CN101142480A - 测定变态反应的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种通过测定人IgE致敏细胞在被食物中的变应原激活时的脱粒程度从而测定变态反应的方法。

Description

测定变态反应的方法

技术领域

本发明涉及变态反应领域，尤其是食物变态反应领域。本发明提供了一种体外方法，该方法用以确定当受试者接触一种特定食品时是否会表现出变态反应。本发明还提供了一种开发具有良好变应性的食品的方法。

背景技术

食物变态反应是一种发生于易敏感个体中的有害免疫反应，这种变态反应是由摄入食物中诱发变态反应的物质造成的，并能造成皮炎，哮喘，消化道阻塞，过敏性休克等等。食物变态反应最初被称为I型变态反应，即一种由IgE抗体介导的免疫障碍，其中IgE抗体与摄入体内的食物变应原反应。近年来食物变态反应的病人数量持续上升，食物变态反应的现象在医学和食品工业领域引起严重的问题。

引发变态反应的食物包括蛋类，乳品，肉类，鱼，甲壳类和软体类动物，谷物，豆类和坚果，水果，蔬菜，明胶，酵母(啤酒)等。类似地，卵清蛋白，卵类粘蛋白，溶菌酶，酪蛋白，β-乳球蛋白，α-乳白蛋白，谷物蛋白，α-淀粉酶抑制剂等被认为是引发变态反应的食物组份。

尽管已开发出多种测试方法，但食物变态反应的诊断领域还存在很多不足。很多情况下，患者自己注意到其症状与某些变应原间的联系，例如通过观察到摄入可疑变应原时随即产生的不良反应或者通过排除以及再次接触变应原来源。因此，详细的回忆通常非常有助于确诊。

食物变态反应的诊断以多种部分补充的方法进行。除回忆外，还可通过体内测量和体外分析进一步诊断。用食物变应原提取物进行皮肤测试是最常用的一种体内技术。有时需要用口腔诱发法来确定哪些食物成份是所观察到的变态反应的病原因子。开发具有良好变应性的食品需要进行双盲试验，以安慰剂作对照进行食物诱发测试。最常用的体外测试是RAST和ELISA。在这些测试中，潜在的变应性抗原物质被固定到一种固相上(例如，琼脂糖凝胶，磁性颗粒，聚苯乙烯板等)。将所述固相与病人血清进行培养，之后通常测量特异性IgE抗体的结合。

特别地，所述ELISA方法存在一些缺点。比如该方法不能总检测到食物变态反应患者敏感的变应原。换句话说，该方法不能总检测到患者的IgE抗体所识别的物质。同时，该方法只能检测出已知的变应原，并且每种方法只能检测一种变应原。此外，该方法使用检测单一抗原的抗体，不能用于检查含有未知抗原的引发变态反应的食物(例如，一种使用单一抗体的方法，该抗体是通过暴露于位于蛋白中的卵清蛋白而制得的，这种方法不适用于检查蛋黄以及例如蛋黄酱等)。所述使用检测单一抗原的抗体的方法不适用于检查经加工的食品，因为这些方法不能检测变性的或有分子修饰的变应原。

虽然已经识别出了很多变应原，其中有一些已被分离并深入到分子水平研究其特性。然而，在实践中，通常只需识别某种特定食品作为变应原来源就足够了，比如含有几种已知的变应原蛋白的牛奶。

对于诱发测试，具体的情况会产生具体的问题，例如变态反应可能延迟或非常弥散或是复杂临床症状的一部分。在第一种情况中，当变态反应延迟时，就很难将变态反应与引发变态反应的特定食物联系起来。通常，变态反应的症状类似于诸如头痛，疲劳和关节痛等常见问题的症状。还有可能同种物质会产生不同的反应或者至少不能每次都产生相同的反应。可以想象，对于医生和患者而言要确诊既困难，费时，还经常失败。

此外，对于病危的患者，医生迫不得已才会采用诱发测试。而且，几乎不可能将一种临床症状或陈述与真正的变态反应可靠地联系起来，尤其是涉及到婴儿，更尤其是病危婴儿时。

Takagi et al.(2003)Biol.Pharm.Bull.Vol 26(2)，p252中描述了转染了人FcεRIα-链的RBL-2H3细胞在检测可结合受体的血清IgE中的应用。用变态反应患者的热灭活血清致敏所述转染的细胞，并用抗人IgE的抗体进行刺激。在测定具有不同稀释度的血清样本中的脱粒(degranulation)程度的β-氨基己糖苷酶分析中获得了矛盾的结果。没有针对食物变态反应的具体进展。

Aketami et al.(2001)Immunology Letters vol 75，p185将钙浓度与脱粒相联系，所述脱粒是通过在RBL-2H3细胞系统中的β-氨基己糖苷酶测试进行测量的，所述RBL-2H3细胞系统用在小鼠中产生的特异针对鸡蛋白蛋白的血清致敏。

Dibbern et al.J.Immunological Methods，(2003)vol 274，p 37描述了表达完整的人FcεRI受体的细胞。用来自被花生变应原刺激的花生敏感型患者的血清致敏所述细胞，通过测定氚标记的5-羟色胺测量所述细胞的脱粒程度。

发明内容

目前已经发现可以用一种体外测试测定受试者对一种食品的变态反应，该测试是通过用一种含该受试者血清的样品致敏具有脱粒能力的细胞。将所述致敏的细胞与例如一种食品进行培养，通过测定该致敏细胞的脱粒程度，可以确定所述受试者对某种变应原具有IgE介导的反应，或者在所述食品中含有变应原。

本发明方法的一个主要优势在于它可以测定对于一种“完整”的食品的变态反应。这种方法尤其适合于尚未知其是否会对食物变应原发生变态反应的患者以及处于病危状态的患者。这些患者对于食品的变态反应可能引起更大的应激导致病情恶化甚至死亡。因此，如果病危患者住院，那么确定这些患者是否为变态反应或确定哪些食品具有良好的变应性就非常重要。此外，有一部分无完整记录的食物变态反应史的受试者是婴儿，本发明的方法对于这部分受试者尤其具有优势，尤其是当这些婴儿病危并例如住院时。因此，本发明的方法尤其适合于测试完全营养食品，例如婴儿乳品配方，管饲营养配方和临床营养。

本发明的另一优势在于产品开发领域。通过混合来自一群对例如乳品有变态反应的受试者的血清，可获得一种具有多种变态反应特异性的混合血清。用这种混合的血清致敏具有脱粒能力的细胞，并测试不同食物组份的脱粒程度，可以开发出一种具有最良好的变应性的食物组份。

因此本发明涉及一种测定受试者变态反应的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)将有脱粒能力的细胞与含有人IgE的水溶液进行培养，从而获得致敏细胞；

(b)将步骤(a)中获得的致敏细胞与一种变应原进行培养，所述变应原包括一种成分，所述成分选自一种或多种来自乳品，蛋类和水果的成分；

(c)测定脱粒的程度。

另一方面，本发明涉及一种开发具有良好变应性的食品的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)将有脱粒能力的细胞与含有人IgE的水溶液进行培养，从而获得致敏细胞；

(b)将步骤(a)中获得的致敏细胞与一种食品组合物进行培养；

(c)测定脱粒程度；

(d)如果所述食品的变应性不合适，可任选地重复步骤(a)、(b)和(c)，其中在步骤(b)中使用一种不同的食品组合物；

(e)任选地重复步骤(d)一次或多次，直至获得一种具有良好的变应性的食品产物。

本发明还涉及一种用以实现本发明方法的成套试剂盒(kit of parts)，所述成套试剂盒包括至少一种含有乳品，蛋类或水果的营养组合物以及脱粒检测方法，所述脱粒检测方法选自测定胞外和/或胞内Ca²⁺浓度的方法，进行同位素分析的方法和/或测定β-氨基已糖苷酶活性的方法。

具体实施方式

细胞

具有脱粒能力的细胞主要指肥大细胞和血液嗜碱性细胞。脱粒是变态反应中的主要现象。IgE抗体与肥大细胞和嗜碱性细胞表面的高亲和性的IgE受体的结合，以及随之的受体交联是脱粒过程中的第一步，在此过程中释放引发I型变态反应的物质。因此，稳定的人肥大细胞和嗜碱性细胞的细胞系是适合于本发明方法的细胞。目前这样的细胞系不是现成的，需要从新鲜收集的外周血中制备或由人脐带血CD34⁺祖细胞逐渐获得。因此，优选地，通过与癌细胞系融合使这些细胞永生化。

在这些具有脱粒能力的细胞中一个关键的因素是IgE受体的存在，尤其是FcεRI的存在，FcεRI通常以四聚体形式(αβγ₂)或三聚体形式(αγ₂)表达。优选地，IgE受体至少有一部分能结合人IgE(hIgE)。IgE的α-链结合IgE，γ-链转导信号。已有研究表明当非人嗜碱性细胞转染人FcεRI的α-，β-，γ-链时(Dibbern et al.supra)，或甚至只转染FcεRI的α-链时(Takagi et al.supra)，所述非人嗜碱性细胞能表现出人IgE-依赖型的脱粒。尤其是所述非人嗜碱性细胞是来自啮齿动物的嗜碱性细胞，优选地来自大鼠，尤其是鼠嗜碱性白血病细胞(RBL)。因此，在一个实施方案中，所述具有脱粒能力的细胞是转染了人FcεRI的嗜碱性细胞，优选地转染了人FcεRI的α-链。在另一个实施方案中，所述具有脱粒能力的细胞来自啮齿动物，优选地该细胞为RBL-细胞。

致敏作用

在本发明的方法中，用一种包含人IgE的水溶液致敏具有脱粒能力的细胞。优选地，所述水溶液包括来自受试者的血清，优选地，是来自人受试者的血清，更优选地是来自婴儿的血清。为了评价一种食品是否含有变应原，例如在开发具有良好变应性的食品的过程中，优选地使用来自一群受试者的血清，即混合血清，尤其是来自已知对某种食品有变态反应的受试者。

变应原

目前在诊断受试者的变态反应时，需要用纯化或分离的变应原，与此不同的是，本发明方法提供了评价对于完整食品的变态反应的可能性。当测试对于含有很多种具有多个变态反应诱导表位的组份的食品的变态反应时，这种方法尤其有用。本发明方法还适用于从多种营养产品中选出引发较少变态反应的营养产品。因此，本发明方法具体地适用于测定对于存在于乳品，蛋类和水果中的变应原的变态反应，并由此测定对基于乳品，蛋类和水果的食品或包含这些成份的食品的变态反应。

在一个特别优选的实施方案中，测定了对一种完整营养组合物的变态反应，所述完整营养组合物即一种包含蛋白质，碳水化合物和任意脂肪的产品。优选地，所述营养组合物以粉末或液体形态进行测试，并且优选地包含干重的2至50wt％的蛋白、干重的5至50wt％的脂质、和维生素，优选地还包括矿物质。本发明方法中优选地使用包含乳蛋白的营养组合物，优选地包括营养组合物干重的至少1wt％的乳蛋白，尤其是酪蛋白，乳清和/或水解乳蛋白。

脱粒

在本技术领域中有多种测量脱粒的方法。肥大细胞和嗜碱性细胞释放出的颗粒的特征在于它们含有β-氨基己糖苷酶，5-羟色胺和组胺。颗粒的释放是一个钙离子依赖型过程。肥大细胞和嗜碱性细胞脱粒时发生的生化变化包括动员Ca²⁺，提高磷脂代谢，释放花生四烯酸，产生环AMP以及活化蛋白激酶。在本发明方法中，任何能够测量上述任意过程的方法都可适用。特别地，可以测定胞外和/或胞内Ca²⁺浓度(Aketani et al.supra)，和/或进行同位素分析例如测定氚标记的5-羟色胺的存在(Dibbern et al.supra)，和/或测定β-氨基己糖苷酶活性(Takagi et al.supra；Marchand et al.Allergy(2003)1037)，以此作为脱粒程度的测量方法。优选地，用4-甲基伞形酯-N-乙酰基-β-D-氨基葡萄糖苷(4-methylumbelliferyl-N-acetyl-β-D-glucosaminide)测定β-氨基己糖苷酶活性；优选地，用Fura-2 AM(如下所示)测定胞外和/或胞内Ca²⁺浓度；优选地，在同位素分析中使用[³H]5-羟色胺。

为方便起见，脱粒程度用相对于“阳性”对照(用纯的人IgE致敏并用抗人IgE进行刺激)的百分比表示。

通常，本领域技术人员清楚怎样的变应性被认为是良好的。根据经验可认为，如果脱粒程度明显高于同一脱粒测试中测量到的合适的阴性对照样本的脱粒程度，那么这种变应性就不是良好的；所述阴性对照样本通常为非变态反应受试者的血清样本或来自多个非变态反应受试者的混合血清。一种优选的良好变应性的量度为，脱粒程度小于阳性对照脱粒程度的50％，优选地小于30％；所述阳性对照通常为同一测试中的纯化的IgE。

同样的原则也适用于确定一个受试者对一种食品是否表现出变态反应。可以认为如果脱粒程度是阳性对照脱粒程度的至少30％，优选地为50％，则该受试者表现出变态反应；所述阳性对照通常为同一测试中的纯化的IgE。优选地，可认为如果脱粒程度明显高于同一脱粒测试中测量到的合适的阴性对照样本的脱粒程度，则该受试者表现出变态反应；所述阴性对照样本通常为非变态反应受试者的血清样本或来自多个非变态反应受试者的混合血清。

受试者

本发明方法尤其适用于测定年龄在0至10岁间的儿童的变态反应，优选地，是年龄在0至4岁间的婴儿。本发明方法能有利地用于测定6至36个月大的婴儿的变态反应。因此，本发明方法还能适用于婴儿福利中心为个体婴儿推荐最佳的营养。

本发明方法还尤其适用于测定病危患者对一种食品的变态反应。在一个更优选的实施方案中，本方法可用以防止患者发生过敏性休克。优选地，所述待检测的水溶液包括来自患有哮喘，心脏病，糖尿病和/或动脉粥样硬化的患者的血清。这些病人尤其还经受着变态反应造成的不良效果。

成套试剂盒

另一方面，本发明还提供了一种适用于本文中所述方法的成套试剂盒。所成套述试剂盒包括至少一种营养组合物，优选为至少两种，更优选地为3至10种；以及测定胞外和/或胞内Ca²⁺浓度的方法，和/或进行同位素分析的方法和/或测定β-氨基已糖苷酶活性的方法。优选地，以每种营养组合物0.1至100克之间的量提供所述营养组合物。优选地，所述成套试剂盒包含一种适用于其中一种所述测试的成份，该成份选自4-甲基伞形酯-N-乙酰基-β-D-氨基葡萄糖苷、Fura-2 AM和[3H]5-羟色胺。Fura-2 AM为1-[6-氨基-2-(5-羧基-2-噁唑基)-5-苯并呋喃基氧]-2-(2’-氨基-5’-甲基苯氧基)-乙烷-N，N，N’，N’-四乙酸五乙酰甲酯(CAS编号：108964-32-5)。

在一个实施方案中，所述脱粒检测方法可被根据本发明方法测量脱粒的说明书代替，或者可以用这种说明书作为该试剂盒的补充。在另一个实施方案中，所述营养组合物可被一系列至少两种或多种组合物代替，所述组合物系列代表了已知的变应原。因此，这样一个组合物系列不需要由营养组合物本身组成，而是可以包括产生变态反应的纯的或分离的或单个的抗原决定基。

实施例

实施例1：用变态反应和未变态反应患者的血清诱发脱粒作用

用于产品开发和替代变态反应型的脱粒模型

以下系统可用于检测食品变应原以及测定变态反应患者的反应性测试：

脱粒细胞培养于无Geneticin培养基中(选择性标记)1至2天，用优选地被一定程度稀释的一种来源的IgE(纯化的个体血清和/或混合血清组)过夜致敏细胞。如果是产品开发，则所述血清优先地分离自变态反应患者，尤其是牛奶或蛋类的变态反应供者。用PIPES缓冲液(和/或Tyrode缓冲液)洗涤含有IgE的相应致敏细胞几次，以除去未结合的IgE。所述细胞再用变应原刺激30分钟至1小时，该变应原可以是纯化的变应原，但优先使用待开发的食物组合物的商品食品。典型的变应原浓度范围为0-1000ng/ml。将被刺激细胞的上清液移至专用于荧光检测的96孔板上，并在37℃与底物4-甲基伞形酯-N-乙酰基-β-D-氨基葡萄糖苷培养30分钟至1小时。用甘氨酸缓冲液终止反应，并用荧光板读数器在360nm激发波长和460nm发射波长下测定荧光值。

如Takagi et al.(2003)Biol.Pharm.Bull.252中所述，用人FcεRIα-链转染RBL-2H3细胞系。为验证原理，用纯化的食物成份建立上述测试系统。随后该系统用于检测对一些商品中的食品产生的变态反应(例如Nutrilon^婴儿营养品)。

检测食物变应原，主要为乳品及其衍生物(酪蛋白，乳清蛋白等)。用相对于固定浓度的阳性对照(纯人IgE)的百分比表示脱粒程度。

检测1/50-1/320稀释范围的个体血清以及混合血清。在这些稀释浓度范围内，对于一种固定浓度的变应原来说，脱粒是剂量依赖型的。相反的，无论用何种浓度进行测试，用于致敏脱粒细胞的非变应性血清，在加入变应原后并不会引发脱粒。

此外，用变应性血清测试所观察到的脱粒是一种动态现象，其中受刺激的细胞保持良好的形状，细胞还能存活。

整个脱粒测试中都使用了对照。只有IgE或只有变应原存在的情况下，细胞的脱粒不高于背景水平。在所述体外系统的检测中，一直存在于培养基中的抗生素(青霉素/链霉素)也不产生显著的干扰。

表1总结了商品测试的结果，其中的数值表示相对于设定为100％的“阳性”对照(用纯的人IgE致敏并用抗人IgE进行刺激)的百分比。

表1

当对比不同试验组时，用个体变应性血清或混合血清致敏细胞所诱发的脱粒与用非变态反应血清产生的脱粒背景水平相比具有显著性差异(分别为p＜0.005和p＜0.0001)。使用完整的乳品以及商业食品(Nutrilon^)也测量到了这种显著性差异。

实施例2：对牛奶有变态反应(CMA)的患者的血清、不是对牛奶有变态 反应的变态反应患者的血清以及非变态反应患者的血清诱发的脱粒。

该方法按照实施方案1所述进行。试验结果如表2所述，该结果表明本方法适用于检测病人个体对具有完全营养的产品的变态反应。不是对牛奶变态反应的变态反应患者确实表现出阴性结果，这说明了本方法的可靠性。

表2

实施例3：成套试剂盒：

成套试剂盒包括：

(1)一个含有1克Nutrilon 2^TM(Nutricia，Zoetermeer，Netherlands)的包装；

(2)一个含有1克Nutrilon Hypo-Allergeen^TM(Nutricia，Zoetermeer，Netherlands)的包装；

(3)一个含有1克Neocate^TM(Nutricia，Zoetermeer，Netherlands)的包装；

(4)4-甲基伞形酯-N-乙酰基-β-D-氨基葡萄糖苷(来自Fluka，Sigma-Aldrich)。

Claims (12)

1.一种测定受试者体内的变态反应的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)将有脱粒能力的细胞与含有人IgE的水溶液进行培养，从而获得致敏细胞；

(b)将步骤(a)中获得的致敏细胞与一种变应原进行培养，所述变应原包括一种成分，所述成分选自一种或多种来自乳品，蛋类和水果的成分；

(c)测定脱粒的程度。

2.一种开发具有良好变应性的食品的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)将有脱粒能力的细胞与含有人IgE的水溶液进行培养，从而获得致敏细胞；

(b)将步骤(a)中获得的致敏细胞与一种食品组合物进行培养；

(c)测定脱粒程度；

(d)如果所述食品的变应性不合适，可任选地重复步骤(a)、(b)和(c)，其中在步骤(b)中使用一种不同的食品组合物；

(e)任选地重复步骤(d)一次或多次，直至获得一种具有良好的变应性的食品产物。

3.根据权利要求1或2的方法，其中所述具有脱粒能力的细胞选自肥大细胞和嗜碱性细胞。

4.根据前述权利要求任一项的方法，其中所述变应原是一种营养组合物，该组分包括干重的2至50wt％的蛋白质，干重的10至90wt％的碳水化合物，任选地干重的5至50wt％的脂质以及任选地维生素。

5.根据前述权利要求任一项的方法，其中所述具有脱粒能力的细胞是转染了人FcεRI的α-链的嗜碱性细胞。

6.根据前述权利要求任一项的方法，其中所述具有脱粒能力的细胞来自啮齿动物，优选地，所述细胞为RBL-细胞。

7.根据前述权利要求任一项的方法，其中所述含有人IgE的水溶液含有一个受试者的血清。

8.根据前述权利要求任一项的方法，其中所述含有人IgE的水溶液含有来自一群受试者的混合血清。

9.根据前述权利要求任一项的方法，其中所述受试者是年龄为0-10岁的儿童，优选地为年龄为0-4岁的婴儿。

10.根据前述权利要求任一项的方法，其中所述步骤(b)中的致敏细胞与含有乳品、蛋类或水果的食品产物一起培养，或与基于乳品、蛋类和水果的食品一起培养。

11.根据权利要求1-8任一项的方法，其中所述步骤(b)中的致敏细胞与含有10至60en％的脂质、5至50en％的蛋白质和15至90en％的碳水化合物的食品组合物一起培养。

12.适用于根据权利要求1-11任一项的方法的成套试剂盒，所述成套试剂盒包括至少一种含有乳品、蛋类或水果的营养组合物以及脱粒检测方法，所述方法选自测定胞外和/或胞内Ca²⁺浓度的方法，进行同位素分析的方法和/或测定β-氨基已糖苷酶活性的方法。