FI93861C - Menetelmä asparagiini- -amidohydrolaasientsyymien aktiivisuuden mittaamiseksi ja menetelmässä käyttökelpoinen testivälineistö - Google Patents

Description

93861

Menetelmä asparagiini-B-amidohydrolaasientsyymien aktiivisuuden mittaamiseksi ja menetelmässä käyttökelpoinen tes-tivälineistö 5 Esillä oleva keksintö koskee uutta menetelmää aspa- ragiini-B-amidohydrolaasientsyymien aktiivisuuden mittaamiseksi biologisista näytteistä. Keksintö koskee lisäksi testivällneistöä, joka soveltuu käytettäväksi tällaisten entsyymien määrityksessä.

10 Asparagiini-B-amidohydrolaaseja, joiden aktiivisuu den määrittämiseen esillä olevan keksinnön mukaista menetelmää voidaan käyttää, ovat esimerkiksi glykosyyliaspara-ginaasit [glykoasparaginaasi, N4-(B-N-asetyyliglukoosiami-nyyli)-L-asparaginaasi, aspartyyliglukosaminidaasi, EC 15 3.5.1.26, AGA], jotka katalysoivat asparagiinin ja N-ase- tyyliglukoosiamiinin välisen N-glykosidisidoksen hajoamista eri glykoasparagiineissa [Makino, M. et ai., Bio-chem. Biophys. Res. Commun. 24 (1966) 961 - 966; Makino, M. et ai., J. Biochem. 63 (1968) 186 - 192; Tarentino, A. 20 L. ja Maley, F., Arch. Biochem. Biophys. 130 (1969) 295 -303]. Tämä N-glykosidinen sidos yhdistää oligosakkaridin ja peptidiketjun toisiinsa näissä glykoproteiineissa [Montreuil, J., Pure Applied Chem. 42 (1975) 431 - 477]. Glykosyyliasparaginaaseja esiintyy esimerkiksi eri nisä-··.< 25 kässolujen lysosomeissa.

Toinen esimerkki asparagiini-B-amidohydrolaaseis-ta, joiden aktiivisuutta voidaan määrittää esillä olevan keksinnön mukaisesti, ovat asparaginaasit (L-asparagiini-amidohydrolaasi, EC 3.5.1.1). Nämä entsyymit hydrolysoivat 30 D- tai L-asparagiinia, jossa on vapaat α-amino- ja a-kar-boksyyliryhmät, jolloin muodostuu aspartaattia ja ammoniakkia [Cooney, D. A. ja Handschumacher, R. E., Annual Review of Pharmacology 10 (1970) 421 - 440]. Asparaginaasit ovat yleisiä entsyymejä luonnossa ja niitä on eristet-35 ty mm. bakteeri-, hiiva-, kasvi- ja nisäkässoluista. Bak- 2 93861 teerien glutaminaasi-asparaginaasit pystyvät asparagiinin lisäksi hydrolysoimaan glutamiinia glutamiinihapoksi ja ammoniakiksi.

Elimistössä glykosyyliasparaginaasientsyymi kata-5 lysoi seuraavia reaktioita: 1 3 -GlycoNH2 ±HZ0 10 (A) GlycoAsn -^ E - Asp--^ Asp

2 / ±NH20H

15

β-AHA

jossa reaktiossa GlykoAsn on ns. glykoasparagiini, jossa L-asparagiinin β-aminoryhmään on kiinnittynyt hiilihyd-20 raattiketju; GlykoNH2 on hiilihydraattiyksikkö, jossa on 1-amino-N-asetyyliglukoosiamiinirakenne pelkistävässä päässä; E-Asp on S-aspartyyli-entsyymi-välituote; B-AHA on L-aspartaatti-B-hydroksamaatti; ja Asp on L-aspartaatti [Kaartinen, V. et ai., J. Biol. Chem. 267 (1992) 6855 -25 6858].

GlykoNH2 hajoaa edelleen ei-entsymaattisesti vapaaksi hiilihydraattiosaksi ja ammoniakiksi [Makino, M. et ai., Biochem. Biophys. Res. Commun. 24 (1966) 961 - 966] seuraavasti: 30 (B) GlykoNH2 + H20 -> Glykaani + NH3

Ihmisillä glykosyyliasparaginaasiaktiivisuuden puuttuminen aiheuttaa resessiivisesti periytyvän aspartyy-.35 liglykosamiiniurian eli AGU-taudin, jolle on ominaista glykoasparagiinien, erityisesti aspartyyliglukoosiamii-nin, kerääntyminen kudoksiin ja kehon nesteisiin. Taudin kliiniseen kuvaan kuuluu vähitellen paheneva psykomotori 93861 3 sen kehityksen hidastuminen ja taantuminen ja lopulta valkea kehitysvammaisuus. AGU-taudin kuvasi ensimmäisen kerran englantilainen tutkija Pollitt työtovereineen vuonna 1968 [Pollitt, R.J. et ai., Lancet 2 (1968) 253 - 255] ja 5 myöhemmissä tutkimuksissa sen on todettu aiheutuvan piste-mutaatioista glykosyyliasparaginaasientsyymiä koodaavassa geenissä [Mononen, I. et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88 (1991) 2941 - 2945; Fisher, K. J. ja Aronson Jr, N. N., J. Biol. Chem. 266 (1991) 12 105 - 12 113; Ikonen E. et 10 ai., EMBO J. 10 (1991) 51 - 58]. Tämän geenivirheen takia AGU-tautia sairastavilta potilailta otettujen solunäytteiden glykosyyliasparaginaasiaktiivisuudet ovat matalia, lähes olemattomia vastaavien kontrollinäytteiden aktiivisuuteen verrattuna. AGU-tauti on epätavallisen yleinen 15 suomalaisten keskuudessa: kantajafrekvenssi on 1:30 [Mononen T. et ai., Human Genet. 87 (1991) 266 - 268].

Glykosyyliasparaginaasiaktiivisuuden määrityksessä on käytetty hyväksi entsyymireaktioissa vapautuvia reaktiotuotteita . Tavallisimmin glykosyyliasparaginaasiaktii-20 visuutta on määritetty mittaamalla kolorimetrisesti entsyymin vaikutuksesta substraatista, aspartyyliglukoosi-amiinista, vapautuvaa N-asetyyliglukoosiamiinla Morgan-Elson-reaktion mukaisesti [kts. esim. Makino, M. et ai., Biochem. Biophys. Res. Commun. 24 (1966) 961 - 966; Du-”"25 gal, B., Biochem. J. 163 (1977) 9 - 14; Aula, P. et ai., Pediatr. Res. 10 (1976) 625 - 629]. Tämän menetelmän eräs haittapuoli on se, että biologisilla näytteillä määritysmenetelmässä on käytettävä pitkää, jopa 18 tunnin inku-bolntiaikaa. Menetelmä ei myöskään ole spesifinen, sillä 30 se on herkkä biologisissa näytteissä läsnä olevien heksos-aminidaasien erilaisista glykokonjugaateista vapauttamista heksosamiineista johtuville virheille sekä epäspesifiselle värinmuodostukselle. Niinpä on suositeltu heksosaminidaa-sien samanaikaista mittausta (Aula, P. et ai., yllä). Me-35 netelmä onkin harvoin käytetty ja huonosti rutiinitutkimusmenetelmäksi soveltuva.

4 93861

Glykosyyliasparaginaasiaktilvisuutta on määritetty myös mittaamalla edellä kuvatussa reaktiossa B vapautuvaa ammoniakkia [Makino, M. et ai., Biochem. Biophys. Res. Conunun. 24 (1966) 961 - 966] tai mittaamalla reaktiossa A 5 vapautuvaa L-aspartaattia entsymaattisesti [Tarentino, A.

L. ja Maley, F., Arch. Biochem. Biophys. 130 (1969) 295 -303]. L-aspartaatin mittaaminen biologisesta seoksesta soveltuu huonosti glykosyyliasparaginaasiaktiivisuuden mittaamiseen, koska L-aspartaattia muodostuu useissa muis-10 sa mahdollisissa reaktioissa, kuten aspartaattlaminotrans-feraasin katalysoimassa reaktiossa: L-aspartaatti + a-ke-toglutaraatti y-» oksaloasetaatti + L-glutamaatti. Myös ammoniakkia muodostuu monissa biologisissa reaktioissa, minkä vuoksi ammoniakin mittaaminen ei spesifisesti kuvaa 15 glykosyyliasparaglnaasin (tai asparaginaasin, katso alla) aktiivisuutta.

Herkempään ja spesifisempään glykosyyliasparaginaa-siaktiivlsuusen mittaamiseen kudoksista tai soluista on kehitetty kaasukromatografinen [Mononen, 1. et ai., Scand.

20 J. Clin. Lab. Invest. 48, Suppl. 191, (1988) 7 - 11] ja korkeapainenestekromatografinen menetelmä [Kaartinen, V. ja Mononen, I. Anal. Biochem. 190 (1990) 98 - 101]. Näissä lähinnä tutkimuskäyttöön sopivissa menetelmissä ennen kro-matografiaa niin substraatti kuin reaktiotuotteetkin muu-25 tetaan johdannaislkseen. Kaasukromatografisessa määritys- • ( l menetelmässä aspartyyliglukoosiamiini ja N-asetyyliglukoo-siamiini todetaan permetyylieetterijohdannaisina ja glyko-syyliasparaginaasin korkeapainenestekromatografinen määritysmenetelmä perustuu substraatin, aspartyyliglukoosi-30 amiinin, ja tuotteen, aspartaatin, mittaukseen fenyyli-isotiosyanaattijohdannaisena. Vaikka nämä menetelmät ovat herkkiä ja erityisesti jälkimmäistä menetelmää voidaan käyttää puhdistamattornien solu-uutteiden ja kudosnäytteiden analysointiin, johdannaisten valmistaminen ja kromato-35 grafia ovat työläitä suorittaa ja rajoittavat menetelmän käyttöä rutiininomaisesti.

93861 5 L-asparaglnaaseja käytetään syöpätautien, mm. akuutin lymfaattisen leukemian (ALL) tukihoidossa, jolloin niitä annetaan potilaalle suuria määriä [Recent Results Cancer Res. 33 (1970) Grundmann, E. ja Oettgen, H. F., 5 toim., Springer Verlag, New York, 1970]. Asparaglnaasien käyttö perustuu siihen, etteivät jotkut leukemiasolut, esim. ALL-solut, pysty syntetisoimaan asparagiinia, jota tarvitaan DNA:n ja välttämättömien proteiinien synteesiin sekä solujen hengissä pysymiseen. Koska normaalit solut 10 pystyvät syntetisoimaan asparagiinia, ne ovat vähemmän herkkiä asparaginaasin aikaansaamalle aminohapon puutteelle. Sopivaa menetelmää L-asparaginaasihoidon seurantaan ei ole ollut käytettävissä.

Tavallisin menetelmä L-asparaginaasiaktiivisuuden 15 mittaamiseksi perustuu ammoniakin määritykseen Nesslerin reaktiolla [Meister, A. kirjassa Methods in Enzymology II, Colowick, S. P. ja Kaplan, N. 0., toim., Academic Press, New York (1955) 380 - 385]. Menetelmän käyttö edellyttää huolellista reaktio-olosuhteiden vakiointia, jopa stabi-20 loivien aineiden käyttöä. Edellä jo mainittu ammoniakin muodostuminen monissa biologisissa reaktioissa hankaloittaa lisäksi tämän menetelmän käyttöä. Samasta ongelmasta kärsii kineettinen menetelmä L-asparaginaasin määrittämiseksi ammoniakkikaasulle herkkää elektrodia käyttäen [Ta-; ‘.25 gami, S. ja Matsuda, K., Chem. Pharm. Bull. 38 (1990) 153 - 155].

L-asparaginaasia on mitattu käyttäen substraattina 14C-L-asparagiinia, jolloin mitataan vapautunutta 14C-aspa-ragiinihappoa paperielektroforeesin avulla [Broome, J. D., 30 Brit. J. Cancer 22 (1968) 595 - 602], Menetelmä on kuiten-; kin alkaa vievä ja altis näyttessä oleville orgaanisille epäpuhtauksille.

L-asparaginaasin määrittämiseksi on kehitetty myös spektrofotometrinen mittausmenetelmä, jossa entsyymlaktii-35 visuuden mittauksessa käytetään hyväksi NADH:n hapettumis- 6 93861 nopeuden mittausta aallonpituudella 340 nm kytketyssä ent-syymimäärityksessä ylimääriä glutamiini-oksaloasetaatti-transaminaasia ja omenahappodehydrogenaasia käyttäen [Cooney, D. A. ja Handschumacher, R. E., Proc. Am. Assoc. Can-5 cer Res. 9 (1968) 640]. Menetelmä monine entsyymireagens-seineen ja substraatteineen on kallis ja altis virheille. Toisessa spektrofotometrisessä menetelmässä käytetään vaihtoehtoisen substraatin, 5-diatso-4-okso-L-norvaliinin mittausta aallonpituudella 274 nm [Handschumacher, R. E. 10 et ai., Federation Proc. 27 (1968) 15].

Vaikka kirjallisuudessa on kuvattu monia menetelmiä asparagiini-8-amidohydrolaasien määrittämiseksi, tarvitaan kuitenkin herkkää ja spesifistä määritysmenetelmää, joka olisi nopea, helppo ja yksinkertainen suorittaa tavallisia 15 laboratoriolaitteita käyttäen. Menetelmän tulisi myös so pia monenlaisista biologisista lähteistä peräisin olevien näytteiden analysointiin. Lisäksi sen tulisi olla myös kustannuksiltaan edullinen rutiinitutkimuksia, mm. suuria näytemääriä käsittäviä seulonta- ja seurantatutkimuksia 20 ajatellen.

Esillä oleva keksintö antaa käyttöön menetelmän, jolla on edellä kuvatut edut ja johon ei liity tunnettujen menetelmien ongelmia ja haittoja.

Hiljattain tehdyt tutkimukset osoittavat, että eräs 25 asparagiini-B-amidohydrolaasientsyymi, ihmisen valkosolu jen glykosyyliasparaginaasi, toimii eksohydrolaasina substraatin L-asparagiiniryhmää kohtaan ja lisäksi hydrolysoi β-metyyli-L-aspartaattia [Kaartinen, V. ja Mononen I., J. Biol. Chem. 267 (1992) 6855 - 6858]. Nyt on yllättäen huo-30 mattu, että asparagiini-B-amidohydrolaasientsyymien aktiivisuuden mittaamisessa on mahdollista käyttää substraatteina yhdisteitä, jotka sisältävät L-asparagiinin B-amino-ryhmään tai L-aspartaatin B-karboksyyliryhmään leimana kiinnitetyn yhdisteen, joka entsyymin katalysoimana ir-35 toaa, jolloin sen määrä voidaan tarkoin mitata tai sen 93861 7 irtoamisnopeutta voidaan seurata, ja siten määrittää näytteessä olevan entsyymin määrä.

Niinpä esillä olevan keksinnön kohteena on menetelmä asparagiini-e-amidohydrolaasientsyymien aktiivisuuden 5 mittaamiseksi biologisista näytteistä, jolloin menetelmälle on tunnusomaista, että näyte saatetaan kosketukseen yhdisteen kanssa, joka sisältää L-asparagiinin 6-amlnoryh-mään tai L-aspartaatin β-karboksyyliryhmään kiinnitettynä helposti todettavissa olevan yhdisteen, joka vapautuu 10 näytteessä olevan entsyymin vaikutuksesta, ja määritetään vapautuva yhdiste.

Erityisesti keksinnön kohteena on menetelmä aspa-ragiini-B-amidohydrolaasientsyymien aktiivisuuden mittaamiseksi biologisista näytteistä, jolloin menetelmälle on 15 tunnusomaista, että näyte saatetaan kosketukseen yhdisteen kanssa, joka sisältää L-asparagiinin B-aminoryhmään tai L-aspartaatin β-karboksyyliryhmään kiinnitettynä lumi-nesoivaa, kuten fluoresoivaa, fosforolvaa tai kemilumine-soivaa, värillistä tai muuta sopivaa yhdistettä, joka va-20 pautuu näytteessä olevan entsyymin vaikutuksesta, ja määritetään vapautuva yhdiste luminometrisesti, kuten fluorometrisesti tai kemiluminometrisesti, fotometrisesti tai muulla tarkoituksenmukaisella menetelmällä.

Keksinnön erityisenä kohteena on menetelmä glyko-•'" 25 syyliasparaginaasien ja asparaginaasien aktiivisuuden mittaamiseksi näytteistä, jolloin menetelmälle on tunnusomaista, että näyte saatetaan kosketukseen yhdisteen kanssa, joka sisältää L-asparagiinin β-aminoryhmään tai L-aspartaatin β-karboksyyliryhmään kiinnitettynä luminesoivan 30 tai värillisen yhdisteen, joka vapautuu näytteessä olevan entsyymin vaikutuksesta, ja määritetään vapautuvan yhdisteen määrä luminometrisesti tai fotometrisesti.

Esillä olevan keksinnön kohteena on lisäksi tes-tivälineistö, joka sopii käytettäväksi edellä kuvatussa 35 menetelmässä ja joka sisältää substraattireagenssln, joka 8 93861 on yhdiste, joka sisältää L-asparagiinin B-aminoryhmään tai L-aspartaatin β-karboksyyliryhmään kiinnitettynä helposti todettavissa olevan yhdisteen, joka vapautuu biologisessa näytteessä olevan entsyymin vaikutuksesta, ja 5 haluttaessa muita määritysmenetelmän vakiointiin tarvittavia reagensseja.

Esillä olevan keksinnön mukaisesti biologista näytettä, jonka asparagiini-B-amidohydrolaaslentsyymiaktiivi-suus halutaan määrittää, inkuboidaan ennalta määrätyn ajan 10 substraattina toimivan yhdisteen kanssa sopivassa puskuri-liuoksessa, esimerkiksi 50 mM Tris-HCl-puskurissa, pH 7,5, minkä jälkeen reaktiota seurataan kineettisesti tai ent-syymireaktio pysäytetään sopivalla tavalla, esimerkiksi nostamalla/laskemalla reaktioseoksen pH:ta, lämpötilaa tai 15 ionivahvuutta tai lisäämällä denaturoivaa yhdistettä esim.

detergenttiä. Reaktion kulkua kineettisesti seurattaessa voidaan seurata esim. absorbanssin muutosta ajan funktiona. Kineettistä reaktiota voidaan seurata fluoresenssin lisäksi myös muita luminesenssiin perustuvia menetelmiä, 20 kuten fosforesenssia, kerniluminesenssia tai bioluminesens-sia, hyväksi käyttäen.

Menetelmässä käytetty inkubointiaika riippuu näytteen sisältämästä entsyymiaktiivisuudesta: esimerkiksi valkosolut sisältävät enemmän entsyymiä kuin seerumi.

25 Siten inkubointiaika vaihtelee käytetystä mittaustavasta kineettisen mittauksen nollasta päätepistemittauksessa käytettyyn inkubointiaikaan, joka voi olla muutamasta sekunnista useisiin tunteihin, edullisesti 10 min - 4 h. Edullisimmin inkubointiaika on 30 min - 1 h.

30 Keksinnön mukaisessa menetelmässä substraattina voidaan käyttää mitä tahansa sopivaa, helposti todettavissa olevaa L-asparagiinin tai L-aspartaatin johdannaista, jossa on vapaa α-amino- ja α-karboksyyliryhmä. Esimerkkejä tällaisista substraateista ovat tunnettujen fluorogeenis-35 ten yhdisteiden, kuten 7-amino-4-metyylikumariinin, B-me- 93861 9 tyyliumbelliferonin, fluoreskiinin, β-naftyyliamiinin, re-sorufiinin, 6-amlnoklnollinin tai resorsinolin, L-aspara-giini- tai L-aspartaattijohdannaiset, joissa on vapaa a-amino- ja α-karboksyyliryhmä. Tällaisia yhdisteitä voivat 5 olla myös tunnettujen värillisten yhdisteiden, kuten β-naftyyliamiinin, sekä kemiluminesenssimenetelmissä käytettyjen yhdisteiden, kuten D-lusiferiinin ja adamantyyli- 1,2-dioksetaanin, vastaavat johdannaiset.

Joitakin fluorogeenisten yhdisteiden aminohappojoh-10 dannaisia on käytetty mikro-organismien osoittamisessa. Esimerkiksi EP-patenttihakemusjulkaisusta 347 771 tunnetaan bakteerien osoittamiseksi tarkoitettu testiväline, joka sisältää kantajan, kinetiikkaa ja fluoresenssia lisäävän tukikerroksen sekä kuivassa muodossa olevaa fluoro-15 geenistä substraattia, joka voi olla 7-amino-4-metyyliku-mariini, β-metyyliumbelliferoni, fluoreskiini, β-naftyy-liamiini tai resorslnoli. US-patenttijulkaisussa 4 675 289 esitetään menetelmä eumykeettien lukumäärän mittaamiseksi, joka perustuu sienten hydrolaasien fluorogeenisista amino-20 happojohdannaisista vapauttaman fluorogeenin määrittämiseen.

a-L-aspartyyli-e-naftyyliamidia on käytetty seerumin angiotensiiniaktiivisuuden määrittämiseen [Nagatsu et ai., Biochem. Pharmacology 14 (1965) 853 - 861]. Aminohap-V' 25 pojen α-aminoryhmään sidotut merkkiaineet eivät kuitenkaan sovellu asparagiini-8-amidohydrolaasin aktiivisuuden mittaukseen, koska substraatin tulee sisältää L-asparagiinia tai L-aspartaattia, jonka α-aminoryhmä on vapaa [Kaartinen et ai., J. Biol. Chem 266 (1991) 5860 - 5869; Kaartinen et 30 ai., J. Biol. Chem 267 (1992) 6855 - 6858].

,< Edullisia keksinnön mukaisessa menetelmässä käytet tyjä substraatteja ovat kaupallisesti saatavissa olevat L-aspartaatti-6-(7-amido-4-metyyllkumariinl) ja L-asparagii-ηΐ-β-naftyyliamiini, joista entsyymin vaikutuksesta vapau-35 tuu 7-amino-4-metyylikumariinia, jonka määrä voidaan mää- 93861 10 rittää fluorometrisesti, tai vastaavasti värillistä ja fluoresoivaa β-naftyyllamiinia. Tällä hetkellä edullisin keksinnön mukaisessa menetelmässä käytetty yhdiste on L-aspartaatti-e-(7-amido-4-metyylikumariini) sen herkkyyden 5 vuoksi.

Näytteessä olevan entsyymin määrä voidaan suhteuttaa muodostuneen todettavissa olevan yhdisteen määrään tai sen vapautumisnopeuteen sinänsä tunnetulla tavalla. Esimerkiksi muodostunut yhdiste voidaan mitata fluorometri-10 sestl tietyn, ennalta määrätyn reaktloajan kuluttua tai sen vapautumlsnopeus voidaan mitata klneettisestl värin muodostumisesta tai värin häviämisestä. Edullisessa suoritusmuodossa käytettäessä substraattina L-aspartaatti-B-(7-amldo-4-metyyllkumarllnla) näytteessä olevan entsyymin 15 vaikutuksesta vapautuva 7-amldo-4-metyyllkumarllnl voidaan mitata fluorometrisesti käyttäen eksltaatlota ja emissiota aallonpituuksilla 350 nm ja vastaavasti 450 nm. Kun keksinnön mukaisessa menetelmässä käytetään substraattina sekä värillistä että fluoresoivaa B-naftyyliaraiinia, voi-20 daan esimerkiksi mitata delta-absorbanssi aallonpituudella 525 nm [Nagatsu, 1. et ai., Biochem. Pharmacology (1965) 853 - 861] tai fluorometrisesti käyttäen eksitaa-tiota ja emissiota aallonpituudella 345 nm ja vastaavasti 405 nm. Kemiluminometrisessä mittauksessa substraattina V . 25 voidaan käyttää esimerkiksi L-asparagiini- tai L-aspar-taatti-e-D-lusiferiinia. Glykosyyliasparaginaasi tai aspa-raginaasi vapauttaa asparagiinin/aspartaatin, jolloin muodostuu D-lusiferilnia, joka reagoi lusiferaasientsyymin ja ATP:n kanssa tuottaen valoa [Miska, W. ja Geiger, R., J. 30 Clin. Chem. Clin. Biochem. 25 (1987) 23 - 30]. Käytettäes- : sä substraattina L-asparaglini- tai L-aspartaatti-B-ada- mantyyli-1,2-dioksetaanla yhdiste hajoaa alkallsessa pHrssa asparaginaasin/glykosyyliasparaginaasin läsnäollessa tuottaen valoa [Schaap, A. P. et ai., Tetrahedron Let-35 ters 28 (1978) 1 159 - 1 162? Voyta, J. C., Clin. Chem. 34 (1988) 1 157], 93861 11

Biologinen näyte voi olla mikä tahansa elimistön neste tai kudos, esimerkiksi plasma, virtsa, lapslvesi, viljelty istukka- tai lapsivesinäyte, valkosolu-uute, viljelty fibroblastinäyte jne. Näyte voi olla myös muu biolo-5 gista materiaalia sisältävä näyte, esimerkiksi bakteeri-, hiiva- tai vastaava näyte. Biologisen näytteen esikäsittelyä ei tarvita, joskin sitä tietysti voidaan käyttää.

Suomen oloissa eräs tärkeä esillä olevan keksinnön mukaisen menetelmän käyttösovellutus on glykosyyliaspara-10 ginaasin mittaamiseen AGU:n diagnostiikassa potilaiden (homotsygootti) ja taudinkantajien (heterotsygootti) toteamiseen ja prenataalidiagnostiikassa käyttäen elimistön nesteitä, kudosnäytteitä ja viljeltyjä soluja. Muita mahdollisia käyttösovellutuksia ovat L-asparaginaasihoidon 15 seuranta (leukemiat, mahdolliset muut syöpäsairaudet), sellaisien sairauksien diagnostiikkaan ja hoidon seuranta, joissa glykosyyliasparaginaasia poistuu soluista solunul-koiseen tilaan seurauksena solujen kuolemasta (esim. infarkti), toiminnan häiriintymisestä (verenkiertohäiriö, '20 tulehdus, maligni transformaatio) tai geneettisestä häi riöstä (I-solutauti), käyttäen elimistön nesteitä, kudosnäytteitä ja viljeltyjä soluja.

Esillä olevan keksinnön mukainen menetelmä on nopea suorittaa. Menetelmä avulla voidaan esimerkiksi aspartyy-.25 liglykosamiiniuria todeta jo yhden tunnin inkubointiajan jälkeen valkosolu- ja flbroblastinäytteistä, samoin plasma- ja virtsanäytteistä. Menetelmä on spesifinen, sillä näytteessä mahdollisesti läsnä olevat heksosaminldaasit eivät pysty hydrolysoimaan menetelmässä käytettyä spesi-30 fistä substraattia. Menetelmä voidaan helposti automati-soida ja sitä voidaan soveltaa asparagiini-e-amldohydro-laasientsyymien aktiivisuuden mittaamiseksi erilaisista biologisista materiaaleista, kuten plasmasta, lapsivedes-tä, valkosoluista jne.

93861 12

Esillä olevaa keksintöä kuvataan nyt yksityiskohtaisesti seuraavlen suoritusesimerkkien avulla. Nämä esimerkit annetaan vain keksinnön valaisemiseksi edelleen, eikä niitä tule katsoa keksintöä rajoittaviksi.

5 Esimerkki 1

Esimerkkejä Michaelisin vakiosta eräille aspara-giini-B-amidohydrolaasientsyymien substraateilla

Asparagiini-B-amidohydrolaasientsyymien kykyä hydrolysoida eri substraatteja tutkittiin käyttäen ihmisen 10 valkosolujen glykosyyliasparaginaasia (AGA), joka puhdistettiin julkaisussa Kaartinen et ai., J. Biol. Chem. 266 (1991) 5860 - 5869, kuvatulla tavalla (spesifinen aktiivisuus 2,2 yksikkö/mg proteiinia), sekä Erwinia-L-asparagi-naasia (L-ASPaasi, Erwinase™, asparaginaasi, joka on eris-15 tetty Erwinia chrysanthemi -bakteerista, Porton Product Ltd., Porton Down, Salisbury, Englanti). Substraatteina käytettiin glykosyyliasparaginaasille sen tärkeintä luonnossa tavattavaa substraattia, aspartyyliglukoosiamiinia (GlcNAc-Asn) ja L-aspartaatti-B-(7-amido-4-metyylikuma-' 20 riinia) (AspAMC, Bachem AG, Bubendorf, Sveitsi) sekä L-asparaginaasille (L-ASPaasi) sen luonnollista substraattia, asparagiinia (Asn) ja L-aspartaatti-B-(7-amido-4-me-tyylikumariinia). Luonnollisia substraatteja käytettäessä mitattiin entsyymireaktioissa vapautuvaa L-aspartaattia . 25 entsymaattisesti [Tarentino, A. L. ja Maley, F., Anal.

Biochem. Biophys. 130 (1969) 295 - 303]. Km-arvo määritettiin käyttäen kaksoisresiprokaali (Lineweaver-Burk) -kuvaajaa. Tulokset on esitetty taulukossa 1.

93861 13

Taulukko 1

Esimerkkejä Michaelisin vakiosta eräille asparagiini-B-amidohydrolaasientsyymien substraateilla 5 Entsyymi Substraatti Km-arvo (μΜ/1) AGA GlcNAc-Asn 110 AGA AspAMC 93 L-ASPaasi Asn 270 L-ASPaasl AspAMC 28 10

Kun entsyymiä käsiteltiin spesifisellä glykosyyli-asparaginaasin inhibiittorilla, diatso-oksonorvaliinilla, AspAMC ei hydrolysoitunut. Tämä osoittaa, että inhibiittori sitoutuu entsyymin aktiiviseen kohtaan.

15 Esimerkki 2

Glykosyyliasparaginaasiaktiivisuuden määritys ihmisen valkosoluista AspAMC:tä substraattina käyttäen

Ihmisen valkosolujen glykosyyliasparaginaasi eristettiin julkaisussa Kaartinen, V. ja Mononen, I., Anal. 20 Biochem. 190 (1990) 98 - 101, kuvatulla tavalla. Valkosolut olivat peräisin aspartyyliglukoosiamiiniuriaa sairastavilta potilailta, joiden AGA-entsyymin geenissä esiintyi kaksi suomalaisille AGU-potilaille tyypillistä pistemutaa-tiota, tai terveiltä verrokeilta (normaali AGA-entsyymi).

.25 Valkosolut eristettiin 10 ml:sta EDTA-verta käyttäen sedi-mentaatiota 6-prosenttiseen dekstraaniin ja suspendoitiin 50 mM Tris-HCl-puskuriin, pH 7,5, joka sisälsi 0,2 % Triton X-100:a ja 0,5 mM EDTA:ta.

Solunäyte jäädytettiin.ja sulatettiin kahdesti ja 30 homogenoitiin sonikoimalla 30 sekuntia, minkä jälkeen ho-.· mogenaatti sentrifugoitiin (3 000 x G, 10 min). Superna- tantti käytettiin glykosyyliasparaginaasiaktiivisuuden määrittämiseen.

Glykosyyliasparaginaasiaktiivisuus määritettiin 35 käyttäen AspAMC:ta 1 mM:n pitoisuutena 50 mM Tris-HCl-puskurissa, pH 7,5, joka sisälsi 0 - 10 % etyleeniglykolia.

93861 14

Seokseen lisättiin edellä saatua supernatanttia, joka sisälsi 100 - 500 pg proteiinia, ja seosta inkuboitiin 1 h 37 °C:ssa. 7-amino-4-metyylikumariinin vapautuminen mitattiin fluorometrisesti käyttäen eksitaatiota ja emissiota 5 aallonpituuksilla 350 nm ja vastaavasti 450 nm ja keräten mittauspisteitä 6-10 minuutin välein. 7-amino-4-metyyli-kumariini fluoresoi hyvin pH:ssa 7,5, mistä syystä entsyy-mireaktiota ei tarvitse pysäyttää erikseen. Reaktion pysäyttämiseen voitaisiin haluttaessa käyttää esimerkiksi 10 natriumglysinaattipuskuria, pH 10,0.

Ihmisen valkosolujen AGA-pitoisuudet määritettiin kuudelta terveeltä vapaaehtoiselta ja kolmelta AGU-poti-laalta saaduista eristetyistä valkosolunäytteistä. Terveiden henkilöiden valkosolujen AGA-aktiivisuukslen kes-15 kiarvo oli 126 pU/mg proteiinia, kun taas AGU-potilaiden valkosolujen AGA-aktiivisuuksien keskiarvo oli 0,03 pU/mg proteiinia. Tulokset on esitetty yksityiskohtaisesti jäljempänä olevassa taulukossa 2. Näytteet 1-6 ovat normaaleja kontrolleja ja näytteet 7-9 AGU-potilaista.

‘ 20 Kuten taulukosta 2 näkyy, keksinnön mukaisella menetel mällä voidaan helposti todeta AGA-entsyymiaktiivisuuden puuttuminen ihmisen valkosoluista.

Taulukko 2.

. 25 Ihmisen valkosolujen AGA-pitoisuudet • <. «.

Näyte nro AGA-pitoisuus (pU/mg proteiinia) 1. 138 2. 96 30 3. 127 4. 162 5. 100 6. 132 7. 0,04 35 8. 0,04 9. 0,00 93861 15

Esimerkki 3

Glykosyyliasparaginaasiaktiivisuuden määritys viljellyistä ihmisen ihon fibroblasteista

Ihmisen fibroblasteja viljeltiin kirjassa Human 5 Cytogenetics - a practical approach, Rooney, D. E. ja Cze-pulkowski, B. H., toira., s. 26 - 31, IRL Press, Oxford, 1989, kuvatulla tavalla. Fibroblastit olivat peräisin as-partyyliglukoosiamiiniuriaa sairastavilta potilailta, joiden AGA-entsyymin geenissä esiintyi kaksi tyypillistä pis-10 temutaatiota, tai terveiltä verrokeilta (normaali AGA-ent-syymi). Fibroblastit eristettiin trypsiinikäsittelyllä ja suspendoitiin 50 mM Tris-HCl-puskuriin, pH 7,5, joka sisälsi 0,2 % Triton X-100:a ja 0,5 mM EDTA:ta, ja käsiteltiin kuten edellä esimerkissä 2 on kuvattu.

15 Glykosyyliasparaginaasiaktiivisuus määritettiin edellä kuvatulla tavalla käyttäen seitsemältä terveeltä vapaaehtoiselta ja neljältä AGU-potilaalta saatuja fibro-blastinäytteitä. Terveiden henkilöiden fibroblastien AGA-aktiivisuuksien keskiarvo oli 46 pU/mg proteiinia, kun 20 taas AGU-potilaiden fibroblastien AGA-aktiivisuuksien keskiarvo oli 0,00 pU/mg proteiinia. Tulokset on esitetty yksityiskohtaisesti jäljempänä olevassa taulukossa 3. Näytteet 1-7 ovat normaaleja kontrolleja ja näytteet 8 -11 AGU-potilaista. Kuten edellä myös taulukosta 3 näkyy, ,-'25 että keksinnön mukaisella menetelmällä voidaan helposti todeta AGA-entsyymin puuttuminen viljellyistä fibroblasteista määrittämällä.

« « 93861 16

Taulukko 3

Viljeltyjen Ihmisen £lbroblastlen AGA-pitoisuudet Näyte nro AGA-pitoisuus (μϋ/mg proteiinia) 5 1. 56 2. 57 3. 76 4. 48 5. 21 10 6. 30 7. 58 8. 0,00 9. 0,00 10. 0,00 15 11. 0,00

Esimerkki 4

Glykosyyliasparaginaasiaktiivisuuden määrittäminen ihmisen seerumista ja plasmasta 20 Glykosyyliasparaglnaasiaktiivisuuden määrittämi seksi seerumi erotettiin hyytymisen jälkeen sentrifugoi-malla (3 000 x G, 10 min). Vastaavasti plasma erotettiin sentrifugoimalla verinäyte, joka oli kerätty EDTA-putkeen. Plasmaa tai seerumia käytettiin glykosyyliasparaginaasiak-:”';25 tiivisuuden määrittämiseen ilman jatkopuhdistusta. Määri tys suoritettiin käyttäen 100 μΐ seerumia tai plasmaa ja 100 μΐ 1 mM AspAMC:tä 50 mM Tri s-HC1-puskurissa, pH 7,5, ja seosta inkuboitiin 4 tuntia 37 eC:ssa. 7-amino-4-metyy-likumariinin vapautuminen mitattiin fluorometrisesti kuten 30 esimerkissä 2.

Ihmisen seerumin ja plasman AGA-pitoisuudet mitattiin viideltä terveeltä vapaaehtoiselta ja kolmelta AGU-potilaalta saaduista seeruminäytteistä. Terveiden henkilöiden seerumin AGA-aktiivisuuksien keskiarvo oli 24 mU/1, 35 kun taas AGU-potilaiden seerumien AGA-aktiivisuuksien kes- 93861 17 kiarvo oli 0,8 mU/1. Vastaavasti samojen terveiden henkilöiden plasman AGA-aktiivlsuukslen keskiarvo oli 21,8 mU/1 ja AGU-potilaiden 0,8 mU/1. Tulokset on esitetty yksityiskohtaisesti jäljempänä olevassa taulukossa 4. Näytteet 1 -5 5 ovat normaaleja kontrolleja ja näytteet 6-8 AGU-poti- lasnäytteitä. Kuten taulukosta 4 näkyy, keksinnön mukaisella menetelmällä voidaan helposti todeta AGA-entsyymiak-tiivlsuuden puuttuminen ihmisen seerumista tai plasmasta.

10 Taulukko 4

Ihmisen seerumin AGA-pitoisuudet Näyte nro AGA-pitoisuus (mU/1)

Seerumi Plasma 15 1. 28 25 2. 23 22 3. 21 19 4. 26 24 5. 22 19 * ' 20 6. 0,5 0,4 7. 1,0 1,5 8. 0,8 0,5

Esimerkki 5 .· 25 Asparaginaasiaktiivisuuden määrittäminen leukemia- potilaiden seerumista L-asparaginaasihoidon aikana

Asparaginaasiaktiivisuuden määrittämiseksi akuuttia lymfaattista leukemiaa (ALL) sairastavalta potilaalta saadusta seeruminäytteestä mitattiin asparaginaasiaktiivisuus 30 esimerkissä 4 glykosyyliasparaginaasille kuvatulla taval-la. Hoidon aikana potilas sai L-asparaginaasi-injektion * · lihakseen 10 päivän ajan päivittäin. 0-näyte otettiin ennen hoidon aloittamista, näyte nro 1 30 minuuttia ensimmäisen injektion jälkeen ja näytteet nro 2-10 juuri en-35 nen seuraavaa injektiota eli 24 tunnin kuluttua edellises- 93861 18 tä lääkeannoksesta. Näyte nro 11 otettiin kuusi päivää hoidon lopettamisesta eli 16 päivää hoidon aloittamisesta. Tulokset on esitetty taulukossa 5, josta näkyy, että ennen hoidon aloittamista potilaan seerumin asparaginaasiaktii-5 visuus (ts. seerumin glykosyyliasparaginaasiaktiivisuus) oli normaalialueella (vrt. taulukko 4). Jo puoli tuntia ensimmäisen L-asparaginaasi-injektion jälkeen voidaan havaita seerumin asparaginaasiaktiivisuuden lisääntyminen. Asparaginaasiaktiivisuus on korkeimmillaan näytteessä 8, 10 jolloin se on lähes kolminkertainen ennen hoitoa olleeseen pitoisuuteen. Kuusi päivää hoidon jälkeen (näyte nro 11) asparaginaasiaktiivisuus on laskemut alle sen arvon, joka saatiin ennen kolmatta hoitokertaa. Keksinnön mukaisella menetelmällä voidaan siis helposti todeta asparaginaasiak-15 tiivisuuden muutokset seerumissa L-asparaginaasihoidon aikana.

Taulukko 5

Asparaginaasiaktiivisuus akuuttia lymfaattista leu-* 20 kemiaa sairastavan potilaan seerumissa L-asparaginaasihoi don aikana Näyte nro S-asparaginaasiaktiivisuus (mU/1) 0. 23 : 25 1. 29 2. 33 3. 43 4. 45 5. 54 30 6. 51 7.

8. 63 9. 57 10. 45 35 11. 40 93861 19

Esimerkki 6

Glykosyyliasparaginaasi- ja asparaginaasiaktiivi-suuden määritys L-Asn-B-NA:ta substraattina käyttäen

Muiden vapaan a-amino- ja α-karboksyyliryhmän si-5 sältävien L-aspartaattijohdannaisten soveltuvuuden osoittamiseksi asparagiini-e-amidohydrolaasien substraatiksi käytettiin 1 mM B-L-asparagiini-B-naftyyliamidiliuosta (Bachem, Sveitsi) 50 mM Tris-HCl-puskurissa, pH 7,5, joka sisälsi 10 mM ditiotreitolia (DTT) ja 3 % N,N-dimetyyli-10 formamidia. Liuokseen lisättiin 280 pg kaupallista Erwina-se-asparaginaasivalmistetta tai 0,25 pg ihmisen valkosoluista puhdistettua glykosyyliasparaginaasia [Kaartinen et ai., J. Biol. Chem. 266 (1991) 5860 - 5869] ja seosta in-kuboitiin neljä tuntia 37 eC:ssa. β-naftyyliamiinin vapau-15 tumista mitattiin fluorometrisesti käyttäen eksikaatiota ja emissiota aallonpituudella 350 nm ja vastaavasti 405 nm [De Lumen, B. 0. ja Tappel, A. L., Anal. Biochem. 48 (1972) 378 - 385] ja keräten mittapisteitä 30 minuutin välein. Taulukossa 6 on esitetty fluoresenssin lisääntymi-‘ ‘ 20 nen inkubaation aikana. Tuloksista on vähennetty fluore-senssiarvot, jotka saatiin vastaavista näytteistä, joissa entsyymi oli korvattu inkubaatiopuskurilla (0-näyte). Sekä asparaginaasia että glykosyyliasparaginaasia sisältävissä putkissa fluoresenssi lisääntyi entsyymien vapauttaessa B-. - 25 naftyyliamiinia tämän β-asparagiinijohdannaisesta, mikä osoittaa yhdisteen soveltuvan asparagiini-B-amidohydro-laasien substraatiksi ja käyttökelpoiseksi näiden entsyymien määrittämiseen.

Edellä kuvattu β-naftyyliamiinin vapautumisen fluo-30 rometrinen määrittäminen voidaan korvata myös spektrofoto-metrisellä mittauksella [Nagätsu, I. et ai., Biochem.

*· · l

Pharmacol. 14 (1965) 853 - 861]. Tällöin inkuboinnin jälkeen reaktio pysäytetään lisäämällä putkeen 1/4 tilavuudesta 1 M asetaattipuskuria, pH 4,2, jossa on 10 % Tween 35 20 -detergenttiä ja 0,5 mg stabilisoitua Fast garnet -di- 93861 20 atsoniumsuolaa. Seosta inkuboldaan 30 minuuttia huoneen lämpötilassa, näytteen absorbanssi mitataan aallonpituudella 525 nm ja vapautuneen naftyyliamiinin määrä määritetään vertaamalla standardikuvaajaan, joka on saatu vastaa-5 valla mittaustavalla käyttäen tunnettuja naftyyliamiini-pitoisuuksia vakioina.

Taulukko 6

Glykosyyliasparaginaasi- ja asparaginaasiaktiivi-10 suuden määritys L-Asn-B-NA substraattina

Aika inkuboinnin alusta (min) Fluoresenssiyksikköjä

Glykosyyliasparaginaasi L-asparaginaasi 30 0 1,8 15 60 0,3 3,5 90 1,5 7,5 120 3,0 11,4 150 2,8 14,2 180 5,8 21,8 20 210 5,5 25,0 240 8,8 32,3 i

Claims (7)

1. 93861
2. 1. Menetelmä asparagiini-B-amidohydrolaasientsyymi-en aktiivisuuden mittaamiseksi biologisista näytteistä, i 5 tunnettu siltä, että näyte saatetaan kosketukseen yhdisteen kanssa, joka sisältää L-asparagllnln 6-amino-ryhmään tai L-aspartaatln 6-karboksyyllryhmään kiinnitettynä luminesoivaa tai värillistä yhdistettä, joka vapautuu näytteessä olevan entsyymin vaikutuksesta, ja määritetään 10 vapautuva yhdiste luminometrlsestl tai fotometrisestl.
3. 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siltä, että glykosyyllasparaginaaslen ja asparaglnaaslen aktiivisuus mitataan saattamalla näyte kosketukseen yhdisteen kanssa,, joka sisältää L-asparagii- 15 nln β-amlnoryhmään tai L-aspartaatln 6-karboksyyllryhmään kiinnitettynä luminesoivan tai värillisen yhdisteen, joka vapautuu näytteessä olevan entsyymin vaikutuksesta, ja määrittämällä vapautuva yhdiste luminometrlsestl tai foto-metrisesti. ‘20 3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että substraattina käytetään fluo-rogeenisen yhdisteen, kuten 7-amino-4-metyylikumariinin, β-metyyliumbelliferonin, fluoreskiinin, 6-naftyyliamiinin, resorufUnin, 6-aminokinoliinin tai resorsinolin, L-aspa-. 25 ragiini- tai L-aspartaattijohdannaista, jossa on vapaa a- amino- ja α-karboksyyliryhmä, ja mittaus tehdään fluoro-metrisesti.
4. 4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että substraattina käytetään vä- 30 rillisen yhdisteen, kuten 6-naftyyliamiinin, L-asparagii-ni- tai L-aspartaattijohdannaista, jossa on vapaa a-amino- ja α-karboksyyliryhmä, ja mittaus tehdään fotomet-risesti.
5. 5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 35 tunnettu siitä, että substraattina käytetään kerni- 93861 lumlnesolvan yhdisteen, kuten D-lusiferiinin tai adaman-tyyli-1,2-dioksetaanin, L-asparagiini- tai L-aspartaat-tijohdannaista, jossa on vapaa α-amino- ja a-karboksyy-liryhmä, ja mittaus tehdään kerniluminometrisesti.
6. 6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että substraattina käytetään L-aspartaatti-B-(7-amido-4-metyylikumariinia) ja mittaus tehdään fluorometrisesti.
7. 7. Testivälineistö, jota käytetään jonkin patent-10 tivaatimuksen 1-6 mukaisessa menetelmässä, tunnet-t u siitä, että se sisältää substraattireagenssin, joka on yhdiste, joka sisältää L-asparagiinin B-aminoryhmään tai L-aspartaatin β-karboksyyliryhmään kiinnitettynä lu-minesoivan tai värillisen yhdisteen, joka vapautuu bio-15 logisessa näytteessä olevan entsyymin vaikutuksesta, ja haluttaessa muita määritysmenetelmän vakiointiin tarvittavia reagensseja. • C ♦ * ’ • € 93861