CN1543508A - 测试系统及其用于鉴定和表征化合物的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及基于来自蠕虫和节肢动物的跨膜受体的测试系统，以及将该系统用于鉴定和表征能有效抗蠕虫、节肢动物的物质或对生物和/或细胞的钙代谢有作用的物质的用途。本发明还涉及特异性配体在所述测试系统中的用途，并且涉及将其用作驱蠕虫或驱节肢动物活性物质的用途。

Description

测试系统及其用于鉴定和表征化合物的用途
本发明涉及基于来自蠕虫和节肢动物的跨膜受体的测试系统，并且涉及将该系统用于鉴定和表征对蠕虫、节肢动物的起作用的物质或对生物和/或细胞的钙平衡起作用的物质的用途。本发明还涉及特异性配体在所述测试系统中的用途，并且涉及将该配体用作驱蠕虫或驱节肢动物活性物质的用途。
寄生性蠕虫和节肢动物对人类和动物健康具有相当大的威胁。仅在农业领域，在世界范围内每年用于控制或预防由所述寄生虫导致的破坏的费用就超过七十亿德国马克(1997年的数字)。有来自多种类型的活性物质的大量的活性物质可用于治疗主要由蠕虫引起的体内寄生虫病和主要由节肢动物引起的体外寄生虫病。在过去20年中，特别是同时对一个门(例如蠕虫)内的多种寄生虫具有良好作用，甚至对不同的动物门(例如蠕虫和昆虫)具有良好作用的活性物质的重要性一直在增强。前者特别包括广谱性驱蠕虫剂，如苯并咪唑和咪唑并噻唑，而后者包括大环内酯。
具有广谱活性的新型活性物质最近一次上市是在大约20年前，这种活性物质是大环内酯。不过，大量的体内寄生虫和体外寄生虫已经对单一类型的活性物质产生了抗性，并且，在某些情况下能同时对多种活性物质产生抗性。因此，一直存在着日益增强的对开发具有抗寄生虫活性的新型物质的迫切需要。
目前正在研究的少量几种有希望的新型活性物质包括环状缩酚肽类，它是多项专利(WO 93/19053，EP-OS 626 376，WO 94/19334，WO 95/07272，EP-OS 626 375，EP-OS 657 171，EP-OS 657 172，EP-OS 657 173)和研究活动(Conder et al.1995；Martin et al.1996；Sasaki et al.1992；Terada M.1992；Samson-Himmelstjerna et al.2000)的主题。
业已披露了为了揭示典型的此类活性物质PF1022A(环(-D-Lac-L-MeLeu-D-PhLac-L-MeLeu-)2)的作用机制的多项研究(参见DE-A-197 04 024中有关这一方面的内容)。其中包括鉴定和表征一种用于环状缩酚肽类的特异性结合蛋白，以及来自绵羊寄生虫捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)的编码这种蛋白的DNA序列(DE-A-197 04024)。在本发明范围内，披露了被称为HC110-R的上述蛋白特别是与作为环状缩酚肽类的另一种典型的配体BAY44-4400(环(-D-Lac-L-MeLeu-D-p-吗啉基-PhLac-L-MeLeu-)的功能性相互作用。为此，业已构建了重组真核细胞系，在该细胞系中，表达了基于先期申请DE-A-197 04 024中披露的SEQ ID NO：2的HC110-R。
因此，本发明特别基于以下目的，根据来自蠕虫和节肢动物，优选来自线虫和螨虫，特别优选来自毛圆线虫科，十分特别优选来自血矛线虫的跨膜受体，特别是根据来自捻转血矛线虫的受体HC110-R提供对测试化合物具有高的处理能力的测试系统(高处理能力筛选测定；HTS-测定)。
同源蛋白被认为是这样的蛋白：它与文献DE-A-197 04 024(该文献的内容被专门收入本申请)中的SEQ ID NO：2所示序列在至少20，优选至少25，特别优选至少30个连续的氨基酸，并且非常特别优选在其整个长度具有至少70％的相同性，优选80％的相同性，特别优选90％的相同性，非常特别优选95％的相同性。
氨基酸序列的相同性程度优选是借助于GCG程序包，9.1版的GAP程序测定的，采用标准设置(Devereux等1984)。
以上目的是通过提供能产生GPCR受体的至少一种生物学活性的多肽，以及通过提供用于获得所述多肽的方法，和通过提供用于鉴定具有杀线虫和杀节肢动物活性的化合物而实现的。
基于重组微生物的测试系统业已被多次用于鉴定药用活性物质，特别是使用能重组表达寄生物基因的微生物(Klein和Geary 1997)。不过，到目前为止，还没有披露过其中的寄生物跨膜受体作为重组功能性蛋白被用于在真核细胞中作为靶的系统。本发明所披露的测试系统可用于在高处理量筛选(HTS)或超级-HTS中鉴定这种新型受体的新的激动剂或拮抗剂。
来自线虫的受体的重组表达通常被证明是困难的。因此，迄今为止通常还不能以以下方式表达来自线虫的G-蛋白-结合的受体(GPCR)：其功能特性(例如对抑制剂的敏感性)相当于天然受体的功能特性。
来自蠕虫，特别是来自线虫和来自节肢动物的受体在真核系统中的功能性表达具有很大的实际意义，例如用于筛选新型驱蠕虫剂或杀节肢动物剂。
因此，本发明还基于以下目的：提供一种表达来自线虫和节肢动物的跨膜受体，特别是GPC受体的可行方法，并且基于此开发一种测试系统，该系统可以鉴定具有杀线虫和杀节肢动物活性的新型物质。
因此，本发明特别涉及来自蠕虫和节肢动物，优选来自线虫和螨虫，特别优选来自毛圆线虫科，非常特别优选来自血矛线虫属，最优选来自寄生性线虫——捻转血矛线虫的孤独G-蛋白-结合的受体的表达，以及将其用作有效筛选杀线虫活性物质的靶蛋白的用途。
业已在从胃肠道线虫——捻转血矛线虫获得的cDNA库中鉴定了这种受体。这种cDNA编码大小为110kDa的7螺旋跨膜蛋白，这种蛋白被称为HC110-R。这种蛋白属于G-蛋白-结合的受体(GPCR)的胰泌素家族，并且与Latrophilin具有很大相似性(图5)。
作为靶的HC110-R受体
GPCR Latrophilin最初是从哺乳动物大脑中分离的。Latrophilin的分子量为210kDa，并且在第一个跨膜片段上游的18号残基上发生翻译后裂解，因此包括2个非共价连接的亚单元。p120亚单元包括N-末端亲水性胞外部分，而p85亚单元包括7个跨膜结构域，和Latrophilins的细胞内C-末端区，对于GPCRs来说它是异常大的。最近，业已鉴定了两种密切相关的同系物Latrophilin-2和Latrophilin-3(还可参见图6)。与Latrophilin-1类似，后者优先在大脑中表达，而Latrophilin-2是普遍表达的，并且倾向于在哺乳动物的胎盘、肾、脾、卵巢、心脏和肺中表达(Ichtchenko等1999；Sugita等1998)。
尽管HC110-R仅有210kDa的Latrophilin大小的一半，序列的相似性还延伸到功能的相似性。对这两种受体的内源配体尚不了解，不过，Latrophilin和HC110-R都受人工配体α-LTX(α-娄蛛毒素(Latrotoxin))的影响。
例如，如果HEK-293细胞是用Latrophilin瞬时转染的话，添加α-LTX会导致外部Ca2+的流入，通过采用放射性45Ca2+的实验设计，可以证实这一点。α-LTX还能在用HC110-R瞬时转染过的HEK-293细胞中导致这种Ca2+的流入，例如，可以通过Ca2+成像进行观察(还可参见图10和11)。
不过，Ca2+的流入是非常复杂的。如果HC110-R是具有C-末端绿色荧光蛋白(GFP)结合的结构形式的话，它是双相的，即在大约3分钟之后出现一种变化，并且在大约22分钟之后出现另一种变化。不过，如果仅将N-末端Myc-His标记插入HC110-R的话，主要流入只会在添加α-LTX之后大约2-3分钟出现。出现这种现象的原因尚不清楚，不过对添加α-LTX的反应是专一性的，正如通过以下说明所证实的：
1.在未转染过的细胞中，以及在用小鼠β2-肾上腺素能受体瞬时转染过的细胞中观察不到Ca2+流入。
2.[Ca2+]i的改变取决于α-LTX剂量(图10)。
3.双相改变需要Ca2+流入，Ca2+流入是通过Ca2+通道进行的，该通道会受到Cd2+的阻断，特别是对L-型通道的阻断，通过其对硝苯地平的敏感性可以证实这一点。
α-LTX与HC110-R的相互作用以及信号传导的确切机制尚有待解释。还可以以Latrophilin-1为例，证实对于由α-LTX导致的进入HEK-293细胞的Ca2+流入来说，只有一个跨膜结构域是必需的(Kraspernov等1999)。
硝苯地平能在本文所披露的系统中抑制α-LTX的作用这一事实表明，该系统还适用于鉴定新的特异性Ca2+通道抑制剂。硝苯地平属于一种类型的Ca2+通道激动剂和拮抗剂，它们是按照其与Ca2+通道的特定位点的结合进行分类的，例如，根据其与L型通道的结合进行分类。三种主要类型的Ca2+通道抑制剂((L-型)包括苄基乙腈类(例如维拉帕米，WO 91/02497)，Benzothiazepinones(例如地尔硫卓)和1，4-二氢吡啶衍生物，如硝苯地平、尼瓦地平、尼莫地平、尼卡地平、伊拉地平、氨氯地平、尼群地平、非洛地平或尼索地平(Bacon等1989；WO 90/09792)。另一种类型的Ca2+通道抑制剂是1，3-二膦酸盐，例如Belfosodil。
因此，本发明还涉及将结合α-LTX的跨膜受体用于鉴定新的Ca2+通道抑制剂的用途。特别优选将7螺旋跨膜受体用于这一目的，特别优选的是它们是G-蛋白结合受体。非常特别优选的是使用胰泌素家族的跨膜受体，最优选使用SEQ ID NO：2所示的HC110-R受体，以及与它的同源性为70％，优选80％，特别优选90％，非常特别优选95％的受体蛋白。
现有资料还证实，HC110-R是新型驱虫剂缩酚肽BAY44-4400的靶。BAY44-4400能在用HC110-R转染过的HEK-293中干扰α-LTX引起的信号传递(图12)。这种干扰可能源于BAY44-4400的离子载体活性，诸如白僵菌素(Beauvericin)、恩镰孢菌素(Enniatin)等的其他缩酚肽类都是这样(Gessner等1996)。不过，BAY44-4400不会导致未转染过的细胞发生变化。另外，BAY44-4400不会影响由异丙肾上腺素诱导的通过用小鼠β2-肾上腺素能受体转染过的HEK-293细胞的信号传递。另外，BAY44-4400起着α-LTX拮抗剂的作用，而BAY44-4400本身不会影响HC110-R转染过的HEK-293细胞的Ca2+浓度。
HC110-R-蛋白
披露于DE 197 04 024 A1中的膜蛋白被确定为驱蠕虫活性物质PF1022A的可能的靶蛋白。可能的靶蛋白是通过以下方法鉴定的：制备寄生线虫捻转血矛线虫的λZAPII cDNA表达文库，并且用PF1022A和KLH(匙孔*戚血蓝蛋白)的缀合物PF1022A-KLH和抗这种缀合物的多克隆抗体筛选该cDNA文库(参见例1)。检查大约1.5×106非扩增重组克隆，发现了一种长度为3036bp的cDNA克隆，它能与来自捻转血矛线虫的3.6kb的mRNA杂交(还可参见实施例2)。利用RACE-PCR技术，补平3′-和5′末端(实施例4)。最后，获得了长度为3539bp的cDNA，并且称之为HC110-R。这种cDNA编码986个氨基酸(110kDa)，其开放读框始于ATG100(图2)。在起始密码子两侧是Kozak序列，用于优化翻译的起始。通过体外翻译在体内转录的HC110-R RNA，证实所产生的蛋白的分子量。
HC110-R蛋白的氨基酸序列表现出某些特殊的特征。该蛋白的细胞外N-末端部分一共包括535个残基。N-末端包括一个长度为21个氨基酸的信号肽和一个位于18号位置的裂解位点。该位点之后是一个凝集素样序列(AA 22-125)和所谓的″Thr-片段″(AA 128-147)，该片段仅在144号位置上被丝氨酸打断。″Thr-片段″下游存在一个富含半胱氨酸的基序，其结构为CX9WX12CX9WXCX5WX9CX3W(AA 166-221)。另外，HC110-R蛋白包括位于536和772号残基之间的7个疏水性α螺旋跨膜结构域。在仅靠所述跨膜区的上游存在另外4个Cys-区，其结构为CXWWX6WX4CX4CX11CXC(AA 478-524)。在该跨膜区中，存在三个包括587-597，654-673和743-749残基的三个胞外环，和三个胞内环(559-569，627-636，696-724号位置)。C-末端的长度为214个残基(24kDa)，并且包括一个富脯氨酸部分(AA 845-861)和PEST-区(AA 915-933)。最后，还存在位于26、499和862残基上的三个推测的N-糖基化位点，和位于衍生的细胞内结构域中的14个推测的磷酸化位点(还可参见图6)。
对数据库进行分析发现了HC110-R-蛋白与源于线虫克氏病(Caenorhabditis elegans)的基因组克隆B0457(GenBankTM保藏号Z54306)的未知跨膜蛋白(1014AA)有48％的相同性和76％的相似性(还可参见图3)。
本文所使用的术语“相同性”表示在所谓的比对中相同的序列位点的数量。相同性以比对长度的百分比表示。
本文所使用的术语“相似性”表示基于相似性测定的序列相似性，就是说，举例来说，测定将缬氨酸假设为苏氨酸或亮氨酸具有多大的相似性。
本文所使用的术语“同源性”表示进化关系，就是说，如果两种同源蛋白是否是由共同的前体序列产生的。该术语不一定与相同性或相似性有任何关系，不过，实际情况是同源序列通常更为相似，或者在比对中比非同源序列具有更多相同的位点。
比较两种序列，发现了两种蛋白所共有的特征，例如，凝集素样序列“Thr-片段”、Cys-基序和PEST-序列。最大的相同性存在于跨膜区(62％)，而存在于N-末端(44％)和C-末端(50％)区相同性不太突出。
另外，HC110-R蛋白与7螺旋G-蛋白结合的跨膜受体(GPCR)，特别是与胰泌素亚科具有20-30％的相同性。比较7个跨膜结构域，发现了胰泌素亚科的各种GPCR和HC110-R之间的结构和序列高度的相同性和相似性(图4)。
来自诸如人(Gen BankTM保藏号E1360690)、牛(例如G416021，G416053和G4185804)和大鼠(U78105和U72487)的哺乳动物的Latrophilin(胰泌素亚科的一个成员)与其他胰泌素受体相比，表现出与HC110-R具有更高的相同性(31％)。特别是，所述跨膜区表现出45-48％的相同性。HC110-R和具有1466个氨基酸的大鼠Latrophilin-1 GPCR(U78105)具有共同的特征，例如，凝聚素结构域，所述半胱氨酸区和位于所述跨膜区前面的保守的4-Cys-基序。后者最近被认为是Latrophilins和其他大型胰泌素GPCRs的蛋白裂解位点。相反，HC110-R的N-末端不包括Latrophilin的Olfactomedin-区和Pro/Thr-区，而反过来Latrophilin又不具有HC110-R的″Thr-片段″。
因此，本发明还涉及用来自蠕虫的具有7个跨膜结构域的G-蛋白结合的跨膜受体鉴定具有驱蠕虫活性的物质。根据本发明，优选使用被认定为胰泌素亚科的受体。
细胞定位
用HC110-R-GFP-融合蛋白在诸如COS-7-细胞或HEK-293-细胞的各种哺乳动物细胞系中进行瞬时转染实验(图7)。之所以选择异源表达，是因为至今尚未建立捻转血矛线虫细胞系。
源于太平洋水母(Aequorea victoria)的绿色荧光蛋白(GFP)可用于在生活细胞中定位蛋白(参见图8)。GFP在细胞水平上被用作体内报导物，用于指示瞬时或稳定转染的频率，并且用于在亚细胞水平上定位蛋白。野生型GFP是由238个氨基酸组成的分子量为27kD的单体，它在受到紫外光(360-400nm；最大为395nm)或蓝色光(440-480nm；最大为475nm)激发之后，能发射最大波长为509nm的绿色光线，而不需要外源基质或辅助因子(Chalfie等1994)。因此，可以通过荧光显微技术在体内直接检测GFP，即使将它作为一种融合蛋白的部分时，它的荧光特征也基本上不变。EGFP(″强″GFP)是野生型GFP的遗传学变体，并且被用于转染哺乳动物细胞(Yang等1996)。通过用Thr取代Ser65，将EGFP的最大激发波长偏移到490nm的唯一一个高峰。载体pEGFP-C1(GenBank保藏号U55763)和pEGFP-N3(GenBank保藏号U55762)[Clontech，Palo Alto，CA，U.S.A.]能在强组成型CMV-启动子的控制之下表达EGFP，并且，可用于将其他蛋白融合在EGFP的N或C末端。
与瞬时表达相比，稳定细胞系的优势在于每一个细胞能永久性表达需要的蛋白，并且能在定位之后分离所述蛋白。为了通过荧光显微术或借助于Western印迹检测所述蛋白，需要抗所述需要的蛋白的抗体，或者适当选择一种表达载体，例如，这种载体将Myc或His标记以正确读框融合在实际蛋白的C-末端，可以购买抗这种蛋白的抗体，在大多数情况下，甚至是单克隆抗体。
本发明同样涉及能够稳定表达HC110-R受体及其同源蛋白的细胞。
α-娄蛛毒素对HC110-R蛋白的影响
为了进一步证实HC110-R和Latrophilin之间的相似性，并检查重组表达的HC110-R的功能，用HC110-R-GFP-融合蛋白对HEK-293-细胞进行瞬时和稳定转染，并且用α-娄蛛毒素(α-LTR)进行刺激。
α-娄蛛毒素是一种突触神经毒素，这种毒素可以从黑寡妇(Latrodectus mactans)毒液中分离。已知它对脊椎动物的中枢神经系统有毒性，其中，它能通过增加[Ca2+]i并刺激神经递质不受控制的胞吐作用，诱导神经元的去极化。因此，业已披露，α-娄蛛毒素的作用至少部分是由Latrophilin介导的。对此，推测α-娄蛛毒素的毒性源于它与和GTP结合蛋白(GPCR)结合的受体相互作用的能力。通常，所述受体能介导内源激素或神经肽的作用(Holz和Habener1998)。
在本发明中，将所谓的“Ca2+成像技术”用于测试转染过的HEK-293细胞对α-LTX的反应，包括测定出现在所述细胞中的Ca2+的[Ca2+]i改变(参见实施例24和图9，10和11)。
α-LTX能导致[Ca2+]i的双相提高。在75nM的浓度下，α-LTX能在添加α-LTX之后2分钟，首先诱导仅有5±0.2nM Ca2+的很小的提高，随后在22分钟之后，Ca2+提高大约220±14.9nM。随着α-LTX浓度的提高(7.5nM-120nM)，所述首次提高变大，而第二次提高变小。当α-LTX的浓度为120nM时，第一次提高达到大约135±13.6nM Ca2+的值，而第二次提高降低到50±7.1nM Ca2+的值。在使用90nM和120nMα-LTX时获得的相同曲线，表明已经达到饱和。
用N-末端GFP标记的HC110-R结构转染HEK-293细胞，并且用75nMα-LTX对其进行刺激，导致略微减弱的第二个高峰。最后，当HC110-R蛋白具有N-末端GFP标记时，也发现了仅仅略微减弱的对α-LTX的反应。因此可以认为，结合在N-或C-末端的GFP标记对于α-LTX结合，和随后由HC110-R进行的信号传导具有微不足道的影响。
没有转染过的细胞或者仅仅用GFP瞬时转染过的细胞没有表现出对α-LTX的反应。如果用具有C-末端GFP标记的其他G-蛋白结合的受体，例如，小鼠β2-肾上腺素能受体或人毒蝇碱能H1乙酰胆碱受体瞬时转染HEK-293细胞的话，由浓度为75nM的α-LTX导致的[Ca2+]i的增加仅仅是少量的(在大约20分钟之后为大约40±10.2nM)或为0。
由α-LTX导致的[Ca2+]i的提高能够导致胞外Ca2+流入和胞内Ca2+流出。如果在添加α-LTX之前或之后用2mM EGTA除去胞外Ca2+的话，表达HC110-R-GFP融合蛋白的HEK-293细胞的[Ca2+]i只有少量的增加。由此可以看出，α-LTX主要是导致胞外Ca2+的流入。这种Ca2+的流入不是基于简单的扩散，而是借助于细胞质膜中的Ca2+通道完成的。
与Ca2+流入相关的大多数Ca2+通道是L型的，因为15μM的硝苯地平就足以明显抑制α-LTX诱导的[Ca2+]i的提高。另外，第一次提高完全被抑制，而第二次提高从267±12.7nM降低到30±5.4nM。
表达具有C-末端Myc/His-标记的HC110-R受体的稳定的或瞬时的HEK-293细胞系，也以剂量依赖性的方式对α-LTX作出反应(图10)。在这种情况下，7.5nM的α-LTX仍然太少，以至于不能产生α-LTX诱导的Ca2+流入，但是25nMα-LTX已足以仅仅在2分钟之后就导致[Ca2+]i提到130±38.0nM。在添加75nMα-LTX时，Ca2+的流入为296±91.5nM，它同样在添加α-LTX 2分钟之后有很大的提高，并且仅仅在27分钟之后就恢复到其原有的Ca2+含量。这种Ca2+信号在信号的高度及其进程中，类似于在相同的α-LTX浓度(75nM)下HC110-R-GFP转染的HEK-293细胞的第二个推迟的Ca2+高峰，不过，反应是在添加α-LTX之后马上出现的，较高浓度(90nM和120nM)HC110-R-GFP转染的细胞也是这样。
因此，本发明同样涉及将α-LTX用作来自线虫的胰泌素家族的跨末受体的激动剂。优选将α-LTX用作SEQ ID NO.2所示HC110-R受体的激动剂，并且用作与该受体具有70％，优选80％，特别优选90％，非常特别优选95％同源性的受体蛋白的激动剂。
本发明还涉及将α-LTX用作杀线虫剂的应用。
本发明还涉及将α-LTX用于鉴定具有杀线虫或杀节肢动物活性的化合物的方法中的应用，所述化合物可能具有跨膜受体的激动剂或拮抗剂活性。
本发明还涉及将α-LTX用于鉴定能抑制Ca2+通道的化合物的方法中的应用。
BAY44-4400对α-LTX作用的影响
根据具体物种，PF1022A能在100-800ng/ml的浓度下对线虫产生作用(Terada，1992)。为了研究在每一种情况下PF1022A与HC110-R之间的可能的相互作用和由HC110-R介导的信号传递，将BAY44-4400(它是PF1022A的一种易溶的衍生物)用于下面的用负载FURA-2的并且用HC110-R-GFP转染过的HEK-293细胞进行的Ca2+成像实验。
在400ng/ml的浓度下，非常有效的杀线虫剂BAY44-4400和实际上没有效果的对映体PF1022-001，都不能在HC110-R-GFP转染过的HEK-293细胞中诱导Ca2+反应，即使这种细胞用所述活性物质预培养了90分钟也是如此。与此相反，这两种物质都能影响取决于α-LTX的信号传递，不过它们的影响强度不同(图12和14)。在存在4ng/mlBAY44-4400的情况下，α-LTX在14分钟之后只能诱导少量的Ca2+增加，最大增加量为44±6.0nM Ca2+(图12)。不过，在存在PF1022-001的情况下，α-LTX能在6分钟之后导致103±11.5nM的Ca2+的较大的提高(图10B)。在另一种方法中，用4ng/ml或400ng/mlBAY44-4400和PF1022A预培养所述细胞90分钟，并且在用α-LTX刺激所述细胞之前除去所述活性物质。用PF1022A预培养的HEK-293细胞，在对α-LTX的反应方面没有出现明显改变。只有BAY44-4400能影响所述细胞对α-LTX的敏感性。在4ng/ml的BAY44-4400浓度下，α-LTX能在达到稳定的Ca2+含量之前19分钟诱导Ca2+增加(95±20.5nM Ca2+)。在400ng/ml BAY44-4400的浓度下，α-LTX只能导致Ca2+浓度提高到大约65±7.5nM Ca2+。另外，这种小的提高偏移了12分钟。
为了证实以上结果的专一性，还在未转染过的HEK-293细胞中测定了1mM卡巴胆碱对内源天然M1-R的影响。400ng/ml BAY44-4400的存在没有改变所述细胞的反应。在HEK-293细胞中由异丙肾上腺素和槟榔碱诱导的内源天然β2-R或烟碱性胆碱能受体的刺激不会受BAY44-4400的任何影响。
最后，在本发明的范围内，通过Ca2+成像研究了PF1022A的一种溶解性更高的变体BAY44-4400在HEK-293细胞中对HC110-R蛋白的影响，所述细胞能瞬时或稳定表达具有C-末端GFP的HC110-R蛋白。在仅用400ng/ml BAY44-4400培养HEK-293细胞时，在50分钟内，所述细胞以与胞内Ca2+浓度改变不可比的方式作出反应。不过，在存在α-LTX的情况下可以发现BAY44-4400的作用。在添加75nMα-LTX之前，用BAY44-4400培养细胞6分钟能够减弱α-LTX对Ca2+浓度的影响。[Ca2+]i的第一次小的增加消失，而第二次增加在α-LTX加入后15分钟减少85％。如果在用FURA处理所述细胞30分钟之前，用BAY44-4400预培养所述细胞60分钟的话，它对α-LTX的反应会更强。在添加75nMα-LTX 30分钟之后，Ca2+的第一次增加会完全消失，并且只有70nM[Ca2+]i的非常小的第二次增加。
为了证实BAY44-4400对α-LTX作用的专一性影响，进行了两种对照实验。首先，用具有C-末端GFP标记的小鼠β2-肾上腺素能受体瞬时或稳定转染HEK-293细胞，并且，用异丙肾上腺素作配体。
实际上，异丙肾上腺素也能导致明显的Ca2+反应。在添加异丙肾上腺素之后不久，只有一次Ca2+的增加。不过，这种增加不受BAY44-4400的影响。
另外，通过代替BAY44-4400用光学对映体作为配体，证实了BAY44-4400和HC110-R之间相互作用的专一性。在用400ng/ml的驱蠕虫活性减弱了100倍的PF1022A衍生物PF1022-001：环(-L-Lac-D-MeLeu-L-PhLac-D-Me-Leu-)2(又被称为光学对映体)预培养所述细胞90分钟之后，在添加75nM α-LTX 6分钟之后，Ca2+浓度只有110nM的增加，就是说增加量降低了59％。如果在添加75nMα-LTX之前6分钟添加4ng/ml所述光学对映体的话，在添加α-LTX之后，[Ca2+]i会马上增加67nM[Ca2+]i。如果所述光学对映体浓度提高，所述增加量会降低到20nM Ca2+。
本文所使用的术语“多肽”表示通常被称为肽、寡聚肽或寡聚体的短的氨基酸链，和通常被称为蛋白的较长的氨基酸链。它包括可以通过天然加工，如翻译后加工或通过化学方法修饰的氨基酸链，这是现有技术。所述修饰可以在不同位点上进行，并可以在一个多肽上进行多次。例如，在肽主链上，在氨基酸侧链上，在氨基末端或羧基末端进行。所述修饰包括乙酰化，酰化，ADP核糖基化，酰胺化，与黄素、血红素部分、核苷酸或核苷酸衍生物、脂类或脂类衍生物或磷脂酰肌醇的共价连接，环化，形成二硫键，去甲基化，形成胱氨酸，甲酰化，γ-羧基化，糖基化，羟基化，碘化，甲基化，肉豆蔻酰化，氧化，蛋白酶解加工，磷酸化，硒酸化和由tRNA介导的氨基酸的添加。
根据本发明，所述多肽能够以“成熟的”蛋白形式或作为较大蛋白，如融合蛋白的一部分使用。它们还可以具有分泌-或“前导”序列，原序列，能使得它便于纯化的序列，如多个组氨酸残基，或额外的稳定氨基酸。
同源蛋白或多肽被认为是与DE-A-197 04 024(该专利的内容被专门收入本申请)中的SEQ ID NO：2所示序列在至少20，优选至少25，特别优选至少30个连续氨基酸的长度上，非常特别优选在其整个长度上具有至少70％相同性，优选80％相同性，特别优选90％相同性，非常特别优选95％相同性的蛋白或多肽。
根据本发明，所使用的所述多肽不一定是完整的受体，而且还可以只是它的片段，只要该片段仍然至少具有完整受体的生物学活性就行。对此，所述多肽也不一定来自捻转血矛线虫的跨膜受体。相当于蠕虫的其他物种甚至是节肢动物的跨膜受体的多肽或其仍然能发挥所述受体的生物学活性的片段，也被认为是本发明的多肽。
用于本发明的所述多肽与天然存在的GPC受体的相应部分相比可能具有缺失或氨基酸取代，只要它们仍然至少具有所述完整受体的生物学活性就行，优选保守性取代。所述保守性取代包括来自下列一组的一种氨基酸被另一种氨基酸所取代的变化：
1.小的脂族非极性或弱极性残基：Ala，Ser，Thr，Pro和Gly；
2.极性，带负电荷的残基及其酰胺：Asp，Asn，Glu和Gln；
3.极性带正电荷的残基：His，Arg和Lys；
4.大的脂族非极性残基：Met，Leu，Ile，Val和Cys；和
5.芳族残基：Phe，Tyr和Trp。
下表表示优选的保守性取代：
 原始残基  取代
 Ala  Gly，Ser
 Arg  Lys
 Asn  Gln，His
 Asp  Glu
 Cys  Ser
 Gln  Asn
 Glu  Asp
 Gly  Ala，Pro
 His  Asn，Gln
 Ile  Leu，Val
 Leu  Ile，Val
 Lys  Arg，Gln，Glu
 Met  Leu，Tyr，Ile
 Phe  Met，Leu，Tyr
 Ser  Thr
 Thr  Ser
 Trp  Tyr
 Tyr  Trp，Phe
 Val  Ile，Leu
另外，可以将上述序列以及在DE-A-197 04 024中的序列SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.3用于发现编码与蠕虫或节肢动物中功能上类似的跨膜受体的结构相关的多肽的基因。功能上相似的受体表示本发明的受体，所述受体包括这样的多肽，尽管它们在氨基酸序列上与本文所披露的多肽不同，但是具有基本上相同的生物学功能。
本文所使用的术语“基本上相同的生物学功能”表示与能够发挥特别是诸如胰泌素亚科受体的作用或相当于源于捻转血矛线虫的HC110-R受体的作用的G-蛋白-结合7螺旋跨膜受体结构相关的功能。所述功能还包括上文所披露的所述受体的特性，如对作为激动剂的α-LTX或作为α-LTX的拮抗剂的硝苯地平的敏感性。
本文所使用的术语“杂交”表示单链核酸分子与互补链发生碱基配对的过程。通过这种方法，根据本文所披露的序列信息，可以从除了捻转血矛线虫以外的其他线虫以及从节肢动物体内分离编码具有GPCP受体生物学活性的多肽的DNA片段。
就合适的探针而言，优选氨基末端和羧基末端cDNA部分。选择杂交条件，以便也能够从其他生物中检测相似性较低的序列。例如，具有较低严格性的杂交条件如下：杂交是在40-55℃下，在6×SSC/0％甲酰胺的杂交溶液中进行的。用于特定的第二个洗涤步骤的条件必须经过测试，例如，首先在50℃下用2×SSC洗涤，然后评估信号强度。然后改变洗涤条件。
例如，合适的杂交条件如下：
杂交溶液：6×SSC/0％甲酰胺，优选杂交溶液：6×SSC/25％甲酰胺
杂交温度：34℃，优选杂交温度42℃
第一个洗涤步骤：2×SSC，40℃，
第二个洗涤步骤：2×SSC，45℃；优选的第二个洗涤步骤：0.6×SSC，55℃；特别优选的第二个洗涤步骤：0.3×SSC，65℃
杂交条件大体上是按以下公式计算的：
解链温度Tm＝81.5℃+16.6 log[c(Na+)]+0.41(％G+C))-500/n(Lottspeich和Zorbas 1998)。
在该公式中，c是浓度，而n是以碱基对为单位的杂交序列的长度。对于＞100bp的序列来说，可以省略500/n这一项。最严格的洗涤是在低于Tm 5-15℃的温度下，用15mM Na+的离子强度(相当于0.1×SSC)进行的。如果将RNA探针用于杂交的话，解链温度高出10-15℃。
在本发明的方法中，被用于鉴定具有杀线虫和杀节肢动物活性的多肽是用披露于DE-A-197 04 024中的SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.3所示核酸编码的。
本发明还包括与SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.3所示序列至少20，优选至少100，特别优选至少500个连续核苷酸上，非常特别优选在其整个长度上具有至少70％相同性，优选80％相同性，特别优选90％相同性，非常特别优选95％相同性的核酸的用途。
本发明的核酸还可用于生产转基因无脊椎动物。所述转基因无脊椎动物可用于以本发明的受体或其的变体不同于野生型表达为基础的测试系统。还包括对其他基因或基因控制序列(例如启动子)的修饰导致本发明受体或其变体表达改变的所有转基因无脊椎动物。
例如，转基因无脊椎动物的生产，在果蝇(Drosophilamelanoaster)中是通过P-因子介导的基因转移进行的，或者在克氏病中是通过转座子介导的基因转移进行的(例如，通过Tc1，Plasterk 1996)。
因此，本发明涉及包括至少一种本发明的核酸的转基因无脊椎动物，优选果蝇或克氏病物种的转基因无脊椎动物，及其转基因后代。所述转基因无脊椎动物优选包括与本发明的野生型形式不同的受体。
本发明的核酸可以用常规方法生产。例如，可以完全化学合成所述核酸分子，还可以仅化学合成本发明序列的短的片段，并且用同位素或荧光染料对这种寡核苷酸进行标记。可以将标记过的寡核苷酸用于筛选由线虫mRNA或昆虫mRNA产生的cDNA文库。选择与所述标记过的寡核苷酸杂交过的克隆用于分离相关的DNA。在对所分离的DNA进行表征之后，用简单的方法获得本发明的核酸。
还可以使用化学合成的寡核苷酸通过PCR方法生产本发明的核酸。
本文所使用的术语“寡核苷酸”表示由10-50个核苷酸，优选15-30个核苷酸组成的DNA分子。例如，这种分子是化学合成的，并且可以用作探针。
可将本发明的核酸用于分离并表征天然存在的编码区附近的调控区。因此本发明还涉及所述调控区。
本发明的方法还包括载体的用途，这种载体包括用于本发明的核酸或用于本发明的DNA结构。可以使用的载体包括在分子生物学实验室中使用的所有的噬菌体、质粒、噬菌粒、噬粒、粘粒、YACs、BACs、人工染色体或适合粒子轰击的颗粒。
对于植物细胞来说，优选的载体是pBIN及其衍生物，对于酵母细胞来说，优选载体是pFL61。对于细菌细胞来说，优选的在载体是pBLUESCRIPT，对于噬菌体来说，优选的载体是λZAP(购自Stratagene)。
在本发明的范围内，业已使用了各种载体，并且生产了多种结构。本发明还涉及用于瞬时或稳定转化细胞系，以及用于稳定表达HC110-R受体的载体。
生产了会导致表达具有N-末端EGFP标记(EGFP-HC110-R)或C-末端EGFP标记(HC110-R-EGFP)的融合蛋白表达的EGFP结构，用于在真核细胞中进行瞬时表达。本发明还涉及由所述载体和常规GFP载体以及红移和蓝移变体编码的多肽。
本发明还涉及用于稳定表达的另一种结构-载体pMyc6xHis。载体pMyc6xHis是通过用限制酶NhiI和SfiI对载体pSecTagA[Invitrogen，Leek，NL]进行双重消化，然后补平末端，并重新连接该载体而产生的。
本发明还涉及包含用于本发明的核酸或用于本发明的载体的宿主细胞。本发明特别涉及具有HC110-R-Myc/His的稳定转化过的HEK-293细胞系，该细胞系业已交由国际保藏机构-德国微生物和细胞培养物保藏所DSMZ，GmbH(Mascheroder Weglb in 38124 Braunschweig)保藏，保藏号为DSM ACC2464。
本发明还涉及包含用于本发明的核酸或用于本发明的载体以及能够使细胞表达在存在Ca2+的条件下发射光线的水母发光蛋白-一种发光蛋白的载体的宿主细胞。相应的宿主细胞能够借助水母发光蛋白指示剂跟踪Ca2+浓度的变化，并因此跟踪诸如对HC110-R的物质的作用。本发明特别涉及具有HC110-R-Myc/His的，稳定转化过的HEK-293细胞系，该细胞系能够表达水母发光蛋白，并且业已交由国际保藏机构-德国微生物和细胞培养物保藏所DSMZ，GmbH(Mascheroder Weg lb in38124 Braunschweig)保藏，保藏号为DSM ACC2465。
本文所使用的术语“宿主细胞”表示天然状态下不包含本发明的核酸的细胞。
合适的和优选的宿主细胞包括诸如酵母、哺乳动物、两栖动物、昆虫或植物细胞的真核细胞，优选的真核宿主细胞包括HEK-293-细胞，Schneider S2-，斜纹夜蛾Sf9-，Kc-，CHO-，HepG-2-，K1-，COS-1-，COS-7-，HeLa-，C127-，3T3-或BHK-细胞，特别是爪蟾卵母细胞，而HEK-293或COS-7细胞是非常特别合适的。
本发明同样涉及将相应于披露于DE-A-197 04 024中的SEQ IDNO.2所示序列的DNA用于检测来自蠕虫，优选来自线虫门，特别优选来自毛圆线虫科，非常特别优选来自血矛线虫属，最优选来自捻转血矛线虫的DNA的用途。
另外，本发明涉及相应于上述DNA序列或其互补链的一部分并能够与它杂交的寡核苷酸。本发明涉及将所述寡核苷酸或其部分用作下述的应用
a)Northern或Southern印迹分析的探针，
b)诊断方法的PCR引物，用于检测上述线虫，其中，相关蠕虫的DNA特别是借助于所述引物和PCR技术扩增的，然后进行鉴定。
本发明还涉及一种用于检测蠕虫的方法，所述蠕虫优选来自线虫门，特别优选来自毛圆线虫科，非常特别优选来自血矛线虫属，最优选来自捻转血矛线虫，其中，上述寡核苷酸能够与源于所述生物的寡核苷酸专一性杂交，并且，随后通过PCR技术对所述DNA进行扩增。
例如，上述生物的检测可以通过以下方法进行：
a)提供一种能够与编码本发明的HC110-R的DNA或它的互补链，或其5′-或3′-旁侧区杂交的寡核苷酸探针或引物，
b)让所述寡核苷酸探针或引物与含有相应制备的DNA样品接触，
c)检测所述寡核苷酸或引物的杂交(例如通过聚合酶链式反应)，
d)对所检测的HC110-R基因的序列进行测序，和
e)将所述序列与本发明的DNA序列进行比较，优选与披露于专利申请DE-A-197 04 024中的SEQ ID NO：2进行比较。
因此，本发明还涉及用于检测蠕虫的诊断测试试剂盒，所述蠕虫优选来自线虫门，特别优选来自毛圆线虫科，非常特别优选来自血矛线虫属，最优选来自捻转血矛线虫，该试剂盒特别提供可用于从上述系统类型中检测物种的方法中的上述的寡核苷酸。
本发明还涉及上述诊断测试试剂盒，其中，可用于该测试试剂盒的寡核苷酸具有一种可检测的标记。所述可检测的标记特别包括酶，酶底物，辅酶，酶抑制剂，荧光标记，生色团，发光标记和放射性同位素。
本发明还涉及将来自蠕虫，优选来自线虫门，特别优选来自毛圆线虫科，非常特别优选来自血矛线虫属，最优选来自捻转血矛线虫的上述HC110-R多肽或其片段以及与它的同源性为70％，优选80％，特别优选90％，非常特别优选95％的受体蛋白用于生产疫苗的用途，所述疫苗至少包括一种HC110-R多肽或其片段以及与它的同源性为70％，优选80％，特别优选90％，非常特别优选95％的受体蛋白。在这里，所述疫苗能够诱导对上述HC110-R蛋白具有专一性的免疫反应。
在一种优选实施方案中，所述疫苗包括一个抗原决定子，例如，具有专利申请DE-A-197 04 024中所披露的SEQ ID NO：2所示氨基酸序列或由上述DNA或其片段所编码的多肽的一个决定子。
本发明还涉及生产用于本发明的多肽的方法。由已知核酸编码的多肽可以通过在合适条件下培养含有这种核酸的宿主细胞产生。然后可以通过常规方法从所述细胞或培养基中分离所需要的多肽。所述多肽还可以在体外系统中生产。
例如，正如在实施例中所披露的，用于快速分离由宿主细胞利用本发明的核酸合成的本发明的多肽的方法是从表达融合蛋白开始，其中，可以用一种简单方法亲和纯化所述融合配偶体。例如，所述融合配偶体可以是谷胱甘肽S-转移酶。然后可以在谷胱甘肽亲和柱上纯化所述融合蛋白。可以通过部分蛋白裂解除去所述融合配偶体，例如裂解位于所述融合配偶体和需要纯化的本发明的多肽之间的接头。可以对所述接头进行设计，以便它包括诸如精氨酸和赖氨酸残基的靶氨基酸，由这些靶氨基酸形成胰蛋白酶裂解的位点。所述接头可以通过用寡核苷酸进行的标准克隆方法制备。另一种可行的方法是基于组氨酸融合蛋白的应用，并且在Ni2+ Talon柱上纯化。
其他可行的纯化方法是基于制备性电泳，FPLC，HPLC(例如使用凝胶过滤，反相或轻度疏水性柱)，凝胶过滤，差异沉淀，离子交换色谱和亲和色谱。
由于受体样蛋白激酶是膜蛋白，在所述纯化方法中优选进行洗涤剂提取，例如，使用对所述多肽的二级和三级结构只有微弱影响或根本没有影响的洗涤剂，如非离子型洗涤剂。
用于本发明的多肽的纯化，可以包括从能表达本发明的核酸的宿主细胞中分离膜。所述细胞优选能够以足够的拷贝数量表达所述多肽，使膜级份中的所述多肽的数量至少比存在于来自天然表达HC110-R基因的相应膜中的数量高10倍；所述数量特别优选至少高出100倍，非常特别优选至少高出1000倍。
本文所使用的术语“分离或纯化”表示所述多肽是从所述细胞或组织的其他蛋白或其他大分子中分离的。与来自所述细胞的制剂相比，以蛋白含量计，含有所述多肽的本发明的组合物优选至少浓缩了10倍，特别优选浓缩了至少100倍。
还可以借助于能与所述多肽结合的抗体对本发明的多肽进行亲和纯化，而不使用融合配偶体。
本发明还涉及能专一性结合上述多肽或受体的抗体。所述抗体是用常规方法生产的。例如，所述抗体可以通过以下方法生产：注射实质上的免疫感受态宿主，其具有能有效产生抗体量的诸如源于捻转血矛线虫的HC110-R受体或其片段的本发明的跨膜受体，然后分离所述抗体。还可以通过本身已知的方法获得产生单克隆抗体的永生化细胞系。如果需要的话，所述抗体可以用一种检测试剂进行标记，所述检测试剂的优选例子包括酶、放射性标记因子、荧光化合物或生物素。代替完整抗体，还可以使用具有所需专一性结合特性的抗体片段。
本文所使用的术语“激动剂”表示能激活跨膜受体的分子。
本文所使用的“拮抗剂”表示能从其结合位点上排斥激动剂或抑制激动剂的功能的分子。
本文所使用的“调节剂”是激动剂和拮抗剂的统称。调节剂可以是能结合本发明多肽的小的有机化学分子，肽或抗体。调节剂还可以是能够结合一种分子的有机化学分子，肽或抗体，所述分子反过来又能结合本发明的多肽，并因此影响所述多肽的生物学活性。调节剂可以是天然底物和配体的模拟物。
所述调节剂优选是小的有机化合物。
所述调节剂与所述多肽的结合能够以导致用它处理过的蠕虫或节肢动物死亡的方式改变细胞过程。
因此，本发明还涉及将所述多肽的调节剂用作驱蠕虫剂和杀节肢动物剂的用途。
本发明还特别涉及将α-LTX用作驱蠕虫剂的用途。
本发明的核酸或多肽在本发明方法中的应用使得能够发现能结合本发明受体的化合物。所述化合物同样可被用作驱蠕虫剂，例如作为植物的杀线虫剂或用于动物的驱蠕虫活性物质。例如，让包括所述核酸并且能够表达相应的受体或多肽或它们的基因产物的宿主细胞与一种化合物或多种化合物的混合物接触，接触条件为使得至少一种化合物能够与宿主细胞、受体或一种多肽相互作用。
本发明特别涉及一种适合鉴定能结合来自蠕虫或节肢动物的跨膜受体，优选结合胰泌素亚科的GPCR，特别优选结合来自捻转血矛线虫的受体HC110-R，以及结合在序列上与它具有70％，优选80％，特别优选90％，非常特别优选95％相同性的受体的杀线虫活性物质。不过，所述方法还可以用来自除了上述物种以外的其他物种的HC110-R-同源受体进行。本发明全面包括使用除了本发明的HC110-R以外的受体的方法。
本发明的方法包括高处理量筛选(例如，高处理量筛选(HTS)和超高处理量筛选(UHTS))。对此，既可以应用含本发明核酸和/或本发明多肽的宿主细胞也可以应用含有本发明核酸和/或本发明多肽的无细胞制剂。
无细胞测试系统
用于测试化合物和天然提取物的很多测试系统被设计成具有高处理能力，以便增加在特定时间内研究的物质的数量。基于无细胞操作的测试系统需要纯化的或半纯化的蛋白。该系统适用于以初步检测一种物质对靶蛋白的可能影响为目的的“初步”测试。
在这样的体外系统中，诸如细胞毒性的作用通常被忽视了。另外，该测试系统还能检查所述物质的抑制或阻抑作用以及刺激作用。可以通过取决于浓度的测试系列检查一种物质的效力。可以将不含测试物质的对照组合物用于评估所述作用。
基于细胞的测试系统
可以通过本发明获得的用HC110-R稳定转化过的细胞系使得用于鉴定能调节HC110-R和同源受体活性的物质的基于细胞的测试系统的开发成为可能，不过，也可利用可以根据本发明鉴定的源于其他物种的相应的同源受体。
本发明还能够鉴定能发挥钙通道抑制剂作用的其他化合物。
可以通过在存在或缺乏可能是激动剂或拮抗剂的候选分子的条件下，与所述多肽的标记过的底物或配体一起培养合成的反应混合物(例如体外翻译产物)或细胞成分，如含有所述多肽的细胞膜或任何其他制剂发现调节剂。根据所述标记配体结合的增强或减弱，或者根据所述标记底物转化的增加或减弱，可以证实所述候选分子加强或抑制本发明多肽活性的能力。良好结合并且能导致本发明多肽活性提高的分子是激动剂。结合良好但是不能诱导本发明多肽的生物学活性的分子有可能是良好的拮抗剂。
闪烁亲近测定法(SPA)
用于鉴定能调节HC110-R和与它同源的受体蛋白的活性的物质的一种可行的方法是所谓的闪烁亲近测定法(SPA)，参见EP-A-015473。该测试系统利用了一种受体(例如HC110-R)与放射性标记的配体(例如小的有机分子或第二种放射性标记的蛋白分子)之间的相互作用。在这种情况下，所述受体与具有闪烁分子的小球或小珠结合。在放射性衰减期间，所述小球中的闪烁物质被放射性标记的亚原子颗粒激发，并且发射可检测的光子。对测试条件进行优化，以便只有由所述配体发射的颗粒是由结合于所述受体或HC110-R上的配体发射的才产生信号。
在一种可行的实施方案中，HC110-R与有或没有相互作用或结合的测试物质的玻珠结合。在这种情况下，还可以使用HC110-R受体的片段。例如，放射性标记过的配体可以是标记过的α-LTX、硝苯地平或标记过的缩酚肽。当一种结合配体与固定化的HC110-R受体结合时，这种配体必须抑制或破坏存在于固定化HC110-R和标记过的配体之间的相互作用，以便它本身结合于接触部位的有关区域。然后可以通过闪光，检测与固定化HC110-R受体的成功结合。相应地，通过测试化合物的结合破坏了固定化的和游离的标记过的配体之间的现有配合，这会导致检测到的闪光强度的降低。因此，该测试系统相当于一个互补抑制系统。
双杂交系统
基于完整细胞的测试系统的另一个例子是所谓的“双杂交系统”。该系统的一个具体例子是所谓的“相互作用陷阱”。该系统包括在酵母中遗传学筛选相互作用蛋白(例如，参见Gyuris et al.1993)。该测试系统被设计成通过能产生可检测信号的成功的相互作用检测并说明两种蛋白之间的相互作用。
这种测试系统还可用于在特定时间内测试大量的测试物质。
该系统基于两种载体的构建：“诱饵”载体和“捕食”载体。将编码本发明HC110-R或其片段的基因克隆到诱饵载体上，然后作为与LexA蛋白——一种DNA结合蛋白融合的融合蛋白形式表达。将编码HC110-R相互作用配偶体，例如编码α-LTX的第二个基因克隆到捕食载体上，其中，它作为与B42捕食蛋白融合的融合蛋白形式表达。这两种载体都存在于酿酒酵母宿主中，在该宿主中包括多个拷贝的位于lacZ或HIS3报导基因5’一侧的LexA-结合DNA。如果相互作用是发生在两种融合蛋白之间的话，所述报导基因的转录就被激活。如果所述测试物质的存在导致了所述相互作用的抑制或破坏的话，这两种融合蛋白就不再能够相互作用，并且也不能再产生所述报导基因的产物。
排斥实验
能够发现本发明的多肽的调节剂的方法的另一个例子是排斥实验，其中，在适合这一目的的条件下，用一种已知能与本发明多肽结合的分子，如天然底物或配体或底物或配体模拟物将本发明的多肽和一种潜在的调节剂连接在一起。根据本发明，优选将α-LTX用于这一目的。
可以将一种已知分析系统(例如来自Biacore AB，Uppsala，Schweden)用于分子相互作用研究，该分析系统采用完整的HC110-R蛋白或HC110-R的N-和/或C-末端缺失变体，或通过体外诱变或其他已知方法修饰过的HC110-R分子的其他变体。对此，一方面，可
(i)通过已知化学方法(通过胺、硫醇、醛结合)或亲和结合(例如抗生蛋白链菌素-生物素，IMAC)将HC110-R蛋白或其片段结合在生物芯片上，或另一方面
(ii)将α-LTX或诸如BAY44-4400的另一种调节剂或在(i)中所披露的其他可能的配体结合在所述芯片上。
存在于溶液中的配体(HC110-R蛋白或另一种任何调节剂，例如BAY44-4400等)与固定化分子的结合可以通过物理方法检测。在所述Biacore仪器上，所述配体被固定在具有一薄层金的传感器芯片上。分析物溶液是通过所述芯片上的一个微流室扩散的。所述分析物与固定配体的结合能提高所述表面上的局部浓度，而靠近所述金层的培养基的折射指数逐渐增加。这种变化会对所述金属中的游离的电子(细胞质基因组)和由所述仪器发射的光子之间的相互作用产生影响。这种物理变化与所述芯片上分子的质量和数量成正比，并且实时记录配体-分析物结合，以便能够确定表观结合/解离速度(Fivash等1998)。通过竞争实验证实这种结合的专一性。
相应地测定还可以用于确定对配体结合来说起重要作用的HC110-R蛋白结构域，并用于鉴定新的、以前没有披露过的HC110-R配体。
钙成像
钙成像或信号传导被认为是用于检测与HC110-R相互作用的物质的另一种方法(例如参见图10和11)，这需要使用钙指示剂，借助这种指示剂可以检测细胞内钙含量的变化。在本方法中，采用向其中添加了钙指示剂的HC110-R表达细胞。当存在由HC110-R激动剂导致的钙流入，或者存在细胞内钙释放的情况下，UV激发会发生指示剂负载钙相关的吸收值的变化。在该系统中，通过由所述激动剂(例如α-LTX)的完全或部分抑制诱导的钙信号鉴定拮抗剂。适用于这一目的的可行的钙指示剂包括Fura-2(Sigma)或Indo-1(MolecularProbes)。
其他的钙指示剂可以受到可见光线的激发，并且能根据其钙负荷以可检测的方式改变其荧光特征。指示剂Fluo-3和Fluo-4具有高的钙亲和力。由于Fluo-4具有强的荧光信号，它特别适合在这样的测试系统中测定：其中，所述细胞只是以低密度使用的，例如HEK293细胞。其他的指示剂包括Rhod-2，x-Rhod-1，Fluo-5N，Fluo-5F，Mag-Fluo-4，Rhod-5F，Rhod-5N，Y-Rhod-5N，Mag-Rhod-2，Mag-X-Rhod-1，Calcium Green-1和2，Calcium Green-5N，OregonGreen 488 BAPTA-1，Orgeon Green 488 BAPTA-2和-5N，Fura Red，和Calcein等。
向细胞中装载钙指示剂的另一种方法是在靶细胞中重复表达发光蛋白。这种发光蛋白在与Ca2+离子形成复合物之后以发光形式作出反应。业已在多项研究和测试系统中多次使用过的发光蛋白是水母发光蛋白。在该测试方法中，首先向能表达所述靶蛋白并能同时表达水母发光蛋白的细胞中加载发光体Coelenterazin。由所述细胞产生的表水母发光蛋白与Coelenterazin和二氧化碳形成复合物。如果随后Ca2+也进入所述细胞并且与所述复合物结合的话，就会释放出二氧化碳并发出兰色光线(最大发射波长为大约466nm)。此时的光线发射与主要在细胞内的Ca2+浓度相关。
因此，本发明还涉及将来HC110-R、它的片段或来自其他生物的类似蛋白用于一种测试方法中的用途，其中，所述受体的功能或调节剂与所述受体的结合是通过由水母发光蛋白或类似的发光蛋白介导的光信号检测的。
通过这种方式还可以利用包括本发明核酸的宿主细胞或转基因无脊椎动物发现能改变所述受体表达的物质。这种物质可能还是有价值的驱蠕虫剂。
因此，通过本发明方法发现的活性物质适用于控制出现在农业、林业、贮存和材料保护以及卫生领域的动物害虫，特别是昆虫、蜘蛛和线虫。通过本发明方法发现的活性物质特别适用于控制线虫和蜘蛛。上述害虫包括：
等足目，例如，潮虫(Oniscus asellus)、平甲虫、鼠妇。
倍足目，例如，具斑马陆。
唇足目，例如，食果地蜈蚣、蚰蜒属。
综合目，例如，庭园么蚰。
缨尾目，例如，台湾衣鱼。
弹尾目，例如，武装棘跳虫。
直翅目，例如，家蟋蟀、蝼蛄属、非洲飞蝗、黑蝗属、沙漠蝗。
蜚蠊目，例如，东方蜚蠊、美洲大蠊、马得拉蜚蠊、德国小蠊。
革翅目，例如，欧洲球螋。
等翅目，例如，散白蚁属。
虱目，例如，体虱、血虱属、颚虱属、嚼虱属、畜虱属。
缨翅目，例如，温室条蓟马、烟蓟马、棕榈蓟马、苜蓿蓟马。
异翅亚目，例如，扁盾蝽属、棉红蝽(Dysdercus intermedius)、方背皮蝽、温带臭虫、长红猎蝽、椎猎蝽属。
同翅目，例如，甘蓝粉虱、甘薯粉虱、温室白粉虱、棉蚜、甘蓝蚜、茶  隐瘤蚜、豆卫矛蚜、苹果蚜、苹果绵蚜、桃大尾蚜、葡萄根瘤蚜、瘿绵蚜属、麦长管蚜、瘤蚜属、忽布疣蚜、禾谷缢管蚜、绿小叶蝉属、殃叶蝉(Euscelis bilobatus)、黑尾叶蝉、欧果坚球蚧、榄珠蜡蚧、灰飞虱、褐飞虱、红肾圆盾蚧、常春藤圆盾蚧、粉蚧属、木虱属。
鳞翅目，例如，棉红铃虫、松粉蝶尺蛾、果园秋尺蛾、潜叶细蛾(lithocolletis blancardella)、苹果巢蛾、小菜蛾、黄褐天幕毛虫、黄毒蛾、毒蛾属、棉潜蛾(Bucculatrix thurberiella)、柑橘潜叶蛾、地夜蛾属、切夜蛾属、脏切夜蛾、埃及钻夜蛾、实夜蛾属、甘蓝夜蛾、小眼夜蛾、灰翅夜蛾属、粉纹夜蛾、苹果蠹蛾、粉蝶属、禾草螟属、玉米螟、地中海粉斑螟、蜡螟、幕谷蛾、袋谷蛾、褐织蛾、黄尾卷叶蛾、烟卷蛾(Capua reticulana)、云杉色卷蛾、葡萄果蠹蛾、茶长卷蛾、栎绿卷蛾、Cnaphalocerus属、水稻负泥虫。
鞘翅目，例如，家具窃蠹、谷蠹、豆象(Bruchidius obtectus)、菜豆象、北美家天牛、蓝毛臀萤叶甲、马铃薯叶甲、辣根猿叶甲、条叶甲属、油菜金头跳甲、墨西哥豆瓢虫、隐食甲属、锯谷盗、花象属、米象属、葡萄黑耳喙象、香蕉根颈象、种子象、紫苜蓿叶象、皮蠹属、斑皮蠹属、圆皮蠹属、毛皮蠹属、粉蠹属、油菜花露尾甲、蛛甲属、黄蛛甲、麦蛛甲、拟谷盗属、黄粉甲、叩甲属、宽胸叩甲属、五月鳃金龟、马铃薯鳃金龟、褐新西兰肋翅鳃角金龟、稻水象。
膜翅目，例如，松叶蜂属、实叶蜂属、毛蚁属、小家蚁、胡蜂属。
双翅目，例如，伊蚊属、按蚊属、库蚊属、黄猩猩果蝇、家蝇属、厕蝇属、红头丽蝇、绿蝇属、金蝇属、疽蝇属、胃蝇属、虱蝇属、螫蝇属、狂蝇属、皮蝇属、虻属、螗蜩属(Tannia spp.)、花园毛蚊、瑞典麦杆蝇、草种蝇属、菠菜泉蝇、地中海实蝇、油橄榄果实蝇、沼泽大蚊、种蝇属、斑潜蝇属。
蚤目，例如，印鼠客蚤、角叶蚤属。
蛛形纲，例如，蝎(Scorpio maurus)、红斑蛛、粗脚粉螨、锐缘蜱属、纯缘蜱属、鸡皮刺螨、兔瘿螨、柑橘皱叶刺瘿螨、牛蜱属、扇头蜱属、花蜱属、璃眼蜱属、硬蜱属、瘙螨属、痒螨属、疥螨属、跗线螨属、苜蓿苔螨、全爪螨属、叶螨属、半跗线螨属、短须螨属。
植物寄生线虫包括，例如短体线虫属、相似穿孔线虫、起绒草茎线虫、半穿刺线虫、异皮属、球异皮属、根结属、滑刃线虫属、长针线虫属、剑线属、毛刺属、伞滑刃线虫属。
本发明活性化合物组合不仅对植物害虫、卫生害虫和储藏物品中的害虫具有活性，而且在兽医领域，对防治动物寄生虫(外寄生虫)也有活性，例如硬蜱、软蜱、兽疥癣螨、虱状蒲螨、蝇(叮咬和吸食)、寄生性蝇幼虫、虱、毛虱、羽虱和跳蚤。这些寄生虫包括：
虱目，例如，血虱属、颚虱属、虱属、Pthirus spp.、管虱属；
食毛目以及钝角亚目和细角亚目，例如，毛羽虱属、Menoponspp.、巨毛虱属、羽虱属、Werneckiella spp.、Lepikentron spp.、畜虱属、嚼虱属、猫羽虱属；
双翅目以及长角亚目和短角亚目，例如，伊蚊属、按蚊属、库蚊属、蚋属、真蚋属、白蛉属、Lutzomyia spp.、库蠓属、斑虻属、瘤虻属、黄虻属、虻属、麻翅虻属、Philipomyia spp.、蜂虱蝇属.、家蝇属、齿股蝇属、螫蝇属、角蝇属、莫蝇属、厕蝇属、舌蝇属、丽蝇属、绿蝇属、金蝇属、Wohlfahrtia spp.、麻蝇属、狂蝇属、皮蝇属、胃蝇属、虱蝇属、Lipoptena spp.、蜱蝇属；
蚤目，例如，蚤属、栉首蚤属、印鼠客蚤属、角叶蚤属；
异翅亚目，例如，臭虫属、椎猎蝽属、红腹猎蝽属、全圆蝽属；
蜚蠊目，例如，东方蜚蠊、美洲大蠊、德国小蠊、蜚蠊属；
蜱螨目以及后气门亚目和中气门亚目，例如，锐缘蜱属、纯缘蜱属、残喙蜱属、硬蜱属、花蜱属、牛蜱属、革蜱属、Haemophysalis spp.、璃眼蜱属、扇头蜱属、皮刺螨属、刺利螨属、肺刺螨属、胸孔螨属、瓦螨属；
辐螨亚目(前气门亚目)和粉螨目(无气门亚目)，例如，蜂跗线螨属、姬螫螨属、禽螫厘螨属、肉螨属、疮螨属、蠕形螨属、恙螨属、牦螨属、粉螨属、食酪螨属、嗜木螨属、颈下螨属、翅螨属、瘙螨属、痒螨属、耳螨属、疥螨属、痂螨属、疙螨属、胞螨属、皮膜螨属。
通过本发明方法发现的活性物质还适用于控制螨虫，特别是室内尘螨，例如屋尘螨和D.farinae。
通过本发明方法发现的活性物质还适合用于控制危害农业生产牲畜的节肢动物，所述牲畜如牛、绵羊、山羊、马、猪、驴、骆驼、水牛、兔、鸡、火鸡、鸭、鹅、蜜蜂，其他宠物，如狗、猫，笼养鸟类和水生鱼类，以及所谓的实验动物，如仓鼠、豚鼠、大鼠和小鼠。控制所述节肢动物是降低死亡率并减少产量(肉类、乳、羊毛、皮毛、蛋、蜜等的产量)的减少，以便可以通过使用本发明的活性物质使动物饲养变得更经济和更容易。
通过本发明所披露的方法和多肽发现的化合物，还可用于治疗受到人类或生产性牲畜、宠物、动物园动物和实验室和试验动物的致病性体外寄生物的感染的动物和人。
所述化合物可以在普通、敏感性门和抗性门发育的任何阶段使用。还可以通过用含有上述一种或多种化合物的组合物处理来预防生产性牲畜的经济损失，以及预防或治疗人类和动物的疾病。下面的寄生物特别适合作为所发现的活性物质的各种目标。
嘴刺目(Enoplida)，例如鞭虫属(Trichuris spp.)，毛细线虫属(Capillaria spp.)，Trichomosoldes spp.，毛线虫属(Trichinella spp)。
小杆亚纲(Rhabditia)，例如Micronema spp.，粪圆属(Strongyloides spp)。
圆线虫目(Strongylida)，例如圆线虫属(Strongylus spp.)，Triodontophorus spp.，Oesophagodontus spp.，Trichonemaspp.，Gyalocephalus spp.，Cylindropharynx spp.，Poteriostomum spp.，Cyclococercus spp.，Cylicostephanusspp.，Oesophagostomum spp.，Chabertia spp.，Stephanurusspp.，Ancylostoma spp.，Uncinaria spp.，Bunostomum spp.，Globocephalus spp.，Syngamus spp.，Cyathostomum spp.，Cylicocyclus spp.，Neostrongylus spp.，Cystocaulus spp.，Pneumostrongylus spp.，Spicocaulus spp.，Elaphostrongylusspp.，Parelaphostrongylus spp.，Crenosoma spp.，Paracrenosoma spp.，Angiostrongylus spp.，Aelurostrongylusspp.，Filaroides spp.，Parafilaroides spp.，Trichostrongylus spp.，Haemonchus spp.，Ostertagia spp.，Marshallagia spp.，Cooperia spp.，Nematodirus spp.，Hyostrongylus spp.，Obeliscoides spp.，Amidostomum spp.，Ollulanus spp.，Dictyocaulus spp.，Muellerius spp.，Protostrongylus spp。
尖尾属(Oxyurida)，例如Oxyuris spp.，Enteroblus spp.，Passalurus spp.，Syphacia spp.，Aspiculuris spp.，Heterakisspp。
蛔属(Ascaridia)，例如Ascaris spp.，Toxascaris spp.，弓蛔虫，Parascaris spp.，Anisakis spp.，Ascaridia spp。
旋尾目(Spirurida)，例如Gnathostoma spp.，Physalopteraspp.，Thelazia spp.，Gongylonema spp.，Habronema spp.，Parabronema spp.，Draschia spp.，Dracunculus spp。
丝虫属(Filariida)，例如Stephanofilaria spp.，Parafilaria spp.，Setaria spp.，Loa spp.，Dirofilaria spp.，Litomosoides spp.，Brugia spp.，Wuchereria spp.，Onchocercaspp。
大棘吻属(Gigantorhynchida)，例如Filicollis spp.，Moniliformis spp.，Macracanthorhynchus spp.，Prosthenorchisspp。
鞭毛纲(Flagellata)。
锥虫科，例如布鲁斯锥虫(Trypanosoma b.brucei)，冈比锥虫(T.b.gambiense)，罗德森锥虫(T.b.rhodesiense)，T.congolense，克鲁兹锥虫(T.Cruzi)，伊氏锥虫(T.evansi)，马锥虫(T.equinum)，刘氏锥虫(T.lewisi)，鲈鱼锥虫(T.percae)，T.simiae，活跃锥虫(T.vivax)，巴西利什曼虫(Leishmaniabrasililensis)，多氏利什曼虫(L.donovani)，热带利什曼虫(L.tropica).
毛滴虫科，例如吸吮贾弟虫(Giardia lamblia)，犬贾弟虫(G.canis)。
肉鞭毛虫门(Rhizopoda)如例，如痢疾内变形虫(Entamoebahistolytica)，哈氏阿米巴科，例如棘阿米巴属(Acanthamoebasp.)，
哈氏阿米巴属(Hartmanella sp)、Hartmanella spp.。
Apicomplexa(Sporozoa)，如堆形艾美球虫(Eimeriaacervulina)，腺样艾美球虫(E.adenoids)，阿州艾美球虫(E.alabahmensis)，鸭艾美球虫(E.anatis)，鹅艾美球虫(E.anseris)，阿氏艾美球虫(E.arloingi)，E.ashata，奥门艾美球虫(E.auburnensis)，牛艾美球虫(E.bovis)，波氏艾美球虫(E.brunetti)，犬艾美球虫(E.canis)，E.chinchillae，E.clupearum，鸽艾美球虫(E.columbae)，E.contorta，槌状艾美球虫(E.crandalis)，德氏艾美球虫(E.debliecki)，散布艾美球虫(E.dispersa)，椭圆艾美球虫(E.eliipsoidales)，镰刀形艾美球虫(E.falciformis)，福氏艾美球虫(E.faurei)，唇艾美球虫(E.labbeana)，勒氏艾美球虫(E.leucarti)，大艾美球虫(E.magna)，巨型艾美球虫(E.maxima)，中型艾美球虫(E.media)，珠鸡艾美球虫(E.meleagridis)，E.meleagrimitis，和缓艾美球虫(E.mitis)，尼氏艾美球虫(E.necatrix)，尼纳艾美球虫(E.ninakohlyakimovae)，E.ovis，小艾美球虫(E.parva)，孔雀艾美球虫(E.pavonis)，穿孔艾美球虫(E.perforans)，E.phasani，梨形艾美球虫(E.pikriformis)，塞前艾美球虫(E.praecox)，E.residua，粗糙艾美球虫(E.scabra)，艾美球虫属(E.spec.)，兔肝艾美球虫(E.stiedai)，猪艾美球虫(E.suis)，柔嫩艾美球虫(E.tenella)，树艾美球虫(E.truncata)，E.truttae，邱氏艾美球虫(E.zuernii)，球孢子虫属(Globidium spec.)，贝氏等孢子虫(Isospora belli)，犬等孢子虫(I.canis)，猫等孢子虫(I.felis)，I.ohioensis，I.rivolta，等孢子属(I.spec.)，猪等孢子虫(I.suis)，Neospora carinum，Cystisospora属，隐孢子属(Cryptosporidium spec.).
弓浆虫科，例如鼠弓浆虫(Toxoplasma gondii)
肉孢子虫科，例如牛犬肉孢子虫(Sarcocystis bovicanis)，牛人肉孢子虫(S.bovihominis)，S.neurona，S.ovicanis，S.ovifelis，肉孢子虫属(S.spec.)，猪人肉孢子虫(S.suihominis)
Leucozoide，例如Leucozytozoon simondi
疟虫科，例如柏氏疟虫(Plasmodium berghei)，恶性疟原虫(P.falciparum)，三日疟原虫(P.malariae)，蛋形疟原虫(P.ovale)，间日疟原虫(P.vivax)，疟虫属(P.spec.)
焦虫目，例如Babesia argentina，牛巴贝虫(B.bovis)，犬巴贝虫(B.canis)，巴贝虫属(B.spec.)，小泰来虫(Theileriaparva)，泰来虫属(T.spec.)
阿德尔球虫目(Adeleina)，例如犬肝簇虫(Hepatozoon canis)，肝簇虫属(H.spec)。
此外还有粘孢子门和微孢子门，例如格留虫属(Glugea spec.)，微粒子虫属(Nosema spec.)，以及卡氏肺囊虫、 纤毛门(Ciliata)如结肠肠袋虫(Balantidium coli)，Ichthiophthirius属，车轮虫属(Trichodina spec.)， 累枝虫属(Epistylis spec.)。
所发现的化合物和组合物还对原生动物门的昆虫有效，如微粒子虫目(Microsporidia)，特别是小孢子虫目，非常特别的是Nosemaapis种的昆虫，这种昆虫是蜜蜂的寄生虫。
因此，本发明还涉及将利用本发明方法和/或利用本发明的核酸和多肽发现的化合物用于生产控制蠕虫和节肢动物的组合物的用途。
实施例
1.构建并筛选cDNA文库
cDNA文库的构建，KLH-PF1022A缀合物和抗PF1022A的抗血清的生产，以及cDNA文库的免疫筛选和DNA分析是按照披露WO 98/15625中的方法进行的。
2.RNA的分离
通过GTC/CsCl缓冲(Kissen)方法从成体捻转血矛线虫体内提取并分离总RNA(Sambrook等1989)，或通过GTC/苯酚/氯仿提取用一个步骤获得(Chomczynski和Sacchi 1987)。通过在寡聚(dT)纤维素上层析分离poly(A)+RNA(Aviv和Leder，1972)。
3.Northern印迹
在琼脂糖凝胶中分离来自捻转血矛线虫的乙醛酸化的总RNA(每个泳道20微克)(Sambrook等1989；McMaster和Carmicheal 1977)，并且通过碱性毛细转移方法转移到转移到Hybond N膜(Amersham)上(Chomczynski，1992)。通过用Megaprime试剂盒(Amersham，Braunschweig，德国)和50μCi的[α-32P]dCTP(3000Ci/mmol，ICN，Meckenheim，德国)随机标记线性化的质粒DNA(HC110-R)制备放射性标记的探针。杂交是在65℃下，在6xSSC(1xSSC：0.15MNaCl，0.015M柠檬酸钠)5x Denhardt′s试剂(0.1％聚乙烯基吡咯烷酮，0.1％BSA，0.1％Ficoll 400)、0.1％SDS和100μg/ml雪鱼精子DNA中进行一夜。在65℃下用0.1xSSC和0.1％SDS以高严格性洗涤所述滤膜并且曝光(Kodak BioMax MS胶片，-80℃)，参见图1(A)。
4.5′-和3′-RACE-PCR
利用5′/3′-RACE方法分离在鉴定的cDNA克隆中缺少的5′-和3′末端。
5′-RACE基于对来自mRNA的基因的5’末端的专一性扩增。将序列专一性引物和AMV逆转录酶用于合成第一股cDNA链。将poly(A)尾巴连接在该产物上，以便它能够在随后的PCR中使用寡聚dT锚定引物和嵌套序列专一性引物。还可以在第二种PCR中使用另一种嵌套引物，以便确保专一性。
在3′-RACE中，第一股cDNA链是用寡聚dT引物合成的，而随后的PCR反应是用序列专一性引物进行的。
用引物5′-GGT CAC CGT CGT CCC AGA AA-3′和购自GIBCO BRL(Eggenstein，德国)的5′-RACE试剂盒由1微克总捻转雪矛线虫RNA合成cDNA。将Superscript逆转录酶用于这一目的。用末端脱氧核糖核苷转移酶对该cDNA的C末端进行C加尾。第一次扩增是用400nM寡聚脱氧肌苷锚定引物(5′-CUA CUA CUA CUA GGC CAC GCG TCG ACT AGTACG GGI IGG GII GGG IIG-3′)和400nM第一嵌套引物5′-CCA TTC GATTCC TCT TCT CG-3′(Birsner和Grob，Denzlingen，德国)在含有200μM每一种dNTP、1.5mM MgCl2、1/5所述加尾cDNA和2.5U天然Taq聚合酶的50μl反应溶液中进行的。第一次变性是在94℃下进行5分钟，然后进行35轮以下各个步骤：94℃1分钟，53℃1分钟，72℃2分钟，随后是在72℃下进行10分钟的最后的合成步骤。嵌套PCR的反应条件与上文所述相同，所不同的是将1μl所述第一次扩增产物用作模板，并且使用基因专一性第二嵌套引物5′-GTC GAT GGT GCA GATTTC GC-3′，它是锚定引物(5′-CUA CUA CUA CUA GGC CAC GCG TCG ACTAGT AC-3′)的截短形式，并且在53℃的退火温度只进行25轮。
3′-RACE-PCR(GIBCO BRL，Eggenstein，德国)是用1微克来自成体捻转血矛线虫的RNA和500nM寡聚dT接头引物5′-GGC CAC GCGTCG ACT AGT ACT TTT TTT TTT TTT TTT T-3′进行的，开始在70℃下预培养10分钟，并且在4℃下培养2分钟。在20μl的体积中添加2.5mM MgCl2、500μM每一种dNTP、10μM DTT和200U的Super-Script II逆转录酶之后，将所述cDNA在42℃下培养50分钟，并且在最后一个步骤在70℃下培养15分钟，在4℃下培养10分钟。通过2U的大肠杆菌RNase H，并且在37℃下培养10分钟除去RNA。第一次扩增是用400nM通用接头引物(5′-CUA CUA CUA CUA GGC CACGCG TCG ACT AGT AC-3′)和400nM序列专一性引物5′-TTTGTTCTT CCTTGG TAT CC-3′在含有200mM的每一种dNTP、1.5mM MgCl2、1/10的所述加尾的cDNA和2.5U天然Taq-DNA聚合酶的50μl的反应体积中进行的。第一个变性步骤是在94℃下进行3分钟，然后进行35轮以下每一个步骤：94℃1分钟，51℃1分钟和72℃2分钟，最后的合成步骤为72℃15分钟。将2μl第一扩增产物用于嵌套PCR，所采用的条件其他方面相同，所不同的是在这里使用较短的接头引物5′-GGC CACGCG TCG ACT AGT AC-3′和嵌套引物5′-ACA CTC TAA TCT CCA ACTG-3′，在这里进行30轮。在2％琼脂糖凝胶上分析PCR产物，洗脱并且在TA-载体pMosBlue(Amersham，Braunschweig，德国)中克隆。
5.RNA的转移
通过Chomczynski(1992)的方法，在碱性转移溶液中，通过向下的碱性毛细转移，用2小时时间将分离的RNA从乙二醛凝胶上或将基因组DNA从TBE-琼脂糖凝胶上转移到中性Hybond-N尼龙膜[Amersham，Braunschweig]上。然后，在0.2M磷酸钠缓冲液(pH6.8)中中和所述膜20分钟，干燥，并且在80℃下烘干20-60分钟。为了与放射性标记的探针杂交，将所述膜与5ml/cm2预杂交溶液一起密封在塑料袋中，并且在65℃下培养3小时。将该缓冲液换成杂交溶液进行杂交。在使用Rapid Hyb.溶液[Amersham，Braunschweig]时，预杂交是在65℃下，在没有额外的预杂交溶液的情况下进行30分钟。在添加通过随机启动进行放射性标记的探针之后，在65℃下杂交过夜。然后用65℃的热2xSSC/0.1％SDS洗涤该膜一次，20分钟，并且用0.1xSSC/0.1％SDS洗涤3次，每次1小时。在-80℃下，用相应的加厚胶片让所述膜对Kodak X-OMAT或Kodak BIOMAX-MS X光胶片进行感光。
6.体外转录和翻译
按照生产商推荐的方法，在存在35S标记的甲硫氨酸和半胱氨酸(ICN，Eschwege，德国)的条件下用TNT T7/T3结合的网织红细胞裂解物系统(Promega)转录并翻译HC110-R的完整长度的编码序列。用兔网织红细胞裂解物系统(Promega，Serva，Heidelberg)翻译RNA，使用40μCi 35S标记的混合物(＞1000Ci/mmol，ICN，Meckenheim，德国)，1μg环状HC110-R质粒DNA和10U的T3-RNA聚合酶。该反应在30℃下进行90分钟。正对照含有1μg的荧光素酶对照DNA。
通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(Lmmli，1970)分离反应产物，并且用扩增荧光作图溶液(Amersham Pharmacia Biotech)或1M水杨酸钠(pH7)(Chamberlain，1979)进行荧光作图，然后干燥所述凝胶并曝光(Kodak BioMax MR加厚胶片，-80℃)，参见图1(B)。
另外，将购自Ambion[Heidelberg]的MAXIscript体外转录试剂盒用于由克隆到pBluescript SK中的HC110-R cDNA体外合成RNA转录物。用限制酶Hind III或SalI在终止密码子后面将4μg HC110-R质粒DNA线性化，用苯酚/氯仿提取，在3倍体积的乙醇中沉淀，并且溶解在DEPC-H2O中。将2μg的HC110-R cDNA在50μl反应混合物中与2.5μl 200mM DTT，各2.5μl的10mM ATP，CTP，GTP和UTP，5μl的10倍转录缓冲液，1.6μl的RNasin抑制剂(40U/μl)[Promega，Heidelberg]和2μl的T3噬菌体聚合酶(10U/μl)混合，并且在37℃下培养2小时。1小时之后，再添加2μl T3噬菌体聚合酶(10U/μl)。将混合物与1.5μl的无RNase的DNaseI(2U/μ1)和1μl RNasin抑制剂(40U/μl)混合，并且在37℃下培养15分钟，用苯酚/氯仿提取，在3倍体积的乙醇中沉淀，并且重新悬浮在25μl的DEPC-H2O中，在乙二醛凝胶上对1/5体积的样品进行分析。
7.DNA分析
通过双脱氧核苷酸链终止方法，用自动化激光荧光测序仪(LICOR4000；MWG，Ebersberg，德国)，和Thermo Sequenase荧光标记的循环测序试剂盒(Amersham，Braunschweig，德国)对所述克隆进行测序。用GCG软件(Genetics Computer Group Inc.，Madison，WI，U.S.A.)和PC/GENE软件(Intelligenetics，Mountain View，CA，U.S.A.)确定两股链的序列。用FASTA(Pearson和Lipman1988)，BLITZ(Smith和Waterman 1981)和BLAST(Altschul和Lipmann 1990)程序筛选EMBL-和Swiss-Prot蛋白数据库，研究所述衍生蛋白序列的相似性。用SAPS(Brendel等1992)和使用PROSITE和Prot-Param(Appel等1994)分析蛋白序列。
8.从捻转血矛线虫中制备蛋白提取物
将在液氮中冷冻的50-100mg捻转血矛线虫放入1ml TRIZOL[Gibco，Karlsruhe]中。在玻璃研钵中将所述线虫和TRIZOL一起匀浆3×15秒，并且在室温下培养5分钟。在向每毫升TRIZOL中添加200μl氯仿之后，摇晃该样品15秒，在室温下将混合物再培养2-3分钟，然后在4℃下以7000-12000rpm的速度离心10分钟。上部水相含有RNA，两相的界面部分含有基因组DNA，而红色有机相含有蛋白(Coombs等1990；Chomczynski 1993)。取出水相并且分别进行处理，以每毫升TRIZOL 300μl 100％乙醇的用量将所述两相界面和有机相混合，充分混合并在室温下培养2-3分钟。在4℃下以2000rpm的速度离心5分钟，然后将蛋白上清液小心转移到新的Eppendorf试管中，并且用1ml异丙醇在室温下沉淀10分钟。再次在4℃下以12000rpm的速度离心10分钟，放弃上清液，将蛋白沉淀进行以下操作3次：与2ml的用95％乙醇制备的0.3M胍盐酸盐溶液混合，涡旋搅拌，在室温下培养20分钟，并且在4℃下以7500rpm的速度离心5分钟，然后将沉淀溶解在2ml 100％乙醇中，在室温下沉淀20分钟，并且在4℃下以7500rpm的速度离心沉淀5分钟。在真空条件下对沉淀物进行短时干燥，并且重新悬浮在尿素裂解缓冲液(8M)中。通过在4℃下以10000rpm的速度离心10分钟除去不溶性材料，并且将上清液转移到一个新的Eppendorf试管中，测定蛋白浓度，然后在-20℃下保存直到作进一步的处理。
9.用酵母细胞制备蛋白提取物
通过用单一酵母菌落接种5ml的YPAD培养基，并且在30℃下摇晃培养直到饱和(2天)，用酵母培养物制备蛋白提取物。在4℃下以3000rpm的速度对各2ml的所述酵母培养物离心(Heraeus Biofuge15R)2分钟，用水洗涤1次，重新悬浮在250μl的酵母裂解缓冲液中，转移到一个小试管中，放入玻璃珠(直径0.5mm)直到刚好位于液面下，并且以最高设定速度涡旋搅拌5分钟。然后添加4x RotiLoad缓冲液[Roth，Karlsruhe]，并且在95℃下培养该混合物5分钟。将破碎的细胞转移到Eppendorf试管中，并且通过以14000rpm的速度离心(Eppendorf离心机5415C)15分钟除去细胞碎片。将通过这种方法制备的20μl样品加样到SDS聚丙烯酰胺凝胶上。
10.用大肠杆菌细胞制备蛋白提取物
通过在4℃下，在Heraeus下压台离心机中以5000rpm的速度离心从5ml过夜培养物中沉淀1×107大肠杆菌细胞制备蛋白提取物。用5ml PBS洗涤，并且再次离心。然后将沉淀重新悬浮在1ml TRIZOL[Gibco，Karlsruhe]中，并且作进一步的加工。
作为上述方案的一种替代方案，可以再次将PBS洗涤的细胞沉淀重新悬浮在PBS中，并且通过若干次短的超声波脉冲[Sonifier B-12，Branson Sonic Power Compa ny，Danbury，U.S.A.]，液氮和通过添加溶菌酶破坏所述细胞。
在测定蛋白之后，添加4x RotiLoad缓冲液[Roth，arlsruhe]，并且通过加样到SDS聚丙烯酰胺凝胶上分析其级份。在每个泳道上添加的蛋白总量为10-20μg。
11.用细胞培养物制备蛋白提取物
事先通过用胰蛋白酶-EDTA溶液胰化或在冷冻后用细胞刮刀机械分离，将在含有FCS的培养基中培养的35毫米细胞培养皿中的铺满的贴壁细胞或5-10×106非贴壁哺乳动物细胞将其转移到Eppendorf试管中，在室温下以13000rpm的速度离心沉淀10秒，用PBS洗涤2次，并且再次离心。在将所述细胞溶解在1ml TRIZOL中之后，通过剧烈涡旋搅拌或通过用一次性注射器针头抽吸所述细胞若干次，裂解所述细胞，并且在室温下培养5分钟。作为上述方法的一种替代方案，还可以将细胞沉淀重新悬浮在1ml PBS或尿素裂解缓冲液(8M)中，并且进行短时超声波处理[Sonifier B-12，Branson Sonic Power Company，Danbury，U.S.A.]。然后通过Bradford(1976)或Lowry等(1951)的方法测定蛋白含量。
12.在大肠杆菌中诱导蛋白表达
通过克隆到表达载体pRSET B(Invitrogen，Leek，NL)中的三种HC110-R片段——完全HC110-R cDNA没有TM结构域的N-末端以及第7个TM结构域后面的C-末端生产抗HC110-R蛋白的多克隆抗体，并因此使得所述片段的N-末端与6xHis标记融合，同时符合其读框。
用P84_ATG BamHI 5′-引物5′-CTG CCG GAT CCT CGG TTT AAT ACCAAC  ATG AGG-3′和P3121_TGA HindIII 3′-引物5′-GCA CTA AGC TTGACT GAA GCG CAC AAC CTC G-3′扩增HC110-R的完整的编码区，用P84_ATG BamHI 5′-引物(参见上文)和P1434_TGA HindIII 3′-引物5′-GGC TCA AGC TTA  TCA GAG AAC AAG CGA CAC GGC-3′扩增直到第一个跨膜结构域的N-末端，并且用P2486_ATG BamHI 5′-引物5′-CTA TCG GAT CCC AAC  ATG GCT GGC TCC CGT GAT ACC TCT AGG-3′和P3121_TGA HindIII 3′引物(参见上文)扩增始于第7个跨膜结构域之后的C-末端。所有三种质粒PCR的淬火温度最初是在56℃下进行5轮，然后在62℃下进行30轮。用酶BamHI和HindIII消化PCR产物，并且定向连接到同样用BamHI/HindIII线性化的pRSET B表达载体上。
在pRSET B载体上，表达是受细菌噬菌体T7的病毒启动子操纵的。因此，克隆是在不含T7 RNA聚合酶基因的XL1-Blue大肠杆菌菌株中进行的。然后将重组质粒转入表达T7聚合酶的BL21(De3)pLysS大肠杆菌细胞中，所述细胞还包括通过氯霉素抗性稳定化的质粒pACYC184，并且，所述细胞能表达少量的T7溶菌酶，一种T7 RNA聚合酶的天然抑制剂。由于所述细胞是受lacUV5启动子控制的，IPTG诱导会导致T7 RNA聚合酶表达，并因此还能诱导所述融合蛋白表达。
在相同的选择压力下，将具有所需HC110-R质粒的单一菌落从含有50μg/ml氨苄青霉素和35μg/ml氯霉素的新的LB平板上转移到50ml LB培养基中，并且在37℃下以280rpm的速度摇晃培养过夜，直到稳定期。然后将过夜培养物稀释到OD600＝0.3，并且继续在37℃下以280rpm的速度摇晃培养100ml培养物，直到OD600＝0.6-0.5。
取出一个OD600单位，并且对未诱导过的细胞进行短时间的离心，将沉淀的细胞分散在100μl的8M尿素裂解缓冲液，pH8.0，和50μl 4×RotiLoad缓冲液[Roth，Karlsruhe]中。将来诱导过的样品变性2分钟，通过在Sonifier B-12[Branson Sonic Power Company，Danbury，U.S.A.]中用数秒钟时间进行短时间的超声波脉冲，剪切基因组DNA，并且通过以14000rpm的速度离心3分钟使不溶性颗粒沉淀。
通过添加1mM IPTG诱导融合蛋白的表达，并且在37℃下对100ml培养物再进行3-4小时培养。在培养之后，在4℃下以5000rpm的速度[Heraeus-荧光离心机]对诱导过的细胞进行离心15分钟，用PBS洗涤沉淀，然后重新悬浮在8ml 8M尿素裂解缓冲液中。通过将所述细胞浸泡在液氮中，然后在37℃下融化3次破坏所述细胞。在第一次液氮处理之后，添加0.75mg/ml的溶菌酶。在液氮中进行最后一次冷冻之后，在16℃下培养20分钟，然后进行短时间的超声波脉冲处理，每次10秒，同时在冰水浴中冷却，直到所述溶液具有和水类似的粘度。在4℃下以13000rpm的速度离心10分钟[Beckmann J2-21；JS13.1转子]，取出150μl诱导过的样品，并且与50μl 4x RotiLoad缓冲液[Roth]混合，然后通过SDS-PAGE检查特定HC110-R蛋白片段的诱导和未诱导过的样品，然后进行考马斯染色或用小鼠抗His抗体进行Western印迹分析。
将剩余的上清液转移到一个新的试管中，并且在-20℃下保存以便通过亲和层析作进一步的纯化。
13.通过金属亲和层析纯化蛋白
富集是在变性条件下，使用IMAC系统(″固定化金属亲和层析″)在购自Clontech[Palo Alto，U.S.A.]的TALONspin柱上通过N-末端6x His标记进行的。所述柱中的树脂首先分别用5倍体积的8M尿素裂解缓冲液，pH8.0平衡，在4℃下以3000rpm的速度沉降4分钟，并且在室温下与HC110-R蛋白上清液一起轻轻摇晃培养20分钟。再次离心，然后用10倍柱体积的8M尿素裂解缓冲液，pH8.0，在室温下轻轻摇晃10分钟，并再次离心洗涤树脂3次。在最后一个洗涤步骤之后，将沉淀溶解在1ml的8M尿素裂解缓冲液中，并用于对所述柱进行加样，然后用3倍柱体积的8M尿素裂解缓冲液洗涤该柱2次，然后用含有咪唑的8M尿素裂解缓冲液洗脱出若干个级份，每个级份150μl。通过凝胶分析和Bradford蛋白测定测定所述级份中融合蛋白的含量。
14.通过亲和层析纯化蛋白
下面通过举例形式说明通过金属亲和层析纯化蛋白。富集是在变性条件下，使用IMAC系统(″固定化金属亲和层析″)在购自Clontech[Palo Alto，U.S.A.]的TALONspin柱上通过N-末端6x His标记进行的。所述柱中的树脂首先分别用5倍体积的8M尿素裂解缓冲液，pH8.0平衡，在4℃下以3000rpm的速度沉降10分钟，并且在室温下与HC110-R蛋白上清液一起轻轻摇晃培养20分钟。再次离心，然后用10倍柱体积的8M尿素裂解缓冲液，pH8.0，在室温下轻轻摇晃10分钟，并再次离心洗涤树脂3次。在最后一个洗涤步骤之后，将沉淀溶解在1ml的8M尿素裂解缓冲液中，并用于对所述柱进行加样，然后用3倍柱体积的8M尿素裂解缓冲液洗涤该柱2次，然后用含有咪唑的8M尿素裂解缓冲液洗脱出若干个级份，每个级份150μl。通过凝胶分析和Bradford蛋白测定，测定所述级份中融合蛋白的含量。
15.氨基酸序列分析
为了检查由cDNA完整克隆的HC110-R推测的氨基酸序列，将包括688bp(2486-3182号位置)和一个前导起始密码子和Kozak序列的3’末端克隆到pRSET B-表达载体上，并且通过添加1mM IPTG，诱导21kD蛋白(189AA)在感受态BL21(DE3)pLysS大肠杆菌细胞中的表达。在Talon基质上富集具有N-末端His标记的融合蛋白，并且通过Centrion试管浓缩并脱盐。由于具有N-末端His标记，1nM的21kD HC110-R蛋白的部分C-末端蛋白测序是用由TopLab(Martinsried)改进的Boyd(Boyd等1992)方法通过逐步Schlack-Kumpf降解(Schlack等1926)进行的。消除的氨基酸测序是在PROCISE 492氨基酸序列分析仪(PE Applied Biosystems，Weiterstadt)上进行的，并且用由ABI 140C微型梯度系统和ABI 785A UV/VIS检测仪组成的PROCISE C反相HPLC系统进行分析，并且用PROCISE C控制软件和ABI数据分析软件进行鉴定。
在37℃下，用2％胰蛋白酶(Roche Molecular Biochemicals，Mannheim)对25皮摩尔的21kD HC110-R蛋白进行内部裂解过夜。通过在用胰蛋白酶消化之后比较HC110-R标准层析图谱和胰蛋白酶空白消化的层析图谱，一共挑选四种肽片段，以便避免对胰蛋白酶自我裂解产物进行测序。通过由TopLab(Martinsried)按Hunkapiller等(1983)改进的逐步Edman降解方法，对这四个肽片段进行N-末端蛋白部分测序。分离裂解的肽片段，并且通过HPLC分离。将吸印到Immobilon上的肽级份导入PROCISE 492氨基酸测序仪(AppliedBiosystems，Weiterstadt)的反应室中，并且在140 C-PTH-分析仪和UV检测仪785 A(Applied Biosystems，Weiterstadt)上分离氨基酸。通过反相HPLC对氨基酸进行定量，并且通过与在测序分析之前建立的标准层析图比较驻留时间进行鉴定。
16.细胞培养物系
以下细胞培养物系是从德国微生物和细胞培养物保藏所GmbH[Braunschweig][Drexler等1995]购买的：
COS-7细胞(DSM：ACC 60)         -猴子，肾
HEK-293细胞(ATCC：CRL 1573)    -人，胚胎，肾
17.各种细胞培养物系的培养
在37℃下，在5％二氧化碳和95％湿度下，在110mm组织培养皿[Greiner，Solingen]中用10ml的培养基培养贴壁细胞系COS-7和HEK-293。通过在DMEM培养基中培养COS-7和HEK-293保持所述细胞培养物。所述培养基含有3.024g/l NaHCO3，10％FCS，50U/ml青霉素和50μg/ml链霉素，并且在使用之前加热到37℃。为了继代培养COS-7细胞，将其在4℃下保存2小时，然后用细胞刮棒将其从培养皿上机械分离。可以用玻璃移液管将HEK-293细胞直接从培养皿底部分离。
18.真核细胞的瞬时和稳定转染
将购自Roche Molecular Biochemicals[Mannheim]的非脂质体转染试剂FuGENE 6用于将外源DNA瞬时导入哺乳动物细胞(Kurachi等1998)。为此，将悬浮在2ml培养基中的大约0.5-1.5×105细胞放在35mm的组织培养皿上，在该培养皿中放有涂有1％明胶的无菌玻璃载玻片，以便随后用于共焦激光扫描显微分析。在37℃，5％二氧化碳和95％湿度条件下，将所述细胞培养过夜。在转染之前再次更换培养基。为了进行转染，对于每一种反应混合物，将3μl FuGENE 6[RocheMolecular Biochemicals]稀释在97μl的无血清培养基中，并且在室温下培养5分钟，对于每一种混合物来说，用移液管将100μl稀释过的FuGENE 6滴加到1-2μg质粒DNA(0.5-1μg/μl)上，并且在小心混合之后，在室温下再培养15分钟。然后，将完整的反应混合物滴加到所述细胞中，并通过轻轻转动培养皿均匀分布所述转染混合物。将所述细胞再培养1-2天，不更换培养基。每一种转染总是同时进行以下三种负对照：装有未转染过的0.5-1.5×105细胞的35毫米组织培养皿，将DNA但无FuGENE 6添加到第二个培养皿里面的转染混合物中，以及将FuGENE 6但无DNA添加到第三个培养皿中。
为了稳定转染，以正确读框将需要的质粒HC110-R克隆到稍稍修饰过的表达载体pSecTag A[Invitrogen，Leek，NL]或pIRESneo[Clontech，Palo Alto，U.S.A.]中。所述载体带有作为标记的抗性基因，以便在瞬时转染之后72小时分别添加Zeozin和G418或博来霉素48，以及随后每一次更换培养基时，只有能永久性表达所述抗性基因产物的成功转染的细胞能够成活。含有Zeozin和G418的选择培养基的最佳浓度是通过事先鉴定相应细胞系的系列稀释液确定的。
19.重组蛋白在哺乳动物细胞中的细胞定位
将HC110-R-DNA的完整编码区克隆到pEGFP-N3的HindIII/SalI位点上，以将HC110-R蛋白的C-末端连接在GFP(绿色荧光蛋白)上。137kDa的融合蛋白是在瞬时转化过的受体细胞系中表达的，通过Western印迹分析可以证实这一点。CLSM(共聚焦激光扫描显微分析)证实，HC110-R-GFP融合蛋白定位于COS-7和HEK-293细胞的细胞质中，并且还在较低程度上定位于细胞质膜上(还可参见图8)。
将装有Leica CLSM附加TCS NT(‘共聚焦激光扫描显微装置’Leica Lasertechnik，Heidelberg)1.5.451版的Zeiss IM 35显微镜(Zeiss Oberkochen)用于共聚焦激光扫描显微分析。用波长为488nm的氩激光激发GFP蛋白和异硫氰酸荧光素(FITC)的荧光，并且用波长为568nm的氪激光激发罗丹明，德克萨斯红，Phgcoerythrin，Alexa 568，LysoTracckerTMRed DND99，MitoTrackerTM Red CMX Ros和碘化丙锭的荧光。用1024×1024象素的分辨率和0.5μm的厚度对所述细胞的Z-系列的光学切片进行扫描(Giese等1995)。用AVS软件(Advanced Visual System Inc.，Waltham，M.A.，U.S.A.)进行评估，随后用Windows的Adobe Photoshop 5.0和CorelDraw 8.0进行评估。
通过用LysotrackerTM——用于标记酸性细胞系的探针——定位证实，所述融合蛋白特别定位于酸性溶酶体中。发现在靠近细胞核的部分含有HC110-R蛋白的小泡的数量增加。制备GFP和小鼠β2-肾上腺素能GPCR的融合蛋白作对照(保藏号X155643，Nakada等1989)，并且用它进行转染在细胞中产生了与HC110-R-GFP融合蛋白相同的分布形式(图8)。
20.用于瞬时表达的EGFP结构
用限制酶HindIII和SalI裂解载体pEGFP C1和pEGFP N3[Clontech，Palo Alto，CA，U.S.A.]。HC110-R完整长度cDNA的扩增是用P83EGFP-ATG HindIII 5′引物5′-GGT AGA AGC TTT TCG GTTTAA TAC CAA C AT  GAG G-3′和P3057EGFP_o.TGA SalI 3′引物5′-CTG TGT CGA CAA CAT TTC GCC AAT AGT TAG G-3′在65℃的退火温度下进行的。然后，同样用HindIII和SalI裂解PCR产物，并且连接，以便产生特定载体的HindIII和SalI裂解位点之间的开放读框，并且转化。所得到的具有N-末端GFP标记的融合蛋白被称为 GFP-HC110- R，而具有C-末端EGFP标记的被称为 HC110-R-GFP。通过以下方法将小鼠β2肾上腺素能受体(Gen Bank保藏号P18762；Nakada等1989)与C-末端EGFP标记融合：用P117小鼠β2AR XhoI 5′引物5′-TAC CTCGAG CTG CTA ACC TGC CAG CC A  TG-3′和P1349小鼠β2AR EcoRI 3′引物5′-TGT AGA ATT CTT CCT TCC TTG GGA GTC AAC GCT-3′扩增完整长度cDNA，使用55/60℃的退火温度，用限制酶XhoI和EcoRI裂解，并且连接到用XhoI-EcoRI线性化的pEGFP N3上。将事先用P70HumM1Rez XhoI 5′引物5′-ATA TCT CGA GAG CCC CAC CTA GCC ACCATG AAC A-3′和P1465HumM1Rez EcoRI 3′引物5′-GAC GAA TTC CATTGG CGG GAG GGA GTG CGG T-3′在55/60℃下扩增的人毒蝇碱性受体1的完整长度cDNA(huM1Rez；Gen Bank保藏号Y00508；Allard等1987)同样连接到XhoI-EcoRI裂解过的pEGFP N3载体上。所得到的具有开放读框的融合蛋白被称为 小鼠β 2 AR-EGFP和 huM1Rez-EGFP。
21.用于稳定或瞬时转染的HC110-R-MycHis标记结构
载体pMyc6xHis是通过用限制酶NhiI和SfiI进行双重消化，然后补平末端，并且重新连接由载体pSecTagA[Invitrogen，Leek，NL]产生的。用PCR引物P83MycTag_ATG BamHI 5′引物5′-ATA GGA TCCTTC GGT TTA ATA CCA AC A  TGA GG-3′和P3058MycTag_o.TGA XbaI3′引物5′-CCT GTC TAG AAA CAT TTC GCC AAT AGT TAG G-3′在56-60℃的退火温度下扩增HC110-R的编码区，用酶BamHI和XbaI裂解，并且连接到同样用BamHI-XbaI线性化的pMyc6xHis载体上，并且转染到大肠杆菌DH5α细胞中。然后用该结构稳定转染COS-7细胞，并且在Zeocin选择压力下保持。
与此同时，用引物P83_ATGNotI-5′5′-ATA TTG CGG CCG CTT CGGTTT AAT ACC AAC  ATG-3′和pMycHis_TGABamHI-3′5′-CGC GGA TCCTAG AAG GCA CAG TCG AGG-3′扩增HC110-RMycHis-cDNA，然后裂解，并且连接到同样用BamHI和NotI限制消化过的双顺反子表达载体pIRES1neo(GenBank保藏号U89673)[Clontech，Palo Alto，U.S.A.]上。pIRESlneo载体还包括一个位于新霉素抗性基因的起始ATG上游不远处的脑心肌炎病毒(ECMV)的内部核糖体结合位点(IRES)(Rees等1996)。这样，只从具有人巨噬细胞病毒(CMV)启动子的一个mRNA翻译出了HC110-R和抗生素抗性标记的两种开放读框(Jackson等1990；Jang等1988)。通过COS-7和HEK-293细胞中的G418进行选择[Calbiochem-Novabiochem，La Jolla，CA，U.S.A.]。
22.共聚焦激光扫描显微分析
将装有Leica CLSM附加TCS NT(‘共聚焦激光扫描显微装置’Leica Lasertechnik，Heidelberg)1.5.451版的Zeiss IM 35显微镜(Zeiss Oberkochen)用于共聚焦激光扫描显微分析。用波长为488nm的氩激光和波长为568nm的氪激光激发荧光。用1024×1024象素的分辨率和0.5μm的厚度对所述细胞的Z-系列的光学切片进行扫描(Giese等1995)。用AVS软件(Advanced Visual System Inc.，Waltham，M.A.，U.S.A)进行评估，随后用Windows的AdobePhotoshop 5.0和Corel Draw 8.0进行评估。
23.研究α-LTX与HC110-R片段的结合
通过SDS-PAGE(Lammli等，1970)分离蛋白(20μg/泳道)，并且电吸印到硝酸纤维素膜上，在α-LTX结合实验中，将印迹与浓度为20nM的α-LTX一起在TST中在室温下培养2小时。用TST洗涤3次，然后使用浓度为0.1μg/ml的抗α-LTX抗体(来自兔子Calbiochem-Novabiochem)和与过氧化物酶缀合的直接抗IgG的抗体(来自山羊，稀释比1∶25000)。在所有实验中用ECL(Amersham-Pharmacia)检测所述抗体，还可参见图9。
24.钙成像
在用HC110-R-EGFP-或β2-AR-EGFP结构瞬时转染过的COS-7和HEK293细胞中测定细胞内游离Ca2+的浓度[Ca2+]i(还可参见图11)。在每一种情况下，都将2×105个COS-7和HEK293细胞添加到涂有1％凝胶的42毫米盖玻片上，所述盖玻片放置在装有5ml DMEM培养基(含有10％FCS和pen/strep)的55mm组织培养皿中。转染是借助于非脂质体转染试剂FuGENE 6[Roche Molecular Biochemicals，Mannheim]进行的。所述转染需要首先用6μl FuGENE 6，在不含FCS的200μl DMEM培养基中，在室温下培养5分钟，然后增加4μg质粒DNA，在室温下再培养15分钟，然后通过移液管将所有转染混合物滴加到所述细胞上。将在其正确读框中融合了GFP标记的HC110-R完整长度克隆的结构以及同样在其3’末端具有GFP标记的β2-肾上腺素能受体的完整cDNA用于转染。用4μg纯的pEGFP-N3表达载体[Clontech，Heidelberg]的质粒DNA和添加过转染试剂FuGENE 6但没有DNA的未转染过的细胞作对照。
在37℃，5％CO2和95％湿度条件下，在Na+-HBS溶液(150mM NaCl；5.4mM KCl；1.8mM CaCl2；0.8mM MgSO4·7H2O；20mM葡萄糖；溶解于H2O中的20mM Hepes，pH7.3)中转染30分钟，在转染之后48小时用1μM Fura-2/乙酰氧基甲酯(Fura-2/AM)[Sigma，Deisenhofen]加载所述细胞。在培养之后，在倒置显微镜[Zeiss，Aciovert；Germany]下检查加载了Fura-2/AM的细胞，与此同时，在一台数字成像荧光显微镜(PTI)上观察，分别以440和490nm的波长分辨转染过的和未转染过的细胞。通过固定ROI(感兴趣的区域)平均各选择了5-7个转染过的细胞和未转染过的细胞，在340nm(钙结合Fura-2/AM)和380nm(无Fura-2/AM)波长下激发，并且在510nm波长下测定发射。用Image Master 1.x软件进行评估，包括计算340∶510nm，380∶510nm的商数，并且将340/380∶510nm的比例(背景纠正图象)作为所添加试剂的函数。
一般总是在开始测定之后6分钟添加试剂，包括取出适当体积的Na+-HBS缓冲液，并且通过移液管将试剂直接添加到所述样品容器中，再培养30-50分钟。在实验中，样品容器中的总体积稳定在1.5ml。首先将30nM和75nMα-娄蛛毒素[α-LTX，RBI.Natick，U.S.A.]添加到表达HC110-R-GFP融合蛋白的COS-7细胞中，并且向表达HC110-R-GFP的HEK-293细胞中添加各种浓度的α-LTX(7.5nM；25nM；50nM，75nM，90nM和120nM)，以便确定剂量依赖性，或加入各种浓度的环缩酚肽BAY44-4400(100ng/ml(89.3nM)，333ng/ml(297nM)；400ng/ml(357nM)，1μg/ml(893nM)，10μg/ml(8.9μM)，在0.1％的DMSO中)添加到能，以便确定最佳活性浓度，在每一种情况下都是在开始实验之后6分钟添加的。在某些实验中，用4或400ng/ml BAY44-4400或用没有驱蠕虫活性的4或400ng/ml的光学对映体PF1022-001在Na+-HBS中，在37℃、和5％CO2和97％湿度下预培养HEK-293细胞90分钟，并且在60分钟之后通过向BAY44-4400溶液或PF1022-001中添加1μM Fura-2/AM，用剩余的30分钟对所述细胞进行加载。将所述细胞导入有关装置，然后在开始实验之后6分钟添加75nMα-LTX。用能表达具有C-末端GFP标记的β2-肾上腺素能受体(β2-R-GFP)的HEK-293细胞测得75nM的最佳α-LTX浓度。将CdCl2(在每种情况下为1μM和10μM)溶解在Na+-HBS中，并且将硝苯地平(15μM)和EGTA(2mM)溶解在0.1％DMSO中。在开始实验之后，添加α-LTX之前马上添加CdCl2和硝苯地平，而EGTA是在实验开始时和添加α-LTX之后4分钟添加的。溶解的α-LTX以300nM的浓度存在于50mM Tris-HCl，pH8.0中；BAY44-4400最初是溶解在纯的DMSO(0.004-10μg/ml的母液)中。用Na+-HBS缓冲液将母液调整到需要的浓度。通过在Na+-HBS中建立一系列的稀释液发现可以溶解在最终浓度为0.1％DMSO中的活性物质BAY44-4400的最大量。在所选择的浓度下，0.1％DMSO和任何其他测试成分都不会与Fura-2/AM相互作用。
用Excel 98表格计算程序分析有关数据。结果来自至少2-4次重复实验，在每一次实验中都使用4-8个转染过的和未转染过的细胞。
在通过McCormack等(1991)的方法预先进行校正之后，通过Grynkiewicz等(1985)的方法计算细胞内钙浓度。
25.PF1022A与HC110-R的结合
通过下面的SDS-PAGE配体沉淀和分析流式细胞测定证实PF1022A和吗啉衍生物BAY44-4400与HC110-R的结合。还希望验证PF1022A及其衍生物是否能像α-LTX那样在HC110-R转染过的HEK-293细胞中导致[Ca2+]i浓度改变，或者能影响HC110-R介导的α-LTX信号传导。
有时候，在免疫荧光中能产生明确信号的抗体或蛋白在用于免疫吸印方法中时没有反应。由于蛋白变性是进行SDS-PAGE所必须的，可能会破坏构像决定表位，因此，能专一识别所述表位的抗体或蛋白就不再能结合。因此，在Western印迹中HC110-R与生物素化的活性物质PF1022A和与比PF1022A的溶解度更高的吗啉衍生物BAY44-4400的特异性结合都无法鉴定。BAY44-4400与PF1022A的差别在于两个吗啉残基，这两个残基与PF1022A的两个D-苯基乳酰基团的苯环共价结合。不过，如果在SDS分离凝胶中用尿素对所述蛋白进行复性的话，就可以在Western印迹中检测HC110-R的专一性结合，尿素能够通过消除疏水性相互作用除去部分SDS。为此，通过SDS-PAGE对来自未转染过的HEK-293细胞、来自瞬时表达HC110-R-Myc/His的293细胞，以及来自在大肠杆菌中表达的HC110-R的54kDa N-和21kDa C-末端的总蛋白进行分离、复性并且用常规方法吸印。在用配体BAY44-4400培养之后，用兔抗PF1022A-KLH免疫血清和山羊抗兔IgG-HRP抗体进行免疫检测。另外，对含有未转染过的、用HC110-R-Myc/His瞬时转染过的HEK-293细胞和在大肠杆菌中表达的HC110-R的N末端和来自捻转血矛线虫的总蛋白的蛋白级份的部分复性的SDS聚丙烯酰胺凝胶进行吸印，用PF1022A-生物素培养，并且用抗生蛋白链菌素HRP检测，两个印迹中的每一个都表现出能稳定表达HC110-R-Myc/His的HEK-293细胞中具有大小为116kDa的独特带，而在未转染过的细胞的泳道上没有出现这样大小的带。另外，吗啉衍生物BAY44-4400和生物素化的PF1022A都能结合HC110-R的54kDa N-末端，但是21kDa C-末端没有表现出专一性的PF1022A结合。用生物素化的PF1022A在来自成体捻转血矛线虫的总蛋白级份中一共能检测到两条带：一条带的大小为110kDa，而另一条的大小为大约88kDa。后者极有可能是生物素化的蛋白，如对于线虫Heterakis spumosa已披露过，具有83kDa，特别是，与大小为110kDa的带不同，在仅使用抗生蛋白链菌素HRP的条件下也能进行检测。另一方面，在单独使用抗生蛋白链菌素HRP时，用HC110-R-Myc/His稳定转染过的HEK-293细胞不再出现大小为116kDa的带。另外，还有可能排除由山羊抗兔IgG-HRP二级抗体本身导致的非专一性信号。
为了进一步验证上述结果，进行以下配体沉淀。将2mg和4mg磁性Dynal M-280抗生蛋白链菌素结合的小球与500μg生物素化的PF1022A混合。在与4mg Dynal小球混合的对照混合物中，用TST缓冲液取代PF1022A。在添加在大肠杆菌中表达的事先通过亲和层析纯化的HC110-R N-末端和C-末端的混合物之前，通过磁力分离除去多余的PF1022A-生物素。在再次磁力分离以便除去未结合的HC110-R片段之后，通过SDS-PAGE分离来自2mg和4mg Dynal小球的一等份式样，并且吸印。沉淀的检测是通过N-末端融合的His标记用小鼠抗HisIgG和兔抗小鼠IgG-HRP抗体进行的。只有HC110-R的N-末端54kDa部分是通过PF1022A沉淀的，而没有结合PF1022A的HC110-R的C-末端预先通过磁力分离除去。通过向反应混合物中添加非生物素化的PF1022A排出HC110-R的N-或C-末端与抗生蛋白链菌素结合的小球的非专一性结合。
另外，通过FACS分析检验了配体PF1022A在体内与HC110-R的结合(图13)。为此，用HC110-R-GFP或GFP-HC110-R瞬时转染HEK-293细胞，或者用HC110-R-Myc/His和GFP瞬时共转染。用未转染过的HEK-293细胞或β2-R-GFP或M1-R-GFP瞬时转染过的HEK-293细胞作对照。在转染之后24小时，用生物素化的PF1022A培养细胞，并且用抗生蛋白链菌素-Phycoerythrin检测-PF1022A结合的细胞，并最终固定。仅用抗生蛋白链菌素-Phycoerythrin培养用HC110-R-GFP转染的细胞的负对照，而不使用PF1022A-生物素。
用FACScan以488nm的激发波长对10000 HEK-293细胞进行荧光分析，分析其细胞大小，粒度和荧光染色。与TRITC相似，Phycoerythrin具有与EGFP重叠的吸收光谱，而发射光谱是充分分开的，这样两种荧光色素能够在一种波长下激发。通过在主要细胞群体上设置一个闸门(Gate)，在测定荧光强度时排出细胞碎片。为了进行定量评估，根据未转染过的和GFP转染过的细胞固定阴性、未染色的和阳性GFP荧光细胞的极限。从其他GFP荧光样品中扣除4.6％的绿色荧光的未转染过的HEK-293细胞(自发荧光)；并且从所有红色荧光细胞中扣除由Phycoerythrin结合的抗生蛋白链菌素非专一性染色的细胞的值(5.4％)(表1)。
表1：通过FACScan检测PF1022A与用HC110-R转染过的HEK-293细胞的结合
质粒   GFP-荧光 Phycoerythrin-荧光
未转染   0±0％ 0±0％
GFP   17,0±0,5％ 1,3±0,4％
HC110-R-GFP   10,9±0,2％ 4,5±0,4％
GFP-HC110-R   9,4±2,5％ 2,5±0,3％
β2-R-GFP   7,6±0,4％ 0,8±0,1％
M1-R-GFP   8,2±0,7％ 1,6±0,1％
HC110-R-Myc/His+GFP   23,1±2,3％ 10,3±0,7％
如果计算在扣除自发荧光和由抗生蛋白链菌素-Phycoerythrin产生的非专一性红色染色之后还能产生红色荧光的绿色荧光细胞的百分比，发现41.2％的表达HC110-R-GFP的细胞，26.8％的表达GFP-HC110-R的细胞，和44.5％的用HC110-R-Myc/His和GFP共转染的细胞能结合PF1022A，而只有7.5％的表达GFP的细胞，9.9％的表达β2-R-GFP的细胞，和19.2％的表达M1-R-GFP的细胞结合PF1022A(图13)。
26.PF1022A衍生物与HC110-R介导的α-LTX信号传导的相互作用
根据线虫的种类，PF1022A表现出10-9-10-3mg/ml的体外神经药理学活性。为了检测HC110-R对PF1022A及其衍生物的任何干扰以及由HC110-R介导的α-LTX信号传导，用Ca2+成像方法研究BAY44-4400(PF1022A的一种更可溶的吗啉变体)对能瞬时或稳定表达HC110-R的HEK-293细胞的作用。用PF1022A的光学对映体PF1022-001作对照，这种对映体在体外和体内的活性比PF1022低100倍。首先将BAY44-4400和PF1022-001溶解在纯的DMSO中，因为这两种物质具有疏水性。选择母液浓度，以便在实验混合物中总是只存在0.1％的DMSO。在对照实验中，可以排除高达并且包括0.1％的DMSO浓度在使用未转染过的HEK-293细胞和用HC110-R-GFP转染过的HEK-293细胞进行的实验的实验结果的影响(图14A)。一方面，用100，300或400ng/ml和1或10μg/ml BAY44-4400刺激负载Fura-2的未转染过的细胞和用HC110-R-GFP转染过的细胞，另一方面，用相同浓度的PF1022-001刺激。在任一种浓度下，在为期50分钟的整个实验期间都没有可检测的Ca2+介导的反应。图14B和C通过举例形式证实了400ng/ml BAY44-4400和PF1022-001对用HC110-R-GFP和M1-R-GFP转染的细胞的刺激作用。由于PF1022A衍生物还有可能被所述细胞吸收，并因此有可能干扰二级信号传导途径，并且由于PF1022A衍生物根据寄生虫的类型能在幼虫体内维持较长时间，在某些实验中，需要用所述衍生物预培养所述细胞90分钟。用4ng/ml或400ng/mlBAY44-4400或PF1022-001预培养了90分钟的细胞没有出现[Ca2+]i的变化(图14D)。在直接添加浓度为300ng/ml BAY44-4400和上述浓度的该化合物时，与所述光学对映体不同，可以在放大40倍的监测装置上观察所述细胞略有膨胀，不过，这种膨胀在几分钟之内就恢复了，这是所述驱蠕虫剂在用HC110-R-GFP转染过的HEK-293细胞中的直接作用的结果。
最近的实验业已证实，在用Heterakis spumosa进行的体外和体内实验中，哌嗪能协同增强PF1022A/BAY44-4400的作用。当同时提供400ng/ml BAY44-4400和1或10μM哌嗪(图14F)时，在未转染过的HEK-293细胞和用HC110-R-GFP瞬时转染过的HEK-293细胞中检测不到[Ca2+]i浓度的变化。含有10μM哌嗪的对照混合物同样不会导致未转染过的和HC110-R-GFP转染过的细胞中Ca2+平衡的改变(图14E)。
与此不同，在存在75nMα-LTX的条件下，BAY44-4400和光学对映体PF1022-001都能影响表达HC110-R-GFP的HEK-293细胞中由α-LTX诱导的信号传导，不过，影响的程度有所不同(图14B-E)。在对照实验中，在刺激之前6分钟用75nMα-LTX，0.1％DMSO处理用HC110-R-GFP或M1-R-GFP转染过的细胞，可以排除以后一种浓度用于溶解BAY44-4400和PF1022-001的溶剂对α-LTX诱导的[Ca2+]i浓度变化所产生的影响。与表达M1-R-GFP的细胞不同，在添加α-LTX之后，表达HC110-R-GFP的细胞表现出上文所述的双相特征，具有相当的[Ca2+]i浓度值。在添加α-LTX之前6分钟用4ng/ml BAY44-4400培养表达HC110-R-GFP的细胞能减小所述α-LTX对[Ca2+]i浓度的影响：由α-LTX诱导的[Ca2+]i浓度的第一次小的提高消失，在添加α-LTX之后14分钟出现的第二个推迟的高峰降低到44±6.0nM Ca2+(图15B)。在存在4ng/ml PF1022-001的条件下(是在用α-LTX刺激之前6分钟添加的)Ca2+会迅速增加103±11.5nM(图15B)。与添加4ng/ml BAY44-4400类似(图15B)，在添加α-LTX之前6分钟向表达HC110-R-GFP的细胞中添加400ng/ml BAY44-4400能在23分钟之后出现推迟了的49±4.2nM的[Ca2+]i浓度的增加，它在8分钟后降到与原始值相比略微提高了11±1.4nM的水平上(图15C)。在用75nMα-LTX培养之前6分钟添加400ng/ml PF1022-001，会导致Ca2+的快速增加，增加量为112±14.3nM(图15C)，与前面通过添加4ng/ml PF1022-001所观察到的结果类似(图15B)。在另一种实验设计中，在每一种情况下都用4ng/ml(图15D)或400ng/mlBAY44-4400或PF1022-001(图15E)预培养表达HC110-R-GFP的HEK-293细胞90分钟。在所述培养和用Fura-2/AM加载所述细胞之后，小心洗去没有被结合或吸收的活性物质，然后用75nMα-LTX刺激所述细胞。用光学对映体PF1022-001预培养过的用HC110-R转染过的细胞在用4ng/ml PF1022-001处理时表现出[Ca2+]i有102±6.4nM(图15D)，并且在用400ng/ml处理时表现出Ca2+浓度有109±8.4nM的增加(图15E)。Ca2+的这种增加在添加α-LTX之后几分钟内就出现，它类似于前面在图15B和C中当PF1022-001在用α-LTX刺激之前直接添加时出现的Ca2+浓度的快速变化。相反，BAY44-4400表现出与α-LTX诱导的Ca2+流入不同的反应：在用4ng/ml BAY44-4400预培养表达HC110-R-GFP的细胞90分钟时，由α-LTX诱导的[Ca2+]i浓度的95±20.5nM的最大增加值出现在第10分钟，然后又回落到[Ca2+]i浓度提高了23±2.6nM的延伸的平台部分(图15D)。在用400ng/ml BAY44-4400预培养时，在用α-LTX刺激之后[Ca2+]i浓度的最大增加值为65±7.5nM(图15D)，而且，与用4ng/mlBAY44-4400预培养相比这种增加还推迟了12分钟(图15C)。
如果在添加α-LTX之前6分钟，向稳定表达HC110-R-Myc/His的HEK-293细胞中添加400ng/ml BAY44-4400，能完全抑制马上出现的[Ca2+]i的267±45.8nM的增加(图15F)。与此相反，添加400ng/mlPF1022-001不会导致Ca2+浓度的显著变化，Ca2+浓度的增加为209±33.4nM(图15F)。
为了证实BAY44-4400在表达HC110-R细胞中对α-LTX介导的Ca2+信号传导的专一性影响，进行了以下对照实验：首先，在有和没有400ng/ml BAY44-4400的条件下，用1mM氯化氨甲酰胆碱(卡巴胆碱)-毒蝇碱性乙酰胆碱受体的配体-刺激未转染过的HEK-293细胞(图15G)。在这两种情况下存在类似的由内源天然毒蝇碱性乙酰胆碱受体导致的规模相当的[Ca2+]i浓度的尽快增加，对于HEK-293细胞来说，在有BAY44-4400的条件下增加值为58±8.1nM Ca2+，而在没有所述驱蠕虫剂的条件下增加值为53±6.8nM Ca2+。与未转染过的细胞相比(图15G)，用C-末端与GFP融合的人毒蝇碱性M乙酰胆碱受体(M1-R-GFP)其他瞬时转染的HEK-293细胞会出现Ca2+浓度的小的增加，在有400ng/ml BAY44-4400的条件下增加值为89±5.5nM，而在没有这种物质的情况下增加值为85±6.1nM Ca2+(图15H)。没有发现BAY44-4400对M1-R-GPCR有任何显著的影响。与上述卡巴胆碱处理相似，在有和没有400ng/ml BAY44-4400的条件下，用1mM异丙肾上腺素刺激未转染过的HEK-293细胞中的内源存在的天然β2-肾上腺素能受体，或用1mM槟榔碱刺激烟酸受体，同样不会导致[Ca2+]i浓度的显著差异(图15I)。在有BAY44-4400的条件下异丙肾上腺素能导致Ca2+浓度增加45±4.7nM，而在没有BAY44-4400的条件下能导致48±5.7nM Ca2+的增加。在槟榔碱刺激之后，在有BAY44-4400的条件下Ca2+增加了28±4.1nM，而在没有所述活性物质的情况下Ca2+增加了27±3.5nM(图15I)。
27.获得抗体
通过采用雌性NMRI小鼠以及兔获得抗体(Chinchilla-Bastarde)。为了对NMRI小鼠进行免疫，将3×15μg的纯化的21kDC-末端HC110-R蛋白片段与100μlFCA一起分别溶解在100μl PBS-中，并且在第1、8和15天皮下注射到两只新生NMRI小鼠体内。在第23天采集血样并且获得血清。
为了获得血清，首先在37℃将通过心脏穿孔获得的血液培养1小时。然后在4℃下培养至少2小时。然后分两次在4℃以3000rpm的速度在Beckman GPKR离心机中离心10分钟使细胞成分沉淀，并且在56℃下用45分钟时间使上清液失活。在4℃下以13000rpm的速度在Heraeus Biofuge 15R中再离心10分钟，然后就可以取出血清并且在-20℃下保存待用。
在第一次血样采集并获得预免疫前血清之后，首先给两只兔子皮下注射50μg的C-末端21kDHC110-R蛋白，和54kD N-末端HC110-R蛋白，所述蛋白悬浮在由等量PBS-和FCA组成的悬浮液中。在首次免疫接种之后第31和79天分别用100μg的抗原再进行两次免疫。第一次采集血样在第43天进行，在首次免疫接种之后第98天第2次采集血样并获得血清。
附图说明
图1：HC110-R mRNA和蛋白
A)用来自捻转血矛线虫的总RNA和HC110-R的3.6kbp cDNA进行的Northern印迹分析。
B)体外翻译的35S标记的HC110-R蛋白的10％SDS-PAGE荧光图谱。体外翻译1μg体外转录的HC110-R mRNA(HC110-R)，负对照不含HC110-R mRNA(对照)，用1μg荧光素酶mRNA作正对照(荧光素酶)。
图2：HC110-R的完整长度cDNA序列和衍生的氨基酸序列
在HC110-R(GenBank保藏号AJ272270)的Kozak基序(Kozak，1989)和聚腺苷酸化信号下面划线；将100号位置上的起始密码子加粗。信号肽(1-21号残基，加粗)，凝集素样序列(22-125号残基，点划线)；Thr片段(128-147号残基，灰色背景)；结构CX9WX12CX9WXCX5WX9CX3W富含半胱氨酸区(166-221号残基，波浪线，另外将Cys和Trp残基加粗)；结构CXWWX6WX4CX11CXC的4-Cys区(478-524号残基，虚线，另外将Cys和Trp残基加粗)；7个跨膜区(563-772号残基，加粗并且加下划线)；富脯氨酸片段(845-861号残基，灰色背景)；PEST区(915-933号残基，灰色背景)；N-糖基化位点(26，499和862号残基，加粗)；胰泌素GPCRs之间的Cys-Cys对的高度保守的推测的二硫键(595和666号位置，加粗并且加双下划线)。
图3：捻转血矛线虫HC110-R和克氏病粘粒克隆B0457(CE-B0457： GenBank保藏号Z54306)的衍生的氨基酸序列的比较
信号肽(SP，1-21号残基，加粗)，凝集素样序列(凝集素，22-125号残基，点划线)；Thr片段(富T区，128-147号残基，灰色背景)；结构CX9WX12CX9WXCX5WX9CX3W的富Cys区(C标记，166-221号残基，波浪线，另外将Cys和Trp残基加粗)；结构CXWWX6WX4CX11CXC的4-Cys基序(4C区，478-524号残基，虚线，另外将Cys和Trp残基加粗)；7个跨膜区(563-772号残基，加粗并且加下划线)；富Pro片段(富P区，845-861号残基，灰色背景)；PEST区(PEST，915-933号残基，灰色背景)；N-糖基化位点(26，499和862号残基，加粗)；胰泌素GPCRs之间的Cys-Cys对的高度保守的推测的二硫键(595和666号位置，加粗并且加双下划线)。相同的氨基酸用星号标出，关系非常密切的氨基酸用冒号标出，相关的氨基酸用单一的点标出。
图4：7-跨膜受体HC110-R和胰泌素亚科的若干种其他受体的比 较
HC110-R：捻转血矛线虫七螺旋孤独跨膜受体(保藏号AJ272270)；BTLAT3：Bos taurus Latrophilin-3(若干种剪接变体，保藏号G4164053-G4164075)；RNLAT1：Rattus norvegicusLatrophilin-1(保藏号U78105，U72487)；MMEMR1：Mus musculusEMR1激素受体前体(保藏号Q61549)；HSCD97：智人(Homo Sapiens)白细胞激活抗原CD97(保藏号P48960)；MMCADH：M.musculus钙粘着蛋白7-跨膜受体前体(保藏号G3800738)；XLXRF1：Xenopuslaevis促肾上腺皮质素释放受体前体(保藏号042602)；RNVIP1：R.norvegicus血管活性肠多肽受体前体2(保藏号Q02643)。将所述7个跨膜结构域涂成灰背景(I-VII)，而高度保守的推测的二硫键被加粗。
图5：捻转血矛线虫HC110-R和R.norvegicus Latrophilin- 1(GenBank保藏号U78105，U72487)的衍生的氨基酸序列的比较
信号肽(SP，1-21号残基，加粗)，凝集素样序列(凝集素，22-125号残基，点划线)；Thr片段(富T区，128-147号残基，灰色背景)；结构CX9WX12CX9WXCX5WX9CX3W的富Cys区(C标记，166-221号残基，波浪线，另外将Cys和Trp残基加粗)；结构CXWWX6WX4CX11CXC的4-Cys基序(4C区，478-524号残基，虚线，另外将Cys和Trp残基加粗)；7个跨膜区(563-772号残基，加粗并且加下划线)；富Pro片段(富P区，845-861号残基，灰色背景)；PEST区(PEST，915-933号残基，灰色背景)；N-糖基化位点(26，499和862号残基，加粗)；胰泌素GPCRs之间的Cys-Cys对的高度保守的推测的二硫键(595和666号位置，加粗并且加双下划线)。相同的氨基酸用星号标出，关系非常密切的氨基酸用冒号标出，相关的氨基酸用单一的点标出。
图6：HC110-R蛋白和小鼠Latrodhilin-1的结构
A)具有7个跨膜结构域的HC110-R的疏水性吸印。
B)HC110-R的蛋白结构具有以下特有基序：信号序列(SP)，凝集素结构域(凝集素)，Thr片段(T片段)，Cys基序(标记)，4-Cys区(4C区)，7个跨膜结构域(1-7，黑色)，富Pro基序(富P区)和PEST序列(PEST)。推测的糖基化位点标在图下(N)，其中还标出了4C区的Cys残基以及推测的二硫键的两个保守的Cys残基(细线条，没有大写字母)。
C)Latrophilin-1的蛋白结构。Latrophilin-1没有Thr片段，但是包括一个额外的Olfaktomedin结合基序(olfactomedin)，一个Pro-Thr区(P-T区)，一个接头基序(接头)和一个包括若干重复的长的片段(长)。
图7：HC110-R-GFP在HEK-293和COS-7细胞中的表达
A)在转染之后24小时通过三唑方法从用GFP(GFP)或HC110-R-GFP(HC110-R)瞬时转染过的HEK-293细胞和COS-7细胞和未转染过的(n.t.)HEK-293细胞和COS-7细胞中分离总蛋白。
B)在转染之后24小时，通过三唑方法从用β2-R-GFP(β2-R)或M1-R-GFP(M1-R)瞬时转染过的HEK-293细胞和未转染过的(n.t.)HEK-293细胞中分离总蛋白。SDS-标记带在116，90，70和55kDa(标记)。
以每个泳道20μg的总蛋白量在10％SDS聚丙烯酰胺凝胶上分离，并且吸印到硝酸纤维素膜上。在RotiBlock溶液中封闭过夜，然后通过ECL系统用单克隆小鼠抗GFP IgG一级抗体(0.4μg/ml)和单克隆兔抗小鼠IgG-HRP二级抗体(1∶25000)进行免疫检测。
图8：通过CLSM在转染过的COS-7细胞中对HC110-R和β 2 -R进 行细胞定位
用具有C-末端GFP标记的HC110-R-GFP和β2-R-GFP转染COS-7细胞。在转染之后24小时进行CSLM。标度相当于10μm。
A)HC110-R-GFP是在质膜和细胞质腔室中表达的。在细胞核附近可以看到细胞质小泡的增多。
B)通过酸性溶酶体对绿色HC110-R-GFP蛋白进行CSLM共定位，在37℃下用LysoTracker Red DND-99染色1小时。
C)β2-R-GFP转染的细胞表现出与HC110-R-GFP转染的细胞类似的GFP荧光图案，或者如在(A)项目中所述。可以将所述受体定位于质膜和小泡中，并且在某些场合下用酸性脂质体共定位，所述溶酶体在37℃下用LysoTracker Red DND-99染色1小时。
D)在某些场合下，表达的β2-R-GFP与用单克隆抗KDEL抗体染色的内质网共同定位。
图9：α-娄蛛毒素与HC110-R的结合
A)在10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离从Latrodectus revivensis毒液腺中分离的5μg总蛋白(1)，纯的130kDa α-LTX(2)，以及来自用存在于pIRESlneo载体上的HC110-R-Myc/His结构稳定转染过的HEK-293细胞的40μg总蛋白(3)，来自未转染过的细胞的40μg总蛋白(4)，来自在大肠杆菌中诱导的HC110-R的54kDa N-末端的40μg总蛋白(6)和21kDa C-末端的40μg总蛋白(7)，吸印并且封闭过夜。将变性的蛋白与20nMα-LTX一起培养2小时，并且用兔抗α-LTX IgG-HRP抗体(1∶5000)，山羊抗兔α-LTX IgG-HRP抗体(1∶25000)和ECL系统检测α-LTX的可能的结合。
B)在10％DS-聚丙烯酰胺凝胶上分离各自为40μg的来自在大肠杆菌中诱导的HC110-R的C末端(1)和N末端(2)，和未转染过的HEK-293细胞(3)，以及用HC110-R-Myc/His稳定转染过的HEK-293细胞(4)，和成体捻转血矛线虫的总蛋白，并且用含有4M尿素的复性缓冲液进行部分复性。将所述印迹封闭过夜，与20nM纯的α-LTX一起培养，并且用兔抗α-LTX IgG抗体(1∶5000)，生物素蛋白A(1∶100)，抗生蛋白链菌素过氧化物酶(1∶3000)和ECL系统检测α-LTX结合的蛋白。
图10：α-LTX对HC110-R介导的Ca2+ 信号传导的剂量依赖性
在用HC110-R-GFP转染之后48小时，用1μM Fura-2/AM对HEK-293细胞进行加载30分钟。在开始测定之后6分钟用各种浓度的α-LTX再刺激所述细胞44分钟。测定340/380nm商数(比例)作为时间的函数。所挑选的细胞的数量用n表示。
A)用7.5nM(黑色线条)或25nMα-LTX(灰色线条)刺激表达HC110-R-GFP的细胞。
B)将50nM(灰色线条)或75nMα-LTX(黑色线条)添加到表达HC110-R-GFP的细胞中。
C)用90nM(灰色线条)或120nMα-LTX(黑色线条)刺激表达HC110-R-GFP的细胞。
D)将以nM为单位的[Ca2+]i在横坐标上作图，并且将用于刺激表达HC110-R-GFP的HEK-293细胞的第一次快速峰(第1个峰，灰色线条)，和第2个推迟的峰(第2个峰，黑色线条)的α-LTX浓度(0，7，5，25，50，75，90和120nM)在纵坐标上作图。
图11：HC110-R转染过的HEK 293细胞的Ca2+ 成像
A)具有C-末端GFP标记的HC110-R(HC110-R-GFP)：黑色线条
具有N-末端GFP标记的HC110-R(GFP-HC110-R)：灰色线条。
B)75nMα-LTX与未转染过的HEK-293细胞(n.t.，黑色线条)和GFP转染过的细胞(GFP，灰色)。
C)75nMα-LTX与用C-末端标记的人M1毒蝇碱性乙酰胆碱受体转染过的细胞(M1-R-GFP，灰色线条)，以及用C-末端标记的小鼠β2-肾上腺素能乙酰胆碱受体转染过的细胞(β2-R-GFP，黑色线条)。
D)在添加α-LTX(75nM)之前6分钟，用2mM EGTA处理用HC110-R-GFP转染过的细胞(+EGTA，灰色线条)。在对照中去掉了EGTA(-EGTA，黑色线条)。
E)在添加α-LTX(75nM)之后10分钟添加2mM EGTA(+EGTA，灰色线条)。在对照混合物中不添加EGTA(-EGTA，黑色线条)。
F)作为对照，将未转染过的(n.t.，灰色线条)和表达HC110-R-GFP的细胞(灰色线条)与2nM EGTA混合30分钟。
图12：BAY44-4400对由α-LTX导致的信号传递的干扰
用GFP标记的HC110-R蛋白瞬时转染HEK-293细胞，并且在转染之后48小时进行刺激(箭头)。进行Ca2+成像50分钟(图A-D)，对照实验用未转染过的HEK-293细胞的各种内源天然受体进行20分钟。n＝细胞数量。
A)向细胞中添加400ng/ml BAY44-4400(黑色线条)或PF1022-001(灰色线条)。作为对照，在添加BAY44-4400或PF1022-001之后，用Na+-HBS-HEPES缓冲液(HBS)处理细胞，所述缓冲液还被用作相应物质的溶剂。
B)在存在4ng/ml BAY44-4400(黑色线条)和PF1022-001(灰色线条)的条件下由α-LTX(75nM)导致的信号传递。
C)在与4ng/ml BAY44-4400(黑色线条)或PF 1022-001(灰色线条)一起预培养90分钟的细胞中由α-LTX引起的信号传递。在添加α-LTX之前除去了所述物质。
D)在与400ng/ml BAY44-4400(黑色线条)或PF1022-001(灰色线条)一起预培养90分钟的HC110-R-GFP转染过的细胞中，由α-LTX引起的信号传递。在添加α-LTX之前除去所述物质。
E)在有400ng/ml BAY44-4400(400ng/ml BAY44-4400，黑色线条)或没有400ng/ml BAY44-4400(灰色线条，-BAY44-4400)的条件下用1mM氯化氨甲酰胆碱(卡巴胆碱)刺激未转染过的HEK-293细胞100秒。
F)在有400ng/ml BAY44-4400(400ng/ml BAY44-4400，黑色线条)或没有400ng/ml BAY44-4400(灰色线条，-BAY44-4400)的条件下分别用1mM异丙肾上腺素和1mM槟榔碱刺激未转染过的HEK-293细胞各100秒。
图13：通过FACScan检测PF1022A与HC110-R转染过的HEK-293 细胞的结合
在每一种情况下，在转染之后24小时将没有转染过的，用GFP、HC110-R-GFP、GFP-HC110-R、β2-R-GFP和M1-R-GFP瞬时转染过的和用HC110-R-Myc/His和GFP瞬时共转染过的5×105个HEK-293细胞与0.5μg/ml PF1022A-生物素和抗生蛋白链菌素-Phycoerythrin(1∶300)一起培养，然后固定。作为负对照，将HC110-R-GFP转染过的细胞仅与抗生蛋白链菌素Phycoerythrin一起培养，而不使用PF1022A生物素。在扣除自发荧光，即来自所有荧光细胞中的绿色通道中的4.6％的未转染过的细胞(n.t.)以及由抗生蛋白链菌素-Phycoerythrin在红色通道中引起的4.4％的非专一性染色之后，得到了结合有PF1022A的GFP-荧光细胞(GFP，HC110-R-GFP，GFP-HC110-R，β2-R-GFP，M1-R-GFP和HC110-R-Myc/His+GFP)的百分比(PF1022A结合百分比)。通过测定三批次的平均值得到标准偏差。
图14：RAY44-4400和光学对映体PF1022-001对HC110-R-介导 的Ca2+ 信号传导的影响
在未转染过的HEK-293细胞中和在用HC10-R-GFP或M1-R-GFP瞬时转染之后48小时的转染过的细胞中，用1μM Fura-2/AM对细胞进行加载。测定340/380上商数量(比例作为时间的函数。所挑选的细胞的数量用n表示。
A)作为对照，在6分钟之后将未转染过的(n.t.，灰色线条)和HC110-R-GFP转染过的(HC110-R-GFP，黑色线条)细胞与0.1％的溶剂DMSO在Na+-HBS缓冲液中混合。
B)6分钟之后，用400ng/ml BAY44-4400刺激HC110-R-GFP(黑色线条)和M1-R-GFP(灰色线条)转染过的细胞。
C)与(B)类似，6分钟之后，用400ng/ml PF1022-001刺激HC110-R-GFP(黑色线条)和M1-R-GFP(灰色线条)转染过的细胞。
D)将表达HC110-R-GFP的细胞与400ng/ml BAY44-4400(黑色线条)或PF1022-001(灰色线条)一起预培养90分钟，并且在测定之前洗去未结合的物质。
E)6分钟之后，将10μM哌嗪添加到未转染过的(n.t.，灰色线条)和表达HC110-R-GFP的细胞(HC110-R-GFP，黑色线条)中。
F)与(E)类似，6分钟之后，将10μM哌嗪和400ng/ml BAY44-4400的混合物添加到未转染过的(n.t.，灰色线条)和表达HC110-R-GFP的细胞(HC110-R-GFP，黑色线条)中。
图15：PF1022A衍生物对HC110-R介导的α-LTX信号传导的相 互作用
用1μM Fura-2/AM对未转染过的HEK-293细胞和在用HC110-R-GFP或M1-R-GFP瞬时转染之后48小时对转染过的细胞进行加载。所采用的α-LTX的量总是75nM。对于用对照物质进行的实验来说，以1.6ml Na+-HBS/分钟的流速冲洗细胞。测定340/380nm商数(比例)，作为时间的函数。所选择的细胞的数量用n表示。
A)在α-LTX刺激之前6分钟，将表达HC110-R-GFP(黑色线条)和M1-R-GFP(灰色线条)的细胞与0.1％DMSO混合，以便排除由DMSO对α-LTX诱导的[Ca2+]i浓度变化的影响。
B)在添加α-LTX之前6分钟将用HC110-R-GFP转染过的细胞与4ng/ml BAY44-4400(黑色线条)或PF1022-001(灰色线条)混合。
C)与(B)类似，在用α-LTX刺激之前6分钟将4ng/ml BAY44-4400(黑色线条)或PF1022-001(灰色线条)添加到表达HC110-R-GFP的细胞中。
D)将用HC110-R-GFP转染的细胞与4ng/ml BAY44-4400(黑色线条)或PF1022-001(灰色线条)一起预培养90分钟，并且在测定之前除去未结合的物质。在6分钟之后用α-LTX刺激细胞。
E)与(D)类似，将HC110-R-GFP转染过的细胞与400ng/mlBAY44-4400(黑色线条)或PF1022-001(灰色线条)一起预培养90分钟，在测定之前除去未结合的物质，并且在6分钟之后用α-LTX刺激所述细胞。
F)在添加α-LTX之前6分钟，将稳定表达HC110-R-Myc/His的细胞与400ng/ml BAY44-4400(黑色线条)或PF1022-001(灰色线条)混合。
G)作为对照，在有(400ng/ml BAY44-4400，黑色线条)或没有(-400ng/ml BAY44-4400，灰色线条)400ng/ml BAY44-4400的条件下在6分钟之后将1mM氯化氨甲酰胆碱(卡巴胆碱)添加到未转染过的细胞中，培养100秒，并且再次用Na+-HBS洗涤。
H)与(G)类似，在6分钟之后，在有(400ng/ml BAY44-4400，黑色线条)或没有(-400ng/ml BAY44-4400，灰色线条)400ng/mlBAY44-4400的条件下用1mM卡巴胆碱刺激M1-R-GFP转染过的细胞100秒，并且再次用Na+-HBS洗涤。
I)作为对照，在有(400ng/ml BAY44-4400，黑色线条)或没有(-400ng/ml BAY44-4400，灰色线条)400ng/ml BAY44-4400的条件下，在3分钟之后用1mM异丙肾上腺素刺激未转染过的细胞100秒，并且在12分钟之后用1mM槟榔碱刺激未转染过的细胞100秒。并且在100秒之后再次用Na+-HBS洗掉所述物质。
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Claims (45)

1.将来自蠕虫的钙通道跨膜受体用于鉴定具有驱蠕虫活性的物质的用途。
2.将来自节肢动物的钙通道跨膜受体用于鉴定具有杀节肢动物的活性物质的用途。
3.如权利要求1或2的跨膜受体的用途，其特征在于它是具有7个跨膜结构域的G-蛋白结合的跨膜受体。
4.如权利要求1-3中任意一项的跨膜受体的用途，其特征在于它们是胰泌素亚科的跨膜受体。
5.如权利要求1、3或4的跨膜受体的用途，其特征在于它们是来自线虫的跨膜受体。
6.如权利要求2-4中任意一项的跨膜受体的用途，其特征在于它们是来自螨目的跨膜受体。
7.如权利要求1和3-5中任意一项的跨膜受体的用途，其特征在于它是来自捻转血矛线虫的跨膜受体HC110-R。
8.如权利要求1-6中任意一项的跨膜受体的用途，其特征在于它与跨膜受体HC110-R同源。
9.将权利要求1-8中任意一项的跨膜受体用于鉴定钙通道抑制剂的用途。
10.将权利要求1-8中任意一项的跨膜受体用于鉴定钙通道抑制剂的用途，其特征在于它们是结合α-娄蛛毒素的跨膜受体。
11.将α-娄蛛毒素用作权利要求1，3-5和7中任意一项的跨膜受体的激动剂的用途。
12.将α-娄蛛毒素用作杀线虫剂的用途。
13.将α-娄蛛毒素用于鉴定具有杀线虫和/或杀节肢动物活性的化合物的方法中的用途。
14.用于获得HC110-R受体及其蛋白同系物的方法，包括在原核或真核表达系统中表达所述多肽或其片段。
15.如权利要求14的方法，其特征在于它涉及真核表达系统。
16.如权利要求15的方法，其特征在于将HEK 293-或COS7-细胞用于表达。
17.能够瞬时表达受体HC110-R以及与它同源的蛋白的宿主细胞。
18.能够稳定表达受体HC110-R以及与它同源的蛋白的宿主细胞。
19.如权利要求18的宿主细胞，其特征在于它们能表达水母发光蛋白。
20.如权利要求18的宿主细胞，其特征在于它们是保藏号为DSMACC2464的稳定转化过的细胞系。
21.如权利要求18或19的宿主细胞，其特征在于它们是保藏号为DSM ACC2465的稳定转化过的细胞系。
22.用于稳定转化权利要求18-21中任意一项的宿主细胞和用于瞬时转化权利要求17的宿主细胞的载体。
23.用于稳定转化权利要求18或20的宿主细胞的载体，其特征在于它涉及到载体pMyc6xHis。
24.用于鉴定来自蠕虫和/或节肢动物的钙通道跨膜受体的激动剂和/或拮抗剂的方法，包括以下步骤：
a)让权利要求17-21中任意一项的宿主细胞或其膜与一种化合物或多种化合物的混合物接触，接触条件为使得化合物能够与所述肽相互作用，和
b)确定能专一性结合所述多肽的化合物。
25.用于发现改变来自蠕虫或节肢动物的钙通道跨膜受体表达的化合物的方法，包括以下步骤：
a)让权利要求17-21中任意一项的宿主细胞与一种化合物或多种化合物的混合物接触，
b)测定钙通道跨膜受体浓度，和
c)测定能专一性影响所述多肽表达的化合物。
26.如权利要求24或25的方法，其特征在于它涉及胰泌素亚科的G-蛋白结合跨膜受体或其片段。
27.如权利要求24或25的方法，其特征在于它涉及跨膜受体HC110-R或其片段以及与它同源的蛋白。
28.如权利要求24、26和27中任意一项的方法，其特征在于让测试物质与所述跨膜受体接触，接触条件为使得所述受体分子能够与测试物质相互作用，然后，
a)检测业已发生的测试物质的结合，和
b)比较在所述测试物质存在的条件下受体分子的活性和在没有测试物质存在的条件下受体分子的活性。
29.如权利要求24-28中任意一项的方法，其特征在于使用基于细胞的测试系统。
30.如权利要求29的方法，其特征在于使用权利要求17-21中任意一项的细胞。
31.如权利要求24和26-28中任意一项的方法，其特征在于使用无细胞测试系统。
32.如权利要求24、26-31中任意一项的方法，其特征在于测试物质与跨膜受体的相互作用是通过排斥与它结合的α-娄蛛毒素检测的。
33.如权利要求24、26-31中任意一项的方法，其特征在于测试物质与跨膜受体的相互作用是通过排斥与它结合的硝苯地平检测的。
34.硝苯地平在权利要求24和26-31中任意一项的方法中的用途。
35.在权利要求24-34中任意一项的方法中鉴定的物质。
36.将权利要求35的物质用于制备用来控制蠕虫和/或节肢动物的组合物的用途。
37.将HC110-R受体以及与它同源的蛋白的调节剂用作驱蠕虫剂和/或杀节肢动物剂的用途。
38.将编码HC110-R受体的DNA以及与它同源的DNA用于生产转基因无脊椎动物的用途。
39.包括HC110-R受体或与它同源的蛋白的转基因无脊椎动物。
40.如权利要求39的转基因无脊椎动物，其特征在于它们是果蝇和克氏病。
41.将专一性杂交编码HC110-R受体的DNA的DNA寡核苷酸用于检测来自蠕虫的DNA的用途。
42.用于从蠕虫中检测DNA的方法，其特征在于：
a)提供能够与编码HC110-R受体的DNA或其互补链杂交或与它的5′-或3′-旁侧区杂交的DNA寡核苷酸，
b)让所述DNA寡核苷酸与含有DNA的样品接触，
c)检测所述DNA寡核苷酸的杂交，
d)对检测到的序列进行测序，和
e)将所述序列与编码HC110-R受体的DNA序列进行比较。
43.诊断测试试剂盒，包括编码HC110-R受体的DNA序列或它的片段或与它同源的DNA序列。
44.如权利要求43的诊断测试试剂盒，其特征在于所述DNA序列具有可检测的标记。
45.将HC110-R受体或其片段以及与它同源的蛋白用于生产疫苗的用途。
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