CN112986231A - 一种测定银耳多糖含量的高通量方法 - Google Patents

一种测定银耳多糖含量的高通量方法 Download PDF

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张帆
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Abstract

本发明属于生化分析和检验领域，具体涉及一种测定银耳多糖含量的高通量方法，配制不同浓度梯度的单糖标准溶液，取待测样品溶液加入盐酸溶液，加热水解后冷却至室温，将待测样品溶液定容；将A液、B液、C液按比例在冰浴条件下配制显色剂，分别取单糖标准溶液和水解后的待测样品溶液，冰浴条件下加入显色剂，混匀后预热，之后加热进行显色反应，测定吸光度值构建标准曲线计算可得待测样品的银耳多糖含量，所述A液、B液、C液为浓硫酸、超纯水、苯酚，通过水解待测样品、冰浴下配制显色液和与样品混匀，使反应可控，避免传统方法具有的测定误差，提高测定的准确性，克服了传统银耳多糖测定方法中存在的误差过大、重现性低等问题。

Description

一种测定银耳多糖含量的高通量方法
技术领域
本发明属于生化分析和检验领域，具体涉及一种测定银耳多糖含量的高通量方法。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
银耳多糖(Tremella fuciformis polysaccharides，TFPS)是从银耳子实体中获得的一种酸性杂多糖，具有调节免疫、降血糖与降血脂、抗辐射、抗肿瘤、抗衰老与抗氧化等多种功能作用，可以广泛应用于食品、医药、化妆品等各个领域。
目前，多糖含量的检测方法主要采用硫酸苯酚和硫酸蒽酮比色法。硫酸蒽酮法存在较严重的稳定性问题，且容易被色氨酸含量较高蛋白质所影响，方法重现性也较低；而传统的硫酸苯酚法也存在平行样品之间吸光度偏差较大、检测的重现性与准确性不好等缺点[1]。与此同时，在利用硫酸蒽酮法制定标准曲线时，此方法也显现出测定的不稳定性。孙晨雨等[2]采用硫酸蒽酮法进行多糖含量的测定，分别精密量取6.0mL的配制的蒽酮试液，摇匀后冷却15min。沸水浴10min后，冷水冷却15min，测定波长620nm处吸光度值测定所得的标准曲线，其线性关系非常不理想，线性回归方程的R2值为0.988。彭云飞[3]使用苯酚硫酸法未在冰浴条件下进行，用移液枪分别精确量取0、0.2、0.4、0.5、0.8、0.9、1.0mL至20mL的具塞试管中，补加蒸馏水至1.0mL，加入5％的苯酚1mL、5mL浓硫酸摇匀后沸水浴15min，取出后迅速冷却至室温，测定490nm处的吸光值。试验设三次平行，取平均值。绘制标准曲线并做线性回归处理，得到线性回归方程，其R2值为0.9949，仍然无法满足理想标准曲线的要求。虽然传统的硫酸苯酚法测定的稳定性较硫酸蒽酮法有了一定的提高，但是仍然存在测定重现性不好，样品偏差较大等问题。
传统的硫酸苯酚法测定总糖含量为先加入苯酚，后加入浓硫酸，这种方法会导致测定过程中局部反应温度过高，从而引起误差较大等一系列问题。该案例中研究试剂与样本的添加顺序不同，对测定结果造成影响也大有不同。以空白试剂为对照，改变样品添加顺序，测定的吸光度在0.05～0.5变动，对测定结果造成的影响巨大[4]。而采用硫酸蒽酮法时，不同的糖类与蒽酮的显色深度不同，容易造成显色误差，无从判断结果的准确性。以上两种传统方法都会在总糖测定实验过程中产生无法规避的不利因素，造成不可避免的测定误差或者错误的发生。
因目前缺少准确的测定方法，银耳多糖功效和应用的相关研究开发受到了严重的阻碍，因此，亟需一种准确的多糖测定方法，实现银耳多糖总糖含量的定量检测。
参考文献：
[1]Dubois M,Gilles K A,Hamilton J K,et al.Colorimetric method fordetermination of sugars and related substances[J].AnalyticalChemistry,1956,28(3):350-356.
[2]孙晨雨,王飞,张建玲,等.银耳多糖最适提取工艺条件探析[J].农产品加工,2018,8(4):27-29.
[3]彭云飞.银耳多糖酶法提取及生物活性研究[D].福州:福建农林大学,2017.
[4]黄丽，黄凤柳.苯酚—硫酸法测定佛手瓜水溶性多糖的条件优化研究[J].韶关学院学报·自然科学,2020,41(12):9-10
发明内容
针对上述现有技术的不足，本发明提出了一种测定银耳多糖含量的高通量方法，在传统测定方法的基础上进行优化，对工作液用量及比例、显色测定条件等方面进行改良，以解决目前存在的总糖含量测定不准确、不稳定的问题，实现总糖含量的稳定测定，克服银耳多糖功能应用开发的发展阻碍，同时对总糖含量测定起到一定的指导作用。
本发明是通过如下技术方案实现的：
本发明的第一个方面，提供一种测定银耳多糖含量的高通量方法为，配制不同浓度梯度的单糖标准溶液，取待测样品溶液加入盐酸溶液，加热水解，水解后冷却至室温，将待测样品溶液定容；将A液、B液、C液按比例在冰浴条件下配制成显色剂溶液，分别取不同浓度梯度的单糖标准溶液和处理后的待测样品溶液，冰浴条件下加入显色剂溶液，混匀后预热，之后加热进行显色反应，测定吸光度值构建标准曲线计算可得待测样品的银耳多糖含量，所述A液、B液、C液为浓硫酸、超纯水、苯酚。本发明侧重解决银耳多糖稳定测定的问题，处理得到的银耳多糖溶液，其中多糖的含量远远高于脂质、蛋白质，处理好多糖本身的存在形式，找到一种适合于测定的方法，即可实现多糖含量的准确测定。
本申请提供的一个或多个技术方案具有如下优点或有益效果：
(1)对样本进行了规范的水解处理，确保通过不同提取方式所得的银耳多糖都能够水解为单糖，更好地与硫酸苯酚溶液发生显色反应，避免因处理方式不同等其他诸多因素的干扰，同时4M的盐酸可使水解反应充分进行，水解彻底，确保了测定结果的准确性，实现了总糖测定的稳定性。
(2)在冰浴条件下中将各工作液按照一定程序进行充分混合，所配制的硫酸苯酚溶液本身几乎无颜色，通过将B液与C提前混合，并在冰浴条件的控制下，使得当浓硫酸缓慢加入后，反应温和，避免了传统方法测定过程中浓硫酸的加入导致的局部温度过高而引起的测定误差，使测定准确度的大幅度提高，实现了传统技术的突破；实验结果置信度高。本发明方法实现了测定结果的稳定并且可重复，有效规避了传统测定方法中存在的误差较大问题。
(3)本方案首先对样本进行规范预处理(通过对不同处理所得到的样本溶液进行统一规范地水解预处理，能很大程度上确保不同的待测样本溶液进行显色反应前能够达到统一的标准)，避免由于不同提取处理、溶液制备方式等诸多因素对之后所进行的显色反应产生的不可预测的影响。在此基础上，进一步结合在显色反应中对工作试剂混合顺序的要求以及在显色液配置过程中冰浴等诸多条件的把控，可以实现测定过程两种处理方式协同增效的效果，使检测重复性、稳定性好。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
如前所述，传统银耳多糖测定方法中存在误差过大、重现性低等问题，为了克服上述问题，本发明提出了一种测定银耳多糖含量的高通量方法，消除了实验试剂、试剂添加顺序、多糖水解过程、温度控制等因素造成的测定影响，克服了传统测定误差过大的缺点，得到了具有理想线性的标准曲线，且样本测定实验结果稳定可重复，彻底解决了传统方法测定不准确和不平行的问题。此方法操作快捷、使用方便、保存稳定，在有效节约成本的同时完成了对银耳多糖总糖含量的准确测定，实现了传统技术的突破，打破了传统影响因素的限制，将用以指导总糖含量的测定和应用。
根据本发明，配制不同浓度梯度的单糖标准溶液，取待测样品溶液加入盐酸溶液，加热水解，水解后冷却至室温，将待测样品溶液定容；将A液、B液、C液按比例在冰浴条件下配制成显色剂溶液，分别取不同浓度梯度的单糖标准溶液和处理后的待测样品溶液，冰浴条件下加入显色剂溶液，混匀后预热，之后加热进行显色反应，测定吸光度值构建标准曲线计算可得待测样品的银耳多糖含量，所述A液、B液、C液为浓硫酸、超纯水、苯酚。对样本进行规范预处理，结合在显色反应中对工作试剂混合顺序的要求以及在显色液配置过程中冰浴等诸多条件的把控，可以实现测定过程两种处理方式协同增效的效果，使检测重复性、稳定性好。
进一步的，所述A液、B液、C液配比为1:0.5:0.01；水解温度为80～100℃；配制过程中按照比例将B液与C充分混合，后将A液在冰浴条件下沿玻璃棒缓缓加入其中，边倒边搅拌，防止因局部反应温度过高；配制的显色剂为现配现用，放置时间尽量不超过30min。
本申请人研究发现，由于配置显色试剂时，硫酸加入会造成的温度骤升的影响，工作液C苯酚遇热会被氧化生成粉红色的苯醌。如不加以合理控制，显色试剂本身会显现一定的颜色，从而引起测定误差，导致银耳多糖测定存在不稳定、准确的问题。
本申请的一个实施例中叙述的显色试剂配置中工作试剂混合顺序为B+C+A，通过最后加入A液，使得在显色试剂配置过程中A液的稀释倍数达到最大，使得A液入水后的反应温和，减少热量的释放，避免显色试剂本身的颜色变化。
经发明人试验验证，在冰浴条件下能够有效避免浓硫酸遇水释放的热量所引起的显色溶液的变色问题。从而确保显色试剂本身无颜色，降低显色试剂本身的颜色对实验结果造成的影响。
进一步的，方法具体包括以下步骤：
(1)标准品配制：配制不同浓度梯度的单糖标准溶液；
(2)待测样本处理：取实验处理后的待测样品溶液放入反应容器中，并加入盐酸溶液；
(3)待测样本水解：将反应容器在80～100℃加热10min以上；
(4)待测样本定容：待步骤(3)反应容器取出冷却至室温后，将待测样品溶液进行定容处理，后移取一定量进行显色反应；
(5)显色试剂配制：将工作液A液、B液、C液按照一定比例在冰浴条件下配制成显色反应所需的显色剂溶液；
(6)充分混合：在冰浴条件下，所取的不同浓度梯度的单糖标准溶液和处理后的待测样本溶液中加入步骤(5)所配的显色剂溶液；
(7)加热预处理：充分混合后，置于恒温水浴中预热处理2min以上；可有效避免冷热交替可能引起的容器炸裂；
(8)显色反应：控制反应条件在80～100℃的水浴中加热15min以上进行显色反应；
(9)测定：在微孔板的各孔中加入待测的溶液，测定各单糖标准溶液和待测样品溶液的吸光度值；
(10)计算：将各单糖标准溶液的吸光度值与浓度进行回归拟合来构建标准曲线；根据标准曲线计算待测样品含有银耳多糖的浓度，即可得到含量。
进一步的，步骤(1)中配制浓度范围为0～1.5mg/mL的单糖标准溶液5个以上，优选地，配制浓度分别为0、0.1、0.2、0.5、1、1.5mg/mL的葡萄糖标准品；步骤(2)中，待测样品溶液与盐酸溶液体积比为5：4～10，优选的，加入的盐酸溶液为4mol/L，待测样品溶液与盐酸溶液体积比为1：1，取待测样品溶液2.5mL，加入盐酸溶液2.5mL。加入4M盐酸使待测样品溶液充分被水解。通过对不同处理所得到的样本溶液进行统一规范地水解预处理，能很大程度上确保不同的待测样本溶液进行显色反应前能够达到统一的标准，在本发明所指的4M盐酸下得到完全水解进而更好进行显色。
进一步的，步骤(3)中，反应容器每4～6min摇匀一次，促进水解过程充分；优选的，步骤(3)中，恒温水浴加热的温度为100℃，加热时间为20min。
进一步的，步骤(4)中移取80μL待测液进行显色反应，优选的，步骤(5)中所述A液、B液、C液配比为1:0.5:0.01，配制过程中按比例将B液与C液充分混合，后加入A液，优选的，加入A液时缓慢加入，边加边搅拌。
进一步的，步骤(6)中加入3.6mL以上的显色剂溶液。
进一步的，步骤(7)加热预处理条件为55℃，加热时间为3min。
进一步的，步骤(9)所述多孔微孔板是96孔板，在特定波长下测定各单糖标准溶液和待测样品溶液的吸光度值，特定波长优选为490nm。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本公开的技术方案，以下将结合具体的实施例与对比例详细说明本公开的技术方案。
实施例1：标准曲线构建稳定性验证
实验方法：
利用上述所说明的实验方法流程，对单糖梯度标准溶液进行测定。配制浓度范围为0～1.5mg/mL的单糖标准品5个以上，优选地，配制浓度分别为0、0.1、0.2、0.5、1、1.5mg/mL的葡萄糖标准品以构建定量用标准曲线。在本发明所述的冰浴条件下将各工作液按照一定比例和顺序配制显色剂溶液，显色剂溶液为现配现用，放置时间尽量不超过30min。并在冰浴条件下将各标准溶液与显色剂溶液充分混合，后置于55℃下预热处理2min以上，之后控制反应条件在100℃恒温水浴中加热20min进行显色反应。反应完成后，在多孔微孔板的各孔中加入待测溶液，并置于酶标仪上在特定波长下读取微孔的吸光度值。
各个理论标曲点浓度(mg/mL)的吸光度A(490nm)
Figure BDA0002966292030000061
通过多次测定，构建的标准曲线实验显示，制作的标准曲线R2值至少0.999以上，稳定性强，置信度强。
实施例2：待测样品重复稳定性检测
实验案例1:
取经银耳提取实验处理的样品A溶液加入2.5mL 4mol/L的盐酸，放置在100℃水浴锅中加热20min，加热完成后定容。在冰浴条件下将各工作液按照一定比例和顺序配制显色剂溶液。取定容完后的样品A溶液80uL在冰浴条件下加入至少3.6mL显色剂溶液，在经55℃下加热预处理2min以上，后置于100℃恒温水浴中加热20min。在多孔微孔板的各孔中加入处理后的样本溶液，并置于酶标仪上在490nm下读取微孔的吸光度值，依据建立的标准曲线计算总糖含量。
实验案例2:
取经银耳提取实验处理的样品B溶液加入2.5mL 4mol/L的盐酸，放置在100℃水浴锅中加热20min，加热完成后定容。在冰浴条件下将各工作液按照一定比例和顺序配制显色剂溶液。取定容完后的样品B溶液80uL在冰浴条件下加入至少3.6mL显色剂溶液，在经55℃下加热预处理2min以上，后置于100℃恒温水浴中加热20min。在多孔微孔板的各孔中加入处理后的样本溶液，并置于酶标仪上在490nm下读取微孔的吸光度值，依据建立的标准曲线计算总糖含量。
实验案例3:
取经银耳提取实验处理的样品C溶液加入2.5mL 4mol/L的盐酸，放置在100℃水浴锅中加热20min，加热完成后定容。在冰浴条件下将各工作液按照一定比例和顺序配制显色剂溶液。取定容完后的样品C溶液80uL在冰浴条件下加入至少3.6mL显色剂溶液，在经55℃下加热预处理2min以上，后置于100℃恒温水浴中加热20min。在多孔微孔板的各孔中加入处理后的样本溶液，并置于酶标仪上在490nm下读取微孔的吸光度值，依据建立的标准曲线计算总糖含量。
对比案例1：
取经银耳提取实验处理的对比待测样本液样品A，不经过水解，直接定容。取定容完后的样品A溶液80uL，加5％苯酚试剂1.0mL，迅速滴加5.0mL浓硫酸，后置于100℃水浴锅中加热20min，进行显色反应,于490nm处用空白调零测吸光度，然后代入标准曲线算出其总糖含量。
对比案例2：
取经银耳提取实验处理的对比待测样本液样品B，不经过水解，直接定容。取定容完后的样品B溶液80uL，加5％苯酚试剂1.0mL，迅速滴加5.0mL浓硫酸，摇匀后在室温下静置30min；于490nm处用空白调零测吸光度，然后代入标准曲线算出其总糖含量。
各待测样品重复稳定性测定多糖含量(％)
Figure BDA0002966292030000081
通过实验对比发现，采用本发明的方法对样本进行总糖含量检测，相对误差较小，稳定性和重复性较好，可以同时对多批样本进行批量检测，对样本进行了规范水解处理，确保了测定结果的准确性，实现了总糖测定的稳定性，优化条件避免了传统方法导致的局部温度过高而引起的测定误差，实验结果置信度高。
本发明方法实现了测定结果的稳定并且可重复，有效规避了传统测定方法中存在的误差较大问题。
应注意的是，以上实例仅用于说明本发明的技术方案而非对其进行限制。尽管参照所给出的实例对本发明进行了详细说明，但是本领域的普通技术人员可根据需要对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。

Claims (10)

1.一种测定银耳多糖含量的高通量方法，其特征在于，配制不同浓度梯度的单糖标准溶液，取待测样品溶液加入盐酸溶液，加热水解，水解后冷却至室温，将待测样品溶液定容；将A液、B液、C液按比例在冰浴条件下配制成显色剂溶液，分别取不同浓度梯度的单糖标准溶液和处理后的待测样品溶液，冰浴条件下加入显色剂溶液，混匀后预热，之后加热进行显色反应，测定吸光度值构建标准曲线计算可得待测样品的银耳多糖含量，所述A液、B液、C液为浓硫酸、超纯水、苯酚。
2.如权利要求1所述的一种测定银耳多糖含量的高通量方法，其特征在于，所述A液、B液、C液配比为1:0.5:0.01，优选的，水解温度为80～100℃。
3.如权利要求3所述的一种测定银耳多糖含量的高通量方法，其特征在于，配制过程中按比例将B液与C液充分混合，后加入A液。
4.如权利要求1所述的一种测定银耳多糖含量的高通量方法，其特征在于，
具体包括以下步骤：
(1)标准品配制：配制不同浓度梯度的单糖标准溶液；
(2)待测样本处理：取实验处理后的待测样品溶液放入反应容器中，并加入盐酸溶液；
(3)待测样本水解：将反应容器在80～100℃加热10min以上；
(4)待测样本定容：待步骤(3)反应容器取出冷却至室温后，将待测样品溶液进行定容处理，后移取一定量进行显色反应；
(5)显色试剂配制：将工作液A液、B液、C液按照一定比例在冰浴条件下配制成显色反应所需的显色剂溶液；
(6)充分混合：在冰浴条件下，所取的不同浓度梯度的单糖标准溶液和处理后的待测样本溶液中加入步骤(5)所配的显色剂溶液；
(7)加热预处理：充分混合后，置于恒温水浴中预热处理2min以上；
(8)显色反应：控制反应条件在80～100℃的水浴中加热15min以上进行显色反应；
(9)测定：在微孔板的各孔中加入待测的溶液，测定各单糖标准溶液和待测样品溶液的吸光度值；
(10)计算：将各单糖标准溶液的吸光度值与浓度进行回归拟合来构建标准曲线；根据标准曲线计算待测样品含有银耳多糖的浓度，即可得到含量。
5.如权利要求4所述的一种测定银耳多糖含量的高通量方法，其特征在于，步骤(1)中配制浓度范围为0～1.5mg/mL的单糖标准溶液5个以上，优选地，配制浓度分别为0、0.1、0.2、0.5、1、1.5mg/mL的葡萄糖标准品；步骤(2)中，待测样品溶液与盐酸溶液体积比为5：4～10，优选的，加入的盐酸溶液为4mol/L，待测样品溶液与盐酸溶液体积比为1：1，取待测样品溶液2.5mL，加入盐酸溶液2.5mL。
6.如权利要求4所述的一种测定银耳多糖含量的高通量方法，其特征在于，步骤(3)中，反应容器每4～6min摇匀一次，优选的，步骤(3)中，采用恒温水浴加热的温度为100℃，加热时间为20min。
7.如权利要求4所述的一种测定银耳多糖含量的高通量方法，其特征在于，步骤(4)中移取80μL待测液进行显色反应，优选的，步骤(5)中所述A液、B液、C液配比为1:0.5:0.01，配制过程中按比例将B液与C液充分混合，后加入A液，优选的，加入A液时缓慢加入，边加边搅拌。
8.如权利要求1所述的一种测定银耳多糖含量的高通量方法，其特征在于，步骤(6)中加入3.6mL以上的显色剂溶液。
9.如权利要求1所述的一种测定银耳多糖含量的高通量方法，其特征在于，步骤(7)加热预处理条件为55℃，加热时间为3min。
10.如权利要求1所述的一种测定银耳多糖含量的高通量方法，其特征在于，步骤(9)所述多孔微孔板是96孔板，在特定波长下测定各单糖标准溶液和待测样品溶液的吸光度值，特定波长优选为490nm。
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