CN1824776A

CN1824776A - 扩张型心肌病诊断和治疗方法及用于该方法的试剂

Info

Publication number: CN1824776A
Application number: CN 200510051991
Authority: CN
Inventors: 惠汝太; 王虎; 郑维越; 陈敬洲; 宋晓东; 甄一松; 石毅
Original assignee: Fuwai Hospital of CAMS and PUMC
Current assignee: Fuwai Cardiovascular Disease Hospital of CAMS and PUMC; Fuwai Hospital of CAMS and PUMC
Priority date: 2005-02-23
Filing date: 2005-02-23
Publication date: 2006-08-30

Abstract

本发明涉及将LMNA基因中的单核苷酸多态性和患者心脏疾病特别是扩张型心肌病相关联的方法。本发明还涉及确定患者对心脏疾病特别是扩张型心肌病的遗传易感性或者诊断患者心脏疾病特别是扩张型心肌病的方法，此方法包括检测LMNA基因中的至少一个单核苷酸多态性，特别是LMNA基因第244位核苷酸的多态性(如G244A)或者laminA蛋白质第82位氨基酸的突变。本发明还涉及在序列中包含在上面所限定位置上的多态性的分离的核酸，能与这种核酸杂交的核酸引物和寡核苷酸探针和包含一种或多种这样的引物和探针用于检测LMNA基因中的多态性的诊断试剂盒。本发明还涉及扩张型心肌病的治疗方法。

Description

扩张型心肌病诊断和治疗方法及用于该方法的试剂

技术领域

本发明涉及扩张型心肌病的诊断和治疗方法、用于该目的试剂、组合物和试剂盒及其用途。

背景技术

扩张型心肌病是一种以左室或双心室的扩张和收缩功能损害为特点的心肌疾病，它可能是自发的，家族性/遗传性，病毒性和/或免疫性，或酒精中毒/中毒性，或是和其他已知的心血管疾病有关，这些心血管疾病的心肌功能失常的程度不能用异常的负荷或缺血损害来解释，最终可导致进行性难治性的心衰，是一种严重的健康问题，是心脏移植的主要适应征之一，且常伴发室性心律失常，猝死率高，5年内病死率15％-50％。在美国应用对该病晚期的诊断标准进行人群扩张型心肌病流行病学调查中发现该病发病率为36.5/10万。约半数患者的发病机制不明。在相当长时间内对遗传因素在本病中的重要性估计不足。一些前瞻性的研究证实了该病的遗传倾向，估计约有25％的扩张型心肌病患者与遗传因素有关。真正的发病情况可能仍然估计过低，因为除家族史以外，尚无临床或组织病理学的标准来对家族性和非家族性的患者进行鉴别，而且正像肥厚型心肌病一样，一些被认为是散发的病例实际上是一种原发突变，能遗传给后代。由于外显率不完全且与年龄相关，或没有认真全面的家族史调查易导致一些家族性病例被误为散发病例。

扩张型心肌病患者中有一半患者是特发性的，在特发性心肌病患者中有30-40％的患者是家族遗传性的，其遗传方式绝大多数为常染色体显性遗传，有少数为X连锁遗传，常染色体隐性遗传极为罕见。目前已经有8个染色体定位与扩张型心肌病有关，并已确定了7个主要致病基因，包括：肌动蛋白(Actin)、肌营养不良蛋白(Dystrophy)、tafazzin、桥粒蛋白(Desmin)、δ-sarcoglycan、SCN5A和Lamin A/C。与遗传有关的扩张型心肌病的表型通常分为以下几类：成年人的扩张型心肌病不伴有传导障碍及肌肉病变定位于9q13-q22、10q21-q23、1q32、2q31、2q11-q22、15q14，伴有骨骼肌病变的通常为X连锁遗传，伴有传导阻滞的患者通常定位于1p1-q21、3p22-25，而扩张型心肌病伴有房室传导阻滞的患者与核纤层蛋白A/C(Lamin A/C)基因的突变有关(表1)。

表1：扩张型心肌病遗传方式及主要致病基因

遗传方式	伴随症状	定位	基因
遗传方式	伴随症状	定位	基因	常染色体显性遗传	无无无无无传导障碍肌病传导障碍传导障碍传导障碍听觉障碍二尖瓣脱垂肌病	1q322q312q359q13-2215q151p21.21p21.22q14-223p226q236q23-2410q21-2317q12-21.33	？？Desmin？ActinLamin A/CLamin A/C？？？？？α-Sarcoglycan
常染色体隐性遗传		？	？	常染色体显性遗传	无无无无无传导障碍肌病传导障碍传导障碍传导障碍听觉障碍二尖瓣脱垂肌病		？？Desmin？ActinLamin A/CLamin A/C？？？？？α-Sarcoglycan
常染色体隐性遗传		？	？	X连锁显性遗传	肌病Bath syndrome	Xp21Xq28	DystrophinTafazzin

目前已知的核纤层蛋白A/C(Lamin A/C)基因与扩张型心肌病有关的突变见下表：

HGMD Accession

Number	Codon Nucleotide Amino acid Phenotype				Reference
Number	Codon Nucleotide Amino acid Phenotype				Reference	CM993177CM993178CM022420CM022421CM032007CM022422CM993179CM993180CM014206CM024123CM014207CM022423CM993181	608597111161190195203203215225317571	gCGC-GGCCTC-CGCcAAG-GAGtGAG-TAGcGAG-AAGgCGG-TGGAACa-AAGGAA-GGAgGAA-AAACTG-CCGcCGA-TGAgGAG-AAGcCGC-AGC	Arg-GlyLeu-ArgLys-GluGlu-TermGlu-LysArg-TrpAsn-LysGlu-GlyGlu-LysLeu-ProArg-TermGlu-LysArg-Ser	Cardiomyopathy，dilatedCardiomyopathy，dilatedCardiomyopathy，dilatedCardiomyopathy，dilatedCardiomyopathy，dilatedCardiomyopathy，dilatedCardiomyopathy，dilatedCardiomyopathy，dilatedCardiomyopathy，dilatedCardiomyopathy，dilatedCardiomyopathy，dilatedCardiomyopathy，dilatedCardiomyopathy，dilated	111 2 3 2 1 1 4 5 4 2 1

References

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5-Hershberger(2002)Am Heart J 144，1081

目前对扩张型心肌病的早期诊断尚无特异的方法，而中晚期扩张型心肌病的诊断亦需排除其他疾病(如冠心病、高血压性心脏病、肺心病等)才能诊断，而且诊断明确多为中晚期患者，此类患者预后较差。在治疗方面也无特效治疗，疗效欠佳。我们首次在中国人群中检测到扩张型心肌病的基因突变，并对其功能进行了初步的研究，这对于亚临床型扩张型心肌病患者的诊断、治疗及进一步寻找新的治疗方法提供了新的思路。

单核苷酸多态性

人类基因组中的序列变异主要由单核苷酸多态性(″SNP″)组成，其余序列变异是短串联重复(包括微卫星)、长串联重复(小卫星)和其它插入和缺失。SNP是群体中以可测频率(即＞1％)出现两个可替换碱基的位置。SNP被称为是″等位的″，因为由于此多态性的存在，一个物种的一些成员可能具有未突变序列(即，原始“等位基因”)，而其它成员可能具有突变序列(即变体或突变等位基因)。在最简单的情况下，可能仅存在一个突变序列，该多态性被称为二对等位基因多态性。可替换突变的发生可产生三对等位基因多态性等。SNP广泛存在于基因组中，改变基因功能的SNP可能直接有助于表型变异。由于它们的流行和普遍本质，SNP有潜力成为定位参与人类疾病情况的基因的重要工具，见如Wang等，Science 280：1077-1082(1998)，它公开了一个探索性研究，其中2,227个SNP被作图定位于一个2.3兆碱基的DNA区域内。

单核苷酸多态性和特定表型之间的关系不表示或需要SNP是该表型的原因。相反，这种关系可能仅表示SNP位于表型决定因子在基因组上的存在位置的附近，由此更可能被发现与这些决定因子关联和由此与感兴趣的表型关联。因此，SNP可能与“真正”的功能变异存在连锁不平衡(LD)。当基因组两个不同位置上的等位基因的相关性比期望的相关性更高时存在LD，又称作等位基因相关(allelicassociation)。因此，SNP可以用作标记，由于其接近引起特定表型的突变而具有价值。

发明内容

本发明涉及将LMNA基因中的单核苷酸多态性和患者疾病(如心脏疾病特别是扩张型心肌病)相关联的方法。本发明还涉及确定患者对疾病(如心脏疾病特别是扩张型心肌病)的遗传易感性或者诊断患者疾病(如心脏疾病特别是扩张型心肌病)的方法，此方法包括检测LMNA基因中的至少一个单核苷酸多态性。优选地，这种方法包括至少检测所述样品中LMNA基因第244位的核苷酸或者lamin A蛋白质第82位的氨基酸，并参照LMNA基因中的多态性确定个体状态。本发明还涉及在序列中包含在上面所限定位置上的多态性的分离的核酸，涉及能与这种核酸杂交的核酸引物和寡核苷酸探针和涉及包含一种或多种这样的引物和探针用于检测LMNA基因中的多态性的诊断试剂盒。

本发明还涉及治疗或者预防患者疾病(如心脏疾病特别是扩张型心肌病)的方法，所述患者的LMNA基因第244位的G发生突变(如G244A突变)或者lamin A蛋白质第82位E发生突变(如E82K突变)，包括向所述患者给予正常的LMNA基因或者正常的lamin A蛋白质。

下文将结合附图对本发明进行更进详细的说明。应当理解，这些说明用于对本发明进行举例说明的目的。本发明的范围不受具体说明的限制。

附图简述

图1：扩张型心肌病家系图。

图2：LMNA基因发生G244A突变。上图：患者下图：正常人。

图3：LMNA基因的12个外显子及其蛋白上的结构元件。12个外显子依照其相应的氨基酸位置排列，Lamin A蛋白的central roddomain由1A、1B和2A、2B四个亚结构域加上之间的linkers构成，尾端则包括核定位信号(NLS)，immunoglobulin fold(Ig fold)和羧基末端的CAAX序列，我们发现的新突变E82K正好位于1B的氨基端。

图4：不同物种之间lamin A蛋白部分序列的比较，相同的碱基用红色表示，保守碱基用蓝色表示，绿色表示碱基间有弱的保守性，可以看出人lamin A蛋白中82位的谷氨酸E在生物进化中具有极高的保守性。

图5：稳定转染突变型LMNA基因的HEK293细胞与其它组细胞间存在差异。A示转染野生型LMNA基因的HEK293细胞HE染色照片，B示其电镜照片，C示转染突变型LMNA基因的HEK293细胞HE染色照片，D示其电镜照片。箭头所示为处于分裂期的细胞。E示四组细胞-HEK293细胞，分别转染空载体、野生型和突变型LMNA基因的HEK293细胞组中分裂期的细胞占细胞总数的百分比的统计学结果：转染突变型LMNA基因的HEK293细胞组中分裂期细胞占细胞总数的百分比为17.4％±1.65，与其它三组细胞-转染野生LMNA基因的细胞(5.6％±0.55)，转染空载体的细胞(5.0％±0.30)和对照细胞(4.9％±0.69)存在显著性差异(P＜0.01，M±SD，n＝3)。

图6：0.8mmol/L的H₂O₂诱导24h后，转染突变型LMNA基因的HEK293细胞的凋亡率显著高于对照细胞和转染野生型LMNA基因和空载体的HEK293细胞。A，B，C，D分别为对照细胞，空载体转染，野生型LMNA基因转染和突变型LMNA基因转染的HEK293细胞Hochest33342染色后荧光显微镜下的形态，箭头示凋亡细胞。E示转染突变型LMNA基因的细胞组凋亡率为29.1％±1.24，明显高于其它三组细胞-转染野生LMNA基因的细胞(2.6％±0.28)，转染空载体的细胞(2.4％±0.32)和对照细胞(1.9％±0.31)(P＜0.01，M±SD，n＝3)

图7：0.8mmol/L的H2O2诱导24h后，四组细胞-对照组细胞和分别转染突变型、野生型LMNA基因和空载体的HEK293细胞组处于不同细胞周期的细胞数占细胞总数的百分比之间的统计学比较。A示转染突变型LMNA基因的细胞组G1，G2期细胞百分比分别为37.8％±0.93，15.8％±0.55与其它三组细胞间存在显著性差异(P＜0.01，M±SD，n＝3)。C示转染突变型LMNA基因的细胞组S期细胞百分比为46.4％±1.24，明显高于其它三组细胞(P＜0.01，M±SD，n＝3)。

具体实施方式

本发明部分基于以下发现：LMNA基因中G244A突变或者lamin A蛋白质中E82K突变会导致患者疾病如心脏疾病特别是扩张型心肌病的发生。本发明发现的LMNA基因中G244A突变或者lamin A蛋白质中E82K突变可以用于相关疾病的诊断、预后、治疗、对该疾病遗传易感性的检测、以及用于这些目的的药物筛选等。因此，本发明提供用于这些目的和其它目的的化合物、组合物、药物和方法等。

突变核酸分子

一方面，本发明涉及分离的第244-246位核苷酸(如第244位)发生突变如G244A突变的编码lamin A蛋白质的核酸分子，或者称突变LMNA核酸分子，或它们的互补链或它们的包含至少一个多态性的具有至少10个碱基的片段。由于该突变LMNA基因的第244-246位核苷酸突变，所述lamin A蛋白质具有降低的生物活性或者没有生物活性。

优选地，所述突变核酸分子来源于动物，优选哺乳动物，更优选灵长类动物，最优选人类。

一种“分离的”LMNA核酸分子是这样一种核酸分子，它从至少一种污染性核酸分子中被鉴别和分离出来，在LMNA核酸的天然来源中该污染性核酸分子通常与它联系在一起。分离的LMNA核酸分子以非天然的形式存在或存在于非天然的环境中。因此分离的LMNA核酸分子与存在于天然细胞中的LMNA核酸分子可被区别开来。然而，分离LMNA核酸分子包括在通常表达LMNA的细胞中含有的LMNA核酸分子，在此细胞中，例如，此核酸分子在染色体中的位置不同于其在天然细胞中时的染色体位置。

根据本发明的核酸可包括例如DNA、RNA(如mRNA)、合成核酸、多肽核酸、修饰的核苷酸或它们的混合物。DNA包括cDNA，也包括其对应的基因组DNA。DNA可是单链的也可是双链的。构成核酸的核苷酸可通过各种已知的连接方式连接起来，例如酯、氨基磺酸酯、磺酰胺、硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、氨基甲酸酯等，对这些方法的选择依赖于所要达到的目的，例如抗核酸酶(如RNaseH)、改善体内稳定性等。见例如美国专利5,378,825。

本发明突变核酸分子的一个具体的实施方案是具有第244-246位核苷酸突变(如G244A突变)的GenBank登录号NM_170707所示的LMNA基因cDNA序列(该序列显示在SEQ ID NO：1中)。在本发明中，LMNA基因的核苷酸编号是按照以下标准进行的：以LMNA基因cDNA序列起始密码子ATG中的A为+1。

SEQ ID NO：1的序列如下：

ATGGAGACCCCGTCCCAGCGGCGCGCCACCCGCAGCGGGGCGCAGGCCAGCTCCACTCCGCTGTCGCC

CACCCGCATCACCCGGCTGCAGGAGAAGGAGGACCTGCAGGAGCTCAATGATCGCTTGGCGGTCTACATC

GACCGTGTGCGCTCGCTGGAAACGGAGAACGCAGGGCTGCGCCTTCGCATCACCGAGTCTGAAGAGGTGG

TCAGCCGCGAGGTGTCCGGCATCAAGGCCGCCTAC

AGGCCGAGCTCGGGGATGCCCGCAAGACCCTTGA

CTCAGTAGCCAAGGAGCGCGCCCGCCTGCAGCTGGAGCTGAGCAAAGTGCGTGAGGAGTTTAAGGAGCTG

AAAGCGCGCAATACCAAGAAGGAGGGTGACCTGATAGCTGCTCAGGCTCGGCTGAAGGACCTGGAGGCTC

TGCTGAACTCCAAGGAGGCCGCACTGAGCACTGCTCTCAGTGAGAAGCGCACGCTGGAGGGCGAGCTGCA

TGATCTGCGGGGCCAGGTGGCCAAGCTTGAGGCAGCCCTAGGTGAGGCCAAGAAGCAACTTCAGGATGAG

ATGCTGCGGCGGGTGGATGCTGAGAACAGGCTGCAGACCATGAAGGAGGAACTGGACTTCCAGAAGAACA

TCTACAGTGAGGAGCTGCGTGAGACCAAGCGCCGTCATGAGACCCGACTGGTGGAGATTGACAATGGGAA

GCAGCGTGAGTTTGAGAGCCGGCTGGCGGATGCGCTGCAGGAACTGCGGGCCCAGCATGAGGACCAGGTG

GAGCAGTATAAGAAGGAGCTGGAGAAGACTTATTCTGCCAAGCTGGACAATGCCAGGCAGTCTGCTGAGA

GGAACAGCAACCTGGTGGGGGCTGCCCACGAGGAGCTGCAGCAGTCGCGCATCCGCATCGACAGCCTCTC

TGCCCAGCTCAGCCAGCTCCAGAAGCAGCTGGCAGCCAAGGAGGCGAAGCTTCGAGACCTGGAGGACTCA

CTGGCCCGTGAGCGGGACACCAGCCGGCGGCTGCTGGCGGAAAAGGAGCGGGAGATGGCCGAGATGCGGG

CAAGGATGCAGCAGCAGCTGGACGAGTACCAGGAGCTTCTGGACATCAAGCTGGCCCTGGACATGGAGAT

CCACGCCTACCGCAAGCTCTTGGAGGGCGAGGAGGAGAGGCTACGCCTGTCCCCCAGCCCTACCTCGCAG

CGCAGCCGTGGCCGTGCTTCCTCTCACTCATCCCAGACACAGGGTGGGGGCAGCGTCACCAAAAAGCGCA

AACTGGAGTCCACTGAGAGCCGCAGCAGCTTCTCACAGCACGCACGCACTAGCGGGCGCGTGGCCGTGGA

GGAGGTGGATGAGGAGGGCAAGTTTGTCCGGCTGCGCAACAAGTCCAATGAGGACCAGTCCATGGGCAAT

TGGCAGATCAAGCGCCAGAATGGAGATGATCCCTTGCTGACTTACCGGTTCCCACCAAAGTTCACCCTGA

AGGCTGGGCAGGTGGTGACGATCTGGGCTGCAGGAGCTGGGGCCACCCACAGCCCCCCTACCGACCTGGT

GTGGAAGGCACAGAACACCTGGGGCTGCGGGAACAGCCTGCGTACGGCTCTCATCAACTCCACTGGGGAA

GAAGTGGCCATGCGCAAGCTGGTGCGCTCAGTGACTGTGGTTGAGGACGACGAGGATGAGGATGGAGATG

ACCTGCTCCATCACCACCACGGCTCCCACTGCAGCAGCTCGGGGGACCCCGCTGAGTACAACCTGCGCTC

GCGCACCGTGCTGTGCGGGACCTGCGGGCAGCCTGCCGACAAGGCATCTGCCAGCGGCTCAGGAGCCCAG

GTGGGCGGACCCATCTCCTCTGGCTCTTCTGCCTCCAGTGTCACGGTCACTCGCAGCTACCGCAGTGTGG

GGGGCAGTGGGGGTGGCAGCTTCGGGGACAATCTGGTCACCCGCTCCTACCTCCTGGGCAACTCCAGCCC

CCGAACCCAGAGCCCCCAGAACTGCAGCATCATGTAA

注：第82位密码子(第244-246位核苷酸)(

AG)以粗体表示，第244位碱基( )加下划线。

“G244A突变”是指在本发明的核酸分子中与SEQ ID NO：1所示序列第244位对应的核苷酸G突变为A。同样，本发明的核酸序列和氨基酸序列中核苷酸和氨基酸残基的编号是指与SEQ ID NO：1所示序列或其编码的氨基酸序列相同位置(或编号)对应的核苷酸和氨基酸残基。

“对应”是指本发明核酸分子或者蛋白质的序列在与参考序列如SEQ ID NO：1或者SEQ ID NO：2所示序列最佳比对(alignment)后与该参考序列某位置相对的位置。因此，本发明核酸分子或者蛋白质“对应位置”或者“对应核苷酸”或者“对应氨基酸”不一定是与参考序列编号相同的位置、或者核苷酸或者氨基酸。

本发明的“突变核酸分子”或者“突变LMNA基因”涵盖任何LMNA基因和其片段，只要该核酸分子与LMNA基因cDNA第244-246位核苷酸对应的核苷酸发生突变即可。因此，本发明LMNA基因包括SEQ ID NO：1中公开的序列和/或其片段的变体如等位变体和简并性变体、物种同系物、同源基因。

“第244-246位核苷酸的突变”或者“与LMNA基因cDNA第244-246位核苷酸对应的核苷酸发生突变”包括任何类型的突变，如缺失、添加、插入、重复、替代等，优选替代。突变如替代可以是不改变其编码的氨基酸，也可以使其编码的氨基酸发生改变，优选的突变如替代使其编码的氨基酸发生改变。所述突变如替代还可以在LMNA核酸分子第244-246位核苷酸的任何一个位置(第244、245、246位)发生。在一个优选的例子中，第244-246位核苷酸的突变导致编码的氨基酸(第82位E(即Glu))的突变(如缺失、添加、插入、重复、替代等，优选替代)，优选地，E82被替代为与K(即Lys)具有类似极性和/或疏水性的氨基酸残基，如Lys、Arg、His。在一个特别优选实施方案中，第244-246位核苷酸的突变导致E82K突变，如第244位发生突变(如G244A突变或者G244A+G246A)。

“变体”是指与本发明多核苷酸或多肽不同，但保留了其基本性质的多核苷酸或多肽。一般地，变体与本发明多核苷酸或多肽在整体上极为相似，并在许多区域中是一致的。等位变体是指一个基因占据同一个染色体座位的两个或多个可替代形式中的任意一个。等位变异通过突变自然发生，并可导致种群内的多态现象。基因突变可以是沉默的(在编码的多肽中没有变化)，也可编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位变体是基因的等位变体编码的多肽。

在另一个实施方案中，本发明包括同源核酸序列，其与SEQ IDNO：1具有至少70％(优选至少75％、至少75％、至少80％、至少85％、更优选至少90％、至少93％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％)同一性并包含G244A突变的核苷酸序列；

本发明多核苷酸或多核苷酸区与另一个序列具有某种“序列同一性”百分数(如80％、85％、90％或95％)是指当比对时两个序列比较的相同碱基百分数。这种比对(alignment)和百分数同源性或序列同一性可采用本领域已知的软件程序来确定，所述程序例如当代分子生物学实验方法(Current Protocols in Molecular Biology)(F.M.Ausubel等编著，1987)Supplement 30，section 7.7.18，Table 7.7.1中所述的程序。优选的比对程序是ALIGN Plus(Scientific andEducational Software，Pennsylvania)，优选使用默认参数。

在另一个实施方案中，本发明包括与SEQ ID NO：1或其子序列或互补链在低严谨条件，更优选中等严谨条件，更优选中高严谨条件，甚至更优选高严谨条件，最优选极高严谨条件下下杂交并包含G244A突变的核苷酸序列(J.Sambrook，E.F.Fritsch，和T.Maniatus，1989，分子克隆实验手册(Molecular Cloning，A LaboratoryManual)，第二版，Cold Spring Harbor，纽约)。

在另一个实施方案中，本发明涉及在SEQ ID NO：1中存在一个或多个(如至多1、2、3、4、5、10、20、50、70个或者100个)核苷酸插入、缺失和/或替代并包含G244A突变的核苷酸序列。

在另一个实施方案中，本发明涉及前述序列中包含G244A突变的片段。该片段一般长至少约10个核苷酸，例如15个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个，并可以长达100个、150个、200个、500个、或者LMNA基因全长，并包括其中的任何数目。

蛋白质

另一方面，本发明还涉及第82位E发生突变如E82K突变的laminA蛋白质。由于第82位E发生突变如E82K突变，所述lamin A蛋白质具有降低的生物活性或者丧失生物活性。

lamin A蛋白质第82位E发生的突变包括任何类型的突变，如缺失、添加、插入、重复、替代等，优选替代。突变如替代可以不改变或者改变氨基酸的极性和疏水性或者二级结构，优选的突变如替代使氨基酸的极性和疏水性或者二级结构发生改变。所述突变优选是E82被替代为与K(即Lys)具有类似极性和/或疏水性的氨基酸残基，如Lys、Arg、His。在一个特别优选实施方案中，突变导致E82K突变。

“E82K突变”是指在本发明的lamin A蛋白质中与SEQ ID NO：2所示序列第82位对应的氨基酸残基E(谷氨酸，Glu)突变为K(赖氨酸，Lys)。

本发明的“突变lamin A蛋白质”涵盖任何lamin A蛋白质和其片段，只要该lamin A蛋白质第82位E发生突变(如E82K突变)即可。

在本发明中，“蛋白质”和“多肽”可以互换使用，因此，它们并不受限于长度。

在一个具体实施方案中，本发明所述突变蛋白质具有包含第82位E的突变如E82K突变的SEQ ID NO：2的氨基酸序列。

SEQ ID NO：2的氨基酸序列：

METPSQRRATRSGAQASSTPLSPTRITRLQEKEDLQELNDRLAV

YIDRVRSLETENAGLRLRITESEEVVSREVSGIKAAY AELGDARKTLDSVAKERARL

QLELSKVREEFKELKARNTKKEGDLIAAQARLKDLEALLNSKEAALSTALSEKRTLEG

ELHDLRGQVAKLEAALGEAKKQLQDEMLRRVDAENRLQTMKEELDFQKNIYSEELRET

KRRHETRLVEIDNGKQREFESRLADALQELRAQHEDQVEQYKKELEKTYSAKLDNARQ

SAERNSNLVGAAHEELQQSRIRIDSLSAQLSQLQKQLAAKEAKLRDLEDSLARERDTS

RRLLAEKEREMAEMRARMQQQLDEYQELLDIKLALDMEIHAYRKLLEGEEERLRLSPS

PTSQRSRGRASSHSSQTQGGGSVTKKRKLESTESRSSFSQHARTSGRVAVEEVDEEGK

FVRLRNKSNEDQSMGNWQIKRQNGDDPLLTYRFPPKFTLKAGQVVTIWAAGAGATHSP

PTDLVWKAQNTWGCGNSLRTALINSTGEEVAMRKLVRSVTVVEDDEDEDGDDLLHHHH

GSHCSSSGDPAEYNLRSRTVLCGTCGQPADKASASGSGAQVGGPISSGSSASSVTVTR

SYRSVGGSGGGSFGDNLVTRSYLLGNSSPRTQSPQNCSIM

注：E82标有下划线

在一个具体实施方案中，本发明所述突变蛋白质包含或者以下氨基酸序列之一组成：

(1)包含第82位E的突变如E82K突变的SEQ ID NO：2的氨基酸序列；

(2)由本发明突变核酸分子编码的氨基酸序列；

(3)与SEQ ID NO：2具有至少70％(优选至少75％、至少75％、至少80％、至少85％、更优选至少90％、至少93％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％)同一性并包含E82K突变的氨基酸序列；

(4)在SEQ ID NO：2中存在一个或多个插入、缺失和/或替代并包含E82K突变的氨基酸序列；

(5)前述序列中包含E82K突变的片段。

为了本发明的目的，两个氨基酸序列之间的同一性程度采用Clustal法(Higgins，1989，CABIOS 5：151-153)和LASERGENE^TMMEGALIGN^TM软件(DNASTAR公司，Madison，WI)并使用同一性表和下列多序列对比(multiple alignment)参数来确定：空位罚分为10，空位长度罚分(gap penalty)为10。两两对比(Pairwise alignment)参数是：Ktuple＝1，空位罚分＝3，窗口(windows)＝5，对角线(diagonals)＝5。

优选地，本发明多肽包含SEQ ID NO.2的氨基酸序列或其等位变体；或它们的片段。在一个更优选的实施方案中，本发明多肽包含SEQID NO.2的氨基酸序列。

SEQ ID NO.2的片段是从该氨基酸序列的氨基和/或羧基末端缺失了一个或多个氨基酸的多肽。

单核苷酸多态性及其检测

本发明还涉及将LMNA基因中的单核苷酸多态性和患者疾病(如心脏疾病特别是扩张型心肌病)相关联的方法。本发明还涉及确定患者对疾病(如心脏疾病特别是扩张型心肌病)的遗传易感性或者诊断患者疾病(如心脏疾病特别是扩张型心肌病)的方法，此方法包括检测LMNA基因中的至少一个单核苷酸多态性。优选地，这种方法包括至少检测所述样品中LMNA基因第244位的核苷酸或者lamin A蛋白质第82位的氨基酸，并参照LMNA基因中的多态性确定个体状态。本发明还涉及在序列中包含在上面所限定位置上的多态性的分离的核酸，涉及能与这种核酸杂交的核酸引物和寡核苷酸探针和涉及包含一种或多种这样的引物和探针用于检测LMNA基因中的多态性的诊断试剂盒。

术语“患者”是指动物，优选哺乳动物，更优选灵长类动物，最优选人类。

术语“多态性”广义上限定为包括已知发生在核苷酸序列中的所有变异，包括插入，缺失，置换和重复序列(包括二重重复)。

根据本发明的上述方法可通过使用用于检测单核苷酸变异的任何合适方法而得以施用，比如用质谱对PCR产物的直接质量分析，对侵入性切割产物(invasive cleavage product)的直接分析，直接的序列分析，等位基因特异性扩增(即，ARMS^TM-等位基因特异性扩增，ARMS指扩增受阻突变体系(amplification refractory mutationsystem))，ALEX(扩增受阻突变系统线性延伸(amplificationrefractory mutation system linear extension)和COPS(竞争性寡核苷酸引发系统)，等位基因特异性杂交(ASH)，寡核苷酸连接试验(OLA)，侵入者试验，DNA芯片分析和限制性片段长度多态性(RFLP)(综述参见基因组研究(Genome Research)，1998年，8卷，769-776页；Pharmacogenomics，2000年，1卷，95-100页；人类突变(HumanMutation)，2001年，17卷，475-492页)。

携有所述多态性的核酸试样方便地是从个体中获得的血液、支气管肺泡灌洗液、痰、尿液或其它体液或组织样本。这些样品可以预先进行纯化，例如分离总DNA。可以明了，试样同样可以是对应于试样中序列的核酸序列，也就是说，在等位基因变异分析前，核酸样品中的全部或一部分区域可先用任何一种方便的技术如聚合酶链反应(PCR)或连接酶链反应(LCR)扩增。

LMNA基因中的多态性可通过对患者的核酸样品进行测序和将此序列与对照物比较来确定，或通过PCR扩增不同种族来源的无关个体的DNA中的400-600个碱基对的片段(涵盖LMNA基因的编码区和调节区)来确定。这些样品中的片段可用正向和反向引物测序，多态性可用PolyPhred软件(经华盛顿大学许可)检测而变体的等位基因频率可被确定(人类突变(Human Mutation)，2001年，17卷，243-254页)。

显然，对于对本领域技术人员来说有大量的分析方法可被用于检测在本发明的一个或多个多态位置处变异核苷酸存在与否。一般来说，等位基因变异的检测需要突变辨别技术，任选地扩增反应和任选地信号生成系统。国际专利申请WO00/06768列出了许多扩增技术和突变检测技术，其中一些是基于PCR技术的。这些技术可和许多信号生成系统联合使用，可选的信号生成系统也被列于WO00/06768。

用于检测等位基因变异的许多现行方法综述于Nollau等，临床化学(Clin.Chem.)，1997年，43期，1114-1120页；在标准教科书例如“突变检测实验指南”(Laboratory Protocols for MutationDetection)U.Landegren编辑，牛津大学出版社，1996年和“PCR”第二版Newton & Graham编辑，BIOS Scientific Publishers Limited，1997年。

本发明涉及可被用做检测LMNA基因中多态性的诊断引物的等位基因特异性核酸引物，该诊断引物能够与在序列内于LMNA基因第244位包含多态性(例如第244位的G和A或者其反向互补序列)的核酸杂交。

等位基因特异性引物通常与恒定引物一起用于诸如PCR反应等扩增反应中，通过对位于一个特定序列位置处的一个等位基因的选择性扩增而使等位基因之间得以区分开来，例如用在ARMS 试验中的引物。等位基因特异性引物的长度优选17-50个核苷酸，更优选大约17-35个核苷酸，最优选大约17-30个核苷酸。

优选地，等位基因特异性引物与待检测的等位基因完全地相对应，但是也可以考虑其衍生物，其中3’端大约有6到8个核苷酸与待检测的等位基因对应而不超过10个，比如不超过8，6，4，2或者1个剩余核苷酸在不显著影响引物特性的情况下可以发生变化。常常在第2和/或第3位(相对于3’端)的核苷酸被错配以优化差异引物结合和优先仅从正确的等位基因辨别引物延伸。

本发明还涉及用于检测LMNA基因中的多态性的寡核苷酸探针，该探针能特异地与在序列内包含位于LMNA基因第244位的多态性(例如第244位的G和A或者其反向互补序列)的核酸杂交。

术语“寡核苷酸探针”指长度至少有17个核苷酸的一种核苷酸序列，此序列与部分或全部的人类LMNA基因，特别是表达多态性的人类LMNA基因部分对应。优选长度17到50个核苷酸。一般来说这样的探针包含与基因中相应的野生型或变体座位完全互补的碱基序列。

然而，如果需要，可以引入一个或多个错配，前提是寡核苷酸探针的辨别能力不被过度影响。本发明的探针可以携有一个或多个标记以便于检测，比如在Moleaular Beacons中。

本发明还包含一种诊断试剂盒，该试剂盒含有具有LMNA基因单核苷酸多态性的一种或多种核酸引物和/或一种或多种寡核苷酸探针，所述多态性选自于：LMNA基因第244位的G和A，以及它们的反向互补序列。

在一些实施方案中，一种组合物含有用于同时探测两个或更多个多态性位点的寡核苷酸身份的两个或更多个不同标记的基因分型寡核苷酸。也可考虑含有两套或更多套等位基因特异性引物对以允许同时靶向和扩增含多态性位点的两个或更多个区域的引物组合物。

本发明的LMNA基因分型寡核苷酸也可以固定在固体表面或在固体表面合成，如芯片、珠或玻片(如见WO 98/20020和WO 98/20019)。这种固定的基因分型寡核苷酸可以用于各种多态性检测试验，包括但不限于探针杂交和聚合酶延伸试验。本发明的固定的LMNA基因分型寡核苷酸可以包括为同时快速筛选DNA样品在多个基因中的多态性而设计的有序寡核苷酸阵列。

本发明等位基因特异性寡核苷酸引物优选具有与特定SNP的仅一种核苷酸互补的3’末端核苷酸，或优选地3’倒数第二个核苷酸，由此只有存在含该核苷酸的等位基因时其才可以用作聚合酶介导的延伸反应的引物。与编码链或非编码链杂交的等位基因特异性寡核苷酸引物包括在本发明中。使用本领域技术人员已知的技术可以开发检测LMNA基因多态性的ASO引物。

本发明其它基因分型寡核苷酸与位于这里所鉴定的新多态性位点之一下游一个至几个核苷酸处的靶区域杂交。这种寡核苷酸可用于聚合酶介导的引物延伸方法中以检测这里所描述的新多态性之一，因此这种基因分型寡核苷酸这里称作“引物延伸寡核苷酸”。在优选实施方案中，引物延伸寡核苷酸的3’末端是与多态性位点紧临的核苷酸互补的脱氧核苷酸。

在另一个实施方案中，本发明提供了包括包装在分开容器中的至少两个基因分型寡核苷酸的试剂盒。该试剂盒也可以含有包装在分开容器中的其它成分如杂交缓冲液(此时寡核苷酸待用作探针)。可供选择地，当寡核苷酸待用于扩增靶区域时，该试剂盒可以含有包装在分开容器中的聚合酶和用于聚合酶介导的引物延伸如FCR的经优化反应缓冲液。

上述寡核苷酸组合物和试剂盒在个体LMNA基因的基因分型和/或单元型分型方法中有用。

本发明还涉及能够特异识别lamin A蛋白质E82K突变的抗体。所述抗体可以是单克隆抗体或者多克隆抗体

本发明还涉及包含本发明突变核酸分子的载体。所述载体可以是表达载体或者克隆载体。优选地，所述突变核酸分子与控制所述突变核酸分子在目的宿主细胞中表达的调控序列可操作地连接。

本发明还涉及包含本发明的突变核酸分子或者载体的细胞(包括动物细胞、植物细胞和微生物细胞)或者生物体，例如非人动物，优选哺乳动物，更优选试验动物。

本发明还涉及组合物，其包含本发明的突变核酸分子或者蛋白质。

本发明还涉及在患者中矫正LMNA基因突变的方法，所述患者的LMNA基因第244位的G发生突变(如G244A突变)或者lamin A蛋白质第82位E发生突变(如E82K突变)，所述方法包括向所述患者给予正常的LMNA基因或者正常的lamin A蛋白质。

用正常的LMNA基因来进行基因治疗可以采用本领域已知的任何方法进行，这些方法本身对于本发明不是关键的。本领域有多种基因治疗方法，这些方法的具体细节可参考各种相关试验手册或者其它文献。

本发明还涉及正常的LMNA基因或者正常的lamin A蛋白质在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或者预防患者疾病(如心脏疾病特别是扩张型心肌病)，所述患者的LMNA基因第244位的G发生突变(如G244A突变)或者lamin A蛋白质第82位E发生突变(如E82K突变)。

本发明还涉及含有正常的LMNA基因或者正常的lamin A蛋白质的药物组合物。所述药物组合物可用于治疗或者预防患者疾病(如心脏疾病特别是扩张型心肌病)，所述患者的LMNA基因第244位的G发生突变(如G244A突变)或者lamin A蛋白质第82位E发生突变(如E82K突变)。

本发明还涉及诊断患者疾病(如心脏疾病特别是扩张型心肌病)的方法，所述方法包括检测所述患者的LMNA基因中第244位G突变如G244A突变的存在或者lamin A蛋白质中第82位E突变如E82K突变的存在。

本发明还涉及确定患者对疾病(如心脏疾病特别是扩张型心肌病)的遗传易感性的方法，所述方法检测所述患者的LMNA基因中第244位G突变如G244A突变的存在或者lamin A蛋白质中第82位E突变如E82K突变的存在。

检测单核苷酸突变和氨基酸突变的技术是本领域已知的，并在本文中有描述。本发明的诊断和检测方法可以采用任何这些技术。

本发明还涉及检测所述患者的LMNA基因中第244位G突变如G244A突变的存在或者lamin A蛋白质中第82位E突变如E82K突变的存在的物质在制备诊断试剂的用途，所述诊断试剂用于诊断患者疾病(如心脏疾病特别是扩张型心肌病)或者用于确定患者对疾病(如心脏疾病特别是扩张型心肌病)的遗传易感性。

在一个具体实施方案中，所述物质选自：

本发明的突变核酸分子；

能够特异识别lamin A蛋白质E82K突变的抗体；和

能够特异识别LMNA基因G244A突变的引物或者探针或者限制性内切酶；以及用于检测本发明单核苷酸多态性的任何其它试剂。

本发明还涉及分析从患者获得的离体生物样品的方法，包括：检测所述样品中LMNA基因第244位G突变如G244A突变的存在或者lamin A蛋白质第82位E突变如E82K突变的存在。优选地，所述方法还包括确定所述患者对疾病(如心脏疾病特别是扩张型心肌病)的遗传易感性或者诊断患者疾病(如心脏疾病特别是扩张型心肌病)。

本发明还涉及分析从患者获得的离体生物样品或者核酸样品的基因型的方法，包括：检测所述样品中LMNA基因第244位的多态性(如G244A突变)或者lamin A蛋白质第82位的多态性(如E82K突变)。优选地，所述方法还包括根据所述多态性确定所述患者对疾病(如心脏疾病特别是扩张型心肌病)的遗传易感性或者诊断患者疾病(如心脏疾病特别是扩张型心肌病)。

在上述诊断疾病、确定遗传易感性、分析样品和分析基因型的方法中，当LMNA基因第244位G发生突变，尤其是G244A突变，或者lamin A蛋白质第82位E发生突变，尤其是E82K突变时，指示患者对疾病(如心脏疾病特别是扩张型心肌病)具有遗传易感性(如果患者没有可检测/可观察的疾病症状)，或者患者可能患有疾病(如心脏疾病特别是扩张型心肌病)(如果患者出现可检测/可观察的疾病症状)。

本发明还涉及筛选或者评价用于预防或者治疗扩张型心肌病的药物的方法，包括：

将候选物质(包括纯化的或者未纯化的化合物、组合物或者提取物等)与包含本发明核酸分子或者本发明蛋白质或者本发明载体的细胞、组织、或者器官接触，并检测lamin A蛋白质的活性或者指示扩张型心肌病状况的指标；

或者

将候选物质给予包含本发明核酸分子的转基因非人动物，并检测lamin A蛋白质的活性或者检查扩张型心肌病的症状或者指示扩张型心肌病状况的指标。

如果所述细胞或者动物中检测lamin A蛋白质的活性或者检查扩张型心肌病的症状或者指示扩张型心肌病状况的指标改善，指示候选物质具有预防或者治疗扩张型心肌病的潜力。

一般地，本发明涉及：

1.一种分离的LMNA核酸分子或其片段，它具有第244-246位核苷酸的突变，特别是第244位G的突变，如G244A突变。

2.项目1的核酸分子，其中，所述核酸分子来源于动物，优选哺乳动物，更优选灵长类动物，最优选人类。

3.前述项目任一项的核酸分子，其中，所述核酸分子是DNA(特别是cDNA和基因组DNA)。

4.前述项目任一项的核酸分子，其中，所述核酸分子包含以下核苷酸序列之一：

(1)包含G244A突变的SEQ ID NO：1的核苷酸序列；

(2)与SEQ ID NO：1具有至少70％(优选至少75％、至少75％、至少80％、至少85％、更优选至少90％、至少93％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％)同一性并包含G244A突变的核苷酸序列；

(3)与SEQ ID NO：1在严紧条件下杂交并包含G244A突变的核苷酸序列；

(4)在SEQ ID NO：1中存在一个或多个插入、缺失和/或替代并包含G244A突变的核苷酸序列；

(5)前述序列中包含G244A突变的片段；和

(6)前述序列的简并序列和互补序列。

5.包含第82位E的突变如E82K突变的lamin A蛋白质。

6.项目5的蛋白质，其中，所述蛋白质来源于动物，优选哺乳动物，更优选灵长类动物，最优选人类。

7.前述项目任一项的蛋白质，其中，所述蛋白质包含以下氨基酸序列之一：

(1)包含E82K突变的SEQ ID NO：2的氨基酸序列；

(2)由项目1-4任一项的核酸分子编码的氨基酸序列；

(5)前述序列中包含E82K突变的片段。

8.能够特异识别lamin A蛋白质E82K突变的抗体。

9.包含项目1-4任一项的核酸分子的载体。

10.包含项目1-4任一项的核酸分子或者项目9的载体的细胞(包括动物细胞、植物细胞和微生物细胞)或者生物体，优选试验动物。

11.组合物，其包含项目1-4任一项的核酸分子或者5-7任一项的蛋白质。

12.用于确定LMNA第244位多态性位点的遗传多态性模式的工具。

13.项目12的工具，它是LMNA基因第244位多态性分型寡核苷酸，优选是：等位基因特异性核酸引物，能够检测LMNA基因第244位的多态性(例如第244位的G和A或者其反向互补序列)，和用于检测LMNA基因中的多态性的寡核苷酸探针，其能特异地与具有LMNA基因第244位多态性(例如第244位的G和A或者其反向互补序列)的核酸杂交。

14.根据项目13的工具，其中寡核苷酸探针的长度为17-50个核苷酸。

15.包含一种或多种项目13定义的LMNA基因第244位多态性分型寡核苷酸的诊断试剂盒。

16.治疗或者预防患者疾病(如心脏疾病特别是扩张型心肌病)的方法，所述患者的LMNA基因第244位的G发生突变(如G244A突变)或者lamin A蛋白质第82位E发生突变(如E82K突变)，所述方法包括向所述患者给予正常的LMNA基因或者正常的lamin A蛋白质。

17.在患者中矫正LMNA基因突变的方法，所述患者的LMNA基因第244位的G发生突变(如G244A突变)或者lamin A蛋白质第82位E发生突变(如E82K突变)，所述方法包括向所述患者给予正常的LMNA基因或者正常的lamin A蛋白质。

18.正常的LMNA基因或者正常的lamin A蛋白质在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或者预防患者疾病(如心脏疾病特别是扩张型心肌病)，所述患者的LMNA基因第244位的G发生突变(如G244A突变)或者lamin A蛋白质第82位E发生突变(如E82K突变)。

19.含有正常的LMNA基因或者正常的lamin A蛋白质的药物组合物。

20.诊断患者疾病(如心脏疾病特别是扩张型心肌病)的方法，所述方法包括检测来自所述患者的样品的LMNA基因中第244位G突变如G244A突变的存在或者lamin A蛋白质中第82位E突变如E82K突变的存在。

21.确定患者对疾病(如心脏疾病特别是扩张型心肌病)的遗传易感性的方法，所述方法包括检测来自所述患者的样品的LMNA基因中第244位G突变如G244A突变的存在或者lamin A蛋白质中第82位E突变如E82K突变的存在。

22.分析从患者分离的离体生物0样品的方法，包括：检测所述样品中LMNA基因第244位G突变如G244A突变的存在或者lamin A蛋白质第82位E突变如E82K突变的存在。

23.项目22的方法，还包括确定所述患者对疾病(如心脏疾病特别是扩张型心肌病)的遗传易感性或者诊断患者疾病(如心脏疾病特别是扩张型心肌病)。

24.项目20至23任一项的方法，其中使用包括选自以下的差异核酸分析技术的试验：用质谱对PCR产物直接质量分析、对侵入性切割产物直接分析、直接序列分析、等位基因特异性扩增、等位基因特异性杂交、寡核苷酸连接试验、侵入者试验、DNA芯片分析和限制性片段长度多态性。

25.筛选或者评价用于预防或者治疗扩张型心肌病的药物的方法，包括：

将候选物质与包含项目1-4的核酸分子或者项目5-7的蛋白质或者本发明的载体的细胞、组织、或者器官接触，并检测lamin A蛋白质的活性或者指示扩张型心肌病状况的指标；

或者

将候选物质给予包含项目1-4的核酸分子的转基因非人动物，并检测lamin A蛋白质的活性或者检查扩张型心肌病的症状或者指示扩张型心肌病状况的指标。

26.项目25的方法，所述细胞、组织、器官或动物个体是通过基因敲除或敲入的方法而得到的。

27.一种微阵列，其中包含项目13所定义的LMNA基因第244位多态性分型寡核苷酸。

28.项目27的微阵列，它是DNA芯片的形式。

29.检测生物学样品的LMNA基因中第244位G突变如G244A突变的存在或者lamin A蛋白质中第82位E突变如E82K突变的存在的物质在制备诊断试剂的用途，所述诊断试剂用于诊断患者疾病(如心脏疾病特别是扩张型心肌病)或者用于确定患者对疾病(如心脏疾病特别是扩张型心肌病)的遗传易感性。

30.项目29的用途，其中所述物质选自：

项目1-4的核酸分子；

能够特异识别lamin A蛋白质E82K突变的抗体；和

项目12-14任一项的工具，如

能够特异识别LMNA基因G244A突变的引物或者探针或者限制性内切酶。

实施例

一、研究对象和目的：

研究对象：在山西省长治市采集的一个扩张型心肌病伴有房室传导阻滞的家系，共50名成员。正常研究对照60例为性别、年龄匹配的健康人。研究目的：(1)对此扩张型心肌病家系的50名成员进行Lamin A/C(LMNA)基因突变扫描，寻找突变位点。(2)将野生型及突变型LMNA基因转入HEK293细胞，筛选稳定转染株，光学和电子显微镜观察细胞变化。(3)过氧化氢刺激野生和突变型LMNA基因及空载体稳定转染的HEK293细胞株，流式细胞仪检测三组细胞凋亡率及细胞周期的变化。

扩张型心肌病诊断标准(WHO/ISFC 1995年公布)

1.左室射血分数＜45％

2.左室舒张末期内径＞2.7cm/m2或左心室舒张末内径≥55mm

3.还需排除下列疾病：高血压；冠状动脉性心脏病；长期饮酒史；持续、快速的室上性心律失常；系统性疾病；心包疾病；先天性心脏病；肺心病

二、实验材料：

(一)、主要试剂：

SDS 华美生物工程公司

蛋白酶E 上海生物工程技术有限公司

10×PCR缓冲液 TaKaRa生物技术有限公司

dNTP TaKaRa生物技术有限公司

Taq酶 TaKaRa生物技术有限公司

PCR引物上海生物工程技术有限公司

核酸分子参照物(DL2000) TaKaRa生物技术有限公司

琼脂糖华美生物工程公司

溴化乙锭华美生物工程公司

丙烯酰胺华美生物工程公司

甲叉丙烯酰胺华美生物工程公司

过硫酸铵(APS) 华美生物工程公司

亚基乙二胺(TEMED) 华美生物工程公司

测序用剂美国Perkin Elmer

胎牛血清美国Hyclone公司

DMEM培养基美国Gibco BRL公司

HiSpeed Plasmid Midi Kit 德国QIAGEN公司

Lipofectamin2000 美国Invitrogen公司

Hoechst 33342 美国sigma公司

其它试剂：双蒸水、无水乙醇、氯化钠、氯仿、Tris、EDTA、硼酸、氢氧化钠、甲醛、冰醋酸、溴酚蓝、二甲苯蓝、甘油、氯化铵、碳酸氢铵、醋酸钠

(二)、主要实验仪器：

pH计(Φ71) 美国Beckman

1/1000电子分析天平德国Sartorius

电热恒温水浴箱(WS2-261-79) 北京医疗设备厂

电磁搅拌器(JB-3) 上海雷磁仪器厂

漩涡振荡器江苏国华仪器厂

超纯水装置

低温离心机(RC SC) 美国Sorvall

微型室温离心机(Z231M) 德国Hermle

高速冷冻离心机(Z360K) 德国Hermle

-70℃深低温冰箱(8325) 美国Forma

冰冻干燥机(爱德华EF-4) 美国Savant

紫外分光光度计(UV-1206) 美国Bio-Rad

稳压稳流定时电泳仪(DYY-III6) 北京六一仪器厂

水平电泳槽(Mupid-2) Cosmo.BIO公司

垂直电泳槽北京六一仪器厂

紫外成像扫描仪美国Bio-Rad

微机图象处理系统(ASTVision4I) Cosmo.BIO公司

摄相仪(BIO-RAD Gel Doc1000) Cosmo.BIO公司

微量移液器法国Gilson

PCR仪美国Perkin Elmer

(GeneAmp PCR System9700)

PCR仪(PTC-200) 美国MJ Research

PCR仪(T3-Thermolycler) 德国Biometra

测序仪(ABI PRISM 377) 美国Perkin Elmer

CO2细胞培养箱日本SANYO公司

倒置光学显微镜日本Nikon公司

流式细胞仪美国BD公司

电子显微镜德国西门子公司

荧光显微镜日本Nikon公司

(三)、主要溶液配方

(1)5xTBE：54克Tris，0.5M EDTA(pH＝8.0)20ml，硼酸27.5克，加蒸馏水定容至1000ml。

(2)低渗溶血液：氯化铵7.01克，碳酸氢钾0.07克，加蒸馏水定容至1000ml。

(3)SE：醋酸钠1.36克，氯化钠4.38克，加蒸馏水400ml，冰醋酸调PH至5.6，定容至500ml。

(4)蛋白酶E：10mg/ml

(5)TE：1M Tris-盐酸(pH＝8)1ml，0.5M EDTA(pH＝8.0)0.02ml，加蒸馏水至100ml。

三、实验方法；

1.取外周血，分离白细胞：

(1)取患者肘静脉血5ml，EDTA抗凝，2500rpm离心10min。

(2)小心吸取上层血浆，分装。

(3)在血细胞中加入3倍体积的溶血液，摇匀，冰浴15min。

(4)2500rpm离心10min，弃上清。

(5)加入10ml溶血液，摇匀，冰浴15min。

(6)3000rpm离心10min，弃上清。

(7)倒置离心管，流干残液。

(8)得白细胞，-80℃冻存。

2.从白细胞中提取基因组DNA：

(1)取白细胞，加4.5ml SE，使劲吹打，混匀。

(2)沿管壁加入0.5ml的10％SDS。

(3)加蛋白酶E 50μl。

(4)首尾轻摇10min，混匀。

(5)37℃水浴过夜。

(6)第二天取出，沿管壁加3ml饱和NaCl，迅速手摇15s，使蛋白变性析出。

(7)4000rpm离心10min。

(8)取上清，转入另一管中，加等体积的三氯甲烷，摇10min，混匀。

(9)2500rpm离心10min。

(10)取上清，转入另一管中，加等体积的三氯甲烷，摇10min，混匀。

(11)2500rpm离心10min。

(12)取上清，转入50ml管中，加3倍体积无水乙醇。

(13)首尾轻摇，见DNA絮状沉淀析出。

(14)将DNA挑至管壁，75％乙醇洗涤2遍。

(15)将DNA挑至0.5ml管中，冻干。

(16)加TE 300μl，使DNA溶解，紫外分光光度计测OD值定量，4℃保存。

3.Lamin A/C基因的PCR扩增：

(1)PCR扩增条件(引物及扩增条件根据文献设计)。

基因组序列来自Genebank data base(登陆号为L12399，L12400，L12401)

外显子	引物	扩增条件	循环数
外显子	引物	扩增条件	循环数	123，44，56，77，8	F：ccc aga tcc cga ggt ccg acR：cct ctc cac tcc ccg ccaF：cag act cct tct ctt aaatct acR：cct agg tag aag agt gagtgt acF：cct tca agt tct tgt gttctg tga cR：ctc cct gcc acc atc tgcF：ggc ctc cca gga act aattct gR：cca aag ccc tga gaa gtgaagF：gcc agg act atg ttt agagct tgR：ccc tga tgc agc tgt atccccF：ccc cac ttg gtc tcc ctc	94℃，4min：94℃，30sec，67℃，30sec，72℃，30sec；72℃，4min94℃，4min；94℃，30sec，58℃，30sec，72℃，45sec；72℃，4min94℃，4min；94℃，30sec，60℃，30sec，72℃，45sec；72℃，4min94℃，4min；94℃，30sec，59℃，30sec，72℃45sec，72℃，4min94℃，4min；94℃，30sec，58℃，30sec，72℃，45sec，72℃，4min94℃，4min；94℃，30sec，64	353530353530

9，10，1112

tccR：gaa aag gac act tac cccagcF：gga gcg ctg ggg taa gtg tcR：gct gcg gaa gag aag gcaggc tcF：ggg gtg gca gct tcg gggaca atcR：agg gaa aag gaa ggg aggaga aat

℃，30sec，72℃，45sec℃，4min94℃，4min；94，30sec，℃，30sec，72℃，45sec，℃，4min94℃，4min；94，30sec，℃，30sec，72，45sec，℃，4min

7267725872

3035

(2)PCR反应基本体系(50μl)：

引物(浓度20pmol/μl) 1μl

10×buffer 5μl

TaqDNA聚合酶(2u/μl) 1μl

dNTP(10mM) 1μl

人基因组DNA 1μl

ddH₂O 41μl

4.PCR产物纯化

(1)醋酸氨∶乙醇按1∶5的比例(体积比)混匀；

(2)将PCR产物按1∶6的比例与醋酸氨乙醇混合物(体积比)混匀；

(3)-70℃放置30min；

(4)4000rpm离心10min；

(5)14,000rpm离心15min；

(6)弃上清；

(7)75％乙醇清洗；

(8)14000rpm离心5min；弃上清；

(9)等管中乙醇完全挥发后，加入TE 20μl溶解。

5.测序反应：

(1)反应体系(20μl)

BigDye^TM 4μl

BigDye^TM Buffer 2μl

引物(同PCR扩增引物) 10pmol/μl

(2)反应条件(根据引物的退火温度而定)：

94℃4 min

72℃4 min

4℃∞

(3)测序产物的纯化：

20μl产物中加25μl醋酸铵和125μl乙醇，置-70℃1小时，14,000rpm离心10分钟，弃上清，加75％的乙醇100μl，14,000rpm离心5分钟，弃上清，95℃1分钟烤干，加入2μl loading buffer，混匀，94℃变性5分钟，然后迅速置于冰上。

(4)将纯化后的测序反应产物在ABI PRISM377自动测序仪上测序。

(5)用GeneJockey、AssemblyLIGN^TM、Sequencing Analysis 3.4软件阅读及核对测序图

6.野生型及突变型LMNA基因载体的构建：

含有野生LMNA的pTracer-CMV载体由美国癌症及发展生物学实验室的Colin L.Strwart教授惠赠，委托基因公司将LMNA基因的第244位碱基由G突变为A，即第82位氨基酸由谷氨酸变为赖氨酸。

7.细胞培养：

HEK293细胞含10％胎牛血清(Hyclone，Cat.No.SH30071.02)的DMEM培养基(Gibco，Cat.No.12800-017)，加入100μg/ml的青霉素(华北制药有限公司)和100μg/ml的链霉素(华北制药有限公司)，5％二氧化碳、37℃孵箱孵育。

8.细胞转染：

实验步骤完全按照Invitrogen公司实验手册进行，细胞分为三组，分别为野生组，突变组和空载体组，每组设三个平行的样品，转染前一天将HEK293细胞传入6孔细胞培养板，当细胞覆盖率在80％时进行转染，每孔分别加入3μg的含野生型、突变型LMNA及空载体的质粒和6μl LipofectAMINE(Invitrogen)，并在每孔中加入8μlzeocin(100mg/ml Invitrogen)筛选，1个月后得到稳定克隆。

9.光学和电子显微镜观察：

三组细胞分别用HE染色后光学显微镜下观察细胞大体形态差异，常规方法处理细胞后电子显微镜下观察细胞超微结构的差异。

10.凋亡和细胞周期研究：

三组细胞在用H₂O₂刺激的前一天用无血清的DMEM替换原培养基，24小时后，分别用终浓度为0.8mmol/L的3％H₂O₂刺激24小时，弃去培养基，用生理盐水漂洗细胞两次，70％的冰乙醇固定细胞24小时后流式细胞仪检测三组细胞凋亡率和细胞周期间的差异，同时用Hoechst 33342染色活细胞后荧光显微镜下观察并照相。

实施例1：对扩张型心肌病家系的50名成员进行Lamin A/C(LMNA)基因突变扫描，寻找突变位点。

LMNA基因筛查结果：测序证实该扩张型心肌病家系(图1)中4名患者及4名表型正常的患者子女(12-28岁，无症状)(表2)的LMNA基因第244位核苷酸发生G→A转换，使谷氨酸(Glu)变为赖氨酸(Lys)(图2)。正常对照组皆未发现异常。

此突变位点位于LMNA基因的L1和1B区域的交界处，而该点在生物的进化中是非常保守的，提示该位点可能在蛋白功能中有关键性的作用(图3，4)。

实施例2：将野生型及突变型LMNA基因转入HEK293细胞，筛选稳定转染株，光学和电子显微镜观察细胞变化。

光镜和电镜观察到转染野生型和突变型LMNA基因的HEK293细胞间存在差异：光镜下：转染野生型LMNA基因的细胞和转染突变型LMNA基因的细胞HE染色后，转染突变型LMNA基因的HEK293细胞分裂增殖旺盛，核分裂相明显增多，细胞趋于幼稚化，处于分裂期的细胞占细胞总数的百分比为17.4％±1.65，与其它三组细胞-转染野生LMNA基因的细胞(5.6％±0.55)，转染空载体的细胞(5.0％±0.30)和对照细胞(4.9％±0.69)存在显著性差异(P＜0.01，M±SE，n＝3)(图5A、5C、5E).电镜下：转染野生型LMNA基因的细胞的细胞膜结构完全分化，可见绒毛，胞浆内细胞器丰富，可见线粒体、内质网及大量核糖体，而在转染突变型LMNA基因的HEK293细胞中细胞膜结构分化不清，无绒毛，胞浆内细胞器种类完整但数量少，缺少核糖体，细胞明显分化不完全(图5B、5D)

实施例3：过氧化氢刺激野生和突变型LMNA基因及空载体稳定转染的HEK293细胞株，流式细胞仪检测三组细胞凋亡率及细胞周期的变化

H₂O₂诱导的细胞凋亡实验中，转入突变LMNA基因的HEK293细胞的凋亡率明显高于转入野生型LMNA基因的细胞，且细胞周期发生改变：0.8mmol/L的H₂O₂诱导24h后，转入突变LMNA基因的HEK293细胞组凋亡率为29.1％±1.24，明显高于其它三组细胞-转染野生LMNA基因的细胞(2.6％±0.28)，转染空载体的细胞(2.4％±0.32)和对照细胞(1.9％±0.31)(P＜0.01，M±SD，n＝3)(图6).同时，转入突变LMNA基因的HEK293细胞组处于不同细胞周期G1，G2和S期的细胞占细胞总数的百分比与其它三组细胞也存在显著性差异(图7A，7B).

表2：LMNA/C基因突变患者的临床资料

代码	III-19	IV-3	IV-7	IV -11	IV-15	IV-19	IV-40	V-8	V-9	V-20
代码	III-19	IV-3	IV-7	IV -11	IV-15	IV-19	IV-40	V-8	V-9	V-20	年龄性别NYHA分级心律失常心电图左室舒张末内径(mm)左室射血分数％神经肌肉症状	42^*男IV起搏器心律房颤AVBIII°7012N	43男IIIAVBIII°7845N	48^**男IV房室交界性逸博心律ST-TchangN	43男IV阵发性室上速起搏器心律AVBIII°6841N	38男III6043N	34男II5555N	25男I52.866N	27女IN	24女I窦性心律不齐N	12男I窦性心律不齐N

Claims

2.前述权利要求任一项的核酸分子，其中，所述核酸分子包含以下核苷酸序列之一：

(1)包含G244A突变的SEQ ID NO：1的核苷酸序列；

(5)前述序列中包含G244A突变的片段；和

(6)前述序列的简并序列和互补序列。

3.包含第82位E的突变如E82K突变的lamin A蛋白质。

4.前述权利要求任一项的蛋白质，其中，所述蛋白质包含以下氨基酸序列之一：

(1)包含E82K突变的SEQ ID NO：2的氨基酸序列；

(2)由权利要求1-4任一项的核酸分子编码的氨基酸序列；

(5)前述序列中包含E82K突变的片段。

5.用于确定LMNA第244位多态性位点的遗传多态性模式的工具。

6.权利要求5的工具，它是LMNA基因第244位多态性分型寡核苷酸，优选：等位基因特异性核酸引物，能够检测LMNA基因第244位的多态性(例如第244位的G和A或者其反向互补序列)，和用于检测LMNA基因中的多态性的寡核苷酸探针，其能特异地与具有LMNA基因第244位多态性(例如第244位的G和A或者其反向互补序列)的核酸杂交。

7.包含一种或多种权利要求6定义的LMNA基因第244位多态性分型寡核苷酸的诊断试剂盒。

8.正常的LMNA基因或者正常的lamin A蛋白质在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或者预防患者疾病(如心脏疾病特别是扩张型心肌病)，所述患者的LMNA基因第244位的G发生突变(如G244A突变)或者lamin A蛋白质第82位E发生突变(如E82K突变)。

9.诊断患者疾病(如心脏疾病特别是扩张型心肌病)或者确定患者对疾病(如心脏疾病特别是扩张型心肌病)的遗传易感性的方法，所述方法包括检测来自所述患者的样品的LMNA基因中第244位G突变如G244A突变的存在或者lamin A蛋白质中第82位E突变如E82K突变的存在。

10.治疗或者预防患者疾病(如心脏疾病特别是扩张型心肌病)的方法，所述患者的LMNA基因第244位的G发生突变(如G244A突变)或者lamin A蛋白质第82位E发生突变(如E82K突变)，所述方法包括向所述患者给予正常的LMNA基因或者正常的lamin A蛋白质。