CN1211486C

CN1211486C - 编码前神经肽y原突变体,一种信号肽的突变体,的dna分子及其应用

Info

Publication number: CN1211486C
Application number: CNB988123797A
Authority: CN
Inventors: M·库鲁; M·卡沃宁; U·佩索宁; M·乌斯图帕
Original assignee: Hormos Medical Ltd Oy
Current assignee: Hormos Medical Ltd Oy
Priority date: 1997-12-19
Filing date: 1998-12-16
Publication date: 2005-07-20
Anticipated expiration: 2018-12-16
Also published as: HUP0100674A3; HUP0100674A2; US7084242B2; BR9813813A; AU1673599A; CN1282338A; EP1037922A1; NO20003116D0; NZ514067A; PL195844B1; RU2219186C2; WO1999032518A1; AU752138B2; US20030093821A1; NO20003116L; EE200000356A; NZ504633A; CA2314614A1; JP2001526296A; KR20010033351A

Abstract

本发明涉及一段DNA序列，该序列包含编码前神经肽Y原(preproNPY)的核苷酸序列，其中上述的前神经肽Y原中信号肽部分上的第7位的亮氨酸被脯氨酸所取代。本发明进一步涉及到该种或与前神经肽Y原的任何其它裂解产物相连的信号肽突变体，以及在生物样品中检测上述DNA序列或肽的方法。另外，本发明还涉及对具血清胆固醇或LDL胆固醇水平升高体质的患者进行诊断以及对已被诊断为具体内血清胆固醇或LDL胆固醇升高体质的患者进行治疗的方法。携带突变序列或正常序列的转基因动物也包含在本发明的范围内。

Description

编码前神经肽Y原突变体，一种信号肽的突变体，的 DNA分子及其应用

发明领域

本发明涉及一段编码人前神经肽Y原(preproNPY)突变体的DNA序列、其突变信号肽或与前神经肽Y原的任何其它裂解产物相连的信号肽、以及在生物样品中检测上述DNA序列或肽的方法。另外，本发明也涉及用于诊断患者血清胆固醇或LDL胆固醇升高的体质的方法，以及对已诊断出具有血清胆固醇或LDL胆固醇升高体质的患者进行治疗的方法。携带突变序列或正常序列的转基因动物也包含在本发明的范围内。

发明背景

本文中所采用的用于阐明本发明背景的出版物和其它材料，特别是提供了与实践相关的额外细节的案例，均作为参照结合于本文中。

神经肽Y(neuropeptide Y，NPY)是一种含36个氨基酸的肽类激素，在中枢及外周神经系统中均大量表达。NPY在下丘脑调节的进食和能量消耗过程中起着重要作用。对试验动物中枢施用NPY会显著刺激进食，慢性灌输可导致发展肥胖、高胰岛素血症以及胰岛素抗性。关于NPY在人体肥胖或新陈代谢疾病中所起的作用则相对知之甚少。

神经肽Y(NPY)是一个肽家族的成员之一，它是一种神经递质，在中枢及外周神经系统中均大量表达^1，2。NPY涉及好几种调节功能，包括进食^3，4，5、焦虑^6，7、脑下垂体激素释放^8，9，10、生热¹¹和胰岛素释放¹²。

在动物体内，NPY在下丘脑调节的能量平衡过程中起重要作用。中枢施用NPY后明显刺激进食¹³。它也可以通过降低褐色脂肪组织的产热来降低能量消耗，通过提高白色脂肪组织中脂蛋白脂肪酶的活性来帮助能量储存¹⁴。慢性脑室内灌输NPY会导致肥胖及胰岛素抗性的发展¹³。禁食显著增强了脑下垂体NPY的活性(重新喂食则使其活性降低)，而脑下垂体NPY神经则受外周激素(如胰岛素和leptin^*)的反馈调节^14，15，16。因此，在肥胖fa/fa Zucker大鼠中，前NPY原mRNA和NPY在脑下垂体中的表达水平升高，该大鼠的leptin信号传导减弱，原因是其leptin基因上有一个突变位点。对于人类，患厌食症的患者脑脊髓液中NPY的浓度升高¹⁹，这与假定的NPY补偿性激活机理是一致的。重要的是，厌食症患者也表现出胆固醇水平的升高^20，21。然而，文献中却没有将NPY基因或上述的NPY与胆固醇代谢或血清胆固醇水平联系起来的报道。

发明概述

根据本发明的第一方面，本发明涉及一段含有编码前神经肽Y原(prepro-neuropeptide Y，preproNPY)的核苷酸序列的DNA序列，其中上述前NPY原的信号肽部分中第7位上的亮氨酸被脯氨酸取代。

根据本发明的第二方面，本发明涉及一种对患者进行筛选以确定该患者是否携带突变的NPY基因的方法，包括以下步骤：准备待筛选的患者的一份生物样品；和提供一项检测以确定生物样品中i)正常的NPY基因或ii)突变的NPY基因的存在。

根据本发明的第三方面，本发明涉及一种第7位上的亮氨酸被脯氨酸取代的信号肽，以及与前NPY原的任何其它裂解产物相连的上述信号肽。

根据本发明的第四方面，本发明涉及一种抗体，该抗体具有结合上述信号肽及与前NPY原的任何其它裂解产物相连的上述信号肽的能力，以及对生物样品中的上述肽进行确定的免疫测定方法。

根据本发明的第五方面，本发明涉及一种诊断患者血清胆固醇或LDL胆固醇水平升高体质的方法，该方法包括确定该患者在人前NPY原的信号肽部分是否存在多态性，该多态性包括在上述前NPY原的信号肽部分中第7位上的亮氨酸被脯氨酸取代，该多肽性表现出具有血清胆固醇或LDL胆固醇水平升高体质。

根据本发明的第六方面，本发明涉及一种对被诊断具有血清胆固醇或LDL胆固醇升高体质的患者进行治疗，以防止上述患者中血清胆固醇或LDL胆固醇水平升高的方法，包括给该患者施用有效剂量的一种能够抵消突变的NPY基因的影响的药剂。

根据本发明的第七方面，本发明涉及一种对被诊断具有血清胆固醇或LDL胆固醇升高体质的患者进行治疗以防止上述患者中血清胆固醇或LDL胆固醇水平升高的方法，包括对该人进行特定的基因治疗以修复其突变的NPY基因。

根据本发明的又一方面，本发明涉及一种转基因动物，该动物携带有一段含有编码前NPY原的核苷酸序列的DNA序列，其中上述前NPY原的信号肽部分中的第7位上的亮氨酸i)被脯氨酸取代，或ii)没有变化。

根据本发明的又一方面，本发明涉及一种携带一段DNA序列的转基因动物，该DNA序列含有编码其它正常小鼠NPY序列的核苷酸序列，或者该序列的一部分编码成年小鼠NPY肽，但是其中编码小鼠信号肽的核苷酸序列被编码人的正常或突变信号肽的信号肽序列所取代。

根据本发明的又一方面，本发明涉及一种可表达突变的人NPY基因或其部分的细胞株。

附图简述

图1a用图解说明人NPY基因、前NPY原肽和成熟的NPY肽的分子结构

图1b显示人NPY基因的核苷酸序列。大写字母表示外显子序列位于小写字母的内含子序列中。基因文库的新添编号列于圆括号内。箭头表示在该位置上正常基因的T被C取代以形成突变基因。外显子2中的下划线序列是编码28个氨基酸的信号肽的序列(外显子1是序列标号第1号，外显子2是序列标号第2号，外显子3是序列标号第3号，外显子4是序列标号第4号)，

图1c显示人前NPY原mRNA的核苷酸序列(序列标号第5号，蛋白质序列在序列标号第6号中列出)。箭头表示在该位置上正常mRNA的t被c取代以形成突变的mRNA，

图2显示在肥胖患者中a)空腹时的血清中总体胆固醇，b)LDL-胆固醇，c)HDL-胆固醇及d)VLDL-胆固醇，其中实框表示前NPY原的信号肽上Leu/Leu 7纯合的患者(数量＝120)，虚框表示在前NPY原的信号肽上Leu 7/Pro 7杂合或Pro 7/Pro 7纯合的患者(数量＝21)，以及

图3显示在正常患者中a)空腹时的血清胆总体胆固醇，b)LDL-胆固醇，c)HDL-胆固醇及d)VLDL-胆固醇，其中实框表示前NPY原的信号肽上Leu/Leu 7纯合的患者(数量＝56)，虚框表示在前NPY原的信号肽上Leu 7/Pro 7杂合或Pro 7/Pro 7纯合的患者(数量＝8)。

发明详述

本发明是本发明者调查能量代谢和肥胖的基因背景的研究计划中的一部分。在本说明书中我们报道的是对在NPY基因的信号肽部分上的一种相当普遍的多态现象进行鉴定。令人吃惊的是，在正常体重和肥胖的非糖尿病患者中，发现这种7位亮氨酸改变为脯氨酸的多态现象与总体胆固醇以及LDL胆固醇水平的明显升高相关，而不与能量代谢或肥胖相关。

DNA序列、突变的信号肽、或上述的与前NPY原的其它任何裂解产物相连的肽可被用于对患者进行筛选以确定该患者是否为突变NPY基因的携带者。

该鉴定的执行可以通过众所周知的方法进行DNA分析，包括直接对正常和突变的NPY基因进行DNA序列测定，采用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)进行等位基因特异性扩增，以便对正常或突变的NPY序列进行检测；或者也可以通过各种分子生物学的方法对正常或突变的NPY基因进行间接检测，方法包括如PCR-单链构象多态性(single stranded conformation polymorphism，SSCP)方法或变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gelelectrophoresis，DGGE)。对正常或突变的NPY基因的鉴定也可以通过采用限制性片段长度多态性(restriction fragment lengthpolymorphism，RFLP)方法来进行，该方法尤其适于大量的样品的基因型测定。

鉴定也可以在RNA水平上进行，通过采用各种方法分析RNA在组织水平的表达。可以设计等位基因特异性探针进行杂交。杂交的进行可以如通过Northern印迹、RNA酶保护测定(RNase protectionassay)或原位杂交的方法。源于正常或突变的NPY基因的RNA的分析可以通过首先将组织RNA转换为cDNA，然后通过等位基因特异性PCR方法扩增cDNA。

可选择的，测定可以通过免疫测定来进行，将样品与一种抗体接触，该抗体可以与信号肽或与前NPY原的其它任何裂解产物相连的的上述肽相结合。

抗体可以通过对抗正常或突变的前NPY原，或者更特异地，对抗NPY正常或突变的信号肽来产生。抗体的制备可以在实验动物体内进行以获得多克隆抗体，或者在体外采用细胞株进行以获得单克隆抗体。

已被诊断出具有血清胆固醇或LDL胆固醇水平升高体质的患者，其治疗可以通过对其施用有效剂量的可抵消突变NPY基因影响的试剂，来阻止该患者体内血清胆固醇或LDL胆固醇水平的升高。这种治疗可以通过特定基因疗法以修复突变的NPY序列；或者通过施用药物疗法，其目的是调节内源性NPY的合成、释放或代谢；或者通过调节NPY的作用在NPY靶位点以特定的方式与特定的NPY受体蛋白相互作用。目前，已经克隆并定性出五种不同的NPY受体亚型(Y1-Y5受体)，也已经合成出与这些NPY受体特异性地相互作用的药物分子。本发明中所描述的药物疗法并不仅仅局限于这些已经被命名的NPY受体或机理，也包括其他将被发现的NPY受体或相关机理。

突变的NPY序列对NPY基因功能的影响可以在转基因动物中进行研究。转基因动物的制备可以通过定向同源重组的方法。人正常及突变的NPY信号肽序列(或者是任意含有编码前神经肽Y(preproNPY)原的核苷酸序列的DNA序列，或者是其部分编码成年小鼠或人成熟NPY肽氨基酸序列，其中要么i)上述前NPY原的信号肽部分的第7位上的亮氨酸已被脯氨酸取代，或者ii)上述前NPY原的信号肽部分的第7位上的亮氨酸保持不变)将被导入NPY基因序列以取代内源性的信号肽序列。在这些条件下，内源性NPY基因仍然正常发挥功能，但是前NPY原的合成受正常或突变的人NPY信号肽序列调控。这种转基因模型可被用于以一种十分特殊的方式来研究突变的NPY基因在生理学上的重要性。它也提供了一种用于研究和筛选新的药物分子的理想的临床前模型，上述药物分子是被设计用于改变突变NPY基因的影响。

在以下试验中将更详细地描述本发明。

试验

方法

采用单链构象多态性(SSCP)分析的方法对芬兰90名肥胖患者中NPY基因的编码区进行筛选以确定可能存在的序列变体。通过限制型片段长度多态性(RFLP)的方法对141名肥胖、非糖尿病主体(研究I)和64名正常体重的主体(研究II)进行基因型的确定，之后分析这两个独立的研究人群中确定的亮氨酸7至脯氨酸的多态性和与肥胖相关的代谢参数之间的等位关联。

用SSCP方法筛选NPY基因的研究主体

在研究I的人群中90名随机选取的芬兰肥胖者中取得的DNA样品被用来进行NPY基因的筛选以得到外显子序列的变体。

关联和基因型频率分析的研究主体

研究I

在一项减肥研究(Uusitupa等，1996)中把具有正常的肝、肾和甲状腺功能的141名肥胖个体(29名男性和112名女性)包括在NPY序列变体和显型参数的关联研究中。所有个体均没有糖尿病、过度酗酒或吸烟(已知可影响基础代谢率(basal metabolic rate，BMR)、胆固醇(除了一名个体在使用β阻断剂^*)或葡萄糖的代谢)的历史。他们的平均±标准差(SD)年龄为43±8岁，平均身体质量指数(body mass index，BMI)为34.7，范围28-43kg/m²。所有显型测量均在12小时空腹之后的早晨采用常规的方法进行。测量包括体重、身体质量指数、肥胖百分率^*(percental fat)、呼吸商(respiratory quotient，RQ)、基础代谢率、腰臀比(waist-to-hip ratio，WHR)以及空腹血清中的leptin^*、葡萄糖、胰岛素、胆固醇和三羧酸甘油酯的水平。研究I个体的主要特性列于表1。分析方法在别处已有详细描述^22，23。在饮食日记中记录每天对几种营养物质(包括碳水化合物、蛋白质、脂肪和胆固醇)摄取量的详细数据，这对所有肥胖个体都是有用的。

研究II

开始，随机对照人群样本(年龄45-64岁)的选取是在1979-1981年芬兰Kuopio^*地区的人口登记册中通过使用随机编码表格^*选取的，同时考虑了居住在农村和城市的人群分布。在开始联系的183名个体中，最后招收了144名。对照个体中正常体重(BMI＜27kg/m²)的个体被选为加入本调查(研究II)并被跟踪调查了10年。总共检查了64名(26名男性和38名女性)正常肝抗胰岛素^*(normoglycemic)、非糖尿病的健康芬兰人。对照个体分别在1985-1986和1991-1992年的首次检查之后的5年和10年再次接受检查。研究II人群在这些各自的时间点上的特性列于表2。原始记录被Kuopio和Helsinki大学道德规范委员会(the Ethics Committees ofthe University of Kuopio and Helsinki)认可。研究II人群以前已有详细描述²⁴。

PCR-SSCP分析

人NPY基因分为四个外显子，第一个含有不翻译区，第二个外显子编码信号肽(氨基酸序列残基1-28)以及成熟的NPY氨基酸残基29-63，第三个外显子编码残基64-90，第四个外显子含有proNPY羧基端的七肽以及不翻译的3’-区(图1a)²⁵。用于扩增NPY基因的四个外显子区的PCR引物对以及相应的PCR退火温度(Ta)如下：第一对5’TTGGGGTGTGGGTGGCTC(序列编号第7号)以及5’CCTAGACAGACGGGTCGTAGCA(序列编号第8号)，Ta＝65℃，第二对5’CCCGTCCGTTGAGCC TTCTG(序列编号第9号)以及5’CGGTCCCGCGGTCCC(序列编号第10号)，Ta＝67℃，第三对5’AAAGACTTTTTTT TTTCCAG(序列编号第11号)，以及5’AATGTCCCCATCACAAG(序列编号第12号)，Ta＝51℃，以及第四对5’CCTTACAT GCTTTGCTTCTTA(序列编号第13号)，以及5’GATTTTTCATTGAGGAGGAT(序列编号第14号)，Ta-51℃。PCR反应(共5μl)含有100ng基因组DNA(分离自全血或经过固定的淋巴母细胞系)，1.0mM dNTPs，30nM ³³P-dCTP，每种引物2.5mM，0.25U AmpliTaq聚合酶(Perkin Elmer Cetus，Norwalk，CT)。PCR条件的最优化可以通过使用PCR Optimizer^TM(Invitrogen，San Diego，CA)。样品的扩增通过使用基因扩增PCR系统(GeneAmp PCRsystem)9600(Perkin Elmer Cetus，Norwalk，CT)，30个循环，其中在94℃保持30秒，在最佳退火温度保持30秒，在72℃保持30秒。接着进行延长步骤，在72℃保持7分钟。把经过扩增的样品与SSCP缓冲液(含95％甲酰胺，10mM NaOH，0.05％二甲苯蓝以及0.05％溴酚蓝，总体积25μg)相混合。上样前，样品在95℃变性5分钟并冰浴5分钟。把3μl混合物上到一MDE^TM凝胶(FMC，BioProducts，Rockland，MA)上。SSCP-凝胶电泳是在两个不同的实施条件下进行的：6％MDE凝胶，于+4℃；以及3％MDE凝胶，含10％甘油，于室温。在5W衡压下电泳20小时。干燥凝胶并通过将一Kodak BIOMAX MR底片在室温下曝光24小时以进行放射自显影。

序列测定

把SSCP中的异常迁移条带用Thermo Cycle Sequenase^TM试剂盒(Amersham Life Science，Inc.Cleveland，OH)进行系列测定。

基因型确定

用于研究I和II中主体的基因型确定的引物也是用于外显子2PCR扩增的那些引物。外显子2中T(1128)至C(1128)的替换产生一个Bsi EI(New England Biolabs，Inc.Beverly，MA)位点。

酶切通过2％琼脂糖凝胶电泳进行分析。

空腹血清参数和人体测量

血液葡萄糖的分析通过葡萄糖氧化酶的方法(Glox：Kabi Ab，Stockholm，瑞典)。血清胰岛素的分析通过放射性免疫测定(antiserumM 8309：Novo Industries，Copenhagen，丹麦)。本方法的变更系数为5.4％，灵敏度为2mU/l。确定从12小时空腹的样本中取出的血清和脂蛋白中的脂类。脂蛋白的分离是通过超速离心在密度1.006处去掉VLDL，接着用葡聚糖硫酸盐和氯化镁沉淀漂浮在下部的部分²⁶。酶法是用来确定整体血清中的胆固醇和三羧酸甘油酯、超速离心VLDL之后的上层部分以及沉淀LDL之后的上清。LDL是作为整体血清与VLDL和HDL的加和之间的区别。整体胆固醇、HDL胆固醇和三羧酸甘油酯的测定间变化分别为1.3％、0.95％和3.1％，试样间变化分别为3.3％、1.9％和5.2％。免鞋测量站高的精确度^*为0.5厘米。体重的测量是通过电子体重仪(model 707：Seca.Hamburg，德国)，个体赤足、穿短裤。计算身体质量指数(BMI)(体重[千克]/身高[米²])。对于腰臀比，腰围的测量是在肾脏水平位置、侧部较低肋骨边缘和髂骨顶部之间。臀围的测量是在沿着^*(trough^*怀疑拼写有误^*)公共骨合生的较大的转子水平部位。静止能量消耗的测量是通过间接的能量测定方法(Deltatrac，TM Datex，Helsinki，芬兰)，该方法使用一种计算机跟踪处理、用天棚遮盖的气体分析系统，每次测量之前用精确的气体混合物校准该系统。该方法在以前已有详细描述²⁹。

统计分析

对于Hardy-Weinberg平衡的基因型频率贡献的测定是通过X²分析。所有关于相关分析的计算均通过使用SPSS/WIN程序，版本6.0(SPSS，Chicago，IL)。两组之间在显型参数上的统计区别通过Student’st^*测试来评估。在研究I中，基因型与显型参数之间的多种比较没有用到多样测试的形式纠正。在研究II中，我们有一条先验假设，即多样性与血清胆固醇水平相关，因此不采用其它的统计比较，只采用空腹血清中总体、LDL、HDL和VLDL胆固醇水平的比较。

结果

SSCP筛选是基于探测胸腺嘧啶脱氧核糖(1128)是否被胞嘧啶取代以导致第7位(前NPY原信号肽部分的疏水残基)上的亮氨酸到脯氨酸的氨基酸变化。对于正常体重和肥胖个体而言，亮氨酸7至脯氨酸多态性等位基因频率均为0.08。与相应的具亮氨酸//亮氨酸7基因型个体的数值相比，具脯氨酸7等位基因的肥胖个体具有明显较高的空腹血清中总体、LDL和VLDL胆固醇水平以及较低的HDL胆固醇水平。这些值分别为6.2±1.1比5.3±0.9毫摩尔/升(P＝0.0001)，4.2±1.0比3.5±0.8毫摩尔/升(P＝0.0003)，0.9±0.6比0.7±0.5毫摩尔/升(P＝0.042)，1.1±0.3比1.2±0.3毫摩尔/升(P＝0.041)。这些差别无法通过包括年龄、性别、吸烟、伴随药物或apoE显型在内的混淆因素来解释。在肥胖个体中，NPY基因中亮氨酸7至脯氨酸多态性与任何肥胖相关的参数均没有关系，这些参数包括体重、BMI、腰臀比、脂肪质量、基础代谢率或其它代谢参数，如空腹血浆中葡萄糖、胰岛素、leptin^*或三磷酸甘油酯的水平。在研究II的正常体重个体中，确定了脯氨酸7等位基因与较高的血清总体胆固醇(P＝0.035)和LDL-胆固醇(p＝0.036)水平之间的显著关联。

NPY基因外显子区域的SSCP筛选

通过SSCP筛选包含全部NPY基因编码区的各个外显子的突变体。已确定的多态性有1)T(1128)至C(1128)，2)A(1258)至G(1258)，3)T(5671)至C(5671)，以及4)T(8233)至A(8233)。多态性的编号是根据Minth等，1996，其中多态性2和3已经有报道²⁵。

基因型频率

所有等位基因频率均处于Hardy-Weinberg平衡。已发现的T(1128)至C(1128)的多态性的基因频率在肥胖个体(n＝141)中为0.078，在正常体重对照的芬兰人(n＝64)中为0.077。这两个人群中任何等位基因的贡献均无区别。

相关分析

研究I：

脯氨酸7/脯氨酸7纯合基因型仅在一例个体中发现，该个体被归入杂合型人群中。脯氨酸7/亮氨酸7基因型个体(包括一例脯氨酸7/脯氨酸7基因型)与野生型亮氨酸7/亮氨酸7基因型个体之间的相关分析显示出各种水平高度明显的区别，这些区别有空腹血清中总体胆固醇6.2±1.1比5.3±0.9毫摩尔/升(P＝0.0001)、LDL胆固醇4.2±1.0比3.5±0.8毫摩尔/升(P＝0.0003)、和VLDL胆固醇0.9±0.6比0.7±0.5毫摩尔/升(P＝0.042)以及HDL胆固醇1.1±0.3比1.2±0.3毫摩尔/升(P＝0.041)(图2)。当分别分析肥胖男性(总体胆固醇、LDL胆固醇、VLDL胆固醇和HDL胆固醇)和肥胖女性(总体胆固醇和LDL胆固醇胆固醇)时，这些区别仍然高度明显。两种基因型人群中，总体脂肪、饱和脂肪酸、不饱和脂肪酸或饮食规定的胆固醇的摄取量没有区别。肥胖程度也不能解释这些发现。在这两个不同的人群中，apo脂蛋白E显型的贡献没有区别(数据未显示)。

研究II：

一例个体为脯氨酸7/脯氨酸7纯合型，将其并入杂合型分析。在正常体重个体中，每三次测量中均为具有脯氨酸7的个体空腹血清中总体和LDL胆固醇水平明显高于亮氨酸7/亮氨酸7基因型的个体。空腹血清中总体胆固醇7.4±0.6比6.7±0.9毫摩尔/升(P＝0.035)，LDL胆固醇5.2±0.6比4.5±0.9毫摩尔/升(P＝0.036)。在VLDL胆固醇(0.8±0.5比0.7±0.4毫摩尔/升)或HDL胆固醇水平(1.3±0.4比1.5±0.3毫摩尔/升)中没有明显的统计差别(图3)。

讨论

本研究提供了第一步证据，即在正常体重和非糖尿病肥胖个体中，NPY基因中7位亮氨酸改变为脯氨酸的多态性与临床上不利的血清胆固醇和LDL胆固醇水平相关。这意味着NPY在调节人体胆固醇的代谢中具有以前没有被认识到的功能，以及NPY是最强的遗传因子之一，因而进一步被确定影响血清胆固醇的水平。

本研究主要观察的是在芬兰人中，NPY基因信号肽上已确定的7位亮氨酸改变为脯氨酸的多态性与血清中总体和LDL胆固醇水平的升高明显相关。而且在肥胖人群中，也存在对于具有脯氨酸7等位基因的个体，其VLDL胆固醇明显升高以及HDL胆固醇降低。主要的发现最初是在肥胖、非糖尿病个体中进行，接着在正常体重个体中重复。在芬兰人群中，这种序列变体的等位基因频率约为8％。这种观察到的相关性无法用其它已知可影响胆固醇代谢的混淆因子来解释，如年龄、肥胖度、性别、吸烟、药品或apoE显型。而且，将这种关联归于对于研究人群的统计错误也是极不可能的，因为他们均为本地的芬兰人，具有十分相似的遗传背景。因此，NPY基因7位亮氨酸改变为脯氨酸的多态性可以作为高血清总体胆固醇和LDL胆固醇水平的一项新的重要的遗传标志。

7位亮氨酸改变为脯氨酸的多态性定位于前NPY原的信号肽部分。信号肽在成熟的NPY中被切去，在肽的合成及转运至分泌囊泡的过程中，它对指导肽在内质网中的正确折叠和包装起重要作用。通常信号肽含有一个疏水基元，前NPY原通常就是这样。已知亮氨酸可以形成α-螺旋，然而脯氨酸常常会给主链中的α-螺旋部分引入断裂或扭结。虽然我们没有关于7位亮氨酸改变为脯氨酸的多态性是如何改变前NPY原合成的生化数据，有一点可以推测，即细胞内前NPY原的合成过程被减弱，这样接着会引起NPY活性的改变。然而，为具体地说明这些机理需要进一步的研究。

血清中总体胆固醇和LDL胆固醇的平均水平分别为0.9和0.7毫摩尔/升，与具有亮氨酸7/亮氨酸7基因型的个体相比，具有脯氨酸7等位基因的肥胖和非肥胖芬兰个体中含量较高。而且，在这些个体中还发现有较高的VLDL胆固醇和较低的HDL胆固醇的趋向。这种基因异常对血清胆固醇水平的影响比apoE4等位基因的影响大，与通过对自由生活的芬兰个体的胆固醇降低节食治疗所得到的量级相等(14％)。

在这些代表着芬兰人口8％的个体中，血清中总体胆固醇和LDL胆固醇升高的因素是什么呢？基于胃肠道大量受含NPY的神经调节的事实^31，32，有一点可以推测，即NPY可能参与了饮食中胆固醇的吸收，具有脯氨酸7等位基因的个体中胆固醇吸收量可能有所加。这一点，在另一方面，可能会导致肝脏中B/E(LDL)受体活性的下调以及血清中LDL和其前体(如VLDL)的升高。由于在受影响的个体中VLDL或三羧酸甘油酯的水平没有明显异常，我们认为主要的缺陷不在VLDL的合成或代谢中。有趣的是，然而，中枢NPY可增加脂蛋白脂肪酶mRNA的表达以及增强利于白色脂肪的脂类储存的酶活性。因此，不能完全排除脂蛋白脂肪酶活性的作用。然而，对于血清胆固醇水平升高最可能合理的解释是LDL受体活性数量的降低，该受体已知可以调节血清中LDL的浓度，在较低程度上，也可调节IDL和VLDL颗粒的浓度。没有发现象这种肥胖会改变7位亮氨酸改变为脯氨酸的多态性对血清脂类的影响，因为突变和正常个体之间脂类值的区别与肥胖和正常个体之间的区别类似。毕竟，需要注意的是，没有试验证据以支持以上所讨论的任何机理，这些机理将这种特殊的NPY基因异常与胆固醇代谢联系起来。

如以上所述，apoE-显型4也已知与较高的血清中总体胆固醇和LDL胆固醇水平相关，以前这在我们的研究个体中已经有所报道²²。apoE-显型4在两种NPY群体中平均分配，不会混淆NPY信号肽多态性与血清胆固醇水平差别之间的联系。

在本研究这中，没有发现已确定的NPY基因中7位亮氨酸改变为脯氨酸的多态性与任何肥胖相关的参数有联系，例如体重、BMI、WHR、BMR或RQ。一致地，在正常体重的对照个体和肥胖、非糖尿病个体中，突变的等位基因的基因频率相似。这项结果也与最近在法国人群中进行的研究相符，在该研究中，NPY基因的侧翼标记物(flanking markers)与任何形式的肥胖均没有联系³³。

本研究提供了第一步证据，即在非糖尿病正常体重和肥胖的个体中，NPY基因中7位亮氨酸改变为脯氨酸的多态性与临床上不利的血清胆固醇和脂蛋白水平相关。这暗示着NPY在控制人体胆固醇代谢中可能具有以前尚未知晓的作用，而且它可能是最强的遗传因子之一因而被确定^*在远端影响血清胆固醇的水平。此外，NPY的机理可为新药的发展提供可能的目标。

值得推荐的是本发明中的方法可以结合在各种不同的具体实施方案形式中，在此仅公布了其中几例。对于本领域的专家，很明显也存在其它具体案例^*与本发明的本质相符。因此，所描述的具体案例是说明性的，不能被认作具有限制性。

表1.根据NPY基因中存在或不存在亮氨酸(7)到脯氨酸(7)的突变对141名肥胖个体的人口统计和临床特性。值为平均值(mean)±标准差(SD)。

特征	无突变	有突变	P值
特征	无突变	有突变	P值	年龄，年	40,7±6.2	41.2±8.1	ns
性别，女/男	95/25	17/4	ns	年龄，年	40,7±6.2	41.2±8.1	ns
性别，女/男	95/25	17/4	ns	BMI，千克/米²	34.7±3.8	35.7±3.3	ns
WHR	0.93±0.08	0.94±.0.08	ns	BMI，千克/米²	34.7±3.8	35.7±3.3	ns
WHR	0.93±0.08	0.94±.0.08	ns	BMR，kcal/d^□	1635±142	1639±131	ns
空腹血清胰岛素，皮摩尔/升	94.8±45.3	97.7±53.5	ns	BMR，kcal/d^□	1635±142	1639±131	ns
空腹血清胰岛素，皮摩尔/升	94.8±45.3	97.7±53.5	ns	空腹血清-葡萄糖，毫摩尔/升	5.5±0.7	5.5±.0.8	ns
空腹血清-leptin*，纳克/升^□□	32.9±12.8	26.3±.4.9	ns	空腹血清-葡萄糖，毫摩尔/升	5.5±0.7	5.5±.0.8	ns
空腹血清-leptin*，纳克/升^□□	32.9±12.8	26.3±.4.9	ns	心脏收缩压毫米汞柱	130.7±14.8	128.6±13.2	ns
心脏舒张压毫米汞柱	87.4±10.8	84.7±6.6	ns	心脏收缩压毫米汞柱	130.7±14.8	128.6±13.2	ns

^*经调整适于非肥胖的质量和年龄。

^**leptin水平从69名个体中获得。

表2.在随后的研究(1979-1981年之间)开始时，根据NPY基因中存在或不存在亮氨酸(7)到脯氨酸(7)的突变对64名正常体重的个体的人口统计和临床特性。值为平均值(mean)±标准差(SD)。

特征	无突变	有突变
特征	无突变	有突变	年龄，年	55.8±2.0	55.1±1.8
性别，女/男	31/25	7/1	年龄，年	55.8±2.0	55.1±1.8
性别，女/男	31/25	7/1	BMI，千克/米²	24.3±2.0	24.9±1.8
WHR	0.87±0.08	0.85±0.05	BMI，千克/米²	24.3±2.0	24.9±1.8
WHR	0.87±0.08	0.85±0.05	空腹血清-胰岛素，皮摩尔/升	65.4±44.4	84.0±42.6
空腹血清-葡萄糖，毫摩尔/升	4.9±0.63	4.5±0.57	空腹血清-胰岛素，皮摩尔/升	65.4±44.4	84.0±42.6
空腹血清-葡萄糖，毫摩尔/升	4.9±0.63	4.5±0.57	心脏收缩压毫米汞柱	142.4±17.6	151.1±16.1
心脏舒张压毫米汞柱	86.8±9.0	91.1±8.4	心脏收缩压毫米汞柱	142.4±17.6	151.1±16.1

参考文献

1.Gray TS，Morley JE.Neuropeptide Y：anatomicaldistribution and possible function in mammalian nervous system.自然1986 Feb 3；38(5)：389-401

2.Lundberg JM，Terenius L，Hokfelt T，Martling CR，TatemotoK，Mutt V，Polak J，Bloom S，Goldstein M.Neuropeptide Y(NPY)-like immunoreactivity in peripheral noradrenergicneurons and effects of NPY on sympathetic function.ActaPhysiol Scand 1982 Dec；116(4)：477-480

3.Clark JT，Kaira PS，Kaira SP.Neuropeptide Y stimulatesfeeding but inhibits sexual behavior in rats.内分泌学1985Dec；117(6)：2435-2442

4.Levine AS，Morley JE Neuropeptide Y：a potent inducerof consummatory behavior in rats.肽1984 Nov；5(6)：1025-1029

5.Stanley BG，Leibowitz SF Neuropeptide Y injected in theparaventricuiar hypothalamus：a powerful stimulant of feedingbehavior.美国国立科学院院报1985 Jun，82(11)：3940-3943

6.Heilig M，McLeod S，Brot M，Heinrichs SC，Menzaghi F，Koob GF，Britton KT.Anxiolytic-like action of neuropeptideY：mediation by Y1 receptors in amygdala，and dissociationfrom food intake effects.Neuropsychopharmacology 1993 Jun；8(4)：357-363

7.Wahlestedt C，Pich EM，Koob GF，Yee F，Heilig M.Modulation of anxiety and neuropeptide Y-Y1 receptors byantisense oligodeoxynucleotides.科学1993 Jan 22；259(5094)：528-531

8.Wahlestedt C，Skagerberg G，Ekman R，Heilig M，SundlerF，Hakanson R.Neuropeptide Y(NPY)in the area of thehypothalamic paraventricular nucleus activates thepituitary-adrenocortical axis in the rat.脑研究1987 Aug 4；417(1)：33-38

9.McDonald JK，Lumpkin MD，Samson WK，McCann SM.Neuropeptide Y affects secretion of luteinizing hormone andgrowth hormone in ovariectomized rats.美国国立科学院院报1985 Jan；82(2)：561-564

10.Sahu A，Kaira SP，Crowley WR，Kaira PS.Testosteroneraises neuropeptide-Y coneentration in selected hypothalamicsites and in vitro release from the medial basal hypothalamusof castrated male rats.内分泌学1989 Jan；124(1)：410-414

11.Menendez JA，McGregor IS，Healey PA，Atrens DM，Leibowitz SF.Metabolic effects of neuropeptide Y injectionsinto the paraventricularnucleus of the hypothalamus.脑研究1990 May 14；516(1)：8-14

12.Moltz JH，McDnald JK，Neuropeptide Y：direct andindirect action on insulin secretion in the rat.肽1985 Nov；6(6)：1155-1159

13.ZrejevskiN，Cusin I，Vettor R，Rohner-JeanrenaudF，Jeanrenaud B.Chronic intracerebroventricular NPYadministration to normal rats mimics hormonal and metabolicchanges of obesity.内分泌学133：1753-1758

14.Sahu A，Sninsky CA，Kaira PS，Kaira SP.Neuropeptide-Yconcentration in microdissected hypothalamic regionsand invitro release from the medial basal hypothalamus-preopticarea of streptozotocin-diabetic rats with and without insulinsubstitution therapy.内分泌学1990 Jan；126(1)：192-198

15.Stephens TW，Basinski M，Bristow PK，Bue-Valleskey JM，Burgett SG，Craft L，Hale J，Hoffmann J，Hsiung HM，KriauciunasA，et al.The role of neuropeptide Y in the antiobesity actionof the obese geneproduct.自然1995 Oct 12；377(6549)：530-532

16.Schwartz MW，Baskin DG，Bukowski TR，Kuijper JL，FosterD，Lasser G，Prunkard DE，Porte D Jr，Woods SC，Seeley RJ，WeigleDS.Specif icily of leptin action on elevated blood glucoselevels andhypothalamic neuropeptide Y gene expression inob/ob mice.糖尿病1996 Apr；45(4)：531-535

17.Pesonen U，Huupponen R，Rouru J，Koulu M.Hypothalamicneuropeptide expression after food restriction in Zucker rats：evidence of persistent neuropeptide Y gene activation.BrainRes Mol Brain Res 1992 Dee；16(3-4)：255-260

18.Chua SC Jr，White DW，Wu-Peng XS，Liu SM，Okada N，Kershaw EE，Chung WK，Power-Kehoe L，Chua M，Tartaglia LA，Leibel RL.Phenotype of fatty due to Gln269Pro mutation inthe leptinreceptor(Lepr).糖尿病1996 Aug；45(8)：1141-1143

19.Kaye WH，Berrettini W，Gwirtsman H，George D.T.1990Altered cerebrospinal fluid neuropeptide Y and peptide YYimmunoreactivity in anorexia and bulimia nervosa.Arch.Gen.Psychiatry 47：548-556.

20.Mordasini R，Klose G，Greten H.Secondary type IIhyperlipoproteinemia in patients with anorexia nervosa.代谢1978 Jan；27(1)：71-79

21.Sanchez-Muniz FJ，Marcos A，Varela P.Serum lipids andapolipoprotein B values，blood pressure and pulse rate inanorexia nervosa.Eur J Clin Nutr 1991 Jan；45(1)：33-36

22.Uusitupa MI，Karhunen L，Rissanen A，Franssila-Kallunki A，Niskanen L，Kervinen K，Kesaniemi YA.Apolipoprotein E phenotype modifies metabolic andhemodynamicabnormalities related to central obesity in women.Am J Clin Nutr 1996 Aug；64(2)：131-136

23.Sipilainen R，Uusitupa M，Heikkinen S，Rissanen A，Laakso M.Polymorphism of the R，-adrenergic receptor geneaffects basal metabolic rate in obese Finns.1997.糖尿病46：77-80

24.Uusitupa M，Siitonen O，Aro A，Pyorala K.Prevalenceof coronary heart disease，left ventricular failure andhypertension in middle-aged，newly diagnosed type 2(non-insulin-dependent)diabetic subjects.Diabetologia 1985 Jan；28(1)：22-27

25.Minth CD，Andrews PC，Dixon JE.Characterization，sequence，and expression of the cloned human neuropeptide Ygene.J Biol Chem 1986 Sep 15；261(26)；11974-11979

26.R6schlau P，Bernt E，Gruber W.EnzymatischeBestiillmung des Gesamtcholesterins im Serum.Z Klin ChemBiochem 1974.12：403-407

27.Wahlenfieid AW.Triglycerides.Determination afterenzymatic hydrolysis，in；Bergmeyer HU(ed)Methods inenzymatic analysis.Academic Press.New York.pp 1831-1335

28.Uusitupa M，Siitonen O，Penttila I，Aro A，Pyorala K.Proteinuria in enzymatic analysis.Academic Press.New York.pp 1831-1335

28.Uusitupa M，Siitonen O，Penttila I，Aro A，Pyorala K.Proteinuria in newly diagnosed type II diabetic patients.糖尿病治疗1987Mar；10(2)：191-194

M.Determinants of resting energy expenditure in obesenon-diabetic Caucasian women.Int J Obes Relat Metab Disord 1997 Mar；21(3)：197-202

30.Ehnholm C，Lukka M，Kuusi T，Nikkila E，Utermann G.Apolipoprotein E polymorphism

in the Finnish population：gene frequencies and relationto lipoprotein concentrations.J

脂质研究1986Mar；27(3)：227-235

31.Lundberg JM，Terenius L，Hokfelt T，Goldstein M.High levelsof neuropeptide Y in peripheral noradrenergic neurons in variousmainmals including man.Neurosci Lett 1983 Dee 2；42(2)：67-172

32.Wang YN，McDonald JK，Wyatt RJ.Immunocytochemical localizationof neuropeptide Y-like inmunoreactivity in adrenergic and non-adrenergic neurons of the rat gastrointestinal tract.肽1987Jan；8(1)：

29.Karhunen L，Franssila-Kallunki A，Rissanen A，KervinenK，Kesaniemi YA，Uusitupa

序列清单

(1)总体信息：

(i)申请者：Koulu，Markku

Karvonen，Matti

Pesonen，Ullamari

Uusitupa，Matti

(ii)发明题目：编码前神经肽Y原突变体，一种信号肽的突变体，的

DNA分子及其应用

(iii)序列数目：14

(iv)联系地址：

(A)收件人：Rothwell，Figg，Ernst & Kurz，P.C.

(B)街道：555 13th Street NW，Suite 701-E

(C)城市：Washington

(D)州：D.C.

(E)国家：USA

(F)邮编：20304

(v)计算机可读形式：

(A)介质类型：软盘

(B)计算机：IBM PC兼容机

(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS

(D)软件：PatentIn Release#1.0，Version：#1.30

(vi)本次申请数据：

(A)申请号：US 08/994,946

(B)归档日期：19-DEC-1997

(C)分类：

(viii)代理商/代理人信息：

(A)名称：Ihnen，Jeffrey L.

(B)注册号：28,957

(C)参考/登记号码：2328-110

(ix)通讯信息：

(A)电话：202-783-6040

(B)电传：202-783-6031

(2)序列标号1的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：325碱基对

(B)类型：核酸

(C)链的类型：双链

(D)拓扑学：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列描述：序列标号：1：

CCGCTTCTTC AGGCAGTGCC TGGGGCGGGA GGGTTGGGGT GTGGGTGGCT CCCTAAGTCG 60

ACACTCGTGC GGCTGCGGTT CCAGCCCCCT CCCCCCGCCA CTCAGGGGCG GGAAGTGGCG 120

GGTGGGAGTC ACCCAAGCGT GACTGCCCGA GGCCCCTCCT GCCGCGGCGA GGAAGCTCCA 180

TAAAAGCCCT GTCGCGACCC GCTCTCTGCA CCCCATCCGC TGGCTCTCAC CCCTCGGAGA 240

CGCTCGCCCG ACAGCATAGT ACTTGCCGCC CAGCCACGCC CGCGCGCCAG CCACCGTGAG 300

TGCTACGACC CGTCTGTCTA GGGGT 325

(2)序列标号2的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：247碱基对

(B)类型：核酸

(C)链的类型：双链

(D)拓扑学：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列描述：序列标号：2：

CCCGTCCGTT GAGCCTTCTG TGCCTGCAGA TGCTAGGTAA CAAGCGACTG GGGCTGTCCG 60

GACTGACCCT CGCCCTGTCC CTGCTCGTGT GCCTGGGTGC GCTGGCCGAG GCGTACCCCT 120

CCAAGCCGGA CAACCCGGGC GAGGACGCAC CAGCGGAGGA CATGGCCAGA TACTACTCAG 180

CGCTGGGACA CTACATCAAC CTCATCACCA GGCAGAGGTG GGTGGGACCG CGGGACCGAT 240

TCCGGGA 247

(2)序列标号3的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：142碱基对

(B)类型：核酸

(C)链的类型：双链

(D)拓扑学：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列描述：序列标号：3：

ACTTGCTTTA AAAGACTTTT TTTTTTCCAG ATATGGAAAA CGATCTAGCC CAGAGACACT 60

GATTTCAGAC CTCTTGATGA GAGAAAGCAC AGAAAATGTT CCCAGAACTC GGTATGACAA 120

GGCTTGTGAT GGGGACATTG TT 142

(2)序列标号4的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：300碱基对

(B)类型：核酸

(C)链的类型：双链

(D)拓扑学：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组)

(xi)序列描述：序列标号：4：

CCTTACATGC TTTGCTTCTT ATGTTTTACA GGCTTGAAGA CCCTGCAATG TGGTGATGGG 60

AAATGAGACT TGCTCTCTGG CCTTTTCCTA TTTTCAGCCC ATATTTCATC GTGTAAAACG 120

AGAATCCACC CATCCTACCA ATGCATGCAG CCACTGTGCT GAATTCTGCA ATGTTTTCCT 180

TTGTCATCAT TGTATATATG TGTGTTTAAA TAAAGTATCA TGCATTCAAA AGTGTATCCT 240

CCTCAATGAA AAATCTATTA CAATAGTGAG GATTATTTTC GTTAAACTTA TTATTAACAA 300

(2)序列标号5的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：551碱基对

(B)类型：核酸

(C)链的类型：单链

(D)拓扑学：线性

(ii)分子类型：mRNA

(ix)特征：

(A)名称/检索表*：sig_peptide

(B)定位：87..170

(ix)特征：

(A)名称/检索表*：CDS

(B)定位：87..377

(xi)序列描述：序列标号：5：

ACCCCATCCG CTGGCTCTCA CCCCTCGGAG ACGCTCGCCC GACAGCATAG TACTTGCCGC 60

CCAGCCACGC CCGCGCGCCA GCCACC ATG CTA GGT AAC AAG CGA CTG GGG CTG 113

Met Leu Gly Asn Lys Arg Leu Gly Leu

1 5

TCC GGA CTG ACC CTC GCC CTG TCC CTG CTC GTG TGC CTG GGT GCG CTG 161

Ser Gly Leu Thr Leu Ala Leu Ser Leu Leu Val Cys Leu Gly Ala Leu

10 15 20 25

GCC GAG GCG TAC CCC TCC AAG CCG GAC AAC CCG GGC GAG GAC GCA CCA 209

Ala Glu Ala Tyr Pro Ser Lys Pro Asp Asn Pro Gly Glu Asp Ala Pro

30 35 40

GCG GAG GAC ATG GCC AGA TAC TAC TCG GCG CTG CGA CAC TAC ATC AAC 257

Ala Glu Asp Met Ala Arg Tyr Tyr Ser Ala Leu Arg His Tyr Ile Asn

45 50 55

CTC ATC ACC AGG CAG AGA TAT GGA AAA CGA TCC AGC CCA GAG ACA CTG 305

Leu Ile Thr Arg Gln Arg Tyr Gly Lys Arg Ser Ser Pro Glu Thr Leu

60 65 70

ATT TCA GAC CTC TTG ATG AGA GAA AGC ACA GAA AAT GTT CCC AGA ACT 353

Ile Ser Asp Leu Leu Met Arg Glu Ser Thr Glu Asn Val Pro Arg Thr

75 80 85

CGG CTT GAA GAC CCT GCA ATG TGG TGATGGGAAA TGAGACTTGC TCTCTGGCCT 407

Arg Leu Glu Asp Pro Ala Met Trp

90 95

TTTCCTATTT TCAGCCCATA TTTCATCGTG TAAAACGAGA ATCCACCCAT CCTACCAATG 467

CATGCAGCCA CTGTGCTGAA TTCTGCAATG TTTTCCTTTG TCATCATTGT ATATATGTGT 527

GTTTAAATAA AGTATCATGC ATTC 551

(2)序列标号6的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：98氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑学：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：序列标号：6：

Met Leu Gly Asn Lys Arg Leu Gly Leu Ser Gly Leu Thr Leu Ala Leu

1 5 10 15

Ser Leu Leu Val Cys Leu Gly Ala Leu Ala Glu Ala Tyr Pro Ser Lys

20 25 30

Pro Asp Asn Pro Gly Glu Asp Ala Pro Ala Glu Asp Met Ala Arg Tyr

35 40 45

Tyr Ser Ala Leu Arg His Tyr Ile Asn Leu Ile Thr Arg Gln Arg Tyr

50 55 60

Gly Lys Arg Ser Ser Pro Glu Thr Leu Ile Ser Asp Leu Leu Met Arg

65 70 75 80

Glu Ser Thr Glu Asn Val Pro Arg Thr Arg Leu Glu Asp Pro Ala Met

85 90 95

Trp

(2)序列标号7的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：18碱基对

(B)类型：核酸

(C)链的类型：单链

(D)拓扑学：线性

(ii)分子类型：其它核酸

(A)描述：/desc＝″引物″

(xi)序列描述：序列标号：7：

TTGGGGTGTG GGTGGCTC

(2)序列标号8的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：22碱基对

(B)类型：核酸

(C)链的类型：单链

(D)拓扑学：线性

(ii)分子类型：其它核酸

(A)描述：/desc＝″引物″

(xi)序列描述：序列标号：8：

CCTAGACAGA CGGGTCGTAG CA

(2)序列标号9的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：20碱基对

(B)类型：核酸

(C)链的类型：单链

(D)拓扑学：线性

(ii)分子类型：其它核酸

(A)描述：/desc＝″引物″

(xi)序列描述：序列标号：9：

CCCGTCCGTT GAGCCTTCTG

(2)序列标号10的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：15碱基对

(B)类型：核酸

(C)链的类型：单链

(D)拓扑学：线性

(ii)分子类型：其它核酸

(A)描述：/desc＝″引物″

(xi)序列描述：序列标号：10：

CGGTCCCGCG GTCCC

(2)序列标号11的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：21碱基对

(B)类型：核酸

(C)链的类型：单链

(D)拓扑学：线性

(ii)分子类型：其它核酸

(A)描述：/desc＝″引物″

(xi)序列描述：序列标号：11：

AAAAGACTTT TTTTTTTCCA G

(2)序列标号12的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：17碱基对

(B)类型：核酸

(C)链的类型：单链

(D)拓扑学：线性

(ii)分子类型：其它核酸

(A)描述：/desc＝″引物″

(xi)序列描述：序列标号：12：

AATGTCCCCA TCACAAG

(2)序列标号13的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：21碱基对

(B)类型：核酸

(C)链的类型：单链

(D)拓扑学：线性

(ii)分子类型：其它核酸

(A)描述：/desc＝″引物″

(xi)序列描述：序列标号：13：

CCTTACATGC TTTGCTTCTT A

(2)序列标号14的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：20碱基对

(B)类型：核酸

(C)链的类型：单链

(D)拓扑学：线性

(ii)分子类型：其它核酸

(A)描述：/desc＝″引物″

(xi)序列描述：序列标号：14：

GATTTTTCAT TGAGGAGGAT

Claims

1.编码前神经肽Y原的信号肽部分的DNA序列，其中上述的前神经肽Y原中信号肽部分上的第7位的亮氨酸被脯氨酸所取代，其中所述DNA由SEQ ID NO：2的29至112位核苷酸组成且49位上的T被C取代。

2.如权利要求1中所述的DNA序列，其中上述DNA序列为cDNA。

3.与权利要求1中所述的DNA序列相应的一段RNA序列。

4.一种筛选某一个体以确定该个体是否为突变的NPY基因携带者的方法，该突变的NPY基因包含编码前神经肽Y原的核苷酸序列，其中上述的前神经肽Y原中信号肽部分中的第7位的亮氨酸被脯氨酸所取代，上述方法包括的步骤为：准备待筛选的个体的一份生物样品；和提供一项检测以确定该生物样品中i)正常NPY基因或ii)上述突变NPY基因的存在。

5.如权利要求4中所述的方法，其中的检测是一种利用如权利要求1中所述的DNA序列信息的DNA检测，RNA检测或免疫检测。

6.一种前神经肽Y原信号肽，所说信号肽的第7位上的亮氨酸被脯氨酸取代，其中所述信号肽由一段DNA序列编码，所述DNA序列由SEQ ID NO：2的29至112位核苷酸组成且49位上的T被C取代。

7.一种前神经肽Y原，它具有权利要求1的DNA序列编码的氨基酸序列。

8.能够与权利要求6中所述的信号肽结合的抗体。

9.能够与权利要求7中所述的肽结合的抗体。

10.确定如权利要求6或7中所定义的肽的免疫测定方法，其中生物样品暴露于能够与上述肽结合的抗体。

11.权利要求1-3之任一的DNA序列或权利要求4的RNA序列在制备一种用于诊断一患者血清胆固醇或LDL胆固醇水平升高体质的方法的药剂中的应用，上述方法包括确定该患者在人前NPY原基因的信号肽部分是否具有多态性，上述多态性包括在上述前NPY原的信号肽部分中第7位上的亮氨酸被脯氨酸取代，上述多态性意味着具有血清胆固醇或LDL胆固醇水平升高的体质。

12.表达权利要求1-3之任一的DNA序列的一种细胞株，其中前神经肽Y原的信号肽的7位上的亮氨酸被脯氨酸取代。