procédure analytique permettant de contrôler la qualité des enzymes utilisées. Ces controles sont réalisés par une méthode de titration permettant la détection et dans certains cas la quantification de l'enzyme dans un échantillon donné.

Il est possible de déterminer la présence d'une enzyme par une méthode indirecte basée sur la détection du gène codant cette même enzyme. A l'aide de la PCR et d'initiateurs

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spécifiques de l'enzyme ou du type d'enzyme recherchée, le signal correspondant est amplifié afin d'assurer la détection. Toutefois cette technique ne permet pas de détecter l'activité catalytique d'un échantillon. Une seconde limitation de cette méthode provient du fait que l'échantillon à contrôler doit posséder l'information génétique liée à l'enzyme.

La détection d'une enzyme peut aussi être réalisée par identification directe de la protéine par une technique de séparation comme par exemple un gel d'éléctrophorèse (1D ou 2D), associée à une visualisation par coloration de la protéine qui peut être non-spécifique (par exemple le nitrate d'argent) ou spécifique (par exemple un inhibiteur covalent marqué ou un substrat chromogène de l'enzyme recherchée). Cette méthode permet d'identifier l'enzyme recherchée mais elle n'est que difficilement quantifiable.

La méthode de titration la plus utilisée pour déterminer l'activité catalytique d'une enzyme dans un échantillon consiste en l'utilisation d'un substrat test spécifique de l'enzyme ainsi qu'une technique permettant la détection et la quantification de la réaction entre ce substrat et l'enzyme. Cette technique de détection peut être de type pH-métrique, calorimétrique ou spéctrométrique par exemple. Cette méthode est directe et permet de caractériser un échantillon par ses propriétés catalytiques de manière quantitative. Par contre elle ne permet pas de différencier deux enzymes proches possédant une activité sur le même substrat test. Afin d'augmenter la différenciation entre des échantillons possédant une activité catalytique proche, on peut combiner des mesures d'activités d'une même enzyme sur plusieurs substrats différents. Une des manières de réaliser ces mesures en parallèle consiste à fixer des substrats à la surface de supports solides comme du verre par exemple pour former des "chips". Un exemple fait intervenir des péptides fluorogéniques (J. Am. Chem. Soc.; 2002 ; 124(50); 14868-14870) afin de tester la spécificité de protéases. Ce test est basé sur

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la libération de fluorescence dans les cas où le catalyseur réagit avec un des péptides proposés. Il existe d'autre exemples faisant intervenir des mesures d'activité en parallèle suivant un format de plaques de micro-titration (demande de brevet PTC n : FR 02/03827, Chem. Eur. J. 2002,8, 14, 3221-3228). Une méthode similaire basée sur des réactifs chromogéniques permet d'identifier des micro-organismes (FR 2341865, J. Clin . Pathol.

1977,30,275-277, J. Microbiol. Methods 1992,16, 101-118).

Toutes ces méthodes reposent sur la mise en contact d'un échantillon avec plusieurs substrats séparés les uns des autres ce qui nécessite une mise en oeuvre complexe (microplaque ou "chips") et la réalisation de plusieurs mesures individuelles.

La détermination du profil nécessite de combiner le résultat de toutes ces mesures individuelles. Ces procédés ont une précision et une reproductibilité limitée par les fluctuations statistiques des conditions expérimentales (concentration de l'enzyme et des substrats, température, ...) entre les différentes mesures faites séparément avec chaque substrat. Ils sont également difficiles à mettre en oeuvre car il nécessitent une instrumentation spécifique.

3. Descprition de la technique
La présente invention a pour but de palier les limitations des techniques de l'art antérieur par une méthode pour mesurer des profils de réactivité de manière simplifiée. Un grand nombre de mesures en parallèle est remplacé par un petit de nombre de mesures d'activité sur des mélanges d'une pluralité de substrats.

Cette approche apporte une grande simplification expérimentale car elle ne nécessite qu'un petit nombre de mesures. Les profils de réactivité déterminé à l'aide de mélanges de substrats sont très précis et reproductibles.

L'invention a donc pour objet un procédé pour générer un profil de réactivité d'un échantillon, caractérisé en ce qu'on met l'échantillon en contact avec un ou plusieurs mélanges d'au

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moins trois substrats chacun, on quantifie dans chaque mélange la disparition des substrats et/ou la formation de produits à partir de ces substrats au cours du temps par une analyse séparatrice, et on combine les vitesses de réactions ou les taux de conversion ainsi obtenus.

Le procédé de l'invention possède une grande flexibilité du fait qu'il est basé sur l'utilisation de mélanges d'une pluralité de substrats dont la composition peut être modifiée selon le type d'activité à analyser.

Par analyse séparatrice, on entend une méthode analytique capable de séparer les composantes du mélange, c'est-à-dire les substrats et les produits formés en contact avec l'échantillon, et de les quantifier. L'analyse séparatrice doit permettre de séparer le mélange en plusieurs groupes distincts correspondant chacun à un ou plusieurs substrats ou produits et quantifiables séparément.

Ces méthodes de séparation peuvent être avantageusement l'HPLC (chromatographie liquide haute pression), la CCM (chromatographie sur couche mince) ou la GC (gas chromatography ou chromatographie en phase vapeur). La détection quantitative des substrats et produits après la séparation peut être effectuée en utilisant les méthodes bien connues pour les analyses chromatographiques, telle que la spectrométrie de fluorescence, la spectrométrie UV-Vis, la réfractométrie, la diffraction de lumière (détecteur par dispersion de lumière en phase gazeuse), l'ionisation de flamme, la spectrométrie infrarouge, la spectrométrie par résonnance magnétique nucléaire ou le dichroïsme circulaire. La quantification de chaque substrat ou produit du mélange peut être réalisée en se référant à une calibration ou à une référence interne. La détection quantitative produit une valeur chiffrée pour chaque substrat, produit, ou groupe de substrats ou produits détecté par l'analyse séparatrice. La valeur chiffrée correspond par exemle à la surface ou à la hauteur du signal correspondant.

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La détection peut être réalisée de manière indirecte en utilisant des techniques de dérivatisation. Ces techniques consistent à fixer, en serie de la séparation, un groupement fluorescent ou chemiluminescent sur le composé à détecter afin d'augmenter la sensibilité de la détection.

Dans les meilleures conditions, l'analyse séparatrice utilisée dans le procédé de l'invention permet une séparation de tous les composants du milieu réactionnel. Dans le cadre d'applications particulières, cette condition n'est pas nécessaire pour permettre la création d'un profil de réactivité et l'homme du métier sera capable de fixer les conditions de séparation suffisantes afin de générer un profil de réactivité.

Par exemple dans le cas de l'exemple 1 ci-dessous, un profil de réactivité est réalisé par séparation du mélange en vingt groupes correspondant chacun à une paire d'énantiomères. Il n'est pas nécessaire de connaître la structure exacte de tous les substrats et produits formés lors de l'analyse pour réaliser un profil. Dans une application particulière de l'invention, le procédé fait intervenir des substrats pouvant générer plusieurs produits (exemple 3). Dans ce cas, seul les structures des substrats de départ sont connues.

La présente invention concerne tout particulièrement les échantillons possédant une activité catalytique, par exemple des extraits d'organismes animaux, végétaux ou bactériens. Ils peuvent contenir une ou plusieurs enzymes, par exemple des glycosidases, lipases, estérases, époxyde hydrolases, nitrile hydratases, alcool déshydrogénases ou monoxygénases. Ces échantillons peuvent contenir une ou plusieurs enzymes à différents degrés de pureté. Les échantillons possédant une activité catalytique peuvent également provenir de prélèvements effectués dans le cadre d'une analyse médicale, d'un contrôle de qualité d'un aliment ou d'un bien de consommation, ou du suivi d'un procédé industriel.

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On entend par mélange de substrats un ensemble comportant au minimum trois composés chimiques capables chacun de réagir pour former de nouveaux composés différents. Les concentrations relatives ou absolues de chaque substrat dans le mélange peuvent être connues ou inconnues.

L'invention fait intervenir des substrats possédant des structures différentes leur conférant une réactivité particulière. Ces différences peuvent être tout particulièrement d'ordre stérique, fonctionnel, et stéréochimique.

On entend par profil de réactivité d'un échantillon un ensemble de valeurs chiffrées correspondant aux vitesses de réaction ou aux taux de conversion des substrats pendant ou après la mise en contact avec l'échantillon dans des conditions déterminées. Ce profil dépend de la structure chimique des substrats et des interactions spécifiques de chacun des substrats avec l'échantillon, des conditions de réactions utilisées lors de la mesure, des concentrations d'espèces actives dans l'échantillon, et de la concentration de chaque substrat.

Le profil de réactivité obtenu par la présente invention peut provenir de la combinaison de plusieurs mesures indépendantes réalisées avec un ou plusieurs mélanges de substrats.

Le profil de réactivité est avantageusement représenté sous forme graphique. Dans un cas particulier, le profil de réactivité est représenté par un tableau dont chaque position correspond à l'un des substrats. Ces positions contiennent soit la valeur chiffrée correspondant à la réactivité observée pour le substrat, soit une représentation graphique de cette valeur chiffrée, par exemple une échelle de gris d'intensité proportionelle à la valeur chiffrée.

Dans un cas particulier de l'invention, on peut représenter le profil de réactivité par un tableau dont chaque position

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représente les réactivités obtenues pour deux ou trois substrats différents sous forme d'une couleur. Cette couleur est composée en assignant l'intensité de chaque couleur fondamentale la composant en fonction des réactivité observées sur les deux ou trois substrats (Demande de brevet n CH-1046/02).

A la suite d'une mise en oeuvre de l'invention, les profils de réactivité peuvent être utilisés pour classifier des échantillons suivant leur profil de réactivité (exemple 7). Cette classification peut être effectuée par analyse statistique, par exemple en utilisant une analyse de clustering .

A la suite d'une mise en oeuvre de l'invention , le profil de réactivité d'un échantillon authentique peut servir de référence dans le cadre de contrôle de qualité de divers échantillons. Le profil de réactivité de chaque échantillon à contrôler est alors comparé à celui de l'échantillon authentique afin de déterminer sa qualité. Des variations dans les profils de réactivité sont alors indicatifs du changement de qualité d'un échantillon.

Dans une application particulière de l'invention, l'échantillon peut provenir d'un prélèvement réalisé dans le cadre d'une analyse médicale. Il est alors question de créer le profil de réactivité correspondant à un état pathologique ou physiologique particulier (tumeur, inflammation, infection virale ou bactérienne, etc.). Le profil de réactivité de l'échantillon est alors comparé aux profils de réactivité de référence conduisant ainsi à un diagnostic médical.

Dans une application particulière de l'invention, le procédé permet d'identifier plusieurs activités enzymatiques en proposant à un échantillon une série de substrats possédant chacun une réactivité spécifique avec autant de type d'activité catalytique. Il est possible, par ce test, de mettre en évidence un grand nombre d'activités catalytiques et de les interpréter

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comme nouvelles ou connues par référence à des profils de réactivité de référence.

Dans les exemples, il sera fait référence aux dessins en annexe dans lesquels : - Figure 1 Liste des diols précurseurs des substrats utilisés pour générer les profils de réactivité d'échantillons ayant une activité lipase ou estérase.

- Figure 2 : Liste des échantillons analysés possédant une activité lipase ou estérase (n de référence du fabricant,
Fluka et Roche).

- Figure 3 : Trace HPLC de vingt diols choisis parmis la liste 1 (Condition :100 M de chaque substrat ; HPLC : phase inverse, colonne Vydac C18 218TP54,0,5 x 25 cm, 1,5 mL/mn, gradient eau/acétonitrile/TFA, détection PDA 285 nm).

- Figure 4 : Echelle de gris et de couleur pour les représentations des profils de réactivité des échantillons.

- Figure 5 : Représentation graphique en échelle de gris et de couleur des profils de réactivité des échantillons décrit dans la figure 2.

- Figure 6 : Influence du pH sur la trace HPLC permettant de générer le profil de réactivité de la lipase de l'Aspergillus oryzae établit à partir d'un mélange racémiques de substrats. A : pH=2 ; B : pH=4 ; C : pH=6 ; D : pH=8 ; E : pH=10 ; F : pH=12. (Conditions : PBS pH = 7,4, 1h, [BSA] = 1 mg/mL, [S] = 100 uM, [DMF] = 25 % en volume, [E] =
2,5 ug/mL ; HPLC : phase inverse, colonne Vydac C18 218TP54,
0,5 x 25 cm, 1,5 mL/mn, gradient eau/acétonitrile/TFA, détection PDA 285 nm).

- Figure 7 : Liste des substrats glycosidiques utilisés pour générer le profil de réactivité d'échantillons ayant une activité glycosidase. Le nitrocatéchole sert de référence interne.

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Figure 8 : Trace HPLC de référence du mélange des substrats glycosidiques décrit dans la figure 7 (Condition :133 uM de chaque substrat ; HPLC : phase inverse, colonne Vydac C18
218TP54,0,5 x 25 cm, 1,5 mL/mn, gradient eau/acétonitrile/TFA, détection PDA 300 nm).

Figure 9 : Profil de réactivité d'échantillons possédant une activité glycosidase généré à partir du mélange de substrats décrit dans la figure 7 (Conditions : 37 C , 1h,
PBS pH = 7,4, [S] = 133 M, [E] = 0,2 U/mg ; HPLC : phase inverse, colonne Vydac C18 218TP54,0,5 x 25 cm, 1,5 mL/mn, gradient eau/acétonitrile/TFA, détection PDA 300 nm).

Figure 10 : Trace HPLC de référence du mélange des cinq hexapeptides de la figure 12(Condition :100 M de chaque substrat ; HPLC : phase inverse, colonne Vydac C18 218TP54,
0,5 x 25 cm, 1,5 mL/mn, gradient eau/acétonitrile/TFA, détection PDA 325 nm).

- Figure 11 : Trace HPLC permettant l'établissement d'un profil de réactivité d'échantillons possédant une activité protéase (conditions : Bis Tris, 37 C, 1 h, [S] = 100 uM, [E] = 50 ug/mL ; A : chymotrypsine de pancreas bovin pH = 8 ; B : papaïne de papaya latex pH = 7,5 ; C : pepsine de mucus d'estomac de porc pH = 4 ; D : subtilisine pH = 6,5 ; HPLC : phase inverse, colonne Vydac C18 218TP54,0,5 x 25 cm, 1,5 mL/mn, gradient eau/acétonitrile/TFA, détection PDA 325 nm).

Figure 12 : Illustration de la formation de plusieurs produits à partir d'un même substrat de type hexapeptide.

Figure 13 : Liste des substrats utilisés pour générer le profil de réactivité d'échantillons ayant une activité inconnue. Le nitrocatéchol sert de référence interne.

Figure 14 : Trace HPLC de référence du mélange des substrats décrit dans la figure 13 (Condition :100 uM de chaque substrat ; HPLC : phase inverse, colonne Vydac C18

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218TP54,0,5 x 25 cm, 1,5 mL/mn, gradient eau/acétonitrile/TFA, détection PDA 300 nm).

Figure 15 : Profils de réactivité d'échantillons, possédant des activités multiples, générés à partir du mélange de substrats décrit dans la figure 13 (Conditions : 35 C , 2h, PBS pH = 7,4, [S] = 100 uM, 20 L de suspension de cellules pour 100 uL de solution ; HPLC : phase inverse, colonne Vydac C18 218TP54, 0,5 x 25 cm, 1,5 mL/mn, gradient eau/acétonitrile/TFA, détection PDA 300 nm).

Figure 16 : Schéma synthétique de préparation d'une pluralité de substrats par une seule réaction chimique pour générer le profil de réactivité d'échantillons possédant une activité lipase ou estérase.

Figure 17 : Trace GC d'un mélange de triacylglycérols (C = 34 mg/mL) A : contrôle ; B : PBS, [PCL 1] = 50 ug/mL, [DMF] = 20% en volume ; colonne : OPTIMA Delta-3,0,25 um, 30 m*0,25 mm, injecteur : 250 C.

Figure 18 : Matrice de dissimalirité d'une expérience de clustering à partir des profils de réactivité de 38 enzymes (figure 2) possédant une activité lipase ou estérase.

Figure 19 : Représentation graphique en échelle de gris de la matrice de dissimilarité de la figure 18.

Figure 20 : Liste des substrats de type époxyde déstinés à l'étude d'époxyde hydrolases.

Figure 21 : Trace GC du mélange d'époxydes décrit dans la figure 20 (colonne : OPTIMA Delta-3,0,25 um, 30 m*0,25 mm, injecteur : 180 C).

Figure 22 : Liste de substrats de type ether de coumarine déstinés à l'étude de mono-oxygénases.

Figure 23 : Trace HPLC du mélange d'ethers de coumarine décrit dans la figure 22 (Condition :200 uM de chaque substrat ; HPLC : phase inverse, colonne Vydac C18 218TP54,

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0,5 x 25 cm, 1,5 mL/mn, gradient eau/acétonitrile/TFA, détection PDA 300 nm).

- Figure 24 : Liste de substrats de type amide déstinés à l'étude de mono-oxygénases ou d'amidases.

Figure 25 : Trace HPLC du mélange d'amides décrit dans la figure 26 (Condition :100 M de chaque substrat ; HPLC : phase inverse, colonne Vydac C18 218TP54,0,5 x 25 cm, 1,5 mL/mn, gradient eau/acétonitrile/TFA, détection PDA 300 nm).

Figure 26 : Liste de substrats de type amide déstinés à l'étude de nitrile hydratase.

Figure 27 : Liste de substrats utilisés pour générer le profil de réactivité de lipases par CCM.

Figure 28 : Trace CCM de la lipase de Pseudomonas
Fluoresence généré à partir du mélange de substrats décrit dans la figure 24 (Conditions : 1h, PBS pH = 7,4, [S] = 1 mM, [E] = 25 ug/mL ; CCM gel de silice ; au methanol ; éluant hexane/acétate d'éthyle 2/1 (v/v)).

Exemple 1 : Profil de réactivité de catalyseur de types de type estérase ou lipase.

Dans un réalisation particulière de l'invention, il est possible de réaliser des profils de réactivité d'échantillon possédant des activités de type estérase ou lipase avec des substrats de type ester. Par exemple, ces profils peuvent être réalisés par réaction avec des mélanges équimolaires comportant 20 substrats préparé sous forme de mélange racémiques ou de produits optiquement purs contenant une référence interne (figure 1). Ces mélanges sont synthétisés par une réaction d'estérification de diols choisis parmis les composés de la liste 1 (figure 1), avec le chlorure de capryloyle ou de butyryle. L'homme du métier pourra réaliser d'autres séries de

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substrats à partir d'au moins trois diols de la liste 1, par exemple, des dérivés de type mono-ester ou diester d'un ou plusieurs acides carboxyliques, dérivés carbonates, carbamates, éthers, sulfates, phosphates.

Les échantillons analysés sont des extraits commerciaux liquides ou solides contenant des activités enzymatiques connues (figure 2). On dilue chaque échantillons dans du PBS (tampon phosphate salin pH=7,4) à 1 mg/mL (= solution A). On ajoute 47,5 microlitres de PBS, 15 microlitres de N,N-diméthylformamide, 25 microlitres d'une solution de BSA à 4mg/mL dans du PBS, 10 microlitres d'une solution comportant chaque substrat à une concentration de 2 mM et une référence interne de structure C dans le N,N-diméthylformamide pur puis, on ajoute 2,5 microlitres de la solution A. L'activité estérase ou lipase convertit les substrats en produits correspondants de type diol.

Après un temps d'incubation fixe d'une heure, on effectue une analyse par HPLC qui permet de séparer et quantifier chacun des produits par rapport à la référence interne (figure 3). Le profil d'acitivité de chaque échantillon ainsi obtenu peut être représenté par un graphique en échelle de gris dans le cas de l'utilisation d'un seul mélange de substrats racémiques ou de couleur dans le cas de l'utilisation de plusieurs mélanges de substrats optiquement purs (figure 5). Suivant le même protocole expérimental, l'influence du pH du milieu réactionnel a été testé en mesurant le profil de réactivité d'échantillons de lipase d'aspergillus oryzae dans des solutions tampons dont le pH a été ajusté à 2,4, 6,8, 10 et 12 (figure 6).

Exemple 2 : Profil de réactivité de catalyseur de types glycosidase.

Dans un réalisation particulière de l'invention, il est possible de réaliser des profils de réactivité d'échantillon possédant des activités de type glycosidase avec des substrats

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de type glycosidique. Par exemple, ces profils peuvent être réalisés par réaction avec un mélange équimolaires comportant 15 substrats glycosidiques (figure 7). Les échantillons analysés sont des extraits commerciaux liquides ou solides contenant des activités enzymatiques connues (figure 8). On dilue chaque échantillons dans du PBS (tampon phosphate salin pH=7,4) à 1 U/mL. On ajoute 60 microlitres de PBS, 20 microlitres d'une solution comportant chaque substrat à une concentration de 0.66 mM puis on ajoute 20 microlitres de la solution d'échantillon.

Après un temps d'incubation fixe de une heure à une température de 37 C, on effectue une analyse par HPLC qui permet de séparer et quantifier chacun des constituants du milieu réactionnel et plus particulièrement le taux de conversion (figure 9). Le profil d'acitivité de chaque échantillon ainsi obtenu peut être représenté par un graphique en échelle de gris (figure 8).

Exemple 3 : Profil de réactivité de catalyseurs de types protéases.

Dans un réalisation particulière de l'invention, il est possible de réaliser des profils de réactivité d'échantillon possédant des activités de type protéases avec des substrats de type péptide possédant de 3 à 10 acides aminés chacun et un marqueur fluorescent. Par exemple, ces profils peuvent être réalisés par réaction avec un mélange équimolaires comportant cinq hexapeptides (figure 10). Les échantillons analysés sont des extraits commerciaux liquides ou solides contenant des activités enzymatiques connues. On dilue chaque échantillons dans du Bis Tris (tampon ammonium) dont le pH est ajusté pour chaque échantillon (figure 11) à 1 mg/mL. On ajoute 70 microlitres de solution tampon Bis Tris, 5 microlitres de chaque solution de peptide (C = 2 mM) puis on ajoute 5 microlitres de la solution d'échantillon. L'activité protéase convertit chaque substrat en un ou plusieurs produits (figure 12). Après un temps d'incubation fixe de une heure à la température de 37 C, on

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effectue une analyse par HPLC qui permet de séparer et quantifier les constituants du mélange (figure 11).

Exemple 4 :Test d'identification de micro-organismes.

Dans un réalisation particulière de l'invention, il est possible de réaliser l'identification de micro-organismes dans un échantillon à l'aide des profils de réactivité. Par exemple, ces profils peuvent être réalisés par réaction avec un mélange équimolaire comportant 18 substrats de structure chimique différente et une référence interne (figure 13). Les échantillons analysés sont des extraits de cultures des microorganismes correspondants. On ajoute 60 L de la solution de PBS, 20 L d'une solution comportant chaque substrat à une concentration de 0,5 mM puis on ajoute 20 L d'une suspension de cellules de levure. Chaque substrat sera convertit si l'échantillon contient l'enzyme dont il est spécifique. Après un temps d'incubation fixe de deux heures à la température de 35 C, on effectue une analyse par HPLC qui permet de séparer et quantifier chacun des constituants du milieu réactionnel (figure 14). Le profil d'acitivité de chaque échantillon ainsi obtenu peut être représenté par un graphique en échelle de gris (figure 15) .

Exemple 6 : Profil de réactivité d'une lipase par GC.

Dans un réalisation particulière de l'invention, l'analyse d'activités de type lipase dans un échantillon est réalisée par réaction avec des mélanges de substrat de type triacylglycérole.

Ces substrats sont préparé par une réaction d'estérification de triols avec un mélange de chlorures d'acyles (figure 16).

L'échantillon analysé est un extrait de lipase de Pseudomonas cépacia. On dilue l'échantillon dans du PBS (tampon phosphate salin pH=7,4) à 1 mg/mL. On ajoute 400 microlitres de la solution de PBS, 200 microlitres de N,N-diméthylformamide, 250 microlitres d'une solution de BSA à 4mg/mL dans du PBS, 100

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microlitres d'une solution de substrats à une concentration totale de 34 mg/mL puis on ajoute 50 microlitres de la solution de lipase. Après un temps d'incubation d'une heure, on effectue une analyse par GC qui permet de séparer et quantifier les composés constituant le mélange (figure 17).

Exemple 7 : Analyse comparative de type " clustering " pour une série de profils de réactivité de lipases et estérases.

Dans cet exemple, les profils de réactivité des lipases et des estérases générés lors de l'exemple 1 sont rassemblés afin de réaliser une analyse statistique de clustering. Pour cela, on combine les valeurs chiffrées attribuées à chaque substrat utilisés dans l'exemple 1 pour chacune des 38 enzymes testées.

Cette combinaison est réalisée par un logiciel d'analyse statistique permettant de faire apparaitre des sous classes d'enzymes suivant la similarité ou la dissimilarité des profils de réactivité qui s'expriment par un coefficient de dissimilarité. Ces coefficients sont rassemblés dans une matrice diagonale (figure 18) où chaque enzyme est comparée à toutes les autres. Un coefficient de zero entre deux enzymes signifie une similarité parfaite et plus il s'éloigne de cette valeur, plus les deux enzymes comparées sont différentes. Cette analyse de "clustering" peut être représenté représenté par un graphique en échelle de gris (figure 19) où le noir illustre la plus grande similarité et le blanc la plus grande dissimilarité.

Exemple 8 : Autres exemples de mélanges de substrats pouvant générer des profils de réactivité.

Afin de générer les profils de réactivité d'autres classe d'enzymes, d'autres mélanges de substrats ont été préparés. Un de ces mélanges contient dix époxydes (figure 20) afin d'étudier les profils de réactivité d'échantillons possédant une activité

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de type époxyde hydrolase. Ce mélange de substrats est analysé par chromatographie en phase gazeuse qui conduit à une séparation partielle des constituants (figure 21).

Un autre mélange contient neuf substrats de type ether de coumarine (figure 22). Ces composés peuvent être utilisés pour générer des profils de réactivité d'échantillons possédant une activité de type mono-oxygénase. Ce mélange de substrat est analysé par HPLC qui conduit à une séparation totale des composés du mélange (figure 23).

Un autre mélange contient six substrats de type amide (figure 24). Ces composés peuvent être utilisés pour générer des profils de réactivité d'échantillons possédant une activité de type mono-oxygénase ou amidase. Ce mélange de substrat est analysé par HPLC qui conduit à une séparation totale des composés du mélange (figure 25).

Un autre mélange contient neuf substrats de type nitrile (figure 26). Ces composés peuvent être utilisés pour générer des profils de réactivité d'échantillons possédant une activité de type nitrile hydratse.

Exemple 9 : Profil de réactivité d'une lipase par CCM.

Dans un réalisation particulière de l'invention, l'analyse d'activités de type lipase dans un échantillon est réalisée par réaction avec des mélanges de substrats de type ester (figure 27). L'échantillon analysé est un extrait de lipase de Pseudomonas fluorescence. On dilue l'échantillon dans du PBS (tampon phosphate salin pH=7,4) à 100 pg/mL. On ajoute 10 microlitres de la solution de PBS, 30 microlitres d'une solution de substrats à une concentration 1 mM puis on ajoute 10 microlitres de la solution de lipase dans le PBS. On effectue une analyse par CCM au bout d'un temps de 15 min ainsi que d'une

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heure. Cette analyse permet de séparer les composés constituant le mélange et d'en déterminer la composition (figure 28).

Claims (9)

1. Revendications 1. Procédé pour générer un profil de réactivité d'un échantillon, caractérisé en ce qu'on met l'échantillon, possédant potentiellement une activité catalytique, en contact avec un ou plusieurs mélanges d'au moins trois substrats chacun, on quantifie dans chaque mélange la disparition des substrats et/ou la formation de produits à partir de ces substrats au cours du temps par une analyse séparatrice, et on combine les vitesses de réactions ou les taux de conversion ainsi obtenus.
2. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'échantillon contient une ou plusieurs enzymes possédant différents degrés de pureté, pouvant provenir de multiples sources comme d'organismes animaux, végétaux ou bactériens ainsi que de prélèvements dans le cadre d'une analyse médicale, d'un contrôle de qualité d'un aliment ou d'un bien de consommation.
3. 3. Procédé de mesure de profil de réactivité de type lipase/esterase suivant la revendication 1 faisant intervenir des substrats de type ester.
4. 4. Procédé de mesure de profil de réactivité de type glycosidase suivant la revendication 1 faisant intervenir des substrats de type glycoside.
5. 5. Procédé de mesure de profil de réactivité de type protéase suivant la revendication 1 faisant intervenir des substrats peptidiques possédant de trois à dix acides aminés chacun et un marqueur fluorescent.
6. 6. Procédé de mesure de profil de réactivité de type époxyde hydrolase suivant la revendication 1 faisant intervenir des substrats de type époxyde.

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7. 7. Procédé de mesure de profil de réactivité de type monooxygénase suivant la revendication 1 faisant intervenir des substrats de type ether ou amide.
8. 8. Procédé de mesure de profil de réactivité de type amidase suivant la revendication 1 faisant intervenir des substrats de type amide.
9. 9. Procédé d'identification d'un échantillon, caractérisé en ce qu'on détermine le profil de réactivité de cet échantillon selon le procédé de l'invention, on compare ce profil à une banque de donnée de profils enregistrés pour une série d'échantillons de références et par analogie entre les profils, on identifie l'échantillion.