EP1317562A2 - Auf transmembranrezeptoren aus helminthen basierende testsysteme und deren verwendung zur identifizierung und charakterisierung von verbindungen - Google Patents

Auf transmembranrezeptoren aus helminthen basierende testsysteme und deren verwendung zur identifizierung und charakterisierung von verbindungen

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EP1317562A2
EP1317562A2 EP01974211A EP01974211A EP1317562A2 EP 1317562 A2 EP1317562 A2 EP 1317562A2 EP 01974211 A EP01974211 A EP 01974211A EP 01974211 A EP01974211 A EP 01974211A EP 1317562 A2 EP1317562 A2 EP 1317562A2
Authority
EP
European Patent Office
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spp
cells
receptor
transmembrane
gfp
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP01974211A
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English (en)
French (fr)
Inventor
Georg Von Samson-Himmelstjerna
Achim Harder
Frank Wunderlich
Hans-Peter Schmitt-Wrede
Beate Saeger
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Bayer AG
Original Assignee
Bayer AG
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Filing date
Publication date
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Application filed by Bayer AG filed Critical Bayer AG
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Withdrawn legal-status Critical Current

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Definitions

  • the present invention relates to transmembrane receptors from helminths and
  • Arthropod-based test systems and their use for the identification and characterization of substances with effects against helminths, arthropods or with an effect on the calcium balance of organisms and / or cells.
  • the invention further relates to the use of a specific ligand therein. Test system and its use as an anthelmintic or arthropodicidal active ingredient.
  • the number of parasites produced annually to combat or prevent such diseases is high
  • Macrocyclic lactones were the last two decades ago to introduce a new, broadly effective group of active ingredients to the market.
  • a large number of endo- and ectoparasite species have developed resistance to representatives of individual, and in some cases also several, classes of active substances simultaneously. Therefore, there is a constant and increasingly urgent need to develop new antiparasitic substances.
  • HC110-R the functional interaction of the above-mentioned protein, called HC110-R, is inter alia with the ligand BAY 44-4400 (cyclo (-D-Lac-L-MeLeu- Dp-Mo ⁇ holinyl-PhLac-L-MeLeu- ) as another representative of the cyclic depsipeptides, for which recombinant eukaryotic cell lines were constructed in which the HC110-R is expressed, based on the sequence ID No. 2 described in the earlier application DE-A-197 04 024.
  • the present invention is therefore based in particular on the object, based on transmembrane receptors of helminths and arthropods, preferably from nematodes and acarina, particularly preferably from Trichostrongylidae, very particularly preferably from Haemonchus spp. and in particular based on the HO 10-R receptor from H. contortus, to provide test systems with a high throughput of test compounds (high throughput screening assays; HTS assays).
  • Proteins which are regarded as homologous proteins are those which have an at least 70% identity, preferably 80% identity, particularly preferably 90% identity, very particularly preferably 95% identity, with a sequence according to SEQ ID NO: 2 of the document DE- A-197 04 024, the content of which is expressly intended to be part of the present application, has a length of at least 20, preferably at least 25, particularly preferably at least 30 consecutive amino acids and very particularly preferably over their total lengths.
  • the degree of identity of the amino acid sequences is preferably determined with the aid of the GAP program from the GCG program package, version 9.1 under standard settings (Devereux et al. 1984).
  • the object is achieved by the provision of polypeptides which exercise at least one biological activity of a GPCR receptor and by the provision of a method for obtaining these polypeptides and by the provision of methods for identifying nematicidal and arthropodicidal compounds.
  • test systems based on recombinant microorganisms have already been used in many different ways for identifying pharmaceutically active substances, including using microorganisms which express recombinantly parasitic genes (Klein and Geary 1997). So far, however, no systems are known in which parasitic transmembrane receptors are used as recombinant, functional proteins in eukaryotic cells as targets.
  • the test systems described in this invention allow high-throughput
  • GPCR G protein-coupled receptors
  • the present invention is therefore also based on the object of being able to express transmembrane receptors, especially GPC receptors
  • the present invention thus relates in particular to the expression and use of an orphan G-protein-coupled receptor from helminths and arthropods, preferably from nematodes and acarina, particularly preferably from Trichostrongylidae, very particularly preferably from Haemonchus and most preferably from the parasitic nematode H. contortus as a target protein for the effective search for nematicidal active ingredients.
  • This receptor was identified in a cDNA library which was obtained from the gastrointestinal nematode H. contortus.
  • the cDNA codes for a heptahelical transmembrane protein with a size of 110 kDa, which was designated as HC110-R.
  • the protein belongs to the secretin family of G-protein coupled
  • GPCR Receptors
  • the HC11Q-R receptor as a target
  • the GPCR latrophilin was originally isolated from the mammalian brain.
  • Latrophilin has a molecular mass of 210 kDa and is post-translational
  • the remaining 18 split upstream of the first transmembrane segment consists of two noncovalently linked subunits.
  • the subunit pl20 contains the N-terminal, hydrophilic extracellular portion
  • the p85 subunit contains the seven transmembrane domains and the intracellular C-terminal region of the latrophilin, which is unusually large for GPCRs.
  • Recently two close homologues were identified, latrophilin-2 and latrophili ⁇ i73 (see also Fig. 6).
  • latrophilin-1 is preferred in the brain, while latrophilin-2 is ubiquitously expressed with a preference for placenta, kidney, spleen, ovaries, heart and lungs of mammals (Ichtchenko et al. 1999; Sugita et al. 1998).
  • HO 10-R is only about half the size of the 210 kDa latrophilin, the similarity of the sequence also extends to a functional similarity.
  • the endogenous ligand is still unknown for both receptors, but both latrophilin and HO 10-R are influenced by the artificial ligand ⁇ -LTX (alpha-latro-toxin).
  • ⁇ -LTX causes the influx of external Ca, as can be shown by a test approach with radioactive 45 Ca 2+ .
  • ⁇ -LTX also causes such a Ca 2+ influx in HEK-293 cells that have been transiently transfected with HO 10-R, which can be observed, for example, by Ca 2+ imaging (see also Figs. 10 and 11) ,
  • the HO 10-R is in the form of a construct with a C-terminal green fluorescent protein (GFP) attachment, it is biphasic, ie there is a change after about 3 and another after about 22 minutes.
  • GFP green fluorescent protein
  • the HO 10-R is only preceded by a Myc-His-Tag N-terminal, the main inflow is observed about 2-3 minutes after the addition of ⁇ -LTX. The reason for this is still unknown, but the reaction to the ⁇ -LTX addition is specific, as the later explanations show: 1.
  • the Ca 2+ influx cannot be observed in non-transfected cells and in cells which have been transiently transfected with a ⁇ 2 -adrenergic receptor from the mouse.
  • the biphasic change requires the inflow of Ca 2+ , which occurs through Ca 2+ channels that can be blocked by Cd 2+ , especially those of the L type, as can be seen from their sensitivity to nifedipm.
  • nifedipine blocks the action of the ⁇ -LTX in the system described here shows that the system is also suitable for the identification of new specific calcium channel blockers.
  • Nifedipine belongs to a class of
  • Calcium channel agonists and antagonists which are classified according to their binding to a specific location of a calcium channel, e.g. B. based on their binding to L-type channels.
  • L-type The most important three classes of calcium channel blockers (L-type) are benzoacetonitriles (e.g. Verapamil, WO 91/02497), benzothiazepinones (e.g. Diltiazem) and 1,4-dihydropyridine derivatives such as nifedipine, nivaldipine, nimodipine, nicardipine, isradipine, amlodipine, nitrenipine, felodipine or nisoldipine (Bacon et al.
  • L-type calcium channel blockers are 1,3-diphosphonates, e.g. B. Belfosodil.
  • This invention therefore also relates to the use of ⁇ -LTX-binding transmembrane receptors for the identification of new calcium channel blockers.
  • Heptahelical transmembrane receptors are particularly preferably used, and G-protein binding receptors are particularly preferred.
  • the use of transmembrane receptors is very particularly preferred
  • HO 10-R receptor according to SEQ ID. NO: 2 and also 70%, preferably 80%, particularly preferably 90% and particularly preferably 95% homologous receptor proteins.
  • HO 10-R is a target for the new anthelmintic depsipeptide BAY44-4400.
  • BAY44-4400 interferes with ⁇ -LTX signal transmission in HEK-293 cells that have been transfected with HO 10-R (Fig. 12). This disorder may be due to the ionophoric activity of the BAY 44-4400, as is typical for other depsipeptides, e.g. B. Beauvericin, Enniatin etc. (Geßner et al. 1996). However, BAY44-4400 does not cause changes in non-transfected cells.
  • BAY44-4400 does not interfere with the signal transmission induced by isoproterenol by HEK-293 cells transfected with the ⁇ 2 -adrenergic receptor of the mouse.
  • BAY44-4400 acts as an antagonist of ⁇ -LTX, while BAY44-4400 alone does not affect the Ca 2+ concentration in HO 10-R transfected HEK-293 cells.
  • the membrane protein described in DE 197 04 024 AI was identified as a possible target protein for the anthelmintic active ingredient PF 1022 A.
  • a ⁇ ZAPII cDNA expression library of the parasitic nematode Haemonchus contortus was prepared and the cDNA library was searched using a conjugate of PF1022A and KLH (keyhole limpet hemocyanin), PF1022A-KLH, and polyclonal antibodies against this conjugate (see Ex. 1).
  • Examination of approximately 1.5 ⁇ 10 6 non-amplified, recombinant clones revealed a 3036 bp long cDNA clone which was attached to a 3.6 kb large H.
  • the amino acid sequence of the HO 10-R protein has some special features.
  • the extracellular N-terminal part of the protein consists of a total of 535 residues.
  • the N-terminus contains a signal peptide with a length of 21 amino acids and a cleavage site at position 18. This is followed by a lectin-like sequence (AS 22-125) and a so-called "thr stretch" (AS 128-147), which only is interrupted by a serine in position 144. Downstream of the "thr stretch” is a cysteine-rich motif of the structure CX 9 WX 12 CX 9 WXCX 5 WX 9 CX 3 W (AS 166-221).
  • the protein HO 10-R contains seven hydrophobic, ⁇ -helical transmembrane domains between residues 536 and 772. Directly upstream of the transmembrane region there is another 4-Cys region of the structure CXWWX 6 WX 4 CX ⁇ CXC (AS 478-524 ). In the transmembrane region there are three extracellular loops containing residues 587-597, 654-673 and 743-749 and three intracellular loops (positions 559-569, 627-636, 696-724). The C-terminus is 214 residues long (24 kDa) and contains a proline-rich part (AS 845-861) and a PEST region (AS 915-933). Finally, there are three putative N-glycosylation sites at residues 26, 499 and 862 and 14 putative phosphorylation sites in the derived intracellular domain (see also Fig. 6).
  • identity describes the number of sequence positions that are identical in a so-called “alignment”. It is given as a percentage of the “Alignmenf" length.
  • similarity describes the similarity of sequences based on a similarity metric, that is, a measure thereof, as how. similarly, for example, you want to accept a valine for a threonine or a leucine.
  • homology means evolutionary kinship, that is, when two homologous proteins have evolved from a common tracer sequence. The term does not necessarily have anything to do with it
  • the comparison of the two sequences shows common features of both proteins, for example the lectin-like sequence, the "thr stretch", the Cys motifs and the PEST sequence.
  • the highest identity can be found in the area of the transmembrane region (62%), whereas a less pronounced identity can be found in the N-terminal (44%) and C-terminal (50%) region.
  • the HO 10-R protein has a 20-30% identity with heptahelical G-protein-coupled transmembrane receptors (GPCR), especially with the secretin subfamily. Comparisons of seven transmembrane domains show high identity and similarity in structure and sequence between different GPCRs of the secretin subfamily and HO 10-R (Fig. 4).
  • GPCR G-protein-coupled transmembrane receptors
  • Comparisons of seven transmembrane domains show high identity and similarity in structure and sequence between different GPCRs of the secretin subfamily and HO 10-R (Fig. 4).
  • Latrophilin a member of the secretin subfamily, from mammals such as humans (Gen Bank TM Accession No .: E1360690), cattle (e.g. G416021, G416053 and G4185804), and the rat (U78105 or U72487) shows something higher identity (31%) to HO 10-R than other secretin receptors.
  • HO 10-R and the 1466 amino acid latrophilin-1 GPCR (U78105) from the rat have common features, e.g. B. the lectin domain, the cy stone-rich region and a conserved 4-Cys motif in front of the transmembrane region. The latter has recently been proposed as a proteolysis site for latrophilin and other major GPCR secretin.
  • the N-terminus of HO 10-R does not contain the olfactomedin region and the Pro / Thr-
  • transmembrane receptors are preferably used, which can be assigned to the secretin subfamily.
  • Transient transfection experiments with a HO 10-GFP fusion protein were carried out in various mammalian cell lines, for example COS-7 cells or HEK-293 cells (FIG. 7).
  • the heterologous expression was chosen because no cell lines from H. contortus have yet been established.
  • the green fluorescent protein (GFP) from the Pacific jellyfish Aequorea victoria can be used for protein localization in living cells (see Fig. 8).
  • GFP serves as an in vivo reporter to show the frequency of a transient or stable transfection and at the subcellular level to localize proteins.
  • Wild-type GFP is a 27th kD monomer of 238 amino acids, which after excitation with UV light (360 - 400 nm; max. at 395 nm) or blue light (440 - 480 nm; max. at 475 nm) emits green light with a maximum of 509 nm without the need for exogenous substrates or cofactors (Chalfie et al. 1994).
  • GFP can thus be detected directly by fluorescence microscopy in vivo and its fluorescence behavior remains essentially unchanged even as part of a fusion protein.
  • EGFP ('enhanced' GFP) is a genetic variant of wild-type GFP and is used to transfect mammalian cells (Yang et al. 1996). The excitation maximum of EGFP was shifted to only one peak at 490 nm by substitution of Ser 65 with Thr.
  • N3 (GenBank Accession No .: U55762) [Clontech, Palo Alto, CA, USA] express EGFP under the control of the strong constitutive CMV promoter and can be used to fuse other proteins at the N or C terminus of EGFP ,
  • Stable cell lines offer the advantage over transient expression that each cell permanently expresses the desired protein and isolation of the protein after localization is possible.
  • an antibody against the desired protein is required, or it is advisable to choose an expression vector which, for example, a Myc- or His-Tag C-terminal with the actual protein merged in the correct reading frame, against which there are then commercially available, usually even monoclonal, antibodies.
  • the present invention also relates to cells which are stable
  • HEK-293 cells were transiently and stably transfected with HO10-R-GFP fusion protein and with alpha-latrotoxin ( ⁇ - LTR) stimulated.
  • Alpha-Latrotoxin is a presynaptic neurotoxin that can be obtained from the poison of the Black Widow (Latrodectus mactans). It is known for its toxicity to the central nervous system of vertebrates, where it triggers the depolarization of neurons by increasing [Ca 2+ ] j and stimulating the uncontrolled exocytosis of neurotransmitters. It has also become known that the effect of ⁇ -latrotoxin is at least partially mediated by latrophilin. It is believed that the toxicity of ⁇ -latrotoxin is due to its ability to bind to receptors that are linked to GTP-binding protein
  • GPCR GPCR to interact. These receptors normally mediate the effects of endogenous hormones or neuropeptides.
  • ⁇ -LTX causes a biphasic increase in [Ca 2+ ] j.
  • ⁇ -LTX initially induces a very small increase of only 5 ⁇ 0.2 nM 2
  • HEK-293 cells are transfected with an N-terminal GFP-tagged HO 10-R construct and stimulated with 75 nM ⁇ -LTX, there is a slightly reduced 2nd peak. Finally, a slightly reduced response to ⁇ -LTX was also found when the HO 10-R protein was tagged with an N-terminal GFP tag, so it can be assumed that the attachment of a GFP tag N- or C-terminal has no significant influence on the ⁇ -LTX binding and the following signal transduction by HC 110-R.
  • HEK-293 cells transiently transfected with other C-terminal GFP-tagged G protein-coupled receptors, e.g. B. the ß - adrenergic receptor of the mouse, or the human muscarinic Hl acetylcholine
  • ⁇ -LTX in a concentration of 75 nM causes only a slight (from about 40 ⁇ 10.4 nM after about 20 minutes) to no increase in the [Ca 2+ ] i.
  • the majority of the Ca + channels involved in the Ca + inflow are of the L type, since 15 ⁇ M nifedipine is already sufficient to significantly increase the increase in [Ca + ] j induced by ⁇ -LTX suppress.
  • the stable or transient HEK-293 cell line expressing the C-terminal Myc / His-tagged HO 10-R receptor also responds to ⁇ -LTX in a dose-dependent manner
  • This Ca 2+ signal is similar to the second delayed Ca 2+ peak HO10-R-GFP of transfected HEK-293 cells at the same ⁇ -LTX concentration (75 nM) in the level of the signal and in its course, the answer is only given - as with higher concentrations (90 nM and 120 nM) HO 10-GFP transfected cells - immediately after ⁇ -LTX addition.
  • the invention therefore also relates to the use of ⁇ -LTX as an agonist of transmembrane receptors of the secretin family from nematodes.
  • ⁇ -LTX is preferably used as an agonist of the HO 10-R receptor according to SEQ ID NO: 2 and of 70%, preferably 80%, particularly preferably 90% and very particularly preferably 95% homologous receptor proteins.
  • the present invention also relates to the use of ⁇ -LTX as a nematicide.
  • the present invention also relates to the use of ⁇ -LTX in a method for identifying compounds which are nematicidal or arthropodicidally active, the compounds being able to act as agonists or antagonists of the transmembrane receptors.
  • the present invention also relates to the use of ⁇ -LTX in a method for identifying compounds which block calcium channels.
  • PF1022A exerts its effect on nematodes depending on the species at concentrations in the range of 100-800 ng / ml (Terada, 1992).
  • the following Ca 2+ imaging experiments were carried out in HEK loaded with FURA-2 and transfected with HO 10-R-GFP -293 cells uses the BAY44-4400, which is a more soluble derivative of PF1022A.
  • BAY44-4400 the almost ineffective antipode PF 1022-001 produced a Ca 2+ response in HO 10-R-GFP transfected HEK 293 cells, even if the cells had been preincubated with the active ingredient for 90 minutes. In contrast, both substances influence the signal transmission caused by ⁇ -LTX, although to different degrees (Fig. 12 and 14). In the presence of 4 ng / ml
  • BAY44-4400 causes ⁇ -LTX only a slight Ca 2+ increase with a maximum of 44 ⁇ 6.0 nM Ca 2+ after 14 minutes (Fig. 12). In the presence of PF1022-001, however, ⁇ -LTX causes a larger increase of 103 ⁇ 11.5 nM Ca 2+ after 6 minutes (Fig. 10B). In another approach, the cells were preincubated with either 4 ng / ml or 400 ng / ml BAY44-4400 and PF1022A for 90 minutes
  • HEK-293 cells with only 400 ng / ml BAY 44-4400 react the cells for 50 minutes in no comparable way with a change in the intracellular Ca 2+ concentration.
  • an influence of the BAY 44-4400 can be determined in the presence of the ⁇ -LTX. If cells are incubated 6 minutes before the addition of 75 nM ⁇ -LTX with BAY 44-4400, the influence of the ⁇ -LTX on the Ca 2+ is reduced.
  • isoproterenol also causes a significant Ca 2+ response: immediately after adding isoproterenol, there is only an increase in Ca 2+ . However, this increase is not influenced by BAY 44-4400.
  • polypeptides refers to both short amino acid chains, commonly referred to as peptides, oligopeptides, or oligomers, and longer amino acid chains, commonly referred to as proteins. It includes amino acid chains that can be modified either by natural processes, such as post-translational processing, or by chemical processes that are state of the art. Such modifications can occur at various locations and multiple times in a polypeptide, such as, for example, on the peptide backbone, on the amino acid side chain, on the amino and or on the carboxy terminus.
  • acetylations include, for example, acetylations, acylations, ADP-ribosylations, amidations, covalent linkages with flavins, heme components, nucleotides or nucleotide derivatives, lipids or lipid derivatives or
  • Phosphatidylinositol cyclizations, disulfide bridges, demethylations, Cystine formation, formylation, gamma carboxylation, glycosylation, hydroxylation, iodination, methylation, myristoylation, oxidation, proteolytic processing, phosphorylation, selenoylation and tRNA-mediated addition of amino acids.
  • the polypeptides can be in the form of "mature” proteins or as parts of larger proteins, e.g. can be used as fusion proteins. Furthermore, they can have secreting or “leader” sequences, pro-sequences, sequences which enable simple purification, such as multiple histidine residues, or additional stabilizing amino acids.
  • Proteins or polypeptides which are homologous proteins or polypeptides are those which have at least 70% identity, preferably 80% identity, particularly preferably 90% identity, very particularly preferably 95% identity, with a sequence according to SEQ ID NO: 2 of document DE-A-197 04 024, the content of which is expressly intended to be part of the present application, have a length of at least 20, preferably at least 25, particularly preferably at least 30 consecutive amino acids and very particularly preferably over their total lengths.
  • polypeptides do not have to be complete receptors for their use according to the invention, but can also only be fragments thereof as long as they at least still have the biological activity of the complete receptors.
  • the polypeptides need not be derivable from H. contortus transmembrane receptors. Polypeptides which correspond to transmembrane receptors of other helminthic or arthropod species or fragments thereof which can still exert the biological activity of these receptors are also considered to be according to the invention.
  • polypeptides can be deletions or compared to the corresponding region of naturally occurring GPCR receptors Have amino acid substitutions as long as they still have at least one biological activity of the complete receptors. Conservative substitutions are preferred. Such conservative substitutions include variations in which one amino acid is replaced by another amino acid from the following group:
  • Aromatic residues Phe, Tyr and Tip.
  • functionally similar receptors are understood to mean receptors which comprise polypeptides which differ in amino acid sequence from the polypeptides described here, but have essentially the same biological function.
  • the expression "essentially the same biological function" as used herein means participation in the construction of functional G-protein coupled heptahelical transmembrane receptor receptors, particularly those of the secretin subfamily, or one of the HO 10-R receptor from H. corresponding function to contortus.
  • Such a function also includes the properties of the receptor described above, such as sensitivity to ⁇ -LTX as agonists or nifedipine as antagonists of ⁇ -LTX.
  • hybridize describes the process in which a single-stranded nucleic acid molecule with a complementary strand undergoes base pairing.
  • DNA fragments from nematodes other than H. contortus and from arthropods which code for polypeptides with the biological activity of GPCR receptors can be isolated.
  • the amino-terminal and carboxy-terminal cDNA sections are preferred.
  • the hybridization conditions are chosen so that less similar sequences from other organisms can also be detected.
  • the hybridization conditions under reduced stringency can, for example, look as follows: in 6xSSC / 0% formamide as hybridization solution, hybridization takes place between 40-55 ° C.
  • the conditions of the specific 2nd washing step must be tested, e.g. initially 2xSSC at 50 ° C, then estimation of the signal intensities. This is followed by the modification of the washing conditions.
  • Hybridization solution 6xSSC / 0% formamide
  • preferred hybridization solution 6xSSC / 25% formamide
  • Hybridization temperature 34 ° C
  • preferred hybridization temperature 42 ° C
  • 1st washing step 2xSSC at 40 ° C
  • 2nd washing step 2xSSC at 45 ° C; preferred 2nd washing step: 0.6xSSC at 55 ° C; particularly preferred 2nd washing step: 0.3xSSC at 65 ° C.
  • Hybridization conditions are approximately calculated using the following formula:
  • c is the concentration and n is the length of the hybridizing sequence section in base pairs.
  • the expression 500 / n is omitted for a sequence> 100 bp. It is washed with the highest stringency at a temperature of 5-15 ° C below Tm and an ionic strength of 15 mM Na + (corresponds to 0.1 x SSC). If an RNA sample is used for hybridization, the melting point is 10-15 ° C higher.
  • polypeptides used in the method according to the invention for identifying nematicidal and arthropodicidally active compounds are used by the
  • nucleic acids which have an at least 70% identity, preferably 80% identity, particularly preferably 90% identity, very particularly preferably 95% identity with a sequence according to SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO : 3 over a length of at least 20, preferably at least 100, particularly preferably at least 500 consecutive nucleotides and very particularly preferably over their total length.
  • the nucleic acid according to the invention can also be used to produce transgenic invertebrates. These can be used in test systems which are based on expression of the receptors according to the invention or variants thereof which deviate from the wild type. This also includes all transgenic invertebrates in which the modification of other genes or gene control sequences (for example promoters) causes a change in the expression of the receptors according to the invention or their variants.
  • transgenic invertebrates are produced, for example, in Drosophila melanogaster by P-element-mediated gene transfer or in Caenorhabditis elegans by transposon-mediated gene transfer (e.g. by Tel, Plasterk 1996).
  • the invention thus also relates to transgenic invertebrates which contain at least one of the nucleic acids according to the invention, preferably transgenic invertebrates of the species Drosophila melanogaster or Caenorhabditis elegans, and their transgenic progeny.
  • the transgenic invertebrates preferably contain the receptors according to the invention in a form which differs from the wild type.
  • the nucleic acid according to the invention can be produced in the usual way.
  • the nucleic acid molecule can be completely chemically synthesized. It is also possible to chemically synthesize only short pieces of the sequence according to the invention and to label such oligonucleotides radioactively or with a fluorescent dye.
  • the labeled oligonucleotides can be used to search cDNA libraries made from nematode mRNA or insect mRNA. Clones to which the labeled oligonucleotides hybridize are selected to isolate the DNA in question. After characterizing the isolated DNA, the nucleic acid according to the invention is obtained in a simple manner.
  • the nucleic acid according to the invention can also be produced by means of the PCR method using chemically synthesized oligonucleotides.
  • oligonucleotide (s) as used herein means DNA molecules which consist of 10 to 50 nucleotides, preferably 15 to 30 nucleotides. For example, they are chemically synthesized and can be used as probes.
  • the nucleic acid according to the invention can be used to isolate and characterize the regulatory regions which naturally occur adjacent to the coding region. Such regulatory regions are thus also the subject of the present invention.
  • Vectors which contain a nucleic acid to be used according to the invention or a DNA construct to be used according to the invention are also used in the methods according to the invention. All phages, plasmids, phagmids, phasmids, cosmids, YACs, BACs, artificial chromosomes or particles used for a molecular biological laboratory can be used as vectors
  • Particle bombardment are suitable.
  • Preferred vectors are pBIN and its derivatives for plant cells, pFL61 for yeast cells, pBLUESCRIPT vectors for bacterial cells, lamdaZAP (from Stratagene) for phages.
  • vectors were used and several constructs were created.
  • the vectors used for the transient or stable transformation of cell lines and for the stable expression of the HO 10-R receptor are also the subject of the present invention.
  • EGFP constructs were produced which lead to the expression of fusion proteins with an N-terminal EGFP tag (EGFP-HC110-R) or a C-terminal EGFP tag (HO10-R-EGFP).
  • EGFP-HC110-R N-terminal EGFP tag
  • HO10-R-EGFP C-terminal EGFP tag
  • the vector pMyc ⁇ xHis was used for the stable expression and is also the subject of the present invention.
  • the vector pMyc ⁇ xHis is derived from the vector pSecTagA [ ⁇ nvitrogen, Leek, NL] by double digestion with the restriction enzymes Nhil and Sfil, followed by blunting of the ends and religation of the vector.
  • the present invention also relates to host cells which contain a nucleic acid to be used according to the invention or a vector to be used according to the invention.
  • the stably transformed cell line HEK-293 with HO10-R-Myc / His is the subject of this invention, which is available under number DSM ACC2464 from the international depository DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg lb in 38 124
  • the present invention likewise relates to host cells which contain a nucleic acid to be used according to the invention or a vector to be used according to the invention, and a vector which the cells use to express
  • Aequorin enables a luminescent protein that emits light in the presence of Ca 2+ .
  • Appropriate host cells make it possible to change the Ca 2+ concentration and thus the effect of substances such.
  • the stable transformed cell line HEK-293 capable of expressing aequorin is included
  • HOlO-R-Myc / His is the subject of the invention, which was deposited under number DSM ACC2465 at the international depository DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH, Mascheroder Weg lb in 38 124 Braunschweig.
  • the term "host cell” as used in the present context refers to cells which do not naturally contain the nucleic acids according to the invention.
  • Eukaryotic cells such as yeast, mammalian, amphibian, insect or plant cells are preferably suitable as host cells.
  • Preferred eukaryotic host cells are HEK-293, Schneider S2, Spodoptera Sf9, Kc, CHO, HepG-2, Kl-COS-1, COS-7, HeLa, C127, 3T3 or BHK Cells and especially Xenopus oocytes, HEK-293 or COS-7 cells are particularly suitable.
  • This invention also relates to the use of DNA corresponding to the sequence ID no. Described in application DE-A-197 04 024. 2 for the detection of DNA from helminths, preferably from the Nematoda strain, particularly preferably from the Trichostrongylidae family, very particularly preferably from the Haemonchus genus and most preferably from the Haemonchus contortus species.
  • the invention relates to oligonucleotides which correspond to a region of the DNA sequence described above or its complementary strand and can hybridize to it.
  • the invention relates to the use of these oligonucleotides or parts thereof as
  • PCR primer in a diagnostic method for the detection of the above-mentioned nematodes, the DNA of the helminths in question being specifically amplified with the aid of the primer and the PCR technique and then identified.
  • the invention also relates to a method for the detection of helminths, preferably from the Nematoda strain, particularly preferably from the Trichostrongylidae family, very particularly preferably from the Haemonchus genus and most preferably from the Haemonchus contortus species, oligonucleotides as above described hybridize specifically to DNA sequences which originate from the organisms mentioned and which are then amplified with the aid of the PCR technique.
  • the detection of organisms as mentioned above can e.g. be done by
  • an oligonucleotide sample or primer is available which hydrides to the DNA according to the invention, coding for HO 10-R, or strands complementary thereto, or to the 5 1 - or 3 '-flanking regions thereof,
  • the hybridization of the oligonucleotide or primer is detected (e.g. using the polymerase chain reaction),
  • the invention therefore also relates to a diagnostic test kit for the detection of helminths, preferably from the Nematoda strain, particularly preferably from the Trichostrongylidae family, very particularly preferably of the genus
  • Haemonchus and most preferably the species Haemonchus contortus which, among other things, provides oligonucleotides as described above, which can be used in methods for the detection of species from the systematic groups mentioned.
  • the invention also relates to a diagnostic test kit as described above, the oligonucleotides provided in this kit being provided with a detectable marker.
  • detectable markers can include enzymes, enzyme substrates, coenzymes, enzyme inhibitors, fluorescence markers, chromophores, luminescent markers and radioisotopes.
  • This invention also relates to the use of the above-mentioned HO10-R polypeptides or fragments thereof and of 70%, preferably 80%, particularly preferably 90% and particularly preferably 95% more homologously thereto.
  • Receptor proteins from helminths preferably from the Nematoda strain, particularly preferably from the Trichostrongylidae family, very particularly preferably from the Haemonchus genus and most preferably from the Haemonchus contortus species for the production of vaccines which contain at least one HO10-R polypeptide or fragment or a Contain 70%, preferably 80%, particularly preferably 90% and particularly preferably 95% homologous receptor protein thereof.
  • the vaccine is able to elicit an immune response that is specific for a HO 10-R protein described above.
  • the vaccine contains an antigenic determinant, e.g. a single determinant of a polypeptide with an amino acid sequence according to the sequence described in application DE-A-197 04 024 _D No. 2 or a polypeptide encoded by the above DNA or fragments thereof.
  • an antigenic determinant e.g. a single determinant of a polypeptide with an amino acid sequence according to the sequence described in application DE-A-197 04 024 _D No. 2 or a polypeptide encoded by the above DNA or fragments thereof.
  • the present invention furthermore relates to processes for producing the polypeptides to be used according to the invention.
  • host cells which contain these nucleic acids can be cultured under suitable conditions.
  • the desired polypeptides can then be isolated from the cells or the culture medium in a conventional manner.
  • the polypeptides can also be produced in in vztro systems.
  • a rapid method for isolating the polypeptides according to the invention, which are synthesized by host cells using a nucleic acid according to the invention begins, for example, as described in the examples, with the expression of a fusion protein, whereby the fusion partner can be easily affinity-purified.
  • the fusion partner can be, for example, glutalhione S-transferase.
  • the fusion protein can then be purified on a glutate monofinance column.
  • the fusion partner can, for example, on linkers between the fusion partner and the one to be purified according to the invention. Polypeptide are separated.
  • the linker can be designed to target
  • Amino acids such as arginine and lysine residues, define sites for trypsin cleavage. Standard cloning techniques using oligonucleotides can be used to create such linkers. Another possible method is based on the use of histidine fusion proteins and their purification using Ni 2+ talon columns.
  • detergent extractions are preferably carried out in the cleaning processes, for example using detergents which do not or only slightly influence the secondary and tertiary fractures of the polypeptides, such as non-ionic detergents.
  • the purification of the polypeptides to be used according to the invention can include the isolation of membranes starting from host cells which express the nucleic acids according to the invention. Such cells preferably express the polypeptides in a sufficient number of copies so that the amount of the polypeptides in one
  • Membrane fraction is at least 10 times higher than that in comparable Membranes of cells are found that naturally express the HO10-R gene; the amount is particularly preferably at least 100 times, very particularly preferably at least 1000 times higher.
  • compositions according to the invention which contains the polypeptides are preferably enriched at least 10-fold and particularly preferably at least 100-fold with respect to the protein content compared to a preparation from the host cells.
  • polypeptides according to the invention can also be affinity-purified without a fusion partner using antibodies which bind to the polypeptides.
  • the invention furthermore relates to antibodies which specifically bind to the abovementioned polypeptides or receptors.
  • Such antibodies are produced in the usual way.
  • such antibodies can be produced by injecting a substantially immunocompetent host with an effective amount for antibody production of a transmembrane receptor according to the invention, such as the HO 10-R receptor from H. contortus or a fragment thereof, and by subsequently obtaining this antibody.
  • a transmembrane receptor according to the invention
  • an immortalized cell line which produces monoclonal antibodies can be obtained in a manner known per se.
  • the antibodies can optionally be labeled with a detection reagent.
  • Preferred examples of such a detection reagent are enzymes, radioactively labeled elements, fluorescent chemicals or biotin.
  • fragments can also be used which have the desired specific binding properties.
  • agonist refers to a molecule that activates transmembrane receptors.
  • antagonist refers to a molecule that displaces an agonist from its binding site or inhibits the function of the agonist.
  • modulator as used herein provides the preamble
  • Modulators can be small organic chemical molecules, peptides or antibodies that bind to the polypeptides according to the invention. Furthermore, modulators can be small organic chemical molecules, peptides or antibodies which bind to a molecule which in turn binds to the polypeptides according to the invention and thereby influences their biological activity. Modulators can be mimetics of natural substrates and ligands.
  • the modulators are preferably small organic chemical compounds.
  • the binding of the modulators to the polypeptides can change the cellular processes in a way that leads to the death of the helminths or arthropods treated with them.
  • the present invention therefore also extends to the use of modulators of the polypeptides as anthelmintics and arthropodicides.
  • ⁇ -LTX as an anthelmintic is also the subject of this invention.
  • nucleic acids or polypeptides according to the invention in a method according to the invention also makes it possible to find compounds which bind to the receptors according to the invention.
  • These can also be used as anthelmintics, for example as nematicides in plants or as anthelmintic agents in animals.
  • host cells that contain the nucleic acids and express the corresponding receptors or polypeptides or bring the gene products themselves into contact with a compound or a mixture of compounds under conditions which allow the interaction of at least one compound with the host cells, the receptors or the individual polypeptides.
  • the present invention relates to a method which is suitable for identifying nematicidal active substances which bind to transmembrane receptors from helminths or arthropods, preferably to GPCR of the secretin subfamily, particularly preferably to the HO 10-R receptor from H. contortus and to , 70%, preferably 80%, particularly preferably 90% and very particularly preferably bind to 95% sequence-identical receptors.
  • the methods can also be carried out with a HO 10-R homologous receptor from a species other than that mentioned here. Methods that use a HO 10-R receptor other than the invention are fully encompassed by the present invention.
  • the methods of the invention include high throughput screening (e.g. high throughput screening (HTS) and ultra high throughput screening (UHTS)). Both host cells and cell-free preparations containing the nucleic acids according to the invention and / or the polypeptides according to the invention can be used for this.
  • high throughput screening e.g. high throughput screening (HTS) and ultra high throughput screening (UHTS)
  • HTS high throughput screening
  • UHTS ultra high throughput screening
  • test systems aimed at testing compounds and natural extracts are designed for high throughput numbers in order to maximize the number of substances tested in a given period of time.
  • Test systems that are based on cell-free work require purified or semi-purified protein. They are suitable for a "first" test, which primarily aims to detect a possible influence of a substance on the target protein. Effects such as cell toxicity are usually ignored in these in vitro systems.
  • the test systems check both inhibitory or suppressive effects of the substances and stimulatory effects. The effectiveness of a substance can be checked using concentration-dependent test series. Control approaches without test substances can be used to evaluate the effects.
  • test systems based on cells for the identification of substances is made possible by the cell lines which are stably transformed with HO 10-R and which can be identified by means of the present invention, but also by the corresponding homologous receptors from other species which can be identified by means of the present invention that modulate the activity of HO 10-R and homologous receptors.
  • the present invention also enables the identification of further compounds which are loosely active as calcium channel B.
  • a synthetic reaction mix e.g., products of in vitro translation
  • a cellular component such as a membrane or any other preparation containing the polypeptide
  • a candidate molecule which can be an agonist or antagonist.
  • the ability of the candidate molecule to increase or to inhibit the activity of the polypeptides according to the invention is evident from an increased or decreased binding of the labeled ligand or from an increased or decreased conversion of the labeled substrate.
  • Molecules that bind well and lead to an increased activity of the polypeptides according to the invention are agonists.
  • Molecules that bind well but do not trigger the biological activity of the polypeptides of the invention are likely to be good antagonists.
  • Scintillation Proximity Assay SPA
  • SPA Scintillation Proximity Assay
  • HO 10-R is bound to the beads, either together or without interacting or binding test substances. Fragments of the HO 10-R receptor could also be used.
  • a radioactively marked ligand could e.g. B. labeled ⁇ -LTX, nifedipine or a labeled
  • a binding ligand binds to the immobilized HO 10-R receptor, this ligand would have to inhibit or abolish an existing interaction between the immobilized HO 10-R and the labeled ligand in order to bind itself in the region of the contact area. Binding to the immobilized HO 10-R receptor can then be detected using a flash of light. Correspondingly, an existing complex between an immobilized and a free, labeled ligand is destroyed by the binding of a test substance, which leads to a drop in the detected light flash intensity. The test system then corresponds to a complementary inhibition system. Two hybrid system
  • test system based on whole cells
  • two hybrid system A specific example of this is the so-called "interaction trap”. It is a genetic one
  • test system is designed to detect and describe the interaction of two proteins in that an interaction that has taken place leads to a detectable signal.
  • test system can also be adapted to the testing of large numbers of test substances in a given period.
  • the system is based on the construction of two vectors, the "bait” and the "prey” vector.
  • a gene coding for an HO 10-R according to the invention or fragments thereof is cloned into the bait vector and then expressed as a fusion protein with the LexA protein, a DNA-binding protein.
  • a second gene, coding for an interaction partner of HO 10-R, for example for an ⁇ -LTX, is cloned into the Prey vector, where it is expressed as a fusion protein with the B42-Prey protein.
  • Both vectors are in a Saccharomyces cerevisiae host that has copies of LexA binding DNA on the 5 'side of a lacZ or
  • HIS3 reporter gene contains. If there is an interaction between the two fusion proteins, the transcription of the reporter gene is activated. If the presence of a test substance leads to inhibition or interference with the interaction, the two fusion proteins can no longer interact and the product of the reporter gene is no longer produced.
  • Another example of a method with which modulators of the polypeptides according to the invention can be found is a displacement test, in which the polypeptides according to the invention and a potential modulator with a molecule known to bind to the polypeptides of the invention, such as a natural substrate or ligand or a substrate or ligand mimetic.
  • the ⁇ -LTX is preferably used for this in the manner according to the invention.
  • ⁇ -LTX or another modulator e.g. BAY 44-4400 or other possible ligands can be coupled to the chip as described under (i).
  • the binding of a ligand in solution can be measured physically.
  • the ligand is immobilized on a sensor chip that has a thin gold layer.
  • the analyte solution is perfused through a micro flow cell on the chip. Binding of the analyte to the immobilized ligand increases the local concentration on the surface, the refractive index of the medium near the gold layer gradually increasing. This affects the interaction between free electrons (plasmons) in the metal and photons emitted by the instrument.
  • Corresponding measurements also serve to determine the HO 10-R protein domains that are important for the binding of ligands and to identify new, as yet unknown ligands of the HC 110-R.
  • Calcium imaging or signaling can be viewed as substances (see e.g. Fig. 10 and 11).
  • Calcium indicators are used to make changes in the intracellular calcium level detectable.
  • cells expressing HO 10-R are used, which are loaded with calcium indicators.
  • An antagonist in such a system can be recognized by the total or partial suppression of the calcium signal induced by the agonist (e.g. ⁇ -LTX).
  • Possible Fura-2 (Sigma) or Indo-1 (Molecular Probes) are possible calcium indicators.
  • Fluo-3 and Fluo-4 indicators can be stimulated by visible light and detectably change their fluorescence behavior depending on their calcium load.
  • the Fluo-3 and Fluo-4 indicators have a high affinity for calcium. With its stronger fluorescence signal, Fluo-4 is particularly suitable for measurements in test systems in which the cells are only used in low density, as in the case of the HEK293 cells.
  • Other indicators are Rhod-2, x-Rhod-1, Fluo-5N, Fluo- 5F, Mag-Fluo-4, Rhod-5F, Rhod-5N, Y-Rhod-5N, Mag-Rhod-2, Mag-X -Rhod-1, Calcium Green-1 and -2, Calcium Green-5N, Oregon Green 488 BAPTA-1, Orgeon
  • Aequorin is a photoprotein that is already widely used in numerous examinations and test systems. The cells expressing the target protein and at the same time the aequorin are first loaded with the luminophore coelenterazine in this test method. The apoaequorin formed by the cells forms a complex with the coelenterazine and carbon dioxide. If calcium then enters the cell and binds to the complex, carbon dioxide and blue light are released (maximum emission -466 nm). The light emission correlates with the intracellular calcium concentration.
  • This invention therefore also relates to the use of HO 10-R,
  • the active substances found with the aid of the method according to the invention are correspondingly suitable for controlling animal pests, in particular insects, arachnids and nematodes, which occur in agriculture, in forests, in the protection of stored goods and materials and in the hygiene sector.
  • the active ingredients found with the process according to the invention are particularly suitable for controlling
  • Nematodes and arachnids include: From the order of the Isopoda, for example Oniscus asellus, Armadillidium vulgare, Porcellio scaber.
  • Diplopoda e.g. Blaniulus guttulatus.
  • Chilopoda e.g. Geophilus carpophagus, Scutigera spp ..
  • Thysanura e.g. Lepisma saccharina.
  • Orthoptera e.g. Acheta domesticus, Gryllotalpa spp., Locusta ⁇ migratoria migratorioides, Melanoplus spp., Schistocerca gregaria.
  • Thysanoptera e.g. Hercinothrips femoralis, Thrips tabaci
  • Homoptera e.g. Aleurodes brassicae, Bemisia tabaci, Trialeurodes vaporariorum, Aphis gossypii, Brevicoryne brassicae, Cryptomyzus ribis, Aphis fabae, Aphis pomi, Eriosoma lanigerum, Hyalopterus arundinis, Phylloxera vastatrix, Pemphigus sppe, Phros
  • Empoasca spp. Euscelis bilobatus, Nephotettix cincticeps, Lecanium corni, Saissetia oleae, Laodelphax striatellus, Nilaparvata lugens, Aonidiella aurantii, Aspidiotus hederae, Pseudococcus spp., Psylla spp.
  • Leptinotarsa decemlineata Phaedon cochleariae, Diabrotica spp., Psylliodes chrysocephala, Epilachna varivestis, Atomaria spp., Oryzaephilus surinamensis, Anthonomus spp., Sitophilus spp., Otiorrhynchus sulcatordimidhmpphppm, spp.
  • Anthrenus spp. Attagenus spp., Lyctus spp., Meligethes aeneus, Ptinus spp., Niptus hololeucus, Gibbium psylloides, Tribolium spp., Tenebrio molitor, Agriotes spp., Conoderus spp., Melolontha melolontha, Amphimalltrastitium Lissorhoptrus oryzophilus. From the order of the Hymenoptera e.g. Diprion spp., Hoplocampa spp., Lasius spp., Monomorium pharaonis, Vespa spp.
  • Hymenoptera e.g. Diprion spp., Hoplocampa spp., Lasius spp., Monomorium pharaonis, Vespa spp.
  • Dacus oleae Tipula paludosa, Hylemyia spp., Liriomyza spp ..
  • Hyalomma spp. Ixodes spp., Psoroptes spp., Chorioptes spp., Sarcoptes spp.,
  • Plant-parasitic nematodes include e.g. Pratylenchus spp., Radopholus similis, Ditylenchus dipsaci, Tylenchulus semipenetrans, Heterodera spp., Globodera spp., Meloidogyne spp., Aphelenchoides spp., Longidorus spp., Xiphinema spp., Trichodorus spp., Bursaph.
  • the active ingredients found with the method according to the invention act not only against plant, hygiene and stored-product pests, but also in the veterinary sector against animal parasites (ectoparasites) such as tick ticks, leather ticks, space mites, running mites, flies (stinging and licking), parasitic fly larvae, Lice, hair lice, featherlings and fleas.
  • animal parasites ectoparasites
  • tick ticks such as tick ticks, leather ticks, space mites, running mites, flies (stinging and licking), parasitic fly larvae, Lice, hair lice, featherlings and fleas.
  • Ischnocerina e.g. Trimenopon spp., Menopon spp., Trinoton spp., Bovicola spp., Werneckiella spp., Lepikentron spp., Damalina spp., Trichodectes spp., Felicola spp ..
  • Brachycerina e.g. Aedes spp., Anopheles spp., Cw / ex spp., Simulium spp., Eusimulium spp., Phlebotomus spp., Lutzomyia spp., Culicoides spp., Chrysops spp., Hybomitra spp., Atylotus spp., Tabanus spp ., Haematopota spp., Philipomyia spp., Braula spp., Musca spp., Hydrotaea spp., Stomoxys spp., Haematobia spp., Morellia spp., Fannia spp., Glossina spp., Calliphora spp., Lucilia spp., Chrysomyia spp., Wohlfahrtia spp., Sarcophag
  • Siphonaptrida e.g. Pulex spp., Ctenocephalides spp., Xenopsylla spp., Ceratophyllus spp ..
  • Hyalomma spp. Rhipicephalus spp., Dermanyssus spp., Raillietia spp., Pneumonyssus spp., Sternostoma spp., Varroa spp ..
  • Actinedida Prostigmata
  • Acaridida e.g. Acarapis spp., Cheyletiella spp., Ornitrocheyletia spp., Myobia spp., Psorergates spp., Demodex spp., Trombicula spp., Listrophorus spp., Acarus spp., Tyrophagus spp., Caloglyphus spp., Hypppectoles spp ., Psoroptes spp., Chorioptes spp., Otodectes spp., Sarcoptes spp., Notoedres spp., Knemidocoptes spp., Cytodectes spp., Laminosioptes spp ..
  • the active compounds found with the aid of the process according to the invention are also suitable for controlling mites, in particular house dust mites, for example Dermatophagoides pteronyssinus and Z farinae.
  • the active ingredients found with the method according to the invention are also suitable for controlling arthropods which are used in agricultural animals, such as, for example Cattle, sheep, goats, horses, pigs, donkeys, camels, buffalo, rabbits, chickens, turkeys, ducks, geese, bees, other pets such as dogs, cats, house birds, aquarium fish and so-called experimental animals such as hamsters, guinea pigs, rats and infest mice.
  • arthropods which are used in agricultural animals, such as, for example Cattle, sheep, goats, horses, pigs, donkeys, camels, buffalo, rabbits, chickens, turkeys, ducks, geese, bees, other pets such as dogs, cats, house birds, aquarium fish and so-called experimental animals such as hamsters, guinea pigs, rats and infest mice.
  • the compounds can be used in all development stages of normal, sensitive strains and also resistant strains. Treatment with agents containing one or more of these compounds can prevent or treat both economic losses in farm animals and diseases in humans and animals.
  • the following parasites are of particular interest as targets of the active compounds found:
  • Enoplida e.g. Trichuris spp., Capillaria spp., Trichomosoides spp., Trichinella spp.
  • Rhabditia e.g. Micronema spp., Strongyloides spp.
  • Strongylida e.g. Strongylus spp., Triodontophorus spp., Oesophagodontus spp. Trichonema spp., Gyalocephalus spp., Cylindropharynx spp., Poteriostomum spp
  • Cyclococercus spp. Cylicostephanus spp., Oesophagostomum spp., Chabertia spp Stephanurus spp., Ancylostoma spp., Uncinaria spp., Bunostomum spp., Bunostomum spp., Syngamus spp., Cyathostomum spp., Cyppococus spp. Pneumostrongylus spp., Spicocaulus spp.
  • Elaphostrongylus spp. Parelaphostrongylus spp., Crenosoma spp., Paracrenosoma spp., Angiostrongylus spp., Aelurostrongylus spp., Filaroides spp., Paraf aroides spp., Trichostrongylus spp., Haemonchus spp., Ostertagia spp., Marshallagia spp., Cooperia spp., Nematodirus spp., Hyostrongylus spp., Obeliscoides spp., Amidostomum spp., Ollulanus spp. Dictyocaulus spp., Muellerius spp., Protostrongylus spp.
  • Oxyurida e.g. Oxyuris spp., Enterobius spp., Passalurus spp., Syphacia spp., _4_? Pt-culuris spp., Heterakis spp.
  • Ascaridia e.g. Ascaris spp., Toxascaris spp., Toxocara spp., Parascaris spp., Anisa- / s spp., Ascaridia spp.
  • Spirurida e.g. Gnathostoma spp., Physaloptera spp., Thelazia spp., Gongylonema spp., Habronema spp., Parabronema spp., Draschia spp., Dracunculus spp.
  • Filariida e.g. Stephanofilaria spp., Par ßlaria spp., Setaria spp., Jo ⁇ spp., Dirofilaria spp., Litomosoides spp., Brugia spp., Wuchereria spp., Onchocerca spp.
  • Gigantorhynchida e.g. Filicollis spp., Moniliformis spp., Macracanthorhynchus spp., Prosthenorchis spp.
  • Trypanosomatidae e.g. Trypanosoma b. brucei, T. b. gambiense, T. b. rhodesiense, _T. congolense, T. cruzi, T. evansi, T. equinum, T. lewisi, T. percae, T. simiae, T. vivax, Leishmania brasiliensis, L. donovani, L. tropica
  • Trichomonadidae e.g. Giardia lambilia, G. canis.
  • Hartmanellidae e.g. Acanthamoeba sp., Hartmanella spp. Apicomplexa (Sporozoa), e.g. Eimeria acervulina, E. adenoides, E. alabahmensis,
  • Cryptosporidium spec. Toxoplasmadidae e.g. Toxoplasma gondii Sarcocystidae, e.g. Sarcocystis bovicanis, S. bov ⁇ hominis, S. neuvona, S. ovicanis, S. ovifelis, S. spec, S. su ⁇ hominis Leucozoide, e.g. Leucozytozoon simondi
  • Plasmodiidae e.g. Plasmodium berghei, P. falciparum, P. malariae, P. ovale, P. vivax, P. spec. Piroplasmea, e.g. Babesia argentina, B. bovis, B. canis, B. spec, Theileria parva, T. spec. Adeleina, e.g. Hepatozoon canis, H. spec.
  • Myxospora and Microspora e.g. Glugea spec. and Nosema spec, as well as Pneumocystis carinii, Ciliophora (Ciliata), e.g. Balantidium coli, Ichthiophthirius spec., Trichondina spec. or Epistylis spec.
  • the compounds and agents found are also effective against protozoa of insects, such as those of the Microsporidia strain, especially those of the order Nosema, especially those of the species Nosema apis, which are parasites of the honeybee.
  • the present invention therefore also relates to the use of
  • the library and the DNA analysis were carried out as described in WO 9.8 / 15625.
  • the total RNA was grown according to the GTC / CsCI pillow method
  • Haemonchus contortus nematodes are extracted and isolated (Sambrook et al. 1989) or obtained in a single step by GTC / phenol / chloroform extraction (Chomczynski and Sacchi 1987). Poly (A) + RNA was isolated by chromatography on oligo (dT) cellulose (Aviv and Leder, 1972).
  • RNA from Haemonchus contortus (20 ⁇ g per lane) was separated in an agarose gel (Sambrook et al. 1989; McMaster and Carmicheal 1977) and transferred to a Hybond N membrane (Amersham) using a basic capillary transfer method (Chomczynski, 1992) , Radiolabeled samples were prepared by randomized labeling of linearized plasmid DNA (HO 10-R), using a megaprime kit (Amersham, Braunschweig, Germany) and 50 ⁇ Ci [ ⁇ - 32 P] dCTP (3000 Ci / mmol, ICN, Meckenheim, Germany) were used. Hybridization was carried out overnight at 65 ° C. in 6 ⁇ SSC (1 ⁇ SSC: 0.15 M
  • the 5V3 'RACE method was used to isolate the 5' and 3 'ends missing in the identified cDNA clone.
  • the 5'-RACE is based on the specific amplification of the 5 'end of a gene from mRNA.
  • the first strand of cDNA is synthesized using a sequence-specific primer and the AMV reverse transcriptase.
  • a poly (A) tail is attached to the product, so that in the subsequent PCR an oligo dT anchor.
  • primer and a "nested" sequence-specific primer can be used.
  • Another "nested" primer can be used in a second PCR to ensure specificity.
  • cDNA was synthesized from 1 ⁇ g of total H. contortus RNA with the primer 5'-GGT CAC CGT CGT CCC AGA AA-3 'using the 5'-RACE kit from GIBCO BRL (Eggenstein, Germany). Superscript reverse transcriptase was used for this. The C-tailing of the C-terminus of the cDNA was carried out using the deoxynucleotidyltransferase terminals.
  • the first amplification was carried out with 400 nM of an oligo-deoxy-inosyl anchor primer (5'-CUA CUA CUA CUA GGC CAC GCG TCG ACT AGT ACG GGI IGG GII GGG IIG-3 ') and 400 nM of the first "nested" primer 5'-CCA TTC GAT TCC TCT TCT CG-3 '(Birsner and Grob, Denzlingen, Germany) in 50 ⁇ l containing 200 ⁇ M each dNTP,
  • the first denaturation was at 94 ° C for 5 minutes, followed by 35 cycles of 1 minute each at 94 ° C, 1 minute at 53 ° C and 2 minutes at 72 ° C, again followed by a final synthesis step of 10 minutes at 72 ° C.
  • the reaction conditions for the "nested" PCR were the same as described above, with the exception that 1 ⁇ l of the first amplification product was used as a template was used, as well as the gene-specific second "nested" primer 5'-GTC GAT GGT GCA GAT TTC GC-3 ', a shortened form of the anchor primer (5'-CUA CUA CUA CUA GGC CAC GCG TCG ACT AGT AC-3' ) and only 25 cycles were performed at an annealing temperature of 53 ° C.
  • the 3'-RACE-PCR (GIBCO BRL, Eggenstein, Germany) was carried out with 1 ⁇ g of the total RNA adult H. contortus and 500 nM of the oligo dT adapter primer 5'-GGC CAC GCG TCG ACT AGT ACT TTT TTT TTT TTT T-3 'was performed, starting with preincubation for 10 minutes at 70 ° C and 2 minutes at 4 ° C. After adding 2.5 mM MgCl 2 , 500 ⁇ M each dNTP, 10 ⁇ M DTT and 200 U
  • the first amplification was carried out with 400 nM of a universal adapter primer (5 '-CUA CUA CUA CUA GGC CAC GCG TCG ACT
  • AGT AC-3 ' 400 nM of the sequence-specific primer 5'-TTTGTTCTT CCT TGG TAT CC-3' in 50 ul containing 200 mM each dNTP, 1.5 M MgCl 2 , a tenth of the "tailed" cDNA and 2.5 U native Taq DNA polymerase.
  • the first denaturation step was at 94 ° C for 3 minutes, followed by 35 cycles of 1 minute each at 94 ° C, 1 minute at 51 ° C and 2 minutes at 72 ° C, and a final synthesis step of 15 minutes at 72 ° C.
  • RNA from the glyoxal gel or genome DNA from a TBE agarose gel on a neutral Hybond-N nylon membrane [Amersham, Braunschweig] is carried out after the 'Downward Alkaline Capillary Transfer' in alkaline transfer solution according to the Chomczynski (1992) method for 2 h.
  • the membrane is then neutralized for 20 minutes in 0.2 M sodium phosphate buffer (pH 6.8), dried and baked at 80 ° C. for 20-60 minutes.
  • the membrane is pre-coated with 5 ml / cm 2 . Hybridization solution sealed in plastic bags and incubated for 3 h at 65 ° C.
  • the buffer is replaced by a hybridization solution.
  • Rapid Hyb. Solution Amersham, Braunschweig
  • prehybridization takes place in 30 min at 65 ° C without additional prehybridization solution.
  • the hybridization is carried out at 65 ° C. overnight.
  • the membrane is then washed once with 65 ° C. 2x SSC / 0.1% SDS for 20 min and three times with 0.1 ⁇ SSC / 0.1% SDS for 1 h each.
  • the membrane is exposed on Kodak X-OMAT or Kodak BIOMAX-MS X-ray films with the appropriate intensifying screen at -80 ° C.
  • the TNT T7 / T3 coupled reticulocyte lysate system (Promega) was used to view the full length of the coding sequence of HO 10-R in the presence of 35 S-labeled methionine and cysteine (ICN, Eschwege, Germany) according to the manufacturer's instructions to transcribe and translate.
  • the RNA was translated using a rabbit reticulocyte lysate system (Promega, Serva, Heidelberg), using a 40 ⁇ Ci 35 S-labeled mixture (> 1000 Ci / mmol, ICN, Meckenheim, Germany), 1 ⁇ g circularized HO 10-R plasmid DNA and 10 U T3 RNA polymerase were used. The reaction was carried out at 30 ° C for 90 minutes.
  • a positive control contained 1 ⁇ g luciferase control
  • reaction products were separated by SDS polyacrylamide gel electrophoresis (Lämmli 1970) and fluorographed using the "Amplify Fluorography Solution” (Amersham Pharmacia Biotech) or 1 M sodium salicylate (pH 7) (Chamberlain 1979), the gels were then dried and exposed (Kodak BioMax MR Film with amplifier at -80 ° C), see Fig. 1 (B).
  • the clones were removed by the dideoxynucleotide chain termination method
  • RNA 50-100 mg of H. contortus worms frozen in liquid nitrogen were in. 1 ml of TRIZOL [Gibco, Düsseldorf] added.
  • the nematodes were homogenized together with the TRIZOL 3x for 15 seconds in a glass potter and incubated at RT for 5 minutes. After adding 200 ⁇ l chloroform per ml TRIZOL and shaking the sample for 15 sec, the mixture was incubated for a further 2-3 min at RT before being centrifuged for 10 min at 7,000-12,000 ⁇ and 4 ° C.
  • the upper aqueous phase contains the RNA, the Inte ⁇ hase the genomic DNA, the red organic
  • E. coli cells were pelleted from a 5 ml overnight culture for 5 min at 5,000 ⁇ m and 4 ° C. in a Heraeus undersink centrifuge, washed with 5 ml PBS and centrifuged again , The pellet was then resuspended in 1 ml of TRIZOL (Gibco, Düsseldorf) and worked up further.
  • the cell pellet washed with PBS was resuspended in PBS " and the cells were destroyed using several short ultrasonic pulses (Sonifier B-12, Branson Sonic Power Company, Danbury, USA), liquid nitrogen and by adding lysozyme.
  • the cell pellet can also be resuspended in 1 ml PBS or urea lysis buffer (8 M) and subjected to a brief ultrasound treatment (Sonifier B-12, Branson Sonic Power Company, Danbury, U.S.A.). Then the protein content according to Bradford (1976) or Lowry et al. (1951).
  • HO 10-R fragments - the complete HO 10-R cDNA, the N-terminal end without TM domains and the C-terminal end after the 7th TM domain - were used to produce polyclonal antibodies against the HO 10-R protein - Cloned into the expression vector pRSET B (Invitrogen, Leek, NL) and thus fused N-terminally with a 6xHis tag while observing the reading frame.
  • the annealing temperature in all three plasmid PCR was first 56 ° C over 5 cycles and then 62 ° C over 30 cycles.
  • the PCR products were digested with the enzymes BamHI and HindIII and ligated directionally into the pRSET B expression vector, which was also linearized by BamHI / HindTH.
  • pRSET B vector expression is controlled via a viral promoter of the bacteriophage T7.
  • the cloning was therefore carried out in the XL1-Blue E. coli strain which contains no gene of the T7 RNA polymerase.
  • the recombinant plasmid was then transformed into BL7 (De3) pLysS E. coli cells expressing T7 polymerase, which additionally contain the plasmid pACYC184, which is stabilized via chloramphenicol resistance, and in small amounts the T7 lysozyme, a natural inhibitor of T7 RNA Polymerase express. Since these cells are under the control of the lacUV5 promoter, IPTG-
  • a single colony with the desired HO 10-R plasmid was isolated from a fresh LB plate with 50 ⁇ g / ml ampicillin and 35 ⁇ g / ml chloramphenicol
  • fusion protein was induced by adding 1 mM ff TG and the 100 ml culture was incubated for a further 3-4 h at 37 ° C. After the incubation, the induced cells were centrifuged for 15 min at 5.Q00 ⁇ m and 4 ° C (Heraeus under-table centrifuge), the pellet was washed in PBS and then resuspended in 8 ml of 8 M urea lysis buffer. The cells were disrupted by immersing the cells 3 times in liquid nitrogen and then thawing them at 37 ° C. After the first nitrogen treatment, 0.75 mg / ml
  • Lysozyme added. After the last incubation in liquid nitrogen, the mixture was incubated for 20 min at 16 ° C., followed by short ultrasonic pulses of 10 sec each and cooling in an ice water bath until the solution had a water-like viscosity. After centrifugation for 10 minutes at 13,000 ⁇ m and 4 ° C (Beckman J2-21; JS 13.1 rotor), an induced 150 ⁇ l sample was taken with
  • the remaining supernatant was transferred to a fresh vessel for further purification by means of affinity chromatography and stored at ⁇ 20 ° C.
  • Enrichment was carried out under denaturing conditions via the N-terminal 6xHis tag using the IMAC system ('Immobilized Metal Affinity Chromatography') via TALONspin columns from Clontech [Palo Alto, U.S.A.].
  • the resin in the column was first equilibrated separately with 5 vol. 8 M urea lysis buffer, pH 8.0, sedimented for 4 min at 3,000 ⁇ m and 4 ° C and together with the
  • the peptide fraction blotted on Immobilon was introduced into the reaction chamber of the amino acid sequencer PROCISE 492 (Applied Biosystems, Rothstadt) and the amino acids in a 140 C-PTH- Analyzer and UV detector 785 A (Applied Biosystems, Rothstadt) separated.
  • the amino acids were quantified by 'reversed phase' HPLC and identified by means of retention time comparison using a standard chromatogram prepared before the sequence analysis.
  • HEK-293 cells (ATCC: CRL 1573) - Human, embryonic, kidney
  • the adherent cell lines COS-7 and HEK-293 were cultivated in 110 mm tissue culture dishes [Greiner, Solingen] in a volume of 10 ml medium at 37 ° C., 5% CO 2 and 95% atmospheric humidity. In order to maintain the cell culture, COS-7 and HEK-293 cells were cultivated in DMEM medium.
  • the media contained 3.024 g / 1 NaHCO 3 , 10% FCS, 50 U / ml penicillin, and 50 ⁇ g / ml
  • the non-liposomal transfection reagent FuGENE 6 from Röche Molecular Biochemicals (Mannheim) was used to transiently introduce foreign DNA into mammalian cells (Kurachi et al. 1998).
  • 0.5 - 1.5 x 10 5 cells in 2 ml medium were applied to 35 mm tissue culture dishes in which the later confocal laser scanning microscopy, a sterile slide glass coated with 1% gelatin was placed.
  • the cells were cultured overnight at 37 ° C, 5% CO 2 and 95% humidity. The medium was changed again before the transfection.
  • the desired plasmid HO 10-R was cloned in the correct reading frame into the slightly modified expression vector pSecTag A [Invitrogen, Leek, NL] or pIRES ⁇ eo [Clontech, Palo Alto, U.S.A.].
  • pSecTag A Invitrogen, Leek, NL
  • pIRES ⁇ eo Clontech, Palo Alto, U.S.A.
  • the complete coding region of the HC110-R-DNA was cloned into the HindHI / Sall site of pEGFP-N3 to the HO 10-R protein C-terminal with GFP (Green
  • the 137 kDa fusion protein is in transiently transformed recipient cell lines expressed, which can be demonstrated by Western blot analysis.
  • the CLSM Confocal Laser Scanning Microscopy shows that the HOlO-R-GFP fusion protein in COS-7 and HEK-293 cells is located in the cytoplasm and to a lesser extent also on the plasma membrane (see also Fig. 8th).
  • a Zeiss IM 35 microscope (Zeiss, Oberkochen) with a Leica CLSM attachment TCS NT ('Confocal Laser Scanning Microscope Unit', Leica Lasertechnik, Heidelberg), version 1.5.451, was used for confocal laser scanning microscopy.
  • the fluorescence of the GFP protein and of the dye fluorescein isothiocyanate (FITC) was measured at 488 nm using an argon laser, which was used for rhodamine, Texas red, phycoerythrin, Alexa 568, LysoTracker TM Red DND-99, MitoTracker TM Red CMX Ros or propidium iodide excited at 568 nm with a krypton laser.
  • the fusion protein is mainly found in acidic lysosomes such as the
  • the vectors pEGFP Cl and pEGFP N3 (Clontech, Palo Alto, CA, U.S.A.) were cut with the restriction enzymes Hind III and Sal I.
  • the HO 10-R, fill length 'cDNA was amplified using the P83EGFP__ATG Hindlü 5' primer
  • a ⁇ 2 -adrenergic receptor from the mouse (Gen Bank Accession No .: P 18762; Nakada et al. 1989) was fused with a C-terminal EGFP tag by combining the 'full length' cDNA with the P117 mouse 2 AR Xhol 5 '-
  • the vector pMyc ⁇ xHis is derived from the vector pSecTagA [rnvitrogen, Leek, NL] by double digestion with the restriction enzymes Nhil and Sfil, followed by
  • the coding region of HO 10-R was determined using the PCR primers P83MycTag_ATG BamHI 5'-primer 5'- ATA GGA TCC TTC GGT TTA ATA CCA ACA TGA GG-3 'and P3058MycTag_o.TGA Xbal 3'-primer 5' -CCT GTC TAG AAA CAT TTC GCC.
  • AAT AGT TAG G-3 ' was amplified at an annealing temperature of 56/60 ° C., cut with the enzymes BamHI and Xbal and ligated into the pMycöxHis vector, likewise linearized by BamHI Xbal, and transformed into E. coli DH5 ⁇ cells.
  • COS-7 cells were stably transfected with the construct and kept under Zeocin selection pressure.
  • the pIRESlweo vector also contains an internal ribosome binding site (IRES) of the encephalomyocarditis virus (ECMV) shortly before the start ATG of the neomycin resistance gene (Rees et al. 1996).
  • IRS internal ribosome binding site
  • ECMV encephalomyocarditis virus
  • a Zeiss IM 35 microscope (Zeiss, Oberkochen) with a Leica CLSM attachment TCS NT ('Confocal Laser Scanning Microscope Unit', Leica Lasertechnik, Heidelberg), version 1.5.451, was used for confocal laser scanning microscopy.
  • the fluorescence was excited at 488 nm with an argon laser and at 568 nm with a krypton laser.
  • Z series of optical sections through the cell were scanned with a resolution of 1024 x 1024 pixels and a layer depth of 0.5 ⁇ m (Giese et al. 1995).
  • the evaluation was carried out with the AVS software . (Advanced Visual Systems Inc., Waltham, MA, USA) and later with Adobe
  • Proteins (20 ⁇ g / lane) were separated by SDS-PAGE (Lammli et al., 1970) and electroblotted on nitrocellulose membranes.
  • the blots were incubated at room temperature with ⁇ -LTX at a concentration of 20 nM in TST for 2 h.
  • an anti- ⁇ -LTX antibody from rabbit, Calbiochem-Novabiochem
  • an antibody conjugated with peroxidase and directed against IgG from rabbit from goat, dilution: 1: 25,000
  • the detection of the antibodies was carried out in all experiments with ECL (Amersham-Pharmacia). See also Figure 9.
  • the intracellular free Ca 2+ concentration [Ca 2+ ] j was transiently transfected with the HO 10-R-EGFP or ß 2 -AR-EGFP construct COS-7 and HEK293 cells using the calcium Imaging method measured (see also Fig. 11).
  • 2 x 10 5 COS-7 and HEK293 cells each were placed on a 42 mm cover glass coated with 1% gelatin in 55 mm tissue culture dishes with 5 ml of DMEM medium (with 10% FCS and pen / strep).
  • the transfection was carried out using the non-liposomal transfection reagent FuGENE 6 (Röche Molecular Biochemicals, Mannheim).
  • the cells were loaded with 1 ⁇ M fura-2 / acetoxymethyl ester (Fura-2 / AM) (Sigma, Deisenhofen) 48 h after the transfection in a Na + HBS solution
  • the cells loaded with Fura-2 / AM were viewed in an inverted microscope (Zeiss, Aciovert, Germany) and in parallel in a digital imaging fluorescence microscope (PTI) and transfected at a wavelength of 440 and 490 nm , as well as non-transfected cells. On average, 5-7 transfected and non-transfected cells were selected by setting an ROI ('region of interest'). The absorbance was measured at 340 nm (calcium-bound Fura-2 / AM) and 380 nm (free Fura-2 / AM), the emission at 510 nm. The evaluation was carried out with the
  • Image Master l.x software by forming the quotient of 340: 510 nm, 380: 510 nm and the ratio of 340/380: 510 nm ('background corrected i ages') as a function of the added agent.
  • Agents were always added 6 min after the start of the measurement by removing an appropriate volume of Na + -HBS buffer and pipetting in directly the agents into the sample vessel for a further 30 to 50 min.
  • the total volume in the sample vessel was a constant 1.5 ml throughout the entire experiment.
  • ⁇ -LTX 75 nM ⁇ -LTX were also added here 6 minutes after the start of the experiment.
  • the optimal ⁇ -LTX concentration of 75 nM was tested on HEK-293 cells which express the ⁇ 2 -adrenergic receptor with C-terminal GFP tag ( ⁇ 2 -R-GFP).
  • CdCl 2 (1 ⁇ M and 10 ⁇ M each) were dissolved in Na + -HBS, nifedipine (15 ⁇ M) and EGTA (2 mM) in 0.1% DMSO.
  • ⁇ -LTX dissolved at a concentration of 300 nM in 50 mM Tris-HCl, pH 8.0; BAY 44-4400 was first dissolved in pure DMSO (stock solutions between 0.004-10 ⁇ g / ml). The stock solutions were in the Na + -HBS-
  • Buffer set to the desired concentration.
  • the maximum detachable amount of the active substance BAY 44-4400 at a final concentration of 0.1% DMSO was determined by applying a series of dilutions in Na + -HBS. Neither 0.1% DMSO nor any other test component interacted with Fura-2 / AM at the selected concentrations.
  • the data were evaluated using the Excel 98 spreadsheet program. The results result from at least 2-4 reproduced experiments, each with 4-8 transfected and non-transfected cells.
  • the intracellular calcium concentration was determined according to Grynkiewicz et al. (1985) after previous calibration according to McCormack et al. (1991).
  • Antibodies or proteins that give clear signals in immunofluorescence occasionally show no reaction when using the immunoblot method. Since denaturation of the proteins is necessary to carry out SDS-PAGE, conformation-dependent epitopes may be destroyed.
  • Antibodies or proteins that specifically recognize such epitopes can therefore no longer bind. So neither with the biotinylated active ingredient PF 1022 A nor with the Mo ⁇ holin derivative BAY44-4400, which is more soluble in comparison to the PF1022A, can HO-R-specific binding be identified in the Western blot.
  • BAY44-4400 differs from PF1022A in that it has 2 Mo ⁇ holin residues that are covalently bound to the phenyl rings of the two D-phenyllactyl residues of PF1022A.
  • a HO 10-R-specific binding can be detected in the Western blot.
  • the immx detection was carried out after the incubation with the ligand BAY44-4400, with a rabbit anti-PF1022A-KLH -] _ mm serum and a goat anti-rabbit IgG-HRP antibody.
  • a partially renatured SDS-polyacrylamide gel with the protein fractions of non-transfected, HO10-R-Myc / His transiently transfected HEK-293 cells as well as the N-terminus of HO 10-R and total protein from H. contortus expressed in E. coli was blotted , incubated with PF1022A-biotin and detected via streptavidin-HRP. Both blots each had a distinct one. 116 kDa band in the HOlO-R-Myc / His stably expressing HEK-293-
  • the precipitate was detected via the N-terminally fused His tag with a mouse anti-His IgG and a rabbit anti-mouse IgG-HRP antibody. Only the N-terminal 54 kDa region of HO 10-R is precipitated by PF1022A, consequently the C-terinine of HO 10-R not bound to PF1022A is removed beforehand by magnetic separation. Non-specific binding of the N- or C-terminus of HO 10-R to the streptavidin-coupled
  • Beads were excluded by not adding a biotinylated PF1022A to a reaction.
  • HEK-293 cells transiently transfected with HO10-R-GFP or GFP-HO10-R or transiently cotransfected with HO10-R-Myc / His and GFP.
  • non-transfected and transfected HEK-293 cells transfected with the ⁇ -R-GFP or the MI-R-GFP were used. 24 hours after the transfection, the cells were incubated with biotinylated PF1022A and PF1022A-bound cells were detected via streptavidin-phycoerythrin and finally fixed.
  • a negative control of HO 10-R-GFP transfected cells was incubated without streptavidin-phycoerythrin without PF1022A-biotin.
  • phycoerythrin has an absorption spectrum overlapping with EGFP with sufficiently separated emission spectra so that both fluorochromes can be excited at only one wavelength.
  • Cell debris was excluded from measuring the fluorescence intensity by placing a gate on the main cell population. For quantitative The limits for negative, unstained and positive, GFP-fluorescent cells were determined based on the non-transfected and GFP-transfected cells.
  • the 4.6% green fluorescent, non-transfected HEK-293 (autofluorescence) cells were subtracted from the other GFP fluorescent samples; and the value for the non-specific staining of the cells by the streptavidin (5.4%) coupled with phycerythrin was subtracted from all red-fluorescent cells (Table 1).
  • PF1022A shows neuropharmacological in vitro activity between 10 "9 -10 " 3 mg / ml depending on the type of nematode.
  • BAY44-4400 a more soluble Mo ⁇ holin variant of PF1022A, examined for HO 10-R transiently or stably expressing HEK-293 cells.
  • the optical in vitro and in vivo was more than 100 times less effective Antipode used for PF1022A, PF1022-001.
  • BAY44-4400 and PF1022-001 were initially dissolved in pure DMSO due to their hydrophobicity.
  • the strain concentration was chosen so that only 0.1% DMSO was present in the test batch. For DMSO concentrations up to and including 0.1%, it could be ruled out in test trials that they would impair the test results in untransfected HEK-293 cells transfected like HO10-R-GFP (Fig. 14A).
  • Fig. 14B and C show an example of the stimulation of HO 10-R-GFP and MI-R-GFP of transfected cells with 400 ng / ml BAY44-4400 and PF1022-001. Since the PF1022A derivatives may also be absorbed by the cells and thus can interfere with signal transduction pathways and because the PF 1022 A-
  • the derivatives remain in the worm for a longer time.
  • the cells were preincubated with the derivatives for 90 min.
  • Cells preincubated for 90 min with 4 ng / ml or 400 ng / ml BAY44-4400 or PF1022-001 showed no change in the [Ca 2+ ] i (Fig. 14D).
  • concentrations from 300 ng / ml BAY44-4400 in contrast to the optical antipode, a slight but reversible cell swelling as a direct effect on the anthelmintic in HO10-R-GFP transfected HEK-293 cells was found a monitor, which showed the cells enlarged 40 times.
  • PF1022-001 400 ng / ml BAY44-4400 or PF1022-001 (Fig.15E) preincubated for 90 min. After the cells had been incubated and loaded with Fura-2 / AM, unbound or ingested active ingredient was carefully washed away before the cells were stimulated with 75 nM ⁇ -LTX. HO 10-R transfected cells preincubated with the optical antipode PF1022-001 showed an increase in the [Ca 2+ ] i by 4 + ng / ml PF1022-001 by 102 + 6.4 nM (Fig. 15D) and at 400 ng / ml a comparable increase of 109 + 8.4 nM Ca 2+ (Fig.15E).
  • mice and rabbits Female NMRI mice and rabbits (chinchilla bastards) were used to obtain antibodies.
  • NMRI mice 3 15 micrograms of the purified 21 kDa C-terminal HO 10-R protein fragment in 100 .mu.l PBS "together were x dissolved with 100 ul FCA and naive on days 1, 8 and 15 show two NMRI Mice injected subcutaneously, blood collection and serum collection on day 23.
  • the blood obtained by cardiac puncture was initially used for serum production
  • Figure 2 Fill length cDNA sequence of HC110-R and deduced amino acid sequence
  • Signal peptide (residues 1-21, bold), lectin-like sequence (residues 22-125, dotted), thr-stretch (residues 128-147, gray background); Cysteine-rich area of the structure CX 9 WX 12 CX 9 WXCX 5 WX 9 CX 3 W (residues 166-221, curved line, Cys and T ⁇ residues additionally fat); 4-Cys region of the structure CXWWX 6 WX 4 CX n CXC (residues 478-524, dashed, Cys and T ⁇ residues additionally bold); the 7 transmembrane regions (between residues 563-772, bold and underlined); the proline-rich stretch (residues 845-861, shaded gray), the PEST region (residues 915-933, shaded gray); the N-glycosylation site (residues 26, 499 and 8
  • Figure 3 Alignment of the derived amino acid sequences of the H. contortus HC110-R and Caenorhabditis elegans cosmid clones B0457 (CE-B0457: GenBank Accession No .: Z54306
  • Figure 4 Alignment of the 7-transmembrane receptor HC110-R and several other receptors of the secretin subfamily
  • HO 10-R Haemonchus contortus heptahehkaler O ⁇ han transmembrane receptor (accession no .: AJ272270); BTLAT3: Bos taurus Lafrophilin-3 (several splicing variants, accession no .: G4164053-G4164075); RNLAT1: Rattus norvegicus Latrophilin-1 (Accession No .: U78105, U72487); MMEMR1: Mus musculus EMR1
  • Hormone receptor precursor (Accession No .: Q61549); HSCD97: Homo sapiens leukocyte activation antigen CD97 (Accession No .: P48960); MMCADH: M. musculus Cadherin 7 transmembrane receptor precursor (Accesion No .: G3800738); XLXRFl: Xenopus laevis corticotropin releasing receptor precursor (accession no .: O42602); RNVIP1: R. norvegicus vasoactive intestinal polypeptide receptor
  • Forerunner 2 (Accession no .: Q02643).
  • the seven transmembrane domains are gray (I-VII) and the highly conserved putative disulfide bond is shown in bold.
  • Figure 5 Alignment of the derived amino acid sequences of H. contortus HC 110-R and R. norvegicus Latrophilin-1 (GenBank Acc. No.
  • Figure 6 Structure of the HClO-R protein and the latrophilin-1 of the rat
  • B HO 10-R protein structure with the following characteristic motifs: signal sequence (SP), lectin domain (lectin), thr-stretch (T-stretch), Cys motif (signature), 4-Cys region (4C -region), 7-transmembrane domain (1-7, black), the pro-rich motif (P-rich) and the PEST sequence (PEST).
  • SP signal sequence
  • lectin lectin
  • T-stretch thr-stretch
  • Cys motif signature
  • 4-Cys region (4C -region
  • 7-transmembrane domain (1-7, black
  • P-rich pro-rich motif
  • PEST PEST sequence
  • Latrophilin-1 has no thr stretch, but contains an additional olfactomedin binding motif (olfactomedin), a pro-thr region (PT region), a linker domain (left) and a long region containing several repeats (long).
  • olfactomedin olfactomedin binding motif
  • PT region pro-thr region
  • linker domain left
  • long long region containing several repeats
  • COS-7 cells were transfected with HO 10-R-GFP and ⁇ 2 -R-GFP, both of which carry a C-terminal GFP tag.
  • the CSLM was performed 24 hours after the transfection.
  • the bar corresponds to 10 ⁇ m.
  • HO 10-R-GFP is expressed on the plasma membrane and in cytoplasmic compartments. A densification of cytoplasmic vesicles can be observed in the vicinity of the nucleus.
  • (C) ⁇ 2 -R-GFP-transfected cells show a GFP fluorescence pattern similar to HO 10-R-GFP, or as described under point (A).
  • the receptor can be located on the plasma membrane and in vesicles and can be partially localized with acid lysosomes, stained with LysoTracker Red DND-99 at 37 ° C for 1 h.
  • the denatured proteins were incubated for 2 h with 20 nM ⁇ -LTX and possible bindings of ⁇ -LTX with a rabbit anti- ⁇ -LTX IgG (1: 5000), a goat anti-rabbit IgG HRP antibody ( 1: 25000) and the ECL system is detected.
  • the blot was blocked overnight, incubated with 20 nM pure ⁇ -LTX and ⁇ -LTX-binding proteins with a rabbit anti- ⁇ -LTX IgG antibody (1: 5000), biotin protein A (1: 100), streptavidin -Peroxidase (1: 3000) and the ECL system.
  • HEK-293 cells were loaded with 1 ⁇ M Fura-2 / AM 48 h after the transient transfection with HO10-R-GFP for 30 min. The cells were stimulated 6 min after the start of the measurement with different ⁇ -LTX concentrations for a further 44 min. The quotient from 340/380 nm (ratio) was measured as a function of time, n indicates the number of selected cells.
  • HO10-R-GFP expressing cells were added 50 nM (gray line) or 75 nM ⁇ -LTX (black line).
  • C HO10-R-GFP expressing cells were stimulated with 90 nM (gray line) or 120 nM ⁇ -LTX (black line).
  • FIG. 11 Ca _2 + imaging of HC110-R transfected HEK 293 cells
  • HO 10-R-GFP C-terminal HO 10-R (HO 10-R-GFP) tagged with GFP: black line.
  • R-GFP black line
  • Fig. 13 Detection of PF1022A binding to HC110-R transfected HEK-293 cells by FACScan
  • R-GFP and MI-R-GFP transfected and HEK-293 cells transiently co-transfected with HO 10-R-Myc / His and GFP were treated with 0.5 ⁇ g / ml PF1022A-biotin and streptavidin-phycoerythrin (24 h after the transfection 1: 300) and then fixed.
  • PF1022A-biotin PF1022A-biotin
  • streptavidin-phycoerythrin 24 h after the transfection 1: 300
  • the cells were loaded with 1 ⁇ M Fura-2 / AM in non-transfected HEK-293 cells and 48 h after the transient transfection with HO10-R-GFP or
  • Non-transfected (n.t, gray line) and HO10-R-GFP transfected (HC 110-R-GFP, black line) cells were used for control after 6 min
  • the cells were loaded with 1 ⁇ M Fura-2 / AM in unfransfected HEK-293 cells and 48 h after transient transfection with HO10-R-GFP or MI-R-GFP.
  • the amount of ⁇ -LTX used was always 75 nM.
  • the cells were washed around with a flow rate of 1.6 ml Na + -HBS / min. The quotient from 340/380 nm (ratio) was measured as a function of time, n indicates the number of selected cells.
  • Davletov BA Meunier FA, Ashton AC, Matsushita H., Hirst WD, Lelianova VG, Wilkin GP, Dolly JO and Ushkaryov YA (1998) Vescile exocatosis stimulated by ⁇ -latrotoxin is mediated by latrophilin and requires both external and stored Ca 2+ . EMBO J. 17, 3909-3920. 18. Davletov BA, Shamotienko OG, Lelianova VG, Grishin EV and
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Abstract

Die Erfindung betrifft auf Transmembranrezeptoren aus Helminthen und Arthropoden basierende Testsysteme und deren Verwendung zur Identifizierung und Charakterisierung von Stoffen mit Wirkungen gegen Helminthen, Arthropoden oder mit Wirkung auf den Calciumhaushalt von Organismen und/oder Zellen. Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung eines spezifischen Liganden in diesem Testsystem und dessen Verwendung als anthelmintischer oder arthropodizider Wirkstoff.

Description

Testsysteme und deren Verwendung zur Identifizierung und Charakterisierung; von Verbindungen
Die vorliegende Erfindung betrifft auf Transmembranrezeptoren aus Helminthen und
Arthropoden basierende Testsysteme und deren Verwendung zur Identifizierung und Charakterisierung von Stoffen mit Wirkungen gegen Helminthen, Arthropoden oder mit Wirkung auf den Calciumhaushalt von Organismen und/oder Zellen. Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung eines spezifischen Liganden in diesem . Testsystem und dessen Verwendung als anthelmintischer oder arthropodizider Wirkstoff.
Parasitische Helminthen und Arthropoden stellen für Menschen und Tiere ein erhebliches Gesundheitsproblem dar. Allein im Bereich der Landwirtschaft betragen die jährlich zur Bekämpfung oder Vermeidung von derartigen Parasiten hervorgerufenen
Schädigungen weltweit mehr als 7 Mrd. DM (Stand 1997). Zur Behandlung von durch die vorwiegend von Helminthen verursachten Endoparasitosen, sowie die in erster Linie durch Arthropoden hervorgerufenen Ektoparasitosen stehen eine große Zahl von Wirksubstanzen aus einer Reihe von Wirkstoffklassen zur Verfügung. Während der letzten zwei Jahrzehnte haben insbesondere derartige Wirkstoffe, die gleichzeitig eine sehr gute Wirkung gegen mehrere Parasitenspezies innerhalb eines Stammes (z.B. Helminthen), oder sogar über verschiedene zoologische Stämme hinweg (z.B. Helminthen und Insekten) aufweisen, an Bedeutung gewonnen. Zu ersteren zählen unter anderem die Breitspektrumanthelmintika wie z.B. die Benzimidazole oder die Imidazothiazole, während die makrozyklischen Laktone zu den letzteren zählen.
Mit den makrozyklischen Laktonen wurde zuletzt vor ca. zwei Jahrzehnten eine neue, breit wirksame Wirkstoffgruppe in den Markt eingeführt. Inzwischen haben je- doch eine Vielzahl von Endo-, als auch Ektoparasitenspezies Resistenzen gegen Vertreter einzelner, teilweise auch mehrerer Wirkstoffklassen gleichzeitig entwickelt. Daher besteht ein ständiger und zunehmend dringender Bedarf, neue antiparasitisch wirksame Substanzen zu entwickeln.
Zu den wenigen neuen aussichtsreichen Wirkstoffgruppen, an denen gegenwärtig ge- arbeitet wird, gehören die cyclischen Depsipeptide, welche Gegenstand umfangreicher Patent- (WO 93/19053, EP-OS 626 376, WO 94/19334, WO 95/07272, EPOS 626 375, EP-OS 657 171, EP-OS 657 172, EP-OS 657 173) und Forschungsaktivitäten sind (Conder et al 1995; Martin et al 1996; Sasaki et al 1992; Terada M 1992; Samson-Himmelstjerna et al. 2000) .
Zur Aufklärung des Wirkmechanismus eines Vertreters dieser Wirkstoffgruppe, dem PF 1022A (cyclo(-D-Lac-L-MeLeu-D-PhLac-L-MeLeu-)2) sind bereits mehrere Studien beschrieben worden (vgl. dazu Angaben in DE-A-197 04 024). Dazu gehörte auch die Identifizierung und Charakterisierung eines spezifischen Bindungsproteins für zyklische Depsipeptide und der für das Protein kodierenden DNA-Sequenz aus dem Schafparasiten Haemonchus contortus (DE-A-197 04 024). Im Rahmen der hier vorliegenden Erfindung wird die funktionale Interaktion des o.a. Proteins, genannt HC110-R, unter anderem mit dem Liganden BAY 44-4400 (cyclo(-D-Lac-L-MeLeu- D-p-Moφholinyl-PhLac-L-MeLeu-), als einem weiteren Vertreter der zyklischen Depsipeptide beschrieben. Dazu wurden rekombinante eukaryotische Zellinien konstruiert, in denen das HC110-R, basierend auf der in der früheren Anmeldung DE-A- 197 04 024 beschriebenen Sequenz ID No. 2, exprimiert wird.
Der vorliegenden Erfindung liegt demnach insbesondere die Aufgabe zugrunde, auf Basis von Transmembranrezeptoren von Helminthen und Arthropoden, bevorzugt aus Nematoden und Akarina, besonders bevorzugt aus Trichostrongylidae, ganz besonders bevorzugt aus Haemonchus spp. und insbesondere auf Basis des Rezeptors HO 10-R aus H. contortus, Testsysteme mit einem hohen Durchsatz an Testverbindungen (High Throughput Screening Assays; HTS-Assays) bereitzustellen. Als homologe Proteine werden solche Proteine betrachtet, die eine zumindest 70 %ige Identität, vorzugsweise 80 %ige Identität, besonders bevorzugt 90 %ige Identität, ganz besonders bevorzugt 95 %ige Identität, mit einer Sequenz gemäß SEQ ID NO: 2 des Dokuments DE-A-197 04 024, dessen Inhalt ausdrücklich Teil der vorliegenden Anmeldung sein soll, über eine Länge von wenigstens 20, vorzugsweise wenigstens 25, besonders bevorzugt wenigstens 30 fortlaufenden Aminosäuren und ganz besonders bevorzugt über deren Gesamtlängen aufweisen.
Der Grad der Identität der .Aminosäuresequenzen wird vorzugsweise bestimmt mit Hilfe des Programms GAP aus dem Programmpaket GCG, Version 9.1 unter Standardeinstellungen (Devereux et al. 1984).
Die Aufgabe wird gelöst durch die Bereitstellung von Polypeptiden, welche zumindest eine biologische Aktivität eines GPCR-Rezeptors ausüben sowie durch die Bereit- Stellung eines Verfahrens zur Gewinnung dieser Polypeptide und durch die Bereitstellung von Verfahren zum Identifizieren von nematizid und arthropodizid wirksamen Verbindungen.
Auf rekombinanten Mikroorganismen basierende Testsysteme wurden bereits viel- fältig zur Identifizierung von pharmazeutisch wirksamen Substanzen verwendet, unter anderem auch unter Verwendung von Mikroorganismen, die rekombinant parasitische Gene exprimieren (Klein und Geary 1997). Bisher sind jedoch keine Systeme bekannt, in denen parasitische Transmembranrezeptoren als rekombinante, funktionale Proteine in eukaryotischen Zellen als Targets verwendet werden. Durch die in dieser Erfindung beschriebenen Prüfsysteme lassen sich im High-Throughput-
Screening (HTS), bzw. im Ultra-HTS neue Agonisten und Antagonisten dieser neuen Rezeptorklasse identifizieren.
Die rekombinante Expression von Rezeptoren aus Nematoden hat sich regelmäßig als schwierig erwiesen. So ist es bisher im allgemeinen nicht gelungen, G-Protein gekoppelte Rezeptoren (GPCR) aus Nematoden so zu exprimieren, dass ihre ftmktionalen Eigenschaften (z.B. Empfindlichkeit gegenüber Inhibitoren) denen natürlicher Rezeptoren entspricht.
Es ist von großer praktischer Bedeutung, beispielsweise für die Suche nach neuen Anthelmintika oder Arthropodiziden, Rezeptoren aus Helminthen, insbesondere
Nematoden sowie aus Arthropoden in eukaryotischen Systemen funktionell auszuprägen.
Der vorliegenden Erfindung liegt somit auch die Aufgabe zu Grunde, eine Möglichkeit zur Expression von Transmembranrezeptoren, vor allem von GPC-Rezeptoren aus
Nematoden und Arthropoden bereit zu stellen und darauf basierend ein Testsystem zu entwickeln, das die Identifizierung von neuen nematizid und arthropodizid wirksamen Substanzen ermöglicht.
Die vorliegende Erfindung betrifft somit insbesondere die Expression und Verwendung eines orphanen G-Protein-gekoppelten Rezeptors aus Helminthen und Arthropoden, bevorzugt aus Nematoden und Akarina, besonders bevorzugt aus Trichostrongylidae, ganz besonders bevorzugt aus Haemonchus und am meisten bevorzugt aus dem parasitären Nematoden H. contortus als Zielprotein für die effektive Suche nach nematiziden Wirkstoffen.
Dieser Rezeptor wurde in einer cDNA-Bibliothek identifiziert, die aus dem gastro- intestinalen Nematoden H. contortus gewonnen wurde. Die cDNA kodiert für ein heptahelikales Transmembranprotein einer Größe von 110 kDa, das als HC110-R be- zeichnet wurde. Das Protein gehört zur Sekretin-Familie von G-Protein gekoppelten
Rezeptoren (GPCR) und zeigt eine hohe Ähnlichkeit zu Latrophilin (Abb.5).
Der HC11Q-R Rezeptor als Target
Der GPCR Latrophilin wurde ursprünglich aus dem Gehirn von Säugern isoliert.
Latrophilin hat eine molekulare Masse von 210 kDa und wird posttranslational an Rest 18 stromaufwärts des ersten Transmembransegments gespalten, besteht also aus zwei nichtkovalent verknüpften Untereinheiten. Die Untereinheit pl20 enthält den N- terminalen, hydrophilen extrazellulären Anteil, die p85-Untereinheit enthält die sieben Transmembran-Domänen und die intrazelluläre C-terminale Region des Latrophilins, die für GPCRs ungewöhnlich groß ist. Vor kurzem wurden zwei enge Homologe identifiziert, Latrophilin-2 und Latrophiliιi73 (siehe auch Abb. 6). Letzteres wird bevorzugt, wie auch das Latrophilin- 1, im Gehirn exprimiert, während Latrophilin-2 ubiquitär mit einer Präferenz für Plazenta, Niere, Milz, Ovarien, Herz und Lunge von Säugern exprimiert wird (Ichtchenko et al. 1999; Sugita et al. 1998).
Obwohl HO 10-R nur etwa halb so groß ist wie das 210 kDa große Latrophilin, erstreckt sich die Ähnlichkeit der Sequenz auch auf eine funktionelle Ähnlichkeit. Für beide Rezeptoren ist der endogene Ligand noch unbekannt, aber sowohl Latrophilin als auch HO 10-R werden durch den künstlichen Liganden α-LTX (alpha-Latro- toxin) beeinflusst.
Werden z. B. HEK-293 -Zellen transient mit Latrophilin transfiziert, verursacht die Zugabe von α-LTX den Einstrom von externem Ca , wie anhand eines Versuchsansatzes mit radioaktivem 45Ca2+ gezeigt werden kann. α-LTX verursacht einen solchen Ca2+-Einstrom auch bei HEK-293 -Zellen, die transient mit HO 10-R transfiziert wurden, was zum Beispiel durch Ca2+-Imaging beobachtet werden kann (siehe auch Abb. 10 und 11).
Dieser Ca2+-Einstrom ist allerdings sehr komplex. Liegt das HO 10-R als Konstrukt mit C-terminalem Green-Fluorescent-Protein (GFP) Anhang vor, ist er biphasisch, d.h. es zeigt sich eine Änderung nach ca. 3 und eine weitere nach ca. 22 Minuten. Wird dem HO 10-R jedoch nur ein Myc-His-Tag N-terminal vorangestellt, so wird Haupteinstrom bereits ca. 2-3 Minuten nach Zugabe von α-LTX beobachtet. Der Grund hierfür ist bislang unbekannt, die Reaktion auf die α-LTX Zugabe ist jedoch, wie die späteren Ausführungen zeigen, spezifisch: 1. Der Ca2+-Einstrom kann nicht beobachtet werden in nicht transfizierten Zellen sowie in Zellen, die transient mit einem ß2-adrenergen Rezeptor aus der Maus transfiziert wurden.
2. Die Änderungen der [Ca2+]i sind α-LTX dosisabhängig (Abb. 10).
3. Die biphasische Änderung benötigt den Einstrom von Ca2+, der durch Ca2+- Kanäle erfolgt, die von Cd2+ blockiert werden können, vor allem solche des L-Typs, wie anhand deren Empfindlichkeit gegenüber Nifedipm zu erkennen ist.
Der genaue Mechanismus der Interaktion von α-LTX mit HO 10-R und die Weiterleitung von Signalen muss noch geklärt werden. Am Beispiel des Latrophilin-1 konnte gezeigt werden, dass nur eine einzige Transmembran-Domäne für den durch α-LTX bedingten Ca2+-Einstrom in HEK-293 -Zellen nötig ist (Kraspernov et al.
1999).
Die Tatsache, daß Nifedipin die Wirkung des α-LTX in dem hier beschriebenen System blockiert, zeigt, dass sich das Systems auch für die Identifizierung neuer spezifischer Calcium-Kanal-Blocker eignet. Nifedipin gehört zu einer Klasse von
Calcium-Kanal Agonisten und Antagonisten, die entsprechend ihrer Bindung an einen spezifischen Ort eines Calcium-Kanals eingeteilt werden, z. B. anhand ihrer Bindung an Kanäle des L-Typs. Bei den wichtigsten drei Klassen von Calcium- Kanal-Blockern (L-Typ) handelt es sich um Benzoacetonitrile (z. B. Verapamil, WO 91/02497), Benzothiazepinone (z. B. Diltiazem) und 1,4-Dihydropyridin-Derivate wie Nifedipin, Nivaldipin, Nimodipin, Nicardipin, Isradipin, Amlodipin, Nitren- dipine, Felodipin oder Nisoldipin (Bacon et al. 1989; WO 90/09792). Eine weitere Klasse von Blockern von Calcium-Kanälen des L-Typs sind 1,3-Diphosphonate, z. B. Belfosodil. Gegenstand dieser Erfindung ist daher auch die Verwendung von α-LTX bindenden Transmembranrezeptoren zur Identifizierung von neuen Calcium-Kanal-Blockern. Besonders bevorzugt werden dabei heptahelikale Transmembranrezeptoren verwendet, besonders bevorzugt handelt es sich um G-Protein bindende Rezeptoren. Ganz besonders bevorzugt ist die Verwendung von Transmembranrezeptoren der
Sekretin-Familie. Am meisten bevorzugt ist die .Verwendung des HO 10-R Rezeptors gemäß SEQ ID. NO: 2 sowie dazu zu 70 %, bevorzugt zu 80 %, besonders bevorzugt zu 90 % und besonders bevorzugt zu 95 % homologer Rezeptorproteine.
Die vorliegenden Daten zeigen auch, dass HO 10-R ein Target für das neue anthelmintische Depsipeptid BAY44-4400 ist. BAY44-4400 stört die Signalübertragung durch α-LTX in HEK-293-Zellen, die mit HO 10-R transfiziert wurden (Abb. 12). Diese Störung kann auf der ionophoren Aktivität des BAY 44-4400 beruhen, wie es für andere Depsipeptide typisch ist, z. B. dem Beauvericin, Enniatin etc. (Geßner et al. 1996). BAY44-4400 verursacht jedoch keine Änderungen in nicht transfizierten Zellen. Ausserdem stört BAY44-4400 nicht die durch Isoproterenol induzierte Signalübertragung durch mit dem ß2-adrenergen Rezeptor der Maus transfizierten HEK-293-Zellen. Darüber hinaus wirkt BAY44-4400 als Antagonist von α-LTX, während BAY44-4400 alleine die Ca2+-Konzentration in HO 10-R transfizierten HEK-293-Zellen nicht beeinflusst.
Das HCllO-R-Protein
Das in DE 197 04 024 AI beschriebene Membranprotein wurde als ein mögliches Zielprotein für den anthelmintischen Wirkstoff PF 1022 A identifiziert. Zur Identifizierung möglicher Zielproteine wurde eine λZAPII cDNA-Expressions-Bibliothek des parasitären Nematoden Haemonchus contortus hergestellt und die cDNA- Bibliothek mit Hilfe eines Konjugats aus PF1022A und KLH (keyhole limpet hemocyanin), PF1022A-KLH, und polyklonalen Antikörpern gegen dieses Konjugat durchsucht (siehe Bsp. 1). Die Überprüfung von etwa l,5xl06 nicht amplifizierten, rekombinanten Klonen ergab einen 3036 bp langen cDNA-Klon, der an eine 3,6 kb große mRNA aus H. contortus hybridisierte (siehe auch Bsp. 2). Um die 3'- und 5'- Enden zu vervollständigen, wurde die RACE-PCR-Technik verwendet (Bsp. 4). Schließlich wurde eine 3539 bp lange cDNA erhalten, die als HO 10-R bezeichnet wurde. Diese cDNA kodiert für 986 Aminosäuren (110 kDa), wobei der offene Leserahmen mit dem ATG100 beginnt (Abb. 2). Das Startkodon ist zur optimalen
Initiation der Translation von einer Kozak-Sequenz umgeben. Das abgeleitete Molekulargewicht des Proteins wurde durch die in vitro Translation der in vitro transkribierten HC 110-R RNA bestätigt.
Die Aminosäuresequenz des HO 10-R Proteins weist einige besondere Merkmale auf. Der extrazelluläre N-terminale Teil des Proteins besteht aus insgesamt 535 Resten. Der N-Terminus enthält ein Signalpeptid mit einer Länge von 21 Aminosäuren und einer Spaltstelle an Position 18. Darauf folgt eine Lektin-ähnliche Sequenz (AS 22-125) und ein sogenannter "Thr-Stretch" (AS 128-147), der nur durch ein Serin in Position 144 unterbrochen wird. Stromabwärts des "Thr-Stretch" folgt ein cysteinreiches Motiv der Struktur CX9WX12CX9WXCX5WX9CX3W (AS 166- 221). Darüberhinaus enthält das Protein HO 10-R sieben hydrophobe, α-helikale Transmembran-Domänen zwischen den Resten 536 und 772. Direkt stromaufwärts der Transmembran-Region existiert eine weitere 4-Cys-Region der Struktur CXWWX6WX4CXπCXC (AS 478-524). In der Transmembranregion gibt es drei extrazelluläre Loops enthaltend die Reste 587-597, 654-673 und 743-749 und drei intrazelluläre Loops (Position 559-569, 627-636, 696-724). Der C-Terminus ist 214 Reste lang (24 kDa) und enthält einen prolinreichen Teil (AS 845-861) und eine PEST-Region (AS 915-933). Schließlich existieren noch drei putative N-Glyko- sylierungsstellen an den Resten 26, 499 und 862 sowie 14 putative Phos- phorylierungsstellen in der abgeleiteten intrazellulären Domänen (siehe auch Abb. 6).
Die Analyse von Datenbanken ergab eine 48%ige Identität und 76%ige Ähnlichkeit des HO lO-R-Proteins mit einem unbekannten Transmembranprotein (1014 AS), welches aus dem genomischen Klon B0457 (GenBank™ Accession Number Z54306) des Nematoden Caenorhabditis elegans abgeleitet wurde (siehe auch Abb. 3).
Der Begriff "Identität" wie er hier verwendet wird, beschreibt die Zahl von Sequenzpositionen, die in einem so genannten "Alignment" identisch sind. Sie wird in Prozent der "Alignmenf'-Länge angegeben.
Der Begriff "Ähnlichkeit", wie er hierin verwendet wird, beschreibt die Ähnlichkeit von Sequenzen auf Basis einer Ahnlichkeitsmetrik, also eines Maßes dafür, als wie . ähnlich man beispielsweise ein Valin zu einem Threonin oder zu einem Leucin annehmen will.
Der Begriff "Homologie", wie er hierin verwendet wird, bedeutet evolutionäre Verwandtschaft, wenn sich also zwei homologe Proteine sich aus einer gemeinsamen Verläufersequenz entwickelt haben. Der Begriff hat nicht unbedingt etwas mit
Identität oder Ähnlichkeit zu tun, abgesehen davon, dass homologe Sequenzen meist ähnlicher sind, oder in einem "Alignment" mehr identische Positionen besitzen als nicht-homologe Sequenzen.
Der Vergleich beider Sequenzen zeigt gemeinsame Merkmale beider Proteine, so zum Beispiel die Lektin-ähnliche Sequenz, den "Thr-Stretch", die Cys-Motive und die PEST-Sequenz. Die höchste Identität ist im Bereich der Transmembranregion zu finden (62%), wogegen eine geringer ausgeprägte Identität in der N-terminalen (44%) und C-terminalen (50%) Region zu finden ist.
Darüberhinaus weist das Protein HO 10-R eine 20-30%ige Identität mit heptahelikalen G-Protein-gekoppelten Transmembranrezeptoren (GPCR) auf, besonders mit der Sekretin-Subfamilie. Vergleiche von sieben Transmembran- Domänen zeigen hohe Identität und Ähnlichkeit hinsichtlich Struktur und Sequenz zwischen verschiedenen GPCR der Sekretin-Subfamilie und HO 10-R (Abb. 4). Latrophilin, ein Mitglied der Sekretin-Subfamilie, aus Säugern wie dem Menschen (Gen Bank ™ Accession Nr.: E1360690), dem Rind (z. B. G416021, G416053 und G4185804), und der Ratte (U78105 oder U72487) zeigt eine etwas höhere Identität (31 %) zu HO 10-R als andere Sekretin-Rezeptoren. Vor allem die Transmembran- regionen zeigen eine Identität von 45-48 %. HO 10-R und der 1466 Aminosäuren große Latrophilin-1 GPCR (U78105) aus der Ratte weisen gemeinsame Merkmale auf, z. B. die Lektin-Domäne, die cy steinreiche Region und ein konserviertes 4-Cys- Motiv vor der Transmembranregion. Letzteres wurde vor kurzem als Proteolysestelle von Latrophilin und anderen großen Sekretin GPCR vorgeschlagen. Dagegen enthält der N-Terminus des HO 10-R nicht die Olfactomedin-Region und die Pro/Thr-
Region des Latrophilins, während Latrophilin wiederum nicht den "Thr-Stretch" des HO 10-R aufweist.
Gegenstand der vorliegenden Anmeldung ist deshalb auch die Verwendung G- Protein gekoppelten Transmembranrezeptoren mit sieben Transmembran-Domänen aus Helminthen zum Identifizieren von anthelmintisch wirksamen Substanzen. Bevorzugt werden erfindungsgemäß Transmembranrezeptoren verwendet, die der Sekretin-Subfamilie zugeordnet werden können.
Zelluläre Lokalisation
Transiente Transfektionsexperimente mit einem HO 10-R-GFP-Fusionsprotein wurden in verschiedenen Säugerzelllinien durchgeführt, so zum Beispiel COS-7- Zellen oder HEK-293-Zellen (Abb. 7). Die heterologe Expression wurde gewählt, da bislang noch keine Zelllinien aus H. contortus etabliert wurden.
Zur Proteinlokalisation in lebenden Zellen (siehe Abb. 8) läßt sich das grünfluoreszierende Protein (Green Fluorescent Protein, GFP) aus der pazifischen Qualle Aequorea victoria verwenden. Auf zellulärer Ebene dient GFP als ein in vivo Reporter, um die Frequenz einer transienten oder stabilen Transfektion aufzuzeigen und auf subzellulärer Ebene zur Lokalisation von Proteinen. Wildtyp-GFP ist ein 27 kD-Monomer aus 238 Aminosäuren, das nach Anregung mit UV-Licht (360 - 400 nm; Max. bei 395 nm) oder blauem Licht (440 - 480 nm; Max. bei 475 nm) grünes Licht mit einem Maximum von 509 nm emittiert, ohne dazu exogene Substrate oder Kofaktoren zu benötigen (Chalfie et al. 1994). GFP läßt sich somit direkt durch Fluoreszenzmikroskopie in vivo nachweisen und sein Fluoreszenzverhalten bleibt auch als Teil eines Fusionsproteins im wesentlichen unverändert. EGFP (,enhanced' GFP) stellt eine genetische Variante des Wildtyp-GFP dar und wird zur Transfektion von Säugerzellen eingesetzt (Yang et al. 1996). Das Anregungsmaximum von EGFP wurde durch Substitution von Ser65 durch Thr auf nur einen Peak bei 490 nm ver- schoben. Die Vektoren pEGFP-O (GenBank Accession Nr.: U55763) und pEGFP-
N3 (GenBank Accession Nr.: U55762) [Clontech, Palo Alto, CA, U.S.A.] exprimieren EGFP unter der Kontrolle des starken konstitutiven CMV-Promotors und können zur Fusion von anderen Proteinen an den N- bzw. C-Terminus von EGFP verwendet werden.
Stabile Zelllinien bieten gegenüber einer transienten Expression den Vorteil, daß jede Zelle das gewünschte Protein dauerhaft exprimiert und eine Isolation des Proteins nach der Lokalisation möglich wird. Um das Protein Fluoreszenz-mikroskopisch oder mit Hilfe eines Western Blots nachzuweisen, wird ein Antikörper gegen das gewünschte Protein benötigt, oder es bietet sich an, einen Expressionsvektor zu wählen, der beispielsweise ein Myc- oder His-Tag C-terminal mit dem eigentlichen Protein im richtigen Leseraster fusioniert, gegen die es dann käufliche, meist sogar monoklonale Antikörper gibt.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind ebenfalls Zellen, die die stabile
Expression des Rezeptors HC 110-R sowie dazu homologer Proteine ermöglichen. Wirkung von alpha-Latrotoxin auf das HO 10-R Protein
Zur weiteren Substantiierung der Ähnlichkeit zwischen HO 10-R und Latrophilin sowie zur Überprüfung der Funktionalität des rekombinant exprimierten HO 10-R wurden HEK-293 -Zellen transient und stabil mit HOlO-R-GFP-Fusionsprotein transfiziert und mit alpha-Latrotoxin (α-LTR) stimuliert.
Alpha-Latrotoxin ist ein präsynaptisches Neurotoxin, das aus dem Gift der Schwarzen Witwe (Latrodectus mactans) gewonnen werden kann. Es ist bekannt für seine Toxizität für das zentrale Nervensystem von Vertebraten, wo es durch die Erhöhung der [Ca2+]j und die Stimulation der unkontrollierten Exozytose von Neuro- transmittern die Depolarisation von Neuronen auslöst. So ist auch bekannt geworden, dass die Wirkung des α-Latrotoxins zumindest teilweise durch Latrophilin vermittelt wird. Dabei wird angenommen, dass die Toxizität des α-Latrotoxins auf dessen Fähigkeit beruht, mit Rezeptoren, die mit GTP-bindenden Protein gekoppelt sind
(GPCR), zu interagieren. Diese Rezeptoren vermitteln normalerweise die Wirkung endogener Hormone oder Neuropeptide (Holz und Habener 1998).
In der vorliegenden Erfindung wurde die sogenannte "Ca2+-__maging"-Techr_ik ver- wendet, um die Reaktion transfizierter HEK-293 -Zellen auf α-LTX zu testen, indem die Änderung des intrazellulär vorliegenden Ca2+ [Ca2+]i bestimmt wird (siehe Bsp. 24 und Abb. 9, 10 und 11).
α-LTX verursacht einen biphasischen Anstieg von [Ca2+]j. Bei einer Konzentration von 75 nM induziert α-LTX zunächst einen sehr kleinen Anstieg von nur 5±0,2 nM 2
Minuten nach α-LTX-Zugabe und einen stärkeren, verzögerten Anstieg von etwa 220±14,9 nM Ca2+ nach 22 Minuten. Mit zunehmender Konzentration von α-LTX (7,5 nM- 120 nM) wird der erste Anstieg größer, während sich der zweite Anstieg verringert. Bei einer Konzentration von 120 nM α-LTX erreicht der erste Anstieg Werte von etwa 135±13,6 nM Ca2+, während der zweite Anstieg sich auf einen Wert von 50±7,1 nM Ca2+ absenkt. Der gleiche Verlauf bei Einsatz von 90 nM und 120 nM α-LTX deutet auf eine Sättigung hin.
Transfiziert man HEK-293-Zellen mit einem N-terminalen GFP-getaggtem HO 10- R-Konstrukt und stimuliert sie mit 75 nM α-LTX kommt es zu einem geringfügig reduzierten 2. Peak. Schließlich wurde auch dann eine nur geringfügig verminderte Reaktion auf α-LTX hin festgestellt, wenn das HO 10-R Protein mit einem N-terminalen GFP-Tag versehen wurde.Daher kann davon ausgegangen werden, daß das Anhängen eines GFP-Tags N- oder C-terminal keinen wesentlichen Einfluß auf die α-LTX-Bindung und die nachstehende Signaltransduktion durch HC 110-R hat.
Zellen, die nicht oder nur mit GFP transient transfiziert worden waren, zeigen keine Reaktion auf α-LTX. Werden HEK-293 -Zellen transient mit anderen C-terminal GFP-getaggten G-Protein gekoppelten Rezeptoren transfiziert, z. B. dem ß - adrenergen Rezeptor der Maus, oder dem humanen muscarinergen Hl Acetylcholin-
Rezeptor, verursacht α-LTX in einer Konzentration von 75 nM nur einen geringen (von etwa 40±10,4 nM nach etwa 20 Minuten) bis keinen Anstieg der [Ca2+]i.
Der durch α-LTX bedingte Anstieg der [Ca2+]j kann sowohl den Einstrom von extrazellulärem Ca2+ als auch den Ausstrom von intrazellulärem Ca2+ nach sich ziehen. Wird extrazelluläres Ca2+ vor oder nach der Zugabe von α-LTX mit 2 mM EGTA entfernt, zeigt sich nur ein kleiner Anstieg der [Ca2+]j von HEK-293 -Zellen, die das HOlO-R-GFP-Fusionsprotein exprimieren. Daraus wird ersichtlich, dass α- LTX in erster Linie den Einstrom von extrazellulärem Ca2+ verursacht. Dieser Ca +- Einstrom basiert nicht auf einfacher Diffusion, sondern geht mit Hilfe von Ca2+-
Kanälen in der Plasmamembran vonstatten.
Bei einem Großteil der Ca +-Kanäle, die am Ca +-Einstrom beteiligt sind, handelt es sich um solche des L-Typs, da 15 μM Nifedipin bereits ausreichen, den durch α-LTX induzierten Anstieg von [Ca +]j signifikant zu unterdrücken. Dabei wird der erste An- stieg vollständig inhibiert, der zweite Anstieg sinkt von 261 ±12,1 nM auf 30±5,4 nM ab.
Auch die den C-terminal Myc/His-getaggten HO 10-R Rezeptor exprimierende stabile bzw. transiente HEK-293-Zellinie reagiert dosisabhängig auf α-LTX
(Abb. 10). 7,5 nM α-LTX sind auch hier noch zu gering, um einen α-LTX- induzierten Ca2+-Einstrom zu erzeugen. Aber bereits 25 nM α-LTX sind ausreichend, um eine Erhöhung der [Ca2+]j von 130±38,0 nM bereits nach 2 min zu erzeugen. Bei Zugabe von 75 nM α-LTX kommt es zu einem Ca2+-Einstrom von 296±91,5 nM, der ebenfalls 2 min nach α-LTX-Gabe stark zunimmt und erst nach 27 min wieder seinen ursprünglichen Ca2+-Gehalt erreicht. Dieses Ca2+-Signal gleicht dem zweiten verzögerten Ca2+-Peak HO10-R-GFP transfizierter HEK-293 -Zellen bei gleicher α- LTX Konzentration (75 nM) in der Höhe des Signals und in seinem Verlauf, die Antwort erfolgt nur - wie auch bei höheren Konzentrationen (90 nM und 120 nM) HO 10-R-GFP transfizierter Zellen - unmittelbar nach α-LTX-Zugabe.
Gegenstand der Erfindung ist deshalb ebenfalls die Verwendung von α-LTX als Agonist von Transmembranrezeptoren der Sekretin-Familie aus Nematoden. Bevorzugt wird α-LTX als Agonist des HO 10-R Rezeptors gemäß SEQ ID NO: 2 verwen- det sowie von dazu zu 70 %, bevorzugt zu 80 %, besonders bevorzugt zu 90 % und ganz besonders bevorzugt zu 95 % homologer Rezeptorproteine.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ebenfalls die Verwendung von α-LTX als Nematizid.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ebenfalls die Verwendung von α-LTX in einem Verfahren zum Identifizieren von nematizid oder arthropodizid wirksamen Verbindungen, wobei die Verbindungen als Agonisten oder Antagonisten der Transmembranrezeptoren wirksam sein können. Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ebenfalls die Verwendung von α-LTX in einem Verfahren zum Identifizieren von Verbindungen, die Calcium-Kanäle blockieren.
Einfluss von BAY 44-4400 auf die Wirkung von α-LTX
PF1022A übt seine Wirkung auf Nematoden in Abhängigkeit von der jeweiligen Spezies bei Konzentrationen im Bereich von 100-800 ng/ml aus (Terada, 1992). Um jeweils eine mögliche Wechselwirkung zwischen PF1022A mit HO 10-R und der durch HO 10-R vermittelten Signalübertragung zu untersuchen, wurde in den folgenden Ca2+-Imaging Experimenten in mit FURA-2 beladenen und mit HO 10-R- GFP transfizierten HEK-293-Zellen das BAY44-4400 verwendet, das ein leichter lösliches Derivat von PF1022A ist.
Bei einer Konzentration von 400 ng/ml rufen weder das sehr effektive Nematizid
BAY44-4400 noch die nahezu ineffektive Antipode PF 1022-001 eine Ca2+- Antwort in HO 10-R-GFP transfizierten HEK 293-Zellen hervor, selbst wenn die Zellen für 90 Minuten mit dem Wirkstoff vorinkubiert worden waren. Im Gegensatz dazu beeinflussen beide Substanzen die durch α-LTX bedingte Signalübertragimg, wenn auch in verschiedenem Ausmaß (Abb. 12 und 14). Bei Anwesenheit von 4 ng/ml
BAY44-4400 ruft α-LTX einen nur geringen Ca2+-Anstieg mit einem Maximum von 44±6,0 nM Ca2+ nach 14 Minuten hervor (Abb. 12). Bei Anwesenheit von PF1022- 001 verursacht α-LTX jedoch einen größeren Anstieg von 103±11,5 nM Ca2+ nach 6 Minuten (Abb. 10B). In einem anderen Ansatz wurden die Zellen entweder mit 4 ng/ml oder 400 ng/ml BAY44-4400 und PF1022A für 90 Minuten vorinkubiert, die
Wirkstoffe dann entfernt bevor die Zellen mit α-LTX stimuliert wurden. HEK-293- Zellen, die mit PF1022A vorinkubiert worden waren, zeigten keine signifikante Änderung in ihrer Reaktion auf α-LTX. Nur BAY44-4400 beeinflusste die Empfindlichkeit der Zellen gegenüber α-LTX. Bei einer Konzentration von BAY44- 4400 von 4 ng/ml induzierte α-LTX einen Ca2+-Anstieg (95±20,5 nM Ca2+), 19
Minuten bevor ein stabiles Ca2+-Niveau erreicht wurde. Bei 400 ng/ml BAY44-4400 verursachte α-LTX nur einen Anstieg der Ca2+-Konzentration auf etwa 65±7,5 nM Ca2+. Zusätzlich war dieser kleinere Anstieg um 12 Minuten verschoben.
Um die Spezifizität dieser Ergebnisse zu untermauern, wurde weiterhin der Effekt von ImM Carbachol auf das endogene, natürliche Ml-R in nicht transfizierten HEK-
293 -Zellen gemessen. Die Anwesenheit von 400 ng/ml BAY44-4400 veränderte die Antwort der Zellen nicht. Auch die durch Isoproterenol und Arecolin induzierte Stimulation des endogenen, natürlichen ß2-R oder des nikotinischen cholinergen Rezeptors in HEK-293 -Zellen wurde durch BAY44-4400 in keiner Weise beein- flusst.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde schließlich durch Ca2+-Imaging der Einfluss von BAY 44-4400, einer besser löslichen Variante von PF1022A, auf das HO lO-R-Protein in HEK-293 -Zellen untersucht, die transient oder stabil ein C-ter- minal mit GFP versehenes HO lO-R-Protein exprimieren. Bei einer Inkubation von
HEK-293-Zellen mit nur 400 ng/ml BAY 44-4400 reagieren die Zellen für 50 Minuten in keiner vergleichbaren Weise mit einer Änderung der intrazellulären Ca2+- Konzentration. Allerdings kann ein Einfluss des BAY 44-4400 bei Anwesenheit des α-LTX festgestellt werden. Inkubiert man Zellen 6 Minuten vor der Zugabe von 75 nM α-LTX mit BAY 44-4400, verringert sich der Einfluss des α-LTX auf die Ca2+-
Konzentration. Der erste kleine Anstieg der [Ca2+]i verschwindet und der zweite wird 15 Minuten nach der Zugabe von α-LTX um 85 % reduziert. Die Reaktion auf α- LTX verstärkt sich noch mehr, wenn die Zellen für 60 Minuten mit BAY 44-4400 vorinkubiert werden, bevor die Zellen für 30 Minuten mit FURA versetzt werden. Es ergibt sich ein völliges Verschwinden des ersten Ca2+-Anstiegs sowie ein nur sehr geringer zweiter Anstieg von 70 nM [Ca2+],- 30 Minuten nach Zugabe von 75 nM α- LTX.
Um den spezifischen Einfluss von BAY 44-4400 auf die Wirkung von α-LTX zu zei- gen, wurden zwei Kontrollexperimente durchgeführt. Zunächst wurden HEK-293-
Zellen transient oder stabil mit einem C-terminal mit einem GFP-Tag versehenen ß2- adrenergen Rezeptor aus der Maus transfiziert und Isoproterenol als Ligand verwendet.
Tatsächlich verursacht Isoproterenol auch eine signifikante Ca2+-Antwort: direkt nach der Zugabe von Isoproterenol ergibt sich nur ein Ca2+-Anstieg. Dieser Anstieg wir j edoch nicht durch BAY 44-4400 beeinflusst.
Weiterhin wird die Spezifität der Wechselwirkung zwischen BAY 44-4400 mit HO 10-R mit Hilfe des optischen Antipoden gezeigt, die die Stelle des BAY 44- 4400 als Ligand einnehmen. Nach Voririkubation der Zellen mit 400 ng/ml eines anthelmintisch 100-fach schwächer wirksamen Derivates von PF1022A des PF 1022- 001: cyclo(-L-Lac-D-MeLeu-L-PhLac-D-Me-Leu-)2 (auch als optischer Antipode bezeichnet) für 90 Minuten ergibt sich nur ein Ca2+- Anstieg von 110 nM 6 Minuten nach Zugabe von 75 nM α-LTX, also eine Verringerung um 59 %. Wenn 4 ng/ml des optischen Antipode 6 Minuten vor der Zugabe von 75 nM α-LTX zugegeben werden, ergibt sich ein Anstieg von 67 nM [Ca2+]j direkt nach der Zugabe des α- LTX. Mit zunehmender Konzentration des optischen Antipode verringert sich der Anstieg auf 20 nM Ca2+.
Der Ausdruck "Polypeptide", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich sowohl auf kurze Aminosäureketten, die gewöhnlich als Peptide, Oligopeptide oder Oligomere bezeichnet werden, als auch auf längere Aminosäureketten, die gewöhnlich als Proteine bezeichnet werden. Er umfasst Aminosäureketten, die entweder durch natürliche Prozesse, wie posttranslationale Prozessierung, oder durch chemische Verfahren, die Stand der Technik sind, modifiziert sein können. Solche Modifikationen können an verschiedenen Stellen und mehrfach in einem Polypeptid vorkommen, wie beispielsweise an dem Peptid-Rückgrat, an der Aminosäure-Seitenkette, am Amino- und oder am Carboxy-Terminus. Sie umfassen beispielsweise Acetylierungen, Acylierungen, ADP-Ribosylierungen, Amidierungen, kovalente Verknüpfungen mit Flavinen, Häm- Anteilen, Nukleotiden oder Nukleotid-Derivaten, Lipiden oder Lipid-Derivaten oder
Phophatidylinositol, Cyclisierungen, Disulfidbrückenbildungen, Demethylierungen, Cystin-Bildungen, Formylierungen, gamma-Carboxylierungen, Glycosylierungen, Hydroxylierungen, Iodierungen, Methylierungen, Myristoylierungen, Oxidationen, proteolytische Prozessierungen, Phosphorylierungen, Selenoylierungen und tRNA- ve mittelte Additionen von Aminosäuren.
Die Polypeptide können erfindungsgemäß in der Form "reifer" Proteine oder als Teile größerer Proteine, z.B. als Fusionsproteine verwendet werden. Weiterhin können sie Sezemierungs- oder "Leader"-Sequenzen, Pro-Sequenzen, Sequenzen, die eine einfache Reinigung ermöglichen, wie mehrfache Histidin-Reste, oder zusätz- liehe stabilisierende Aminosäuren aufweisen.
Als homologe Proteine oder Polypeptide werden solche Proteine oder Polypeptide betrachtet, die eine zumindest 70 %ige Identität, vorzugsweise 80 %ige Identität, besonders bevorzugt 90 %ige Identität, ganz besonders bevorzugt 95 %ige Identität, mit einer Sequenz gemäß SEQ ID NO: 2 des Dokuments DE-A-197 04 024, dessen Inhalt ausdrücklich Teil der vorliegenden Anmeldung sein soll, über eine Länge von wenigstens 20, vorzugsweise wenigstens 25, besonders bevorzugt wenigstens 30 fortlaufenden Aminosäuren und ganz besonders bevorzugt über deren Gesamtlängen aufweisen.
Die Polypeptide müssen für ihre erfindungsgemäße Verwendung nicht vollständige Rezeptoren darstellen, sondern können auch nur Fragmente davon sein, solange sie zumindest noch die biologische Aktivität der vollständigen Rezeptoren aufweisen. Dabei müssen die Polypeptide nicht von Transmembranrezeptoren aus H. contortus ableitbar sein. Als erfindungsgemäß werden auch Polypeptide betrachtet, die Transmembranrezeptoren von anderen Helminthen- oder auch Arthropodenspezies entsprechen oder Fragmenten davon, die noch die biologische Aktivität dieser Rezeptoren ausüben können.
Die Polypeptide können für ihre erfindungsgemäße Verwendung im Vergleich zu der entsprechenden Region natürlich vorkommender GPCR-Rezeptoren Deletionen oder Aminosäuresubstitutionen aufweisen, solange sie zumindest noch eine biologische Aktivität der vollständigen Rezeptoren ausüben. Konservative Substitutionen sind bevorzugt. Solche konservativen Substitutionen umfassen Variationen, wobei eine Aminosäure durch eine andere Aminosäure aus der folgenden Gruppe ersetzt wird:
1. Kleine aliphatische, nicht-polare oder wenig polare Reste: Ala, Ser, Thr, Pro und Gly;
2. Polare, negativ geladene Reste und deren A ide: Asp, Asn, Glu und Gin;
3. Polare, positiv geladene Reste: His, Arg und Lys; 4. Große aliphatische, nicht-polare Reste: Met, Leu, Ile, Val und Cys; und
5. Aromatische Reste: Phe, Tyr und Tip.
Die folgende Liste zeigt bevorzugte konservative Substitutionen:
Die vorstehend und in DE-A-197 04 024 unter SEQ ID NO:l und SEQ ID NO: 3 beschriebenen Sequenzen können außerdem zum Auffinden von Genen verwendet werden, die für Polypeptide kodieren, welche am Aufbau von funktionell ähnlichen Transmembranrezeptoren in Helminthen oder Arthropoden beteiligt sind. Unter funktionell ähnlichen Rezeptoren werden gemäß der vorliegenden Erfindung Rezeptoren verstanden, die Polypeptide umfassen, welche sich zwar hinsichtlich der Aminosäuresequenz von den hierin beschriebenen Polypeptiden unterscheiden, aber im wesentlichen dieselbe biologische Funktion haben. Der Ausdruck "im wesentlichen dieselbe biologische Funktion", wie er hierin verwendet wird, bedeutet eine Beteiligung am Aufbau von funktionsfähigen G-Protein gekoppelten heptahelikalen Transmembranrezeptorenrezeptoren, besonders solcher Rezeptoren der Sekretin-Subfamilie, bzw. eine dem HO 10-R Rezeptor aus H. contortus entsprechende Funktion. Eine solche Funktion beinhaltet auch die vorstehend beschriebenen Eigenschaften des Rezeptors, wie der Sensitivität gegenüber α-LTX als Agonisten oder Nifedipin als Antagonisten des α-LTX.
Der Ausdruck "hybridisieren", wie er hierin verwendet wird, beschreibt den Vorgang, bei welchem ein einzelsträngiges Nukleinsäuremolekül mit einem komplementären Strang eine Basenpaarung eingeht. Auf diese Weise können ausgehend von der hierin offenbarten Sequenzinformation beispielsweise DNA-Fragmente aus anderen Nematoden als H. contortus sowie aus Arthropoden isoliert werden, welche für Polypeptide mit der biologischen Aktivität von GPCR-Rezeptoren codieren.
In Hinblick auf eine geeignete Sonde werden die aminoterminalen und carboxyter- minalen cDNA-Abschnitte bevorzugt. Die Hybridisierungsbedingungen werden so gewählt, dass auch weniger ähnliche Sequenzen aus anderen Organismen detektier- bar sind. Die Hybridisierungsbedingungen unter erniedrigter Stringenz können beispielsweise wie folgt aussehen: in 6xSSC/0% Formamid als Hybridisierungslösung wird zwischen 40-55°C hybridisiert. Die Bedingungen des spezifischen 2. Waschschritt müssen ausgetestet werden, z.B. initial 2xSSC bei 50°C, dann Abschätzung der Signalintensitäten. Daraufhin folgt die Modifikation der Waschbedingungen.
Beispielhaft werden nachfolgend geeignete Hybridisierungsbedingungen angegeben:
Hybridisierungslösung: 6xSSC / 0 % Formamid, bevorzugte Hybridisierungslösung: 6xSSC / 25 % Formamid
Hybridisierungstemperatur: 34°C, bevorzugte Hybridisierungstemperatur: 42°C 1. Waschschritt: 2xSSC bei 40°C
2. Waschschritt: 2xSSC bei 45°C; bevorzugter 2. Waschschritt: 0,6xSSC bei 55°C; besonders bevorzugter 2. Waschschritt: 0,3xSSC bei 65°C.
Hybridisierungsbedingungen werden nach folgender Formel näherungsweise berechnet:
Die Schmelztemperatur Tm = 81.5°C + 16.6 logfctNa*)] + 0.41 (%G + C)) - 500/n
(Lottspeich und Zorbas 1998).
Dabei ist c die Konzentration und n die Länge des hybridisierenden Sequenzabschnitts in Basenpaaren. Für eine Sequenz >100 bp entfällt der Ausdruck 500/n. Mit höchster Stringenz wird bei einer Temperatur 5-15°C unterhalb Tm und einer Ionenstärke von 15 mM Na+ (entspricht 0.1 x SSC) gewaschen. Wird eine RNA-Probe zur Hybridisierung verwendet, so ist der Schmelzpunkt um 10-15°C höher.
Die im erfindungsgemäßen Verfahren zum Identifizieren von nematizid und arthro- podizid wirksamen Verbindungen verwendeten Polypeptide werden von den in DE-
A-197 04 024 unter SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 3 beschriebenen Nukleinsäuren kodiert.
Weiterhin werden zur erfindungsgemäßen Verwendung solche Nukleinsäuren erfasst, die eine zumindest 70 %ige Identität, vorzugsweise 80 %ige Identität, besonders bevorzugt 90 %ige Identität, ganz besonders bevorzugt 95 %ige Identität mit einer Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 über eine Länge von wenigstens 20, vorzugsweise wenigstens 100, besonders bevorzugt wenigstens 500 fortlaufenden Nukleotiden und ganz besonders bevorzugt über deren Gesamtlänge aufweisen. Die erfindungsgemäße Nukleinsäure kann ebenfalls zur Herstellung transgener Invertebraten verwendet werden. Diese können in Testsystemen eingesetzt werden, die auf einer vom Wildtyp abweichenden Expression der erfindungsgemäßen Rezeptoren oder Varianten hiervon basieren. Femer fallen hierunter sämtliche transgenen Invertebraten, bei denen durch die Modifikation anderer Gene oder Genkontrollsequenzen (z.B. Promotoren) eine Veränderung der Expression der erfindungsgemäßen Rezeptoren oder deren Varianten eintritt.
Die Herstellung der transgenen Invertebraten erfolgt beispielsweise in Drosophila melanogaster durch P-Element-vermittelten Gentransfer oder in Caenorhabditis elegans durch Transposon-vermittelten Gentransfer (z.B. durch Tel, Plasterk 1996).
Gegenstand der Erfindung sind somit auch transgene Invertebraten, die __umindest eine der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren enthalten, vorzugsweise transgene Invertebraten der Arten Drosophila melanogaster oder Caenorhabditis elegans, sowie deren transgene Nachkommen. Vorzugsweise enthalten die transgenen Invertebraten die erfindungsgemäßen Rezeptoren in einer vom Wildtyp abweichenden Form.
Die erfindungsgemäße Nukleinsäure kann auf die übliche Weise hergestellt werden. Beispielsweise kann das Nukleinsäuremolekül vollständig chemisch synthetisiert werden. Man kann auch nur kurze Stücke der erfindungsgemäßen Sequenz chemisch synthetisieren und solche Oligonukleotide radioaktiv oder mit einem Fluoreszenzfarbstoff markieren. Die markierten Oligonukleotide können verwendet werden, um ausgehend von Nematoden-mRNA oder Insekten-mRNA hergestellte cDNA-Banken zu durchsuchen. Klone, an die die markierten Oligonukleotide hybridisieren, werden zur Isolierung der betreffenden DNA ausgewählt. Nach der Charakterisierung der isolierten DNA erhält man auf einfache Weise die erfindungsgemäße Nukleinsäure.
Die erfindungsgemäße Nukleinsäure kann auch mittels PCR- Verfahren unter Ver- wendung chemisch synthetisierter Oligonukleotide hergestellt werden. Der Ausdruck 'Oligonukleotid(e)", wie er hierin verwendet wird, bedeutet DNA- Moleküle, die aus 10 bis 50 Nukleotiden, vorzugsweise 15 bis 30 Nukleotiden, bestehen. Sie werden z.B. chemisch synthetisiert und können als Sonden verwendet werden.
Die erfindungsgemäße Nukleinsäure kann zur Isoherung und Charakterisierung der regulatorischen Regionen, die natürlicherweise benachbart zu der kodierenden Region vorkommen, verwendet werden. Solche regulatorischen Regionen sind somit ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
In den erfindungsgemäßen Verfahren kommen ebenfalls Vektoren zum Einsatz, die eine erfindungsgemäß zu verwendende Nukleinsäure oder ein erfindungsgemäß zu verwendendes DNA-Konstrukt enthalten. Als Vektoren können alle in molekularbiologischen Laboratorien verwendete Phagen, Plasmide, Phagmide, Phasmide, Cosmide, YACs, BACs, künstliche Chromosomen oder Partikel, die für einen
Partikelbeschuss geeignet sind, verwendet werden.
Bevorzugte Vektoren sind pBIN und seine Derivate für pflanzliche Zellen, pFL61 für Hefezellen, pBLUESCRIPT- Vektoren für bakterielle Zellen, lamdaZAP (Fa. Stratagene) für Phagen.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurden verschiedene Vektoren verwendet und mehrere Konstrukte erstellt. Die Vektoren, die zur transienten bzw. stabilen Transformation von Zelllinien und zur stabilen Expression des HO 10-R Rezeptors verwendet wurden, sind ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
Zur transienten Expression in eukaryotischen Zellen wurden EGFP-Konstrukte hergestellt, die zur Expression von Fusionsproteinen mit einem N-terminalen EGFP-Tag (EGFP-HC110-R) oder einem C-terminalen EGFP-Tag (HO10-R-EGFP) führen. Die von diesen Vektoren und den herkömmlichen GFP- Vektoren sowie Rotshift- und Blaushift-Varianten kodierten Polypeptide sind ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
Für die stabile Expression wurde ein weiteres Konstrukt, der Vektor pMycόxHis, verwendet, der ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist. Der Vektor pMycόxHis leitet sich von dem Vektor pSecTagA [ϊnvitrogen, Leek, NL] durch Doppelverdau mit den Restriktionsenzymen Nhil und Sfil, gefolgt von ,blunting' der Enden und Religation des Vektors ab.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind auch Wirtszellen, die eine erfindungsgemäß zu verwendende Nukleinsäure oder einen erfindungsgemäß zu verwendenden Vektor enthalten. Insbesondere ist die stabil transformierte Zelllinie HEK-293 mit HOlO-R-Myc/His Gegenstand dieser Erfindung, die unter der Nummer DSM ACC2464 bei der internationalen Hinterlegungsstelle DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg lb in 38 124
Braunschweig hinterlegt wurde.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind ebenfalls Wirtszellen, die eine erfindungsgemäß zu verwendende Nukleinsäure oder einen erfindungsgemäß zu ver- wendenden Vektor enthalten, sowie einen Vektor, der die Zellen zur Expression von
Aequorin befähigt, einem Lumineszenz-Protein, das in Gegenwart von Ca2+ Licht emittiert. Durch entsprechende Wirtszellen wird es möglich gemacht, die Veränderung der Ca2+-Konzentration und damit die Wirkung von Substanzen z. B. auf HO 10-R mit Hilfe des Indikators Aequorin zu verfolgen. Insbesondere ist die zur Expression von Aequorin befähigte, stabil transformierte Zelllinie HEK-293 mit
HOlO-R-Myc/His Gegenstand der Erfindung, die unter der Nummer DSM ACC2465 bei der internationalen Hinterlegungsstelle DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg lb in 38 124 Braunschweig hinterlegt wurde. Der Ausdruck "Wirtszelle", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf Zellen, die natürlicherweise die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren nicht enthalten.
Als Wirtszellen eignen sich vorzugsweise eukaryotische Zellen, wie Hefen, Säuger-, Amphibien-, Insekten- oder Pflanzenzellen. Bevorzugte eukaryotische Wirtszellen sind HEK-293-, Schneider S2-, Spodoptera Sf9-, Kc-, CHO-, HepG-2-,Kl- COS-1-, COS-7-, HeLa-, C127-, 3T3- oder BHK-Zellen und insbesondere Xenopus-Oocyten, ganz besonders eigenen sich HEK-293- oder COS-7-Zellen.
Gegenstand dieser Erfindung ist ebenfalls die Verwendung von DNA entsprechend der in Anmeldung DE-A-197 04 024 beschriebenen Sequenz ID No. 2 zur Detektion von DNA aus Helminthen, bevorzugt aus dem Stamm Nematoda, besonders bevorzugt aus der Familie Trichostrongylidae, ganz besonders bevorzugt der Gattung Haemonchus und am meisten bevorzugt der Art Haemonchus contortus.
Die Erfindung bezieht sich dabei auf Oligonukleotide die einer Region der oben beschriebenen DNA-Sequenz oder deren komplementärem Strang entsprechen und an diese hybridisieren können. Die Erfindung bezieht sich auf die Verwendung dieser Oligonukleotide oder Teilen davon als
a) Proben in Northern- oder Southern-Blot-Assays,
b) PCR-Primer in einem diagnostischen Verfahren zur Detektion der oben genannten Nematoden, wobei die DNA der betreffenden Helminthen spezifisch mit Hilfe der Primer und der PCR-Technik amplifiziert und dann identifiziert wird.
Gegenstand der Erfindung ist auch ein Verfahren zur Detektion von Helminthen, bevorzugt aus dem Stamm Nematoda, besonders bevorzugt aus der Familie Tri- chostrongylidae, ganz besonders bevorzugt der Gattung Haemonchus und am meisten bevorzugt der Art Haemonchus contortus, wobei Oligonukleotide wie oben beschrieben zu DNA-Sequenzen spezifisch hybridisieren, die aus den genannten Organismen stammen, und die dann mit Hilfe der PCR-Technik amplifiziert werden.
Die Detektion von Organismen wie obengenannt kann z.B. erfolgen, indem man
a) eine Oligonukleotidprobe bzw. Primer zur Verfügung stellt, die an die erfindungsgemäße, für HO 10-R kodierende, DNA oder dazu komplementäre Stränge hydridisieren oder an die 51- oder 3 '-flankierenden Regionen derselben,
b) die Oligonukleotidprobe bzw. die Primer mit einer entsprechend aufbereiteten, DNA enthaltenden Probe in Kontakt bringt,
c) die Hybridisierung des Oligonukleotids bzw. Primers detektiert (z.B. mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion),
d) die detektierte Sequenz des HO 10-R-Gens sequenziert, und
e) die Sequenz mit den erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen vergleicht, bevorzugt mit der in Anmeldung DE-A-197 04 024 beschriebenen Sequenz
ID No. 2.
Gegenstand der Erfindung ist deshalb ebenfalls ein diagnostischer Testkit zur Detektion von von Helminthen, bevorzugt aus dem Stamm Nematoda, besonders bevorzugt aus der Familie Trichostrongylidae, ganz besonders bevorzugt der Gattung
Haemonchus und am meisten bevorzugt der Art Haemonchus contortus, der unter anderem Oligonukleotide wie oben beschrieben zur Verfügung stellt, die in Verfahren zur Detektion von Spezies aus den genannten systematischen Gruppen verwendet werden können. Gegenstand der Erfindung ist ebenfalls ein diagnostischer Testkit wie vorstehend beschrieben, wobei die in diesem Kit zur Verfügung gestellten Oligonukleotide mit einem detektierbaren Marker versehen sind. Solche detektierbaren Marker können u.a. Enzyme beinhalten, Enzym-Substrate, Coenzyme, Enzyminhibitoren, Fluores- zenzmarker, Chromophore, lumineszente Marker und Radioisotope.
Gegenstand dieser Erfindung ist auch die Verwendung der vorstehend genannten HOlO-R-Polypeptide oder Fragmente davon sowie von dazu zu 70 %, bevorzugt zu 80 %, besonders bevorzugt zu 90 % und besonders bevorzugt zu 95 % homologer . Rezeptorproteine aus Helminthen, bevorzugt aus dem Stamm Nematoda, besonders bevorzugt aus der Familie Trichostrongylidae, ganz besonders bevorzugt der Gattung Haemonchus und am meisten bevorzugt der Art Haemonchus contortus zur Herstellung von Vakzinen, die mindestens ein HOlO-R-Polypeptid oder Fragment oder ein dazu zu 70 %, bevorzugt zu 80 %, besonders bevorzugt zu 90 % und besonders bevorzugt zu 95 % homologes Rezeptorprotein davon enthalten. Das Vakzin ist dabei in der Lage eine Immunantwort hervorzurufen, die spezifisch ist für ein vorstehend beschriebene HO 10-R Protein.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthält das Vakzin eine antigene Deter- minante, z.B. eine einzelne Determinante eines Polypeptids mit einer Aminosäuresequenz gemäß der in Anmeldung DE-A-197 04 024 beschriebenen Sequenz _D No. 2 oder eines Polypeptids, das von der vorstehend genannten DNA oder Fragmenten davon kodiert wird.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind weiterhin Verfahren zum Herstellen der erfindungsgemäß zu verwendenden Polypeptide. Zur Herstellung der Polypeptide, die von den bekannten Nukleinsäuren kodiert werden, können Wirtszellen, die diese Nukleinsäuren enthalten, unter geeigneten Bedingungen kultiviert werden. Die gewünschten Polypeptide können danach auf übliche Weise aus den Zellen oder dem Kulturmedium isoliert werden. Die Polypeptide können auch in in vztro-Systemen hergestellt werden. Ein schnelles Verfahren zum Isolieren der erfhidungsgemäßen Polypeptide, die von Wirtszellen unter Verwendung einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure synthetisiert werden, beginnt zum Beispiel, wie in den Beispielen beschrieben, mit der Expression eines Fusionsproteins, wobei der Fusionspartner auf einfache Weise affinitätsgereinigt werden kann. Der Fusionspartner kann beispielsweise Glutalhion S-Transferase sein. Das Fusionsprotein kann dann an einer GlutatMon- finitätssäule gereinigt werden. Der Fusionspartner kann durch partielle proteolytische Spaltung beispielsweise an Linkern zwischen dem Fusionspartner und dem zu reinigenden erfindungsgemäßen . Polypeptid abgetrennt werden. Der Linker kann so gestaltet werden, dass er Ziel-
Aminosäuren, wie Arginin- und Lysin-Reste einschließt, die Stellen für eine Spaltung durch Trypsin definieren. Um solche Linker zu erzeugen, können Standard- Klonierungsverfahren unter Verwendung von Oligonukleotiden angewendet werden. Ein weiteres mögliches Verfahren basiert auf der Verwendung von Histidin-Fusions- proteinen und deren Aufreinigung über Ni2+-Talonsäulen.
Weitere mögliche Reinigungsverfahren basieren auf präparativer Elektrophorese, FPLC, HPLC (z.B. unter Anwendung von Gelfiltrations-, Reversphasen- oder leicht hydrophoben Säulen), Gelfiltration, differentieller Präzipitation, Ionenaustausch- Chromatographie und Affinitätschromatographie.
Da rezeptorähnliche Proteinkinasen Membranproteine darstellen, werden in den Reinigungsverfahren vorzugsweise Detergenzextraktionen durchgeführt, beispielsweise unter Verwendung von Detergenzien, die die Sekundär- und Tertiärstrakturen der Polypeptide nicht oder nur wenig beeinflussen, wie nicht-ionische Detergenzien.
Die Reinigung der erfindungsgemäß zu verwendenden Polypeptide kann die Isolierung von Membranen ausgehend von Wirtszellen, die die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren exprimieren, umfassen. Vorzugsweise exprimieren solche Zellen die Polypeptide in einer ausreichenden Kopienanzahl, so dass die Menge der Polypeptide in einer
Membranfraktion mindestens 10-fach höher ist als diejenige, die in vergleichbaren Membranen von Zellen gefunden wird, die das HOlO-R-Gen natürlicherweise exprimieren; besonders bevorzugt ist die Menge mindestens 100-fach, ganz besonders bevorzugt mindestens 1000-fach höher.
Die Ausdrücke "Isolierung oder Reinigung", wie sie hierin verwendet werden, bedeuten, dass die Polypeptide von anderen Proteinen oder anderen Makromolekülen der Zelle oder des Gewebes abgetrennt werden. Vorzugsweise ist eine erfindungsgemäße, die Polypeptide enthaltende Zusammensetzung hinsichtlich des Proteingehalts gegenüber einer Präparation aus den Wirtszellen mindestens 10-fach und besonders be- vorzugt mindestens 100-fach angereichert.
Die erfindungsgemäßen Polypeptide können auch ohne Fusionspartner mit Hilfe von Antikörpern, die an die Polypeptide binden, affinitätsgereinigt werden.
Weiterhin sind Antiköφer Gegenstand der Erfindung, die spezifisch an die vorstehend genannten Polypeptide bzw. Rezeptoren binden. Die Herstellung solcher Antiköφer erfolgt auf die übliche Weise. Beispielsweise können solche Antiköφer produziert werden durch die Injektion eines substantiell immunkompetenten Wirts mit einer für die Antiköφeφroduktion effektiven Menge eines erfindungsgemäßen Transmem- branrezeptors wie des HO 10-R Rezeptors aus H. contortus oder eines Fragments davon und durch nachfolgende Gewinnung dieses Antiköφers. Weiterhin läßt sich in an sich bekannter Weise eine immortalisierte Zellinie erhalten, die monoklonale Antiköφer produziert. Die Antiköφer können gegebenenfalls mit einem Nachweisreagenz markiert sein. Bevorzugte Beispiele für ein solches Nachweis-Reagenz sind Enzyme, radioaktiv markierte Elemente, fluoreszierende Chemikalien oder Biotin.
Anstelle des vollständigen Antiköφers können auch Fragmente eingesetzt werden, die die gewünschten spezifischen Bindungseigenschaften besitzen.
Der Ausdruck "Agonist", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf ein Molekül, das Transmembranrezeptoren aktiviert. Der Ausdruck "Antagonist", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf ein Molekül, das einen Agonisten von seiner Bindungsstelle verdrängt oder die Funktion des Agonisten inhibiert.
Der Ausdruck "Modulator", wie er hierin verwendet wird, stellt den Oberbegriff zu
Agonist bzw. Antagonist dar. Modulatoren können kleine organisch-chemische Moleküle, Peptide oder Antiköφer sein, die an die erfindungsgemäßen Polypeptide binden. Weiterhin können Modulatoren kleine organisch-chemische Moleküle, Peptide oder Antiköφer sein, die an ein Molekül binden, welches wiederum an die erfindungsgemäßen Polypeptide bindet, und dadurch deren biologische Aktivität be- einflusst. Modulatoren können Mimetika von natürlichen Substraten und Liganden darstellen.
Vorzugsweise handelt es sich bei den Modulatoren um kleine organisch-chemische Verbindungen.
Die Bindung der Modulatoren an die Polypeptide kann die zellulären Vorgänge auf eine Weise verändern, die zum Absterben der damit behandelten Helminthen oder Arthropoden führt.
Daher erstreckt sich die vorliegende Erfindung auch auf die Verwendung von Modulatoren der Polypeptide als Anthelmintika und Arthropodizide.
Insbesondere ist die Verwendung des α-LTX als Anthelmintikum ebenfalls Gegen- stand dieser Erfindung.
Die erfindungsgemäße Verwendung der Nukleinsäuren bzw. Polypeptide in einem erfindungsgemäßen Verfahren ermöglicht auch das Auffinden von Verbindungen, die an die erfindungsgemäßen Rezeptoren binden. Diese können ebenfalls als Anthelmintika, z.B. als Nematizide bei Pflanzen oder als anthelmintische Wirkstoffe bei Tieren angewandt werden. Beispielsweise werden Wirtszellen, die die Nukleinsäuren enthalten und die entsprechenden Rezeptoren bzw. Polypeptide exprimieren oder die Genprodukte selbst mit einer Verbindung oder einem Gemisch von Verbindungen unter Bedingungen in Kontakt gebracht, die die Wechselwirkung 2ranindest einer Verbindung mit den Wirtszellen, den Rezeptoren oder den einzelnen Polypeptiden erlauben.
Insbesondere ist ein Verfahren Gegenstand der vorliegenden Erfindung, dass zur Identifizierung von nematiziden Wirkstoffen geeignet ist, die an Transmembranrezeptoren aus Helminthen oder Arthropoden binden, bevorzugt an GPCR der Sekretin-Subfamilie, besonders bevorzugt an den Rezeptor HO 10-R aus H. contortus sowie an . dazu zu 70 %, bevorzugt zu 80 %, besonders bevorzugt zu 90 % und ganz besonders bevorzugt an dazu zu 95 % sequenzidentische Rezeptoren binden. Die Verfahren können jedoch auch mit einem HO 10-R homologen Rezeptor aus einer anderen als der hier genannten Spezies durchgeführt werden. Verfahren, die andere als den erfindungsgemäßen HO 10-R Rezeptor verwenden, sind von der vorliegenden Erfindung voll umfasst.
Die erfindungsgemäßen Verfahren schließen Hochdurchsatz-Screening (z.B. high throughput screening (HTS) und ultra high throughput screening (UHTS)) ein. Dafür können sowohl Wirtszellen als auch zellfreie Präparationen verwendet werden, die die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren und/oder die erfindungsgemäßen Polypeptide enthalten.
Zellfreie Testsysteme
Viele Testsysteme, die die Prüfung von Verbindungen und natürlichen Extrakten zum Ziel haben, sind auf hohe Durchsatzzahlen ausgerichtet, um die Zahl der untersuchten Substanzen in einem gegebenen Zeitraum zu maximieren. Testsysteme, die auf zellfreiem Arbeiten beruhen, brauchen gereinigtes oder semi-gereinigtes Protein. Sie sind geeignet für eine "erste" Prüfung, die in erster Linie darauf abzielt, einen möglichen Einfluß einer Substanz auf das Zielprotein zu detektieren. Effekte wie Zelltoxizität werden in diesen in vitro Systemen in der Regel ignoriert. Die Testsysteme übeφriifen dabei sowohl inhibierende bzw. suppressive Effekte der Substanzen, als auch stimulatorische Effekte. Die Effektivität einer Substanz kann durch konzentrationsabhängige Testreihen übeφriift werden. Kontrollansätze ohne Testsubstanzen können zur Bewertung der Effekte herangezogen werden.
Auf Zellen basierende Testsysteme
Durch die anhand der vorliegenden Erfindung verfügbaren, stabil mit HO 10-R transformierten Zelllinien, aber auch durch die anhand der vorliegenden Erfindung indentifizierbaren entsprechenden, homologen Rezeptoren aus anderen Spezies, wird die Entwicklung von Testsystemen, die auf Zellen basieren, zur Identifizierung von Substanzen ermöglicht, die die Aktivität von HO 10-R und homologer Rezeptoren modulieren.
Ebenso wird durch die vorliegende Erfindung die Identifizierung von weiteren Verbindungen ermöglicht, die als Calcium-Kanal-B locker wirksam sind.
Um Modulatoren aufzufinden, kann ein synthetischer Reaktionsmix (z.B. Produkte der in vitro-Translation) oder ein zellulärer Bestandteil, wie eine Membran oder irgendeine andere Präparation, die das Polypeptid enthält, zusammen mit einem markierten Substrat oder Liganden der Polypeptide in Gegenwart und Abwesenheit eines Kandidatenmoleküls, das ein Agonist oder Antagonist sein kann, inkubiert werden. Die Fähigkeit des Kandidatenmoleküls, die Aktivität der erfindungsgemäßen Polypeptide zu erhöhen oder zu hemmen, wird erkennbar an einer erhöhten oder verringerten Bindung des markierten Liganden oder an einer erhöhten oder verringerten Umsetzung des markierten Substrates. Moleküle, die gut binden und zu einer erhöhten Aktivität der erfindungsgemäßen Polypeptide führen, sind Agonisten. Moleküle, die gut binden, aber nicht die biologische Aktivität der erfindungsgemäßen Polypeptide auslösen, sind wahrscheinlich gute Antagonisten. Scintillation Proximity Assay (SPA)
Eine Möglichkeit zur Identifizierung von Substanzen, die die Aktivtät von HO 10-R bzw. dazu homologer Rezeptoφroteine modulieren, ist der sogenannten "Scintillation Proximity Assay" (SPA), siehe EP-A- 015 473. Dieses Testsystem nutzt die Interaktion eines Rezeptors (z.B. HO 10-R) mit einem radiomarkierten Liganden (z.B. ein kleines organisches Molekül oder ein zweites, radioaktiv markiertes Proteinmolekül). Der Rezeptor ist dabei an kleine Kügelchen ("Microspheres") oder Perlen ("Beads") gebunden, die mit szintillierenden Molekülen versehen sind. Im Verlauf des Abfalls der Radioaktivität wird die szintillierende Substanz im Kügelchen durch die subatomaren Partikel des radioaktiven Markers angeregt und ein detektierbares Photon emittiert. Die Testbedingungen werden so optimiert, daß nur jene vom Liganden ausgehenden Partikel zu einem Signal führen, die von einem an den Rezeptor bzw. HO 10-R gebundenen Liganden ausgehen.
In einer möglichen Ausführungsform ist HO 10-R an die Beads gebunden, entweder zusammen oder ohne interagierende bzw. bindende Testsubstanzen. Verwendet werden könnten dabei auch Fragmente des HO 10-R Rezeptors. Ein radioaktiv mar- kierter Ligand könnte z. B. markiertes α-LTX, Nifedipin oder ein markiertes
Depsipeptid sein. Bei einer Bindung eines bindenden Liganden an den immobilisierte HO 10-R Rezeptor, müßte dieser Ligand eine bestehende Interaktion zwischen dem immobilisiertem HO 10-R und dem markierten Liganden inhibieren oder aufheben, um selbst im Bereich der Kontaktfläche zu binden. Eine erfolgte Bindung an den immobilisierte HO 10-R Rezeptor kann dann anhand eines Lichtblitzes detektiert werden. Entsprechend wird ein bestehender Komplex zwischen einem immobilisierten und einem freien, markierten Liganden durch die Bindung einer Testsubstanz zerstört, was zu einem Abfall der detektierten Lichtblitzintensität führt. Das Testsystem entspricht dann einem komplementären Inhibitions-System. Two Hybrid System
Ein weiteres Beispiel für ein auf ganzen Zellen basierendes Testsystem ist das sogenannte "Two Hybrid System". Ein spezifisches Beispiel dafür ist die sogenannte "Interaction Trap", die Interaktions-Falle. Es handelt sich dabei um eine genetische
Selektion von interagierenden Proteinen in Hefe (siehe, z.B. Gyuris et al. 1993). Das Testsystem ist darauf ausgelegt, die Interaktion zweier Proteine zu detektieren und zu beschreiben, indem eine erfolgte Interaktion zu einem detektierbaren Signal führt.
Ein solches Testsystem kann auch an die Prüfung großer Zahlen von Testsubstanzen in einem gegebenen Zeitraum angepaßt werden.
Das System beruht auf der Konstruktion zweier Vektoren, dem "Bait"- und dem "Prey" -Vektor. Ein für ein erfindungsgemäßes HO 10-R oder Fragmente davon kodierendes Gen wird in den Bait- Vektor kloniert und dann als Fusionsprotein mit dem LexA-Protein, einem DNA-bindenden Protein, exprimiert. Ein zweites Gen, kodierend für ein Interaktionspartner von HO 10-R, beispielsweise für ein α-LTX, wird in den Prey- Vektor kloniert, wo es als Fusionsprotein mit dem B42-Prey-Protein exprimiert wird. Beide Vektoren liegen in einem Saccharomyces cerevisiae-Wirt vor, der Kopien von LexA-bindender DNA auf der 5'-Seite eines lacZ- oder
HIS3-Reportergens enthält. Findet eine Interaktion zwischen den beiden Fusions-Proteinen statt, kommt es zur Aktivierung der Transkription des Reportergens. Führt die Anwesenheit einer Testsubstanz zur Inhibition oder zur Störung der Interaktion, können die beiden Fusions-Proteine nicht mehr interagieren und das Produkt des Reportergens wird nicht mehr hergestellt.
Verdrängungstest
Ein weiteres Beispiel für ein Verfahren, mit welchem Modulatoren der erfindungsge- mäßen Polypeptide aufgefunden werden können, ist ein Verdrängungstest, bei dem man unter dafür geeigneten Bedingungen die erfindungsgemäßen Polypeptide und einen potenziellen Modulator mit einem Molekül, das bekanntermaßen an die erfindungsgemäßen Polypeptide bindet, wie einem natürlichen Substrat oder Liganden oder einem Substrat- oder Liganden-Mimetikum zusammenbringt. Bevorzugt wird dazu in erfindungsgemäßer Weise das α-LTX verwendet.
Im Rahmen von molekularen Interaktionsstudien unter Verwendung des vollständigen HO 10-R Proteins bzw der N- und/oder C-terminalen Deletionsmutanten von HO 10-R, oder auch mit durch in vitro Mutagenese bzw. sonstige bekannte Methoden veränderten HO 10-R Molekülvarianten, kann ein bekanntes Analyse- system eingesetzt werden, z.B. von Biacore AB, Uppsala, Schweden. Dabei kann einerseits
(i) das HO 10-R Protein oder Fragmente davon über bekannte chemische Methoden (Kopplung über Amine, Thiole, Aldehyde) oder Affinitätsbindung (z.B. Streptavidin-Biotin, IMAC) an einen Biochip gekoppelt oder andererseits
(ii) α-LTX oder ein anderer Modulator z.B. BAY 44-4400 oder andere mögliche Liganden wie unter (i) beschrieben an den Chip gekoppelt werden.
Die Bindung eines in Lösung befindlichen Liganden (HO 10-R Protein, bzw. ein beliebiger Modulator z.B. BAY 44-4400 etc.) an die immobilisierten Moleküle ist physikalisch messbar. Bei dem Biacore Instrument wird der Ligand auf einem Sensorchip immobilisiert, der eine dünne Goldschicht aufweist. Die Analytlösung wird durch eine Mikroflusszelle auf dem Chip perfundiert. Bindung des Analyten an den immobilisierten Liganden erhöht die lokale Konzentration auf der Oberfläche, wobei der Brechungsindex des Mediums nahe der Goldschicht graduell erhöht wird. Dies hat einen Einfluß auf die Interaktion zwischen freien Elektronen (Plasmonen) in dem Metall und Photonen, die vom Instrument emittiert werden. Diese physi- kaiischen Änderungen sind proportional zur Masse und Molekülzahl auf dem Chip, die Ligand-Analyt Bindung wird in Echtzeit registriert, wodurch Bestimmung der apparenten Assoziations-ZDissoziationrate möglich ist (Fivash et al. 1998). Durch Kompetitionsversuche wird die Spezifität der Bindung validiert.
Entsprechende Messungen dienen auch zur Bestimmung der für die Bindung von Liganden wichtigen HO 10-R Proteindomänen sowie die Identifikation neuer noch nicht bekannter Liganden des HC 110-R.
Calcium Imaging
Als weiteres Verfahren zur Detektion von mit dem HO 10-R interagierenden
Substanzen ist das Calcium Imaging oder Signaling anzusehen (siehe z.B. Abb. 10 und 11). Dabei kommen Calcium-Indikatoren zum Einsatz mit deren Hilfe Änderungen im intrazellulären Calciumspiegel detektierbar gemacht werden. Im Rahmen dieser Verfahren kommen HO 10-R exprimierende Zellen zum Einsatz, die mit Calcium- Indikatoren beladen werden. Unter UV- Anregung kommt es dann bei einem durch einen HO 10-R Agonisten hervorgerufenen Calcium-Einstrom, bzw. bei Freisetzung intrazellulären Calciums zu einer Änderung der Absoφtion in Abhängigkeit der Calciumbeladung des Indikators. Ein Antagonist läßt sich in einem derartigen System durch die vollständige oder teilweise Unterdrückung des von dem Agonisten (z.B. α- LTX) induzierten Calciumsignals erkennen. Als mögliche Calcium-Indikatoren kommen dazu das Fura-2 (Sigma) oder Indo-1 (Molecular Probes) in Betracht.
Weitere Calcium Indikatoren lassen sich durch sichtbares Licht anregen und ändern in Abhängigkeit von ihrer Calciumbeladung detektierbar ihr Fluoreszenzverhalten. Die Indikatoren Fluo-3 und Fluo-4 weisen eine hohe Calciumaffinität auf. Fluo-4 eignet sich mit seinem stärkeren Fluoreszenzsignal dabei insbesondere für Messungen bei Testsystemen, bei denen die Zellen nur in geringer Dichte eingesetzt werden, wie im Falle der HEK293-Zellen. Weitere Indikatoren sind Rhod-2, x-Rhod-1, Fluo-5N, Fluo- 5F, Mag-Fluo-4, Rhod-5F, Rhod-5N, Y-Rhod-5N, Mag-Rhod-2, Mag-X-Rhod-1, Calcium Green-1 und -2, Calcium Green-5N, Oregon Green 488 BAPTA-1, Orgeon
Green 488 BAPTA-2 und -5N, Fura Red, Calcein und ähnliche. Eine Alternative zur Beladung von Zellen mit Calcium Indikatoren stellt die rekombinante Expression von Photoproteinen in den Zielzellen dar. Diese Photoproteine reagieren dann in Form einer Lichtemission nachdem sie mit Calciumionen einen Komplex eingegangen sind. Ein in zahlreichen Untersuchungen und Testsystemen bereits vielfach verwendetes Photoprotein ist das Aequorin. Die das Zielprotein und gleichzeitig das Aequorin exprimierenden Zellen werden in diesem Testverfahren zunächst mit dem Luminophor Coelenterazin beladen. Das von den Zellen gebildete Apoaequorin bildet mit dem Coelenterazin und Kohlendioxid einen Komplex. Tritt an- schließend Calcium in die Zelle hinzu und bindet an den Komplex, kommt es zur Freisetzung von Kohlendioxid und blauem Licht (Emissions-Maximum -466 nm). Die Lichtemission korreliert dabei mit der intrazellulär herrschenden Calciumkonzen- tration.
Gegenstand dieser Erfindung ist damit ebenfalls die Verwendung von HO 10-R,
Fragmenten davon oder ähnlicher Proteine aus anderen Organismen in einem Testverfahren, in dem die Funktion des Rezeptors oder die Bindung von Modulatoren an den Rezeptor mittels eines durch Aequorin oder ähnlichen Photoproteinen vermittelten Lichtsignals detektiert wird.
Unter Verwendung von Wirtszellen oder transgenen Invertebraten, die die erfindungsgemäße Nukleinsäure enthalten, ist es auf diese Weise auch möglich, Substanzen aufzufinden, welche die Expression der Rezeptoren verändern. Auch solche Substanzen können wertvolle Anthelminthika darstellen.
Die mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens gefundenen Wirkstoffe eignen sich entsprechend zur Bekämpfung von tierischen Schädlingen, insbesondere Insekten, Spinnentieren und Nematoden, die in der Landwirtschaft, in Forsten, im Vorrats- und Materialschutz sowie auf dem Hygienesektor vorkommen. Besonders eignen sich die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren gefundenen Wirkstoffe zur Bekämpfung von
Nematoden und Spinnentieren. Zu den oben erwähnten Schädlingen gehören: Aus der Ordnung der Isopoda z.B. Oniscus asellus, Armadillidium vulgäre, Porcellio scaber.
Aus der Ordnung der Diplopoda z.B. Blaniulus guttulatus. Aus der Ordnung der Chilopoda z.B. Geophilus carpophagus, Scutigera spp..
Aus der Ordnung der Symphyla z.B. Scutigerella Immaculata.
Aus der Ordnung der Thysanura z.B. Lepisma saccharina.
Aus der Ordnung der Collembola z.B. Onychiurus armatus.
Aus der Ordnung der Orthoptera z.B. Acheta domesticus, Gryllotalpa spp., Locusta ■ migratoria migratorioides, Melanoplus spp., Schistocerca gregaria.
Aus der Ordnung der Blattaria z.B. Blatta orientalis, Periplaneta americana,
Leucophaea mader ae, Blattella germanica.
Aus der Ordnung der Dermaptera z.B. Forßcula auricularia.
Aus der Ordnung der Isoptera z.B. Reticulitermes spp.. Aus der Ordnung der Phthiraptera z.B. Pediculus humanus corporis, Haematopinus spp., Linognathus spp., Trichodectes spp., Damalinia spp..
Aus der Ordnung der Thysanoptera z.B. Hercinothrips femoralis, Thrips tabaci,
Thrips palmi, Frankliniella accidentalis.
Aus der Ordnung der Heteroptera z.B. Eurygaster spp., Dysdercus intermedius, Piesma quadrata, Cimex lectularius, Rhodnius prolixus, Triatoma spp.
Aus der Ordnung der Homoptera z.B. Aleurodes brassicae, Bemisia tabaci, Trialeurodes vaporariorum, Aphis gossypii, Brevicoryne brassicae, Cryptomyzus ribis, Aphis fabae, Aphis pomi, Eriosoma lanigerum, Hyalopterus arundinis, Phylloxera vastatrix, Pemphigus spp., Macrosiphum avenae, Myzus spp., Phorodon humuli, Rhopalosiphum padi, Empoasca spp., Euscelis bilobatus, Nephotettix cincticeps, Lecanium corni, Saissetia oleae, Laodelphax striatellus, Nilaparvata lugens, Aonidiella aurantii, Aspidiotus hederae, Pseudococcus spp., Psylla spp.
Aus der Ordnung der Lepidoptera z.B. Pectinophora gossypiella, Bupalus piniarius,
Cheimatobia brumata, Lithocolletis blancardella, Hyponomeuta padella, Plutella xylostella, Malacosoma neustria, Euproctis chrysorrhoea, Lymantria spp., Bucculatrix thurberiella, Phyllocnistis citrella, Agrotis spp., Euxoa spp., Feltia spp., Earias insulana, Heliothis spp., Mamestra brassicae, Panolis flammea, Spodoptera spp., Trichoplusia ni, Carpocapsa pomonella, Pieris spp., Chilo spp., Pyrausta nubϊlälis, Ephestia kuehniella, Galleria mellonella, Tineola bisselliella, Tinea pellionella, Hofmannophila pseudospretella, Cacoecia podana, Capua reticulana, Choristoneura fumiferana, Clysia ambiguella, Homona magnanima, Tortrix viridana, Cnaphalocerus spp., Oulema oryzae. Aus der Ordnung der Coleoptera z.B. Anobium punctatum, Rhizopertha dominica, Bruchidius obtectus, Acanthoscelides obtectus, Hylotrupes bajulus, Agelastica alni,
Leptinotarsa decemlineata, Phaedon cochleariae, Diabrotica spp., Psylliodes chrysocephala, Epilachna varivestis, Atomaria spp., Oryzaephilus surinamensis, Anthonomus spp., Sitophilus spp., Otiorrhynchus sulcatus, Cosmopolites sordidus, Ceuthorrhynchus assimilis, Hypera postica, Dermestes spp., Trogoderma spp., Anthrenus spp., Attagenus spp., Lyctus spp., Meligethes aeneus, Ptinus spp., Niptus hololeucus, Gibbium psylloides, Tribolium spp., Tenebrio molitor, Agriotes spp., Conoderus spp., Melolontha melolontha, Amphimallon solstitialis, Costelytra zealandica, Lissorhoptrus oryzophilus. Aus der Ordnung der Hymenoptera z.B. Diprion spp., Hoplocampa spp., Lasius spp., Monomorium pharaonis, Vespa spp.
Aus der Ordnung der Diptera z.B. Aedes spp., Anopheles spp., Culex spp., Drosophila melanogaster, Musca spp., Fannia spp., Calliphora erythrocephala, Lucilia spp., Chrysomyia spp., Cuterebra spp., Gastrophilus spp., Hyppobosca spp., Stomoxys spp., Oestrus spp., Hypoderma spp., Tabanus spp., Tannia spp., _5zb o hortulanus, Oscinella frit, Phorbia spp., Pegomyia hyoscyami, Ceratitis capitata,
Dacus oleae, Tipula paludosa, Hylemyia spp., Liriomyza spp..
Aus der Ordnung der Siphonaptera z.B. Xenopsylla cheopis, Ceratophyllus spp..
Aus der Klasse der Arachnida z.B. Scorpio maurus, Latrodectus mactans, Acarus siro, Argas spp., Ornithodoros spp., Dermanyssus gallinae, Eriophyes ribis, Phyllocoptruta oleivora, Boophilus spp., Rhipicephalus spp., Amblyomma spp.,
Hyalomma spp., Ixodes spp., Psoroptes spp., Chorioptes spp., Sarcoptes spp.,
Tarsonemus spp., Bryobia praetiosa, Panonychus spp., Tetranychus spp., Hemitarsonemus spp., Brevipalpus spp..
Zu den pflanzenparasitären Nematoden gehören z.B. Pratylenchus spp., Radopholus similis, Ditylenchus dipsaci, Tylenchulus semipenetrans, Heterodera spp., Globodera spp., Meloidogyne spp., Aphelenchoides spp., Longidorus spp., Xiphinema spp., Trichodorus spp., Bursaphelenchus spp.
Die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren gefundenen Wirkstoffe wirken nicht nur gegen Pflanzen-, Hygiene- und Vorratsschädlinge, sondern auch auf dem veterinärmedizinischen Sektor gegen tierische Parasiten (Ektoparasiten) wie Schildzecken, Lederzecken, Räudemilben, Laufmilben, Fliegen (stechend und leckend), parasitierende Fliegenlarven, Läuse, Haarlinge, Federlinge und Flöhe. Zu diesen Parasiten gehören:
Aus der Ordnung der Anoplurida z.B. Haematopinus spp., Linognathus spp., Pediculus spp., Phtirus spp., Solenopotes spp.. Aus der Ordnung der Mallophagida und den Unterordnungen Amblycerina sowie
Ischnocerina z.B. Trimenopon spp., Menopon spp., Trinoton spp., Bovicola spp., Werneckiella spp., Lepikentron spp., Damalina spp., Trichodectes spp., Felicola spp..
Aus der Ordnung Diptera und den Unterordnungen Nematocerina sowie
Brachycerina z.B. Aedes spp., Anopheles spp., Cw/ex spp., Simulium spp., Eusimulium spp., Phlebotomus spp., Lutzomyia spp., Culicoides spp., Chrysops spp., Hybomitra spp., Atylotus spp., Tabanus spp., Haematopota spp., Philipomyia spp., Braula spp., Musca spp., Hydrotaea spp., Stomoxys spp., Haematobia spp., Morellia spp., Fannia spp., Glossina spp., Calliphora spp., Lucilia spp., Chrysomyia spp., Wohlfahrtia spp., Sarcophaga spp., Oestrus spp., Hypoderma spp., Gasterophilus spp., Hippobosca spp., Lipoptena spp., Melophagus spp..
Aus der Ordnung der Siphonapterida z.B. Pulex spp., Ctenocephalides spp., Xenopsylla spp., Ceratophyllus spp..
Aus der Ordnung der Heteropterida z.B. Cimex spp., Triatoma spp., Rhodnius spp., Panstrongylus spp..
Aus der Ordnung der Blattarida z.B. R/ ttα orientalis, Periplaneta americana,
Blattela germanica, Supella spp..
Aus der Unterklasse der Acaria (Acarida) und den Ordnungen der Meta- sowie Mesostigmata z.B. Argas spp., Ornithodorus spp., Otobius spp., Ixodes spp., Amblyomma spp., Boophilus spp., Dermacentor spp., Haemophysalis spp.,
Hyalomma spp., Rhipicephalus spp., Dermanyssus spp., Raillietia spp., Pneumonyssus spp., Sternostoma spp., Varroa spp..
Aus der Ordnung der Actinedida (Prostigmata) und Acaridida (Astigmata) z.B. Acarapis spp., Cheyletiella spp., Ornithocheyletia spp., Myobia spp., Psorergates spp., Demodex spp., Trombicula spp., Listrophorus spp., Acarus spp., Tyrophagus spp., Caloglyphus spp., Hypodectes spp., Pterolichus spp., Psoroptes spp., Chorioptes spp., Otodectes spp., Sarcoptes spp., Notoedres spp., Knemidocoptes spp., Cytodectes spp., Laminosioptes spp..
Die mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens gefundenen Wirkstoffe eignen sich auch zur Bekämpfung von Milben, insbesondere Hausstaubmilben z.B. Dermatophagoides pteronyssinus und Z farinae.
Die mit den erfindungsgemäßen Verfahren gefundenen Wirkstoffe eignen sich auch zur Bekämpfung von Arthropoden, die landwirtschaftliche Nutztiere, wie z.B. Rinder, Schafe, Ziegen, Pferde, Schweine, Esel, Kamele, Büffel, Kaninchen, Hühner, Puten, Enten, Gänse, Bienen, sonstige Haustiere wie z.B. Hunde, Katzen, Stubenvögel, Aquarienfische sowie sogenannte Versuchstiere, wie z.B. Hamster, Meerschweinchen, Ratten und Mäuse befallen. Durch die Bekämpfung dieser Arthropoden sollen Todesfälle und Leistungsminderungen (bei Fleisch, Milch,
Wolle, Häuten, Eiern, Honig usw.) vermindert werden, so daß durch den Einsatz der erfindungsgemäßen Wirkstoffe eine wirtschaftlichere und einfachere Tierhaltung möglich ist.
Verbindungen, die mit Hilfe der beschriebenen Verfahren und Polypeptide gefunden werden, sind ebenfalls wertvoll zur Behandlung von Tieren und Menschen, die mit pathogenen Endoparasiten des Menschen oder von Nutztieren, Hobbytieren, Zootieren sowie Labor und Versuchstieren infiziert sind.
Die Verbindungen können in allen Entwicklungsstadien normaler, sensitiver Stämme und auch resistenter Stämme verwendet werden. Durch die Behandlung mit Mitteln, die eine oder mehrere dieser Verbindungen enthalten, können sowohl wirtschaftliche Verluste bei Nutztieren und Krankheiten bei Menschen und Tieren vermieden oder behandelt werden. Die folgenden Parasiten sind dabei von besonderem Interesse als Ziele der gefundenen Wirkstoffe:
Enoplida, z.B. Trichuris spp., Capillaria spp., Trichomosoides spp., Trichinella spp.
Rhabditia, z.B. Micronema spp., Strongyloides spp.
Strongylida, z.B. Strongylus spp., Triodontophorus spp., Oesophagodontus spp Trichonema spp., Gyalocephalus spp., Cylindropharynx spp., Poteriostomum spp
Cyclococercus spp., Cylicostephanus spp., Oesophagostomum spp., Chabertia spp Stephanurus spp., Ancylostoma spp., Uncinaria spp., Bunostomum spp Globocephalus spp., Syngamus spp., Cyathostomum spp., Cylicocyclus spp Neostrongylus spp., Cystocaulus spp., Pneumostrongylus spp., Spicocaulus spp Elaphostrongylus spp., Parelaphostrongylus spp., Crenosoma spp., Paracrenosoma spp., Angiostrongylus spp., Aelurostrongylus spp., Filaroides spp., Paraf aroides spp., Trichostrongylus spp., Haemonchus spp., Ostertagia spp., Marshallagia spp., Cooperia spp., Nematodirus spp., Hyostrongylus spp., Obeliscoides spp., Amidostomum spp., Ollulanus spp. Dictyocaulus spp., Muellerius spp., Protostrongylus spp.
Oxyurida, z.B. Oxyuris spp., Enterobius spp., Passalurus spp., Syphacia spp., _4_?pt- culuris spp., Heterakis spp.
Ascaridia, z.B. Ascaris spp., Toxascaris spp., Toxocara spp., Parascaris spp., Anisa- / s spp., Ascaridia spp.
Spirurida, z.B. Gnathostoma spp., Physaloptera spp., Thelazia spp., Gongylonema spp., Habronema spp., Parabronema spp., Draschia spp., Dracunculus spp.
Filariida, z.B. Stephanofilaria spp., Par ßlaria spp., Setaria spp., Joα spp., Dirofilaria spp., Litomosoides spp., Brugia spp., Wuchereria spp., Onchocerca spp.
Gigantorhynchida, z.B. Filicollis spp., Moniliformis spp., Macracanthorhynchus spp., Prosthenorchis spp.
Mastigophora (Flagellata)
Trypanosomatidae, z.B. Trypanosoma b. brucei, T. b. gambiense, T. b. rhodesiense, _T. congolense, T. cruzi, T. evansi, T. equinum, T. lewisi, T. percae, T. simiae, T. vivax, Leishmania brasiliensis, L. donovani, L. tropica
Trichomonadidae , z.B. Giardia lambilia, G. canis.
Sarcomastigophora (Rhizopoda), z.B. Entamoeba histolytica
Hartmanellidae, z.B. Acanthamoeba sp., Hartmanella spp. Apicomplexa (Sporozoa), z.B. Eimeria acervulina, E. adenoides, E. alabahmensis,
E. anatis, E. anseris, E. arloingi, E. ashata, E. auburnensis, E. bovis, E. brunetti, E. canis, E. chinchillae, E. clupearum, E. columbae, E. contorta, E. crandalis, E. debliecki, E. dispersa, E. ellipsoidales, E. falciformis, E. faurei, E. labbeana, E. leucarti, E. magna, E. maxima, E. media, E. meleagridis. E. meleagrimitis, E. mitis, E. necatrix, E. ninakohlyakimovae, E. ovis, E. parva, E. pavonis, E. perforans, E. phasani, E. piriformis, E. praecox, E. residua, E. scabra, E. spec, E. stiedai, E. suis, E. tenella, E. truncata, E. truttae, E. zuernii, Globidium spec, Isospora belli, I. canis, I. felis, I. ohioensis, I. rivolta, I. spec, I. suis, Neospora caninum, Cystisospora spec. Cryptosporidium spec. Toxoplasmadidae, z.B. Toxoplasma gondii Sarcocystidae, z.B. Sarcocystis bovicanis, S. bovϊhominis, S. neuvona, S. ovicanis, S. ovifelis, S. spec, S. suϊhominis Leucozoide, z.B. Leucozytozoon simondi
Plasmodiidae, z.B. Plasmodium berghei, P. falciparum, P. malariae, P. ovale, P. vivax, P. spec. Piroplasmea, z.B. Babesia argentina, B. bovis, B. canis, B. spec, Theileria parva, T. spec. Adeleina, z.B. Hepatozoon canis, H. spec.
Weiterhin von Bedeutung sind
Myxospora und Microspora, z.B. Glugea spec. und Nosema spec, sowie Pneumocystis carinii, Ciliophora (Ciliata), z.B. Balantidium coli, Ichthiophthirius spec, Trichondina spec. oder Epistylis spec.
Die gefundenen Verbindungen und Mittel sind ebenfalls effektiv gegenüber Protozoen von Insekten, wie solche des Stammes Microsporidia, besonders solche der Ordnung Nosema, ganz besonder solche der Art Nosema apis, die Parasiten der Honigbiene sind.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist deshalb auch die Verwendung von
Verbindungen, die mit einen erfindungsgemäßen Verfahren und/oder unter Verwendung der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren oder Polypeptide gefunden wurden, zur Herstellung eines Mittels der Bekämpfung von Helminthen und/oder Arthropoden. Beispiele
1. Konstruktion und Durchsuchen der cDNA-Bibliothek
Die Konstruktion der cDNA-Bibliothek, die Herstellung von KLH-PF1022A- Konjugat und Antiserum gegen PF1022A sowie das Immunscreening der cDNA-
Bibliothek und die DNA- Analyse erfolgte wie in WO 9,8/15625 beschrieben.
2. Isolierung von RNA
Die totale RNA wurde entsprechend der GTC/CsCIKissen-Methode aus adulten
Haemonchus contortus Nematoden extrahiert und isoliert (Sambrook et al. 1989) oder durch einen einzigen Schritt durch GTC/Phenol/Chloroform-Extraktion gewonnen (Chomczynski und Sacchi 1987). Poly (A)+ RNA wurde durch Chromatographie an oligo(dT)Cellulose isoliert (Aviv und Leder, 1972).
Northern Blotting
Glyoxylierte totale RNA aus Haemonchus contortus (20 μg pro Bahn) wurden im Agarosegel aufgetrennt (Sambrook et al. 1989; McMaster und Carmicheal 1977) und auf eine Hybond N Membran (Amersham) mittels basischer Kapillar-Transfer- methode übertragen (Chomczynski, 1992). Radiomarkierte Proben wurden durch randomisierte Markierung linearisierter Plasmid-DNA (HO 10-R) hergestellt, wobei ein Megaprime-Kit (Amersham, Braunschweig, Deutschland) und 50 μCi [α- 32P]dCTP (3000 Ci/mmol, ICN, Meckenheim, Deutschland) verwendet wurden. Die Hybridisierung wurde über Nacht durchgeführt bei 65°C in 6 x SSC (lx SSC:0, 15 M
NaCl, 0,015 M Na-Citrat), 5x Denhardt's Reagenz (0,1 % Polyinylpyrrolidon, 0,1 % BSA, 0,1 % Ficoll 400), 0,1 % SDS und 100 μg/ml Heringssperma-DNA. Die Filter wurden unter hoher Stringenz in 0,lxSSC und 0,1 % SDS bei 65°C gewaschen und exponiert (Kodak BioMax MS Filme bei -80°C), siehe Abb. 1 (A). 4. 5 - und 3'-RACE-PCR
Zur Isolierung der im identifizierten cDNA Klon fehlenden 5'- und 3 '-Enden wurde das Verfahren des 5V3'-RACE angewendet.
Das 5'-RACE beruht auf der spezifischen Amplifizierung des 5 '-Endes eines Gens aus mRNA. Mit Hilfe eines sequenzspezifischen Primers und der AMV Reversen Transkriptase wird der cDNA-Erststrang synthetisiert. An das Produkt wird ein ein poly (A)-Schwanz angehängt, so dass in der nachfolgenden PCR ein oligo dT- Anker- . primer und ein "nested" sequenzspezifischer Primer eingesetzt werden kann. In einer zweiten PCR kann ein weiterer "nested" Primer verwendet werden, um die Spezifität zu gewährleisten.
Im 3 '-RACE erfolgt die cDNA-Erststrangsynthese mit einem oligo dT-Primer und die nach-folgenden PCR Reaktionen mit sequenzspezifischen Primern.
cDNA wurde aus 1 μg totaler H. contortus RNA mit dem Primer 5'-GGT CAC CGT CGT CCC AGA AA-3' synthetisiert unter Verwendung des 5'-RACE Kits von GIBCO BRL (Eggenstein, Deutschland). Dazu wurde die Superscript Reverse Transkriptase verwendet. Das C-Tailing des C-Terminus der cDNA wurde mit Hilfe der Terminalen Desoxynukleotidyltransferase durchgeführt. Die erste Amplifikation erfolgte mit 400 nM eines oligo-desoxy-inosyl- Anker-Primers (5'-CUA CUA CUA CUA GGC CAC GCG TCG ACT AGT ACG GGI IGG GII GGG IIG-3') und 400 nM des ersten "nested" Primers 5'-CCA TTC GAT TCC TCT TCT CG-3' (Birsner und Grob, Denzlingen, Deutschland) in 50 μl enthaltend 200 μM jedes dNTP,
1,5 mM MgCl2, ein Fünftel der "tailed" cDNA und 2,5 U der nativen Taq- Polymerase. Die erste Denaturierung erfolgte bei 94°C für 5 Minuten, gefolgt von 35 Zyklen zu je 1 Minute bei 94°C, 1 Minute bei 53°C und 2 Minuten bei 72°C, wiederum gefolgt von einem letzten Syntheseschritt von 10 Minuten bei 72°C. Die Reaktionsbedingungen für die "nested" PCR waren dieselben wie oben beschrieben, mit der Ausnahme, dass 1 μl des ersten Amplifikationsproduktes als Template verwendet wurde, sowie der genspezifische zweite "nested" Primer 5'-GTC GAT GGT GCA GAT TTC GC-3 ', eine verkürzte Form des Anker-Primers (5'-CUA CUA CUA CUA GGC CAC GCG TCG ACT AGT AC-3') und nur 25 Zyklen bei einer Annealing-Temperatur von 53°C durchgeführt wurden.
Die 3'-RACE-PCR (GIBCO BRL, Eggenstein, Deutschland) wurde mit 1 μg der totalen RNA adulter H. contortus und 500 nM des oligo dT Adapter-Primers 5'-GGC CAC GCG TCG ACT AGT ACT TTT TTT TTT TTT TTT T-3' durchgeführt, beginnend mit einer Präinkubation für 10 Minuten bei 70°C und 2 Minuten bei 4°C. Nach Zugabe von 2,5 mM MgCl2, 500 μM jedes dNTP, 10 μM DTT und 200 U
Super-Script II Reverse Transkriptase in 20 μl wurde die cDNA für 50 Minuten bei 42°C und in einem abschließenden Schritt für 15 Minuten bei 70°C und 10 Minuten bei 4°C inkubiert. Die RNA wurde durch 2 U E. coli RNase H und einer Inkubation bei 37°C für 10 Minuten entfernt. Die erste Amplifikation erfolgte mit 400 nM eines universellen Adapter-Primers (5 '-CUA CUA CUA CUA GGC CAC GCG TCG ACT
AGT AC-3') und 400 nM des sequenzspezifischen Primers 5'-TTTGTTCTT CCT TGG TAT CC-3' in 50 μl enthaltend 200 mM jedes dNTP, 1,5 M MgCl2, ein Zehntel der "tailed" cDNA und 2,5 U native Taq-DNA-Polymerase. Der erste Denaturierungsschritt erfolgte bei 94°C für 3 Minuten, gefolgt von 35 Zyklen zu je 1 Minute bei 94°C, 1 Minute bei 51°C und 2 Minuten bei 72°C sowie einem abschließenden Syntheseschritt von 15 Minuten bei 72°C. Für die "nested" PCR wurden 2 μl der ersten Amplifikation bei ansonsten gleichen Bedingungen verwendet, wobei nun der kürzere Adapter-Primer 5'-GGC CAC GCG TCG ACT AGT AC- 3 'und der "nested" Primer 5'-ACA CTC TAA TCT CCA ACT G-3' bei nunmehr 30 Zyklen verwendet wurden. Die PCR-Produkte wurden auf 2%igen Agarose-Gelen analysiert, eluiert und in den TA- Vektor xMosBlue (Amersham, Braunschweig, Deutschland) kloniert. 5. Transfer der RNA
Der Transfer der aufgetrennten RNA aus dem Glyoxalgel bzw. genom. DNA aus einem TBE-Agarosegel auf eine neutrale Hybond-N Nylonmembran [Amersham, Braunschweig] erfolgt nach dem 'Downward Alkaline Capillary Transfer' in alkalischer Transferlösung nach der Methode von Chomczynski (1992) für 2 h. Danach wird die Membran für 20 min in 0,2 M Natriumphosphat-Puffer (pH 6,8) neutralisiert, getrocknet und für 20 - 60 min bei 80°C gebacken. Für die Hybridisierung gegen radioaktiv markierte Sonden wird die Membran mit 5 ml/cm2 Prä- . hybridisierungslösung in Kunststofftüten eingeschweißt und für 3 h bei 65°C inkubiert. Zur Hybridisierung wird der Puffer durch Hybridisierungslösung ersetzt. Bei Verwendung von Rapid Hyb.-Lösung [Amersham, Braunschweig] erfolgt die Prähybridisierung in 30 min bei 65°C ohne zusätzliche Prähybridisierungslösung. Nach Zugabe der durch 'Random Priming' radioaktiv markierten Sonde erfolgt die Hybridisierung bei 65°C über Nacht. Danach wird die Membran einmal mit 65°C warmem 2x SSC / 0,1 % SDS für 20 min und dreimal mit 0,lx SSC / 0,1 % SDS für je 1 h gewaschen. Die Exposition der Membran erfolgt auf Kodak X-OMAT oder Kodak BIOMAX-MS Röntgenfilmen mit entsprechender Verstärkerfolie bei -80°C.
6. In vitro Transkription und Translation
Das TNT T7/T3 gekoppelte Retikulocytenlysat-System (Promega) wurde verwendet, um die volle Länge der kodierenden Sequenz von HO 10-R in der Gegenwart von 35S-markiertem Methionin und Cystein (ICN, Eschwege, Deutschland) entsprechend den Vorschriften des Herstellers zu transkribieren und translatieren. Die RNA wurde mit einem Kaninchen Retikulocytenlysat-System (Promega, Serva, Heidelberg) translatiert, wobei eine 40 μCi 35S-markierte Mischung (>1000 Ci/mmol, ICN, Meckenheim, Deutschland), 1 μg zirkularisierte HO 10-R Plasmid-DNA und 10 U T3-RNA-Polymerase verwendet wurden. Die Reaktion wurde bei 30°C für 90 Minuten durchgeführt. Eine positive Kontrolle enthielt 1 μg Luciferase-Kontroll-
DNA. Die Reaktionsprodukte wurden durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (Lämmli 1970) aufgetrennt und mit Hilfe der "Amplify Fluorography Solution" (Amersham Pharmacia Biotech) oder 1 M Natriumsalicylat (pH 7) fluorographiert (Chamberlain 1979), die Gele dann getrocknet und exponiert (Kodak BioMax MR Film mit Verstärker bei -80°C), siehe Abb. 1 (B).
Alternativ wurde zur in vitro Synthese eines RNA-Transkriptes aus in pBluescript SK Monierter HO 10-R cDNA das 'MAXIscript In Vitro Transcription Kit' von Ambion (Heidelberg) herangezogen. 4 μg HO 10-R Plasmid-DNA wurden mit dem
Restriktionsenzym Hind III bzw. Sal I hinter dem Stop-Codon linearisiert, mit Phenol-Chloroform extrahiert, in 3 Vol. Ethanol gefällt und in DEPC-H O gelöst. In einem 50 μl Reaktionsansatz wurden 2 μg HO 10-R cDNA mit 2,5 μl 200 mM DTT, je 2,5 μl 10 mM ATP, CTP, GTP und UTP, 5 μl lOx Transkriptionspuffer, 1,6 μl RNasin-Inhibitor (40 U / μl) (Promega, Heidelberg) und 2 μl T3-Phagen-Polymerase
(10 U / μl) versetzt und für 2 h bei 37°C inkubiert. Nach 1 h wurden noch einmal 2 μl T3-Phagen-Polymerase (10 U / μl) hinzugegeben. Der Ansatz wurde mit 1,5 μl RNasefreier DNase I (2 U / μl) und 1 μl RNasin-Inhibitor (40 U/μl) versetzt, für 15 min bei 37°C inkubiert, mit Phenol-Chloroform extrahiert, in 3 Vol. Ethanol gefallt und in 25 μl DEPC-H2O resuspendiert. 1/5 Vol. der Probe wurde in einem
Glyoxalgel analysiert.
7. DNA-Analyse
Die Klone wurden durch die Didesoxynukleotid-Kettenterminationsmethode unter
Zuhilfenahme der automatisierten Laser-Fluoreszenz-Sequenzierung (LICOR 4000; MWG, Ebersberg, Deutschland) sequenziert sowie des "Thermo Sequenase fluorescent-labeled cycle sequencing kit" (Amersham, Braunschweig, Deutschland). Die Sequenzen beider Stränge wurden bestimmt und die Sequenzdaten mit der GCG- Software (Genetics Computer Group Inc., Madison, WI, USA) sowie der PC/GENE-
Software (Intelligenetics, Mountain View, CA, USA). Die Programme FASTA (Pearson und Lipman 1988), BLITZ (Smith und Waterman 1981) und BLAST (Altschul und Lipmann 1990) wurden verwendet, um die EMBL- und Swiss-Prot Protein-Datenbanken nach Sequenzähnlichkeiten der abgeleiteten Proteinsequenz zu durchsuchen. Die Proteinsequenzen wurden mit SAPS analysiert (Brendel et al. 1992), sowie mit PROSITE und Prot-Param (Appel et al. 1994).
8. Herstellung von Proteinextrakten aus Haemonchus contortus
50 — 100 mg in flüssigem Stickstoff eingefrorene H. contortus-Würmer wurden in . 1 ml TRIZOL [Gibco, Karlsruhe] aufgenommen. Die Nematoden wurden zusammen mit dem TRIZOL 3x für 15 sec in einem Glas-Potter homogenisiert und für 5 min bei RT inkubiert. Nach Zugabe von 200 μl Chloroform pro ml TRIZOL und Schütteln der Probe für 15 sec wurde der Ansatz für weitere 2 - 3 min bei RT inkubiert, bevor er für 10 min bei 7.000 - 12.000 φ und 4°C zentrifugiert wurde. Die obere wäßrige Phase enthält die RNA, die Inteφhase die genomische DNA, die rote organische
Phase die Proteine (Coombs et al. 1990; Chomczynski 1993). Die wäßrige Phase wurde entfernt und separat aufbereitet. Die Inteφhase und organische Phase wurden mit 300 μl 100 % Ethanol pro ml TRIZOL versetzt, gut durchmischt und für 2-3 min bei RT inkubiert. Nach einer Zentrifugation für 2.000 φm für 5 min und 4°C wurde der Protein-Überstand vorsichtig in ein neues Eppendorfgefäß überführt und mit 1 ml
Isopropanol für 10 min bei RT gefällt. Es wurde erneut für 10 min bei 12.000 φm und 4°C zentrifugiert, der Überstand verworfen und das Proteinpellet 3x mit je 2 ml 0,3 M Guanidin-Hydrochlorid-Lösung in 95 % Ethanol versetzt, „gevortext", für 20 min bei RT inkubiert und für 5 min bei 7.500 φm und 4°C zentrifugiert. Danach wurde das Pellet in 2 ml 100 % Ethanol gelöst, für 20 min bei RT gefällt und für
5 min bei 7.500 φm und 4°C pelletiert. Das Pellet wurde kurz vakuumgetrocknet und in Harnstoff-Lysispuffer (8 M) resuspendiert. Unlösliches Material wurde durch eine Zentrifugation für 10 min bei 10.000 φm und 4°C entfernt, der Überstand in ein neues Eppendorfgefäß überführt und nach Bestimmung der Proteinkonzentration bis zur Weiterverarbeitung bei -20°C gelagert. 9. Herstellung von Proteinextrakten aus Hefezellen
Zur Herstellung von Proteinextrakten aus einer Hefekultur wurden 5 ml YPAD- Medium mit einer Hefe-Einzelkolonie angeimpft und bis zur Sättigung bei 30°C ge- schüttelt (2 Tage). Jeweils 2 ml einer solchen Hefekultur wurden für 2 min bei
3.000 φm und 4°C (Heraeus Biofuge 15 R) abzentrifugiert, einmal mit H2O gewaschen, in 250 μl Hefe-Lysispuffer resuspendiert, in ein kleines Reagenzglas überführt, mit Glasperlen (0 0,5 mm) bis knapp unter den Flüssigkeitsspiegel aufgefüllt und für 5 min auf höchster Stufe „gevortext". Anschließend wurde 4x RotiLoad- Puffer (Roth, Karlsruhe) zugegeben und der Ansatz für 5 min bei 95°C inkubiert. Die aufgeschlossenen Zellen wurden in ein Eppendorfgefäß überführt und die Zelltrümmer für 5 min bei 14.000 φm (Eppendorf Centrifuge 5415 C) abzentrifugiert. Jeweils 20 μl der so aufbereiteten Proben wurden auf ein SDS-Polyacrylamidgel aufgetragen.
10. Herstellung von Proteinextrakten aus E. coli-Zellen
Zur Herstellung von Proteinextrakten wurden 1 x 107 E. coli-Zellen aus einer 5 ml Über-Nacht-Kultur für 5 min bei 5.000 φm und 4°C in einer Heraeus-Untertisch- zentrifuge pelletiert, mit 5 ml PBS gewaschen und erneut abzentrifugiert. Das Pellet wurde danach in 1 ml TRIZOL (Gibco, Karlsruhe) resuspendiert und weiter aufgearbeitet.
Alternativ hierzu wurde das mit PBS gewaschene Zellpellet wieder in PBS" resuspendiert und die Zellen mit Hilfe von mehreren kurzen Ultraschallimpulsen (Sonifier B- 12, Branson Sonic Power Company, Danbury, U.S.A.), flüssigem Stickstoff und durch Zugabe von Lysozym zerstört.
In Anschluß an die Proteinbestimmung wurde 4x RotiLoad-Puffer (Roth, Karlsruhe) zugegeben und die Fraktion durch Auftragung auf ein SDS-Polyacrylamidgel analysiert. Dabei wurde pro Spur eine Proteinmenge von insgesamt 10 - 20 μg aufgetragen. 11. Herstellung von Proteinextrakten aus der Zellkultur
Eine konfluente 35 mm Zellkulturschale adhärenter Zellen bzw. 5 - 10 x 106 nicht- adhärente Säuger-Zellen in FCS-haltigem Medium wurden zuvor mit einer Trypsin-
EDTA-Lösung abtrypsiniert oder mechanisch nach Kälteeinwirkung mit einem Zellschaber abgelöst, in ein Eppendorfgefäß überführt, für 10 sec bei 13.000 φm und RT pelletiert, zweimal mit PBS gewaschen und erneut abzentrifugiert. Nach Aufnahme der Zellen in 1 ml TRIZOL wurden diese durch kräftiges „Vortexen" oder durch mehrfaches Ziehen der Zellen durch die Kanüle einer Einwegspritze lysiert und für
5 min bei RT inkubiert. Alternativ hierzu kann das Zellpellet auch in 1 ml PBS oder Harnstoff-Lysispuffer (8 M) resuspendiert und einer kurzen Ultraschallbehandlung (Sonifier B-12, Branson Sonic Power Company, Danbury, U.S.A.) unterzogen werden. Danach wird der Proteingehalt nach Bradford (1976) oder Lowry et al. (1951) bestimmt.
12. Induzierbare Protein-Expression in E. coli
Zur Herstellung von polyklonalen Antiköφern gegen das HO 10-R Protein wurden drei HO 10-R Fragmente - die komplette HO 10-R cDNA, das N-terminale Ende ohne TM-Domänen und das C-terminale Ende nach der 7. TM-Domäne - in den Expressionsvektor pRSET B (Invitrogen, Leek, NL) kloniert und so N-terminal mit einem 6xHis-Tag unter Beachtung des Leserasters fusioniert.
Der komplette kodierende Bereich von HO 10-R wurde mit dem P84_ATG BamHI
5 '-Primer 5 '-CTG CCG GAT CCT CGG TTT AAT ACC AAC ATG AGG-3' und dem P3121_TGA Hindlll 3'-Primer 5'-GCA CTA AGC TTG ACT GAA GCG CAC AAC CTC G-3', der N-Terminus bis zur 1. Transmembrandomäne wurde mit den Primern P84_ATG BamHI 5'-Primer (s. o.) und dem P1434_TGA Hindlll 3'-Primer 5 '-GGC TCA AGC TTA TCA GAG AAC AAG CGA CAC GGC-3 ', und der C-Ter- minus beginnend nach der 7. Transmembrandomäne wurde mit dem P2486_ATG BamHI 5 '-Primer 5'-CTA TCG GAT CCC AAC ATG GCT GGC TCC CGT GAT ACC TCT AGG-3' und dem P3121_TGA Hindin 3'-Primer (s. o.) amp ifiziert. Die Annealingtemperatur betrug bei allen drei Plasmid-PCR zunächst über 5 Zyklen 56°C und dann über 30 Zyklen 62°C. Die PCR-Produkte wurden mit den Enzymen BamHI und Hindlll verdaut und gerichtet in den ebenfalls BamHI / HindTH linearisierten pRSET B-Expressionsvektor ligiert.
In dem pRSET B-Vektor wird die Expression über einen viralen Promoter des Bakteriophagen T7 kontrolliert. Die Klonierung erfolgte deshalb in dem XLl-Blue E. coli Stamm, der kein Gen der T7 RNA Polymerase enthält. Das rekombinante Plasmid wurde danach in T7 Polymerase exprimierenden BL21(De3)pLysS E. coli-Zellen transformiert, die zusätzlich das Plasmid pACYC184 enthalten, das über eine Chloramphenicolresistenz stabilisiert wird, und in geringen Mengen das T7- Lysozym, einen natürlichen Inhibitor der T7 RNA-Polymerase, exprimieren. Da diese Zellen unter der Kontrolle des lacUV5 Promoters stehen, erfolgt bei IPTG-
Induktion die Expression der T7 RNA Polymerase und damit auch die des Fusionsproteins.
Eine Einzelkolonie mit dem gewünschten HO 10-R Plasmid wurde von einer frischen LB-Platte mit 50 μg / ml Ampicillin und 35 μg / ml Chloramphenicol in
50 ml LB-Medium unter gleichem Selektionsdruck überimpft und ÜN bei 37°C und 280 φm bis zur stationären Phase geschüttelt. Diese ÜN-Kultur wurde anschließend auf OD6oo = 0,3 verdünnt und 100 ml der Kultur bei 37°C und 280 φm bis zu einer OD600 = 0,6 - 0,5 weitergeschüttelt.
1 OD60o -Einheit wurde abgenommen, die nicht-induzierten Zellen kurz abzentrifugiert und in 150 μl 8 M-Harnstoff-Lysispuffer, pH 8,0, und 50 μl 4xRotiLoad- Puffer [Roth, Karlsruhe] aufgenommen. Die nicht-induzierte Probe wurde für 2 min denaturiert, die genomische DNA durch kurze Ultraschallimpulse von wenigen Sekunden im Sonifier B-12 [Branson Sonic Power Company, Danbury, U.S.A.] geschert und unlösliche Partikel durch eine 3minütige Zentrifugation bei 14.000 φm pelletiert.
Die Expression des Fusionsproteins wurde durch Zugabe von 1 mM ff TG induziert und die 100 ml Kultur für weitere 3 - 4 h bei 37°C inkubiert. Nach der Inkubation wurden die induzierten Zellen für 15 min bei 5.Q00 φm und 4°C (Heraeus- Untertischzentrifuge) abzentrifugiert, das Pellet in PBS gewaschen und anschließend in 8 ml 8 M-Harnstoff-Lysispuffer resuspendiert. Der Aufschluß der Zellen erfolgte durch 3maliges Eintauchen der Zellen in flüssigen Stickstoff und anschließendes Auftauen bei 37°C. Nach der ersten Stickstoffbehandlung wurden 0,75 mg/ml
Lysozym zugesetzt. Nach der letzten Inkubation in flüssigem Stickstoff erfolgte eine Inkubation für 20 min bei 16°C, gefolgt von kurzen Ultraschallimpulsen zu je 10 sec und einer Abkühlung im Eiswasserbad, bis die Lösung eine wasserähnliche Viskosität aufwies. Nach einer lOminütigen Zentrifugation bei 13.000 φm und 4°C (Beckman J2-21; JS 13.1-Rotor) wurde eine induzierte 150 μl Probe entnommen, mit
50 μl 4xRotiLoad-Puffer (Roth) versetzt und die Induktion des jeweiligen HO 10-R Proteinfragmentes zusammen mit der nicht-induzierten Probe durch SDS-PAGE mit anschließender Coomassiefärbung bzw. Western Blot- Analyse mit einem Maus-anti- His- Antiköφer übeφriift.
Der restliche Überstand wurde für die weitere Aufreinigung mittels Affinitäts- chromatographie in ein frisches Gefäß überführt und bei - 20°C gelagert.
13. Proteinaufreinigung durch Metall-Affinitätschromatographie
Die Anreicherung erfolgte unter denaturierenden Bedingungen über das N-terminale 6xHis-Tag mit Hilfe des IMAC-Systems ('Immobilized Metal Affmity Chromato- graphy') über TALONspin-Säulen von Clontech [Palo Alto, U.S.A.]. Das Harz der Säule wurde zunächst separat mit 5 Vol. 8 M-Harnstoff-Lysispuffer, pH 8,0, äquili- briert, für 4 min bei 3.000 φm und 4°C sedimentiert und zusammen mit dem
HO 10-R Protein-Überstand für 20 min bei RT unter leichtem Schütteln inkubiert. Nach einer erneuten Zentrifugation wurde das Harz 3mal mit dem lOfachen Volumen 8 M-Harnstoff-Lysispuffer, pH 8,0, für 10 min bei RT unter leichtem Schütteln gewaschen und wieder abzentrifugiert. Nach dem letzten Waschschritt wurde das Pellet in 1 ml 8 M-Harnstoff-Lysispuffer aufgenommen und damit die Säule beladen; diese wurde im folgenden noch 2mal mit dem 3 fachen Volumen 8 M-Harnstoff-Lysispuffer gewaschen, bevor die Elution mit Imidazolhaltigem 8 M-Harnstoff- Lysispuffer in mehreren Fraktionen zu je 150 μl erfolgte. Der Gehalt von Fusionsprotein in den Fraktionen wird durch Gelanalyse und Proteinbestimmung nach Bradford ermittelt.
14. Proteinaufreinigung durch Affinitätschromatographie
An dieser Stelle soll beispielhaft die Proteinaufreinigung durch Metall-Affinitätschromatographie beschrieben werden. Die Anreicherung erfolgte unter denatu- rierenden Bedingungen über das N-terminale 6xHis-Tag mit Hilfe des IMAC-
Systems (Tmmobilized Metal Affinity Chromatography') über TALONspin-Säulen von Clontech [Palo Alto, U.S.A.]. Das Harz der Säule wurde zunächst separat mit 5 Vol. 8 M-Harnstoff-Lysispuffer, pH 8,0, äquilibriert, für 4 min bei 3.000 φm und 4°C sedimentiert und zusammen mit dem HC-1 Protein-Überstand für 20 min bei RT unter leichtem Schütteln inkubiert. Nach einer erneuten Zentrifugation wurde das
Harz 3mal mit dem lOfachen Volumen 8 M-Harnstoff-Lysispuffer, pH 8,0, für 10 min bei RT unter leichtem Schütteln gewaschen und wieder abzentrifugiert. Nach dem letzten Waschschritt wurde das Pellet in 1 ml 8 M-Harnstoff-Lysispuffer aufgenommen und damit die Säule beladen; diese wurde im folgenden noch 2mal mit dem 3fachen Volumen 8 M-Harnstoff-Lysispuffer gewaschen, bevor die Elution mit Imidazolhaltigem 8 M-Harnstoff-Lysispuffer in mehreren Fraktionen zu je 150 μl erfolgte. Der Gehalt von Fusionsprotein in den Fraktionen wird durch Gelanalyse und Proteinbestimmung nach Bradford ermittelt. 15. Aminosäuresequenzanalyse
Zur Übeφrüfung der deduzierten Aminosäure-Sequenz ausgehend von dem cDNA- full length Klon HO 10-R wurde das 3 '-Ende bestehend aus 688 bp (Pos. 2486- 3182) mit einem vorangestellten Start-Codon und Kozak-Sequenz in den pRSET B-
Expressionsvektor kloniert und in kompetenten BL21(DE3)pLysS E. coli-Zellen die Expression des 21 kD Proteins (189 AS) durch Zugabe von lmM IPTG induziert. Das mit einem N-terminalen HisTag versehene Fusionsprotein wurde über eine Talon-Matrix angereichert und mittels Centriconröhrchen aufkonzentriert und ent- salzt. Wegen des N-terminalen HisTags wurde eine C-terminale Protein- An- sequenzierung von 1 nM des 21 kD HO 10-R Proteins nach dem schrittweisen Schlack-Kumpf- Abbau (Schlack et al. 1926) in einer Modifikation von Boyd (Boyd et al. 1992) von der Firma TopLab (Martinsried) durchgeführt. Die Sequenzierung der abgespaltenen Aminosäuren erfolgte in einem Aminosäuresequenzierer PROCISE 492 (PE Applied Biosystems, Weiterstadt) und wurde mit dem PROCISE
C Reversed phase HPLC System, bestehend aus einem ABI HOC Mikrogradienten System und einem ABI 785A UV / VIS Detektor, analysiert und mit der PROCISE C Kontrollsoftware sowie der ABI Data Analysis Software identifiziert.
25 pmol des 21 kD HO 10-R Proteins wurden durch 2 % Trypsin (Röche Molecular
Biochemicals, Mannheim) bei 37°C über Nacht intern gespalten. Insgesamt wurden vier Peptidfragmente durch einen Vergleich des HO 10-R Standardchromato- grammes nach dem Trypsin- Verdau mit dem Chromatogra m des Trypsin-Blank- verdaus ausgewählt, um die Sequenzierung von tryptischen Autolyseprodukten aus- zuschließen. Diese vier Peptidfragmente wurden einer N-terminalen Protein-An- sequenzierang nach dem Verfahren des schrittweisen Edman-Abbaues in einer Modifikation nach Hunkapiller et al. (1983) durch die Firma TopLab (Martinsried) unterzogen. Die gespaltenen Peptidfragmente wurden mittels HPLC aufgetrennt und fraktioniert. Die auf Immobilon geblottete Peptidfraktion wurde in die Reaktionskammer des Aminosäuresequenzierers PROCISE 492 (Applied Biosystems, Weiterstadt) eingebracht und die Aminosäuren in einem 140 C-PTH- Analyser und UV-Detektor 785 A (Applied Biosystems, Weiterstadt) abgetrennt. Die Aminosäuren wurden quantitativ durch 'Reversed Phase' HPLC erfaßt und über Retentionszeitvergleich mit einem vor der Sequenzanalyse erstellten Standard- chromatogramm identifiziert.
16. Zellkulturlinien
Die folgenden Zellkulturlinien wurden über die Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH [Braunschweig] bezogen [Drexler et al. 1995]: COS-7-ZeIlen (DSM: ACC 60) - Affe, Niere
HEK-293-ZeIlen (ATCC: CRL 1573) - Human, embryonal, Niere
17. Kultivierung der verschiedenen Zellkulturlinien
Die Kultivierung der adhärenten Zellinien COS-7 und HEK-293 erfolgte in 110 mm Gewebekulturschalen [Greiner, Solingen] in einem Volumen von 10 ml Medium bei 37°C, 5 % CO2 und 95 % Luftfeuchtigkeit. Zur Aufrechterhaltung der Zellkultur wurden COS-7- und HEK-293-Zellen in DMEM-Medium kultiviert. Die Medien enthielten 3,024 g/1 NaHCO3, 10 % FCS, 50 U / ml Penicillin, sowie 50 μg/ml
Streptomycin und wurden vor Gebrauch auf 37°C erwärmt. Zur Subkultivierung der COS-7-Zellen wurden diese für 2 h bei 4°C gelagert und anschließend mechanisch mit einem Zellschaber von der Kulturschale abgelöst. Die HEK-293-Zellen ließen sich direkt mit einer Glaspipette vom Boden der Kulturschale ablösen.
18. Transiente und stabile Transfektion von eukaryotischen Zellen
Um Fremd-DNA transient in Säuger-Zellen einzubringen, wurde das nicht- liposomale Transfektionsreagenz FuGENE 6 von Röche Molecular Biochemicals (Mannheim) eingesetzt (Kurachi et al. 1998). Dazu wurden ca. 0,5 - 1,5 x 105 Zellen in 2 ml Medium auf 35 mm große Gewebekulturschalen ausgebracht, in die für die spätere konfokale Laserscanning-Mikroskopie ein steriles, mit 1 % Gelatine beschichtetes Objektträgergläschen gelegt wurde. Die Zellen wurden bei 37°C, 5 % CO2 und 95 % Luftfeuchtigkeit über Nacht kultiviert. Vor der Transfektion wurde noch einmal das Medium gewechselt. Für die Transfektion wurden pro Reaktionsan- satz 3 μl FuGENE 6 [Röche Molecular Biochemicals] in 97 μl serumfreiem Medium verdünnt und für 5 min bei RT inkubiert. Tropfenweise wurden je 100 μl des verdünnten FuGENE 6 pro Ansatz zu 1-2 μg Plasmid-DNA (0,5-1 μg/μl) pipettiert, vorsichtig gemischt und für weitere 15 min bei RT inkubiert. Danach wurde der komplette Reaktionsansatz tropfenweise zu den Zellen gegeben und durch leichtes Schwenken der Schale die Transfektionsmischung gleichmäßig verteilt. Die Zellen wurden ohne Mediumwechsel für 1 - 2 Tage weiterkultiviert. Bei jeder Transfektion wurden folgende 3 Negativkontrollen stets mit durchgeführt: eine 35 mm-Gewebe- kulturschale mit 0,5 - 1,5 x 105 Zellen wurde nicht transfiziert, einer zweiten Schale wurde zwar DNA, aber kein FuGENE 6 im Transfektionsansatz zugesetzt und einer dritten Schale wurde FuGENE 6, aber keine DNA zugefügt.
Für eine stabile Transfektion wurde das gewünschte Plasmid HO 10-R im richtigen Leseraster in den leicht modifizierten Expressionsvektor pSecTag A [Invitrogen, Leek, NL] bzw. pIRESπeo [Clontech, Palo Alto, U.S.A.] kloniert. Diese Vektoren tragen ein Resistenzgen als Marker, so daß bei Zugabe von Zeozin bzw. G418 oder
Bleomycin 48 72 h nach der transienten Transfektion und bei jedem folgenden Mediumwechsel nur erfolgreich transfizierte Zellen, die das Resistenzgenprodukt dauerhaft exprimieren, überleben. Die optimale Konzentration des Zeozin- bzw- G418- haltigen Selektionsmediums wurde zuvor durch Anlegen einer Verdünnungsreihe für die jeweilige Zelllinie ermittelt.
19. Zelluläre Lokalisation rekombinanter Proteine in Säuger-Zellen
Die vollständige kodierende Region der HC110-R-DNA wurde in die HindHI/Sall- Stelle vonpEGFP-N3 kloniert, um das HO 10-R-Protein C-terminal mit GFP (Green
Fluorescent Protein) zu verknüpfen. Das 137 kDa große Fusionsprotein wird in transient transformierten Empfangerzelllinien exprimiert, was durch Western-Blot- Analyse nachgewiesen werden kann. Die CLSM (Confocal Laser Scanning Micros- copy) zeigt, dass das HOlO-R-GFP-Fusionsprotein in COS-7 und HEK-293 -Zellen im Cytoplasma lokalisiert ist sowie in geringerem Ausmaß auch an der Plasma- membran (siehe auch Abb. 8).
Für die konfokale Laserscanning-Mikroskopie wurde ein Zeiss IM 35 Mikroskop (Zeiss, Oberkochen) mit einem Leica CLSM-Aufsatz TCS NT ('Confocal Laser Scanning Microscope Unit', Leica Lasertechnik, Heidelberg), Version 1.5.451, ver- wendet. Die Fluoreszenz des GFP-Proteins sowie des Farbstoffes Fluoreszein-Iso- thiocyanat (FITC) wurde bei 488 nm mit einem Argon-Laser, die für Rhodamin, Texas-Rot, Phycoerythrin, Alexa 568, LysoTracker™Red DND-99, MitoTracker™Red CMX Ros bzw. Propidiumiodid bei 568 nm mit einem Krypton- Laser angeregt. Z-Serien von optischen Schnitten durch die Zelle wurden mit einer Auflösung von 1024 x 1024 Pixel und einer Schichttiefe von 0,5 μm gescannt (Giese et al. 1995). Die Ausweitung erfolgte mit der AVS Software (Advanced Visual Systems Inc., Waltham, M.A., U.S.A.) sowie später mit Adobe Photoshop 5.0 und Corel Draw 8.0 für Windows.
Das Fusionsprotein findet sich dabei vor allem in sauren Lysosomen, wie die
Kolokalisierang mit Hilfe von Lysotracker™, eine Probe zur Markierung saurer Organellen, zeigt. Die das HOlO-R-Protein enthaltenden Vesikel wurden vermehrt in der Nähe des Nukleus beobachtet. Zur Kontrolle wurden ein Fusionsprotein aus GFP und dem ß2-adrenergen GPCR aus der Maus hergestellt (Accession Number X155643, Nakada et al. 1989), dessen Transfektion im gleichen Verteilungsmuster innerhalb der Zelle resultierte wie im Falle des HOlO-R-GFP-Fusionsproteins (Abb. 8). 20. EGFP-Konstrukte für die transiente Expression
Die Vektoren pEGFP Cl und pEGFP N3 (Clontech, Palo Alto, CA, U.S.A.) wurden mit den Restriktionsenzymen Hind III und Sal I geschnitten. Die Amplifizierung der HO 10-R ,füll length' cDNA erfolgte mit dem P83EGFP__ATG Hindlü 5'-Primer
5'-GGT AGA AGC TTT TCG GTT TAA TAG CAA CAT GAG G-3' und dem P3057EGFP_o.TGA Sall 3 '-Primer 5 '-CTG TGT CGA CAA CAT TTC GCC AAT AGT TAG G-3' bei einer Annealing-Temperatur von 65°C. Das PCR-Produkt wurde anschließend ebenfalls mit den Enzymen Hind III und Sall geschnitten und unter Erzeugung eines offenen Leserasters zwischen die Hind HI und Sall-Schnittstellen des jeweiligen Vektors ligiert und transformiert. Das entstehende Fusionsprotein mit dem N-terminalen GFP-Tag wurde GFP-HO10-R, das mit dem C-terminalen EGFP- Tag HO10-R-GFP genannt. Ein ß2-Adrenerger Rezeptor aus der Maus (Gen Bank Accession Nr.: P 18762; Nakada et al. 1989) wurde mit einem C-terminalen EGFP- Tag fusioniert, indem die ,full length' cDNA mit dem P117Mausß2AR Xhol 5'-
Primer 5'-TAC CTC GAG CTG CTA ACC TGC CAG CCA TG-3' und dem P1349Mausß2AR EcoRI 3'-Primer 5'-TGT AGA ATT CTT CCT TCC TTG GGA GTC AAC GCT-3' mit einer Annealingtemperatur von 55/60°C amplifiziert, mit den Restriktionsenzymen Xhol und EcoRI geschnitten und in den Xhol - EcoRI linearisieren pEGFP N3 ligiert wurde. Ebenfalls in den Xhol - EcoRI geschnittenen pEGFP N3-Vektor wurde die ,full length' cDNA eines humanen muscarinischen Rezeptors 1 (huMIRez.; Gen Bank Accession Nr.: Y00508; Allard et al. 1987) ligiert, die zuvor mit dem P70HumMlRez Xhol 5 '-Primer 5'-ATA TCT CGA GAG CCC CAC CTA GCC ACC ATG AAC A-3' und dem P1465HumMlRez EcoRI 3'- Primer 5'-GAC GAA TTC CAT TGG CGG GAG GGA GTG CGG T-3'bei 55/60°C amplifiziert wurde. Die resultierenden Fusionsproteine mit offenem Leseraster wurden Mausß^AR-EGFP und huMIRez-EGFP genannt. 21. HCllO-R-MycHis-Tag Konstrukte für die stabile oder transiente Transfektion
Der Vektor pMycόxHis leitet sich von dem Vektor pSecTagA [rnvitrogen, Leek, NL] durch Doppelverdau mit den Restriktionsenzymen Nhil und Sfil, gefolgt von
,blunting' der Enden und Religation des Vektors. ,Die codierende Region von HO 10-R wurde mit Hilfe der PCR-Primer P83MycTag_ATG BamHI 5'-Primer 5'- ATA GGA TCC TTC GGT TTA ATA CCA ACA TGA GG-3' und P3058MycTag_o.TGA Xbal 3'-Primer 5'-CCT GTC TAG AAA CAT TTC GCC . AAT AGT TAG G-3' bei einer Annealingtemperatur von 56/60°C amplifiziert, mit den Enzymen BamHI und Xbal geschnitten und in den gleichfalls BamHI Xbal linearisierten pMycöxHis- Vektor ligiert und in E. coli DH5α-Zellen transformiert. Im folgenden wurden COS-7-Zellen stabil mit dem Konstrukt transfiziert und unter Zeocin-Selektionsdruck gehalten.
Parallel hierzu wurde die HOlO-RMycHis-cDNA mit den Primern P83_ATGNotI- 5' 5'-ATA TTG CGG CCG CTT CGG TTT AAT ACC AAC ATG-3' und pMycHis_TGABamHI-3' 5'-CGC GGA TCC TAG AAG GCA CAG TCG AGG-3' amplifiziert, nachgeschnitten und in den gleichfalls BamHI und Notl restringierten bicistronischen Expressionsvektor pIRESlπeo (GenBank Accession Nr.: U89673)
(Clontech, Palo Alto, U.S.A.) ligiert. Der pIRESlweo Vektor enthält zusätzlich eine interne Ribosomen-Bindestelle (IRES) des Enzephalomyöcarditis-Virus (ECMV) kurz vor dem Start- ATG des Neomycin-Resistenzgens (Rees et al. 1996). Auf diese Weise werden zwei offene Leseraster, das des HO 10-R und das des Antibiotika-Re- sistenzmarkers, von nur einer mRNA mit einem humanen Cytomegalovirus- (CMV-)
Promoter translatiert (Jackson et al 1990; Jang et al. 1988). Die Selektion erfolgte durch G418 (Calbiochem-Novabiochem, La Jolla, CA, U.S.A.) in COS-7- und HEK- 293-Zellen. 22. Konfokale Laserscanning-Mikroskopie
Für die konfokale Laserscanning-Mikroskopie wurde ein Zeiss IM 35 Mikroskop (Zeiss, Oberkochen) mit einem Leica CLSM- Aufsatz TCS NT ('Confocal Laser Scanning Microscope Unit', Leica Lasertechnik, Heidelberg), Version 1.5.451, verwendet. Die Fluoreszenz wurde bei 488 nm mit einem, Argon-Laser, bei 568 nm mit einem Krypton-Laser angeregt. Z-Serien von optischen Schnitten durch die Zelle wurden mit einer Auflösung von 1024 x 1024 Pixel und einer Schichttiefe von 0,5 μm gescannt (Giese et al. 1995). Die Auswertung erfolgte mit der AVS Software . (Advanced Visual Systems Inc., Waltham, M.A., U.S.A.) sowie später mit Adobe
Photoshop 5.0 und Corel Draw 8.0 für Windows.
23. Bindungsstudien von α-LTX an HC110-R Fragmente
Proteine (20 μg/Bahn) wurden durch SDS-PAGE (Lammli et al., 1970) aufgetrennt und auf Nitrocellulosemembranen elektrogeblotted. Im Falle von α-LTX-Bindungs- experimenten wurden die Blots bei Raumtemperatur mit α-LTX bei einer Konzentration von 20 nM in TST für 2h inkubiert. Nach dreimaligem Waschen mit TST wurde ein anti-α-LTX-Antiköφer (aus Kaninchen, Calbiochem-Novabiochem) bei einer Konzentration von 0,1 μg/ml und ein mit Peroxidase konjugierter und gegen IgG aus Kaninchen gerichteter Antiköφer (aus Ziege, Verdünnung: 1 :25 000) verwendet. Die Detektion der Antiköφer erfolgte in allen Experimenten mit ECL (Amersham-Pharmacia). Siehe auch Abbildung 9.
24. Calcium-Imaging
Die intrazelluläre freie Ca2+-Konzentration [Ca2+]j wurde in transient mit dem HO 10-R-EGFP- bzw. ß2-AR-EGFP-Konstrukt transfizierten COS-7- und HEK293- Zellen mit Hilfe der Calcium-Imaging-Methode gemessen (siehe auch Abb. 11). Je 2 x 105 COS-7- und HEK293-Zellen wurden auf ein mit 1 %iger Gelatine beschichtetes 42 mm großes Deckgläschen in 55 mm großen Gewebekulturschalen mit 5 ml DMEM-Medium (mit 10 % FCS und Pen / Strep) ausgebracht. Die Transfektion erfolgte mit Hilfe des nicht-liposomalen Transfektionsreagenzes FuGENE 6 (Röche Molecular Biochemicals, Mannheim). Dabei wurden 6 μl FuGENE 6 in 200 μl DMEM-Medium ohne FCS zunächst für 5 min bei RT und nach Zugabe von 4 μg Plasmid-DNA für weitere 15 min bei RT inkubiert, bevor der gesamte Transfektionsansatz tropfenweise zu den Zellen pipettiert wurde. Transfiziert wurden Konstrukte des HO 10-R ,full length' Klones mit einem im richtigen Leseraster fusionierten GFP-Tag und die komplette cDNA des ß - Adrenergen Rezeptors, die ebenfalls mit einem GFP-Tag am 3 '-Ende versehen worden war. Als Kontrolle dienten 4 μg Plasmid-DNA des reinen pEGFP-N3-
Expressionsvektors (Clontech, Heidelberg), sowie nicht-transfizierte Zellen, denen das Transfektionsreagenz FuGENE 6 ohne DNA zugesetzt wurde.
Die Beladung der Zellen mit 1 μM Fura-2 / Acetoxymethylester (Fura-2 / AM) (Sigma, Deisenhofen) erfolgte 48 h nach der Transfektion in einer Na+-HBS-Lösung
(150 mM NaCl; 5,4 mM KC1; 1,8 mM CaCl2; 0,8 mM MgSO4 7 H2O; 20 mM Glucose; 20 M Hepes in H2O, pH 7,3) für 30 min bei 37°C, 5 % CO2 und 95 % Luftfeuchtigkeit. Nach der Inkubation wurden die mit Fura-2 / AM beladenen Zellen in einem Inversmikrokop (Zeiss, Aciovert, Germany) und parallel hierzu in einem digitalen ,Imaging'-Fluoreszenzmikroskop (PTI) betrachtet und bei einer Wellenlänge von 440 bzw. 490 nm in transfizierte, sowie nicht transfizierte Zellen unterschieden. Durchschnittlich wurden je 5-7 transfizierte und nicht transfizierte Zellen durch das Setzen eines ROI (,region of interest') ausgewählt. Die Messung der Extinktion erfolgte bei 340 nm (Calcium-gebundenes Fura-2 / AM) und 380 nm (freies Fura-2 / AM), die der Emission bei 510 nm. Die Auswertung erfolgte mit der
Image Master l.x-Software durch Bildung des Quotienten von 340:510 nm, 380:510 nm und des Ratio von 340/380:510 nm (,background corrected i ages') als eine Funktion des zugefügten Agens.
Die Zugabe von Agentien erfolgte stets 6 min nach Beginn der Messung durch Abnahme eines entsprechenden Volumens Na+-HBS -Puffer und direktes Zupipettieren der Agentien in das Probengefäß für weitere 30 bis 50 min. Das Gesamtvolumen im Probengefaß betrug während des gesamten Versuches konstant 1,5 ml. Zu den das Fusionsprotein HO10-R-GFP exprimierenden COS-7-Zellen wurden zunächst 30 nM und 75 nM α-Latrotoxin (α-LTX, RBI. Natick, U.S.A.), zu den HO10-R- GFP exprimierenden HEK-293-Zellen wurden zur Ermittlung der Dosisabhängigkeit verschiedene Konzentrationen an α-LTX (7,5 nM; 25 nM; 50 nM, 75 nM, 90 nM und 120 nM), bzw. zur Ermittlung der optimalen Wirkkonzentration verschiedene Konzentrationen des zyklischen Depsipeptids BAY 44-4400 (100 ng/ml (89,3 nM), 333 ng / ml (297 nM); 400 ng / ml (357 nM),l μg/ml (893 nM), 10 μg/ml (8,9 μM) in 0,1 % DMSO) jeweils 6 min nach Versuchsbeginn zugesetzt. In einigen
Experimenten wurden die HEK-293 -Zellen für 90 min mit 4 bzw. 400 ng/ml BAY 44-4400, bzw. mit 4 bzw. 400 ng / ml des anthelmintisch inaktiven optischen Antipoden PF1022-001 in Na+-HBS bei 37°C, 5 % CO2 und 97 % Luftfeuchte vorinkubiert und die Zellen nach 60 min durch Zusetzen von 1 μM Fura-2/AM zur BAY 44-4400-Lösung, bzw. zum PF1022-001, während der restlichen 30 min beladen.
Nach dem Einbringen der Zellen in die Apparatur wurden auch hier 6 min nach Versuchsbeginn 75 nM α-LTX zugesetzt. An HEK-293-Zellen, die den ß2-Adrenergen Rezeptor mit C-terminalem GFP-Tag (ß2-R-GFP) exprimieren, wurde die optimale α-LTX-Konzentration von 75 nM ausgetestet. CdCl2 (je 1 μM und 10 μM) wurden in Na+-HBS, Nifedipin (15 μM) und EGTA (2 mM) in 0,1 % DMSO gelöst. Die
Zugabe von CdCl2 und Nifedipin erfolgte direkt zu Versuchsbeginn und vor α-LTX- Zugabe, EGTA wurde sowohl zu Versuchsbeginn, als auch 4 min nach α-LTX-Zu- gabe. Gelöstes α-LTX lag in einer Konzentration von 300 nM in 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, vor; BAY 44-4400 wurde zunächst in reinem DMSO (Stammlösungen zwischen 0,004-10 μg/ml) gelöst. Die Stammlösungen wurden in dem Na+-HBS-
Puffer auf die gewünschte Konzentration eingestellt. Die maximal lösbare Menge des Wirkstoffes BAY 44-4400 bei einer Endkonzentration von 0,1 % DMSO wurde durch Anlegen einer Verdünnungsreihe in Na+-HBS ermittelt. Weder 0,1 % DMSO noch eine andere Testkomponente interagierte bei den gewählten Konzentrationen mit Fura-2 / AM. Die Daten wurden mit Hilfe des Tabellenkalkulationsprogrammes Excel 98 ausgewertet. Die Ergebnisse resultieren aus wenigstens 2 - 4 reproduzierten Versuchen zu je 4-8 transfizierten und nicht-transfizierten Zellen.
Die intrazelluläre Calcium-Konzentration wurde nach Grynkiewicz et al. (1985) nach vorausgehende Kalbrierung gemäß McCormack et al. (1991) berechnet.
25. Bindung von PF1022A an HC110-R
Im Folgenden soll die Bindung von PF1022A und dem Moφholin-Derivat BAY44-
4400 an HO 10-R durch SDS-PAGE, Liganden-Präzipitation und analytische Durch- flußcytometrie gezeigt werden. Außerdem soll übeφriift werden, ob PF1022A und seine Derivate - ähnlich wie α-LTX - zu Veränderungen der [Ca2+]; in HO 10-R transfizierten HEK-293-Zellen führen oder aber das HO 10-R vermittelte α-LTX- 'Signalling' beeinflussen.
Gelegentlich zeigen Antiköφer oder Proteine, die in der Immunfluoreszenz deutliche Signale geben, keine Reaktion bei der Anwendung des Immunoblot- Verfahrens. Da zur Durchführung der SDS-PAGE eine Denaturierung der Proteine notwendig ist, kommt es gegebenenfalls zu einer Zerstörung konformationsabhängiger Epitope.
Antiköφer oder Proteine, die spezifisch solche Epitope erkennen, können deshalb nicht mehr binden. So kann auch weder mit dem biotinylierten Wirkstoff PF 1022 A, noch mit dem im Vergleich zum PF1022A besser löslichen Moφholin-Derivat BAY44-4400 eine HO 10-R spezifische Bindung im Western Blot ausgemacht werden. BAY44-4400 unterscheidet sich von PF1022A durch 2 Moφholin-Reste, die kovalent an die Phenylringe der beiden D-Phenyllactyl-Reste von PF1022A gebunden sind. Renaturiert man die Proteine im SDS-Trenngel jedoch mit Hilfe von Harnstoff, der durch Aufhebung hydrophober Wechselwirkungen eine partielle Entfernung des SDS bewirkt, so kann im Western Blot eine HO 10-R spezifische Bindung nachgewiesen werden. Hierzu wurde Gesamtprotein aus nicht transfizierten, aus HO lO-R-Myc/His transient exprimierenden HEK-293-Zellen sowie aus dem in E. coli exprimierten 54 kDa großen N- und dem 21 kDa großen C-Terminus von HC110-R durch SDS-PAGE aufgetrennt, renaturiert und wie gewohnt geblottet. Die Immx detektion erfolgte nach der Inkubation mit dem Liganden BAY44-4400, mit einem Kaninchen-anti-PF1022A-KLH-]_mmunserum und einem Ziege-anti-Kanin- chen IgG-HRP-Antiköφer. Ferner wurde ein partiell renaturiertes SDS-Polyacrylamidgel mit den Proteinfraktionen nicht transfizierter, HOlO-R-Myc/His transient transfizierter HEK-293 -Zellen sowie dem in E. coli exprimierten N-Terminus von HO 10-R und Gesamtprotein aus H. contortus geblottet, mit PF1022A-Biotin inkubiert und über Streptavidin-HRP detektiert. Beide Blots wiesen je eine distinkte . 116 kDa große Bande in den HOlO-R-Myc/His stabil exprimierenden HEK-293-
Zellen auf, wohingegen die Spuren mit nicht transfizierten Zellen keine Bande in dieser Höhe aufwiesen. Ferner banden sowohl das Moφholinderivat BAY44-4400, als auch das biotinylierte PF1022A an den 54 kDa großen N-Terminus von HO 10-R, der 21 kDa große C-Terminus zeigte keine spezifische PF1022A- Bindung. Durch das biotinylierte PF1022A konnten in der Gesamt-Proteinfraktion adulter H. contortus Nematoden insgesamt 2 Banden detektiert werden: Eine 110 kDa große Bande und eine weitere ca. 88 kDa große Bande. Bei letzterer handelt es sich höchstwahrscheinlich um ein biotinyliertes Protein, wie es bereits für den Nematoden Heterakis spumosa mit 83 kDa beschrieben wurde, zumal es im Gegen- satz zu der 110 kDa großen Bande selbst dann detektiert wird, wenn der Nachweis ausschließlich über Streptavidin-HRP erfolgt. HOlO-R-Myc/His stabil transfizierte HEK-293-Zellen weisen dagegen allein unter Streptavidin-HRP keine 116 kDa große Bande mehr auf. Des Weiteren konnte ausgeschlossen werden, dass der verwendete Ziege-anti-Kaninchen IgG-HRP-Sekx därantiköφer allein unspezifische Signale verursacht.
Um diese Ergebnisse weiter zu verifizieren, wurde folgende Liganden-Präzipitation durchgeführt. Je 2 mg und 4 mg magnetische Dynal M-280-Streptavidin-gekoppelte Beads wurden mit 500 μg biotinyliertem PF1022A versetzt. Einem Kontrollansatz mit 4 mg Dynal-Beads wurde TST-Puffer anstelle von PF1022A zugesetzt. Überschüssiges PF1022A-Biotin wurde durch magnetische Separation entfernt, bevor ein Gemisch aus den in E. coli exprimierten und zuvor über Affinitätschromatographie aufgereinigten HO 10-R N- und C-Terminus zugegeben wurde. Nach erneuter magnetischer Separation zur Abtrennung nicht gebundener HCllO-R-Fragmente wurde je ein Aliquot ausgehend von 2 mg und 4 mg Dynal-Beads über SDS-PAGE aufge- trennt und geblottet. Die Detektion des Präzipitates erfolgte über das N-terminal fusionierte His-Tag mit einem Maus-anti-His IgG- und einem Kaninchen-anti-Maus IgG-HRP- Antiköφer. Nur die N-terminale 54 kDa große Region von HO 10-R wird durch PF1022A präzipitiert, folglich wird der nicht an PF1022A gebundene C- Teπriinus von HO 10-R zuvor durch magnetische Separation entfernt. Unspezifische Bindungen des N- oder C-Terminus von HO 10-R an die Streptavidin-gekoppelten
Beads wurden ausgeschlossen, indem einem Reaktionsansatz kein biotinyliertes PF1022A zugesetzt wurde.
Die Bindung des Liganden PF1022A in vivo an HO 10-R wurde außerdem mit Hilfe der FACS- Analyse übeφriift (Abb. 13). Hierzu wurden in Dreifach- Ansätzen
HEK-293-Zellen transient mit HO10-R-GFP oder GFP-HO10-R transfiziert oder aber transient mit HO lO-R-Myc/His und GFP kotransfiziert. Zur Kontrolle wurden nicht transfizierte sowie transient mit dem ß -R-GFP oder dem Ml-R-GFP transfizierte HEK-293-Zellen eingesetzt. 24 h nach der Transfektion wurden die Zellen mit biotinyliertem PF1022A inkubiert und PF1022A-gebundene Zellen über Strep- tavidin-Phycoerythrin detektiert und abschließend fixiert. Eine Negativkontrolle HO 10-R-GFP transfizierter Zellen wurde ohne PF1022A-Biotin nur mit Strepta- vidin-Phycoerythrin inkubiert.
Die Fluoreszenzanalyse von je 10000 HEK-293 -Zellen erfolgte mit dem FACScan bei einer Anregungswellenlänge von 488 nm hinsichtlich ihrer Zellgröße, Granula- rität und Fluoreszenzfärbung. Phycoerythrin besitzt - wie auch TRITC - ein mit EGFP überlappendes Absoφtionsspektrum bei ausreichend getrennten Emissionsspektren, so daß beide Fluorochrome bei nur einer Wellenlänge angeregt werden können. Zelltrümmer wurden durch das Setzen eines 'Gate' auf die Haupt-Zellpopulation von der Messung der Fluoreszenzintensität ausgeschlossen. Zur quantitativen Auswertung wurden die Grenzen für negative, ungefärbte und positive, GFP-fluores- zierende Zellen anhand der nicht transfizierten und mit GFP transfizierten Zellen festgelegt. Die 4,6 % grünfluoreszierenden, nicht transfizierten HEK-293 -Zellen (Autofluoreszenz) wurden von den anderen GFP-fluoreszierenden Proben abgezogen; und der Wert für die unspezifische Färbung der Zellen durch das mit Phyco- erythrin gekoppelte Streptavidin (5,4 %) wurde von allen rotfluoreszierenden Zellen abgezogen (Tab. 1).
Tabelle 1: Nachweis der PF1022A-Bindung an HO 10-R transfizierte HEK-293- Zellen durch FACScan
Berechnet man den prozentualen Anteil der grünfluoreszierenden Zellen, die nach Abzug der Autofluoreszenz bzw. der unspezifischen Rotfärbung durch Streptavidin- Phycoerythrin auch rotfluoreszierend waren, so binden 41,2 % der HO10-R-GFP exprimierenden Zellen, 26,8 % der GFP-HO 10-R exprimierenden Zellen sowie 44,5 % der mit HO lO-R-Myc/His und GFP kotransfizierten Zellen PF1022A, dagegen binden nur 7,5 % der GFP exprimierenden Zellen, 9,9 % der ß2-R-GFP exprimierenden Zellen und 19,2 % der Ml-R-GFP exprimierenden Zellen PF 1022A (Abb. 13).
26. Wechselwirkungen von PF1022A-Derivaten mit HC110-R vermittelter α-LTX Signaltransduktion
PF1022A zeigt neuropharmakologische in vitro Aktivität zwischen 10"9-10"3 mg/ml je nach Nematodenart. Um eine mögliche Interferenz von PF1022A und seiner Derivate mit HO 10-R und dem durch HO 10-R vermittelten α-LTX-'Signalling' festzustellen, wurde mit Hilfe der Ca2+-Imaging-Methode der Einfluß von
BAY44-4400, einer besser löslichen Moφholin-Variante von PF1022A, auf HO 10-R transient oder stabil exprimierende HEK-293-Zellen untersucht. Zur Kontrolle wurde der in vitro wie in vivo mehr als lOOfach weniger wirksame optische Antipode zu PF1022A, PF1022-001, eingesetzt. BAY44-4400 und PF1022-001 wurden aufgrund ihrer Hydrophobizität zunächst in reinem DMSO gelöst. Die Stammkonzentration wurde dabei so gewählt, daß im Versuchsansatz stets nur 0,1 % DMSO gegenwärtig waren. Für DMSO-Konzenfrationen bis einschließlich 0,1 % konnte in KonfroUversuchen ausgeschlossen werden, daß sie in nicht transfizierten wie HO10-R-GFP transfizierten HEK-293-Zellen zu einer Beeinträchtigung der Versuchsergebnisse führten (Abb. 14A). Fura-2 beladene nicht transfizierte sowie mit HO 10-R-GFP transfizierte Zellen wurden zum einen mit 100, 300 oder 400 ng/ml sowie 1 oder 10 μg/ml BAY44-4400 und zum anderen mit den gleichen Konzentrationen PF 1022-001 stimuliert. Bei keiner Konzentration konnte über den gesamten Zeitraum von 50 min eine Ca -vermittelte Antwort festgestellt werden. Abb. 14B und C zeigen exemplarisch die Stimulation HO 10-R-GFP und Ml-R-GFP transfizierter Zellen mit 400 ng/ml BAY44-4400 und PF1022-001. Da die PF1022A- Derivate möglicherweise auch von den Zellen aufgenommen werden und damit sekundär in Signaltransduktionswege eingreifen können und weil die PF 1022 A-
Derivate je nach Parasit längere Zeit im Wurm verweilen, wurden die Zellen in einigen Versuchen für 90 min mit den Derivaten vorinkubiert. Zellen, die für 90 min mit 4 ng/ml oder 400 ng/ml BAY44-4400 oder PF1022-001 vorinkubiert wurden, zeigten keine Veränderung der [Ca2+]i (Abb. 14D). Bei direkter Zugabe von Konzentrationen ab 300 ng/ml BAY44-4400 konnte - im Gegensatz zu dem optischen Antipoden - eine leichte, aber innerhalb weniger Minuten reversible Zellschwellung als unmittelbare Wirkung auf das Anthelmintikum in HO10-R-GFP transfizierten HEK-293-Zellen auf einem Monitor, der die Zellen 40fach vergrößert darstellte, beobachtet werden.
Von Piperazin weiß man neuesten Versuchen zufolge, daß es die Wirkung von PF1022A/BAY44-4400 in in vitro- wie in vz'vo-Versuchen mit Heterakis spumosa synergistisch verstärkt. Bei gleichzeitiger Gabe von 400 ng/ml BAY44-4400 mit 1 oder 10 μM Piperazin (Abb. 14F) konnte weder in nicht transfizierten, noch in HO 10-R-GFP transient transfizierten HEK-293-Zellen eine Änderung der [Ca2+]j festgestellt werden. Der Kontrollansatz mit 10 μM Piperazin führte ebenfalls in nicht fransfizierten und HO 10-R-GFP transfizierten Zellen zu keiner Veränderung des Ca2+-Haushaltes (Abb. 14E).
Im Gegensatz dazu beeinflußten sowohl BAY44-4400, als auch der optische Antipode PF 1022-001, in Anwesenheit von 75 nM α-LTX die α-LTX-induzierte
Signaltransduktion von HO 10-R-GFP exprimierenden, HEK-293-Zellen, wenngleich auch in unterschiedlichem Ausmaß (Abb. 14B-E). In einem Kontrollexperiment, in dem man HO10-R-GFP oder Ml-R-GFP transfizierten Zellen 6 min vor der Stimulation mit 75 nM α-LTX 0,1 % DMSO zusetzte, konnte ausgeschlossen werden, daß das für BAY44-4400 und auch PF 1022-001 verwendete Lösungsmittel in dieser Konzentration einen Einfluß auf die durch α-LTX induzierte Veränderung der [Ca2+]i ausübte. HO10-R-GFP exprimierende Zellen zeigten im Gegensatz zu den Ml-R-GFP exprimierenden Zellen nach α-LTX-Zugabe den bereits geschilderten biphasischen Verlauf mit vergleichbaren Werten für [Ca2+]i (Abb. 15A). Inkubierte man HO10-R-GFP exprimierende Zellen 6 min vor der α-LTX-Zugabe mit 4 ng/ml BAY44-4400, so verringerte sich der beschriebene Einfluß des α-LTX auf die Ca2+-Konzentration: Der durch α-LTX induzierte erste kleine Anstieg der [Ca2+]j verschwand und der zweite verzögerte Peak wurde 14 min nach der α-LTX- Zugabe auf 44+6,0 nM Ca2+ reduziert (Abb. 15B). fri Anwesenheit von 4 ng/ml PF 1022-001 - die Zugabe erfolgte 6 min vor der Stimulation mit α-LTX - kam es zu einem schnellen sofortigen Anstieg von 103±11,5 nM Ca2+ (Abb. 15B). Wurde HO 10-R-GFP exprimierenden Zellen 6 min vor der α-LTX-Zugabe 400 ng/ml BAY44-4400 zugesetzt, kam es - ähnlich wie bei 4 ng/ml BAY44-4400 (Abb. 15B) -
94- zu einer verzögerten Erhöhung der [Ca ]; um 49+4,2 nM nach 23 min, die 8 min später auf ein verglichen mit den Ausgangswerten um 11+1,4 nM leicht erhöhtes
Plateau absank (Abb. 15C). Setzte man 400 ng/ml PFl 022-001 6 min vor der Inkubation mit 75 nM α-LTX zu, so kam es zu einer schnellen Ca2+-Erhöhung um 112±14,3 nM Ca2+ (Abb. 15C), wie sie bereits bei Zugabe von 4 ng/ml PF 1022-001 beobachtet werden konnte (Abb. 15B). In einem anderen Versuchsansatz wurden HO 10-R-GFP exprimierende HEK-293 -Zellen jeweils mit 4 ng/ml (Abb. 15D) oder
400 ng/ml BAY44-4400 bzw. PF1022-001 (Abb. 15E) für 90 min vorinkubiert. Nicht gebundener oder aufgenommener Wirkstoff wurde nach der Inkubation und Beladung der Zellen mit Fura-2/AM sorgfaltig weggewaschen, bevor die Zellen mit 75 nM α-LTX stimuliert wurden. Mit dem optischen Antipoden PF1022-001 vorinkubierte HO 10-R transfizierte Zellen zeigten bei 4 ng/ml PF1022-001 eine Erhöhung der [Ca2+]i um 102+6,4 nM (Abb. 15D) und bei 400 ng/ml eine vergleichbare Erhöhung um 109+8,4 nM Ca2+ (Abb. 15E). Dieser bereits wenige Minuten nach α-LTX-Zugabe beobachtete Ca2+- Anstieg glich den bereits in Abb. 15B und C beobachteten schnellen Veränderungen der [Ca ];, als PF1022-001 unmittelbar vor der Stimulation mit α-LTX zugegeben wurde. BAY44-4400 dagegen zeigte unter- schiedliche Antworten bezüglich des α-LTX induzierten Ca2+-Einstroms: Wurden
HO10-R-GFP exprimierende Zellen mit 4 ng/ml BAY44-4400 für 90 min vor- inkubiert, kam es durch α-LTX-Induktion zu einer maximalen Erhöhung der [Ca ], um 95±20,5 nM bei 10 min, bevor sie auf ein um 23+2,6 nM Ca2+ erhöhtes ausgedehntes Plateau absank (Abb. 15D). Bei Vorinkubation mit 400 ng/ml BAY44-4400 kam es nach α-LTX-Stimulation zu einer Ca2+-Erhöhung der [Ca2+]i um maximal
65±7,5 nM (Abb. 15D), die zudem noch 12 min verzögert gegenüber der Vorinkubation mit 4 ng/ml BAY44-4400 auftrat (Abb. 15C).
Setzte man stabil HO 10-R-Myc/His exprimierenden HEK-293-Zellen 6 min vor der α-LTX-Zugabe 400 ng/ml BAY44-4400 zu, so wird die beobachtete direkte Erhöhung der [Ca2+]i um 267+45,8 nM komplett inhibiert (Abb. 15F). Im Gegensatz dazu führt die Zugabe von 400 ng/ml PF 1022-001 mit einer Ca2+-Erhöhung um 209±33,4 nM Ca2+ zu keiner signifikanten Veränderung der [Ca2+]; (Abb. 15F).
Um den spezifischen Einfluß von BAY44-4400 auf das α-LTX vermittelte Ca2+-
'Signalling' in HO 10-R exprimierenden Zellen zu zeigen, wurden folgende Kontrollexperimente durchgeführt: Zunächst wurden nicht transfizierte HEK-293- Zellen mit 1 mM Carbamylcholin-Chlorid (Carbachol), einem Liganden für muscarinische Acetylcholin-Rezeptoren, unter An- und Abwesenheit von 400 ng/ml BAY44-4400 stimuliert (Abb. 15G). In beiden Fällen kam es zu einer vergleichbaren sofortigen Erhöhung der [Ca2+]i durch endogene, natürliche muscarinische Acetyl- cholin-Rezeptoren um 58+8,1 nM Ca2+ für HEK-293-Zellen bei Anwesenheit von BAY44-4400 und um 53+6,8 nM Ca2+ bei Abwesenheit des Anthelmintikums. Die zusätzliche fransiente Transfektion von HEK-293-Zellen mit dem C-terminal GFP- fusionierten, humanen muscarinischen Ml-Acetylcholin-Rezeptor (Ml-R-GFP) führte zu einer gegenüber nicht fransfizierten Zellen (Abb. 15G) leichten Erhöhung der [Ca2+]ι um 89+5,5 nM bei An- und um 85±6,1 nM Ca2+ bei Abwesenheit von 400 ng/ml BAY44-4400 (Abb. 15H). Auch konnte kein signifikanter Einfluß von BAY44-4400 auf den Ml-R-GPCR beobachtet werden. Stimulierte man in nicht fransfizierten HEK-293-Zellen die endogen vorhandenen natürlichen ß2-adrenergen Rezeptoren mit 1 mM Isoproterenol oder die nicotinischen Rezeptoren mit 1 mM
Arecolin - wie bereits für Carbachol beschrieben - unter An- und Abwesenheit von 400 ng/ml BAY44-4400, so kam es auch hier zu keinem signifikanten Unterschied der [Ca2+]ι (Abb. 151). Isoproterenol induzierte einen Anstieg der [Ca2+]j von 45+4,7 nM in An- und eine Zunahme von 48±5,7 nM Ca2+ in Abwesenheit von BAY44-4400. Infolge der Arecolin-Stimulation kommt es in Anwesenheit von
BAY44-4400 zu einer Erhöhung um 28±4,1 nM Ca2+, in Abwesenheit des Wirkstoffes um 27+3,5 nM Ca2+ (Abb. 151).
27. Gewinnung von Antikörpern
Zur Gewinnung von Antiköφern wurden weibliche NMRI-Mäusen sowie Kaninchen (Chinchilla-Bastarde) eingesetzt. Für die Immunisierung der NMRI-Mäuse wurden 3 x 15 μg des aufgereinigten 21 kD großen C-terminalen HO 10-R Proteinfragmentes in je 100 μl PBS" zusammen mit 100 μl FCA gelöst und an den Tagen 1, 8 und 15 zwei naiven NMRI-Mäusen subkutan gespritzt. Die Blutabnahme und Serumgewinnung erfolgte am Tag 23.
Zur Serumgewinnung wurde das durch Herzpunktion gewonnene Blut zunächst für
1 h bei 37°C und dann für mindestens 2 h bei 4°C inkubiert. Anschließend wurden die zellulären Bestandteile zweimal für 10 min bei 3000 φm und 4°C in der
Beckman GPKR-Zentrifuge pelletiert und der Überstand daraufhin für 45 min bei 56°C inaktiviert. Nach einer weiteren lOminütigen Zentrifugation bei 13000 φm und 4°C in der Heraeus Biofuge 15R konnte das Serum abgenommen und bis zum weiteren Gebrauch bei -20°C gelagert werden.
Zwei Kaninchen wurde nach der ersten Blutentnahme und Gewinnung des Präimmunserums zunächst 50 μg des C-terminalen 21 kD großen HO 10-R Proteins, sowie des 54 kD großen N-terminalen HO 10-R Proteins in einer zu gleichen Teilen aus PBS" und FCA bestehenden Suspension subkutan injiziert. Zwei weitere Immunisierungen mit je 100 μg Antigen erfolgten am Tag 31 und Tag 79 nach der ersten Immunisierung. Eine erste Blutentnahme wurde am Tag 43 durchgeführt. Eine zweite Blutentnahme und Serumgewinnung erfolgte am Tag 98 nach der ersten Immunisierung.
Beschreibung der Abbildungen
Abbildung 1: HC110-R mRNA und Protein
(A) Northern Blot Analyse unter Verwendung von Gesamt-RNA aus Haemonchus contortus und der 3,6 kbp cDNA von HO 10-R.
(B) 10% SDS-PAGE-Fluorogramm von in vitro .franslatiertem 35S-markierten HOlO-R-Protein. In v tro-Translation von 1 μg in vitro transkribierter HO 10-R mRNA (HO 10-R), Negativ-Kontrolle ohne HO 10-R mRNA (control), lμg Luciferase mRNA als Positiv-Kontrolle (luciferase).
Abbildung 2: Füll length cDNA-Sequenz von HC110-R und abgeleitete Aminosäuresequenz
Das Kozak-Motiv (Kozak, 1989) und das Polyadenylierungsignal von HO 10-R (GenBank Accession Nr.: AJ272270) sind unterstrichen; das Startkodon in Position
100 ist fett gedruckt. Signalpeptid (Reste 1-21, fett), Lektin-ähnliche Sequenz (Reste 22-125, gepunktet), Thr-Stretch (Reste 128-147, grau unterlegt); Cystein-reicher Bereich der Struktur CX9WX12CX9WXCX5WX9CX3W (Reste 166-221, geschwungene Linie, Cys- und Tφ-Reste zusätzlich fett); 4-Cys-Region der Struktur CXWWX6WX4CXnCXC (Reste 478-524, gestrichelt, Cys- und Tφ-Reste zusätzlich fett); die 7 Transmembranregionen (zwischen Resten 563-772, fett und unterstrichen); der Prolin-reiche Stretch (Reste 845-861, grau unterlegt), die PEST- Region (Reste 915-933, grau unterlegt); die N-Glykosylierungstelle (Reste 26, 499 und 862, fett); die hochkonservierte putative Disulfidbindung des Cys-Cys-Paares zwischen Sekretin GPCRs (Position 595 und 666, fett und doppelt unterstrichen). Abbildung 3: Alignment der abgeleiteten Aminosäuresequenzen des H. contortus HC110-R und Caenorhabditis elegans Cosmid-Klons B0457 (CE- B0457: GenBank Accession Nr.: Z54306
Signalpeptid (SP, Reste 1-21, fett), Lektin-ähnliche Sequenz (Lektin, Reste 22-125, gepunkted); Thr-Stretch (T-reich, Reste 128-147, grau .unterlegt); Cys-reiche Region der Struktur CX9WX12CX9WXCX5WX9CX3W (C-Signatur, Reste 166-221, geschwungene Linie, Cys- und Tφ-Reste zusätzlich fett); 4-Cys-Motiv der Struktur CXWWXeWX^XπCXC (4 C-Region, Reste 478-524, gestrichelt, Cys- und Tφ- Reste zusätzlich fett); die 7 Transmembranregionen (zwischen Resten 536-772, fett und unterstrichen); der Pro-reiche Stretch (P-reich, Reste 845-861, grau unterlegt); die PEST-Region (PEST, Reste 915-933, grau unterlegt); die N-Glykosylierungs- stellen (Reste 26, 499 und 862, fett); die hochkonservierte putative Disulfidbindung des Cys-Cys-Paares zwischen Sekretin GPCRs (Position 595 und 666, fett und doppelt unterstrichen). Identische Aminosäuren sind mit Sternchen markiert, sehr nahe miteinander verwandte Aminosäuren mit einem Doppelpunkt, verwandte Aminosäuren mit einem einzelnen Punkt.
Abbildung 4: Alignment des 7-Transmembranrezeptors HC110-R und mehrerer anderer Rezeptoren der Sekretin-Subfamilie
HO 10-R: Haemonchus contortus heptahehkaler Oφhan-Transmembranrezeptor (Accession Nr.: AJ272270); BTLAT3: Bos taurus Lafrophilin-3 (mehrere Splicing- Varianten, Accession Nr.: G4164053-G4164075); RNLAT1: Rattus norvegicus Latrophilin- 1 (Accession Nr.: U78105, U72487); MMEMR1: Mus musculus EMR1
Hormonrezeptor Vorläufer (Accession Nr.: Q61549); HSCD97: Homo sapiens Leukozyten Aktivierungsantigen CD97 (Accession Nr.: P48960); MMCADH: M. musculus Cadherin 7-Transmembranrezeptor- Vorläufer (Accesion Nr.: G3800738); XLXRFl: Xenopus laevis Corticotropin Releasing Rezeptor- Vorläufer (Accession Nr.: O42602); RNVIP1 : R. norvegicus vasoaktiver intestinaler Polypeptidrezeptor-
Vorläufer 2 (Accession Nr.: Q02643). Die sieben Transmembrandomänen sind grau unterlegt (I-VII) und die hochkonservierte putative Disulfidbindung ist fett dargestellt.
Abbildung 5: Alignment der abgeleiteten Aminosäuresequenzen des H. contortus HC 110-R und R. norvegicus Latrophilin-1 (GenBank Acc. Nr.
Ü78105, U72487)
Signalpeptid (SP, Reste 1-21, fett), Lektin-ähnliche Sequenz (Lektin, Reste 22-125, gepunkted); Thr-Stretch (T-reich, Reste 128-147, grau unterlegt); Cys-reiche Region . der Struktur CX9WX12CX9WXCX5WX9CX3W (C-Signatur, Reste 166-221, geschwungene Linie, Cys- und Tφ-Reste zusätzlich fett); 4-Cys-Motiv der Struktur CXW XβWXjCXnCXC (4 C-Region, Reste 478-524, gestrichelt, Cys- und Tφ- Reste zusätzlich fett); die 7 Transmembranregionen (zwischen Resten 536-772, fett und unterstrichen); der Pro-reiche Stretch (P-reich, Reste 845-861, grau unterlegt); die PEST-Region (PEST, Reste 915-933, grau unterlegt); die N-Glykosylierungs- stellen (Reste 26, 499 und 862, fett); die hochkonservierte putative Disulfidbindung des Cys-Cys-Paares zwischen Sekretin GPCRs (Position 595 und 666, fett und doppelt unterstrichen). Identische Aminosäuren sind mit Sternchen markiert, sehr nahe miteinander verwandte Aminosäuren mit einem Doppelpunkt, verwandte Aminosäuren mit einem einzelnen Punkt.
Abbildung 6: Struktur des HCllO-R-Proteins und des Latrophilin-1 der Ratte
( A) Hy drophobizitätsplot von HC 110-R mit der 7-Transmembrandomäne.
(B) Proteinstraktur von HO 10-R mit den folgenden charakteristischen Motiven: Signalsequenz (SP), Lektin-Domäne (lectin), Thr-Stretch (T-stretch),Cys- Motiv (signature), 4-Cys-Region (4C-region), 7-Transmembrandomäne (1-7, schwarz), das Pro-reiche Motiv (P-rich) und die PEST-Sequenz (PEST). Die putativen Glykosylierungsstellen sind unter dem Diagramm dargestellt (N), die Cys-Reste der 4C-Region und die beiden konservierten Cys-Reste der putativen Disulfidbindung ebenfalls (dünne Linie ohne Großbuchstaben).
(C) Proteinstruktur von Latrophilin- 1. Latrophilin- 1 hat ke nen Thr-Stretch, enthält aber ein zusätzliches Olfaktomedin-Bindungsmotiv (olfactomedin), eine Pro-Thr-Region (P-T-Region), eine Linker-Domäne (linker) und eine lange, mehrere Repeats enthaltende Region (long).
Abbildung 7: Expression von HC110-R-GFP in HEK-293 und COS-7-Zellen
(A) Gesamtprotein aus transient mit GFP (GFP) oder HO 10-R-GFP (HO 10-R) transfizierten sowie nicht transfizierten (n. t.) HEK-293- und COS-7-Zellen wurde 24 h nach der Transfektion über die Trizol-Methode isoliert.
(B) Gesamtprotein aus transient mit ß2-R-GFP (ß2-R) oder Ml-R-GFP (Ml-R) transfizierten sowie nicht transfizierten (n. t.) HEK-293 -Zellen wurde 24 h nach der Transfektion über die Trizol-Methode isoliert. SDS-Marker-Banden bei 116, 90, 70 und 55 kDa (Marker).
Je 20 μg Gesamtprotein pro Spur wurden über ein 10 %iges SDS-Polyacrylamidgel aufgetrennt und auf eine Nitrocellulosemembran geblottet. Nach dem Blocken in RotiBlock-Lösung über Nacht erfolgte die Immundetektion mit dem monoklonalen Maus-anti-GFP IgG-Primär- (0,4 μg/ml) und dem monoklonalen Kaninchen-antiMaus IgG-HRP-Sekundärantiköφer (1:25000) durch das ECL-System. Abbildung 8: Zelluläre Lokalisation von HC110-R und ß2-R in transfizierten COS-7-Zellen durch CLSM
COS-7-Zellen wurden mit HO 10-R-GFP und ß2-R-GFP transfiziert, die beide einen C-terminalen GFP-Tag tragen. Die CSLM wurde 24 Stunden nach der Transfektion durchgeführt. Der Balken entspricht 10 μm.
(A) HO 10-R-GFP wird an der Plasmamembran und in cytoplasmischen Kompartimenten exprimiert. In der Nähe des Nukleus kann eine Verdichtung von cytoplasmischen Vesikeln beobachtet werden.
(B) CSLM-Kolokalisation des grünen HOlO-R-GFP-Proteins mit sauren Lysosomen, gefärbt mit LysoTracker Red DND-99 bei 37°C für lh.
(C) ß2-R-GFP transfizierte Zellen zeigen ein ähnliches GFP-Fluoreszenzmuster wie HO 10-R-GFP, bzw. wie unter Punkt (A) beschrieben. Der Rezeptor kann an der Plasmamembran und in Vesikeln lokalisiert werden und kann teilweise mit sauren Lysosomen, gefärbt mit LysoTracker Red DND-99 bei 37°C für lh, kolokalisiert werden.
(D) Exprimierter ß -R-GFP kolokalisiert teilweise mit dem endoplasmatischen Retikulum, gefärbt mit monoklonalen anti-KDEL-Antiköφern.
Abbildung 9: Bindung von α-Latrotoxin an HO 10-R
(A) 5 μg Gesamtprotein isolierter Latrodectus revivensis Giftdrüsen (1) sowie reines 130 kDa großes α-LTX (2), ferner je 40 μg Gesamtprotein stabil mit dem HO lO-R-Myc/His-Konstrukt in dem pIRESlneo- Vektor transfizierter HEK-293-Zellen (3), nicht transfizierter Zellen (4) und des in E. coli in- duzierten 54 kDa großen N-Terminus (6) und 21 kDa großen C-Terminus (7) von HO 10-R wurden in einem 10 %igen SDS-Polyacrylamidgel aufgetrennt, geblottet und über Nacht geblockt. Die denaturierten Proteine wurden für 2 h mit 20 nM α-LTX inkubiert und mögliche Bindungen von α-LTX mit einem Kaninchen-anti-α-LTX IgG- (1:5000), einem Ziege-anti-Kaninchen IgG- HRP-Antiköφer (1:25000) und dem ECL-System detektiert.
(B) Je 40 μg Gesamtprotein des in E. coli induzierten C- (1) und N-Terminus (2) von HO 10-R sowie nicht transfizierter (3) und stabil mit HO 10-R-Myc His transfizierter HEK-293 -Zellen (4) und adulter H. contortus Nematoden (5) wurde in einem 10 %igen SDS-Polyacrylamidgel aufgetrennt und mit einem 4 M Harnstoff-haltigem Renaturienmgspuffer partiell renaturiert. Der Blot wurde über Nacht geblockt, mit 20 nM reinem α-LTX inkubiert und α-LTX bindende Proteine mit einem Kaninchen-anti-α-LTX IgG-Antiköφer (1:5000), Biotin-Protein A (1:100), Streptavidin-Peroxidase (1:3000) und dem ECL-System nachgewiesen.
Abbildung 10: Dosisabhängigkeit von α-LTX auf das HCllO-R-vermittelte Ca2+-Signalling
HEK-293-Zellen wurden 48 h nach der transienten Transfektion mit HO10-R-GFP für 30 min mit 1 μM Fura-2/AM beladen. Die Stimulation der Zellen erfolgte 6 min nach Beginn der Messung mit unterschiedlichen α-LTX-Konzenfrationen für weitere 44 min. Gemessen wurde der Quotient aus 340/380 nm (Ratio) in Abhängigkeit von der Zeit, n gibt die Anzahl der ausgewählten Zellen an.
(A) HO 10-R-GFP exprimierende Zellen wurden mit 7,5 nM (schwarze Linie) oder 25 nM α-LTX (graue Linie) stimuliert.
(B) HO10-R-GFP exprimierenden Zellen wurde 50 nM (graue Linie) oder 75 nM α-LTX (schwarze Linie) zugesetzt. (C) HO10-R-GFP exprimierende Zellen wurden mit 90 nM (graue Linie) oder 120 nM α-LTX (schwarze Linie) stimuliert.
(D) Auf der Abszisse ist die [Ca2+]j in nM, auf der Ordinate sind die zur Stimulation von HO 10-R-GFP exprimierenden HEK-293-Zellen eingesetzten α-LTX-Konzentrationen (0, 7,5, 25, 50, 75, 90 und 120 nM) für den ersten schnellen Peak (1. Peak, graue Linie) und den zweiten verzögerten Peak (2. Peak, schwarze Linie) aufgetragen.
Abbildung 11: Ca _2+ -Imaging von HC110-R transfizierten HEK 293-Zellen
(A) C-terminal mit GFP getaggtes HO 10-R (HO 10-R-GFP): schwarze Linie. N-terminal mit GFP getaggtes HO 10-R (GFP-HO 10-R): graue Linie.
(B) 75 nM α-LTX mit nicht-transfizierten HEK-293 -Zellen (n. t., schwarze Linie) und GFP-fransfizierten Zellen (GFP, graue Linie).
(C) 75 nM α-LTX mit Zellen, die mit C-terminal getaggtem humanen Ml muskarinischen Acetylcholinrezeptor (Ml-R-GFP, graue Linie) und mit C-terminal getaggtem ß2-adrenergem Acetylcholinrezeptor aus der Maus (ß2-
R-GFP, schwarze Linie) transfiziert wurden.
(D) HO10-R-GFP transfizierte Zellen wurden 6 Minuten vor α-LTX-Zugabe (75 nM) mit 2 mM EGTA behandelt (+EGTA, graue Linie). In der Kontrolle wurde EGTA weggelassen (-EGTA, schwarze Linie).
(E) 2mM EGTA wurden 10 min nach α-LTX-Zugabe (75 nM) zugesetzt (+EGTA, graue Linie). Dem Kontrollansatz wurde kein EGTA zugesetzt (-EGTA, schwarze Linie). (F) Zur Kontrolle wurden nicht transfizierte (n. t, graue Linie) und HO10-R- GFP exprimierende Zellen (schwarze Linie) über 30 Minuten mit 2 nM EGTA verstetzt.
Abbildung 12: Störung der durch α-LTX bedingten Signalfibertragung durch
BAY44-4400
HEK-293 -Zellen wurden transient mit GFP-getaggtem HOlO-R-Protein fransfiziert und 48 h nach der Transfektion stimuliert (Pfeile). Ca2+-Imaging wurde für 50 Mi- nuten (Abb. A-D) durchgeführt, Kontrollexperimente mit verschiedenen endogenen natürlichen Rezeptoren nicht-fransfizierter HEK-293-Zellen für 20 Minuten, n = Anzahl der Zellen.
(A) Zugabe von 400 ng/ml BAY44-4400 (schwarze Linie) oder von PF 1022-001 (graue Linie) zu den Zellen. Zur Kontrolle wurden die Zellen nach der
Zugabe von BAY44-4400 oder PF1022-001 mit Na+-HBS-HEPES-Puffer
(HBS) behandelt, der auch als Lösungsmittel für die jeweiligen Substanzen diente.
(B) Durch α-LTX (75 nM) bedingte Signalübertragung in Gegenwart von 4 ng/ml
BAY44-4400 (schwarze Linie) und PF1022-001 (graue Linie).
(C) Durch α-LTX bedingte Signalüberfragung in Zellen, die für 90 Minuten mit 4 ng/ml BAY44-4400 (schwarze Linie) oder PF 1022-001 (graue Linie) vor- inkubiert wurden. Die Substanzen wurden vor der Zugabe von α-LTX wieder entfernt.
(D) Durch α-LTX bedingte Signalübertragung in HO10-R-GFP fransfizierten Zellen, die für 90 Minuten mit 400 ng/ml BAY44-4400 (schwarze Linie) oder PF 1022-001 (graue Linie) vorinkubiert wurden. Die Substanzen wurden vor der Zugabe von α-LTX wieder entfernt. (E) Nicht-transfizierte HEK-293 -Zellen wurden mit 1 mM Carbamylcholine- chlorid (Carbachol) für 100 s in An- (400 ng/ml BAY44-4400, schwarze Linie) oder Abwesenheit von 400 ng/ml BAY44-4400 (graue Linie, -BAY44-4400) stimuliert.
(F) Nicht-transfizierte HEK-293-Zellen wurden mit 1 mM Isoproterenol und mit 1 mM Arecolin für jeweils 100 s in An- (400 mg/ml BAY 44-4400, scharze Linie) oder Abwesenheit von 400 ng/ml BAY44-4400 (-BAY44-4400, graue Linie) stimuliert.
Abb. 13: Nachweis der PF1022A-Bindung an HC110-R transfizierte HEK-293- Zellen durch FACScan
Je 5 x 105 nicht transfizierte, transient mit GFP, HO 10-R-GFP, GFP-HO10-R, ß2-
R-GFP und Ml-R-GFP transfizierte sowie transient mit HO 10-R-Myc/His und GFP kotransfizierte HEK-293-Zellen wurden 24 h nach der Transfektion mit 0,5 μg/ml PF1022A-Biotin und Streptavidin-Phycoerythrin (1:300) inkubiert und anschließend fixiert. Als Negativkontrolle wurden HO 10-R-GFP transfizierte Zellen ohne PF1022A-Biotin nur mit Streptavidin-Phycoerythrin inkubiert. Nach Abzug der
Autofluoreszenz, d. h. der 4,6 % nicht transfizierten Zellen (n. t.) im Grünkanal von allen grün-fluoreszierenden Zellen und der durch Streptavidin-Phycoerythrin bedingten 4,4 % unspezifischen Färbung im Rotkanal wurde der prozentuale Anteil der GFP-fluoreszierenden Zellen (GFP, HO 10-R-GFP, GFP-HO 10-R, ß2-R-GFP, Ml-R-GFP und HO 10-R-Myc/His + GFP) ermittelt, die PF1022A gebunden haben
(PF1022A-Bindung in %). Die Standardabweichung ergibt sich durch die Bestimmung der Mittelwerte von Dreifach- Ansätzen. Abb. 14: Einfluß von BAY44-4400 und dem optischen Antipoden PF1022-001 auf das HO 10-R vermittelte Ca2+-'SignaIIing'
Die Beladxmg der Zellen mit 1 μM Fura-2/AM erfolgte in nicht transfizierten HEK- 293-Zellen sowie 48 h nach der transienten Transfektion mit HO10-R-GFP oder
Ml-R-GFP. Gemessen wurde der Quotient aus 340/380 nm (Ratio) in Abhängigkeit von der Zeit, n gibt die Anzahl der ausgewählten Zellen an.
(A) Nicht fransfizierte (n. t, graue Linie) und HO10-R-GFP fransfizierte (HC 110-R-GFP, schwarze Linie) Zellen wurden zur Kontrolle nach 6 min mit
0,1 % des Lösungsmittels DMSO in Na+-HBS-Puffer versetzt.
(B) HO10-R-GFP (schwarze Linie) und Ml-R-GFP (graue Linie) fransfizierte Zellen wurden nach 6 min mit 400 ng/ml BAY44-4400 stimuliert.
(C) Wie (B), HO10-R-GFP (schwarze Linie) und Ml-R-GFP (graue Linie) transfizierte Zellen wurden nach 6 min mit 400 ng/ml PF 1022-001 stimuliert.
(D) HO 10-R-GFP exprimierende Zellen wurden für 90 min mit 400 ng/ml BAY44-4400 (schwarze Linie) oder PF 1022-001 (graue Linie) vorinkubiert und nicht gebundene Substanzen vor der Messung weggewaschen.
(E) Nicht fransfizierten (n. t., graue Linie) und HC110-R-GFP exprimierenden Zellen (HO10-R-GFP, schwarze Linie) wurde nach 6 min 10 μM Piperazin zugesetzt.
(F) Wie (E), nur wurde nicht transfizierten (n. t, graue Linie) und HO 10-R-GFP exprimierenden Zellen (HO10-R-GFP, schwarze Linie) nach 6 min ein Gemisch aus 10 μM Piperazin und 400 ng/ml BAY44-4400 verabreicht. Abb. 15: Wechselwirkungen des HC110-R vermittelten α-LTX Signalling durch PF1022A-Derivate
Die Beladung der Zellen mit 1 μM Fura-2/AM erfolgte in nicht fransfizierten HEK- 293 -Zellen sowie 48 h nach der transienten Transfektion mit HO10-R-GFP oder Ml-R-GFP. Die eingesetzte α-LTX-Menge betrug stets 75 nM. Für die Versuche mit den Kontrollsubstanzen wurden die Zellen mit einer Fließgeschwindigkeit von 1,6 ml Na+-HBS/min umspült. Gemessen wurde der Quotient aus 340/380 nm (Ratio) in Abhängigkeit von der Zeit, n gibt die Anzahl der ausgewählten Zellen an.
(A) HO10-R-GFP (schwarze Linie) und Ml-R-GFP (graue Linie) exprimierende Zellen wurden 6 min vor der α-LTX-Stimulation mit 0,1 % DMSO versetzt, um auszuschließen, daß DMSO Einfluß auf α-LTX induzierte Veränderungen der [Ca2+]j nimmt.
(B) HO 10-R-GFP fransfizierte Zellen wurden 6 min vor der α-LTX Zugabe mit 4 ng/ml BAY44-4400 (schwarze Linie) oder PF 1022-001 (graue Linie) versetzt.
(C) Wie (B), nur wurde HO10-R-GFP exprimierenden Zellen 6 min vor der
Stimulation mit α-LTX 400 ng/ml BAY44-4400 (schwarze Linie) oder PF 1022-001 (graue Linie) zugegeben.
(D) HO 10-R-GFP transfizierte Zellen wurden für 90 min mit 4 ng/ml BAY44-4400 (schwarze Linie) oder PF 1022-001 (graue Linie) vorinkubiert und nicht gebundene Substanzen vor der Messung entfernt. Die Stimulation der Zellen erfolgte nach 6 min mit α-LTX.
(E) Wie (D), nur wurden HO 10-R-GFP transfizierte Zellen für 90 min mit 400 ng/ml BAY44-4400 (schwarze Linie) oder PF1022-001 (graue Linie) vorinkubiert, nicht gebundene Substanzen vor der Messung entfernt und die Zellen nach 6 min mit α-LTX stimuliert.
(F) HO 10-R-Myc/His stabil exprimierende Zellen wurden 6 min vor der Zugabe von α-LTX mit 400 ng/ml BAY44-4400 (schwarze Linie) oder PF1022-001 (graue Linie) versetzt.
(G) Zur Kontrolle wurde nicht transfizierten Zellen in An- (400 ng/ml BAY44-4400, schwarze Linie) oder Abwesenheit (-BAY44-4400, graue Linie) von 400 ng/ml BAY44-4400 nach 6 min 1 mM Carbamylcholin- Chlorid (Carbachol) für 100 s zugesetzt und wieder mit Na+-HBS ausgewaschen.
(H) Wie (G), nur wurden Ml-R-GFP transfizierte Zellen in An- (400 ng/ml BAY44-4400, schwarze Linie) oder Abwesenheit (-BAY44-4400, graue Linie) von 400 ng/ml BAY44-4400 nach 6 min mit 1 mM Carbachol für
100 s stimuliert und wieder mit Na+-HBS ausgewaschen.
(I) Zur Kontrolle wurden nicht fransfizierte Zellen in An- (400 ng/ml BAY44-4400, schwarze Linie) oder Abwesenheit (-BAY44-4400, graue Linie) von 400 ng/ml BAY44-4400 nach 3 min für 100 s mit 1 mM Isoproterenol und nach 12 min für 100 s mit 1 mM Arecolin stimuliert. Die Substanzen wurden nach den 100 s wieder mit Na+-HBS ausgewaschen.
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Original (für EINREICHUNG ) - gedruckt am 20.08.2001 11 :03:45 AM -1 Formular - PCT/RO/134 (EASY) Angaben zu einem hinterlegten Mikroorganismus und/oder anderem hinterlegten biologischen Material -1-1 erstellt durch Benutzung von PCT-EASY Version .2 . 92 (aktualisiert 01 . 03 .2001) -2 Internationales Aktenzeichen.
-3 Aktenzeichen des Anmelders oder LEA34240- O Anwalts
Die nachstehenden Angaben betreffen den Mikroorganismus und/oder anderes biologisches Material, der/das in der Beschreibung genannt ist -1 Seite 25 -2 Zeile 27 -3 Angaben betr. Hinterlegung -3-1 Name der Hinterlegungsstelle DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH -3-2 Anschrift der Hinterlegungsstelle Mascheroder Weg lb, D-38124 Braunschweig, Germany -3-3 Datum der Hinterlegung 25 Mai 2000 (25 . 05 .2000) -3-4 Eingangsnummer DSMZ ACC2465 -4 Weitere Angaben KEINE -5 Bestimmungsstaaten, für die alle Bestimmungs Staaten besondere Angaben gemacht werden -6 Gesondert eingereichte Angaben KEINE
Diese Angaben werden dem Internationalen Büro später übermittelt
Die nachstehenden Angaben betreffen den Mikroorganismus und/oder anderes biologisches Material, der/das in der Beschreibung genannt ist -1 Seite 25 -2 Zeile 14 -3 Angaben betr. Hinterlegung -3-1 Name der Hinterlegungsstelle DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH -3-2 Anschrift der Hinterlegungsstelle Mascheroder Weg lb , D-38124 Braunschweig , Germany -3-3 Datum der Hinterlegung 25 Mai 2000 (25 . 05 .2000) -3-4 Eingangsnummer DSMZ ACC2464 -4 Weitere Angaben KEINE -5 Bestimmungsstaaten, für die alle Bestimmungs Staaten besondere Angaben gemacht werden Original (für EINREICHUNG ) - gedruckt am 20.08.2001 11 :03:45 AM -6 Gesondert eingereichte Angaben KEINE
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VOM ANMELDEAMT AUSZUFÜLLEN -4 Dieses Formular ist mit der internationalen Anmeldung eingegangen
(ja oder nein) 3 ? -4-1 Bevollmächtigter Bediensteter
N. MAILLIARD
VOM INTERNATIONALEN BÜRO AUSZUFÜLLEN -5 Dieses Formular ist an folgendem Datum beim internationalen Büro eingegangen -5-1 Bevollmächtigter Bediensteter

Claims

Patentansprüche
1. Verwendung von Calcium-Kanal-Transmembranrezeptoren aus Helminthen zum Identifizieren von anthelminthisch wirksamen Substanzen.
2. Verwendung von Calcium-Kanal-Transmembranrezeptoren aus Arthropoden zum Identifizieren von arthropodizid wirksamen Substanzen.
3. Verwendung von Transmembranrezeptoren gemäß Anspruch 1 oder 2, da- durch gekennzeichnet, dass es sich um G-Protein gekoppelte Transmembranrezeptoren mit sieben Transmembran-Domänen handelt.
4. Verwendung von Transmembranrezeptoren gemäß einem der Ansprüche 1 bis
3, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um Transmembranrezeptoren der Sekretin-Subfamilie handelt.
5. Verwendung von Transmembranrezeptoren gemäß einem der Ansprüche 1, 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um Transmembranrezeptoren aus Nematoden handelt.
6. Verwendung von Transmembranrezeptoren gemäß einem der Ansprüche 2 bis
4, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um Transmembranrezeptoren aus Akarina handelt.
7. Verwendung von Transmembranrezeptoren gemäß einem der Ansprüche 1 und 3 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um den Transmembranrezeptor HO 10-R aus Haemonchus contortus handelt.
8. Verwendung von Transmembranrezeptoren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass sie zum Transmembranrezeptor HO 10-R homolog sind.
. Verwendung von Transmembranrezeptoren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8 zum Identifizieren von Calcium-Kanal-B lockern.
10. Verwendung von Transmembranrezeptoren gemäß einem der Ansprüche 1 bis
8 zum Identifizieren von Calcium-Kanal-Blockern, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um alpha-Latrotoxin bindende Transmembranrezeptoren handelt.
11. Verwendung von alpha-Latrotoxin als Agonist von Transmembranrezeptoren gemäß einem der Ansprüche 1, 3 bis 5 und 7.
12. Verwendung von alpha-Latrotoxin als Nematizid.
13. Verwendung von alpha-Latrotoxin in Verfahren zum Identifizieren von nematizid und/oder arthropodizid wirksamen Verbindungen.
14. Verfahren zur Gewinnung des HO 10-R Rezeptors sowie dazu homologer Proteine umfassend die Expression des Polypeptids oder Fragmenten davon in einem prokaryontischen oder eukaryontischen Expressionssystem.
15. Verfahren gemäß Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um ein eukaryontisches Expressionssystem handelt.
16. Verfahren gemäß Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass zur Expression HEK 293- oder COS7-Zellen verwendet werden.
17. Wirtszellen, die eine transiente Expression des Rezeptors HO 10-R sowie dazu homologer Proteine ermöglichen.
18. Wirtszellen, die eine stabile Expression des Rezeptors HO 10-R sowie dazu homologer Proteine ermöglichen.
19. Wirtszellen gemäß Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass sie Aequorin exprimieren.
20. Wirtszellen gemäß Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um die stabil transformierte Zelllinie der Hinterlegungsnummer DSM ACC2464 handelt.
21. Wirtszellen gemäß Anspruch 18 oder 19, dadurch gekennzeichnet, dass es - sich um die stabil transformierte Zelllinie der Hinterlegungsnummer DSM
ACC2465 handelt.
22. Vektoren zur stabilen Transformation von Wirtszellen gemäß einem der Ansprüche 18 bis 21 und zur transienten Transformation von Wirtszellen gemäß Anspruch 17.
23. Vektoren zur stabilen Transformation von Wirtszellen gemäß Anspruch 18 oder 20, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um den Vektor pMycόxHis handelt.
24. Verfahren zum Identifizieren von Agonisten und/oder Antagonisten von Calcium-Kanal-Transmembranrezeptoren aus Helminthen und/oder Arthropoden, umfassend die folgenden Schritte:
a) Inkontaktbringen einer Wirtszelle gemäß einem der Ansprüche 17 bis
21 oder von Membranen derselben mit einer chemischen Verbindung oder einem Gemisch von chemischen Verbindungen unter Bedingungen, die die Interaktion einer chemischen Verbindung mit dem Polypeptid erlauben, und b) Bestimmen der chemischen Verbindung, die spezifisch an das Polypeptid bindet.
25. Verfahren zum Auffinden von Verbindungen, welche die Expression von Calcium-Kanal-Transmembranrezeptoren aus Helminthen oder Arthropoden verändern, umfassend die folgenden Schritte: ,
a) Inkontaktbringen einer Wirtszelle gemäß einem der Ansprüche 17 bis 21 mit einer chemischen Verbindung oder einem Gemisch von chemischen Verbindungen,
b) Bestimmen der Calcium-Kanal-Transmembranrezeptor-Konzentration, und
c) Bestimmen der Verbindung, welche die Expression des Polypeptids spezifisch beeinflusst.
26. Verfahren gemäß Anspruch 24 oder 25, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um G-Protein gekoppelte Transmembranrezeptoren der Sekretin-Subfamilie oder Fragmente davon handelt.
27. Verfahren gemäß Anspruch 24 oder 25, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um den Transmembranrezeptor HO 10-R oder Fragmente davon sowie dazu homologer Proteine handelt.
28. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 24, 26 und 27, dadurch gekennzeichnet, dass man die Testsubstanz unter solchen Bedingungen mit dem Transmembranrezeptor in Kontakt bringt, die eine Interaktion der Rezeptormoleküle mit der Testsubstanz gestatten, und dann a) die erfolgte Bindung der Testsubstanz detektiert, und b) die Aktivität des Rezeptormoleküls bei Anwesenheit der Testsubstanz mit dessen Aktivität bei Abwesenheit einer Testsubstanz vergleicht.
29. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 24 bis 28, dadurch gekennzeichnet, dass man ein auf Zellen basierendes Testsystem verwendet.
30. Verfahren gemäß Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, dass man Zellen gemäß einem der Ansprüche 17 bis 21 verwendet.
31. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 24 und 26 bis 28, dadurch gekennzeichnet, dass man ein zellfreies Testsystem verwendet.
32. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 24 und 26 bis 31, dadurch gekenn- zeichnet,, dass die Interaktion einer Testsubstanz mit dem Transmembranrezeptor durch die Verdrängung von daran gebundenem alpha-Latrotoxin detektiert wird.
33. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 24 und 26 bis 31, dadurch gekenn- zeichnet, dass die Interaktion einer Testsubstanz mit dem Transmembranrezeptor durch die Verdrängung von daran gebundenem Nifedipm detektiert wird.
34. Verwendung von Nifedipin in einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 24 und 26 bis 31.
35. Substanzen, die in einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 24 bis 34 identifiziert werden.
36. Verwendung von Substanzen gemäß Anspruch 35 zur Herstellung eines
Mittels zur Bekämpfimg von Helminthen und/oder Arthropoden.
37. Verwendung von Modulatoren des Rezeptors HO 10-R sowie dazu homologer Proteine als Anthelminthika und oder Arthropodizide.
38. Verwendung der für den Rezeptor HO 10-R kodierenden DNA sowie dazu homologer DNA zur Herstellung transgener Invertebraten.
39. Transgene Invertebraten, die den Rezeptor HO 10-R oder dazu homologe Proteine enthalten.
40. Transgene Invertebraten gemäß Anspruch 39, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um Drosophila melanogaster und Caenorhabditis elegans handelt.
41. Verwendung von DNA-Oligonukleotiden, die spezifisch an die für den Rezeptor HO 10-R kodierende DNA hybridisieren, zur Detektion von DNA, die aus Helminthen stammt.
42. Verfahren zur Detektion von DNA aus Helminthen, dadurch gekennzeichnet, dass man
a) DNA-Oligonukleotide zur Verfügung stellt, die an die für den
Rezeptor HO 10-R kodierende DNA oder dazu komplementäre
Stränge hybridisieren oder an die 5'- oder 3'- flankierenden Regionen derselben, b) die DNA-Oligonukleotide mit einer DNA enthaltenden Probe in
Kontakt bringt, c) die Hybridisierung des DNA-Oligonukleotids detektiert, d) die detektierte Sequenz sequenziert, und e) die Sequenz mit der für den Rezeptor HO 10-R kodierenden DNA- Sequenz vergleicht.
43. Diagnostischer Testkit umfassend eine für den Rezeptor HO 10-R kodierende DNA-Sequenz oder Fragment davon oder dazu homologe DNA-Sequenzen.
44. Diagnostischer Testkit gemäß Anspruch 43, dadurch gekennzeichnet, dass die DNA-Sequenzen mit einem detektierbaren Marker versehen sind.
45. Verwendung des Rezeptors HO 10-R oder Fragmenten davon sowie dazu homologer Proteine zur Herstellung von Vakzinen.
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