CN102666574A - 具有增加的钙亲和性及增强的生物发光的修饰的发光蛋白及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了具有增强的钙亲和性以及增强的生物发光的修饰的发光蛋白,例如修饰的Clytin,以及其在报告基因系统和基于细胞的测定中作为钙指示剂的应用。
Description
相关申请
本申请要求2009年9月17日提交的临时专利申请61/276,875号及2009年7月14日提交的临时专利申请61/270,826号的优先权,每个临时申请的完整内容以其全文引入本文。
发明领域
本发明提供了具有增加的钙亲和性以及增强的生物发光的修饰的发光蛋白(photoprotein),例如修饰的Clytin,生物发光本发明还提供了这些蛋白质在报告基因系统和基于细胞的测定中作为钙指示剂的应用。
发明背景
迄今为止已经从生物体分离了一些据报道在与Ca2+反应时发光的发光蛋白,包括水母素(Aequorin)、Halistaurin、Obelin、Mnemiospin、Clytin和Berovin。通常地,所有前述发光蛋白的大小均相对较小,且被认为含有共同的有机底物(腔肠素(coelenterazine)及以复合物形式结合的分子氧。
水母素是最广泛研究的Ca2+激活的发光蛋白,分离自水螅虫Aequoreavictoria.。在水母素的情况中,Ca2+的结合导致蛋白质构象变化,使所述蛋白质转变为酶,催化腔肠素被氧氧化,并发光(即λmax=470nm)。水母素已经用于检测特别是由G蛋白结合的受体(GPCR)介导的细胞中钙流动(calcium flux),如Stables et al.(Anal.Biochem.,252:115-126(1997))所述。此外,水母素介导的发光钙测定已经用于GPCR高通量筛选,如Ungrin et al.(Anal.Biochem.,272:34-42(1999))所述。此外,表达水母素的细胞也已经用于药物筛选测定,如美国专利No.6,872,538所述。
尽管钙激活的发光蛋白如水母素用于检测例如由GPCR刺激的钙流动以及用于药物筛选,但是相对于由受体诱导的钙的细胞质浓度(例如0.1μM至0.2μM范围),水母素对于钙的亲和性仍很低(即仅大约7μM)。此外,线粒体靶向的水母素在GPCR刺激后看起来产生更好的信号,钙亲和性受线粒体钙积累的异质性影响,水母素通常在线粒体中相对于细胞质较低量表达。
相似地,其它钙激活的发光蛋白如Obelin和Clytin也已经被报道具有较低的钙亲和性和/或低水平的光发射。见例如Inouye and Sahara,ProteinExpress.Purif.,53:384-389(2007);Bovolenta et al.,J.Biomol.Screen,12:694-704(2007)。
发明概述
本发明提供了至少部分修饰的发光蛋白,例如修饰形式的Clytin,其相对于本领域已知的野生型(wt)发光蛋白具有增加的细胞内钙亲和性和/或呈现出增强的生物发光,所述野生型发光蛋白如wt-水母素和/或wt-Clytin和/或wt-Obelin。本发明进一步提供了这种发光蛋白在基于细胞测定中检测钙流动(例如GPCR刺激的钙流动)的应用及其在药物输送中的应用。
在本发明的一些实施方案中,提供了修饰的发光蛋白,其包含在wt-Clytin的EF hand III结构域包含至少一个氨基酸修饰的氨基酸序列,所述wt-Clytin的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示,其中所述修饰的发光蛋白与包含SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的发光蛋白相比呈现出增加的对细胞内钙的亲和性及增强的生物发光。
在一些实施方案中,本发明的修饰的发光蛋白包含SEQ ID NO:1所示氨基酸序列中至少第168位赖氨酸由除组氨酸、精氨酸和赖氨酸之外的氨基酸置换的氨基酸序列;其中所述修饰的发光蛋白与包含SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的发光蛋白相比呈现出增加的对细胞内钙的亲和性及增强的生物发光。
在一具体实施方案中,本发明的修饰的发光蛋白包含SEQ ID NO:1所示氨基酸序列中至少第168位赖氨酸由天冬氨酸置换的氨基酸序列,;其中所述修饰的发光蛋白与包含SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的发光蛋白及包含SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的发光蛋白相比均呈现出增加的对细胞内钙的亲和性及增强的生物发光。
在一些实施方案中,本发明的修饰的发光蛋白与wt-Clytin和/或wt-水母素相比呈现出增加的对细胞内钙的亲和性。在一些实施方案中,修饰的发光蛋白对于细胞内钙的EC50值为500nM或更低,其中所述修饰的发光蛋白不包含SEQ ID NO:2所示氨基酸序列或者其变体。
本发明涵盖的修饰的发光蛋白包括这样的发光蛋白,所述发光蛋白包含选自以下的氨基酸序列:SEQ ID NO:9(K168D)、SEQ ID NO:11(K168E)、SEQ ID NO:15(K168G)、SEQ ID NO:17(K168N)、SEQ ID NO:19(K168Q)、SEQ ID NO:21(K168S)、SEQ ID NO:23(K168T)、SEQ ID NO:25(K168V)和SEQ ID NO:27(K168Y)。
在多种实施方案中,本发明涵盖的修饰的发光蛋白相对于包含SEQ IDNO:1所示氨基酸序列的wt-Clytin呈现出增加的对细胞内钙的亲和性。在一些实施方案中,本发明的修饰的发光蛋白相对于包含SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的发光蛋白呈现出对细胞内钙的亲和性增加1.5%、或者2%、或者3%、或者4%、或者5%、或者10%、或者20%、或者25%、或者30%、或者40%、或者50%、或者60%、或者70%、或者80%、或者90%或者90%以上。
此外,在一些实施方案中,本发明涵盖的修饰的发光蛋白相对于wt-Clytin呈现出增强的生物发光。在一些实施方案中,本发明的修饰的发光蛋白相对于包含SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的发光蛋白呈现出生物发光增加1.5%、或者2%、或者3%、或者4%、或者5%、或者10%、或者20%、或者25%、或者30%、或者40%、或者50%、或者60%、或者70%、或者80%、或者90%或者90%以上。
本发明涵盖的各种发光蛋白相对于wt-Clytin和wt-水母素之一或这两者呈现出增加的对细胞内钙的亲和性。
在一些实施方案中,本发明的一或多种发光蛋白呈现出的对细胞内钙的亲和性以及生物发光是在用编码所述修饰的发光蛋白的核酸分子转染的细胞中测量的。举例的细胞包括但不限于CHO细胞、HEK293T细胞、HeLa细胞、NIH3T3细胞和U-2OS细胞。
本发明还涵盖了编码本发明的发光蛋白的核酸分子以及包含这种核酸分子的载体。在进一步的实施方案中,提供了用编码修饰的发光蛋白的核酸转染的哺乳动物细胞。
在进一步的实施方案中,提供了本发明涵盖的修饰的发光蛋白的使用方法。
在一些实施方案中,提供了用于检测细胞中钙流动的体外方法。这种方法包括如下步骤:a)提供表达如本文所述修饰的发光蛋白的细胞;b)使所述细胞与导致钙流动的物质接触;及c)检测所述发光蛋白的生物发光,其中所述生物发光表明存在钙流动。
在进一步的实施方案中,提供了用于筛选调节GPCR活性或者离子通道的化合物的方法,其中这种方法包括如下步骤:a)提供表达如本文所述修饰的发光蛋白的细胞;b)使所述细胞与候选化合物接触;及c)检测发光蛋白的生物发光,其中发光蛋白生物发光在存在所述候选化合物的条件下的变化表明所述化合物调节GPCR活性或者离子通道活性。
在多种实施方案中,钙流动是由调节GPCR活性或者离子通道活性导致的。举例的GPCR包括但不限于H1组胺受体、抑胃多肽(GIP)受体、GLP-1受体、胰高血糖素受体、S1P2鞘氨醇1-磷酸盐受体、EP1前列腺素受体或者EP3前列腺素受体。举例的离子通道包括瞬时感受器电位A1(transientreceptor potential A1,TRPA1)。
在一些实施方案中,修饰的发光蛋白包含线粒体信号序列。举例的线粒体信号序列是COX8线粒体序列,如SEQ ID NO:8所示。
附图简述
图1描述了发光蛋白Clytin(SEQ ID NO:1)、水母素(SEQ ID NO:2)、Mitrocomin(SEQ ID NO:3)和Obelin(SEQ ID NO:4)的氨基酸序列比对。方框中是钙结合的螺旋-转角-螺旋(HTH)/EF hand基序。序列相同性以星号(*)标示,序列相似性用冒号(:)标示。
图2描绘了总结举例实验结果的图,所述实验在HEK293T细胞中使用瞬时共转染测定测量了野生型线粒体水母素(mt-水母素,其氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示)、野生型线粒体Clytin(mt-Clytin,其氨基酸序列如SEQID NO:5所示)、野生型线粒体Obelin(mt-Obelin,其氨基酸序列如SEQ IDNO:7所示)、修饰的线粒体Clytin(K168D)(mt-Clytin K168D,其氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示)以及修饰的线粒体Clytin(K168E)(mt-ClytinK168E,其氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示)对钙的亲和性。X轴表示钙浓度,Y轴表示在存在指定浓度钙条件下发出的生物发光与在存在1.5mMCaCl2条件下发出的生物发光之间标准化log比(log(L/Lmax))。
图3描绘了总结举例实验结果的图,所述实验在U-2OS细胞中测量受体介导的生物发光的变化,所述U-2OS细胞用编码H1组胺受体的cDNA及编码以下任一的cDNA瞬时共转染:野生型线粒体水母素(mt-水母素,其氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示)、野生型线粒体Clytin(mt-Clytin,其氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示)、野生型细胞质水母素(wt-水母素,其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示)、野生型细胞质Clyin(wt-Clytin,其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示)、修饰的线粒体Clytin(mt-Clytin K168D,其氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示)或者修饰的细胞质Clytin(K168D,其氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示)。X轴表示施加于细胞的组胺的浓度,Y轴表示以相对发光单位(RLU)测量的生物发光。
图4描绘了总结举例实验结果的图,所述实验比较了在U-2OS细胞中受体介导的生物发光的变化与通过使用Triton X-100在存在1mM CaCl2条件下使细胞膜透化而诱导的生物发光的变化,所述U-2OS细胞用编码H1组胺受体的cDNA及编码以下任一的cDNA瞬时共转染:野生型线粒体水母素(mt-水母素,其氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示)、野生型线粒体Clytin(mt-Clytin,其氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示)、野生型细胞质水母素(wt-水母素,其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示)、野生型细胞质Clyin(wt-Clytin,其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示)、修饰的线粒体Clytin(mt-Clytin K168D,其氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示)或者修饰的细胞质Clytin(K168D,其氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示)。Y轴表示以相对发光单位(RLU)测量的生物发光。转染进细胞中的特定发光蛋白在X轴上表示。
图5描绘了总结举例实验结果的图,所述实验测量了在HEK293T细胞中的受体介导的生物发光的变化,所述HEK293T细胞用编码GIP、嵌合的杂交G蛋白的cDNA以及编码如下任一的cDNA瞬时共转染:野生型线粒体水母素(mt-水母素,其氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示)、野生型线粒体Clytin(mt-Clytin,其氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示)、野生型线粒体Obelin(mt-Obelin,其氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示)、野生型细胞质水母素(wt-水母素,其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示)、野生型细胞质Clyin(wt-Clytin,其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示)、野生型细胞质Obelin(wt-Obelin,其氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示)、修饰的线粒体Clytin(mt-Clytin K168D,其氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示)或者修饰的细胞质Clytin(Clytin K168D,其氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示)。X轴表示施加于所述细胞的GIP浓度,Y轴表示以相对发光单位(RLU)测量的生物发光。
图6A-6E描绘了总结举例实验结果的图,所述实验测量了在用编码GLP-1(胰高血糖素样肽-1)受体、胰高血糖素受体、S1P2(鞘氨醇1-磷酸受体2)受体、EP1受体和EP3受体(后两个受体是前列腺素E2受体)、嵌合的杂交G蛋白(GLP-1受体、胰高血糖素受体和S1P2受体)以及修饰的细胞质Clytin(Clytin K168D,其氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示)的cDNA瞬时共转染的HEK293T细胞中的受体介导的生物发光变化。X轴表示施加于所述细胞的每种受体的相应配体的浓度,Y轴表示以相对发光单位(RLU)测量的生物发光。
图7A-7F描绘了总结举例实验结果的图,所述实验测量在用编码GIP受体(抑胃肽受体)、CXCR1受体、CXCR4受体、胰高血糖素受体、GLP-1受体或者EP1受体、嵌合的杂交(promiscuous)G蛋白以及修饰的细胞质Clytin(Clytin K168D,其氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示)的cDNA瞬时共转染的HEK293T细胞中的受体介导的生物发光变化。图7G描绘了总结举例实验结果的图,所述实验测量了在稳定表达D2受体、杂交G蛋白和修饰的细胞质Clytin(Clytin K168E,其氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示)的CHO-K1细胞中的受体介导的生物发光变化。图中的生物发光数据得自FLIPRTetra Plus高通量发光平板测量仪(Molecular Devices)。
图8描绘了总结举例实验结果的图,所述实验测量了在HEK293细胞中的受体介导的生物发光变化,所述HEK293细胞稳定表达编码TRPA1阳离子通道的cDNA并用编码如下任一的cDNA瞬时共转染:野生型线粒体水母素(mt-水母素,其氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示)、野生型线粒体Clytin(mt-Clytin,其氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示)、野生型细胞质水母素(wt-水母素,其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示)、野生型细胞质Clyin(wt-Clytin,其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示)、修饰的线粒体Clytin(mt-Clytin K168D,其氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示)或者修饰的细胞质Clytin(Clytin K168D,其氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示)。X轴表示施加于所述细胞的异硫氰酸烯丙酯(AITC)浓度,Y轴表示以相对发光单位(RLU)测量的生物发光。
发明详述
本发明提供了修饰的发光蛋白,如修饰的Clytin,其相对于wt-Clytin和/或wt-水母素和/或wt-Obelin具有增加的钙亲和性以及增强的生物发光,本发明还提供了其在报告基因系统和基于细胞的测定中作为钙指示剂的应用。
I.定义
为了更易于理解本发明,首先定义一些术语。另外的定义在详细描述中阐述。
术语“发光蛋白”或者“Ca2+激活的发光蛋白”在本文可互换使用,是指在与钙结合时发光的蛋白质。发光蛋白通常分离自海洋腔肠动物,在存在钙的条件下通过分子内反应发出可见光。已知发光蛋白的钙结合位点与在其它Ca2+结合蛋白如钙调蛋白(Calmodulin)中发现的那些位点相似,但是与其它Ca2+蛋白不同在于相对高含量的半胱氨酸、组氨酸、色氨酸、脯氨酸和酪氨酸残基。
举例的发光蛋白包括但不限于Obelin、Clytin、水母素、Halistaurin、Mnemiospin和Berovin,通常不包括萤光素酶(Luciferases)。所有这些发光蛋白均是脱辅基蛋白、咪唑并哌嗪生色团(imidazopyrazine chromophore)(腔肠素)和氧的复合物。
在一些实施方案中,本发明提供了修饰的发光蛋白。在一具体实施方案中,本发明涉及修饰的Clytin。发光蛋白Clytin(SEQ ID NO:1)、水母素(SEQ ID NO:2)、Mitrocomin(SEQ ID NO:3)和Obelin(SEQ ID NO:4)的氨基酸序列比对在图1中示出。
术语“修饰的发光蛋白”或者“Ca2+激活的修饰的发光蛋白”在本文可互换使用,是指野生型发光蛋白的氨基酸序列变体(例如wt-Clytin的变体,wt-Clytin的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示),其相对于wt-Clytin呈现出增加的对细胞内钙的亲和性以及增强的生物发光。在一些实施方案中,本发明的修饰的发光蛋白包括在wt-Clytin的螺旋-转角-螺旋结构域(HTH)(例如EF hand III结构域)中的至少一个氨基酸修饰,其中所述修饰的发光蛋白相对于wt-Clytin呈现出增加的对细胞内钙的亲和性以及增强的生物发光。在一些实施方案中,修饰的发光蛋白包含SEQ ID NO:1中至少第168位的赖氨酸残基由除组氨酸、精氨酸和赖氨酸之外的氨基酸置换的氨基酸序列,其中所述修饰的发光蛋白相对于包含SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的发光蛋白呈现出增加的对细胞内钙的亲和性以及增强的生物发光。在一些实施方案中,修饰的发光蛋白包含SEQ ID NO:1中至少第168位赖氨酸残基由天冬氨酸置换的氨基酸序列,其中所述发光蛋白相对于包含SEQ IDNO:1所示氨基酸序列的发光蛋白及包含SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的发光蛋白均呈现出增加的对细胞内钙的亲和性以及增强的生物发光。
在举例的实施方案中,本发明的修饰的发光蛋白包含选自如下的氨基酸序列:SEQ ID NO:9(K168D)、SEQ ID NO:11(K168E)、SEQ ID NO:15(K168G)、SEQ ID NO:17(K168N)、SEQ ID NO:19(K168Q)、SEQ ID NO:21(K168S)、SEQ ID NO:23(K168T)、SEQ ID NO:25(K168V)和SEQ ID NO:27(K168Y)。在一些实施方案中,本发明的修饰的发光蛋白进一步包含线粒体靶向信号序列,例如COX8线粒体标签,其氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。
EF hand结构域是在包括本发明涵盖的发光蛋白在内的钙结合蛋白质大家族中发现的一种螺旋-转角-螺旋(HTH)结构结构域。其由两个彼此大致垂直的并通过一个短的环区域(通常大约12个氨基酸)连接的α螺旋组成,其通常结合钙离子。EF hand结构域是根据其在描述蛋白质小白蛋白(Parvalbumin)的传统命名法命名的,小白蛋白含有三个这种基序,且被认为通过其钙结合活性参与肌肉舒张。EF hand结构域也在信号蛋白钙调蛋白的每个结构结构域以及在肌肉蛋白肌钙蛋白-C(Troponin-C)中出现。
术语“HTH IV结构域”或者“EF hand III结构域”是指在Clytin中发现的四个螺旋-转角-螺旋结构域(三个是EF hand结构域)的第四个结构域以及三个EF hand结构域的第三个结构域,其包含第162至173位氨基酸残基,及包括氨基酸序列DLDNSGKLDVDE(SEQ ID NO:31)。所述Clytin的HTH IV结构域(或者EF hand III结构域)据报道在生理相关浓度结合钙。
不受任何理论限制,应理解本发明涵盖的氨基酸序列变体可以与其所衍生自的亲本氨基酸序列不同,可以在亲本氨基酸序列任何位置具有一或多个氨基酸取代、缺失和/或插入,及包括在至少一个HTH结构域中的至少一个氨基酸取代(例如在Clytin第168位,该残基在EF hand III结构域中),其中所述变体呈现出增加的钙亲和性(例如在HEK293T细胞中细胞内钙的EC50值为500nM或更低)及增强的生物发光。在一些实施方案中,氨基酸序列变体与亲本序列(即SEQ ID NO:1所示wt-Clytin)具有至少大约70%、或者至少大约80%、或者至少大约85%、或者至少大约90%、或者至少大约95%、或者至少大约96%、或者至少大约97%、或者至少大约98%、或者至少大约99%相同性,其中这种变体呈现出增加的对细胞内钙的亲和性及增强的生物发光,且这种变体不包含SEQ ID NO:2所示氨基酸序列或者其变体。
术语“序列相同性”是指当例如通过程序GAP或者BESTFIT使用默认缺口权重(gap weight)进行最佳排列比对时,两个核苷酸或者氨基酸序列具有至少70%序列相同性、或者至少80%序列相同性、或者至少85%序列相同性、或者至少90%序列相同性、或者至少95%序列相同性或者更高相同性(例如99%序列相同性或更多)。对于序列比对,一般一个序列作为参照序列(例如亲本序列),检测序列与其对比。当使用序列对比算法时,检测序列和参照序列均输入计算机中,如果需要随后指定配对物,指定序列算法程序参数。然后所述序列对比算法基于指定的程序参数计算所述检测序列与参照序列的序列相同性。
可以进行最佳序列比对,例如通过Smith&Waterman,Adv.Appl.Math.2:482(1981)的局部同源性算法、Needleman&Wunsch,J.Mol.Biol.48:443(1970)的同源性比对算法、Pearson&Lipman,Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA85:2444(1988)的搜索相似性方法及这些算法的计算机执行(GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA,Wisconsin Genetics Software Package,Genetics Computer Group,575Science Dr.,Madison,Wis.),或者通过目测进行(见Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology)。适于确定序列相同性和序列相似性百分比的一个算法实例是BLAST算法,在Altschul etal.,J.Mol.Biol.215:403(1990)中描述。进行BLAST分析的软件可通过National Center for Biotechnology Information公开获得(通过国立卫生研究院NCBI互联网服务器公开获得)。一般可用默认参数进行所述序列对比,但是也可以使用指定参数。对于氨基酸序列,BLASTP程序使用默认wordlength(W)=3,expectation(E)=10,BLOSUM62得分矩阵(见Henikoff&Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915(1989))。使用MUSCLE(Multiple Sequence Comparison by Log Expectation)算法(Edgar,Nucl.AcidsRes.32:1792(2004))进行多个序列比对的软件可通过欧洲生物信息学中心(European Bioinformatics Institute)互联网服务器公开得自欧洲分子生物学实验室(European Molecular Biology Laboratories)。
在一个实施方案中,本发明的修饰的发光蛋白基于wt-Clytin的氨基酸序列(即SEQ ID NO:1所示序列),其中所述修饰的发光蛋白至少包含在第168位赖氨酸残基由除组氨酸、精氨酸和赖氨酸之外的氨基酸置换。在一些实施方案中,在SEQ ID NO:1第168位的赖氨酸由选自以下的氨基酸置换:天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸、酪氨酸和谷氨酰胺,其中修饰的发光蛋白相对于野生型发光蛋白(例如wt-Clytin和/或wt-水母素和/或Obelin)呈现出增加的钙亲和性(例如在HEK293T细胞中EC50为500nM或更低)及增强的生物发光。在一具体实施方案中,本发明的修饰的发光蛋白包含至少在第168位的赖氨酸由天冬氨酸置换的氨基酸序列,其中所述修饰的发光蛋白相对于wt-Clytin和wt-水母素呈现出增加的对细胞内钙的亲和性和增强的生物发光。
在一些实施方案中,本发明的修饰的发光蛋白包含线粒体靶向序列(例如SEQ ID NO:8所示)。在一些实施方案中,包含线粒体靶向序列的Clytin变体如SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26和SEQ IDNO:28所示。
置换SEQ ID NO:1第168位赖氨酸的合适氨基酸包括除了组氨酸、精氨酸和赖氨酸之外的任何天然发生的氨基酸。在一些实施方案中,置换在第168位赖氨酸的合适氨基酸包括选自如下的一种天然发生的氨基酸:天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸、酪氨酸和谷氨酰胺。本领域熟知的非天然发生的氨基酸和氨基酸衍生物也可用于置换在第168位的赖氨酸。
如本文所用,术语“生物发光”、“发光”、“生物发光的”或者“发光的”涉及本发明的修饰的发光蛋白在与二价阳离子如Ca2+结合时发出可见光的能力。生物发光反应一般需要三个主要组分:萤光素、萤光素酶和分子氧。然而,也可需要其它组分,包括阳离子(例如Ca2+和Mg2+)及辅因子(例如ATP、NAD(P)H)。萤光素酶是催化底物萤光素氧化的酶,并产生不稳定的中间体。当不稳定的中间体衰变至其基态时发光,产生氧化萤光素。生物发光可以使用本领域已知的及本文描述的一或多种技术测量,包括但不限于使用光度计,如Victor2 and Lumilux(PERKINELMER)、FLIPR和FlexStation(MOLECULAR DEVICES/MDS ANALYTICAL)、Mithras(BERTHOLD TECHNOLOGIES)、FDSS(HAMAMATSU PHOTONICS)和PHERAstar(BMG LABTECH)。
如本文所用,术语“增强的生物发光”是指修饰的发光蛋白的生物发光相对于野生型发光蛋白在存在Ca2+条件下的任何增加。例如,在举例的实施方案中,如在用增加细胞内Ca2+的物质刺激的活细胞中或者在暴露于含有不同浓度Ca2+的溶液的渗透化处理的细胞中所测量到的,修饰的发光蛋白如本文所述修饰的Clyin(例如在第168位具有氨基酸修饰的Clytin)的生物发光相对于wt-Clytin和/或wt-水母素的生物发光增强。修饰的发光蛋白在存在钙的条件下的生物发光相对于野生型发光蛋白(例如wt-Clytin和/或wt-水母素和/或Obelin)可增加大约1.5%、或者大约2%、或者大约3%、或者大约4%、或者大约5%、或者大约10%、或者大约20%、或者大约30%、或者大约40%、或者大约50%、或者大约60%、或者大约70%、或者大约80%、或者大约90%或者90%以上。在一些实施方案中,修饰的发光蛋白在存在钙的条件下的生物发光相对于野生型发光蛋白(例如wt-Clytin和/或wt-水母素)增加大约1.5倍、或者2倍、或者5倍、或者10倍、或者15倍、或者20倍、或者25倍、或者30倍、或者35倍、或者40倍、45倍、或者50倍、或者55倍、或者60倍、或者65倍、或者70倍、或者75倍、或者80倍、或者85倍、90倍,或者90倍以上。
本领域熟知细胞内钙作为许多重要的生理学应答和病理生理学病症的调节剂。在大多数这些情况中,细胞外信号是由受体(例如GPCR和离子通道)接受的,并转变为细胞内Ca2+浓度的变化,其导致细胞内部Ca2+敏感性变化,包括但不限于调节Ca2+敏感性激酶、蛋白酶和转录因子的调节。因此,测量细胞内Ca2+浓度是理解细胞蛋白质的细胞内处理和调节所必需的。此外,Ca2+在细胞内信号传输中的关键作用使其成为药物研发中非常有吸引力的报告物。对于制药业重要的许多药物靶类别包括但不限于G蛋白结合的受体(GPCR)、离子通道和转运蛋白,当被激活时触发Ca2+调动(mobilization),称作“钙流动”。
细胞内Ca2+浓度或者钙流动的变化可以使用荧光染料(例如fura-2和indo-1)(见例如R.Y.Tsien,Nature 290,527(1981);R.Y.Tsien,T.Pozzan,T.J.Rink,J.Cell.Biol.94,325(1982)),Ca2+敏感性生物发光的水母蛋白水母素(例如E.B.Ridgway and C.C.Ashley,Biochem.Biophys.Res.Commun.29,229(1967))或者Ca2+敏感性微电极(例如C.C.Ashley and A.K.Campbell,Eds.,Detection and Measurement of Free Ca2+ in cells(Elsevier,North-Holland,Amsterdam,1979))检测。在举例的实验中,细胞内钙浓度可以通过在表达发光蛋白的哺乳动物细胞中加入腔肠素辅因子并检测光子发射而进行测量,光子发射是细胞内钙浓度的指示。
本发明提供了修饰的发光蛋白,其相对于已知发光蛋白呈现出增加的对细胞内Ca2+的亲和性。因此,本发明的修饰的发光蛋白对于细胞内Ca2+浓度变化更敏感,并因此优于检测钙流动的已知蛋白质和试剂。由于所述修饰的发光蛋白与野生型发光蛋白相比呈现出细胞内钙浓度的变化更高的敏感度,因此所述修饰的发光蛋白非常适用于筛选GPCR或者离子通道活性调节物的测定中,特别适于筛选仅可导致细胞内钙浓度细微变化的调节物。
如本文所用,术语“增加的对细胞内钙的亲和性”是指本发明的修饰的发光蛋白(例如在SEQ ID NO:1所示序列第168位具有氨基酸取代的Clytin)相对于野生型发光蛋白(例如wt-水母素和/或wt-Clytin和/或wt-Obelin)在对于细胞内钙的亲和性的任何增加。例如,对细胞内钙的亲和性相对于野生型发光蛋白(例如wt-Clytin和/或wt-水母素和wt-Obelin)可增加大约1.5%、或者大约2%、或者大约3%、或者大约3.5%、或者大约4%、或者大约5%、或者大约10%、或者大约20%、或者大约30%、或者大约40%、或者大约50%、或者大约60%、或者大约70%、或者大约80%、或者大约90%、或者大约95%、或者大约96%、或者大约97%、或者大约98%、或者大约99%或更多。在一些实施方案中,增加的对细胞内钙的亲和性是指修饰的发光蛋白相对于野生型发光蛋白(例如wt-Clytin和/或wt-水母素和/或wt-Obelin)对于细胞内钙的EC50值降低。发光蛋白对于钙的亲和性可以使用本领域熟知的技术和测定法测量,包括但不限于本文所述技术和测定法。在举例的测定中,如在实施例中描述,钙亲和性是通过将腔肠素装载入发光蛋白表达细胞,随后测量在向所述细胞中加入不同浓度钙时由所述细胞发出的生物发光。
如本文所用,术语“对细胞内钙的EC50值”是指激发发光信号(即生物发光)到达在存在饱和量钙的条件下观测到的发光信号的50%水平的游离钙的浓度(即在此之上钙浓度进一步增加不产生发光信号进一步增加)。如本文所用,细胞内钙的EC50值是修饰的发光蛋白对细胞内钙的亲和性的测量值。EC50值可以使用本领域已知的及本文所述的一或多种测定法测量,例如在下文实施例章节所述方法。在举例的实施方案中,本发明的修饰的发光蛋白在HEK293T细胞中对细胞内钙的EC50值为500nM或更低,其中修饰的发光蛋白不是wt-水母素或者其变体(例如不包含SEQ ID NO:2所示氨基酸序列或者其变体).
在一些实施方案中,修饰的发光蛋白的细胞内钙的EC50值相对于野生型发光蛋白(例如wt-Clytin和/或wt-水母素和/或wt-Obelin)的EC50值降低大约1.5%、或者2%、或者3%、或者4%、或者5%、或者10%、或者15%、或者20%、或者25%、或者30%、或者50%、或者60%、或者70%、或者80%、或者90%、或者95%、或者95%以上。在一些实施方案中,本发明修饰的发光蛋白的EC50值相对于野生型发光蛋白(例如wt-Clytin和/或wt-水母素和/或wt-Obelin)的EC50值降低大约10nM、或者20nM、或者30nM、或者40nM、或者50nM、或者60nM、或者70nM、或者80nM、或者90nM、或者100nM、或者110nM、或者120nM、或者130nM、或者140nM、或者150nM、或者160nM、或者170nM、或者180nM、或者190nM、或者200nM、或者210nM、或者220nM、或者230nM、或者240nM、或者250nM、或者260nM、或者270nM、或者280nM、或者290nM、或者300nM、或者310nM、或者320nM、或者330nM、或者340nM、或者350nM、或者360nM、或者370nM、或者380nM、或者390nM、或者400nM、或者410nM、或者420nM、或者430nM、或者440nM、或者450nM、或者450nM以上。
术语“GPCR”是指G蛋白偶联受体,其参与各种细胞信号转导途径。作为自然界最大和最多样的一个蛋白质家族,G蛋白偶联受体(GPCR)超家族在多种生物和病理学进程如发育和增殖、神经调节、血管发生、代谢紊乱、炎症和病毒感染中起重要作用。其是目前药物学研究中最聚焦的蛋白质家族之一。GPCR超家族的所有成员共有相似的7跨膜结构域,但是可以基于共有的序列基序分类。例如,A类包括视紫红质样GPCR,B类包括促胰液素样GPCR,C类包括促代谢型谷氨酰胺/信息素GPCR、D类包括真菌信息素GPCR,及E类包括cAMP GPCR。另外的GPCR可以分类为Frizzled/Smoothened GPCR、Vomeronasal GPCR及一些仍未分类的GPCR。
下表1列举了本文论述的核酸和氨基酸序列以及相应的序列标识符(SEQ ID NO)。
表1
SEQ ID NO | 简述 |
1 | 野生型Clytin(wt-Clytin)氨基酸序列 |
2 | 野生型水母素(wt-水母素)氨基酸序列 |
3 | 野生型Mitrocomin(wt-Mitrocomin)氨基酸序列 |
4 | 野生型Obelin(wt-Obelin)氨基酸序列 |
5 | 线粒体野生型Clytin(mt-Clytin)氨基酸序列 |
6 | 线粒体野生型水母素(mt-水母素)氨基酸序列 |
7 | 线粒体野生型Obelin(mt-Obelin)氨基酸序列 |
8 | COX 8线粒体标签氨基酸序列 |
9 | K168D修饰的Clytin氨基酸序列 |
10 | 线粒体K168D修饰的Clytin氨基酸序列(mt-Clytin K168D) |
11 | K168E修饰的Clytin氨基酸序列 |
12 | 线粒体K168E修饰的Clytin氨基酸序列(mt-Clytin K168E) |
13 | K168H修饰的Clytin氨基酸序列 |
14 | 线粒体K168H修饰的Clytin氨基酸序列(mt-Clytin K168H) |
15 | K168G修饰的Clytin氨基酸序列 |
16 | 线粒体K168G修饰的Clytin氨基酸序列(mt-Clytin K168G) |
17 | K168N修饰的Clytin氨基酸序列 |
18 | 线粒体K168N修饰的Clytin氨基酸序列(mt-Clytin K168N) |
19 | K168Q修饰的Clytin氨基酸序列 |
20 | 线粒体K168Q修饰的Clytin氨基酸序列(mt-Clytin K168Q) |
21 | K168S修饰的Clytin氨基酸序列 |
22 | 线粒体K168S修饰的Clytin氨基酸序列(mt-Clytin K168S) |
23 | K168T修饰的Clytin氨基酸序列 |
24 | 线粒体K168T修饰的Clytin氨基酸序列(mt-Clytin K168T) |
25 | K168V修饰的Clytin氨基酸序列 |
26 | 线粒体K168V修饰的Clytin氨基酸序列(mt-Clytin K168V) |
27 | K168Y修饰的Clytin氨基酸序列 |
28 | 线粒体K168Y修饰的Clytin氨基酸序列(mt-Clytin K168Y) |
29 | K168R修饰的Clytin氨基酸序列 |
30 | 线粒体K168R修饰的Clytin氨基酸序列(mt-Clytin K168R) |
31 | 野生型Clytin EF hand III结构域氨基酸序列 |
32 | 野生型Clytin(wt-Clytin)核酸序列 |
33 | 野生型水母素(wt-水母素)核酸序列 |
34 | K168D修饰的Clytin核酸序列 |
35 | 线粒体野生型Clytin(mt-Clytin)核酸序列 |
36 | 线粒体野生型水母素(mt-水母素)核酸序列 |
37 | 线粒体K168D修饰的Clytin(mt-Clytin K168D)核酸序列 |
38 | K168D有义引物 |
39 | K168D反义引物 |
40 | K168E有义引物 |
41 | K168E反义引物 |
42 | K168G有义引物 |
43 | K168G反义引物 |
44 | K168N有义引物 |
45 | K168N反义引物 |
46 | K168Q有义引物 |
47 | K168Q反义引物 |
48 | K168V有义引物 |
49 | K168V反义引物 |
50 | K168S有义引物 |
51 | K168S反义引物 |
52 | K168T有义引物 |
53 | K168T反义引物 |
54 | K168Y有义引物 |
55 | K168Y反义引物 |
56 | K168R有义引物 |
57 | K168R反义引物 |
58 | K168H有义引物 |
59 | K168H反义引物 |
60 | H1正向PCR引物 |
61 | H1反向PCR引物 |
II.举例的发光蛋白
本发明涉及修饰的Ca2+结合发光蛋白。所述Ca2+结合发光蛋白是由原生动物门(Protozoa)、刺胞动物门(Cnidaria)和栉水母门(Ctenophora)的发光生物体使用以产生光的蛋白质-底物-氧复合物。本领域已经描述的举例的Ca2+结合发光蛋白包括Thalassicolin、水母素、Mitrocomin、Clytin(也称作Phialidin)、Obelin、Mnemiopsin和Berovin。水母素、Mitrocomin、Clytin和Obelin四种发光蛋白来自刺胞动物门水螅纲,且相对较小(21.4-27.5kDa)。
由于腔肠素是发光蛋白水母素、Mitrocomin、Clytin和Obelin中含有的共同的发光生色团,因此认为发光反应在这四种发光蛋白中是相同的(Tsujiet al.,Photochem.Photobiol.,62:657-661(1995))。常规的命名法根据与生色团复合的多肽定义这些发光蛋白名称,而没有生色团的发光蛋白被称作脱辅基蛋白(例如脱辅基水母素(apoaequorin)、脱辅基clytin(apoclytin)、脱辅基obelin(apoobelin)和脱辅基mitrocomin(apomitrocomin))。此外,Ca2+结合发光蛋白看起来保留紧密结合的O2分子。在钙离子与发光蛋白结合时,所述蛋白质催化腔肠素与O2氧化为coelenteramide、CO2,及在470nm最大发射值的光子。
由于其低毒性,水母素自二十世纪六十年代以来已经用作细胞内钙指示剂。水母素的最初用途是使用生物化学纯化的酶显微注射进感兴趣的细胞中(Blinks et al.Pharmacol Rev.,28:1-93(1976))。
对脱辅基水母素的分子克隆示出其由在一条多肽链中的189个氨基酸残基组成,且含有4个HTH结构域,其中3个具有EF hand Ca2+结合位点的氨基酸序列特征(Inouye et al.,Proc.Natl.Acad Sci USA,82:3154-3158(1985))。水母素基因克隆开启了在细胞或者甚至完整生物体中重组表达之门。用亚细胞靶向信号序列标记的重组水母素cDNA的表达将水母素转运至特定的亚细胞区室,从而可以测量这些区室中的钙浓度(Rizzuto et al.,Methods Cell Biol.40:339-358(1994))。水母素选择性靶向线粒体的这种研究已经揭示当Ca2+从内质网(ER)存储中释放时,线粒体积聚的钙超过在细胞质中的浓度。
许多GPCR通过刺激钙从ER存储中经肌醇三磷酸释放而传输信号。因此,水母素已经用于测量GPCR-介导的钙流动。用线粒体靶向的水母素测量细胞内钙流动的简易性使得可以开发用于多种GPCR的调节物的高通量测定(Stables et al.,Anal.Biochem.,252:115-126(1997);Ungrin et al.,Anal.Biochem.,272:34-42(1999)).此外,水母素用于高通量分析钙离子通道功能(Walstab et al.,Anal.Biochem.,368:185-192(2007))。
III.Clytin的结构
Clytin是也被称作Phialidin的另一种发光蛋白,其克隆自水螅虫Clytiagregarium(先前称作Phialidium gregarium)。
Ca2+激活的Clytin(也称作Clytin-I)的cDNA克隆和序列分析首先由Inouye et al.(FEBS,315,343-346(1993))描述。Clytin由189个氨基酸残基组成,与水母素具有大约64%的氨基酸序列相同性,且包括4个HTH结构域,其中3个是结合Ca2+的EF-hand结构域。野生型Clytin的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。用腔肠素、O2、2-巯基乙醇和EDTA再生纯化的a脱辅基clytin产生Clytin,正如脱辅基水母素再生为水母素的情况。Clytin的生物发光反应被认为与水母素相似,因为据报道在重建的Clytin中加入钙导致发出最大波长470nm的光(Inouye and Sahara,Protein Expr.Purif.,53:384-389(2007))。然而,Clytin与水母素相比呈现出较低的钙亲和性。Cytin的第二种同种型称作Clytin-II,最近已经克隆自Clytia gregarium(Inouye,J.Biochem.,143:711-717(2008))。Clytin-I和Clytin-II呈现出88.4%氨基酸相同性,相似的钙亲和性,以及相似的发光总量子产量,然而其动力学不同,Clytin-II展示出比Clytin-I和水母素均高4.5倍的发光峰值。
IV.修饰的发光蛋白的产生
本发明的修饰的发光蛋白可以使用本领域已知的任何合适方法制成。例如,可以使用核酸定向诱变标准技术,如在Sambrook,Fritsch和Maniatis的书名为Molecular Cloning的实验手册中所述。此外,可以使用包括聚合酶链反应(PCR)诱变的标准分子生物学技术。
在一些实施方案中,所述修饰的发光蛋白是通过使用标准遗传工程技术产生的。例如,编码野生型发光蛋白的核酸分子或者其一部分可以克隆进合适载体中以在合适宿主细胞中表达。合适的表达载体为本领域熟知,一般包括所述修饰的发光蛋白编码序列转录和翻译必需的元件。
本文所述修饰的发光蛋白也可以使用本领域熟知的方法从氨基酸前体中化学合成,包括固相肽合成方法。
修饰的发光蛋白的表达可以在真核宿主如酵母、昆虫或哺乳动物或者在原核宿主如细菌如大肠杆菌细胞中实现。
在一些实施方案中,修饰的发光蛋白包括使这种发光蛋白靶向细胞内特定区室的信号序列,例如以检测特定细胞区室中钙流动。在一具体实施方案中,例如通过在修饰的蛋白质氨基末端包含线粒体信号序列(例如本文所述COX8信号序列),所述修饰的发光蛋白特别靶向线粒体。
在一些实施方案中,修饰的发光蛋白包含在N末端、C末端或者内部区域的标签或者融合物,以检测和/或纯化所述修饰的发光蛋白。这种序列标签包括但不限于血凝素(HA)标签、FLAG标签、myc标签、六组氨酸标签和谷胱甘肽S-转移酶(GST)融合物。
在一些实施方案中,修饰的发光蛋白可以在噬菌体表面表达,由此每个噬菌体含有编码在噬菌体表面上展示的单个的修饰的发光蛋白的DNA序列。在这种方法中,通过合成在发光蛋白序列中的选定位置的随机或者半随机寡核苷酸来制备修饰的发光蛋白文库,选择这些位置是为了在这些位置产生多种氨基酸。将所述编码DNA插入合适的噬菌体载体中,包装成噬菌体颗粒,并用于感染合适的细菌宿主。因此每个序列均被克隆进一个噬菌体载体中,感兴趣的修饰的发光蛋白(例如在clytin情况中在第168位具有突变及具有增加Ca2+的亲和性)可以被分离,并通过核苷酸测序确定编码选择的修饰的发光蛋白的核苷酸序列。
V.向合适的细胞转染编码修饰的发光蛋白的核酸分子
本领域技术人员已知的许多方法均可用于将核酸分子转染进合适细胞中。例如,磷酸钙、阳离子脂质及阳离子聚合物(如聚乙烯亚胺)可以与核酸分子复合并被施加于细胞,随后所述复合物内化并转录和/或翻译所述核酸分子。或者,电物理方法如电穿孔、基因枪(biolistic gene transfer)及显微注射可用于导致细胞质膜瞬时开放,使得核酸分子可以扩散通过细胞质膜。病毒载体如慢病毒、杆状病毒、腺病毒和腺伴随病毒也可以被改造以包含重组基因,所述重组病毒对接受细胞的感染导致编码的重组蛋白表达。理论上,任何哺乳动物细胞系均可以用编码本发明涵盖的修饰的发光蛋白的核酸分子转染。举例的细胞系包括但不限于CHO、COS、HEK293、U-2OS、HeLa和NIH3T3。
这种转染的细胞系可用于测定中,例如在转染后24-72小时。或者,如果感兴趣的核酸分子已经插入还含有可选择标记基因的质粒中,则可以使用对于未转染的细胞有毒性但由共表达的可选择标记失活的化合物对所述细胞进行选择。举例的选择剂包括遗传霉素(geneticin)、潮霉素、新霉素和嘌呤霉素。
VI.测量修饰的发光蛋白对细胞内钙的亲和性
钙激活的发光蛋白对细胞内钙的亲和性可以通过本领域技术人员已知的一些方法确定,包括本文所述那些方法。通常地,每种方法均包括在存在已知钙亲和性的钙结合缓冲液(如EGTA或者EDTA)的条件下使用含有指定浓度钙的溶液。因此,这种缓冲溶液中游离钙的有效浓度可易于计算。
所述发光蛋白可以在细菌如大肠杆菌中表达及纯化,随后与底物腔肠素复合。所述发光蛋白也可以在哺乳动物细胞及从所述细胞中制备的细胞裂解物中表达,随后与腔肠素孵育。或者,可以在表达所述发光蛋白的细胞中加入腔肠素,然后用去污剂如Triton X-100或洋地黄皂甙渗透化。在每种情况中,将所述发光蛋白制备物暴露于指定光度计中缓冲的钙溶液,以定量由于腔肠素氧化而产生的光子发射。
VII.用修饰的发光蛋白测量GPCR介导的或者离子通道介导的生物发光
修饰的发光蛋白也可用于在生物发光测定中测量完整的活细胞中GPCR活性或者离子通道活性。在举例的实验中,将细胞用编码GPCR或者离子通道的核酸分子及编码脱辅基发光蛋白的另一核酸分子转染。或者,可以使用表达内源GPCR或者内源离子通道的细胞,将其用编码脱辅基发光蛋白的核酸分子转染。将转染的细胞维持在培养基中一段时间,以使得编码的重组蛋白表达(典型维持24-72小时)。或者,将转染的细胞用一或多种选择剂处理,一般处理1-3周,以富集含有稳定整合的基因的细胞。
将活的转染的细胞与天然形式或者化学修饰形式的生色团腔肠素一起孵育。在GPCR情况中,然后将含有重建的发光蛋白的细胞暴露于GPCR配体,使用光度计定量发光。
VIII:用于鉴别GPCR活性调节物的筛选方法
本发明还提供了筛选GPCR活性调节物的方法,所述调节物如激活物、抑制剂、刺激剂、增强剂、激动剂和拮抗剂。例如,所述修饰的发光蛋白可用于通过在存在所述调节物条件下检测钙流动而鉴别GPCR活性的调节物。
细胞质游离钙浓度的刺激是许多GPCR的主要信号转导途径。一般而言,激动剂与某些GPCR的结合引发构象变化,激活Gq/11类的异源三聚体G蛋白。激活的GTP结合形式的Gq的α亚基激活磷脂酶C,随后该酶催化膜结合的脂质磷脂酰肌醇裂解。该裂解反应产生二酰甘油和肌醇三磷酸,二酰甘油保持与脂质双层结合,肌醇三磷酸释放进细胞质中。肌醇三磷酸结合并激活内质网(ER)上钙通道,使钙从存储池中动员进入细胞质中。这种GPCR-介导的细胞质游离钙浓度的变化(即钙流动)导致许多生物学重要的下游应答,包括细胞磷酸化和转录的变化。随后,来自细胞质的钙积聚在线粒体中。另外,已经报道了可以发生钙从ER直接转移进线粒体。
已经开发了检测和定量细胞质和线粒体中游离钙变化的一些方法。例如,开发了荧光染料,其在结合钙时荧光强度或者发射或激发波长发生改变。这种染料可施加于细胞以在细胞质中积聚。细胞质钙浓度的变化导致荧光强度或者波长最大值变化,可以通过使用荧光检测仪定量。此外,钙激活的发光蛋白如水母素、Clytin和Obelin可用于监测细胞内钙的变化。这种发光蛋白具有可以与指导其定向不同细胞器的序列融合,由此可以测量不同细胞区室中钙浓度。
由于有简便和灵敏方法用于监测细胞区室内钙浓度变化,筛选GPCR活性调节物的方法通常是利用这种方法。一般而言,将表达内源或者重组GPCR的细胞系与钙敏感性染料如Fluo-4加入到96孔或384孔平板中。具有液体操作性能的荧光平板分析仪在将感兴趣化合物加入到平板的同时定量荧光。可以加入另外第二种已知激动剂以确定第一次加入的化合物是否是拮抗剂并抑制该已知激动剂的活性。这种筛选每天每台设备能分析接近100个平板,或者高达40,000种化合物。这种高通量筛选已经用于且目前普遍用于发现与这种举例的GPCR相互作用的新化合物,所述举例的GPCR如组胺受体(H1-H4)、5-HT受体(5-HT1A、5-HT1B、5-HT1D、5-HT2A、5-HT2B、5-HT2C、5-HT4、5-HT6和5-HT7)、多巴胺受体(D1-D5)、肾上腺素能受体(α1A、α1B、α1D、α2A、α2B、α2C、β1、β2、β3)、胰高血糖素样肽受体(GLP-1受体)、类鸦片受体(δ、κ、μ)。
然而,使用荧光钙测定的筛选尝试有一些限制。例如,固有荧光化合物可干扰该测定,或者信号与背景比率不足以小型化为1536孔形式,以及观测到相对较高比例的假阳性结果。使用表达感兴趣的GPCR的细胞与水母素进行的发光钙测定已经证实克服了一些这样的限制,使得灵敏性增强及产量提高(Gilchrist et al.,J.Biomol.Screen.,13:486-493(2008))。
本发明通过如下实施例得以进一步例证,所述实施例是非限制性的。本文说明书中引用的所有参考文献、专利和公开的专利申请以及图表均通过引用并入本文。
实施例
实施例1:Clytin变体的产生
产生未修饰的用于在细胞质表达的Clytin形式或者含有线粒体靶向序列的Clytin形式。在举例的实验中,由GenScript化学合成编码未修饰的野生型clytin(称作cyto-clytin-wt)的cDNA和具有COX8线粒体前导序列的clytin(称作mt-clytin-wt)的cDNA。随后将所述cDNA亚克隆进哺乳动物表达载体pcDNA3.1中,置于CMV启动子控制下(INVITROGEN)。使用QuikChange试剂盒(STRATAGENE),通过定向诱变在clytin cDNA中导入突变,包括在第168位的赖氨酸置换为天冬氨酸的突变(K168D)。
将编码Clytin中第168位赖氨酸的密码子AAA改变为天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、甘氨酸、谷氨酰胺、缬氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、精氨酸和组氨酸之一的密码子。用于产生这些修饰的引物在表1中概括。
实施例2:野生型Clytin、修饰的Clytin K168D和野生型水母素的钙亲和性测量
在产生修饰形式Clytin之后,在瞬时转染测定中比较各种变体与wt-水母素的细胞内钙亲和性,所述测定使用与H1组胺受体(Genbank AccessionNo.NM_000861,使用来自人脑cDNA文库的H1-特异性引物通过PCR获得,正向引物5’-GCCGCCACCATGAGCCTCCCCA ATTCCTC-3’(SEQ IDNO:60),反向引物5’-TCATCAGGAGCGAATATGCAG AATTCTC-3’(SEQID NO:61))的共转染。
在举例的实验中,将HEK293T细胞(ATCC-CRL-11268)使用Targefect-293试剂(TARGETING SYSTEMS)用如下材料瞬时共转染:每种2μg的pcDNA3.1-H1(含有编码H1组胺受体的cDNA)及含有编码野生型线粒体Clytin(称作mt-Clytin)、具有在第168位赖氨酸被置换成天冬氨酸突变的修饰的线粒体Clytin(称作mt-Clytin K168D)、具有在第168位赖氨酸被置换成谷氨酸突变的修饰的线粒体Clytin(称作mt-Clytin K168E)、野生型线粒体Obelin(称作mt-Obelin)或者野生型线粒体水母素(称作mt-水母素)的cDNA的pcDNA3.1。48小时后,使用Accutase(MILLIPORE)分离细胞,离心,并重悬浮于在FreeStyle293培养基(INVITROGEN)中的5μM腔肠素中,在室温避光孵育3-4小时。在孵育后,将细胞离心并重悬浮于不具有Ca2+的HBSS/HEPES缓冲液中,密度为1×106细胞/ml。接着,使用Victor2光度计平板分析仪(WALLAC,PERKINELMER),将每一转染的100μl/孔细胞悬浮液加入含有的96孔平板中,所述平板中含有50μL/孔的于含有10mM EGTA的MOPS/KCl缓冲液中的Triton X-100以及一系列浓度的Ca2+,由此游离钙的浓度范围在17nM-39.6μM,随后测量20秒总生物发光。
在图2中阐述一个这样的实验的结果。如图2所示,具有K168D突变的修饰的线粒体Clytin(mt-Clytin K168D)具有极高的Ca2+亲和性,即EC50值为129nM。而发现mt-Clytin和mt-水母素的亲和性在先前报道的范围内,即mt-水母素表现出269nM的EC50值,mt-Clytin表现出1348nM的EC50值。具有K168E突变的修饰的线粒体Clytin也呈现出相对较高的钙亲和性,即EC50值为173nM。
实施例3:由多种发光蛋白变体呈现的GPCR介导的发光的比较
在另一实施方案中,通过在细胞中加入不同浓度的组胺以激活H1组胺受体,随后测量各种发光蛋白的生物发光,从而评定各种发光蛋白检测活细胞中钙流动的能力。如实施例2所述,用编码H1组胺受体的cDNA及编码野生型发光蛋白或者本发明修饰的发光蛋白的cDNA一起转染U-2OS细胞,不同之处是使用Lipofectamine2000(INVITROGEN)作为转染试剂。在第二天,对细胞进行胰蛋白酶化,计数,并铺板于白色组织培养处理的96孔平板(COSTAR)中,密度为大约50,000细胞/孔,所述平板中具有由含有10%胎牛血清的DMEM、非必需氨基酸、HEPES和青霉素/链霉素组成的生长培养基。在第三天,除去培养基,将细胞用200μl/孔的HBSS/HEPES(含有Ca2+)洗涤一次。随后将细胞与5μM腔肠素在HBSS/HEPES(含有Ca2+)中以200μl/孔的体积在室温避光孵育3-4小时。孵育后,除去腔肠素溶液,用含有Ca2+和Mg2+的HBSS/HEPES缓冲液洗涤细胞并更换。将在含有Ca2+和Mg2+的HBSS/HEPES中不同浓度的50μl/孔组胺加入细胞中,使用Victor2光度计测量20秒总生物发光。
一个这样的举例的实验结果在图3中描述。如图所示,细胞质ClytinK169D与在该实验中检测的其它形式Clytin和水母素相比呈现出更高的发光。
实施例4:GPCR介导的发光与多种发光蛋白变体介导的总发光的比较
在随后的实验中,比较GPCR介导的生物发光与多种发光蛋白呈现的总生物发光,作为钙激活的发光蛋白有效性的另一种测量。在举例的实验中,如实施例3所述将U-2OS细胞转染、铺板及装载腔肠素。也如实施例3所述测量由单独的缓冲液或者由10μM组胺诱导的发光。此外,还确定通过加入Triton X-100在存在1mM钙条件下诱导的发光,以评定在细胞中使用饱和钙浓度可检测的活性发光蛋白的总量。
一个这样的实验结果在图4的条形图中概括示出。如图4所示,线粒体和细胞质形式的修饰的Clytin K168D均呈现出GPCR-介导的信号接近总信号的100%。而线粒体和细胞质形式的水母素仅分别产生总信号的大约70%和30%,线粒体和细胞质形式的野生型Clytin分别产生总信号的大约30%和3%。
实施例5:多种发光蛋白变体呈现的发光与结合外源嵌合G蛋白的GPCR诱导的发光的比较
在另一实验中,将HEK293T细胞用质粒瞬时共转染,所述质粒含有编码如下蛋白的cDNA:GIP受体(Genbank Accession No.NM_000164,得自OPEN BIOSYSTEMS)、杂交的G蛋白α亚基及一组发光蛋白,所述发光蛋白包括线粒体靶向的野生型Clytin(wt-Clytin)、11种在SEQ ID NO:1第168位具有氨基酸取代的修饰的线粒体靶向的Clytin(SEQ ID NO:10、12、14、16、18、20、22、24、26、28和30)、细胞质野生型Clytin(SEQ ID NO:1),2种具有在SEQ ID NO:1第168位的氨基酸取代的修饰的细胞质Clytin(SEQ ID NO:9和11)、线粒体靶向的和细胞质野生型水母素(分别为SEQ IDNO:6和2)以及线粒体靶向的和细胞质野生型Obelin(分别为SEQ ID NO:7和4)。所述GIP受体通常结合Gs类G蛋白,刺激cAMP途径,且不结合Gq以激活钙流动。然而,GIP受体与含有来自Gαs和Gαq序列的嵌合G蛋白的共表达使得GIP受体可以刺激钙流动。
将细胞以100,000细胞/孔等分在96孔平板中,随后测定由GIP配体(10-11至10-6M)诱导的GPCR介导的生物发光,以及通过加入1%TritonX-100在存在1mM Ca2+条件下确定的总信号。不同浓度GIP与一亚组发光蛋白的剂量应答曲线结果在图5中示出。细胞质和线粒体Clytin K168D显示出比野生型发光蛋白显著较高的信号强度。这些数据证实Clytin K168D在用非天然结合钙途径分析GPCR中可以增强灵敏性。
使用全部发光蛋白获得的结果在下表2中示出,%GPCR/总信号表示由最大GIP(1μM)诱导的信号与由Triton X-100在存在1mM Ca2+条件下诱导的信号的百分比。信号与背景比率是根据由最大GIP(1μM)诱导的信号除以由单独缓冲液诱导的信号计算的。对钙的EC50值如上述图2所述确定,针对在无共转染的GPCR或者G蛋白条件下转染进HEK293T细胞中的线粒体靶向的发光蛋白进行。钙亲和性与在Clytin第168位残基的氨基酸侧链的性质相关。
具有酸性和羟基化侧链的残基如Clytin K168D、K168T和K168E与野生型Clytin、水母素和Obelin(分别为545nM、235nM和345nM)相比通常呈现出较高的钙亲和性(分别为160nM、174nM和176nM)。具有羟基化的或者无侧链的两种其它clytin突变体K168S和K168G呈现出与野生型水母素相似的钙亲和性,但是优于wt-Clytin。在wt-Clytin第168位赖氨酸由疏水性氨基酸残基(例如缬氨酸和酪氨酸)或者咪唑羧酰胺(carboxamide)侧链(例如天冬酰胺和谷氨酰胺)的取代展示出低于wt-水母素但高于野生型Clytin的钙亲和性。Clytin在第168位用碱性残基(例如组氨酸和精氨酸)的取代导致钙亲和性与野生型Clytin相似。
由配体诱导的受体介导的钙流动的EC50值通过发光(Y轴)对施加于细胞的配体浓度(X-轴)绘图,及应用反曲剂量应答曲线拟合算法(GraphPadPrism)计算。具有第168位氨基酸取代的各种修饰形式的Clytin的GPCR-介导的信号也与侧链的性质相关。此外,发光蛋白的亚细胞定位(细胞质对线粒体)看起来对于介导的信号有作用。在检测的所有线粒体靶向形式的发光蛋白中,mt-Clytin K168D产生最低EC50值及最高%GPCR/总信号、最高的信号与背景比率以及使用GIP配体的最大信号。除了Clytin K168R和野生型Clytin之外的所有其它线粒体靶向突变体产生在针对wt-水母素观测到范围内的结果。相似地,在检测的细胞质形式发光蛋白中,Clytin K168D呈现出最低EC50值和最高%GPCR/total、最高信号背景比率以及使用GIP配体的最大信号。显然,在所有其它细胞质或者线粒体发光蛋白中,细胞质Clytin K168D展示出对于GIP配体的最低EC50值和最高最大信号。
表2
实施例6:选自胰高血糖素受体、GLP-1受体、S1P2受体、EP1受体或者EP3受体的GPCR诱导的由Clytin K168D呈现的发光的比较
在另一实验中,将HEK293T细胞用质粒瞬时共转染,所述质粒含有编码举例的GPCR以及在SEQ ID NO:1第168位具有氨基酸取代的修饰形式的细胞质Clytin(SEQ ID NO:9)的cDNA,所述GPCR选自胰高血糖素受体(Genbank Accession No.NM_000160,通过RT-PCR从人肝脏RNA中分离),GLP-1受体(Genbank Accession No.NM_002062,得自CYTOMYX),S1P2受体(GenBank Accession No.NM_004230.3,得自OPEN BIOSYSTEMS),EP1受体(GenBank Accession No.NM_000995,得自OPEN BIOSYSTEMS)或者EP3受体(GenBank Accession No.NM_198716,得自OPENBIOSYSTEMS),杂交G蛋白(针对胰高血糖素受体、GLP-1受体和S1P2受体)。
在转染后48小时,将细胞用CryoMed程序降温仪(THERMOSCIENTIFIC)冷冻保存,并贮存在液氮中。随后将细胞解冻,直接铺板于含有5μM腔肠素的FreeStyle培养基(INVITROGEN)中(Thaw/Assay),或者在培养瓶中由含有10%胎牛血清的DMEM/F12、非必需氨基酸和青霉素/链霉素组成的生长培养基中,在加样腔肠素之前孵育过夜(Thaw/ON Recovery)。在加样腔肠素之后3-4小时,离心细胞,并重悬浮于具有钙和镁的HBSS中。
将细胞以100,000个细胞/孔等分于96孔平板中,随后测定由胰高血糖素受体(胰高血糖素,10-8至10-12.5M),S1P2受体(神经鞘氨醇1-磷酸盐,10-6至10-11.5M),EP1受体(前列腺素E2,10-6至10-11M)或者EP3受体(前列腺素E2,10-6至10-11M)的配体诱导的GPCR介导的生物发光,以及通过加入1%Triton X-100在存在1mM Ca2+条件下确定的总信号。
结果总结于图6A-6E及下表3中。解冻/测定表示在解冻及在测定前直接加样腔肠素的细胞的剂量应答,解冻/过夜恢复表示在加样和测定之前在生长培养基中恢复过夜的细胞的剂量应答。对于除了GLP-1受体之外的每种受体,在加样和测定之前使其恢复过夜的细胞与在解冻后立即加样和测定的细胞相比产生较高的信号。每种细胞处理方法中用于由其配体激活受体的EC50值如上述图5针对转染进具有共转染的GIP受体和G蛋白的HEK293T细胞中的细胞质clytin K168D发光蛋白所述而确定。由此计算的EC50值示于表3中,并与使用稳定表达指定受体(MILLIPORE)的细胞系在荧光钙测定中确定的EC50值对比。在发光测定中获得的数值不高于在荧光测定中获得的数值的4倍。在胰高血糖素受体和S1P2情况中,发光测定与荧光测定相比EC50值低6-100倍,表示在一些情况中发光测定在检测钙流动方面比传统荧光方法呈现出更高的灵敏性。
表3
实施例7:由如下GPCR诱导的由Clytin K168D呈现出的发光的比较:CXCR1受体、CXCR4受体、GIP受体、GLP-1受体、胰高血糖素受体或者EP1受体
在另一实验中,将HEK293T细胞用质粒瞬时共转染,所述质粒含有编码举例的GPCR以及在SEQ ID NO:1第168位具有氨基酸取代的修饰形式的细胞质Clytin(SEQ ID NO:9)的cDNA,所述GPCR选自GIP受体(GenbankAccession No.NM000164,得自OPEN BIOSYSTEMS),CXCR1受体(Genbank Accession No.M68932,得自OPEN BIOSYSTEMS),CXCR4受体(GenBank Accession No.M99293,得自OPEN BIOSYSTEMS),胰高血糖素受体(见实施例6),GLP-1受体(见实施例6),以及EP1受体(见实施例6),杂交的G蛋白(例如在GIP受体、CXCR1受体和CXCR4受体情况中)。在转染后大约48小时,将细胞用CryoMed程序降温仪(THERMO SCIENTIFIC)冷冻保存,并贮存在液氮中。
在另一实验中,将表达D2受体和杂交G蛋白的CHO-K1细胞(MILLIPORE,目录号HTS039C)用在SEQ ID NO:1第168位具有氨基酸取代的修饰形式的细胞质Clytin(SEQ ID NO:11)转染。通过嘌呤霉素抗性选择含有稳定整合的Clytin质粒的细胞,进行有限稀释克隆以获得克隆细胞系,从中选择具有最高多巴胺诱导的发光的克隆。将细胞用CryoMed程序降温仪(THERMO SCIENTIFIC)冷冻保存并贮存在液氮中。
将转染的和冷冻的细胞解冻,以100,000个细胞/孔铺板在聚-D-赖氨酸包被的96孔平板中,在由含有15%胎牛血清的DMEM/F12、非必需氨基酸和青霉素/链霉素组成的生长培养基中培养过夜。随后将细胞加样腔肠素培养4小时,测定由胰高血糖素(Glucagon,10-8至10-12.5M)、GIP受体(GIP,10-6至10-12)、GLP-1受体(GLP-1,10-6至10-12)、CXCR1受体(白细胞介素-8,10-7至10-13M)、EP1受体(前列腺素E2,10-6至10-11M)、CXCR4受体(SDF-1α,10-6至10-11M)或者D2受体(多巴,10-4至10-10.5M)的配体诱导的GPCR介导的生物发光。图中描述的生物发光数据是在FLIPRTetra Plus高通量发光平板分析仪(MOLECULAR DEVICES)上获得的。
结果在图7A-7G中示出。使用FLIPRTetra Plus平板分析仪针对胰高血糖素受体、GLP-1受体和EP1前列腺素受体获得的数值与使用Victor2平板分析仪(WALLAC,PERKINELMER)在图6中获得的那些数值相似。
实施例8:多种发光蛋白变体呈现的发光及由离子通道诱导的发光的比较
在另一实验中,将稳定表达TRPA1阳离子通道的HEK293细胞(Accession No.NM_007332,得自MILLIPORE)用质粒瞬时共转染,所述质粒含有编码如下一组发光蛋白的cDNA,所述发光蛋白包括线粒体靶向的野生型Clytin(mt-Clytin)、在SEQ ID NO:1(SEQ ID NO:10)第168位具有赖氨酸置换为天冬氨酸突变的修饰的线粒体靶向的Clytin,细胞质野生型Clytin(SEQ ID NO:1)、在第168位具有赖氨酸置换为天冬氨酸突变的修饰的细胞质Clytin(SEQ ID NO:9)以及线粒体靶向的和细胞质野生型水母素(分别为SEQ ID NO:6和2)。
将细胞以50,000个细胞/孔等分在96孔平板中,随后测定由AITC配体(10-6至10-3.5M)诱导的离子通道介导的生物发光。不同浓度AITC的剂量应答曲线的结果在图7中示出。细胞质Clytin K168D展示出比细胞质野生型Clytin低的EC50值。此外,细胞质Clytin K168D呈现出比细胞质和线粒体水母素较高的信号。这些数据证实Clytin K168D在举例的钙控制的离子通道分析中增强灵敏性。
本说明书结合文中提及并入本文作参考的参考文献进一步理解。本说明书内的实施方案提供了本发明举例的实施方案,不应解释为限制本发明范围。技术人员易于认识到本发明涵盖的许多其它实施方案。所有出版物和发明均以其全部内容通过引用并入本文。如果通过引用并入的材料于本说明书相矛盾或不一致,以本说明书为准。本文任何参考文献的引述不是承认这些参考文献是本发明的现有技术。
除非特别指出,本发明说明书包括权利要求书中使用的表示整数、细胞培养、处理条件等的所有数字在所有情况中均应理解为是“大约”数值。因此,除非特别指出,则数字参数是近似值,可以根据试图通过本发明获得的希望的性质加以变化。除非特别指出,在一系列元素之前的术语“至少”应理解为是指该系列的每一元素。本领域技术人员仅使用常规实验将认可或者能确定与本文所述本发明具体实施方案的等价物。这种等价物涵盖在权利要求书范围内。
如本领域技术人员已知,在不偏离本发明精神和范围条件下可以对本发明进行许多修改和变化。本文描述的具体实施方案只是例证本发明而无任何限制之意。本说明书和实施例只是举例,本发明的真正范围和精神在所附权利要求书中阐明。
Claims (35)
1.修饰的发光蛋白,其包含SEQ ID NO:1所示氨基酸序列中至少第168位赖氨酸由除组氨酸、精氨酸和赖氨酸之外的氨基酸置换的氨基酸序列;其中所述修饰的发光蛋白与包含SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的发光蛋白相比呈现出增强的对细胞内钙的亲和性以及增强的生物发光。
2.修饰的发光蛋白,其包含SEQ ID NO:1所示氨基酸序列中至少第168位赖氨酸由天冬氨酸置换的氨基酸序列;其中所述修饰的发光蛋白与包含SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的发光蛋白及与包含SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的发光蛋白相比均呈现出增强的对细胞内钙的亲和性以及增强的生物发光。
3.权利要求1的修饰的发光蛋白,其中所述修饰的发光蛋白对细胞内钙的EC50值为500nM或者更低,且其中所述修饰的发光蛋白不包含SEQID NO:2所示氨基酸序列或其变体或衍生物。
4.权利要求1的修饰的发光蛋白,其包含选自以下的氨基酸序列:SEQID NO:9(K168D)、SEQ ID NO:11(K168E)、SEQ ID NO:15(K168G)、SEQ IDNO:17(K168N)、SEQ ID NO:19(K168Q)、SEQ ID NO:21(K168S)、SEQ IDNO:23(K168T)、SEQ ID NO:25(K168V)和SEQ ID NO:27(K168Y)。
5.权利要求1的修饰的发光蛋白,其中所述氨基酸修饰位于所述发光蛋白的EF hand III结构域内。
6.权利要求2的修饰的发光蛋白,其中所述氨基酸修饰位于所述发光蛋白的EF hand III结构域内。
7.权利要求1的修饰的发光蛋白,其中所述修饰的发光蛋白与包含SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的发光蛋白相比呈现出对细胞内钙的亲和性增加2%、或者3%、或者4%、或者5%、或者10%、或者20%、或者25%、或者30%、或者40%、或者50%、或者60%、或者70%、或者80%、或者90%、或者90%以上。
8.权利要求2的修饰的发光蛋白,其中所述修饰的发光蛋白与包含SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的发光蛋白相比呈现出对细胞内钙的亲和性增加2%、或者3%、或者4%、或者5%、或者10%、或者20%、或者25%、或者30%、或者40%、或者50%、或者60%、或者70%、或者80%、或者90%、或者90%以上。
9.权利要求1的修饰的发光蛋白,其中所述修饰的发光蛋白与包含SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的发光蛋白相比呈现出生物发光增加2%、或者3%、或者4%、或者5%、或者10%、或者20%、或者25%、或者30%、或者40%、或者50%、或者60%、或者70%、或者80%、或者90%、或者90%以上。
10.权利要求2的修饰的发光蛋白,其中所述修饰的发光蛋白与包含SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的发光蛋白相比呈现出生物发光增加2%、或者3%、或者4%、或者5%、或者10%、或者20%、或者25%、或者30%、或者40%、或者50%、或者60%、或者70%、或者80%、或者90%、或者90%以上。
11.权利要求1的修饰的发光蛋白,其中所述对细胞内钙的亲和性及生物发光是在用编码权利要求1的修饰的发光蛋白的核酸分子转染的细胞中测量的。
12.权利要求2的修饰的发光蛋白,其中所述对细胞内钙的亲和性及生物发光是在用编码权利要求1的修饰的发光蛋白的核酸分子转染的细胞中测量的。
13.权利要求1的修饰的发光蛋白,其中所述对细胞内钙的亲和性及生物发光是在用编码权利要求2的修饰的发光蛋白的核酸分子转染的细胞中测量的。
14.权利要求2的修饰的发光蛋白,其中所述对细胞内钙的亲和性及生物发光是在用编码权利要求2的修饰的发光蛋白的核酸分子转染的细胞中测量的。
15.权利要求11的修饰的发光蛋白,其中所述细胞选自CHO细胞、HEK293T细胞、HeLa细胞、NIH3T3细胞和U-2OS细胞。
16.权利要求12的修饰的发光蛋白,其中所述细胞选自CHO细胞、HEK293T细胞、HeLa细胞、NIH3T3细胞和U-2OS细胞。
17.权利要求13的修饰的发光蛋白,其中所述细胞选自CHO细胞、HEK293T细胞、HeLa细胞、NIH3T3细胞和U-2OS细胞。
18.权利要求14的修饰的发光蛋白,其中所述细胞选自CHO细胞、HEK293T细胞、HeLa细胞、NIH3T3细胞和U-2OS细胞。
19.编码权利要求1的修饰的发光蛋白的核酸分子。
20.编码权利要求2的修饰的发光蛋白的核酸分子。
21.包含权利要求19的核酸分子的载体。
22.包含权利要求20的核酸分子的载体。
23.用权利要求21的载体转染的哺乳动物细胞。
24.用权利要求22的载体转染的哺乳动物细胞。
25.用于检测细胞中钙流动的体外方法,所述方法包括:a)提供表达权利要求1的修饰的发光蛋白的细胞;b)使所述细胞与导致钙流动的物质接触;以及c)检测所述发光蛋白的生物发光,其中所述生物发光表示存在钙流动。
26.用于检测细胞中钙流动的体外方法,所述方法包括:a)提供表达权利要求2的修饰的发光蛋白的细胞;b)使所述细胞与导致钙流动的物质接触;以及c)检测所述发光蛋白的生物发光,其中所述生物发光表示存在钙流动。
27.用于筛选调节GPCR或者离子通道活性的化合物的方法,所述方法包括:a)提供表达权利要求1的修饰的发光蛋白的细胞;b)使所述细胞与候选化合物接触;以及c)检测所述发光蛋白的生物发光,其中所述发光蛋白的生物发光在存在候选化合物条件下的变化表示所述化合物调节GPCR或者离子通道活性。
28.用于筛选调节GPCR或者离子通道活性的化合物的方法,所述方法包括:a)提供表达权利要求2的修饰的发光蛋白的细胞;b)使所述细胞与候选化合物接触;以及c)检测所述发光蛋白的生物发光,其中所述发光蛋白的生物发光在存在候选化合物条件下的变化表示所述化合物调节GPCR或者离子通道活性。
29.权利要求25的方法,其中所述钙流动是由调节任何GPCR或者离子通道的活性导致。
30.权利要求26的方法,其中所述钙流动是由调节任何GPCR或者离子通道的活性导致。
31.权利要求27的方法,其中所述GPCR选自H1组胺受体、GIP受体、GLP-1受体、胰高血糖素受体、S1P2鞘氨醇1-磷酸受体、CXCR1趋化因子受体、CXCR4趋化因子受体、D2多巴胺受体、EP1受体、EP3前列腺素受体以及TRPA1阳离子通道。
32.权利要求1的修饰的发光蛋白,其包含位于所述发光蛋白N末端的线粒体靶向序列。
33.权利要求2的修饰的发光蛋白,其包含位于所述发光蛋白N末端的线粒体靶向序列。
34.权利要求32的修饰的发光蛋白,其中所述线粒体靶向序列包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。
35.权利要求33的修饰的发光蛋白,其中所述线粒体靶向序列包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。
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