CN111965352A - 一种新生儿进行性肌营养不良症的筛查试剂盒及其方法 - Google Patents
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Abstract
本发明具体公开了一种适用于新生儿进行性肌营养不良症筛查的双抗体夹心免疫分析法体外诊断试剂，特异性的检测肌酸激酶同工酶CK‑MM。本发明采用滤纸干血片校准品和滤纸干血片样本，不受溶血时红细胞释放出AK的影响，使新生儿进行性肌营养不良症筛查实现普及性，本发明公布的滤纸干血片校准品制作方法，解决校准品的不稳定性，防止了肌酸激酶同工酶和/或亚型被血浆中的羧基肽酶的水解。本发明公布的一种特殊的滤纸干血片样本洗脱液，解决样本检测时待测物的稳定性，减少外界因素干扰。本发明可以早期诊断肌营养不良并采取适宜治疗措施后，可大大延缓病情的进展，提高患者的生活质量，也可避免患者盲目求医而造成的巨大花费。
Description
技术领域
本发明涉及筛查试剂盒制备技术领域，具体涉及一种新生儿进行性肌营养不良症的筛查试剂盒及其方法。
背景技术
进行性肌营养不良症是一组遗传性骨骼肌变性疾病，病理上以骨骼肌纤维变性、坏死为主要特点，临床上以缓慢进行性发展的肌肉萎缩、肌无力为主要表现，部分类型还可累及心脏、骨骼系统。传统上分为假性肥大型肌营养不良(pseudohypertrophic musculardystrophy)、面肩肱型肌营养不良(facioscapulohumeral musculardystrophy,FSHD)、肢带型肌营养不良(limb girdle muscular dystrophy,LGMD)、Emery-Dreifuss肌营养不良、眼咽型肌营养不良(oculopharyngeal muscular dystrophy,OPMD)、眼型肌营养不良、远端型肌营养不良和先天型肌营养不良(congenital muscular dystrophy,CMD)。按照遗传方式可分为性连锁隐性遗传型、常染色体显性遗传和常染色体隐性遗传型。以假肥大型肌营养不良最多见，现在亦被称为抗肌萎缩蛋白缺陷型肌营养不良，又分为Duchenne型(Duchenne muscular dystrophy,DMD)和Becker型(Becker muscular dystrophy,BMD)，前者发病率约为1/3500活产男婴，后者发病率较低，约为1/20000。DMD型是肌营养不良中发病率最高、病情最为严重的一型，常早年致残并导致死亡，故称为“严重型”，几乎所有患者均为男孩，女孩患病极为罕见，多在3岁之后发病，12岁左右不能行走，20岁左右因呼吸肌无力、呼吸道感染，引起呼吸肌衰竭死亡。BMD临床表现与DMD类似，但发病年龄较晚，约为5～15岁，病情较轻，进展速度较慢，12岁以后仍能行走，存活时间较长，部分可接近正常寿命。因此有必要发明一种适用于新生儿进行性肌营养不良症筛查的试剂及其检测程序，早期诊断肌营养不良并采取适宜治疗措施后，可大大延缓病情的进展，提高患者的生活质量，也可避免患者盲目求医而造成的巨大花费。
根据典型病史、遗传方式、阳性家族史、肌肉萎缩无力分布特点，结合血清肌酶升高，肌电图呈肌源性改变，肌肉活检病理为肌营养不良或肌源性改变的特征，多数肌营养不良症可获得临床诊断。进一步确诊或具体分型诊断需要用抗缺陷蛋白的特异性抗体进行肌肉组织免疫组化染色以及基因分析。既往已有的血清肌酶检验包括肌酸激酶、乳酸脱氢酶、肌酸激酶同工酶、天冬氨酸氨基转移酶和丙氨酸氨基转移酶等。DMD时肌酸激酶(creatinekinase,CK)升高显著，可达正常值的20～100倍以上，BMD时可升高5～20倍。在疾病不同阶段，肌酶水平也有变化。早期升高显著，当肌肉萎缩严重达疾病晚期时肌酶水平逐渐下降。LGMD和远端型肌病患者肌酶轻到中度升高，FSHD患者肌酶可正常或轻度增高。目前最常用的是采用CK活性进行筛查新生儿是否罹患DMD或BMD。CK是一种二聚体，由M和B两个亚基，形成CK-MM、CK-MB和CK-BB同工酶。CK-BB存在于脑组织中，CK-MM和CK-MB存在于各种肌肉组织中，不同肌肉组织同工酶的比例不同，骨骼肌中98％～99％是CK-MM，1％～2％是CK-MB；心肌内80％左右也是CK-MM，但CK-MB占心肌总CK的15％～25％。进行性肌营养不良主要以肌型肌酸激酶同工酶(CK-MM)为主，因此CK-MM活性的测定是诊断骨骼肌病较特异的指标，同时可检测出DMD隐形携带者。而CK检测值影响因素很多，如年龄、性别、种族、地域和运动状态等多种因素的影响。目前CK检测主要以生物化学法，如比色法、紫外分光光度法和荧光法等检测，国内外测定CK的参考方法为酶偶联法，CK酶偶联法检测极易受溶血时红细胞内释放出的腺苷酸激酶(AK)和血浆/血清其他酶类物质的影响，虽然试剂厂家会在试剂中加入抑制剂腺苷一磷酸(AMP)或P1,P5-二(腺苷-5')五磷酸五锂盐(DAP)来抑制AK的干扰，但抑制率仅为90％～95％，对正常标本而然，升高5％可视为允许误差，但对极端标本其误差可引起假阳性结果。采用CK酶偶联法在新生儿进行性肌营养不良症筛查中采用血清法极难普及，采用滤纸片法极难实现准确性和稳定性。且DMD患者早期血中CK活性通常很高，但存在巨大差异，其病情与CK活性不一致，在病变晚期CK活性可以不升高，如何界定CK检测值与DMD之间的关系还没有明确标准。因此研发一种经济、操作简便、特异性标志物的试剂用于新生儿进行性肌营养不良症筛查非常必要。
发明内容
本发明公开了一种适用于新生儿进行性肌营养不良症筛查的试剂及其检测程序。该试剂及其检测程序检测为进行性肌营养不良症的特异分析物，该特异分析物为人骨骼肌肌酸激酶同工酶(CK-MM)。
本发明的试剂及其检测程序可以通过以下一种或几种方法实现：1)时间分辨荧光免疫分析法；2)化学发光免疫分析法；3)酶联免疫分析法。
本发明公开了一种适用于新生儿进行性肌营养不良症筛查的试剂的主要成分包括：1)包被有特异性捕获抗体的固相载体；2)滤纸干血片校准品；3)特异性检测抗体标记物；4)样本洗脱液；5)实验缓冲液；6)清洗液以及7)信号转换液，所述信号转换液：包括以下的一种或几种，如底物液、终止液、增强液、发光底物液、发光剂。
根据本发明，为了使发明的试剂及其检测程序具有新生儿筛查普及性，待测样本采用滤纸干血片，并为解决校准品的不稳定性，防止肌酸激酶同工酶和/或亚型被血浆中的羧基肽酶的水解，公布了一种校准品的制作方法，校准品制作包括：1)血浆灭活；2)配制防腐剂和抑制剂；3)红细胞洗涤；4)恢复血浆和红细胞比容；5)配制校准品；6)滴制滤纸干血片；7)干燥、过塑。
根据本发明，为了解决发明的试剂及其检测程序在样本检测时待测物的稳定性，减少外界因素干扰，提高待测物从滤纸干血片中的洗脱能力，提高待测物与捕获抗体的反应特异性和亲和性，公布了一种特殊的滤纸干血片样本洗脱液。样本洗脱液含有缓冲剂、防腐剂、免疫信号增强剂、蛋白质和特异性阻断剂。
作为优选，本发明提供一种适用于新生儿进行性肌营养不良症筛查的试剂检测的是肌酸激酶同工酶(CK-MM)，患有DMD时这些标志物升高显著，可达正常值的20～100倍以上，BMD时可升高5～20倍。因此检测样本时为了避免发生HOOK效应，优选双抗体夹心二步法。
根据本发明，双抗体夹心二步法是通过以下检测程序实现：在捕获抗体固相载体中的相应位置加入校准品或待测样本；孵育；校准品或待测样本中待测物与固相载体上的捕获抗体和检测抗体标记物形成“固相捕获抗体-待测物”复合物；通过洗涤固相载体洗去多余的血液样本其他成分；再加入适量的检测抗体标记物工作液；孵育；固相载体上的“固相捕获抗体-待测物”复合物和检测抗体标记物形成“固相捕获抗体-待测物-检测抗体标记物”复合物；通过洗涤固相载体洗去多余的检测抗体标记物；再通过后续的处理使标记物转化为可测量的信号物质；通过计数器进行检测，分析结果。
本发明采用免疫分析法检测肌酸激酶同工酶CK-MM。进行性肌营养不良症(DMD或BMD)出现时，CK总酶活性显著增高，而以CK-MM为主。CK-MM活性的测定是诊断骨骼肌病较特异的指标，同时可检测出DMD隐形携带者，其特异性强。与CK总酶比较，CK-MM亚型是相对稳定的指标，且CK-MM亚型的改变不受CK总酶活性高低的影响。同时采用免疫法测定CK-MM，克服了CK酶偶联法在诊断进行性肌营养不良症(DMD或BMD)时的局限性，测量时易受多重因素影响，特别检测极易受溶血时红细胞释放出AK的影响。特别是本发明研制了一种特殊的样本洗脱液，可以实现新生儿滤纸片法普及筛查，并提高了检测方法的稳定性和准确性，对可疑患者及早确诊，并采取适宜治疗措施后，可大大延缓病情的进展，提高患者的生活质量，也可避免患者盲目求医而造成的巨大花费。
根据本发明提供的试剂，是一种双抗体夹心免疫分析法的体外诊断试剂。该试剂及其检测程序检测为进行性肌营养不良症的特异分析物，该特异分析物为人骨骼肌肌酸激酶同工酶(CK-MM)。
本发明的试剂及其检测程序可以通过一下一种或几种方法实现：1)时间分辨荧光免疫分析法；2)化学发光免疫分析法；3)酶联免疫分析法。
本发明公开了一种适用于新生儿进行性肌营养不良症筛查的试剂的主要成分包括：1)包被有特异性捕获抗体的固相载体；2)滤纸干血片校准品；3)特异性检测抗体标记物；4)样本洗脱液；5)实验缓冲液；6)清洗液以及7)信号转换液。信号转换液：包括以下的一种或几种，如底物液、终止液、增强液、发光底物液、发光剂。
本发明使用的优势抗体有针对CK-MM的鼠单克隆抗体6811817(IgG2b)、鼠单克隆抗体123125(IgG1)、鼠单克隆抗体M18073101、鼠单克隆抗体18121502、鼠单克隆抗体M52213、鼠单克隆抗体2111851、兔多克隆抗体CR75和山羊多克隆抗体CG75。经过优选实验，优选配对抗体为针对人骨骼肌CK-MM的特异性鼠单克隆抗体M18073101、鼠单克隆抗体18121502。
根据本发明的方法，其中，试剂的主要成分1)所述包被有特异性捕获抗体的固相载体具有以下特点：
将捕获抗体用常规包被缓冲液(可以使用50mmol/L，pH 9.6的碳酸缓冲液、20mmol/L，pH 4.5的磷酸盐缓冲液、50mmol/L，pH 7.8的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液或50mmol/L，pH 4.5的柠檬酸盐缓冲液等)稀释至最适浓度，在固相上进行包被，将固相洗涤1次，然后再用封闭液进行封闭，将固相甩干，晾干，真空包装，2～8℃保存备用。
其中捕获抗体是采用特异性针对人骨骼肌肌酸激酶同工酶(CK-MM)特异性单克隆抗体。捕获抗体的浓度均选择在1～7μg/mL间，最适工作浓度为5μg/mL。CK-MM活性的测定是诊断骨骼肌病较特异的指标，同时可检测出DMD隐形携带者，其特异性强。
根据本发明的方法，其中，试剂的主要成分2)所述滤纸干血片校准品具有以下特点：
将肝素抗凝血浆采用42～60℃灭活1～3h，期间要每隔15min轻轻摇晃一次，使血浆内的CK总酶活性和/或其他酶类活性失活。灭活后在血浆中加入20ppm的硫柳汞和0.01％的叠氮钠作为防腐剂，两种防腐剂可以起到协同保护作用。为防止添加入的校准品原料CK-MM及其亚型被血浆中的残存的羧基肽酶水解降低，进一步提高校准品的稳定性，在血浆中加入苯甲酰精氨酸甲酯、6-氨基己酸的一种或两种作为抑制剂，抑制剂均为浓度为1～5mmol/L。并为了进一步提高校准品的热稳定性和延长有效期，在血浆中加入0.5％～2％的海藻糖。将红细胞用生理盐水洗涤3～5次，去除CK总酶和其他酶类。然后将灭活的血浆和洗涤过的红细胞恢复成50％-55％的血细胞比容的全血。然后将校准品原料加入到以上全血中，形成一系列梯度浓度的校准品，充分混匀，用S&S903采血滤纸作为载体，用磁力搅拌器不断搅匀，用移液器将校准品点加至滤纸上，每个校准品血斑滴加全血量为50μL。滤纸血片经室温自然阴干后过塑。
根据本发明的方法，其中，主要成分3)所述特异性检测抗体标记物具有以下特点：
特异性检测抗体标记物的检测抗体与捕获抗体的位点不同，能与相应的抗原形成双抗体夹心检测，组织特异性检测抗体是采用针对人骨骼肌CK-MM特异性单克隆抗体。
酶联免疫分析法所采用的标记物为辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶(β-Gal)等中的一种或几种。
化学发光免疫分析法所采用的标记物为吖啶酯、碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶等中的一种或几种。
时间分辨荧光免疫分析法所采用的标记物为镧系元素中铕(Eu)、铽(Tb)、钐(Sm)、镝(Dy)的双功能基团结构螯合物的一种或几种。
根据本发明的方法，其中，主要成分4)所述样本洗脱液具有以下特点：
样本洗脱液含有常规的缓冲剂、防腐剂、免疫信号增强剂、蛋白质和特异性阻断剂。
其中缓冲液为50mmol/L，pH 7.8的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液；
防腐剂为0.02％(v/v)的
和20ppm的硫柳汞；
免疫信号增强剂为SignalBoostTM免疫信号增强剂、聚乙二醇(PEG)6 000中的一种或两种。SignalBoostTM免疫信号增强剂的使用量为20％～40％(v/v)。聚乙二醇(PEG)6 000的使用量为0.05％～0.2％(m/v)。SignalBoostTM免疫信号增强剂具有降低信噪比、加速抗原抗体反应，提高低丰度蛋白的检测成功率。聚乙二醇(PEG)6 000能提高抗原与抗体的反应性。
蛋白质为小鼠血清(0.1％，v/v)、小牛血清(10％，v/v)、γ-牛球蛋白(0.5％，m/v)和牛血清白蛋白(5％，m/v)的一种或几种。
特异性阻断剂为针对人抗鼠抗体和类风湿因子等异嗜性抗体干扰的TRU BlockTM阻断剂，以及防止肌酸激酶同工酶和/或亚型被血浆中羧基肽酶水解的抑制剂苯甲酰精氨酸甲酯、6-氨基己酸和乙二胺四乙酸二钠的一种或几种，以及防止杂蛋白非特异吸附的吐温40或吐温20。TRU BlockTM阻断剂的使用浓度为5～20mg/mL，苯甲酰精氨酸甲酯、6-氨基己酸浓度为1～5mmol/L，乙二胺四乙酸二钠使用浓度为0.001％(v/v)，吐温40或吐温20的使用浓度为0.04％～0.08％(v/v)。
根据本发明的方法，其中，主要成分5)所述实验缓冲液具有以下特点：
实验缓冲液含有常规的缓冲剂、防腐剂、免疫信号增强剂、蛋白质和螯合剂。
其中缓冲液为三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液；
防腐剂为0.02％(v/v)的
和20ppm的硫柳汞；
免疫信号增强剂为SignalBoostTM免疫信号增强剂、聚乙二醇(PEG)6 000中的一种或两种。SignalBoostTM免疫信号增强剂的使用量为20％～40％(v/v)。聚乙二醇(PEG)6 000的使用量为0.05％～0.2％(m/v)。SignalBoostTM免疫信号增强剂具有降低信噪比、加速抗原抗体反应，提高低丰度蛋白的检测成功率，降低检测抗体标记物的使用量。聚乙二醇(PEG)6 000能提高抗原与抗体的反应性。
蛋白质为小鼠血清(0.1％，v/v)、小牛血清(10％，v/v)、γ-牛球蛋白(0.5％，m/v)和牛血清白蛋白(5％，m/v)的一种或几种。
螯合剂为去除影响反应的金属离子的乙二胺四乙酸二钠，乙二胺四乙酸二钠使用浓度为0.001％(v/v)。
根据本发明的方法，其中，主要成分6)所述清洗液具有以下特点：
清洗液为含有1.125g/L的氯化钠、0.2mL/L的吐温-20、30ppm的
防腐剂的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液。
根据本发明的方法，其中，主要成分7)所述信号转换液具有以下特点：
时间分辨荧光免疫法分析法使用的增强液：含曲拉通、冰乙酸、螯合剂、纯化水。
化学发光免疫分析法使用的发光底物液：含有底物液A和底物液B，其中底物液A含鲁米诺和对碘苯酚溶液，底物液B含有过氧化脲溶液。
化学发光免疫分析法使用的发光底物液：含有底物液A和底物液B，其中底物液A含鲁米诺衍生物溶液，底物液B含有过氧化氢(H2O2)溶液。
化学发光免疫分析法使用的发光剂：含有甲氧基-4-9-3苯磷酸(AMPPD)溶液。
化学发光免疫分析法使用的发光剂：含有氧化剂过氧化氢(H2O2)溶液和pH纠正液NaOH溶液。
酶联免疫分析法使用的底物液和终止液：含有底物液A和底物液B，其中底物液A含有过氧化氢(H2O2)溶液，底物液B含有邻苯二胺(OPD)溶液。终止液含有稀硫酸溶液。
酶联免疫分析法使用的底物液和终止液：含有底物液A和底物液B，其中底物液A含有过氧化氢(H2O2)溶液，底物液B含有四甲基联苯胺(TMB)溶液。终止液含有稀硫酸溶液。
酶联免疫分析法使用的底物液和终止液：底物液含有对硝基苯磷酸盐溶液。终止液含有稀硫酸溶液。
酶联免疫分析法使用的底物液：底物液含有4-甲基伞形酮-β-D-半乳糖苷(4-MUG)溶液。
根据本发明提供的一种适用于新生儿进行性肌营养不良症筛查检测程序：
(1)临床宣教、知情同意
医疗保健机构的医务人员在实施新生儿疾病筛查前，项新生儿监护人介绍进行性肌营养不良症筛查的有关规定、筛查目的、意义、费用、疾病的发病原因、筛查方法、疾病对儿童生长发育的危害性及早期诊断对改善预后的重要性等，及时解答其咨询。医生所提供的信息必须得到新生儿监护人的正确理解，监护人自愿参与新生儿疾病筛查，并在知情同意书上签字，方可进行新生儿疾病筛查样本的采集。
(2)滤纸干血片样本的采集
采集步骤如下：
1)新生儿出生后5～8天进行采血。
2)血片采集人员清洗双手并佩戴无菌、无滑石粉的手套。
3)按摩或热敷新生儿足跟，并用75％乙醇消毒皮肤。
4)待乙醇完全挥发后，使用一次性采血针刺足跟内侧或外侧，深度小于3mm，用干棉球拭去第1滴血，从第2滴血开始取样。
5)将滤纸片接触血滴，切勿触及足跟皮肤，使血液自然渗透至滤纸背面，避免重复滴血，至少采集3个血斑(直径需大于8mm)。
6)手持消毒干棉球轻压采血部位止血。
7)将血片悬空平置，自然晾干呈深褐色。避免阳光及紫外线照射、烘烤、挥发性化学物质等污染。
8)及时将检查合格的滤纸干血片置于密封袋内，密闭保存在2～8℃冰箱中，有条件者可0℃以下保存。
9)所有血片应当按照血源性传染病标本对待，对特殊传染病标本，如艾滋病等应当作标识并单独包装。
(3)试剂准备
1)捕获抗体固相载体：将试剂及所需数量的捕获抗体固相载体平衡至室温(20～25℃)。余下的捕获抗体固相载体及时置入自封袋密闭并于2～8℃保存。
2)清洗工作液：将清洗液和纯化水按适当比例在干净的容器中混合，作为清洗工作液备用。
3)检测抗体标记物工作液：使用前30min内配制，将检测抗体标记物与实验缓冲液按适当比例加进洁净的一次性容器中并混匀；当次实验用完。
(4)检测步骤
1)用全自动板钉打孔法或手工打孔法将滤纸校准品、质量控制品和滤纸干血片样本打下直径约3.0mm样品盘依次放入捕获抗体固相载体中，向固相载体的每个反应位中加入200μL的样本洗脱液。
2)固相载体在室温下，振荡孵育120min。或者固相载体在室温下振荡15min，再在2～8℃条件下静置过夜孵育(20±2h)，然后室温条件下振荡60min。
3)第一步孵育结束后，弃去滤纸干血片，并用清洗工作液洗涤4次。
4)向每个反应位中加入200μL已配好的标记物工作液。
5)在室温下，振荡孵育60min。
6)第二步孵育结束后，用清洗工作液洗涤6次。
7)向每个反应位中依次加入适量的信号转换液。
8)固相载体于室温下振荡5min后检测，在30min内完成检测并进行分析。
(5)结果分析
根据CK-MM结果的高低决定样本复查，如CK-MM结果大于筛查截断参考值(200IU/L)，就对该样本重复检测2次，结合3次结果的平均值决定是否随访监测，如高于监测截断参考值(250IU/L)，应对该新生儿检测随访6～8周，如果检测过程，CK-MM结果持续升高，该新生儿患有进行性肌营养不良症(DMD或BMD)的可能性大，建议做进一步的确诊实验，做出治疗方案，此过程中可结合CK-MM亚型CK-MM3、CK-MM2、CK-MM1结果对病程、判断病情及治疗预后进行判断。
本发明的优点：
本发明提供了一种适用于新生儿进行性肌营养不良症筛查的双抗体夹心免疫分析法体外诊断试剂，特异性的检测肌酸激酶同工酶CK-MM。CK-MM活性的测定是诊断骨骼肌病较特异的指标，同时可检测出DMD隐形携带者，和/或通过CK-MM亚型的测定可为判定进行性肌营养不良症(DMD或BMD)患者的病情变化提供有价值的信息，其特异性强。本发明采用滤纸干血片校准品和滤纸干血片样本，不受溶血时红细胞释放出AK的影响，使新生儿进行性肌营养不良症筛查实现普及性，本发明公布的滤纸干血片校准品制作方法，解决校准品的不稳定性，防止了肌酸激酶同工酶和/或亚型被血浆中的羧基肽酶的水解。本发明公布的一种特殊的滤纸干血片样本洗脱液，解决样本检测时待测物的稳定性，减少外界因素干扰，提高待测物从滤纸干血片中的洗脱能力，提高待测物与捕获抗体的反应特异性和亲和性，防止了肌酸激酶同工酶和/或亚型被血浆中的羧基肽酶的水解，避免了以往酶偶联法检测CK的极易受外界的干扰影响，也解决采用CK酶偶联法在新生儿进行性肌营养不良症筛查中采用血清法极难普及，采用滤纸片法极难实现准确性和稳定性问题。本发明采用双抗体夹心二步法避免检测样本时发生HOOK效应。以往DMD患者病情与CK活性不一致，且如何界定CK检测值与DMD之间的关系还没有明确标准。采用一种适用于新生儿进行性肌营养不良症筛查的试剂检测特异性的检测骨骼肌CK-MM，并建立了其检测程序，可以早期诊断肌营养不良并采取适宜治疗措施后，可大大延缓病情的进展，提高患者的生活质量，也可避免患者盲目求医而造成的巨大花费。
附图说明
图1为本发明CK-MM检测剂量-反应曲线
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1
一种适用于新生儿进行性肌营养不良症筛查的肌酸激酶同工酶(CK-MM)测定试剂(时间分辨荧光免疫分析法)的抗体配对检测效果：
从以上结果可得鼠单克隆抗体M18073101与M18121502配对，与CK-MM反应性达100％，敏感性强；与CK-MB、CK-BB的反应性低，特异性强；线性范围宽。
实施例2
一种适用于新生儿进行性肌营养不良症筛查的肌酸激酶同工酶(CK-MM)测定试剂(时间分辨荧光免疫分析法)组分包括：
捕获抗体固相载体：包被有人骨骼肌CK-MM单克隆抗体5μg/mL；
校准品：滤纸干血片校准品含有6个A、B、C、D、E、F浓度点，校准品A为零浓度，校准品B、C、D、E、F含有系列浓度梯度的肌酸磷酸激酶；校准品溯源至标准物质GBW09167。A、B、C、D、E、F浓度分别为0,20,100,500,2500,10 000IU/mL。
检测抗体标记物：铕标记人骨骼肌CK-MM单克隆抗体。
样本洗脱液：50mmol/L，pH 7.8的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液中含有0.02％(v/v)的
20ppm的硫柳汞、30％(v/v)的SignalBoostTM免疫信号增强剂、0.1％(m/v)的PEG6 000、0.1％(v/v)的小鼠血清、10％(v/v)的小牛血清、10mg/mL的TRU BlockTM阻断剂、2mmol/L的苯甲酰精氨酸甲酯、0.001％(m/v)的乙二胺四乙酸二钠、0.0625％(v/v)吐温40。
实验缓冲液：50mmol/L，pH 7.8的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液中含有0.02％(v/v)的
20ppm的硫柳汞、30％(v/v)的SignalBoostTM免疫信号增强剂、0.1％(m/v)的PEG6 000、10％(v/v)的小牛血清、0.001％(m/v)的乙二胺四乙酸二钠、0.0625％(v/v)吐温20。
浓缩洗液：含有1.125g/L的氯化钠、0.2mL/L的吐温-20、30ppm的
防腐剂的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液。
增强液：含曲拉通、冰乙酸、螯合剂、纯化水。
实施例3
以上实施例2的肌酸激酶同工酶(CK-MM)测定试剂(时间分辨荧光免疫分析法)的具体操作如下：
1.试剂准备
1)捕获抗体固相载体：将试剂及所需数量的捕获抗体固相载体平衡至室温(20～25℃)。余下的捕获抗体固相载体及时置入自封袋密闭并于2～8℃保存。
2)清洗工作液：将清洗液和纯化水按1:25加入干净的容器中混合，作为清洗工作液备用。
3)检测抗体标记物工作液：使用前30min内配制，将检测抗体标记物与实验缓冲液按1:1 200加进洁净的一次性容器中并混匀；当次实验用完。
2.检测步骤
1)用全自动板钉打孔法或手工打孔法将滤纸校准品、质量控制品和滤纸干血片样本打下直径约3.0mm样品盘依次放入捕获抗体固相载体中，向固相载体的每个反应位中加入200μL的样本洗脱液。
2)固相载体在室温下，振荡孵育120min。或者固相载体在室温下振荡15min，再在2～8℃条件下静置过夜孵育(20±2h),再在室温条件下振荡反应60min。
3)第一步孵育结束后，弃去滤纸干血片，并用清洗工作液洗涤4次。
4)向每个反应位中加入200μL已配好的标记物工作液。
5)在室温下，振荡孵育60min。
6)第二步孵育结束后，用清洗工作液洗涤6次。
7)向每个反应位中依次加入增强液200μL。
8)固相载体于室温下振荡5min后检测，在30min内完成检测并进行分析。
实施例4
以上实施例2的肌酸激酶同工酶(CK-MM)测定试剂(时间分辨荧光免疫分析法)的性能评价指标如下：
(1)最低检出限：优于0.5IU/L。
(2)检测范围：3～10 000IU/L。
(3)批内精密度：高、中、低值质控品批内精密度CV＜8％(n＝10)。
(4)批间精密度：3批次试剂检测中值质控品的批间精密度CV＜10％(n＝30)。
(5)准确度：校准品范围内，检测企业参考品的实测值与理论值偏倚在±10％范围内。
(6)HOOK效应：检测1 000 000IU/L的高值样本，检测发光值仍高于校准品10000IU/L的发光值。
(7)稳定性：试剂在2～8℃保存有效期不低于12个月，滤纸干血片样本结果最佳稳定期为30天。
(8)检测了90份正常新生儿的滤纸干血片样本，CK-MM浓度在1.69～216.11IU/L间，均值为48.92±29.25IU/L，95％的百分位数为123.86IU/L，99％的百分位数为177.61IU/L。
(9)剂量反应曲线：采用LIN-MEAS轴变换，SPLINE算法拟合分析，剂量反应曲线的相关系数r可达到1，如附图1。
实施例5
一种适用于新生儿进行性肌营养不良症筛查的肌酸激酶同工酶(CK-MM)测定试剂(化学发光免疫分析法)组分包括：
捕获抗体固相载体：包被有人骨骼肌CK-MM单克隆抗体，包被浓度为2μg/mL；
校准品：滤纸干血片校准品含有6个A、B、C、D、E、F浓度点，校准品A为零浓度，校准品B、C、D、E、F含有系列浓度梯度的CK-M重组抗原；校准品溯源至标准物质GBW09167。CK-MM校准品A、B、C、D、E、F浓度分别为0,20,100,500,2 500,10 000IU/mL。
检测抗体标记物：辣根过氧化物酶标记人骨骼肌CK-MM单克隆抗体。
样本洗脱液：50mmol/L，pH 7.8的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液中含有0.02％(v/v)的
20ppm的硫柳汞、40％(v/v)的SignalBoostTM免疫信号增强剂、0.2％(m/v)的PEG6 000、0.1％(v/v)的小鼠血清、10％(v/v)的小牛血清、20mg/mL的TRU BlockTM阻断剂、5mmol/L的苯甲酰精氨酸甲酯、0.001％(m/v)的乙二胺四乙酸二钠、0.08％(v/v)吐温40。
实验缓冲液：50mmol/L，pH 7.8的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液中含有0.02％(v/v)的
20ppm的硫柳汞、40％(v/v)的SignalBoostTM免疫信号增强剂、0.2％(m/v)的PEG6 000、5％(m/v)的牛血清白蛋白、0.1％(v/v)的小鼠血清、0.001％(m/v)的乙二胺四乙酸二钠、0.0625％(v/v)的吐温20。
浓缩洗液：含有1.125g/L的氯化钠、0.2mL/L的吐温-20、30ppm的
防腐剂的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液。
发光底物液：发光底物A液含鲁米诺和对碘苯酚溶液；发光底物B液含过氧化脲溶液。
实施例6
以上实施例5的肌酸激酶同工酶(CK-MM)测定试剂(化学发光免疫分析法)的具体操作如下：
1.试剂准备
1)捕获抗体固相载体：将试剂及所需数量的捕获抗体固相载体平衡至室温(20～25℃)。余下的捕获抗体固相载体及时置入自封袋密闭并于2～8℃保存。
2)清洗工作液：将清洗液和纯化水按1:25加入干净的容器中混合，作为清洗工作液备用。
3)检测抗体标记物工作液：使用前30min内配制，将检测抗体标记物分别与实验缓冲液均按1:3 000加进不同洁净的一次性容器中并混匀；当次实验用完。
2.检测步骤
1)用全自动板钉打孔法或手工打孔法将滤纸校准品、质量控制品和滤纸干血片样本打下直径约3.0mm样品盘依次放入捕获抗体固相载体中，向固相载体的每个反应位中加入200μL的样本洗脱液。
2)固相载体在室温下，振荡孵育120min。或者固相载体在室温下振荡15min，再在2～8℃条件下静置过夜孵育(20±2h),再在室温条件下振荡反应60min。
3)第一步孵育结束后，弃去滤纸干血片，并用清洗工作液洗涤4次。
4)向包被有CK-MM单克隆抗体的反应位中加入200μL已配好的CK-MM标记物工作液。
5)在室温下，振荡孵育60min。
6)第二步孵育结束后，用清洗工作液洗涤6次。
7)每孔依次加入发光液A、发光液B各100μL，轻振混匀，室温避光放置5min，测发光值。
8)仪器软件自动计算测定结果并形成检测报告。
实施例7
以上实施例5的肌酸激酶同工酶(CK-MM)测定试剂(化学发光免疫分析法)的性能评价指标如下：
最低检出限：优于0.78IU/L。
检测范围：3～10 000IU/L。
批内精密度：高、中、低值质控品批内精密度CV＜8％(n＝10)。
批间精密度：3个批次的试剂盒检测中值质控品批间精密度CV＜10％(n＝30)。
准确度：校准品范围内，检测企业参考品的实测值与理论值偏倚在±10％范围内。
实施例8
一种适用于新生儿进行性肌营养不良症筛查的肌酸激酶同工酶(CK-MM)测定试剂(酶联免疫分析法)组分包括：
捕获抗体固相载体：包被有人骨骼肌CK-MM单克隆抗体，包被浓度为4μg/mL；
校准品：滤纸干血片校准品含有6个A、B、C、D、E、F浓度点，校准品A为零浓度，校准品B、C、D、E、F含有系列浓度梯度的CK-M重组抗原；校准品溯源至标准物质GBW09167。CK-MM校准品A、B、C、D、E、F浓度分别为0,20,100,500,2 500,10 000IU/mL。
检测抗体标记物：辣根过氧化物酶标记人骨骼肌CK-MM单克隆抗体。
样本洗脱液：50mmol/L，pH 7.8的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液中含有0.02％(v/v)的
20ppm的硫柳汞、20％(v/v)的SignalBoostTM免疫信号增强剂、0.2％(m/v)的PEG6 000、0.1％(v/v)的小鼠血清、5％(m/v)的牛血清白蛋白、20mg/mL的TRUBlock TM阻断剂、2mmol/L的苯甲酰精氨酸甲酯、2mmol/L的6-氨基己酸、0.001％(m/v)的乙二胺四乙酸二钠、0.08％(v/v)吐温40。
实验缓冲液：50mmol/L，pH 7.8的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液中含有0.02％(v/v)的
20ppm的硫柳汞、20％(v/v)的SignalBoostTM免疫信号增强剂、0.05％(m/v)的PEG6 000、10％(v/v)的小牛血清、0.001％(m/v)的乙二胺四乙酸二钠、0.04％(v/v)吐温20。
浓缩洗液：含有1.125g/L的氯化钠、0.2mL/L的吐温-20、30ppm的
防腐剂的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液。
底物液：含底物液A氧化剂H2O2溶液溶液和底物液B邻苯二胺(OPD)溶液。
终止液：含有稀硫酸溶液。
实施例9
以上实施例8的肌酸激酶同工酶(CK-MM)测定试剂(酶联免疫分析法)的具体操作如下：
1.试剂准备
1)捕获抗体固相载体：将试剂及所需数量的捕获抗体固相载体平衡至室温(20～25℃)。余下的捕获抗体固相载体及时置入自封袋密闭并于2～8℃保存。
2)清洗工作液：将清洗液和纯化水按1:25加入干净的容器中混合，作为清洗工作液备用。
3)检测抗体标记物工作液：使用前30min内配制，将检测抗体标记物分别与实验缓冲液均按1:3 000加进不同洁净的一次性容器中并混匀；当次实验用完。
2.检测步骤
1)用全自动板钉打孔法或手工打孔法将滤纸校准品、质量控制品和滤纸干血片样本打下直径约3.0mm样品盘依次放入捕获抗体固相载体中，向固相载体的每个反应位中加入200μL的样本洗脱液。
2)固相载体在室温下，振荡孵育120min。或者固相载体在室温下振荡15min，再在2～8℃条件下静置过夜孵育(20±2h),再在室温条件下振荡反应60min。
3)第一步孵育结束后，弃去滤纸干血片，并用清洗工作液洗涤4次。
4)向包被有CK-MM单克隆抗体的反应位中加入200μL已配好的CK-MM标记物工作液。
5)在室温下，振荡孵育60min。
6)第二步孵育结束后，用清洗工作液洗涤6次。
7)每孔依次加入底物液A和底物液B各50μL，轻振混匀，室温避光放置5min，然后加入终止液50μL，测发光值。
8)仪器软件自动计算测定结果并形成检测报告。
实施例10
一种干血滤纸片的样本洗脱试剂用于新生儿促甲状腺激素滤纸干血片的洗脱检测，其组分如下：50mmol/L，pH 7.8的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液中含有0.02％(v/v)的
20ppm的硫柳汞、30％(v/v)的SignalBoostTM免疫信号增强剂、0.1％(m/v)的PEG6 000、0.1％(v/v)的小鼠血清、10％(v/v)的小牛血清、10mg/mL的TRU Block TM阻断剂、2mmol/L的苯甲酰精氨酸甲酯、0.001％(m/v)的乙二胺四乙酸二钠、0.0625％(v/v)吐温40。
新生儿促甲状腺激素滤纸干血片的洗脱检测方法为：
1)加入校准品、质控品、待测样本：用打孔器从Neo TSH血片校准品、质控品以及待测样本的滤纸圆斑上打下直径为3mm(1/8inch)的校准品、质控品以及待测样本(打下纸片须被血液浸透)，并依次放置于微孔反应板中，每孔一片。控制打孔的一致性，使纸片尽量一致。
2)加入标记物工作液：向每孔中加入150μL已用样本洗脱试剂配制好的标记物工作液，并加贴封片。
3)孵育：微孔反应板条在室温下，先用振荡器快速振荡15分钟，在2～8℃静置过夜，第二天再于室温下缓慢振荡孵育30分钟(此为过夜孵育法)；或者用振荡器快速振荡15分钟，然后再室温下缓慢振荡2小时(此为快速孵育法)。
4)洗板：孵育结束后，吸取滤纸片，用洗板机洗涤6次，拍干。
5)加入发光(显色)液：洗涤完成后，向每孔中加入发光(显色)液150μL。
6)检测：微孔反应板条于室温下缓慢振荡10分钟后上机检测。
新生儿促甲状腺激素滤纸干血片的洗脱检测方法的分析性能为：
1)灵敏度：试剂盒的灵敏度不高于1.0μIU/mL。
2)特异性：用黄体生成素(hLH)250U/L进行检测，测得表观TSH浓度不高于1.0μIU/mL。用促卵泡激素(hFSH)250U/L进行检测，测得表观TSH浓度不高于1.0μIU/mL。用绒毛膜促性腺激素(hCG)10000U/L进行检测，测得表观TSH浓度不高于1.0μIU/mL。
3)线性相关系数：试剂(盒)的线性范围(1μIU/mL～260μIU/mL)内的线性达到以下要求：a)线性相关系数r≥0.990；b)检测浓度＜50μIU/mL的TSH纸片时，线性的绝对偏差在±5μIU/mL范围内；检测浓度≥50μIU/mL的TSH纸片时，线性相对偏差不超过±8％。
4)测量准确度：
①校准品不精密度(均一性)：试剂盒校准品(A点除外)B点、C点的不精密度(CV)不超过15.0％；D点、E点、F点的不精密度(CV)不超过10.0％。
②质控品不精密度(均一性)：试剂盒质控品的不精密度(CV)不超过10.0％。
③批内不精密度：试剂盒的批内不精密度(CV)不超过10.0％；
④批间不精密度：试剂盒的批间不精密度(CV)不超过15.0％。
5)质控品的测定值：测定试剂盒内的质控品，测定结果在允许范围内。
6)HOOK效应：检测TSH浓度为1000μIU/mL时，其荧光值仍高于最高点标准品的荧光值。
实施例11
一种干血滤纸片的样本洗脱试剂用于新生儿17α-羟孕酮滤纸干血片的洗脱检测，其组分如下：
50mmol/L，pH 7.8的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液中含有0.02％(v/v)的
20ppm的硫柳汞、40％(v/v)的SignalBoostTM免疫信号增强剂、0.2％(m/v)的PEG6 000、0.1％(v/v)的小鼠血清、10％(v/v)的小牛血清、20mg/mL的TRU Block TM阻断剂、5mmol/L的苯甲酰精氨酸甲酯、0.001％(m/v)的乙二胺四乙酸二钠、0.08％(v/v)吐温40。
新生儿17α-羟孕酮滤纸干血片的洗脱检测方法为：
1)加入校准品、质控品、待测样本：用打孔钳从17α-羟孕酮校准品、质控品或者待测样本的滤纸干血片圆斑上打下直径为3mm(1/8inch)的校准品、质控品或者样本(打下纸片须被血液浸透)，并依次放置于微孔反应板中，每孔一片。控制打孔的一致性，使纸片尽量一致。
2)加抗体工作液：向微孔反应板每孔中加入已用样本洗脱试剂配好的抗体工作液100μL，并加贴封片。
3)第一步孵育：微孔反应板条在室温下，用振荡器缓慢振荡孵育5min(最长15min)。
4)加入铕标记物工作液：向每孔中加入100μL已用样本洗脱试剂配好的铕标记物工作液。
5)第二步孵育：过夜孵育法：微孔反应板条在室温下，用振荡器缓慢振荡孵育10min后，再2℃～8℃静置过夜(20±2h)；快速孵育法：微孔反应板条在室温下，用振荡器缓慢振荡孵育10min后，室温下静置1.5h(温度不高于37℃)。
6)洗板：第二步孵育结束后，弃掉滤纸片，用洗板机洗涤6次，拍干。
7)加入发光(显色)液：向每孔中加入发光(显色)液200μL。
8)检测：微孔反应板条于室温下缓慢振荡5min后上机检测。
新生儿17α-羟孕酮滤纸干血片的洗脱检测方法的分析性能为：
1)空白限：不高于1.83nmol/L。
2)特异性：分别测定不含17α-羟孕酮的结构类似物：雌二醇(11 000.0nmol/L)、睾酮(3 350.0nmol/L)、孕酮(6 880.0nmol/L)和雌三醇(800.0nmol/L)制备的滤纸干血片样本，其交叉反应率不高于2.0％。
3)线性：在约2.0～250.0nmol/L，线性相关系数r不小于0.9900。
4)准确度：检测企业校准品，实测值与标示值的相对偏差不大于±10％。
5)质控品测定值：检测试剂盒内的低、中、高浓度质控品，测定结果在允许范围内。
6)重复性：分别重复检测低、中、高浓度质控品各10次，批内变异系数(CV)不高于10.0％。
7)批间差：采用3个批号的试剂盒，分别重复检测低、中、高浓度质控品各10次，批间变异系数(CV)不高于15.0％。
实施例12
一种干血滤纸片的样本洗脱试剂用于产前筛查甲胎蛋白滤纸干血片的洗脱检测，其组分如下：
50mmol/L，pH 7.8的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液中含有0.02％(v/v)的
20ppm的硫柳汞、20％(v/v)的SignalBoostTM免疫信号增强剂、0.2％(m/v)的PEG6 000、0.1％(v/v)的小鼠血清、5％(m/v)的牛血清白蛋白、20mg/mL的TRU Block TM阻断剂、2mmol/L的苯甲酰精氨酸甲酯、2mmol/L的6-氨基己酸、0.001％(m/v)的乙二胺四乙酸二钠、0.08％(v/v)吐温40。
产前筛查甲胎蛋白滤纸干血片的洗脱检测方法为：
1)加入校准品、质控品、待测样本：用打孔钳从甲胎蛋白校准品、质控品或者待测样本的滤纸干血片圆斑上打下直径为3mm(1/8inch)的校准品、质控品或者样本(打下纸片须被血液浸透)，并依次放置于微孔反应板中，每孔一片。控制打孔的一致性，使纸片尽量一致。
2)加入标记物工作液：向每孔中加入200μL已用样本洗脱试剂配好的标记物工作液，并加贴封片。
3)孵育：微孔反应板条在室温下，用振荡器缓慢振荡孵育30分钟。
4)洗板：孵育结束后，用洗板机洗涤6次，拍干。
5)加入发光(显色)液：洗涤完成后，向每孔中加入发光(显色)液100μL。
6)检测：微孔反应板条于室温下缓慢振荡5分钟后上机检测。
产前筛查甲胎蛋白滤纸干血片的洗脱检测方法的分析性能为：
1)最低检测限：试剂盒的最低检测限不高于0.8U/mL。
2)特异性：用CEA 500ng/mL进行检测，测得表观hAFP浓度不高于0.8U/mL。用白蛋白(ALB)100mg/L进行检测，测得表观hAFP浓度不高于0.8U/mL。至少检测10份孕妇以外的正常血清，检测结果均不高于20.0ng/mL(16.53U/mL)。
3)线性相关系数：试剂(盒)的线性范围(1.0U/mL～500U/mL)内的线性应符合如下要求：a)线性相关系数r≥0.990；b)检测浓度＜50U/mL的AFP时，线性的绝对偏差在±5U/mL范围内；检测浓度≥50U/mL的AFP时，线性相对偏差不超过±8％。
4)测量准确度：在试剂盒的线性区间内，制备2个不同浓度的国家标准品作为样品进行检测，测定值与靶值的相对偏差不超过±8.0％。
5)测量精密度：
①分析内精密度：在试剂盒的线性范围内，设置3个不同浓度的质控品，检测结果的变异系数不高于8.0％。
②分析间精密度：在试剂盒的线性范围内，设置3个不同浓度的质控品，检测结果的变异系数不高于10.0％。
③批间不精密度：在试剂盒的线性范围内，设置3不同浓度的质控品，试剂盒的批间不精密度(CV)不超过15.0％。
6)质控品测定值：在试剂盒的线性范围内，设置3个不同浓度的质控品，测定结果在质控品测定值允许范围内。
7)HOOK效应：检测浓度为5000U/mL的hAFP时，其荧光值仍高于最高点校准品的荧光值。
实施例13
一种干血滤纸片的样本洗脱试剂用于产前筛查游离β-绒毛膜促性腺激素滤纸干血片的洗脱检测，其组分如下：
50mmol/L，pH 7.8的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液中含有0.02％(v/v)的
20ppm的硫柳汞、20％(v/v)的SignalBoostTM免疫信号增强剂、0.2％(m/v)的PEG6 000、0.1％(v/v)的小鼠血清、5％(m/v)的牛血清白蛋白、20mg/mL的TRU Block TM阻断剂、2mmol/L的苯甲酰精氨酸甲酯、2mmol/L的6-氨基己酸、0.001％(m/v)的乙二胺四乙酸二钠、0.08％(v/v)吐温40。
产前筛查游离β-绒毛膜促性腺激素滤纸干血片的洗脱检测方法为：
1)加入校准品、质控品、待测样本：用打孔钳从游离β-绒毛膜促性腺激素校准品、质控品或者待测样本的滤纸干血片圆斑上打下直径为3mm(1/8inch)的校准品、质控品或者样本(打下纸片须被血液浸透)，并依次放置于微孔反应板中，每孔一片。控制打孔的一致性，使纸片尽量一致。
2)加入标记物工作液：向每孔中加入200μL已用样本洗脱试剂配好的标记物工作液，并加贴封片。
3)孵育：微孔反应板条在室温下，用振荡器缓慢振荡孵育30分钟。
4)洗板：孵育结束后，用洗板机洗涤6次，拍干。
5)加入发光(显色)液：洗涤完成后，向每孔中加入发光(显色)液100μL。
6)检测：微孔反应板条于室温下缓慢振荡5分钟后上机检测。
产前筛查游离β-绒毛膜促性腺激素滤纸干血片的洗脱检测方法的分析性能为：
1)最低检测限：试剂盒的最低检测限不高于0.1ng/mL。
2)特异性：500μU/mL促甲状腺激素(hTSH)的表观Fβ-hCG浓度不高于0.25ng/mL；250U/L黄体生成素(hLH)的表观Fβ-hCG浓度不高于0.25ng/mL；250U/L促卵泡激素(hFSH)的表观Fβ-hCG浓度不高于0.25ng/mL；1000U/L绒毛膜促性腺激素(hCG)的表观Fβ-hCG浓度不高于2.0ng/mL。
3)线性范围：试剂(盒)的线性范围(2～200)ng/mL内的线性达到以下要求：a)线性相关系数r≥0.990；b)检测浓度＜10ng/mL的Fβ-hCG时，线性的绝对偏差的绝对值在1.5ng/mL的范围内；检测浓度≥10ng/mL的Fβ-hCG时，线性相对偏差的绝对值≤8％。
4)测量准确度：试剂盒内校准品与相应浓度的绒毛膜促性腺激素β亚单位国家(或国标)标准品同时进行分析测定，用双对数或其他适当的数学模型拟合，要求两条剂量-反应曲线不显著偏离平行；以人绒毛膜促性腺激素β亚单位国家标准品为对照品，试剂盒内校准品的实测值与标示值的效价比应在0.900～1.100之间。
5)测量不精密度
①批内不精密度：试剂盒的批内不精密度(CV)不超过8.0％。
②批间不精密度：试剂盒的批间不精密度(CV)不超过10.0％。
6)HOOK效应：检测Fβ-hCG浓度为1000ng/mL的国家标准品时，其荧光计数仍高于F点的荧光计数。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (12)
1.一种适用于新生儿进行性肌营养不良症筛查的试剂，其特征在于，主要成分包括：1)包被有特异性捕获抗体的固相载体；2)滤纸干血片校准品；3)特异性检测抗体标记物；4)样本洗脱液；5)实验缓冲液；6)清洗液以及7)信号转换液，所述信号转换液：包括以下的一种或几种，如底物液、终止液、增强液、发光底物液、发光剂；
所述试剂检测的是肌酸激酶同工酶(CK-MM)。
2.权利要求1所述的试剂，其特征在于：选择双抗体夹心二步法进行检测。
3.权利要求2所述的试剂，其特征在于，所述双抗体夹心二步法进行检测方法为：
在捕获抗体固相载体中的相应位置加入校准品或待测样本；孵育；校准品或待测样本中待测物与固相载体上的捕获抗体和检测抗体标记物形成“固相捕获抗体-待测物”复合物；通过洗涤固相载体洗去多余的血液样本其他成分；再加入适量的检测抗体标记物工作液；孵育；固相载体上的“固相捕获抗体-待测物”复合物和检测抗体标记物形成“固相捕获抗体-待测物-检测抗体标记物”复合物；通过洗涤固相载体洗去多余的检测抗体标记物；再通过后续的处理使标记物转化为可测量的信号物质；通过计数器进行检测，分析结果。
4.权利要求1-3任一项所述的试剂，所述捕获抗体包括：针对CK-MM的鼠单克隆抗体6811817(IgG2b)、鼠单克隆抗体123125(IgG1)、鼠单克隆抗体M18073101、鼠单克隆抗体18121502、鼠单克隆抗体M52213、鼠单克隆抗体2111851、兔多克隆抗体CR75和山羊多克隆抗体CG75；经过优选实验，优选配对抗体为针对人骨骼肌CK-MM的特异性鼠单克隆抗体M18073101、鼠单克隆抗体18121502。
5.权利要求1-3任一项所述的试剂，其中试剂的主要成分1)所述包被有特异性捕获抗体的固相载体具有以下特点：
将捕获抗体用常规包被缓冲液(可以使用50mmol/L，pH 9.6的碳酸缓冲液、20mmol/L，pH 4.5的磷酸盐缓冲液、50mmol/L，pH 7.8的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液或50mmol/L，pH 4.5的柠檬酸盐缓冲液等)稀释至最适浓度，在固相上进行包被，将固相洗涤1次，然后再用封闭液进行封闭，将固相甩干，晾干，真空包装，2～8℃保存备用；
其中捕获抗体是采用特异性针对人骨骼肌肌酸激酶同工酶(CK-MM)特异性单克隆抗体；捕获抗体的浓度均选择在1～7μg/mL间，最适工作浓度为5μg/mL。
6.权利要求1-5任一项所述的试剂，其中，试剂的主要成分2)所述滤纸干血片校准品具有以下特点：
将肝素抗凝血浆采用42～60℃灭活1～3h，期间要每隔15min轻轻摇晃一次，使血浆内的CK总酶活性和/或其他酶类活性失活；灭活后在血浆中加入20ppm的硫柳汞和0.01％的叠氮钠作为防腐剂，两种防腐剂可以起到协同保护作用；为防止添加入的校准品原料CK-MM及其亚型被血浆中的残存的羧基肽酶水解降低，进一步提高校准品的稳定性，在血浆中加入苯甲酰精氨酸甲酯、6-氨基己酸的一种或两种作为抑制剂，抑制剂均为浓度为1～5mmol/L；并为了进一步提高校准品的热稳定性和延长有效期，在血浆中加入0.5％～2％的海藻糖；将红细胞用生理盐水洗涤3～5次，去除CK总酶和其他酶类；然后将灭活的血浆和洗涤过的红细胞恢复成50％-55％的血细胞比容的全血；然后将校准品原料加入到以上全血中，形成一系列梯度浓度的校准品，充分混匀，用S&S903采血滤纸作为载体，用磁力搅拌器不断搅匀，用移液器将校准品点加至滤纸上，每个校准品血斑滴加全血量为50μL；滤纸血片经室温自然阴干后过塑。
7.权利要求1-6任一项所述的试剂，其中，所述主要成分3)所述特异性检测抗体标记物具有以下特点：
特异性检测抗体标记物的检测抗体与捕获抗体的位点不同，能与相应的抗原形成双抗体夹心检测，组织特异性检测抗体是采用针对人骨骼肌CK-MM特异性单克隆抗体；
酶联免疫分析法所采用的标记物为辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶(β-Gal)等中的一种或几种；
化学发光免疫分析法所采用的标记物为吖啶酯、碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶等中的一种或几种；
时间分辨荧光免疫分析法所采用的标记物为镧系元素中铕(Eu)、铽(Tb)、钐(Sm)、镝(Dy)的双功能基团结构螯合物的一种或几种。
8.权利要求1-7任一项所述的试剂，其中，主要成分4)所述样本洗脱液具有以下特点：
样本洗脱液含有常规的缓冲剂、防腐剂、免疫信号增强剂、蛋白质和特异性阻断剂；
其中缓冲液为50mmol/L，pH 7.8的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液；
防腐剂为0.02％(v/v)的
300和20ppm的硫柳汞；
免疫信号增强剂为SignalBoostTM免疫信号增强剂、聚乙二醇(PEG)6 000中的一种或两种；SignalBoostTM免疫信号增强剂的使用量为20％～40％(v/v)；聚乙二醇(PEG)6 000的使用量为0.05％～0.2％(m/v)；SignalBoostTM免疫信号增强剂具有降低信噪比、加速抗原抗体反应，提高低丰度蛋白的检测成功率；聚乙二醇(PEG)6 000能提高抗原与抗体的反应性；
蛋白质为小鼠血清(0.1％，v/v)、小牛血清(10％，v/v)、γ-牛球蛋白(0.5％，m/v)和牛血清白蛋白(5％，m/v)的一种或几种；
特异性阻断剂为针对人抗鼠抗体和类风湿因子等异嗜性抗体干扰的TRU BlockTM阻断剂，以及防止肌酸激酶同工酶和/或亚型被血浆中羧基肽酶水解的抑制剂苯甲酰精氨酸甲酯、6-氨基己酸和乙二胺四乙酸二钠的一种或几种，以及防止杂蛋白非特异吸附的吐温40或吐温20；TRU BlockTM阻断剂的使用浓度为5～20mg/mL，苯甲酰精氨酸甲酯、6-氨基己酸浓度为1～5mmol/L，乙二胺四乙酸二钠使用浓度为0.001％(v/v)，吐温40或吐温20的使用浓度为0.04％～0.08％(v/v)。
9.权利要求1-8任一项所述的试剂，其中，主要成分5)所述实验缓冲液具有以下特点：
实验缓冲液含有常规的缓冲剂、防腐剂、免疫信号增强剂、蛋白质和螯合剂；
其中缓冲液为三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液；
防腐剂为0.02％(v/v)的
300和20ppm的硫柳汞；
免疫信号增强剂为SignalBoostTM免疫信号增强剂、聚乙二醇(PEG)6 000中的一种或两种；SignalBoostTM免疫信号增强剂的使用量为20％～40％(v/v)；聚乙二醇(PEG)6 000的使用量为0.05％～0.2％(m/v)；SignalBoostTM免疫信号增强剂具有降低信噪比、加速抗原抗体反应，提高低丰度蛋白的检测成功率，降低检测抗体标记物的使用量；聚乙二醇(PEG)6000能提高抗原与抗体的反应性；
蛋白质为小鼠血清(0.1％，v/v)、小牛血清(10％，v/v)、γ-牛球蛋白(0.5％，m/v)和牛血清白蛋白(5％，m/v)的一种或几种；
螯合剂为去除影响反应的金属离子的乙二胺四乙酸二钠，乙二胺四乙酸二钠使用浓度为0.001％(v/v)。
10.权利要求1-9任一项所述的试剂，其中，主要成分6)所述清洗液具有以下特点：
清洗液为含有1.125g/L的氯化钠、0.2mL/L的吐温-20、30ppm的
300防腐剂的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液。
11.权利要求1-10任一项所述的试剂，其中，主要成分7)所述信号转换液具有以下特点：
时间分辨荧光免疫法分析法使用的增强液：含曲拉通、冰乙酸、螯合剂、纯化水；
化学发光免疫分析法使用的发光底物液：含有底物液A和底物液B，其中底物液A含鲁米诺和对碘苯酚溶液，底物液B含有过氧化脲溶液；
化学发光免疫分析法使用的发光底物液：含有底物液A和底物液B，其中底物液A含鲁米诺衍生物溶液，底物液B含有过氧化氢(H2O2)溶液；
化学发光免疫分析法使用的发光剂：含有甲氧基-4-9-3苯磷酸(AMPPD)溶液；
化学发光免疫分析法使用的发光剂：含有氧化剂过氧化氢(H2O2)溶液和pH纠正液NaOH溶液；
酶联免疫分析法使用的底物液和终止液：含有底物液A和底物液B，其中底物液A含有过氧化氢(H2O2)溶液，底物液B含有邻苯二胺(OPD)溶液；终止液含有稀硫酸溶液；
酶联免疫分析法使用的底物液和终止液：含有底物液A和底物液B，其中底物液A含有过氧化氢(H2O2)溶液，底物液B含有四甲基联苯胺(TMB)溶液；终止液含有稀硫酸溶液；
酶联免疫分析法使用的底物液和终止液：底物液含有对硝基苯磷酸盐溶液；终止液含有稀硫酸溶液；
酶联免疫分析法使用的底物液：底物液含有4-甲基伞形酮-β-D-半乳糖苷(4-MUG)溶液。
12.包含权利要求1-11所述试剂的试剂盒。
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