CN1560255A - 红豆杉紫杉烷c13－侧链－n－苯甲酰转运酶蛋白编码序列 - Google Patents
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Abstract
一种红豆杉紫杉烷C13－侧链－N－苯甲酰转运酶蛋白编码序列，属于基因工程领域。所分离出的DNA分子包括：编码具有红豆杉紫杉烷C13－侧链－N－苯甲酰转运酶活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.3中从核苷酸第36－1352位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在40－55℃条件下与SEQ ID NO.3中从核苷酸第36－1352位的核苷酸序列杂交。本发明是一种催化苯甲酰CoA和去苯甲酰紫杉醇生成紫杉醇的酶，对保护人民的健康生长有所帮助。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学、基因工程技术领域。具体地，本发明涉及一种在红豆杉中表达的紫杉烷C13-侧链-N-苯甲酰转运酶及其核酸序列。
背景技术
紫杉醇(taxol)是上世纪70年代由Wani等从短叶红豆杉(Taxus brevifolia)树皮中提取出来的具有独特抗癌作用的天然产物。紫杉醇是经FDA认证的目前最好的天然抗癌药物之一，它是治疗卵巢癌的首选药物，并且对白血病、肺癌、脑癌和其他的一些实体瘤等均有很好的疗效，并且毒副作用很小。现在，紫杉醇生产面临的唯一困难就是药源的严重匮乏。
近几年来对寻找及扩大紫杉醇药源途径的研究取得了极大的进展.由于目前基本阐明了紫杉醇生物合成代谢途径及其关键酶，故利用基因工程技术在基因水平上快速、高效地改良红豆杉，获得遗传修饰的高含量紫杉醇的红豆杉成为可能。相比之下，利用现代生物技术，特别是基因工程技术改良有机体，生产紫杉醇具有很大的优势，因而利用基因工程技术是生产紫杉醇及其药源的最佳途径。
在对现有文献的分析中，虽然“The Proceedings of the National Academy ofSciences of the United States of American(美国国家科学院进展)2002，99(14)，9166-9171”报道从加拿大红豆杉中克隆了紫杉醇生物合成途径中最后的一个酰基转运酶(DBTNBT)基因，但是并没见有进一步研究这个基因家族的其他成员如曼地亚红豆杉(高产紫杉醇的商业品种)种的该基因的同源基因。由于这个基因编码的酶催化紫杉醇合成的最后一步并对紫杉醇合成效率具有重要影响，因此，最后的这一步是基因工程遗传改良红豆杉的重要切入点。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种红豆杉紫杉烷C13-侧链-N-苯甲酰转运酶蛋白编码序列。使其包含所说基因的融合基因构建体，携带该构建体的新的重组表达载体，被所说的表达载体转化植物细胞，以及由转化细胞产生的所说基因的转基因植物及其后代，包括植物种子及植物组织，所获得的转基因植物将具有显著提高的紫杉醇含量。
本发明是通过以下技术方案实现的，本发明所分离出的DNA分子包括：编码具有红豆杉紫杉烷C13-侧链-N-苯甲酰转运酶活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.3中从核苷酸第36-1352位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在40-55℃条件下与SEQ ID NO.3中从核苷酸第36-1352位的核苷酸序列杂交。
较佳地，所述的序列编码具有SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列的多肽。更佳地，所述的序列具有SEQ ID NO.3中从核苷酸第36-1352位的核苷酸序列。
本发明分离出的红豆杉紫杉烷C13-侧链-N-苯甲酰转运酶多肽，它包括：具有SEQ ID NO.3氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。较佳地，该多肽是具有SEQ ID NO.3序列的多肽。
本发明所提供的载体DNA分子转化的宿主细胞，它是真核细胞。它包含所述的DNA分子中8-100个连续核苷酸。
本发明用上述载体。在实例中该宿主细胞是烟草。
在本发明中，“分离的”、“纯化的”DNA是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组分分开，而且已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。
在本发明中，术语“红豆杉紫杉烷C13-侧链-N-苯甲酰转运酶(或多肽)编码序列”指编码具有红豆杉紫杉烷C13-侧链-N-苯甲酰转运酶活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.3中第36-1352位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQID NO.3序列的编码框第36-1352位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID NO.3中第36-1352位核苷酸序列同源性低至约70％的简并序列也能编码出SEQ ID NO.3所述的序列。该术语还包括能在中度严紧条件下，更佳的在高度严紧条件下与SEQ IDNO.3中从核苷酸第36-1352位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。该术语还包括与SEQID NO.3中从核苷酸第36-1352位的核苷酸序列的同源性至少70％，较佳地至少80％，更佳地至少90％，最佳地至少95％的核苷酸序列。
该术语还包括能编码具有与天然的红豆杉紫杉烷C13-侧链-N-苯甲酰转运酶相同功能的蛋白的SEQ ID NO.3中开放阅读框序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。
在本发明中，术语“红豆杉紫杉烷C13-侧链-N-苯甲酰转运酶或多肽”指具有红豆杉紫杉烷C13-侧链-N-苯甲酰转运酶活性的SEQ ID NO.3序列的多肽。该术语还包括具有与天然红豆杉紫杉烷C13-侧链-N-苯甲酰转运酶相同功能的、SEQ ID NO.4序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括红豆杉紫杉烷C13-侧链-N-苯甲酰转运酶的活性片段和活性衍生物。
本发明的红豆杉紫杉烷C13-侧链-N-苯甲酰转运酶多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧条件下能与红豆杉紫杉烷C13-侧链-N-苯甲酰转运酶DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用红豆杉紫杉烷C13-侧链-N-苯甲酰转运酶多肽的血清获得的多肽或蛋白。
在本发明中，“红豆杉紫杉烷C13-侧链-N-苯甲酰转运酶保守性变异多肽”指与SEQ ID NO.3的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个氨基酸性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行替换而产生。
表1
| 最初的残基 | 代表性的取代 | 优选的取代 |
| Ala(A) | Val；Leu；Ile | Val |
| Arg(R) | Lys；Gln；Asn | Lys |
| Asn(N) | Gln；His；Lys；Arg | Gln |
| Asp(D) | Glu | Glu |
| Cys(C) | Ser | Ser |
| Gln(Q) | Asn | Asn |
| Glu(E) | Asp | Asp |
| Gly(G) | Pro；Ala | Ala |
| His(H) | Asn；Gln；Lys；Arg | Arg |
| Ile(I) | Leu；Val；Met；Ala；Phe | Leu |
| Leu(L) | Ile；Val；Met；Ala；Phe | Ile |
| Lys(K) | Arg；Gln；Asn | Arg |
| Met(M) | Leu；Phe；Ile | Leu |
| Phe(F) | Leu；Val；Ile；Ala；Tyr | Leu |
| Pro(P) | Ala | Ala |
| Ser(S) | Thr | Thr |
| Thr(T) | Ser | Ser |
| Trp(W) | Tyr；Phe | Tyr |
| Tyr(Y) | Trp；Phe；Thr；Ser | Phe |
| Val(V) | Ile；Leu；Met；Phe；Ala | Leu |
表2
78％identity in 1007 nt overlap
Query：184 tgttagtctacaatgcctctaacaccatttctgcagatcctgcgactgtaattcgggagg 243
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Sbjct：143 tgttggttttcaatgcccctgacaacatttctgcagatcctgtaaaaataattagagagg 202
Query：244 ctctctccaaggtgttggtgtattattttccttttgctgggcggatgagaaacaaaggag 303
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Sbjct：203 ctctctccaaggtgttggtgtattatttccctcttgctgggcggctcagaagtaaagaaa 262
Query：304 atggggaactggaagtggattgcacgggggaaggtgctctgtttgtagaagccatggcgg 363
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Sbjct：263 ttggggaacttgaagtggagtgcacaggggatggtgctctgtttgtggaagccatggtgg 322
Query：364 acgacaacctttcagtgttgggaggttttgattaccacaatccagcatttgggaagctac 423
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Sbjct：323 aagacaccatttcagtcttacgagatctggatgacctcaatccatcatttcagcagttag 382
Query：424 tttactcactaccactggatacccctattcacgacctccatcctctggttgttcaggtaa 483
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Sbjct：383 ttttttggcatccattggacactgctattgaggatcttcatcttgtgattgttcaggtaa 442
Query：484 ctcgttttacctgcggggggtttgttgtgggattaagtttggaccatagtatatgtgatg 543
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Sbjct：443 cacgttttacatgtgggggcattgccgttggagtgactttgccccatagtgtatgtgatg 502
Query：544 gacgtggtgcaggtcaatttcttaaagccctagcagagatggcgaggggagaggctaagc 603
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Sbjct：503 gacgtggagcagcccagtttgttacagcactggcagagatggcgaggggagaggttaagc 562
Query：604 cctcattggaaccaatatggaatagagagttgttgaagcccgaagaccttatacgcctgc 663
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Sbjct：563 cctcactagaaccaatatggaatagagaattgttgaaccctgaagaccctctacatctcc 622
Query：664 aattttatcactttgaatcgatgcgtccacctccaatagttgaagaaattgttcaagcat 723
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Sbjct：623 agttaaatcaatttgattcgatatgcccacctccaatgctggaggaattgggtcaagctt 682
Query：724 ctattattgtaaactctgagacaataagtaatatcaaacaatacattatggaagaatgta 783
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Sbjct：683 cttttgttataaacgttgacaccatagaatatatgaagcaatgtgtcatggaggaatgta 742
Query：784 aagaatctagttttgcatttggggtcgtagcagcattggcctggctagcgaggacaaggg 843
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Sbjct：743 atgaattttgttcgtcttttgaagtagtggcagcattggtttggatagcacggacaaagg 802
Query：844 cttttcaaattccacatacagagaatgtaaagcttctttttgcagtggatacgaggagat 903
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Sbjct：803 ctcttcaaattccacatactgagaatgtgaagcttctctttgcgatggatttgaggaaat 862
Query：904 catttgatccaccacttccaaaaggttactatggtaatgccgctggtaatgcatgtgcaa 963
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Sbjct：863 tatttaatcccccacttccaaatggatattatggtaatgccattggtactgcatatgcaa 922
Query：964 tggataatgttcaagacctcttaaatggatctctattgcgggctgtaatgattataaaga 1023
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Sbjct：923 tggataatgtccaagacctcttaaatggatctcttttgcgtgctataatgattataaaaa 982
Query：1024 aatcaaaggtctctttaaatgagaa-tat--aagggcaaaaacagtgatgagaccatctg 1080
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Sbjct：983 aagcaaaggctgatttaaaagataattattcgaggtcaagggtagttacaaacccatatt 1042
Query：1081 caatagatgtgaatatgaaacatgaaagcacagttggattaagtgatttgaggcacttgg 1140
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Sbjct：1043 cattagatgtgaacaagaaatccgacaacattcttgcattgagtgactggaggcggttgg 1102
Querv：1141 gatttaatgaagtggactttgggtggggagatgcattaaatgcaagt 1187
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Sbjct：1103 gattttatgaagccgattttgggtggggaggtccactgaatgtaagt 1149
Query：曼地亚红豆杉TmDBTNBT蛋白的核酸序列
sbjct：加拿大红豆杉TcDBTNBT蛋白的核酸序列(AF466397)
表2为本发明的曼地亚红豆杉TmDBTNBT蛋白与加拿大红豆杉TcDBTNBT蛋白的核苷酸序列的同源比较(GAP)表。
表3
61％identity in 433 aa overlap，76％similarity in 433 aa overlap
Query：1 MEKAGSSTEFHVKISDPVMVPPCIPSPKTILQLSAVDNYPAVRGNILDCLLVYNASNTIS 60
MEKAGS T+FHVK DPVMV P +PSPK +QLS VD+ RG I + LLV+NA + IS
Sbjct：1 MEKAGS-TDFHVKKFDPVMVAPSLPSPKATVQLSVVDSLTICRG-IFNTLLVFNAPDNIS 58
Query：61 ADPATVIREALSKVLVYYFPFAGRMRNKGDGELEVDCTGEGALFVEAMADDNLSVLGGFD 120
ADP +IREALSKVLVYYFP AGR+R+K GELEV+CTG+GALFVEAM +D +SVL D
Sbjct：59 ADPVKIIREALSKVLVYYFPLAGRLRSKEIGELEVECTGDGALFVEAMVEDTISVLRDLD 118
Query：121 YHNPAFGKLLYSLPLDTPIHDLHPLVVQVTRFTCGGFVVGLSLDHSICDGRGAGQFLKAL 180
NP+F +L++ PLDT I DLH ++VQVTRFTCGG VG++L HS+CDGRGA QF+ AL
Sbjct：119 DLNPSFQQLVFWHPLDTAIEDLHLVIVQVTRFTCGGIAVGVTLPHSVCDGRGAAQFVTAL 178
Query：181 AEMARGEAKPSLEPIWNRELLKPEDLIRLQFYHFESMRPPPIVEEIVQASIIVNSETISN 240
AEMARGE KPSLEPIWNRELL PED + LQ F+S+ PPP++EE+ QAS ++N +TI
Sbjct：179 AEMARGEVKPSLEPIWNRELLNPEDPLHLQLNQFDSICPPPMLEELGQASFVINVDTIEY 238
Query：241 IKQYIMEECKESSFAFEVVAALAWLARTRAFQIPHTENVKLLFAVDTRRSFDPPLPKGYY 300
+KQ +MEEC E +FEVVAAL W+ART+A QIPHTENVKLLFA+D R+ F+PPLP GYY
Sbjct：239 MKQCVMEECNEFCSSFEVVAALVWIARTKALQIPHTENVKLLFAMDLRKLFNPPLPNGYY 298
Query：301 GNAAGNACAMDNVQDLLNGSLLRAVMIIKKSKVSLNENI-RAKTVMRPSAIDVNMKHEST 359
GNA G A AMDNVQDLLNGSLLRA+MIIKK+K L +N R++ V P ++DVN K ++
Sbjct：299 GNAIGTAYAMDNVQDLLNGSLLRAIMIIKKAKADLKDNYSRSRVVTNPYSLDVNKKSDNI 358
Query：360 VGLSDLRHLGFNEVDFGWGDALNASLVQ---HGVIQQNYFLFLQPSKNMNGGIKIAM-FM 415
+ LSD R LGF E DFGWG LN S +Q +G+ + FL+L P+KN + GIK+ + M
Sbjct：359 LALSDWRRLGFYEADFGWGGPLNVSSLQRLENGLPMFSTFLYLLPAKNKSDGIKLLLSCM 418
Query：416 PQSKVKPFKIEMEALISKYATKV 438
P + +K FKI MEA+I KY +KV
Sbjct：419 PPTTLKSFKIVMEAMIEKYVSKV 441
Query：曼地亚红豆杉TmDBTNBT蛋白氨基酸序列
Sbjct：加拿大红豆杉TcDBTNBT蛋白氨基酸序列(GenBank Accession No.AAM75818)
表3为本发明的曼地亚红豆杉紫杉烷C13-侧链-N-苯甲酰转运酶(TmDBTNBT)与加拿大红豆杉紫杉烷C13-侧链-N-苯甲酰转运酶(TcDBTNBT)蛋白氨基酸序列的同源比较(FASTA)表。其中，相同的氨基酸在两个序列之间用氨基酸单字符标出。
发明还包括红豆杉紫杉烷C13-侧链-N-苯甲酰转运酶或多肽的类似物。这些类似物与天然酰基转运酶多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体，包括质粒，粘粒等。在生产本发明的红豆杉紫杉烷C13-侧链-N-苯甲酰转运酶多肽时，可以将红豆杉紫杉烷C13-侧链-N-苯甲酰转运酶编码序列可操作地连于表达调控序列，从而形成红豆杉紫杉烷C13-侧链-N-苯甲酰转运酶表达载体。
如本发明所用，“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。
在本发明中，术语“宿主细胞”为真核细胞。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、烟草细胞和其它植物细胞。
还可用Northern印迹法技术分析红豆杉紫杉烷C13-侧链-N-苯甲酰转运酶基因产物的表达，即分析红豆杉紫杉烷C13-侧链-N-苯甲酰转运酶的RNA转录物在细胞中的存在与否和数量。
此外，本发明中可用作探针的核酸分子，该分子通常具有红豆杉紫杉烷C13-侧链-N-苯甲酰转运酶核苷酸编码序列的8-100个连续核苷酸，较佳地具有15-50个连续核苷酸。该探针可用于检测样品中是否存在编码红豆杉紫杉烷C13-侧链-N-苯甲酰转运酶的核酸分子。
本发明涉及检测样品中是否存在红豆杉紫杉烷C13-侧链-N-苯甲酰转运酶核苷酸序列的方法，它包括用上述的探针与样品进行杂交，然后检测探针是否发生了结合。较佳地，该样品是PCR扩增后的产物，其中PCR扩增引物对应于红豆杉紫杉烷C13-侧链-N-苯甲酰转运酶核苷酸编码序列，并可位于该编码序列的两侧或中间。引物长度一般为15-50个核苷酸。
此外，根据本发明的红豆杉紫杉烷C13-侧链-N-苯甲酰转运酶核苷酸序列和氨基酸序列，可以在核酸同源性或表达蛋白质的同源性基础上，筛选红豆杉紫杉烷C13-侧链-N-苯甲酰转运酶同源基因或同源蛋白。
为了得到与红豆杉紫杉烷C13-侧链-N-苯甲酰转运酶基因相关的红豆杉cDNAs的点阵，可以用DNA探针筛选红豆杉cDNA文库，这些探针是在低严紧条件下，用32P对红豆杉紫杉烷C13-侧链-N-苯甲酰转运酶的全部或部分做放射活性标记而得的。最适合于筛选的cDNA文库是来自红豆杉的文库。构建来自感兴趣的细胞或者组织的cDNA文库的方法是分子生物学领域众所周知的。另外，许多这样的cDNA文库也可以购买到，例如购自Clontech，Stratagene，Palo Alto，Cal.。这种筛选方法可以识别与红豆杉紫杉烷C13-侧链-N-苯甲酰转运酶的基因家族的核苷酸序列。
本发明的红豆杉紫杉烷C13-侧链-N-苯甲酰转运酶核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
除了用重组法产生之外，本发明蛋白的片段还可用固相技术，通过直接合成肽而加以生产(Stewart等人，(1969)Solid-Phase Peptide Synthesis，WH FreemanCo.，San Francisco；Merrifield J.(1963)J.Am Chem.Soc 85：2149-2154)。在体外合成蛋白质可以用手工或自动进行。例如，可以用Applied Biosystems的431A型肽合成仪(Foster City，CA)来自动合成肽。可以分别化学合成本发明蛋白的各片段，然后用化学方法加以连接以产生全长的分子。
利用本发明的红豆杉紫杉烷C13-侧链-N-苯甲酰转运酶，通过各种常规筛选方法，可筛选出与红豆杉紫杉烷C13-侧链-N-苯甲酰转运酶发生相互作用的物质，或者受体、抑制剂或拮剂等。本发明催化苯甲酰CoA和去苯甲酰紫杉醇生成紫杉醇的酶，在抗性试验中具有明显的作用，对保护人民的健康生长有所帮助。因此，具有很大的应用价值。
具体实施方式
下面结合实验室具体的试验数据和结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
曼地亚红豆杉紫杉烷C13-侧链-N-苯甲酰转运酶基因的克隆
1.组织分离(isolation)
红豆杉(品种为“曼地亚”)幼嫩叶片来源于西南师范大学，采取材料后，立即置于液氮中冷冻保存。
2.RNA的分离(RNA isolation)
取部分组织，用研钵研碎，加入盛有裂解液的1.5mL EP管，充分振荡后，再移入玻璃匀浆器内。匀浆后移至1.5mL EP管中，抽提总RNA(TRIzol Reagents，GIBCOBRL，USA)。用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量，然后在分光光度计上测定RNA含量。
3.基因的全长克隆(Cloning of Full-length cDNA)
根据一些植物酰基转运酶的氨基酸保守序列，设计保守引物，利用同源性基因克隆原理，采用Smart-RACE方法(Clonetech试剂盒)进行cDNA全长克隆，分三个阶段进行：
(1)5’-RACE
PCR(UPM+R2)得到TMR2’(0.7kb)，回收，连接到T-Easy载体上，用SP6或T7作为通用引物，采用终止物荧光标记(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI377测序仪(Perkin-Elmer，USA)上进行测序。测序结果用GCG软件包(Wisconsingroup，USA)中的BLAST和FASTA软件搜索已有的数据库(Genebank+EMBL)，知其核酸序列及编码蛋白与已知植物酰基转运酶基因(如紫杉烷C13-侧链-N-苯甲酰转运酶基因等)的同源性很高，故初步认为它是一个酰基转运酶基因。
(2)3’-RACE
根据5’RACE结果，设计正向特异引物F2，经PCR(UPM+F2)得到TMF2’(1.0kb)(过程同(1))。回收，连接到T-Easy载体上，用SP6或T7作为通用引物，采用终止物荧光标记(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI 377测序仪(Perkin-Elmer，USA)上进行测序。
(3)将5’RACE测序结果与3’RACE测序结果比序后进行拼接，得到全长片段序列信息，并设计一对特异引物进行PCR扩增TmDBTNBT编码区(KF1+KR1)得到TmDBTNBT编码区(1.32kb)(过程同(1))。
BLAST的结果证明从红豆杉中新得到的基因确为一个植物酰基转运酶基因。由于已知的加拿大红豆杉TcDBTNBT蛋白具有催化苯甲酰CoA和去苯甲酰紫杉醇生成紫杉醇的功能(Walker，et al.，2002)，故推测此新克隆的基因具有相同的功能。
通过组合使用上述3种方法，获得了候选的红豆杉TmDBTNBT蛋白的全长编码序列。在拼接得到全长(至少包含完整的开放读框)的基础上，进一步设计引物TmDBTNBTF1：5’-GATTCTCAGCCCATCGTTTCATC-3’(SEQ ID NO.1)为正向引物，寡核苷酸TmDBTNBTR1：5’-GCGGGTTCAAATATTATTTGGAAAATAC-3’(SEQ ID NO.2)为反向引物，以总RNA为模板，进行RT-PCR扩增，F1/R2的PCR条件为94℃5分钟，随之以94℃1分钟、58℃1分钟和72℃2分钟进行35个循环，最后以72℃延伸10分钟。电泳检测PCR扩增产物，获得扩增片段长度为1401bp。然后按常规方法以PCR扩增产物进行克隆、测序，获得SEQ ID NO.3所示的序列。
实施例2
红豆杉紫杉烷C13-侧链-N-苯甲酰转运酶基因的序列信息与同源性分析
本发明新的红豆杉酰基转运酶全长cDNA的长度为1401bp，详细序列见SEQ IDNO.3，其中开放读框位于36-1352位核苷酸。根据全长cDNA推导出红豆杉酰基转运酶的氨基酸序列，共438个氨基酸残基，分子量48410.92，pI为6.10。详细序列见SEQ ID NO.4。
将曼地亚红豆杉紫杉烷C13-侧链-N-苯甲酰转运酶的全长cDNA序列及其编码蛋白质用BLAST程序在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundantGenBank CDS translations+PDB+SwissProt+Superdate+PIR数据库中进行核苷酸和蛋白质同源性检索，结果发现它与加拿大红豆杉紫杉烷C13-侧链-N-苯甲酰转运酶(TcDBTNBT)基因(AF466397)在核苷酸水平上具有78％的同源性(附表2)；在氨基酸水平上，它与加拿大红豆杉紫杉烷C13-侧链-N-苯甲酰转运酶(GenBank AccessionNo.AAM75818)有61％的相同性和76％的相似性(见表3)。由此可见，曼地亚红豆紫杉烷C13-侧链-N-苯甲酰转运酶与加拿大红豆杉紫杉烷C13-侧链-N-苯甲酰转运酶无论从核酸还是蛋白水平上都存在较高的同源性，故可以认为曼地亚红豆杉紫杉烷C13-侧链-N-苯甲酰转运酶在催化苯甲酰CoA和去苯甲酰紫杉醇生成紫杉醇的反应上也具有相似的功能。
实施例3
红豆杉紫杉烷C13-侧链-N-苯甲酰转运酶在大肠杆菌中进行原核表达及提纯
在该实施例中，将全长的红豆杉TmDBTNBT编码序列或片段构建入商品化的蛋白质融合表达载体之中，以表达和提纯重组蛋白。
将红豆杉TmDBTNBT多肽以融合蛋白的形式在大肠杆菌中进行原核表达。
原核表达载体的构建，以及转化大肠杆菌
根据红豆杉TmDBTNBT的氨基酸序列，设计蛋白编码区的引物，并在正反引物上分别引入限制性内切酶位点(这根据选用的pET32a(+)载体而定)，以便构建表达载体。以实施例1中获得的扩增产物为模板，经PCR扩增后，将红豆杉TmDBTNBT基因在保证阅读框正确的前提下克隆至pET32a(+)载体(Novagen)。鉴定好的表达载体利用CaCl2方法转入大肠杆菌BL21，筛选鉴定得到含有pET32a(+)-TmDBTNBT表达载体的工程菌BL21-pET32a(+)-TmDBTNBT。
表达Trx-TmDBTNBT重组蛋白的工程菌的分离鉴定
挑取单菌落的BL21-pET32a(+)-TmDBTNBT工程菌于3ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中振摇培养过夜，按1∶100的浓度吸取培养液于新的LB培养基(含100μg/ml氨苄青霉素)中培养约3小时，至OD600达0.5后，加入IPTG至终浓度1mmol/L继续于37℃分别培养0，1，2，3小时。取培养时间不同的1ml菌液离心，在细菌沉淀物中加入裂解液(2×SDS上样缓冲液50μl，蒸馏水45μl，二巯基乙醇5μl)，混悬细菌沉淀，沸水浴中煮5分钟，10000rpm离心1分钟，上清加入12％SDS-PAGE胶中电泳。染色后观察预期分子量大小的蛋白量随IPTG诱导时间增加而增加的菌株即为表达Trx-TmDBTNBT融合蛋白的工程菌。
Trx-TmDBTNBT融合蛋白的提取纯化
按上述方法诱导表达Trx-TmDBTNBT融合表达蛋白的工程菌BL21-pET32a(+)-TmDBTNBT，经离心沉淀收集菌体，并根据厂家(Novagen)的说明书以BugBuster试剂和Benzonase核酸酶来纯化包涵体。包涵体可用溶解缓冲液(50mM CAPS，pH 11.0，0.3％N-lauroylsarcosine)来溶解，再用透析缓冲液(200mMTris-HCl，pH8.5)来透析。然后用组氨酸结合(His·Bind)树脂进行亲和层析，并经洗脱缓冲液(1M imidazole，500mM NaCl，20mM Tris-HCl pH 7.9)洗脱来收集Trx-TmDBTNBT融合蛋白。融合蛋白经肠激酶20℃酶切16小时后即可分离获得TmDBTNBT的表达蛋白。
实施例4
红豆杉紫杉烷C13-侧链-N-苯甲酰转运酶在红豆杉中进行真核细胞表达
将含目的基因(红豆杉紫杉烷C13-侧链-N-苯甲酰转运酶基因)的表达载体的构建，根据红豆杉紫杉烷C13-侧链-N-苯甲酰转运酶的全长序列(SEQ ID NO.3)，设计扩增出完整编码阅读框的引物，并在上游和下游引物上分别引入限制性内切酶位点(这可视选用的载体而定)，以便构建表达载体。以实施例1中获得的扩增产物为模板，经PCR扩增后，将红豆杉紫杉烷C13-侧链-N-苯甲酰转运酶基因cDNA克隆至中间载体(如pBluescript)，进-步克隆到双元表达载体(如pBI121和改进的pCAMBIA2300)，在保证阅读框架正确的前提下鉴定好的表达载体，再将其转入农杆菌中，利用幼嫩的茎段转化曼地亚红豆杉。利用发根农杆菌Ri质粒介导的曼地亚红豆杉的遗传转化：
1.发根农杆菌A4。使用前自冰箱取出，传代2次，传代用固体培养基为YEB培养基。菌种在使用前接种于YEB液体培养基中，27℃培养过夜。
2.经种子萌发生长8周左右的曼地亚红豆杉的无菌嫩枝条。
3.经过夜培养的菌液，用转化液(B5培养液中加入100μmol/L乙酰丁香酮，10mg/mL的甜菜碱)稀释为100个细菌/mL。取无菌红豆杉顶芽、侧芽、叶、茎、根等植物不同部位，用无菌的解剖刀划以“+”字形伤口，放入上述转化液中，60rpm/min振荡培养8h取出，用无菌水冲洗3次，放入含250-500mg/L卡那霉素和不同浓度6-BA(0.5mg/L-3mg/L)的B5培养基中，每2周转移到新鲜培养基中1次，待长出毛状根后分离毛状根，转移至含250-500mg/L卡那霉素无激素的B5培养基中培养，转移4-5次直至无细菌为止，然后再转移至不含卡那霉素的无激素B5培养基中培养。
4.把在固体培养基中的毛状根的继代培养物，接种于装有100mL无激素B5，培养基的500mL三角瓶中，培养温度、光照、转速等培养条件与愈伤组织液体悬浮培养条件相同，培养20天，将毛状根从培养基上取出放入冷冻干燥机中进行干燥，然后称重，贮存于-70℃备用。毛状根中的紫杉醇抽提按Richard(1993)、Saito(1992)的方法。紫杉醇含量的测定采用HPLC(Catalatic，1993)和紫杉醇单克隆抗体(HawaiiBiotechnology Group Inc.)间接联酶免疫法(蒋成淦，1984)。
本发明涉及的序列及记号分列如下：
(1)SEQ ID NO.1的信息
(i)序列特征：
(A)长度：23bp
(B)类型：核苷酸
(C)链性：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii).分子类型：寡核苷酸
(iii).序列描述：SEQ ID NO.1
GATTCTCAGCCCATCGTTTCATC
(2)SEQ ID NO.2的信息
(i)序列特征：
(A)长度：28bp
(B)类型：核苷酸
(C)链性：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：寡核苷酸
(iii)序列描述：SEQ ID NO.2
GCGGGTTCAAATATTATTTGGAAAATAC
(3)SEQ ID NO.3的信息
(i)序列特征：
(A)长度：1431bp
(B)类型：核苷酸
(C)链性：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：核苷酸
(iii)序列描述：SEQ ID NO.3
<110>上海交通大学
<120>红豆杉紫杉烷C13-侧链-N-苯甲酰转运酶蛋白编码序列
<160>2
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>1431
<212>DNA
<213>曼地亚红豆杉(Taxus median)
<220>
<221>CDS
<222>(36)..(1352)
<223>
<400>1
gattctcagc ccatcgtttc atctttgatc cagtc atg gag aag gca ggc tca 53
Met Glu Lys Ala Gly Ser
1 5
tca aca gag ttc cat gta aag atc tct gat cca gtc atg gtg ccc ccc 101
Ser Thr Glu Phe His Val Lys Ile Ser Asp Pro Val Met Val Pro Pro
10 15 20
tgc atc cct tcc ccc aaa aca atc ctc cag ctc tcc gcc gta gac aat 149
Cys Ile Pro Ser Pro Lys Thr Ile Leu Gln Leu Ser Ala Val Asp Asn
25 30 35
tac cca gcg gta aga gga aat att ctc gac tgc ctg tta gtc tac aat 197
Tyr Pro Ala Val Arg Gly Asn Ile Leu Asp Cys Leu Leu Val Tyr Asn
40 45 50
gcc tct aac acc att tct gca gat cct gcg act gta att cgg gag gct 245
Ala Ser Asn Thr Ile Ser Ala Asp Pro Ala Thr Val Ile Arg Glu Ala
55 60 65 70
ctc tcc aag gtg ttg gtg tat tat ttt cct ttt gct ggg cgg atg aga 293
Leu Ser Lys Val Leu Val Tyr Tyr Phe Pro Phe Ala Gly Arg Met Arg
75 80 85
aac aaa gga gat ggg gaa ctg gaa gtg gat tgc acg ggg gaa ggt gct 341
Asn Lys Gly Asp Gly Glu Leu Glu Val Asp Cys Thr Gly Glu Gly Ala
90 95 100
ctg ttt gta gaa gcc atg gcg gac gac aac ctt tca gtg ttg gga ggt 389
Leu Phe Val Glu Ala Met Ala Asp Asp Asn Leu Ser Val Leu Gly Gly
105 110 115
ttt gat tac cac aat cca gca ttt ggg aag cta ctt tac tca cta cca 437
Phe Asp Tyr His Asn Pro Ala Phe Gly Lys Leu Leu Tyr Ser Leu Pro
120 125 130
ctg gat acc cct att cac gac ctc cat cct ctg gtt gtt cag gta act 485
Leu Asp Thr Pro Ile His Asp Leu His Pro Leu Val Val Gln Val Thr
135 140 145 150
cgt ttt acc tgc ggg ggg ttt gtt gtg gga tta agt ttg gac cat agt 533
Arg Phe Thr Cys Gly Gly Phe Val Val Gly Leu Ser Leu Asp His Ser
155 160 165
ata tgt gat gga cgt ggt gca ggt caa ttt ctt aaa gcc cta gca gag 581
Ile Cys Asp Gly Arg Gly Ala Gly Gln Phe Leu Lys Ala Leu Ala Glu
170 175 180
atg gcg agg gga gag gct aag ccc tca ttg gaa cca ata tgg aat aga 629
Met Ala Arg Gly Glu Ala Lys Pro Ser Leu Glu Pro Ile Trp Asn Arg
185 190 195
gag ttg ttg aag ccc gaa gac ctt ata cgc ctg caa ttt tat cac ttt 677
Glu Leu Leu Lys Pro Glu Asp Leu Ile Arg Leu Gln Phe Tyr His Phe
200 205 210
gaa tcg atg cgt cca cct cca ata gtt gaa gaa att gtt caa gca tct 725
Glu Ser Met Arg Pro Pro Pro Ile Val Glu Glu Ile Val Gln Ala Ser
215 220 225 230
att att gta aac tct gag aca ata agt aat atc aaa caa tac att atg 773
Ile Ile Val Asn Ser Glu Thr Ile Ser Asn Ile Lys Gln Tyr Ile Met
235 240 245
gaa gaa tgt aaa gaa tct agt ttt gca ttt gag gtc gta gca gca ttg 821
Glu Glu Cys Lys Glu Ser Ser Phe Ala Phe Glu Val Val Ala Ala Leu
250 255 260
gcc tgg cta gcg agg aca agg gct ttt caa att cca cat aca gag aat 869
Ala Trp Leu Ala Arg Thr Arg Ala Phe Gln Ile Pro His Thr Glu Asn
265 270 275
gta aag ctt ctt ttt gca gtg gat acg agg aga tca ttt gat cca cca 917
Val Lys Leu Leu Phe Ala Val Asp Thr Arg Arg Ser Phe Asp Pro Pro
280 285 290
ctt cca aaa ggt tac tat ggt aat gcc gct ggt aat gca tgt gca atg 965
Leu Pro Lys Gly Tyr Tyr Gly Asn Ala Ala Gly Asn Ala Cys Ala Met
295 300 305 310
gat aat gtt caa gac ctc tta aat gga tct cta ttg cgg gct gta atg 1013
Asp Asn Val Gln Asp Leu Leu Asn Gly Ser Leu Leu Arg Ala Val Met
315 320 325
att ata aag aaa tca aag gtc tct tta aat gag aat ata agg gca aaa 1061
Ile Ile Lys Lys Ser Lys Val Ser Leu Asn Glu Asn Ile Arg Ala Lys
330 335 340
aca gtg atg aga cca tct gca ata gat gtg aat atg aaa cat gaa agc 1109
Thr Val Met Arg Pro Ser Ala Ile Asp Val Asn Met Lys His Glu Ser
345 350 355
aca gtt gga tta agt gat ttg agg cac ttg gga ttt aat gaa gtg gac 1157
Thr Val Gly Leu Ser Asp Leu Arg His Leu Gly Phe Asn Glu Val Asp
360 365 370
ttt ggg tgg gga gat gca tta aat gca agt ctg gtg caa cat ggg gta 1205
Phe Gly Trp Gly Asp Ala Leu Asn Ala Ser Leu Val Gln His Gly Val
375 380 385 390
att caa caa aat tat ttt ctt ttc cta caa cct tcc aag aac atg aat 1253
Ile Gln Gln Asn Tyr Phe Leu Phe Leu Gln Pro Ser Lys Asn Met Asn
395 400 405
ggt gga ata aag ata gca atg ttc atg ccc caa tca aaa gtg aag cca 1301
Gly Gly Ile Lys Ile Ala Met Phe Met Pro Gln Ser Lys Val Lys Pro
410 415 420
ttc aaa ata gaa atg gaa gcc cta ata agc aaa tat gca act aaa gtg 1349
Phe Lys Ile Glu Met Glu Ala Leu Ile Ser Lys Tyr Ala Thr Lys Val
425 430 435
tga aactacaaca acttgagctt tgtattttcc aaataatatt tgaacccgca 1402
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 1431
<210>2
<211>438
<212>PRT
<213>曼地亚红豆杉(Taxus median)
<400>2
Met Glu Lys Ala Gly Ser Ser Thr Glu Phe His Val Lys Ile Ser Asp
1 5 10 15
Pro Val Met Val Pro Pro Cys Ile Pro Ser Pro Lys Thr Ile Leu Gln
20 25 30
Leu Ser Ala Val Asp Asn Tyr Pro Ala Val Arg Gly Asn Ile Leu Asp
35 40 45
Cys Leu Leu Val Tyr Asn Ala Ser Asn Thr Ile Ser Ala Asp Pro Ala
50 55 60
Thr Val Ile Arg Glu Ala Leu Ser Lys Val Leu Val Tyr Tyr Phe Pro
65 70 75 80
Phe Ala Gly Arg Met Arg Asn Lys Gly Asp Gly Glu Leu Glu Val Asp
85 90 95
Cys Thr Gly Glu Gly Ala Leu Phe Val Glu Ala Met Ala Asp Asp Asn
100 105 110
Leu Ser Val Leu Gly Gly Phe Asp Tyr His Asn Pro Ala Phe Gly Lys
115 120 125
Leu Leu Tyr Ser Leu Pro Leu Asp Thr Pro Ile His Asp Leu His Pro
130 135 140
Leu Val Val Gln Val Thr Arg Phe Thr Cys Gly Gly Phe Val Val Gly
145 150 155 160
Leu Ser Leu Asp His Ser Ile Cys Asp Gly Arg Gly Ala Gly Gln Phe
165 170 175
Leu Lys Ala Leu Ala Glu Met Ala Arg Gly Glu Ala Lys Pro Ser Leu
180 185 190
Glu Pro Ile Trp Asn Arg Glu Leu Leu Lys Pro Glu Asp Leu Ile Arg
195 200 205
Leu Gln Phe Tyr His Phe Glu Ser Met Arg Pro Pro Pro Ile Val Glu
210 215 220
Glu Ile Val Gln Ala Ser Ile Ile Val Asn Ser Glu Thr Ile Ser Asn
225 230 235 240
Ile Lys Gln Tyr Ile Met Glu Glu Cys Lys Glu Ser Ser Phe Ala Phe
245 250 255
Glu Val Val Ala Ala Leu Ala Trp Leu Ala Arg Thr Arg Ala Phe Gln
260 265 270
Ile Pro His Thr Glu Asn Val Lys Leu Leu Phe Ala Val Asp Thr Arg
275 280 285
Arg Ser Phe Asp Pro Pro Leu Pro Lys Gly Tyr Tyr Gly Asn Ala Ala
290 295 300
Gly Asn Ala Cys Ala Met Asp Asn Val Gln Asp Leu Leu Asn Gly Ser
305 310 315 320
Leu Leu Arg Ala Val Met Ile Ile Lys Lys Ser Lys Val Ser Leu Asn
325 330 335
Glu Asn Ile Arg Ala Lys Thr Val Met Arg Pro Ser Ala Ile Asp Val
340 345 350
Asn Met Lys His Glu Ser Thr Val Gly Leu Ser Asp Leu Arg His Leu
355 360 365
Gly Phe Asn Glu Val Asp Phe Gly Trp Gly Asp Ala Leu Asn Ala Ser
370 375 380
Leu Val Gln His Gly Val Ile Gln Gln Asn Tyr Phe Leu Phe Leu Gln
385 390 395 400
Pro Ser Lys Asn Met Asn Gly Gly Ile Lys Ile Ala Met Phe Met Pro
405 410 415
Gln Ser Lys Val Lys Pro Phe Lys Ile Glu Met Glu Ala Leu Ile Ser
420 425 430
Lys Tyr Ala Thr Lys Val
435
Claims (5)
1、一种红豆杉紫杉烷C13-侧链-N-苯甲酰转运酶蛋白编码序列，其特征在于，所分离出的DNA分子包括：编码具有红豆杉紫杉烷C13-侧链-N-苯甲酰转运酶活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.3中从核苷酸第36-1352位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在40-55℃条件下与SEQID NO.3中从核苷酸第36-1352位的核苷酸序列杂交。
2、根据权利要求1所述的红豆杉紫杉烷C13-侧链-N-苯甲酰转运酶蛋白编码序列，其特征是，分离出的红豆杉紫杉烷C13-侧链-N-苯甲酰转运酶多肽，它包括：具有SEQ ID NO.3氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
3、根据权利要求1或2所述的红豆杉紫杉烷C13-侧链-N-苯甲酰转运酶蛋白编码序列，其特征是，该序列具有SEQ ID NO.3中从核苷酸第36-1352位的核苷酸序列。
4、根据权利要求1所述的红豆杉紫杉烷C13-侧链-N-苯甲酰转运酶蛋白编码序列，其特征是，它包含所述的DNA分子中8-100个连续核苷酸。
5、根据权利要求4所述的红豆杉紫杉烷C13-侧链-N-苯甲酰转运酶蛋白编码序列，其特征是，所提供的载体DNA分子转化的宿主细胞，它是真核细胞。
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-
2004
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Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108265038A (zh) * | 2010-12-03 | 2018-07-10 | 基因流股份有限公司 | 改善的光-发射分子 |
| US11661587B2 (en) | 2010-12-03 | 2023-05-30 | Promega Corporation | Light-emitting molecules |
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| CN111748547A (zh) * | 2020-07-07 | 2020-10-09 | 中国农业科学院深圳农业基因组研究所 | 紫杉二烯合酶TcTS2、编码核苷酸序列及其应用 |
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