CN1242061C - 一种短指基因 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种短指基因及其编码的蛋白质，并进行了克隆和序列分析，首次揭示了定位于2q35-q36区段内的IHH基因就是A-1型短指的致病基因；在确定了突变位点的同时，还对该致病基因及其所编码蛋白质的结构和功能域进行了初步的分析及研究。将有力地推动人类肢体发育异常病理机制的进一步研究，加深人类在分子水平上对骨骼发育的认识，并为今后相应的基因诊断、药物设计和临床治疗提供了基因学的依据。
Description
本发明涉及一种短指基因，更具体地，本发明涉及一种A-1型短指基因和该基因编码蛋白质分子的序列。
Bell(Treasury of Human inheritance.1951.5：1-30)将遗传性短指(brachydactyly，BD)分为五种类型既A、B、C、D和E。Bell发现了A型中的三个亚型A-1、A-2和A-3亚型。A-1型短指(BDA-1，MIM：112500)的主要特征是中间指节的缩短，有的中间指节与远端指节融合或中间指节缺失。A-1型短指是上个世纪被Farabeo(1903年)首次报道的人类Mendelian常染色体显性遗传病，并作为典型例子列入教科书中，它是典型的单基因显性遗传病。Mckusick(Mendelian inheritence in man.Johns Hopkins University Press.1975，Baltimore)增加了A-4和A-5型短指。在A-4型短指中第2和第5指的中间指节缩短，第4指节弯曲。在A-5型短指中，所有的中间指节都缺失。Fitch(J MedGenet.1979.16(1)：36-44)重新检查了44张A-1型的X光片，对A-1型作了系统的研究.发现由于各指的缩短，整个手掌显得短小，手骨也比正常手骨短，尤以中间指节缩短最为严重。因此，Fitch将A-4和A-5型短指也归属于A-1型。
A-1型有时伴有其他并发症，如在一个家系中的妇女有拇指关节僵硬和智力障碍(Piussan et al.J Genet Hum.1983.31(2)：107-114)，而一个带有5q11. 2和17q23平衡易位的A-1型患者，有Klippel-Feil(颈喉部发育异常)异常(Slavatinek et al.Clin Dysmorphol.1998.7(1)：21-27)。
虽然在短指的其他类型中取得了一些分子遗传学的研究进展，如Weinstein等(Proc Natl Acad Sci USA.1990.87(21)：8287-8290)在E型短指(BDE)的综合征型(Albright hereditary osteodystrophy)的患者检测到GNAS1基因发生突变，该基因定位于20q；Polinkovsky等(Nat Genet.1997.17(1)：18-19)在C型短指(BDC)的不相关家系中，检测到CDMP1(Cartilage-derived morphogeneticprotein 1，转型生长因子β超家族的一个成员)中的突变，该基因定位于12号染色体上。但是对A-1型的分子遗传学研究却未见报道。
因此，对A-1型短指基因和该基因编码蛋白质分子的序列进行系统的研究，将对遗传疾病的诊断、治疗具有十分重要的和深远的意义。
本发明的目的之一在于公开一种分离出的或纯化的A-1型短指基因序列及其同源变异基因序列，以满足人们对遗传疾病的诊断、治疗的需要；
本发明的目的之二在于公开上述基因编码蛋白质分子的序列。
所说的“分离出的或纯化的”是指(所谓的分离或纯化是指在Genomic DNA水平上，利用引物对于每个外显子的扩增和利用纯化试剂盒对扩增产物进行提纯)。本发明所述的A-1型短指基因序列如SEQ NO.1所示：
(a)序列特征：
*长度：1236碱基对
*类型：核酸
*链型：双链
*拓扑结构：线形
(b)分子类型：mRNDNA文库)
(c)假设：否
(d)反义：否
(e)最初来源：人
(f)序列描述：SEQ ID NO.1：
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GGGCAGGGAGCTGA
序列中阴影部分的字母代表发生突变的两个碱基位置；
上述基因编码蛋白质分子的序列如SEQ NO.2所示：
(a)序列特征：
*长度：411氨基酸
*类型：氨基酸
*链型：单链
*拓扑结构：线形
(b)分子类型：肽
(c)序列描述：SEQ ID NO.2：
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序列中阴影部分的字母代表(发生突变的两个氨基酸位置)；
上述的A-1型短指基因序列SEQ NO.1可具有一种变异体，它编码具有少于8个碱基改变的同源变异序列，而且序列的改变是保守性序列的改变，其基因序列如SEQ ID NO.3所示：(所给出序列是以起始序列密码子ATG开始，终止密码子TGA结尾的编码蛋白区域，均应在保护范围之内)
(a)序列特征：
*长度：1236碱基对
*类型：核酸
*链型：双链
*拓扑结构：线形
(b)分子类型：mRNA(cDNA文库)
(c)假设：否
(d)反义：否
(e)最初来源：人
(f)序列描述：SEQ ID NO.3：
ATGTCTCCCGCCCGGCTCCGGCCCCGACTGCACTTCTGCCTGGTCCTGTTGC
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序列中阴影部分的字母代表发生突变的两个碱基位置；
上述的基因序列的变异体，它编码具有少于8个氨基酸改变的同源变异蛋白，而且氨基酸改变是保守性氨基酸改变，它具有SEQ ID NO.4所示的序列：
(a)序列特征：
*长度：411氨基酸
*类型：氨基酸
*链型：单链
*拓扑结构：线形
(b)分子类型：肽
(c)序列描述：SEQ ID NO.4：
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序列中阴影部分的字母代表发生突变的两个氨基酸位置；
上述的A-1型短指基因序列SEQ NO.1可具有另一种变异体，它编码具有少于8个碱基改变的同源变异序列，而且序列的改变是保守性序列的改变。其序列如SEQ ID NO.5所示：
(a)序列特征：
*长度：1236碱基对
*类型：核酸
*链型：双链
*拓扑结构：线形
(b)分子类型：mRNA(cDNA文库)
(c)假设：否
(d)反义：否
(e)最初来源：人
(f)序列描述：SEQ ID NO.5：
ATGTCTCCCGCCCGGCTCCGGCCCCGACTGCACTTCTGCCTGGTCCTGTTGC
TGCTGCTGGTGGTGCCGGCGGCATGGGGCTGCGGGCCGGGTCGGGTGGTG
GGCAGCCGCCGGCGACCGCCACGCAAACTCGTGCCGCTCGCCTACAAGCA
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序列中阴影部分的字母代表发生突变的两个碱基位置；
上述的基因序列的变异体，它编码具有少于8个氨基酸改变的同源变异蛋白，而且氨基酸改变是保守性氨基酸改变，它具有SEQ ID NO.6所示的序列：
(a)序列特征：
*长度：411氨基酸
*类型：氨基酸
*链型：单链
*拓扑结构：线形
(b)分子类型：肽
(c)序列描述：SEQ ID NO.6：
1 msparlrprl hfclvlllll vvpaawgcgp grvvgsrrrp prklvplayk qfspnvpekt
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361 fwplrlfhsl awgswtpgeg vhwypqllyr lgrllleegs fhplgmsgag s
序列中阴影部分的字母代表发生突变的两个氨基酸位置；
(正常人类IHH的Exon1区域的mRNA序列为SEQ ID NO.1中Exon1部分，两者是包含与被包含的关系)其序列如SEQ ID NO.7所示：
序列描述：SEQ ID NO.7
1.Exon1(正常人)
ATGTCTCCCGCCCGGCTCCGGCCCCGACTGCACTTCTGCCTGGTCCTGTTGC
TGCTGCTGGTGGTGCCGGCGGCATGGGGCTGCGGGCCGGGTCGGGTGGTG
GGCAGCCGCCGGCGACCGCCACGCAAACTCGTGCCGCTCGCCTACAAGCA
GTTCAGCCCCAATGTGCCCGAGAAGACCCTGGGCGCCAGCGGACGCTATGA
AGGCAAGATCGCTCGCAGCTCCGAGCGCTTCAAGGAGCTCACCCCCAATTA
CAATCCAGACATCATCTTCAAGGACGAG
AGAACACAGGCGCCGACCGCCT
CATGACCCAG
序列中阴影部分的字母代表发生突变的一个碱基位置；
序列SEQ ID NO.7所述的基因编码具有SEQ ID NO.8序列的蛋白多肽，序列描述：SEQ ID NO.8：
Exon1编码蛋白(正常人)
MSPARLRPRLHFCLVLLLLLVVPAAWGCGPGRVVGSRRRPPRKLVPLAYKQFSP
NVPEKTLGASGRYEGKIARSSERFKELTPNYNPDIIFKDE
NTGADRLMTQ
序列中阴影部分的字母代表发生突变的一个氨基酸位置；
SEQ ID NO.7可具有一个同源变异体，即病人的IHH的Exon1区域的mRNA序列，即SEQ ID NO.9，其序列如下：
Exon1(病人)
ATGTCTCCCGCCCGGCTCCGGCCCCGACTGCACTTCTGCCTGGTCCTGTTGC
TGCTGCTGGTGGTGCCGGCGGCATGGGGCTGCGGGCCGGGTCGGGTGGTG
GGCAGCCGCCGGCGACCGCCACGCAAACTCGTGCCGCTCGCCTACAAGCA
GTTCAGCCCCAATGTGCCCGAGAAGACCCTGGGCGCCAGCGGACGCTATGA
AGGCAAGATCGCTCGCAGCTCCGAGCGCTTCAAGGAGCTCACCCCCAATTA
CAATCCAGACATCATCTTCAAGGACGAG
AGAACACAGGCGCCGACCGCCT
CATGACCCAG
序列中阴影部分的字母代表发生突变的一个碱基位置；
相应的，上述的mRNA序列SEQ ID NO.9编码具有SEQ ID NO.10序列的蛋白多肽，即SEQ ID NO.10，序列描述如下：
Exon1编码蛋白(病人)
MSPARLRPRLHFCLVLLLLLVVPAAWGCGPGRVVGSRRRPRKLVPLAYKQFSP
NVPEKTLGASGRYEGKIARSSERFKELTPNYNPDIIFKDE
NTGADRLMTQ
序列中阴影部分的字母代表发生突变的一个氨基酸位置；
(正常人类IHH的Exon2区域的mRNA序列为SEQ ID NO.1中Exon2部分，两者是包含与被包含的关系)其序列如SEQ ID NO.11所示：
Exon2(正常人)
CGCTGCAAGGACCGCCTGAACTCGCTGGCTATCTCGGTGATGAACCAGTGG
CCCGGTGTGAAGCTGCGGGTGACC
AGGGCTGGGACGAGGACGGCCACCA
CTCAGAGGAGTCCCTGCATTATGAGGGCCGCGCGGTGGACATCACCACATC
AGACCGCGACCGCAATAAGTATGGACTGCTGGCGCGCTTGGCAGTGGAGGC
CGGCTTTGACTGGGTGTATTACGAGTCAAAGGCCCACGTGCATTGCTCCGTC
AAGTCCG
序列中阴影部分的字母代表发生突变的一个碱基位置；
同理，上述序列SEQ ID NO.11具有SEQ ID NO.12序列的蛋白多肽，序列描述如下：
Exon2编码蛋白(正常人)
RCKDRLNSLAISVMNQWPGVKLRVT
GWDEDGHHSEESLHYEGRAVDITTSD
RDRNKYGLLARLAVEAGFDWVYYESKAHVHCSVK
序列中阴影部分的字母代表发生突变的一个氨基酸位置；
SEQ ID NO.11可具有一个同源变异体，即病人的IHH的Exon2区域的mRNA序列，即SEQ ID NO.13，其序列如下：
Exon2(病人)
CGCTGCAAGGACCGCCTGAACTCGCTGGCTATCTCGGTGATGAACCAGTGG
CCCGGTGTGAAGCTGCGGGTGACC
AGGGCTGGGACGAGGACGGCCACCA
CTCAGAGGAGTCCCTGCATTATGAGGGCCGCGCGGTGGACATCACCACATC
AGACCGCGACCGCAATAAGTATGGACTGCTGGCGCGCTTGGCAGTGGAGGC
CGGCTTTGACTGGGTGTATTACGAGTCAAAGGCCCACGTGCATTGCTCCGTC
AAGTCCG
序列中阴影部分的字母代表发生突变的一个碱基位置；
SEQ ID NO.13具有SEQ ID NO.14序列的蛋白多肽，序列描述如下：
Exon2编码蛋白(病人)
RCKDRLNSLAISVMNQWPGVKLRVT
GWDEDGHHSEESLHYEGRAVDITTSD
RDRNKYGLLARLAAGFDWVYYESKAHVHCSVKS
序列中阴影部分的字母代表发生突变的一个氨基酸位置；
序列SEQ ID NO.7～SEQ ID NO.14是这样推断的：
经过GeneBank搜索数据库可获得如下数据：
A.L38517 Homo sapiens indian hedgehog protein(IHH)mRNA，5′end
B.B.AB021874 Homo sapiens hedgehog gene，5′-flanking region，partial cds
C.U85610 Mus musculus Indian hedgehog protein(Ihh)mRNA，complete cds
D.Q14623 INDIAN HEDGEHOG PROTEIN PRECURSOR(IHH)(HHG-2)
C为老鼠的全长mRNA分为三个外显子，Exon1，Exon2，Exon3.但数据库中仅有的人类IHH数据为A.B。其中A仅仅包含C的Exon2，和Exon3同源序列，并无Exon1，而B则为5’非编码序列。发明人认为数据库中无人类IHH的全长mRNA序列。通过分析老鼠和人类的已有序列可知同源性非常高，利用老鼠的Exon1序列搜索人类Genomic数据库可获得一高度匹配的区域，通过分析这一区域，发明人获得了一种突变体，此区域即为人类IHH的Exon1区域，通过拼接得到人类IHH的全长mRNA，翻译成蛋白后发现与数据库中已有的人类IHH蛋白D.吻合。
以下将通过附图对本发明的有关内容作进一步的说明。
附图1为BDA-1的临床照片；
图2为Exon1的PCR产物胶图；
图3为Exon2的PCR产物胶图；
图4为野生型和突变型基因所编码蛋白质的三维空间构象的变化；
发明人对从贵州、湖南两省的偏远山区采集到两个大的、不相关的A-1家系共38名患者，利用连锁分析成功地将A-1致病基因定位于2q35-q36；利用X光检查这两个大家系中病人得手和足，提供的资料符合Fitch关于非综合征型BDA-1特征的描述。
由图1可见，A1-型短指典型特征是中间指(趾)节缺失，或与中间指(趾)节与远端融合，其中图1-a，图1-b，图1-c来自湖南家系，而图1-d，图1-e和图1-f来自贵州家系。通过单体型的分析，可认定这两个家系没有共同的单体型区段，说明两个家系有不同的奠基者(founder)。该研究结果已在文献“Am.J.Hum.Genet.2000.66：892-903”中进行了公开报道。
在上述研究的基础上，发明人利用常规的PCR扩增候选基因DNA和DNA测序分析等技术，成功地克隆了A-1型致病基因，发现定位于2q35-q36区段IHH基因就是BDA-1致病基因。正是由于IHH基因发生了突变，导致了A-1型的发病。突变分别发生在两个家系IHH基因的exon1(1号外显子上)和exon2(2号外显子上)的编码区内，并在两个家系所有患者的DNA样品上得到了验证。发明人通过PCR扩增，产物纯化，测序的方法获得exon1及exon2序列，具体方法步骤如下(其中所列exon1方法为exon1中包含突变部分的扩增，并未包括全长)：
Exon1：
PCR反应体系：(体系各项试剂除DNA外均由Bio-Asia公司提供，后同)
ddH2O 16.5ul 灭菌双蒸水
Buffer 2.5ul 聚合反应缓冲液包含KCl Tris-HCl溶液
Mg2+ 2.0ul 25mM MgCl2溶液
dNTP 2.0ul 2mM dNTP溶液
Pri-F 0.4ul 20pmol/ul正向引物 5’-CGGACGCTATGAAGGCAAGA-3’
Pri-R 0.4ul 20pmol/ul反向引物 5’-GCCAGCCAGTCGAGAAAATG-3’
Taq 0.2ul DNA合成多聚酶
DNA 1.0ul 20ng/ul人体DNA扩增模板
Volume 25.0ul
PCR反应条件：
1.95℃ 5’
2.95℃ 30”
3.58℃ 45”
4.72℃ 1’
5.Go to step 2 for 35 cycles
6.72℃ 10’
7.4℃ hold
1.5％ agarose gel check
胶图见附图2。
Exon2
PCR反应体系：
ddH2O 13.5ul 灭菌双蒸水
Buffer 2.5ul 聚合反应缓冲液包含KCl Tris-HCl溶液
Mg2+ 1.0ul 25mM MgCl2溶液
dNTP 1.0ul 2mM dNTP溶液
Q 5.0ul Q-Solutin(QIAGEN公司提供)
Pri-F 0.4ul 20pmol/ul正向引物 5’-GCGCCTACACCTGCACCTC-3’
Pri-R 0.4ul 20pmol/ul反向引物 5’-CCTTCTCGGCACTACTCCTCCT-3’
Taq 0.4ul DNA合成多聚酶
DNA 1.0ul 20ng/ul人体DNA扩增模板
Volume 25.0ul
PCR反应条件：
1.95℃ 5’
2.95℃ 30”
3.63℃ 45”-0.5℃/cycle
4.72℃ 1’
5.Go to step 2 for 15 cycles
6.95℃ 30”
7.56℃ 45”
8.72℃ 1’
9.Go to step 6 for 20 cycles
10.72℃ 10’
11.4℃ hold
1.5％ agarose gel check
胶图见附图3。
以上PCR反应均采用96孔板，MJ Research PTC-225 Peltier Thermal CyclerPCR仪进行，胶图照片采用Bio-Rad公司Gel-Doc摄像仪摄取。
A-1型基因PCR扩增产物测序：
PCR产物采用Promega Wizard Kit纯化，按说明书操作
测序反应体系：
ddH2O 2ul 灭菌双蒸水
DNA 5ul 纯化后DNA，计200ng
Buffer 2.5ul 测序用buffer(自配1M Tric-Hcl∶25mM Mgcl2∶ddH2O 2∶2∶1)
BDT 2.5ul ABI BigDyeTerminator Cylce sequencing Ready Reaction Kit
Primer 0.8ul 所获得的PCR产物的正向或反向引物 3pmol/ul
测序反应条件：
1.96℃ 2’
2.96℃ 10”
3.50℃ 5”
4.60℃ 4’
5.Go to step 2 for 40 cycles
6.4℃ hold
结束后加入70％乙醇避光静置15分钟，4000转/分钟离心30分钟，甩去乙醇，精置1小时晾干，加入loading buffer准备上样。测序采用ABI PRISM 377DNA Sequencer进行。
同时我们利用酶切方法对A-1基因PCR扩增产物进行了验证，酶切分析方法如下：
Exon1 产物采用 TaKaRa生物技术公司MboII限制性内切酶酶切
MboII 0.5ul(5U) TaKaRa Biotechnology Co.ltd
Buffer 2.5ul TaKaRa Biotechnology Co.ltd
DNA 10ul PCR产物
ddH2O 7ul 灭菌双蒸水
volume 20ul
37℃ 8小时
采用20％聚丙烯酰胺凝胶检测。
Exon2 产物采用 Sino-American生物技术公司StyI限制性内切酶酶切
StyI 0.3ul(3U) Sino-American Biotechnology Co.ltd
Buffer 2.5ul Sino-American Biotechnology Co.ltd
DNA 5ul PCR产物
ddH2O 12.2ul 灭菌双蒸水
volume 20ul
37℃ 8小时
采用20％聚丙烯酰胺凝胶检测。
而且野生型和突变型基因所编码蛋白质的三维空间构象也发生了改变，结果见图4。采用Swiss-pdbviewer(version 3.7b2)和Ncbi Cn3D(version 3.0)两个软件通过数据库中已有的蛋白晶体结构对此基因编码的蛋白进行模拟分析，图4-A为正常情况，95Glu，131Glu如箭头所示。图4-B为95Glu突变为95Lys的情况。
图4-C为131Glu突变为131Lys的情况。
具体地，在湖南省的家系中是exon1上的第283位G(碱基)突变为A(碱基)，使得野生型exon1编码的蛋白质分子中的第95位Glu(氨基酸)转变为Lys(氨基酸)；而在贵州省的家系中是exon2上的第391位G(碱基)突变为A(碱基)，使得野生型exon2编码的蛋白质分子中的第131位Glu(氨基酸)转变为Lys(氨基酸)。基于野生型exon1、2编码的蛋白质具有如下的生物活性：在对肢体发育过程起关键作用的IHH信号途径中，IHH蛋白的氨基末端为信号域，既包括exon1和exon2所编码的区域(Cell.Vol.100，185-188，January 21，2000，)。我们推测野生型exon1或exon2突变后所编码的蛋白质，可能由于氨基酸组成的改变，从而降低或改变了该蛋白质正常时所具有的生物活性，阻碍了骨组织的正常生长和发育，导致A-1型的产生。
由上述公开的技术方案可见，本发明对于遗传疾病的诊断和治疗将产生十分重要和深远的意义：
首先，本发明克隆了A-1型致病基因即定位于2q35-q36区段IHH基因，确定了该基因的突变位点，并进行了初步的结构和功能域的研究；
其次，本发明揭示了A-1型发病的分子遗传学基础。这一发明将有力地推动人类肢体发育异常病理机制的进一步研究，加深人类在分子水平上对骨骼发育的认识，并为今后相应的基因诊断、药物设计和临床治疗提供了基因学的依据。
第三，本发明提供了一种检测、分析DNA样品中是否具有A-1型基因和进行初步的结构及其功能域研究的方法，为进一步的研究奠定了基础。
Claims (13)
1.一种分离出的或纯化的A-1型短指基因，其特征在于编码具有SEQ ID NO.2序列的蛋白A-1型多肽。
2.如权利要求1所述的基因，其特征在于具有SEQ ID NO.1所示的核酸序列。
3.如权利要求1或2所述的基因，其特征在于包括2q35-q36区段内的IHH基因。
4.一种权利要求1所述的序列的变异体，其特征在于编码具有少于8个保守性氨基酸改变的同源变异蛋白，其具有SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列。
5.如权利要求4所述的变异体，其特征在于编码具有少于8个保守性碱基改变的同源变异序列，具有SEQ ID NO.5所示的核酸序列。
6.如权利要求3所述的基因，其特征在于，所说的IHH基因Exon1区域的编码具有SEQ ID NO.8序列的蛋白多肽。
7.如权利要求3所述的基因，其特征在于，所说的IHH基因Exon1区域，其核酸序列如SEQ ID NO.7所示。
8.一种如权利要求6所述的IHH基因Exon1区域的同源变异体，其特征在于，其编码具有SEQ ID NO.10序列的蛋白多肽。
9.如权利要求8所述的IHH基因Exon1区域的同源变异体，其特征在于，其核酸序列如SEQ ID NO.9所示。
10.如权利要求3所述的基因，其特征在于，所说的IHH基因Exon2区域的编码具有SEQ ID NO.12序列的蛋白多肽。
11.如权利要求3所述的基因，其特征在于，所说的IHH基因Exon2区域，其核酸序列如SEQ ID NO.11所示。
12一种如权利要求10所述的IHH基因Exon2区域的同源变异体，其特征在于，其编码具有SEQ ID NO.14序列的蛋白多肽。
13.如权利要求12所述的IHH基因Exon2区域的同源变异体，其特征在于，其核酸序列如SEQ ID NO.13所示。
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2001
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