CN1814755A - 一种高温中性蛋白酶及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种地衣芽孢杆菌(Bacillus Licheniformis CGMCC NO0800)生产高温中性蛋白酶及其制备方法。通过对高温中性蛋白酶的分离、纯化及分子生物学研究，可获得高温中性蛋白酶的结构基因。该基因片段大小为1129个碱基，表达377个氨基酸。并据此设计了DNA引物，同时克隆出该基因的全基因序列，确定酶蛋白的纯化方法及基因克隆的方法，并对表达载体进行了选择，使该基因与pET28a进行连接，并在大肠杆菌BL21中进行了表达。在获得基因后，并克隆到表达载体上，可能获得高效表达的基因工程菌株，再进行发酵生产，能显著提高酶产量的有效途径。利用该技术生产的产品将使我国洗涤剂工业、毛皮工业、制革工业、丝纺工业、药品及食品工业产生一次变革，可减少生产过程中对环境的污染，提高生产效率和产品质量。无论直接经济效益或社会意义都是很大的。

Description

一种高温中性蛋白酶及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种中性蛋白酶，特别是涉及到一种高温中性蛋白酶及其制备方法。
背景技术：
蛋白酶作为一大类生物酶，广泛应用于食品、医药、洗涤剂、纺织及皮革处理等方面。而高温蛋白酶具有催化反应速度快，无工业污染，催化反应条件适应性宽等特性和优点，尤其是在耐热、耐变性剂、耐有机溶剂等方面具有比较强的优点，有重要的应用价值，不仅如此，对高温蛋白酶的耐热机制的阐明还可以为人们蛋白质工程技术改造天然酶，从而提高其稳定性提供理论依据。但是，现有高温蛋白酶一般酶产量低、生产成本高。
据文献资料显示，国内外对高温中性蛋白酶的研究集中于二十世纪八、九十年代，重点在于菌种的选育、基因工程菌的构建及酶的固定化三个方面。菌种的选育进展缓慢，发酵酶活低；基因工程菌的构建尚处于研究阶段，已构建的工程菌表达量低，还达不到规模化工业生产的要求；酶的固定化虽能提高酶的热稳定性，但也存在诸多应用上的困难，如使用成本效高等。2002年已由新疆农科院微生物应用研究所投资的新疆威仕达生物工程股份有限公司申请了有关中性蛋白酶的专利(专利申请号：02158191.6)，即高温中性蛋白酶菌株、高温中性蛋白酶及其生产工艺已申请了专利，其它未见有关高温中性蛋白酶生产的报导。
该专利根据新疆农科院微生物应用研究所1992年从新疆吐鲁番火焰山土壤中分离筛选到一株高温中性蛋白酶产生菌，该菌种经鉴定为地衣芽孢杆菌(Bacillus LicheniformisCGMCC NO0800)(以下简称XJT9503高温中性酶)，通过新疆农科院立项的支持、以及国家“863”科研攻关，进一步对XJT9503高温中性酶产生菌的生物学特性、分类、发酵产酶的工艺条件、分离提纯及酶学特性等进行了研究。通过摇瓶、7升、25升、250升、3000升及10000升发酵罐上的中试试验研究，确定了产酶最佳条件及酶的稳定性试验，确立了一整套科学的发酵工艺技术路线，发酵平均酶活均在10000u/ml以上，具有好的热稳定性，其最适反应pH7.0-7.2，最适反应温度65℃，弥补了一般中性蛋白酶的不足。通过分级沉淀及柱层析等技术提纯XJT9503高温中性蛋白酶，获得工业级(＞100000u/g)、食品级(＞150000u/g)用高温中性蛋白酶。利用该技术生产的产品将使我国洗涤剂工业、毛皮工业、制革工业、丝纺工业、药品及食品工业产生一次变革，可减少生产过程中对环境的污染，提高生产效率和产品质量。无论直接经济效益或社会意义都是很大的。
由于微生物生长、代谢等因素，利用常规生物发酵技术生产的蛋白酶量有限，培养条件严格，生产成本较高，造成应用困难。生物技术的发展为酶的研究提供了新途径。DNA测序技术的提高，许多嗜热菌的基因组已经被解析。通过与嗜中温菌的已知基因序列对比，已推测得到许多酶蛋白基因序列，但酶的特性还需要在基因表达后得到进一步的表征。定向分子进化技术的发展也为我们获得新型酶提供了新的方法。
发明内容：
本项研究采用分子生物学技术，通过对高温中性蛋白酶的分离、纯化及分子生物学研究，可获得高温中性蛋白酶的结构基因。在获得基因后，利用基因工程手段构建成工程菌，并克隆到表达载体上，获得基因工程菌株，并进行发酵生产，这是一条提高酶产量的有效途径。
本发明主要目的在于提供地衣芽孢杆菌(Bacillus Licheniformis CGMCC NO0800)高温中性蛋白酶的氨基酸序列，并据此设计了DNA引物，用PCR方法从地衣芽孢杆菌XJT9503的总DNA中扩增得到了高温中性蛋白酶基因Gp1，片段大小为1129个碱基，表达377个氨基酸，对所获得的基因进行序列分析测定，并与蛋白酶的氨基酸序列分析对比，确认了所获得的基因。将扩增的Gp1基因DNA片段与表达载体pET-28a连接构建成重组分泌型表达载体pGp1，并在大肠杆菌BL21中进行了表达。
本发明提供的内容包括：
本发明提供了SEQ ID NO：1列出的核苷酸序列，该片段大小1129个碱基。
通过对地衣芽孢杆菌(Bacillus Licheniformis CGMCC NO0800)高温中性蛋白酶基因克隆方法的确定及该基因的全序列测定，根据氨基酸的序列设计引物，对地衣芽孢杆菌(Bacillus Licheniformis CGMCC NO0800)高温中性蛋白酶生产菌总DNA序列进行了PCR扩增，扩增出了一条片段，将此片段连接到pGEM-T载体中，选择阳性质粒进行测序。该片段大小1129个碱基，基因的大小是1.1Kb，与氨基酸序列吻合。
本发明提供了编码包含SEQ ID NO：2中所述的蛋白酶氨基酸序列，该酶共有377个氨基酸组成。
通过对地衣芽孢杆菌(Bacillus Licheniformis CGMCC NO0800)生产的高温中性蛋白酶酶蛋白进行纯化、酶的提纯工艺的研究，获得了电泳纯蛋白，并对酶蛋白进行了质谱分析及氨基酸序列的部分肽段的测定，将获得的电泳纯酶蛋白通过氨基酸序列进行了质谱分析及多肽同源性比较，确定了氨基酸的序列。
同时该发明为获得该基因，还提供了该酶蛋白的提纯方法，即生产该蛋白酶的方法。具体包括如下：
(1)、将地衣芽孢杆菌(Bacillus Licheniformis CGMCC NO0800)高温中性蛋白酶发酵生产的发酵液经10000rpm离心处理去除菌体，收集上清液；
(2)、利用20％-30％饱和度的硫酸铵除去大量的杂蛋白，经过10000rpm离心处理，收集上清液；
(3)、将上清液在-10℃--25℃下使用乙醇可有效的将发酵液中的蛋白酶沉淀，进一步加大乙醇的用量，可使酶蛋白析出体积比大于1∶1；
(4)、上样浓度控制在0.5-2.5mg/ml，上样数量控制在8ul-32ul；
(5)、将沉淀通过SepHadex G100凝胶过滤。
本发明的蛋白酶纯化达到测序的标准，纯化的方法可获得电泳纯蛋白，测序通过质谱分析及部分肽段的氨基酸序列测定，所获得的氨基酸序列大小与所测结果一致。
该发明同时提供了该基因克隆的方法。
通过氨基酸测序分析系统测定纯化的蛋白得到蛋白酶的部分氨基酸序列，根据得到的氨基酸序设计了引物，其上游引物为Gp1P1，下游引物为Gp1P2，上下游引物中均引入了BamHI酶切位点。具体如下：
其上游引物为Gp1P1＞AG
Figure A20051005233800061
GACAAACGGGCGATGCTA＜3(引入BamHI酶切位点)；
下游引物为Gp1P2＞CA
Figure A20051005233800062
TACACTCCAACCGCATTT＜3(引入BamHI酶切位点)。
两引物跨度为1.2Kb。Gp1基因引物由上海基康生物技术有限公司合成。将从地衣芽孢杆菌(Bacillus Licheniformis CGMCC NO0800)纯化的基因组DNA作为模板进行PCR。结果扩增出了一条1.1Kd的特异DNA片段。
本发明进一步提供了含有上面的基因、编码上面的蛋白酶组成型启动子或调节性启动子、作为选择性标记的抗生素抗性基因和转录终止子的新的表达系统。
本发明还提供了一种重组分泌型表达载体，通过将扩增的Gp1基因DNA片段与表达载体pET-28a连接构建成重组分泌型表达载体。
本发明选择的表达载体pET-28a是通过中国农业大学提供，是一种普遍的表达载体，可通过市场购买。
通过选择合适的酶切位点，设计出具有酶切位点、起始及终止密码子的引物对XJT9503高温中性酶生产菌株总DNA进行PCR扩增，将克隆出的基因片段酶切后与同样酶切后的表达载体pET28a进行正向连接，并在大肠杆菌BL21中进行了表达。
本发明通过对地衣芽孢杆菌(Bacillus Licheniformis CGMCC NO0800)高温中性蛋白酶基因的表达载体的构建及在大肠杆菌BL21中的表达。将克隆出的基因片段与表达载体pET28a进行正向连接，并在大肠杆菌BL21中进行了表达，表达产物具有正常的地衣芽孢杆菌(Bacillus Licheniformis CGMCC NO0800)高温中性蛋白酶活性。
构成常规重组方法的一系列步骤基本上是本领域技术人员已知的，例如技术人员可以利用J.Sambrook等人的《分子克隆实验指南》P34(科学出版社(1992))指导的方法容易地实现本发明的目的。
本发明分离和纯化了地衣芽孢杆菌(Bacillus Licheniformis CGMCC NO0800)产生的蛋白酶，进行了蛋白酶的氨基酸序列测定，进行了基因克隆并测定其序列，序列分析结果是SEQID NO：1中列出的蛋白酶的氨基酸序列与B.lichenformis 6816丝氨酸蛋白酶氨基酸序列同源性在96％的相似性。另外，发现在存在蛋白酶抑制剂，如EDTA，蛋白酶的相对活性变低(参见图)。这些观察到的现象支持了本发明的蛋白酶是中性蛋白酶的说法。对酶的SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠-取胜丙烯酰胺凝胶)电泳及质谱分析结明表明本发明蛋白酶带的分子量为27.3KDa。
有益效果：
本发明的蛋白酶纯化达到测序的标准，纯化的方法可获得电泳纯蛋白，测序通过质谱分析及部分肽段的氨基酸序列测定，所获得的氨基酸序列大小与所测结果一致。
重组质粒在宿主BL21中有很好的稳定性，在有选择压力条件下传代60次基本稳定，传代80次重组质粒保留率达68％以上。
附图说明：
图1为高温中性蛋白酶表达载体构建流程图。
图2为氨基酸序列分析，样品的质谱分析图谱。
图3为蛋白酶氨基酸测序结果
图4不同浓度IPTG对高温中性蛋白酶表达的影响结果
具体实施方式
实例1：地衣芽孢杆菌(Bacillus Licheniformis CGMCC NO0800)高温中性蛋白酶的简要制备流程
醪液预处理(初酶)→离心除杂→硫酸铵→离心→乙醇沉淀→收集酶泥→冷冻干燥→Sephadex G100凝胶过滤→电泳分析→氨基酸测序
地衣芽孢杆菌(Bacillus Licheniformis CGMCC NO0800)高温中性蛋白酶发酵生产的发酵液经10000rpm离心处理去除菌体，离心后上清液通过：
1、盐沉淀：在中性盐中以硫酸铵沉淀效果最好，利用25％饱和度的硫酸铵可以除去大量的杂蛋白，经过10000rpm离心处理，收集上清液。
2、有机溶剂沉淀法：我们将上清液在低温下使用乙醇可有效的将发酵液中的蛋白酶沉淀，进一步加大乙醇的用量，可使酶蛋白析出体积比大于1∶1。
3、将以上的处理液经过10000rpm离心后，将沉淀通过SepHadex G100凝胶过滤。
上样前用0.01NPBS上样的体积约为床体积的1％，即0.1毫升，浓度为10-30毫克/毫升。调整流速0.05毫升/分钟，使样品慢慢渗入色谱柱内，当样品加完至快干时，小心加入洗脱液洗脱。我们采用的是含盐洗脱剂0.5NNaCL，它的作用是抑制交联葡聚糖的吸附性质，流速控制与上样流速一致。收集最高峰即可获得电泳纯酶蛋白。将SepHadex G100凝胶过滤后收集的酶样在经过乙醇沉淀浓缩后迅速在10000rpm离心后进行冷冻干燥。-20℃保存。上样时溶解在样品缓冲液中即可。样品浓度2mg/ml为最佳，上样数量控制在18ul-22ul为宜。将纯化的酶蛋白进行氨基酸序列分析。
表1SDS-PAGE不连续系统分离胶和浓缩胶的配制
加样顺序 试剂名称 15％分离胶所需试剂量   5％浓缩胶液所需试剂量
  1   30％凝胶贮液   5.625ml   1.17ml
  2   浓缩胶缓冲贮液   --   202.7ul
  3   分离胶缓冲贮液   2.75ml   --
  4   10％SDS   57.225ul   33ul
  5   10％过硫酸铵   100ul   66ul
    6   TEMED     5ul     3.3ul
    7   双蒸水     3ml     4
实例2：地衣芽孢杆菌(Bacillus Licheniformis CGMCC NO0800)高温中性蛋白酶的氨基酸序列分析
我们将纯化的酶蛋白在北京军事医学科学院进行氨基酸序列分析，样品的质谱分析图谱(可参见图2)以及蛋白酶氨基酸测序结果(可见参图3)。质谱分析结果表明纯化蛋白分子量为27.3kDa。
实例3：地衣芽孢杆菌(Bacillus Licheniformis CGMCC NO0800)高温中性蛋白酶的氨基酸序的引物设计
根据所测定的氨基酸序列测定结果设计一对简并引物，用于PCR扩增Gp1基因。其上游引物为Gp1P1，下游引物为Gp1P2。两引物跨度为1.2Kb。Gp1基因引物由上海基康生物技术有限公司合成。结果扩增出了一条特异基因片段。
P1：5＞AG
Figure A20051005233800091
GACAAACGGGCGATGCTA＜3(引入BamHI酶切位点)
P2：5＞CA TACACTCCAACCGCATTT＜3(引入BamHI酶切位点)
利用Gp1表达引物，以TGp1质粒为模板进行质粒PCR扩增Gp1基因。
取表达载体pET28a 4μl，用BamHI酶切后与回收后的Gp1基因在T4DNA连接酶作用下16℃连接过夜。连接产物转化感受态细胞BL21，随机挑取转化板菌落于LB液体培养基中震荡培养过夜(含卡那霉素60-100μg/ml)，用小量提质粒法提质粒，提出的质粒先通过电泳初步筛选出较大的质粒，然后用BamHI对初筛选出的质粒进行酶切鉴定，Gp1引物进行PCR鉴定。得到的重组质粒命名为B-pGp1。
实例4：基因的扩增方法
PCR反应在50μl体系里进行。取XJT9503提取的DNA1μl做模板，依次加入灭菌去离子水20μl，Taq酶混合溶液25μl，Gp1P1 2μl(25pmol)，Gp1P2 2μl(25pmol)，于PCR自动循环仪内扩增GPl基因cDNA，循环参数为：94℃变性5min，94℃1min，55℃1min，72℃2min，循环数为30个，最后72℃延伸10min，循环结束后取5μl PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色后紫外下观察，分析PCR产物。
实例5不同浓度IPTG对高温中性蛋白酶表达的影响
我们将重组菌B-pGp1在含有0.5-1％酪素的LB培养基上涂板培养(含卡那霉素50-100μg/ml)，选择生长并具有透明圈的菌落进行鉴定。酶活测定结果表明，表达产物具有正常的生物学活性。SDS-PAGE电泳结果显示具有明显的特异性表达条带，表达产物的分子量为27.0×103，同核酸序列测定所推导的值相符。摇瓶实验确定了重组菌的最佳表达条件为IPTG0.75mmol/L，培养起始pH＝6，培养温度为37℃。重组菌所得酶活为2184u/ml。
试验发现，在IPTG浓度低于0.75mmol/L时酶的表达水平随诱导物浓度的提高而提高，继续提高IPTG的浓度酶活反而有所下降(参见图4)。
实例6重组菌酶活的测定方法
——根据中华人民共和国轻工业部于1993-07-29发布，并于1994-03-01实施的《中华人民共和国行业标准》QB/T 1803、1804-93，QB/T 1805、1806-93，工业酶制剂通用试验方法，及该高温中性蛋白酶特性，在测试过程中温度定为65℃、pH为7.2。
(1)定义
1克固体酶粉(或1ml液体酶)，在一定温度下和pH条件下，1分钟水解酪素产生1ug酪氨酸为一个酶活力单位，以u/g(u/ml)表示。
(2)福林法
2.1原理
XJT9503高温中性蛋白酶在65℃，pH7.2条件下，水解酪素底物，产生含有酚基的氨基酸，在碱性条件下，将福林试剂(Folin)还原，生成钼蓝与钨蓝，用分光光度计测定，计算其酶活力。
2.2试剂与溶液
2.2.1福林试剂的制备
适用于常规实验室制备方法。
使用溶液：一份福林试剂与两份水混合，摇匀。
2.2.2碳酸钠溶液c(Na2CO3)＝0.4mol/L
称取无水碳酸钠(Na2CO3)42.4g，用水溶解并定溶至1000ml。
2.2.3三氯乙酸c(CCl3COOH)＝0.4mol/L
称取三氯乙酸65.4g，用水溶解并定溶至1000ml。
2.2.40.02M、pH7.2磷酸缓冲液的配制
称取磷酸氢二钠(Na2HPO4 12H2O)4.90g和磷酸二氢钠(NaH2PO4 2H2O)0.99g，加水溶解并定溶至1000ml。
2.2.550g/L酪素溶液
称取酪素1.000g，精确至0.001g，用少量0.5mol/L氢氧化钠溶液湿润后，加入适量的pH7.2的磷酸缓冲液约80ml，在沸水浴中边加热边搅拌，直至完全溶解，冷却后，转入100ml容量瓶中，用适量的pH缓冲溶液稀释至刻度。此溶液于冰箱中保存，有效期为三天。
2.2.6 100ug/ml L-酪氨酸标准溶液
称取恒重的L-酪氨酸0.1000g，精确至0.0002g，用1mol/L盐酸60ml溶解后定溶至100ml，即为1mg/ml酪氨酸标准溶液。
2.3仪器和设备
2.3.1恒温水浴65±0.2℃、40±0.2℃。
2.3.2分光光度计应符合GB 9721的规定。
2.2.4测定步骤
2.2.4.1标准曲线的绘制
a.L-酪氨酸标准溶液
按下表配制
管号   酪氨酸标准溶液浓度ug/ml   取100ug/ml酪氨酸标准溶液体积ml   取水的体积ml
  0   0   0   10
  1   10   1   9
  2   20   2   8
  3   30   3   7
  4   40   4   6
  5   50   5   5
b.分别取上述溶注液各1.00ml(须做平行试验)，各加0.4mol/ml碳酸钠溶液5.00ml、福林试剂1.00ml，置于40℃水浴中显色20分钟，取出用分光光度计于波长680nm，10mm比色皿，以不含酪氨酸的0号管为空白，分别测定其吸光度。以吸光度A为纵坐标，酪氨酸的浓度c为横坐标，绘制标准曲线(此线应通过零点)。
根据作图或用回归方程，计算出当吸光度为1时的酪氨酸的量(ug)，即为吸光常数K值。其K值应在100左右。
2.2.4.2待测酶样的制备与测定
a.称取酶粉1-2g，精确至0.0002g(或吸取液体酶1.00ml)，用少量pH7.2的磷酸缓冲液溶解，并用捣研，然后将上清液倾入容量瓶中，沉渣中再添加适量缓冲液，研捣3-4次，最后全部移入容量瓶中，用缓冲液定容至刻度，摇匀，用四层纱布过滤，滤液根据酶活力再一次用缓冲液稀释至适当的浓度，供测试用(稀释至测试液吸光值在0.25-0.45范围内)，稀释好的酶液置于冰箱中保存。
b.测定
先将酪素溶液放入65℃恒温水浴中，预热5分钟。
c.计算
X＝A*K*4/10*N
式中：X-样品的酶活力，u/ml(u/g)；
A-样品平行试验的平均吸光度；
K-吸光常数；
4-反应试剂的总体积，ml；
10-反应时间10分钟，以分钟计；
N-稀释倍数。
所测定的结果表示为整数。平行试验相对误差不超过3％。
实例7抑制剂对酶活性的影响：
EDTA对阳性克隆蛋白酶活性的抑制远远大于pMSF对蛋白酶活性的抑制作用，说明此克隆所产生的蛋白酶为中性蛋白酶。B-pGP1分泌的胞内蛋白酶对pMSF敏感，表明该酶活性中心可能含有丝氨酸残基；EDTA强烈抑制酶活性，表明金属离子(如Ca2+)对酶活性或稳定性具有重要影响；向EDTA处理过的酶液中补加过量的Cacl2能恢复部分活力，表明EDTA对部分酶活的抑制作用是可逆的；EDTA与pMSF都只能抑制部分酶活，当它们同时作用时，酶活才几乎被完全抑制(参见表3)。
表3EDTA和pMSF对克隆菌B-pGP1蛋白酶活性的抑制
抑制剂(1mmol/L) 对照 EDTA pMSF   EDTA+Ca2+ EDTA+pMSF
  剩余酶活力(％)   100   40   50   54   0.9
实例8质粒的稳定性
工程菌质粒在不加压的情况下连续转种4次，统计在加和不加Kan的平皿中的菌落数，结果见表4。表4数据表明，带有重组质粒pGp1的E.coli BL21在传代60次质粒基本保持稳定，随着转种次数的增加。存在质粒丢失的现象，传代80次仅有68％的菌株携带重组质粒。
表4工程菌B-pGP1连续转种后在卡那霉素平皿上的菌落数
  传代次数  不含Kan菌数(个)  含Kan菌数(个)
  20   300以上   300以上
  40   300以上   280
  60   300以上   247
  80   300以上   204
SEQUENCE LISTING
<110>新疆农科院微生物所
<120>一种高温中性蛋白酶及其制备方法
<130>高温中性蛋白酶
<160>2
<170>PatentIn version 3.3
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<213>地衣芽孢杆菌(Bacillus Licheniformis)
<220>
<221>CDS
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atg agg aaa aag agt tct tgg ctt ggg atg ctg acg gcc ttc atg ctc    48
Met Arg Lys Lys Ser Ser Trp Leu Gly Met Leu Thr Ala Phe Met Leu
1               5                   10                  15
gtg ttc acg acg gca ttc agc gat tcc gct tct gct gct caa ccg gcg    96
Val Phe Thr Thr Ala Phe Ser Asp Ser Ala Ser Ala Ala Gln Pro Ala
            20                  25                  30
aaa aat gtt gaa aag gat tat att gtc gga ttt aag tca gga gtg aaa    144
Lys Asn Val Glu Lys Asp Tyr Ile Val Gly Phe Lys Ser Gly Val Lys
        35                  40                  45
acc gca tct gtc aaa aag gac atc atc aaa gag agc ggc gga aaa gtg    192
Thr Ala Ser Val Lys Lys Asp Ile Ile Lys Glu Ser Gly Gly Lys Val
    50                  55                  60
gac aag cag ttt aga atc atc aac gcg gca aaa gcg aag cta gac aaa    240
Asp Lys Gln Phe Arg Ile Ile Asn Ala Ala Lys Ala Lys Leu Asp Lys
65                  70                  75                  80
gaa gcg ctt aag gaa gtc aaa aat gat ccg gat gtc gct tat gtg gaa    288
Glu Ala Leu Lys Glu Val Lys Asn Asp Pro Asp Val Ala Tyr Val Glu
                85                  90                  95
gag gat cat gtg gcc cat gcc tcg gcg caa acc gtt cct tac ggc att    336
Glu Asp His Val Ala His Ala Ser Ala Gln Thr Val Pro Tyr Gly Ile
            100                 105                 110
cct ctc att aaa gcg gac aaa gcg cac gct caa cgc ttt aag gga gcg    384
Pro Leu Ile Lys Ala Asp Lys Ala His Ala Gln Arg Phe Lys Gly Ala
        115                 120                 125
aat gta aaa gta gcc gtc ctg gat aca gga atc caa gct tct cat ccg    432
Asn Val Lys Val Ala Val Leu Asp Thr Gly Ile Gln Ala Ser His Pro
    130                 135                 140
gac ttg aac gta gtc ggc gga gca agc ttt gtg gct ggc gaa gct tat    480
Asp Leu Asn Val Val Gly Gly Ala Ser Phe Val Ala Gly Glu Ala Tyr
145                 150                 155                 160
aac acc gac ggc aac aga cac ggc acg cat gtc gcc tgt aca gta gct    528
Asn Thr Asp Gly Asn Arg His Gly Thr His Val Ala Cys Thr Val Ala
                165                 170                 175
gcg ctt gac aat aca acg ggt gta ata cgc gtt gcg cca agc gta tcc    576
Ala Leu Asp Asn Thr Thr Gly Val Ile Arg Val Ala Pro Ser Val Ser
            180                 185                 190
ttg tac gcg gtt aaa gta ctg aat tca agc gga agc gga tca tac agc    624
Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Asn Ser Ser Gly Ser Gly Ser Tyr Ser
        195                 200                 205
ggc att gta agc gga atc gag tgg gcg aca aca aac ggc atg gat gtt    672
Gly Ile Val Ser Gly Ile Glu Trp Ala Thr Thr Asn Gly Met Asp Val
    210                 215                 220
atc aat atg agc ctt ggg gga gca tca ggc tcg aca gcg atg aaa cag    720
Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly Ala Ser Gly Ser Thr Ala Met Lys Gln
225                 230                 235                 240
gca gtc gac aat gca tat gca aga ggg gtt gtc gtt gta gct gca gca    768
Ala Val Asp Asn Ala Tyr Ala Arg Gly Val Val Val Val Ala Ala Ala
                245                 250                 255
ggg aac agc gga tct tca gga aac acg aat aca att ggc tat cct gcg    816
Gly Asn Ser Gly Ser Ser Gly Asn Thr Asn Thr Ile Gly Tyr Pro Ala
            260                 265                 270
aaa tac gat cct gtc atc gct gtt ggt gcg gta gac tct aac agc aac    864
Lys Tyr Asp Pro Val Ile Ala Val Gly Ala Val Asp Ser Asn Ser Asn
        275                 280                 285
aga gct tca ttt tcc agt gtg gga gca gag ctt gaa gtc atg gct cct    912
Arg Ala Ser Phe Ser Ser Val Gly Ala Glu Leu Glu Val Met Ala Pro
    290                 295                 300
ggc gca ggc gta tac agc act tac cca acg aat act tat gca aca ttg    960
Gly Ala Gly Val Tyr Ser Thr Tyr Pro Thr Asn Thr Tyr Ala Thr Leu
305                 310                 315                 320
aac gga acg tca atg gct tct cct cat gta gcg gga gca gca gcc ttg    1008
Asn Gly Thr Ser Met Ala Ser Pro His Val Ala Gly Ala Ala Ala Leu
                325                 330                 335
atc ttg tca aaa cat ccg aac ctt tca gct tca caa gtc cgc aac cgt    1056
Ile Leu Ser Lys His Pro Asn Leu Ser Ala Ser Gln Val Arg Asn Arg
            340                 345                 350
ctc tcc agc acg gcg act tat ttg gga agc tcc ttc tac tat ggg aaa    1104
Leu Ser Ser Thr Ala Thr Tyr Leu Gly Ser Ser Phe Tyr Tyr Gly Lys
        355                 360                 365
agg tct gat caa tgt tta agg atc cgc                                1131
Arg Ser Asp Gln Cys Leu Arg Ile Arg
    370                 375
<210>2
<211>377
<212>PRT
<213>地衣芽孢杆菌(Bacillus Licheniformis)
<400>2
Met Arg Lys Lys Ser Ser Trp Leu Gly Met Leu Thr Ala Phe Met Leu
1               5                   10                  15
Val Phe Thr Thr Ala Phe Ser Asp Ser Ala Ser Ala Ala Gln Pro Ala
            20                  25                  30
Lys Asn Val Glu Lys Asp Tyr Ile Val Gly Phe Lys Ser Gly Val Lys
        35                  40                  45
Thr Ala Ser Val Lys Lys Asp Ile Ile Lys Glu Ser Gly Gly Lys Val
    50                  55                  60
Asp Lys Gln Phe Arg Ile Ile Asn Ala Ala Lys Ala Lys Leu Asp Lys
65                  70                  75                  80
Glu Ala Leu Lys Glu Val Lys Asn Asp Pro Asp Val Ala Tyr Val Glu
                85                  90                  95
Glu Asp His Val Ala His Ala Ser Ala Gln Thr Val Pro Tyr Gly Ile
            100                 105                 110
Pro Leu Ile Lys Ala Asp Lys Ala His Ala Gln Arg Phe Lys Gly Ala
        115                 120                 125
Asn Val Lys Val Ala Val Leu Asp Thr Gly Ile Gln Ala Ser His Pro
    130                 135                 140
Asp Leu Asn Val Val Gly Gly Ala Ser Phe Val Ala Gly Glu Ala Tyr
145                 150                 155                 160
Asn Thr Asp Gly Asn Arg His Gly Thr His Val Ala Cys Thr Val Ala
                165                 170                 175
Ala Leu Asp Asn Thr Thr Gly Val Ile Arg Val Ala Pro Ser Val Ser
            180                 185                 190
Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Asn Ser Ser Gly Ser Gly Ser Tyr Ser
        195                 200                 205
Gly Ile Val Ser Gly Ile Glu Trp Ala Thr Thr Asn Gly Met Asp Val
    210                 215                 220
Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly Ala Ser Gly Ser Thr Ala Met Lys Gln
225                 230                 235                 240
Ala Val Asp Asn Ala Tyr Ala Arg Gly Val Val Val Val Ala Ala Ala
                245                 250                 255
Gly Asn Ser Gly Ser Ser Gly Asn Thr Asn Thr Ile Gly Tyr Pro Ala
            260                 265                 270
Lys Tyr Asp Pro Val Ile Ala Val Gly Ala Val Asp Ser Asn Ser Asn
        275                 280                 285
Arg Ala Ser Phe Ser Ser Val Gly Ala Glu Leu Glu Val Met Ala Pro
    290                 295                 300
Gly Ala Gly Val Tyr Ser Thr Tyr Pro Thr Asn Thr Tyr Ala Thr Leu
305                 310                 315                 320
Asn Gly Thr Ser Met Ala Ser Pro His Val Ala Gly Ala Ala Ala Leu
                325                 330                 335
Ile Leu Ser Lys His Pro Asn Leu Ser Ala Ser Gln Val Arg Asn Arg
            340                 345                 350
Leu Ser Ser Thr Ala Thr Tyr Leu Gly Ser Ser Phe Tyr Tyr Gly Lys
        355                 360                 365
Arg Ser Asp Gln Cys Leu Arg Ile Arg
    370                 375

Claims (10)

1、一种蛋白酶，该蛋白酶包含SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；
2、一种编码SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的核苷酸序列；
3、如权利要求2所述的核苷酸序列，该序列如SEQ ID NO：1所示；
4、如权利要求2所述核苷酸序列的突变体或变异体；
5、一种表达载体，其含有如权利要求2至4任一项所述的核苷酸序列、组成型启动子或调节性启动子、作为选择性标记的抗性基因和转录终止子；
6、如权利要求5所述的表达载体，其为重组分泌型表达载体；
7、如权利要求5所述的表达载体，其含有T7启动子以及具有6个组氨酸的标记结构；
8、一种制备权利要求1所述的蛋白酶的方法，该方法包括以下步骤，
(1)、将地衣芽孢杆菌(Bacillus Licheniformis CGMCC NO0800)高温中性蛋白酶发酵生产的发酵液经10000rpm离心处理去除菌体，收集上清液；
(2)、利用20％-30％饱和度的硫酸铵除去大量的杂蛋白，经过10000rpm离心处理，收集上清液；
(3)、将上清液在-10℃--25℃下使用乙醇可有效的将发酵液中的蛋白酶沉淀，进一步加大乙醇的用量，可使酶蛋白析出体积比大于1∶1；
(4)、上样浓度控制在0.5-2.5mg/ml，上样数量控制在8ul-32ul；
(5)、将沉淀通过SepHadex G100凝胶过滤；
9、一种制备如权利要求2所述的核苷酸序列的方法，其特征在于，根据SEQ IDNO：2所示氨基酸序列设计上、下游引物，该上、下游引物的跨度为1.2Kb并在其中均引入了BamH I酶切位点；利用所述上、下游引物将从地衣芽孢杆菌(Bacillus Licheniformis CGMCC NO0800)纯化的基因组DNA作为模板进行PCR扩增；
10、如权利要求9所述的克隆的方法，其特征在于，
(1)、上游引物为Gp1P1＞AGGGATCCGACAAACGGGCGATGCTA＜3(引入BamHI酶切位点)；
(2)、下游引物为Gp1P2＞CAGGATCCTACACTCCAACCGCATTT＜3(引入BamHI酶切位点)。
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