TWI425094B - 鑑定調控蛋白質－蛋白質相互作用之分子 - Google Patents

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Description

鑑定調控蛋白質一蛋白質相互作用之分子
本發明係關於確定所研究的分子之間相互作用之材料和方法。更具體地說，本發明涉及確定一種特定的物質，即“測試化合物”是否能夠調控感興趣的兩個或更多特定蛋白質的相互作用。確定蛋白質的相互作用涉及到監視報導基因的激活，報導基因可存在於細胞中、溶液中或人工反應包中，或者在一個包含一個或多個感興趣的反應物的單元中，其中報導基因激活與否取決於調控作用是否發生。一般是使用轉形或轉染的細胞來測定，以及用來轉形或轉染細胞的試劑，均屬於本發明的一個方面。還可以採用一種無細胞的系統，或利用人工反應包或帶有一種或多種感興趣的試劑，如病毒、病毒狀顆粒、脂質體等的單元之系統。
透過配體對受體的識別進行的蛋白質/蛋白質相互作用的研究是一個具有濃厚興趣的領域。即使一個特定受體的一個或多個配體為已知，我們仍然希望能夠識別出更有效或更具選擇性的配體。本文將對G-蛋白偶聯的受體GPCR，亦稱為七跨膜受體(7TMR)作為一類可以這種方式特徵化之蛋白質的一個非排他性實例進行討論。但是，任何能夠產生相互作用的蛋白質，如一個代謝通道或一個級聯的成員，均可用於此項測試。
GPCR是已知的人類最大類的細胞表面受體，因此被認為是本發明的主要應用對象。透過GPCR調控信號發送的配體包括荷爾蒙、神經傳遞素、肽、醣蛋白、脂質、核苷和離子。GPCR已知為感知受體，即光、味道、費洛蒙和口味的感受體。由於它們具有如此眾多而多種多樣的作用，GPCR是許多研究的對象，例如，化學戰防護和生物戰防護應用，以及可用來治療各種病症的藥物。已經成功地發現了很多藥物。例如，Howard,et al.估計，50%以上的上市藥物均作用於這些受體(Trends Pharmacol. Sci., 22:132 140(2001).
此處的“GPCR”係指GPCR受體總科的任何成員。這一總科的特徵是有7個跨膜功能部位(7TM)結構。這些受體的實例包括但不限於，A類或“視網膜紫質樣”受體；B類或“分泌素樣”受體；C類或“代謝穀胺酸酯樣”受體；Frizzled和Smoothened相關的受體；黏著受體科或EGF-7TM/LNB-7TM受體；脂聯素受體和相關的受體；以及化學感應受體，包括氣味、味道、犁鼻和費洛蒙受體。例如，人類的GPCR總科包括但不限於以下作者所描述的受體分子:Vassilatis,et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100:4903 4908(2003);Takeda,et al.,FEBS Letters ,520:97 101(2002);Fredricksson,et al.,Mol. Phαrmacol., 63:1256 1272(2003);Glusman,et al.,Genome Res .,11:685 702 (2001);以及Zozulya,et al.,Genome Biol .,2:0018.1 0018.12(2001)。
簡單說來，GPCR功能的作用機制如下：1)GPCR與配體結合，2)引起構象變化，因而3)激發一系列導致細胞生理學變化的細胞事件。GPCR透過調控一批細胞間蛋白質，如異質三聚體鳥嘌呤核苷酸的結合蛋白(G蛋白)和β抑制蛋白(β arrestins)的活性而轉換信號。就G蛋白質來說，配合體-受體復合物激發鳥嘌呤核苷酸交換，並造成G蛋白質的異質三聚體分解為α和βγ子單元。其他情況下，β抑制蛋白可替代G蛋白質，使G的信號反向，增強G蛋白質信號等。
業已觀察到GTP結合的α子單元和βγ異質二聚體均可調節各種細胞效應物蛋白質，包括腺苷醯環化酶和磷脂酶C(PLC)。在傳統的基於細胞的GPCR測試中，受體活性是透過測定G調節的效應物通道的輸出，如由腺苷醯環化酶產生的cAMP的積聚或由PLC活性刺激而造成的分子間鈣的釋放來測定的。
由於種種原因，對有些測試對象，很難研發出傳統的基於G蛋白的信號轉換測試方法。例如，首先不同的GPCR偶聯到不同的G蛋白調節的信號通道。傳統的基於G蛋白的測試方法需要了解目標受體G蛋白的特異性，或者測試方法要求對細胞系統進行設計，強制將目標受體結合到選定的G蛋白效應物通道上。第二，由於GPCR總科是如此之大，所有細胞都表現許多內生的GPCR(以及其他受體和信號發送因子)。因此，除了目標GPCR之外，測得的效應物通道還可能被內生分子調控。這一現象可能引起假陽性或假陰性結果，如在嘗試識別目標GPCR的選擇性調控元時的情況。
G蛋白活性的調節並不是配體/GPCR結合的唯一結果。參見如Luttrell,et al.,J. Cell Sci .,115:455 465(2002)，和Ferguson,Pharmacol. Rev .,53:1 24(2001)，該文獻評述了一些可能導致GPCR信號衰減或終止的活動。這些終止過程對於防止細胞過度刺激以及在細胞外信號和相應的細胞內通道之間強制建立一個暫時的連結是很有用的。
一般來說，激動劑與GPCR的結合會在GPCR激酶磷酸化的受體分子的C終端形成絲胺酸和蘇胺酸殘基。絡合了激動劑的C終端磷酸化的GPCR然後與抑制蛋白科成員反應，如α抑制蛋白、β抑制蛋白或β抑制蛋白2，這些抑制蛋白下調或捕捉受體信號。這一結合可能抑制受體與G蛋白的偶聯，因此，針對受體進行內噬，然後衰退和/或再循環。例如，抑制蛋白的結合，如β抑制蛋白與磷酸化GPCR的結合，可以不同的方式降低目標GPCR的活性。抑制蛋白抑制目標活化的最簡單的機制就是結合到GPCR的細胞內功能部位，從而阻斷異質三聚體G蛋白的結合位點並防止細胞外信號激活信號通道(脫敏作用)。抑制蛋白的另一個機制是將受體連結到膜內噬機構的元素(即網格蛋白介導的內吞作用)，這將開始受體在一個有包衣的載體中內噬以便與一個核內體融合。到達核內體後，受體可被選定進行降解(如用溶酶體)，或者也可以再循環到血漿膜，再次被激活。
因此，可以說，配體與GPCR的結合“調控”了GPCR和抑制蛋白之間的相互作用，因為配合即結合到GPCR造成抑制蛋白與GPCR的結合，從而調控了其活性。此處的“調控”或其任何其他形式用於相互作用或結合的時候，指的是本發明的兩個蛋白質相互作用方式的一些變化，如，測試化合物存在時與測試測試化合物不存在時相比較，相互作用方式的變化。因此，調控僅包括兩個分子的結合。例如，測試化合物存在可能以某種可檢測的方式或形式加強或增強、減弱、抑制、改向、減輕或改變兩個蛋白質的相互作用，或者測試化合物對相互作用的可能性有促進作用等。
在有些情況下，7TMR信號發生可與G蛋白無關。因此，當配體與7TMR結合時，是β抑制蛋白，而不是G蛋白，被調動參與或在細胞中啟動一個信號發送級聯。參見如Violin & Lefkowitz,Trends Pharm Sciences 28(8)416-422,2007和DeFea,Br J Pharm 1-12,doi:10.1038/sj.bjp.0707508,2007，其中總結了兩個始於激活的7TMR的獨立又互相依賴的信號通道，這些信號通道可能涉及一個G蛋白和一個β抑制蛋白;或者也可能僅涉及一個G蛋白或者一個β抑制蛋白。
因此，例如7TMR已知的拮抗劑激活β抑制蛋白信號發送。心得安(Propranolol)是一種已知的β2 腎上腺素受體(ADRB2)拮抗劑並具有G蛋白信號發送能力，它被發現是一種部分的β抑制蛋白信號發送激動劑，激活β抑制蛋白啟動的通道，如在實施本發明所見者。
對細胞外刺激有響應的細胞信號發送事件通常都是由蛋白質-蛋白質相互作用介導的。因此，蛋白質-蛋白質相互作用對細胞生理學家來說具有非常重要的意義。監視這些相互作用的一個工具涉及到使用一個分裂的或改序的報導子激活蛋白質，如煙草蝕刻病毒(TEV)蛋白水解酶。當與相互作用蛋白質共表現為一個融合構築體時，蛋白酶的分裂部分重新獲得活性。Wehr,et al.,“Monitoring Regulated Protein-protein Interactions Using Split TEV”(利用分裂TEV監視受調控的蛋白質-蛋白質相互作用),Nature Methods ,3:985-993(2006)。這一特性與轉錄偶合的報導子系統結合使用。
由此理解產生了另外的方法，用來分析GPCR的激活和抑制。其中一個方法涉及到利用裝在一個帶有轉錄機構的完整單元中的抑制蛋白來監視蛋白質的相互作用。這種方法的優點是不需要瞭解G蛋白的通道方面的知識。參見美國專利第7,049,076號:Lee at al.“蛋白質-蛋白質相互作用分析方法”。Lee et al.提出一種需要轉錄偶聯報導子系統的報導子系統。根據Lee et al.的結果，當兩個蛋白質相互作用時，肽轉錄因子是從第一蛋白質上裂解出來的。第二蛋白質是啟動一個報導子的轉錄因子。該轉錄因子透過轉移到細胞核實現一個可檢測的報導子的轉錄，從而獲得了報導子的功能。由於該方法取決於轉錄，因此，該方法不能用於諸如血小板、人造樣品包或單元，如脂質體、蝸形細菌、病毒樣顆粒和病毒顆粒。
Oakley,et al.,Assay Drug Dev. Technol., 1:21 30(2002)以及頒發給Barak等人的美國專利第5,891,646和6,110,693號“Methods Of Assaying Receptor Activity and Constructs Useful in Such Methods”(分析報導子活性的方法及此類方法中有用的結構)描述了一些分析方法，其中測量了細胞質中螢光標記的抑制蛋白分子向細胞表面被激活受體的的再分布。這些方法依賴細胞的高解析度成像來測量抑制蛋白的重新定位和報導子的活化。熟練的技術人員認識到，這是一個繁雜的程序，可因所用的互補性酶碎片的親和力和相互作用而失敗，這些相互作用可能和調控劑誘導的期望的相互作用形成競爭。因此，該方法的缺點是會因為酶獨立於配體結合而自動重新組合所造成的假陽性結果。最好能有一個更簡單可靠、假陽性結果較少並能夠比較容易地改變為大通量篩選的分析方法。
有關這些方面內容，已經頒發了各種其他美國專利，並提交了多個專利申請。例如，頒發給Bohn等人的美國第6,528,271號專利，“Inhibition Of β-Arrestin Mediated Effects Prolongs and Potentiates Opioid Receptor-Mediated Analgesia”(β-arrestin抑制介導的效應延長並增強阿片樣受體介導的痛覺喪失)提出了一個透過測量β抑制蛋白的抑制來篩選控制疼痛藥物的方法。已公開的美國專利申請案，如2004/0002119,2003/0157553和2003/0143626，以及美國第6,884,870號專利描述了涉及到GPCR的不同形式的分析方法。美國第7,128,915號專利具有類似的GPCR技術。上面提到的美國第7,049,076號專利主要介紹GPCR活性和篩選方法，凸顯了GPCR研究的重要性。
因此，本發明的一個特點，即提供更簡單的分析方法監控和/或確定特定蛋白質/蛋白質相互作用的調控，例如受體媒介的生理作用，如GPCR介導的細胞響應，其中蛋白質包括但不限於膜結合蛋白質，包括一般的受體，以及作為重要實例的GPCR，對於解決本領域內所期望的需求是很令人滿意的。
本發明提供方法來確定測試化合物是否能夠調控特定的感興趣的蛋白質-蛋白質相互作用。蛋白質一蛋白質相互作用是生物學常見的機制，其中細胞與周圍環境作用，它是一種細胞外事件，如一個配體結合到一個受體，能夠產生一種帶有內噬或不帶內噬的內部響應。內噬可能涉及兩個或更多的有一部分在膜上或膜外的蛋白質。因此，二聚體、異質二聚體或多聚體的形成可能產生一個內部響應。細胞內蛋白質-蛋白質相互作用也可能出現在信號級聯中。本發明的一般特點是可以應用於任何類型的蛋白質-蛋白質相互作用。相互作用可能在兩個膜結合的蛋白質之間、一個膜結合的蛋白質和一個胞質蛋白質之間、或胞質蛋白質之間等進行。在一個實施例中，一個胞質蛋白質轉移到另一個細胞器官，如細胞核，其中一個報導子被激活從而產生一個信號。最好是使用一個基於細胞的分析方法，但是也可以使用無細胞的系統，如使用溶菌產物、膜碎片、核碎片等。還包括含有一個或多個有關試劑的人工製備的試劑包或單元，如脂質體、病毒樣顆粒等等。本發明對上述討論的Lee et al.的方法進行了改善，無需轉錄。可以更快地獲得結果，且可以從基於細胞的或無細胞系統中獲得結果。下面是一些特別優選的實施例的一般說明。這些實施例僅為示範目的，並非意在限制所述和所申請的本發明之範圍。
本發明提供的一個特色包括讓至少一個測試化合物與一個表現相關蛋白質的一個細胞表面接觸。可對測試化合物調控相關蛋白質活性，如一個報導子蛋白質活性的能力進行評估。相關蛋白質在細胞中的表現可用下述方法，透過一個選擇的細胞，如一個昆蟲或哺乳動物細胞系的轉形或轉染而獲得:(1)一個包含下述之核酸分子或分子:(a)一個編碼第一個相關蛋白質的多核苷酸和(b)一個編碼報導子活化蛋白質的多核苷酸，該報導子活化蛋白質配有對蛋白酶或一個蛋白酶的活性或可激活部份敏感的裂解位點，以及(2)一個包含下述之核酸分子或分子:(a)一個編碼第二蛋白質的多核苷酸，當存在有調控劑即陽性測試化合物時，該第二蛋白質與第一蛋白質的相互作用發生變化，以及(b)一個編碼對核酸(1)編碼的裂解位點具有特異性之蛋白酶或蛋白酶的活性或可激活部份的多核苷酸。調控蛋白質-蛋白質相互作用(介於感興趣的二種蛋白質間)的分子，如陽性測試化合物，可藉由在需要時在表現第一個和第二個感興趣的蛋白質細胞中以及此處所述的報導子系統中加入報導活化蛋白質的受質來評估或分析。
因此，得自本發明的方法可採用可變換酶作為感興趣的蛋白質-蛋白質相互作用的讀出。用作報導子或報導子活化蛋白質的可變換激活蛋白質，如酶，可透過裂解來激活，如透過與感興趣的第二蛋白質相關的酶活性來激活。另一個選項為一個非活性的激活蛋白質，當感興趣的第一蛋白質和第二蛋白質相互作用的時候，該蛋白質被激活。因此，可以篩選調控感興趣的第一和第二蛋白質相互作用的化合物。這一系統的一個成就是能夠高通量地識別調控選定的蛋白質-蛋白質相互作用的分子。
能夠單獨或和一個或多個相關分子結合使用而產生一個讀出“肽A”的酶以一種活性可以改變的形式存在。這一變化可使酶活化或失活。例如，可在酶上面建立一個裂解位點，可利用與感興趣的第二蛋白質偶聯的第二個酶來裂解並使之失活。
另外，裂解也可能導致激活。可用一個或多個核酸將選擇的酶構建到一個需要的寄主細胞中。例如，一個載體可能包含一個編碼選定的非活性酶分子的多核苷酸，該非活性酶分子可在裂解位點上被裂解從而被活化。裂解位點可為天然出現的，但是更優選的則是將該位點設計加入多核苷酸中，以便將之表現為置換的酶。例如，一個不屬於細胞蛋白質的裂解位點和/或一個不屬於寄主細胞的蛋白質可以轉染到寄主細胞中。另外的實施例包括透過裂解而使酶活化，既可以透過除去阻斷肽，也可以透過允許兩個多肽改變構型，以便它們重新安排位置而激活酶活性。
因此，一個實施例中具有一個活性的多肽，如酶。此處的“酶”可藉由裂解而使之失活。從特異性方面來看，也許希望在酶裡面設計一個裂解位點，能被一個不屬與寄主細胞的蛋白酶辨認出來。裂解位點可以一個連結成份的形式引入，即將兩個蛋白質或“酶”的兩個部份連結在一起，連結成份可以是一個屬於“酶”的裂解位點，例如，帶有裂解位點的酶可能來自另外的細胞類型或另外的物種，且在寄主細胞中不存在，或者裂解位點也可以一個或多個胺基酸的保存性置換而產生。保存性置換為本領域已知的技術。例如，電荷、大小、芳香性或其他特性可以被保存下來以維持活性。活性不必和未經置換的酶完全相同，但是必須在裂解位點透過裂解而改變。可以在一個酶的兩個部份之間插入一個裂解位點。裂解這一位點可能干擾酶，因此造成失活或可能引起催化活動，例如，藉由除去阻斷連結或催化點的一個肽部份或允許置換的酶的兩個部份以一種能夠恢復活性的方式相互作用。
因此，在裂解位點的裂解可能失活或激活一個產生讀數的蛋白質。例如，當包含一個編碼第二個感興趣的蛋白質的多核苷酸的核酸分子之一個表現產物與感興趣的第一蛋白質作用而啟動了能夠辨認並裂解置換的報導子活化蛋白質的蛋白酶的活性的時候，可在一個測試化合物存在的情況下實現裂解。
感興趣的第二蛋白質與感興趣的第一蛋白質在第三分子存在，或不存在的情況下發生相互作用。這一第三分子因此被認為是調控了多肽A和B之間的蛋白質相互作用。由第三分子如一個測試化合物調控的蛋白質-蛋白質或肽-肽相互作用(為了討論的目的，蛋白質和多肽可互換使用)因此可以有效地為本發明的系統報導。調控標記為1和2，第一和第二，A和B等(這些術語此處可互換使用)的多肽之間蛋白質-蛋白質相互作用的分子可藉由活性的報導子活化分子或透過將活性的報導子活化蛋白質的受質加入表現含有感興趣的蛋白質的系統的細胞來進行測量。
蛋白質A和B的選擇是個設計上的決定，因為已知或懷疑可能相關、相互作用的一對分子都可以使用。如此處所討論的，一對適當的分子為帶有G蛋白或β抑制蛋白的7TMR。另外的實例是一個捲曲的受體和一個散亂的結合蛋白質等等。還有一個實例則是一個在細胞相互作用時以及細胞相互作用後起作用的蛋白質。因此，蛋白質A和B在細胞1中。當細胞1為細胞2所接觸或與細胞2接觸時，這一相互作用在細胞1中觸發了一個由細胞1引起的活動，該活動由蛋白質A和B的相互關聯、相互作用等所揭示，並進一步為本發明的試劑所揭示，產生了可察覺且可檢測的信號。
還有一個實例是蛋白質A表現在細胞1中，蛋白質B表現在細胞2中。這可以透過設計讓G蛋白或β抑制蛋白擁有一個細胞外功能部位，或設計讓一個報導子活化蛋白擁有一個在細胞1被一個配體或候選藥物活化後可為細胞1作用或與細胞1作用的細胞外功能部位來實現。另外，兩個細胞上的內生分子也可以自發相互關聯。在另一個實施例中，蛋白酶和報導子活化分子被安排作為細胞外功能部位在一個細胞或一個單元的表面上表現。
還有一個實施例中，相互關聯、組合等等的蛋白質形成一個包含蛋白質A和B的複合結構。這一分析方法可用來識別那些促進或阻止相互關聯或組合的分子。一個實例則是病毒殼體的形成，病毒樣顆粒組合或核醣體的形成。
G蛋白偶聯的受體(GPCR也稱為7TMR，這些術語在此處可互換使用)的常見機制中，GPCR的激動劑活化導致獲取一個涉及信號通道的啟動、終止、增強、反抗的細胞內分子，如G蛋白或β抑制蛋白。因此，G蛋白偶聯的受體激酶可作用於激活的受體，造成受體的磷酸化。磷酸化的受體促進β抑制蛋白結合到受體上。對有些GPCR來說，這一機制得到了很好的保存。在其他場合，活化的受體卻是與β抑制蛋白作用。
為了評估調控蛋白質-蛋白質相互作用如GPCR活化的分子，設計了一個系統來分析蛋白質-蛋白質相互作用並在一個GPCR-置換的報導子分子系統中進行了測試。例如，報導子分子系統可以是一個螢光素酶/螢光素分析系統。一般來說，報導子分子是一個外生分子，對於寄主細胞或信號機制來說是外來的東西。這可使報導子分子被寄主細胞活化或在寄主細胞中自發活化降至最低，因而也降低了信號產生，也就是說，減少了假陽性。報導子活化分子可以是一個帶有功能部位結構的分子，或可被置換以產生一個非活性的報導子活化蛋白質，該蛋白質經過處理後可具有報導子活性的潛質。因此，本申請案考慮到使用一個潛在的報導子活化分子。置換的報導子活化分子使自發報導子活化分子活性降到最低，因此也將假陽性降到最低。例如，在酶片斷互補分析中，酶片斷的親和力可超越目標分子、配體或篩選的分子的反應動力學，結果酶片斷自發重新結合成為功能分子，因此造成更高的背景值和/或假陽性。感興趣的置換報導子活化蛋白質可設計成帶有一個位點，該位點受到作用時，使得置換的報導子活化分子形成一個功能分子。這個位點可為一個蛋白酶位點。蛋白酶位點最好是一個獨特的位點，在感興趣方法組份存在的寄主細胞或單元中很少存在或不存在。這提供了另外的方法來避免完整的報導子活化分子的自發重新關聯，因此降低假陽性。只有參與作用的配體最終將蛋白酶引導到非活性的報導子活化蛋白的附近並使之裂解，才能得到特定的信號，也只有在這個時候，才能產生活動信號活化或產生的實體。本領域已知有一些蛋白酶可用於本發明的實踐。例如，病毒來源的蛋白酶可能很有用，因為它們對於完整的寄主細胞來說通常都是外源的。有一項應用包含一個置換的報導子活化蛋白質基因，其中螢火蟲螢光素酶的編碼序列被連結到GPCR序列的C端終點，β抑制蛋白2(Ar2或Arr2)則被連結到菸草蝕刻病毒(TEV)蛋白酶基因。在另一個實施例中，置換的螢光素酶被連結到β抑制蛋白(Ar或Arr)，TEV基因則被連結到β抑制蛋白作用或β抑制蛋白有關的信號通道的一個下游蛋白質上，或連結到一個受體，如被懷疑獨立於G蛋白而作用的7TMR上。當設計用來表現上述兩者的質粒在細胞中表現的時候，調控GPCR-抑制蛋白-2相互作用的化合物獲取Arr2-蛋白酶融合蛋白質到置換的螢光素酶中的蛋白酶識別位點，TEV蛋白酶然後裂解該置換的螢光素酶。測試化合物的效用可透過由報導子活化蛋白重組導致的酶活性的變化來測量，在本例中，透過作用於一個適當的受質，如一螢光素，螢光素酶變成了活性的並能產生可檢測的信號。
本發明並不限於螢光素酶，或甚至不限於酶。裂解活化是一個已知的現象，如酶原。非酶報導子系統也適用。例如，可使用綠色螢光蛋白(GFP)。一個置換的GFP，即組成部份重新安排的GFP，可用作報導子活化蛋白和報導子。包含在置換的多肽中的諸如TEV或其它帶有識別位點的蛋白酶的作用可裂解置換的報導子活化蛋白/報導子，因而形成重新排列，產生信號。GFP的優勢在於其本身就是一個可檢測的報導子信號發送分子。另外，可在報導子上引入一些不會明顯擾動信號的裂解位點。由蛋白質-蛋白質相互作用產生的裂解會使報導子信號減弱。可在報導子構築體中引入多個裂解位點。
可用三級蛋白質結構來提供熟練的人員指引，將裂解位點放在最合適的地方。例如，當多肽的兩個部份接觸很緊的時候，藉由擾動序列而分開這兩個部份預期會降低或消除活性。裂解時，兩個部份預期會相互作用，從而恢復活性。
感興趣的第一蛋白質可能是一個膜結合的蛋白質，如跨膜受體，例如GPCR。跨膜受體的實例包括β-腎上腺素能受體(ADRB2)、精胺酸後葉加壓素受體2(AVPR2或V2)、血清素受體1a(HTR1A)、m2蕈毒鹼乙醯膽鹼受體(CHRM2)、趨化素(C-C基序)受體5(CCR5)、多巴胺D2受體(DRD2)、K阿片受體(OPRK)，或α1a-腎上腺素能受體(ADRA1A)等等。膜結合受體在本領域眾所周知。應當理解，在所有情況下，本發明並不限於作為本發明的實例描述的特定實施例。例如，諸如酪胺酸激酶胰島素成長因子-1受體(IGF-1R)分子，以及通常不是膜結合的蛋白質分子，如雌激素受體1(ESR1)和雌激素受體2(ESR2)，均可用於本發明。與蛋白質B結合的蛋白酶或蛋白酶之一部份可能是菸草蝕刻病毒核包體A(TEV)蛋白酶。TEV有一7個殘基識別位點，因而比較小的統計上更普通的識別位點蛋白酶更具特異性。其它蛋白酶也適合用於本發明。例如，具有5個殘基識別序列的腸激酶和Xa因子蛋白酶，具有6個殘基識別序列的凝血酶和PureActTM 或Clean CutTM ，以及具有7個殘基識別序列的PreScissionTM 也是可用於本發明的蛋白酶。本發明並不限於使用特定的蛋白酶。但是，蛋白酶必須在某一位點裂解，使得在報導子中產生或改變信號。
活化報導子的蛋白質可為任何能夠與受質作用產生可檢測信號的酶。例如，酶可直接或間接地增加或減少螢光或化學發光，或者也可能造成顏色變化。報導子受質可能為生物物質，如蛋白質，也可能為一個化學物質，其反應為報導子酶所催化。感興趣的第二蛋白質可能為一個抑制性蛋白質，如抑制蛋白。抑制蛋白通常與GPCR作用，對配體/受體相互作用作出反應來調控活性。細胞可為真核細胞或原核生物。報導子可能為外生成份，如β半乳糖苷酶或螢光素酶。為了簡化起見，“報導子酶”係作為報導子活化分子、報導子活化體、報導子調控分子、報導子調控蛋白質或報導子活化蛋白質之等同物，及作為一個能夠改變報導子輸出的分子之簡稱。例如，報導子酶可以酶的功能造成報導子信號變化，或者也可以酶方式或非酶方式引起信號變化，如螢光信號的變化。熟悉本領域的技術人員瞭解調控或激活報導子信號的各種報導子系統和蛋白質。
編碼第一蛋白質的核苷酸序列可被改變以增加與第二蛋白質的相互作用。此類改變包括但不限於，用一個比原序列對第二蛋白質有更高親和力的、編碼胺基酸序列的核苷酸序列來取代第一蛋白質的C端區域的全部或部份核苷酸序列。例如，C端區域可為一個編碼AVPR2、AGTRLI、F2RL1、CXCR2/IL-8b或CCR4的C端區域的核苷酸序列所取代。此類改變在本領域為人們所熟知，是本發明的一個選項功能。
本發明的方法可能包括讓多個測試化合物與多個細胞樣品或單元接觸。每個樣品都可與一個或多個測試化合物接觸。在另一實施例中，一個細胞或單元帶有兩個不同的分子，而這些分子的分子外功能部位又帶有不同的報導子活化分子，兩者均可與β抑制蛋白作用。篩選可透過測定報導子的活性進行，如監控樣品中的酶活性來確定是否有任何化合物或化合物的混合物調控特定的蛋白質/蛋白質相互作用。該方法可能包括讓每個樣品與單一測試化合物接觸，可能讓每個樣品與測試化合物的混合物接觸，或兩者的結合。可用本發明來測試或篩選抑制化合物與蛋白質A之結合的化合物。例如，一項分析可能包含蛋白質A的一個已知的配體，調控配體與蛋白質結合的化合物可被識別和/或特徵化，如競爭型分析方法中那樣。每個分析中可包含對照樣品，與樣品一起進行平行分析。
在有些實施例中，本發明提供一個方法來確定一個測試化合物是否調控感興趣的很多蛋白質相互作用中的一個或多個相互作用。這些實施例一般具有以下特徵：讓一個測試化合物與用以下物質轉形或轉染過的一些細胞樣品接觸：(a)包括以下各項的第一個核酸分子：(i)一個編碼第一蛋白質的多核苷酸和一個編碼一個蛋白酶的裂解位點的多核苷酸序列，(ii)一個編碼在細胞中激活報導子的蛋白質的多核苷酸；以及(b)包括以下各項的第二核酸分子：(i)一個編碼第二蛋白質的多核苷酸，將在感興趣的測試化合物存在的情況下對該第二蛋白質與第一蛋白質的相互作用進行測量，(ii)一個編碼蛋白酶或在裂解位點裂解多肽的多核苷酸。在多個樣品中，第一蛋白質可與多個樣品中之其它第一蛋白質不同。然後，該方法包括測定多個樣品中的一個或多個樣品中報導子的活性，從而確定對感興趣的一個或多個蛋白質相互作用的調控。
在每個樣品中，第二蛋白質可能是不同的，也可能是相同的。所有樣品可合併在一個孔中，每個樣品可能包含不同的第一和第二蛋白質。另外，每個樣品也可以在不同的孔中測試。一個特定樣品中的報導子可能與其它樣品中的報導子不同。測試化合物的混合物可能包含在或存在於一個生物樣品中，如腦脊髓液、尿液、血液、血清、膿汁、腹水、滑液、組織萃取物、植物或草藥萃取物，或滲出液。
在其它實施例中，本發明提供了一個用以下轉形或轉染的重組細胞：(a)包含以下各項的核酸分子：(i)一個編碼第一蛋白質的多核苷酸，(ii)一個編碼蛋白酶、蛋白酶的一部份或一個具有蛋白酶活性的多肽的裂解位點的多核苷酸，以及(iii)一個編碼激活細胞中報導子的蛋白質的多核苷酸；以及(b)一個包含以下成份的核酸分子：(i)一個編碼第二蛋白質的多核苷酸，以測量第二蛋白質在測試化合物存在的情況下與第一蛋白質的相互作用，以及(ii)一個編碼蛋白酶、蛋白酶的一部份或一個具有對該裂解位點有特異性的蛋白酶活性之多肽的多核苷酸。
一個或兩個核酸分子都可以穩定地併入寄主測試細胞的基因組中。該細胞亦可以報導子轉形或轉染。第一蛋白質可能是一個膜結合的蛋白質，如跨膜受體，即GPCR。代表性的跨膜受體包括ADRB2、AVPR2、HTR1A、CHRM2、CCR5、DRD2、OPRK或ADRA1A。
如上所述，蛋白酶或蛋白酶之一部份可能不限於菸草蝕刻病毒核包體A蛋白酶，而可能是激活報導子活化蛋白質的任何蛋白質，可能是任何作用於受質從而產生可用的或可檢測的信號的酶。第二蛋白質可為一個抑制性蛋白質。細胞可為真核細胞或原核生物，一般來說，用於篩選藥物的目的，優選的是真核細胞。以與藥物最終目標類似的方式糖基化的細胞則為首選。細胞可以培養或設計用來提供需要的糖基化特徵。使用與提議的最終目標之糖基化性質不匹配的原核生物細胞對於篩選和特徵化來說可能是有用的。
報導子可以是外生的，如一個β半乳糖苷酶、GFP或螢光素酶。可以改變編碼第一蛋白質的核苷酸序列以增加與第二蛋白質的相互作用，例如藉由用編碼對第二蛋白質比對原來的序列有更高親和力的胺基酸序列的核苷酸序列置換該第一蛋白質C端區域的全部或部份核苷酸序列。該C端區域可為一個編碼AVPR2、AGTRLI、F2RL1、CXCR2/IL-8B或CCR4的C端區域的核苷酸序列所取代。
作為一個實施例，本發明包括提供一種分離的核酸分子，包括(i)編碼一個蛋白質的多核苷酸，(ii)編碼一個蛋白酶、蛋白酶的一部份或一個具有蛋白酶活性的多肽的裂解位點，以及(iii)編碼一個激活細胞或其它系統中的一個報導子之蛋白質的多核苷酸。該蛋白質可能是一個膜結合的蛋白質，如跨膜受體，如GPCR。代表性的跨膜受體包括ADRB2,AVPR2,HTR1A,CHRM2,CCR5,DRD2,OPRK或ADRA1A。蛋白酶或蛋白酶之一部份可能是菸草蝕刻病毒核包體A蛋白酶。如上所述，激活報導子的蛋白質可為任何與一個受質反應產生信號的蛋白質，不需要限制為此處討論的TEV實例。本發明的這一實例或其它實例不應被視為是將本發明限制於特定的實施例。
在有些實施例中，本發明之特徵為一個包含分離的核酸分子的表現載體，該核酸分子係包含：(i)編碼一個蛋白質的多核苷酸，(ii)編碼一個蛋白酶、蛋白酶的一部份或一個具有蛋白酶活性的多肽的裂解位點的多核苷酸，以及(iii)編碼一個激活細胞中的一個報導子之蛋白質並進一步以可操作方式連結到一個啟動子的多核苷酸。
在有些實施例中，本發明之特徵為包含以下之分離的核酸分子：(i)編碼一個蛋白質的多核苷酸，該蛋白質在測試化合物存在的情況下與另一個蛋白質的相互作用有待測量，以及(ii)編碼一個蛋白酶、蛋白酶的一部份或一個具有蛋白酶活性且對裂解位點具有特異性之多肽的多核苷酸。該蛋白質或另外的蛋白質可能為一個抑制性蛋白質，如抑制蛋白。
在一些實施例中，本發明之特徵為一個包含分離的核酸分子之表現載體，該核酸分子包含：(i)編碼一個蛋白質的多核苷酸，並對該蛋白質在測試化合物存在的情況下與另一個蛋白質的相互作用進行測量，以及(ii)編碼一個蛋白酶、或對裂解位點具有特異性之蛋白酶的一部份的多核苷酸，且該核酸可進一步以可操作方式連結到一個啟動子上。
另一個實施例之特徵為一個融合蛋白質，其產生係由表現一分離的核酸分子，該核酸分子包括：(i)編碼一個蛋白質的多核苷酸，(ii)編碼一個蛋白酶、蛋白酶的一部份或一個具有蛋白酶活性的多肽的裂解位點的多核苷酸，以及(iii)編碼一個激活細胞中的一個報導子之蛋白質的多核苷酸，並可進一步以可操作方式連結到一個啟動子上；或者表現一個包括以下的分離的核酸分子：(i)編碼一個蛋白質的多核苷酸，並對該蛋白質在測試化合物存在的情況下與另一個蛋白質的相互作用進行測量，以及(ii)編碼一個蛋白酶、蛋白酶的對裂解位點具有特異性之一部份的多核苷酸。
在還有一個實施例中，本發明之特徵為一個測試套組，其可用於測定一個測試化合物是否調控感興趣的特定蛋白質/蛋白質相互作用。該測試套組包含以下一種或多種成份，每種成份的分別部份：(a)一個包括以下成份的核酸分子，編碼第一蛋白質的多核苷酸(i)編碼一個蛋白酶、蛋白酶的一部份或一個具有蛋白酶活性的多肽的裂解位點的多核苷酸，(ii)編碼一個激活細胞中的報導子之蛋白質的多核苷酸，以及(b)一個包含以下成份的核酸分子：(i)編碼第二蛋白質的多核苷酸，該第二蛋白質在測試化合物存在的情況下與第一蛋白質的相互作用有待測量，(ii)編碼一個蛋白酶、一個蛋白酶對裂解位點具有特異性之一部份的多核苷酸，及視情況含有使(a)和(b)保持分離的機構。該套組還可能包含使用說明。另外，該套組可能包含設計用來表現感興趣的兩個融合蛋白質的任意一個或兩者的細胞。
第一蛋白質可能是一個膜結合蛋白質，如跨膜受體。跨膜受體的一個特殊的類型是GPCR。一個特殊的跨膜蛋白質是GPCR。代表性的跨膜受體包括ADRB2、AVPR2、HTR1A、CHRM2、CCR5、DRD2、OPRK或ADRA1A。蛋白酶、蛋白酶的一部份或一個具有蛋白酶活性的多肽可為菸草蝕刻病毒核包體A蛋白酶。激活該報導子的蛋白質可以是任何作用於一個可檢測的、對裂解活化有反應的報導子活化分子的蛋白酶。該報導子可為任何可由裂解產物產生可檢測信號的分子。第二蛋白質可能為一個抑制性蛋白質，如抑制蛋白。該套組還可能包含編碼報導子活化基因的分離核酸分子之一個單獨部份。報導子活化劑可以是一個β半乳糖苷酶或螢光素酶。可以改變編碼該第一蛋白質的核苷酸序列以增加與第二蛋白質的相互作用，例如藉由用編碼對第二蛋白質比對原來的序列有更高親和力的胺基酸序列之核苷酸序列置換該第一蛋白質C端區域的全部或部份核苷酸序列。該C端區域的核苷酸序列可為一個編碼AVPR2、AGTRLI、F2RL1、CXCR2/IL-8B和CCR4的C端區域的核苷酸序列所取代。
這裡考慮的是，此處所描述的任何方法或組成對於此處所描述的任何其它方法或組成來說都是可實施的。在專利申請範圍和/或說明中，冠詞“一個”當與“包含”聯用的時候，可能代表“一個”的意思，但是也可以表示“一個或更多”、“至少一個”和“一個或多於一個”的意思。當以稍微不同的措詞描述對應的組份時，它們並不意味著是區別各個實施例，整體來說，各種不同的措詞是廣義地描述對應的成份。
當與下面的說明和附圖一起考慮時，將能夠更好地理解本發明的這些和其它實施例。應當理解，下面的說明雖然指出了本發明的各種實施例以及其中許多具體的細節，但是，這些內容僅僅是為了示範之目的，而不是限制本發明的範圍和內容。在不偏離本發明的精神實質的情況下，可在本發明的範圍內進行許多替代、改變、添加和/或重排，本發明包括所有這些替代、改變、添加和/或重排。
本發明的分析檢測蛋白質一蛋白質相互作用，而無需事先瞭解調控該相互作用的化合物或由該相互作用引起的細胞通道的知識。該分析可檢測膜蛋白質的相互作用，如同質二聚體或異質二聚體的形成作用。該分析可檢測膜蛋白與細胞質蛋白之間的相互作用。該分析可檢測兩個細胞質蛋白質的相互作用。該分析可檢測到蛋白質位置變換到細胞內空間或在細胞內轉移到細胞器官中。該分析可檢測到兩個細胞或人造樣品包或單元的相互作用。蛋白質A或B可結合一個可能對蛋白質-蛋白質相互作用並非必不可少的配體、輔因子或其它化合物、分子或物質。
術語“序列”在遺傳工程、核酸和蛋白質研究中有多種用法，如本領域的研究人員所瞭解的，在一個句子、段落、概念、想法、一段文字等的上下文中可能具有不同的含意。例如，一個序列可代表一些特定的多肽(原始結構)的胺基酸殘基或多核苷酸的核苷酸鹼基。在另外的上下文中，序列可能指的是廣義的複合分子，如指整個分子而無需知道原始胺基酸結構的多肽序列。一個基因序列可能與基因為同義詞且指的是多核苷酸本身或整體。序列可指單個多肽或多核苷酸，也可指它們的一部份。因此，當使用“序列可操作地連結”這樣的說法時，即表示單個基因、功能部位或轉錄單元可以某種功能形式被接合或結合在一起，從而能夠表現得自上述結合或接合的單個基因、功能部位、轉錄單元等。序列也可以是一個特定的表現基因或蛋白質的部份，如具有多個功能部份或功能部位的蛋白質的功能部位。如本領域的人員所瞭解的，感興趣的多核苷酸可為DNA或RNA，或兩者的混合物，在本發明的實施中製造或使用這些產品的方法在本領域中均為已知。
例如，圖4顯示對於細胞核荷爾蒙受體經調控活性的的分析。細胞核荷爾蒙受體轉移到細胞核則透過報導子活化蛋白質的重排而引起或激起一個信號，或者一個可被檢測的分子，因此可以作為一個報導子，作為對活化蛋白質的活性的響應而出現螢光或螢光變化，如螢光素酶。得到的信號可為任何可檢測的變化，如強度的變化或激發/發射參數的變化。化學發光是另一種常見的報導子信號。熟悉本領域的人員將會理解，一個蛋白酶或一個置換報導子都可以被設計成含有細胞核和其它目標多肽。這樣的目標多肽可能包含基本的胺基酸。兩者在目標區域產生相互作用時，信號將得到調控。
對於GPCR來說，本分析方法是特異的、靈敏的，且不需要事先知道特定G蛋白質偶聯的知識。該分析方法不受內生GPCR的影響，可用來識別分子、包括激動劑、拮抗劑以及(某些受體)的反轉激動劑。本發明的分析方法是對Lee et al.的方法的改善，避免了對轉錄放大的需求。本發明提供了一個更直接的讀數。
本發明提供了一個比Lee et al.更簡單、更可靠的分析系統，其部份原因是本系統不需要將試劑轉移到細胞核中，然後再轉錄放大信號。因此，讀數可靠近受體調控事件。本發明不像Lee et al.的方法那樣，需要細胞核。事實上，本發明的一個應用就是檢測分泌的蛋白質。細胞質中的報導子和蛋白酶均可激活(或滅活)來自一個分泌的夥伴蛋白質的信號。另外的用途是用於去核細胞，或人工細胞、樣品包或單元。
本發明對於識別調控任何蛋白一蛋白質相互作用的分子尤其有用。DiscoveRXTM 分析是一項使用β arrestin的分析，要求兩個相互作用的蛋白質組份在所有時間都保持在一起，才能產生信號。大多數以前的GPCR分析均基於G蛋白信號，如FLIPR和cAMP方法。任何影響Ca++ 或cAMP含量的分子都可能產生假陽性信號。另一方面，本發明的方法快速、可靠且成本低，同時獨立於可能影響靈敏度和特異性的酶組份結合或G蛋白質信號。
本發明提供分析或篩選任何蛋白質-蛋白質相互作用的方式，其藉由以一個報導子活化蛋白質(其等同者為報導子調控蛋白質/分子或報導子活化蛋白質/分子)融合蛋白質A(或蛋白質B)。該方式的一個實例就是含有蛋白水解裂解位點的置換酶。蛋白質B與一個蛋白酶融合。蛋白質A和蛋白質B的相互作用可為自發的或由第三個分子誘發的。本領域熟練的人員可使用本發明的方法來識別增強或干擾蛋白質-蛋白質相互作用的分子。或者，蛋白質A可與一個蛋白酶融合，蛋白質B可與一個報導子活化蛋白質融合。
本發明的報導子活化蛋白質是潛伏的，可在與第二蛋白質的蛋白酶作用時被激活。一個感興趣的做法就是產生一個報導子活化蛋白質，該報導子活化蛋白質為一個置換的分子，結構上包含一個蛋白酶裂解位點。裂解時，報導子活化蛋白質的部份可結合、組合等以產生一個活性的報導子活化多肽或組合。這一活性的，如酶學上活性的報導子活化蛋白質然後可以作用於一個適當的受質，如一個報導子，從而產生一個可檢測的信號。因此，當被置換的時候，非活性的分子為螢光素酶，當裂解形成了一個生物上活性的螢光素酶時，這個螢光素酶可作用於一個適當的受質，如螢光素以產生一個可檢測的信號，在本例中，即發光。
在另一個實施例中，報導子活化蛋白質是一個報導子。因此，這可被看作是報導子活化蛋白質裂解時的自活化。一個實例是GFP，GFP裂解時發生重排並產生一個獨立於報導子系統的可檢測信號，當報導子活化劑為螢光素酶時，該報導子系統為一個提供螢光素的試劑。
置換的報導子活化基因可構建成為活性的或非活性的。例如，在研發這一技術的時候，構建了一個GPCR-非活性的置換螢光素酶融合物，其中螢光素酶胺基酸序列的次序被改變。原來的N終端片段被移到了C終端，原來的C終端片段被移到了N終端，並用一個蛋白酶辨識位點來融合這兩個次序改變了的片段。GPCR-非活性的置換螢光素酶融合蛋白質與β抑制蛋白2-TEV蛋白酶融合蛋白質相互作用導致非活性的置換螢光素酶的裂解，並產生一種重組的螢光素酶活性。採用一個替代的策略，本發明構建了一個GPCR-活性的置換螢光素酶融合構築體，其中將一個蛋白酶辨識位點引入到原來次序的螢光素酶序列，而沒有顯著地影響應光素酶的活性。GPCR-活性的置換螢光素酶融合蛋白質與β抑制蛋白2-TEV蛋白酶融合蛋白質相互作用導致活性的置換螢光素酶的裂解，並產生兩個非活性的螢光素酶片段，結果造成活性喪失，因此信號變小或喪失。
報導子活化蛋白質可從基於置換蛋白質的報導子中選擇，如Gaussia螢光素酶；水母螢光素酶；β內醯胺酶；β半乳糖苷酶；和螢光蛋白質，如包含蛋白水解裂解位點，如TEV裂解位點的一種綠色螢光蛋白質(GFP)或DsRed蛋白質等。雖然“酶”是作為一個通用術語使用的，報導子活化蛋白質本身卻並不限於“酶”，而是指任何能夠產生信號變化的報導子活化蛋白質。例如，結合或隔離一個螢光蛋白可能就是一種足夠的信號變化，而無需化學反應來改變分子結構。
作為本發明的一個特色，熟練的生物學家或蛋白質化學家可使用不同的斷開點和不同的重疊區域以降低或增加蛋白酶活性、基本螢光素酶活性或重組的螢光素酶活性來構建置換螢光素酶的變異體。Rachel B. KapuSt,et al.Biochemical & Biophysical Research Communications ,294(2002)949-955。
蛋白酶是本領域人士所熟知的，可從各種各樣的來源選擇，如細菌、酵母、真菌、植物、昆蟲、哺乳動物等。生物體需要蛋白酶來處理肽，因此，生物世界提供許多各種各樣的適合用於本發明的蛋白酶。對於一種理想的酶來說，適當裂解位點的選擇通常可以從文獻中或產品目錄中查到。這樣的蛋白酶裂解位點是各種長度的寡肽，如兩個胺基酸、三個胺基酸、四、五、六、七、八、九、十個或更多個胺基酸等。
置換報導子活化蛋白質也可以用替代的蛋白酶裂解位點取代或連結到一個或多個裂解後能夠轉化為活性酶的非活性酶原前體。例如，酶原前體的裂解位點可被改變成對一個能辨識與野生類型不同序列的酶敏感。或者，還可以改變裂解位點以獲得特別希望的效果，如更高的特異性，更容易裂解等。
也可以用一個帶有蛋白酶裂解位點的活性酶來完成分析，活性酶在裂解後則變成非活性酶。這一特徵提供一些簡單性，因為多個具有不同特異性的蛋白水解酶可根據需要作用於活性酶上，不需要或僅需要極少的重新設計。
哺乳動物細胞，如HEK293,COS-7,NIH3T3等，以及酵母細胞可用來建立蛋白質-蛋白質相互作用置換的報導子活化蛋白質分析。也可使用無細胞的系統。此類無細胞系統包括溶菌、膜製備物、病毒儲備液、病毒樣顆粒、脂質體、血小板、膜製備物、蝸形菌、其它人造的基於脂質的單元或刺激生物膜形成一個能夠封閉、附著、攜帶、包括一個生物體的樣品包，如跨膜蛋白質。生物體如基因改造的生物體也可以用於感興趣的分析，或能夠貢獻可用於感興趣的分析的細胞或試劑。
本發明的分析還提供一個可檢測的報導子。該報導子是感興趣的報導子活化蛋白質的受質。因此，在置換的螢光素酶的情況下，適當的報導子是螢光素，在螢光素酶作用下，產生一個可檢測的發光信號。報導子也可以是細胞內的，從而可以提供一個避免細胞溶解的分析方法。例如，融合到麥芽糖結合的蛋白質(MBP)羧基端的GFP當MBP信號序列存在時是不發螢光的。當MBP信號肽除去後，螢光就可以觀察到了。Feilmeier et al.,J Bacteriol 182(14)4068-4076,2000.因此，蛋白酶裂解位點如此處所講授可被引入到MBP信號肽的下游，以產生一種可使用活細胞的分析方法。
該分析方法可利用置換螢光素酶或螢光蛋白質來監控一個蛋白質相互作用複合體的亞細胞位置和位移。圖4是這樣一個實施例的圖示。
本發明係關於確定一種感興趣的物質是否調控以下物質的相互作用：i)一個第一蛋白質，如膜結合的蛋白質，一個受體，如跨膜受體，與ii)一個第二蛋白質，如一個細胞內分子、另一個跨膜蛋白質等，如抑制蛋白科的成員。一個方法涉及到共轉形或共轉染一個可能為原核或真核，且具有兩種構築體的細胞。第一種構築體包括編碼以下物質的第一個核酸：(a)第一蛋白質，如跨膜受體和(b)一個蛋白酶的裂解位點，以及(c)編碼一個活化報導子的蛋白質的第二核酸。第二個構築體包括(a)一個編碼第二蛋白質的核酸，該第二蛋白質與第一蛋白質的相互作用被測量和/或被測定，以及(b)編碼一個蛋白酶、一個蛋白酶的部份或一個具有蛋白酶活性並作用於第一種構築體裂解位點的多肽。在有些實施例中，這類構築體的一個或更多構築體可穩定地結合到細胞中。
本發明的一個實施例的特徵以圖形方式示於圖1。簡單來說，獲得一個表現感興趣的第一蛋白質的細胞。感興趣的蛋白質可能包括一個蛋白水解部份，或者該蛋白水解部份可能在結合或釋放一個配體時與一個複合體結合。作為對配體結合變化的反應，一個非活性的酶被結合到感興趣的第一蛋白質的肽部份。在本實施例中，蛋白酶與非活性酶的接近允許螢光素酶活性的重組。重組的活性影響蛋白質-蛋白質相互作用的報導子。
圖1中的實例顯示一個跨膜蛋白質、一個TEV裂解酶、一個置換的螢光素酶和一個螢光素酶受質，如螢光素。本例中的蛋白質“A”可能為arrestin。感興趣的第一蛋白質可能為一個GPCR。螢光素酶的N和C端可重排並連接到一個TEV蛋白酶裂解位點，以產生一個非活性的置換螢光素酶。所示的置換螢光素酶與β arrestin 2融合。
蛋白質A可與一個蛋白酶融合。蛋白質B可與一個非活性的置換報導子活化蛋白質融合。一個蛋白酶辨識和裂解位點(被一個融合到蛋白質A的蛋白酶識別)被插入到置換的報導子活化蛋白質中。蛋白質A和蛋白質B被調控蛋白質A和蛋白質B相互作用的第三個分子帶到彼此接近的位置。置換的非活性報導子活化蛋白質被附近的融合蛋白酶水解造成置換的非活性報導子活化蛋白質的兩個片段的融合，從而重新產生活性的報導子活化蛋白質活性。報導子活化蛋白質的活性可用適當的試劑、裝置和市售的試劑套組以一個適當的報導子，如螢光素來進行評估。
[0093]作為蛋白質A的GPCR可與TEV蛋白酶融合在一起。或者，GPCR也可與一個置換的非活性報導子活化蛋白質融合。
圖1中，一個與GPCR結合的分子造成β arrestin與GPCR的相互作用。置換的螢光素酶裂解位點被連接到蛋白質A或在蛋白質A附近的TEV蛋白酶水解產生螢光素酶蛋白質片段。這些片段重組成活性的螢光素酶，可利用一個適當的能測量螢光素酶活性的報導子，如細胞中或溶菌產物中的螢光素來檢測或推斷其存在。
該方法可對受體蛋白質如GPCR產生特異的信號，GPCR則可與G蛋白質或βarrestin作用。
圖1所示的一般方法適用於GPCR，因為收集βarrestin是一個常見的現象。但是，任何相互作用、結合或聯合等或懷疑有相互作用、結合、聯合等的分子對均可用於本發明的實踐。
一個示範性的方法採用β arrestin信號通路且不需要事先瞭解特定的G白質偶聯的知識，因為本方法對GPCR或對涉及到的G蛋白質並非是特異的。因此，該方法對孤立的GPCR來說很有用，因為對這些GPCR來說，G蛋白偶聯通道為未知。該方法產生直接的生理學上相關的讀數，而無需像美國第7,049,076專利那樣需要轉錄放大(Lee et al.)。
材料和方法也使得監控G蛋白質成為一個獨立的現象。在這種情況下，可用置換的報導子活化蛋白質來標記β arrestin。一個懷疑或已知與β arrestin作用的分子可用適當的蛋白酶，如顯示對β arrestin有偏向性的GPCR來標記。
相對於酶片段補償分析(如DiscoveRX PathHunterTM β arrestin分析)，本發明具有優勢，因為在酶片段補償分析中，相互作用的夥伴必須連接或在一起，以保證酶片段的補償。另一方面，本發明的方法中，一旦因試劑接近而出現蛋白質水解，即生成了活性的報導子活化劑，不需要蛋白質相互作用夥伴保持結合即可獲得有意義的分析。
編碼這個第一融合蛋白質的核酸和其它肽組份可被引入到寄主細胞中。此類細胞工程設計在本領域為人們所熟知。對各種肽來說，核酸可設計成單一的分子，也可先後或同時引入。例如，有些構築體可以整合到寄主染色體,以獲得穩定的轉染，使用的材料和方法在本領域為人們所熟知。
在另一個替代系統中，感興趣的兩個蛋白質可能在沒有配體或測試化合物的情況下相互作用。配體和測試化合物可能造成兩個蛋白質分解，改變構形，或減少或抑制其相互作用。在這種情況下，細胞中游離的、功能上活性的蛋白水解酶的濃度在一個陽性測試化合物存在的情況下就會降低，導致水解程度減少，報導子活化蛋白的活性也降低。
在一個示範性的實施例中，arrestin為在一個激動劑存在下結合到跨膜受體的第二蛋白質;但是，應該理解，由於受體只是一種類型的蛋白質，分析並不依賴於使用受體分子，激動劑結合也不是能夠出現的唯一相互作用。任何與第二蛋白質作用的蛋白質就足夠了，儘管我們感興趣的是跨膜蛋白質，因為它們在受體接觸到能使細胞結合的受體變為活性狀態的調控劑時，引起細胞、器官和組織反應的作用。此外，激動劑結合到受體並不是可以分析的唯一結合類型。反轉激動劑也可以用本分析方法進行分析。可以測定拮抗劑本身，按照本發明的方法，也可以測定不同的拮抗劑和/或激動劑的相對強度。
本發明的其他細節，包括製造和使用本發明主題內容的具體方法和技術將在下面描述。
如同此處所描述的方法一樣，作為本發明特點的產品也可以簡單地進行描述。例如，在“三部分構築體”中，即一個具有編碼以下內容的序列的構築體：i)一個蛋白質，ii)裂解位點，以及iii)報導子活化蛋白質;報導子可能是一個細胞內蛋白質或膜結合蛋白質，如跨膜受體，屬於GPCR科的成員。裂解位點可為任何可水解的位點，水解可由蛋白質-蛋白質相互作用的一個夥伴蛋白質之蛋白酶的作用實現。裂解可能直接產生報導，裂解也可能對報導子活化蛋白質進行重排，從而從另一個分子獲得報導。第三部分則可能為一個蛋白酶或一個具有蛋白酶活性的多肽。
這些序列可以改變，使得它們編碼的蛋白質的C終端與第二蛋白質有更好、更強的相互作用。此類改變可能包括，如用AVPR2,AGTRLI,F2PLI,CCR4,CXCR2/IL-8等的C終端編碼區取代該蛋白質如GPCR的C終端編碼序列。基因序列可以重新編碼以便優化感興趣的寄主細胞中感興趣的蛋白質的轉譯。
活化報導子的蛋白質可為一個在細胞質內或一個細胞器官如細胞核內作用的蛋白質，或者也可能是一個發起一系列動作反應，從而引起另一個蛋白質作用的分子。熟練的技術人員對此類級聯反應很瞭解，因為他們對細胞事件有深入研究。例如，易位信號，如一個細胞核易位序列可納入到報導子的酶中。定位序列在本領域為人們所熟知。
第二個構築體，如上所述，包括一個編碼與第一蛋白質作用的蛋白質的區域，導致一些可測量的現象。該蛋白質可能為一個活化劑，競爭者、抑制劑、或一個提供協同響應的組分等等，或者更廣義地說，就是第一個蛋白質的“調控劑”。抑制蛋白科的成員是個範例，尤其當第一蛋白質為GPCR時更是如此，但是，其他蛋白紙編碼序列也可用，尤其是當第一個蛋白質不是GPCR時，更是如此。這些兩部分構築體的第二部分編碼蛋白酶、蛋白酶的一部分或具有蛋白酶活性的多肽，該多肽裂解由第一個構築體編碼的報導子活化蛋白質，以生成能夠直接或間接地產生一個可檢測信號的報導子活化蛋白質。
但是，這些作為範例的實施例並不限制本發明，如此處下面另外一些實施例中所討論的，例如，蛋白酶可以融合到蛋白質A或蛋白質B，作為一種設計上的選擇。
寄主細胞
本文中所用的“細胞”、“細胞系”、“細胞培養物”可互換使用。寄主細胞也可以指一個來源細胞，可從其中獲得溶菌產物。所有這些術語還包括其後代，即任何和所有的後代。應當理解，由於有意或無意的突變、選擇或區分，所有後代並不是完全相同的。寄主細胞可以設計來表現一個可篩選的或可選擇的標記物或報導子，它們在被第一個構築體的報導子活化蛋白質作用時，會發出一個信號，其中第一個構築體的報導子活化蛋白質是由第二構築體的融合蛋白質之一部分的蛋白酶所裂解。可篩選的標記物或報導子可以任何方式引入寄主細胞或分析系統中。
無數的細胞系和細胞培養物都可用作寄主細胞。例如，可從美國細胞菌種庫(American Type Culture Collection,ATCC)獲得很多寄主細胞，ATCC是一個保存活生物培養物和基因材料的機構。根據載體主鏈特徵和需要的結果，熟悉本領域的人員可確定一個適當的寄主細胞。例如，一個質粒或黏粒可被引入到原核生物寄主細胞中複製許多載體。可用於載體複製和/或表現的細胞類型包括但不限於細菌，如大腸桿菌(如大腸桿菌菌株RR1、大腸桿菌LE392、大腸桿菌B、大腸桿菌X 1776(ATCC No.31537)、大腸桿菌W3110(F- ,1ambda- ,原養型，ATCC No.273325)、DH5α、JM109和KC8)，桿菌如枯草桿菌;以及其他腸細菌如沙門氏菌、黏質沙雷氏菌、各種假單孢菌，以及一些市售的細菌寄主如Competent Ce11s和SOLOPACKTM Gold Cells(,La Jolla)。在有些實施例中，細菌細胞如大腸桿菌細LE392可用作噬菌體病毒的寄主細胞。
用於載體複製和/或表現的真核寄主細胞實例包括但不限於HeLa、NIH3T3、Jurkat、293(HEK)、COS、CHO、Saos和PC12。其他細胞，如酵母細胞和昆蟲細胞，如Sf9細胞，也是適合的。根據使用目的，熟練的技術人員可以任意選擇他或她喜歡用的寄主細胞。本領域熟練的技術人員瞭解，有許多來自各種細胞類型和生物體的寄主細胞可供使用。
類似地，病毒載體(包括一個噬菌體)可與一個真核或原核寄主細胞，尤其是允許進行載體複製和表現的細胞結合使用。寄主細胞不必為一個永生化細胞系。寄主細胞可能來自一個幹細胞培養物或一個原生細胞培養物，如造血幹細胞、血管、上皮、平滑肌、脾臟、T細胞、B細胞、單核細胞等。寄主細胞可以是經過基因改造的，如包含別的生物體的遺傳材料。Lee et al.的方法中不能使用的細胞也可以用於本發明的方法，因為本發明的方法不需要活性轉錄。例如，去核細胞，如紅細胞或血小板均可用於本發明。
在本發明的分析中，寄主細胞意在包括人工樣品包和單元，如脂質體和病毒樣顆粒。這樣的結構通常模仿或模擬一個細胞或其部分，產生一個帶有由一層薄膜或其他結構與外部完全或部分隔離的內空之圈閉。如上所述，這樣的人工樣品包和單元包括脂質體、蝸形菌、病毒樣顆粒、病毒等。
蛋白質
本發明考慮使用任何兩個已知或懷疑具有物理相互作用的蛋白質。在有些實施例中，蛋白質以融合蛋白質的形式存在或設計成以融合蛋白質的形式存在，第一個蛋白質融合到一個潛伏的或非活性的報導子活化多肽上，第二個蛋白質融合到一個能夠辨認出第一個融合蛋白質上裂解位點的蛋白酶上，第一個融合蛋白質的裂解釋放出報導子活化多肽或使其具有活性。
對第一個蛋白質來說，它可以是一個天然出現的膜結合蛋白質，或透過工程設計使之成為膜結合蛋白質。例如，第一個蛋白質可能是跨膜受體如GPCR，或任何其他感興趣的跨膜受體，包括但不限於受體酪胺酸激酶、受體絲胺酸/蘇胺酸激酶、細胞因子受體等等。此外，眾所周知，蛋白質的部分將和全長的第一個蛋白質以同樣的方式起作用，這樣的第一個蛋白質的活性部分、如分子外功能部位或跨膜功能部位，都在此處蛋白質的定義之內。
本發明可用來分析任何蛋白質的相互作用，而不限於僅分析膜結合的受體，如GPCR，這對於熟悉本領域的技術人員來說是顯而易見的。例如，其他類別的跨膜受體的活性，包括但不限於：受體酪胺酸激酶(RTKs)，如IGF1R，如上皮成長因子受體(EGFR)、ErbB2/HER2/Neu或相關的RTK；受體絲胺酸/蘇胺酸激酶，如轉化成長因子-β(TGFβ)、活化素或骨形成蛋白(BMP)受體；細胞因子受體，如白細胞介素、紅細胞生成素、G-CSF、GM-CSF或腫瘤壞死因子(TNF)干擾素家族的受體；瘦素受體；和其他通常不必為膜結合的受體，如雌激素受體1(ESR1)，和雌激素受體2(ESR2)。在每個情況下，方法可能涉及到用一個改變的受體多核苷酸轉染細胞，該多核苷酸指導嵌合的或融合的蛋白質的表現，包括感興趣的受體、一個蛋白酶裂解點和一個報導子活化多肽。細胞可被第二個多核苷酸，如一個載體轉染，該載體指導嵌合的或融合的蛋白質的表現，包括一個融合到能夠辨認並裂解第一個蛋白質上的裂解位點的蛋白酶上的相互作用蛋白質。第一個和第二個多核苷酸可被包括在一個單分子內，因此避免了共轉染。在RTK的情況下，如EGFR，這一相互作用蛋白質可能由含有多肽如磷脂酶C(PLC)的SH2(Src同源功能部位2)或一個含有轉化蛋白質1(SHC1)的Src同源2功能部位組成。在絲胺酸/蘇胺酸激酶受體的情況下，如TGFβ、活化素和BMP受體，這一相互作用蛋白質可能是一個Smad蛋白或其部分。對細胞因子受體來說，如干擾素α、干擾素β或干擾素γ受體，這一相互作用蛋白質可能是轉錄(STAT)蛋白例如但不限於Stat1或Stat2的一個信號傳感器和活化劑；或Janus激酶蛋白，Jak1、Jak2或Tyk2；或其部分，等等。轉染細胞可包含一個被一報導子活化蛋白作用的報導子。然後進行了一項分析，其中轉染的細胞用一個測試化合物處理一段特定的時間，在測試期間結束時，測量了報導子的活性。如果測試化合物激活感興趣的報導子，則會激發感興趣的受體和相互作用的蛋白質之間的相互作用，導致蛋白酶裂解位點的裂解和報導子活化蛋白質的活化，結果使報導子活性產生了可測量的變化或增加。
其他可能的蛋白質對包括抗體-抗原、酶-受質、二聚化蛋白質、信號傳感級聯組分、一個複合結構的組分，如核醣體或病毒、不同細胞上的細胞間相互作用分子，如提供抗原的細胞和用於響應的免疫細胞，如T細胞、B細胞、NK細胞、樹枝狀細胞、單核細胞、巨噬細胞等等，以及本領域所瞭解的其他蛋白質對。就哪一個蛋白質，如A或B，以及結合到哪個蛋白質或從哪個蛋白質分離方面來說，蛋白酶和具有蛋白酶辨識位點的蛋白質是可交換的。
報導子
報導子可為任何分子，該分子對一個活性報導子或化分子的活性做出響應而改變外觀或功能，並產生一個可檢測的信號，或可以很容易地跟蹤這些變化。這些術語意在寬泛地應用。報導子或化蛋白質一旦被活化(或如在有些可能的實施例中失活)，則在報導子中會產生一個可檢測的變化。這一變化的檢測被用來確定一種測試化合物是否調控了蛋白質-蛋白質之間的相互作用。其他非酶報導子或化蛋白質也可以使用，只要能產生一個可檢測信號即可。因此，已知的報導子活化蛋白質可以使用，如半乳糖甘酶、過氧化物酶、螢光素酶等。可以使用已知的報導子，如半乳糖甘酶受質、過氧化物酶受質、螢光素酶受質、GFP等。
蛋白酶和裂解位點
蛋白酶是很好地特徵化了的酶，可在特定的位點裂解其他蛋白質。一個蛋白酶家族，即Ser/Thr蛋白酶家族，可裂解絲胺酸和/或蘇胺酸殘基。其他蛋白酶包括半胱胺酸或硫醇蛋白酶、天冬胺酸蛋白酶、金屬蛋白酶、胺基酸蛋白酶、二肽酶和三肽酶、羧肽酶和肽基肽酶。這些酶的選擇由本領域熟練的技術人員自己決定，不需要限定為此處描述的分子。眾所周知，酶具有催化功能部位，這些催化功能部位可用來取代全長的蛋白酶。這些內容也包含在本發明之中。一個特定的實施例就是菸草蝕刻病毒細胞核包體A蛋白酶(TEV)，或其活性部分。根據本領域熟練的技術人員的理解，蛋白酶的其他特定的裂解位點也可用。
蛋白質的改變
在本分析的一些實施例中，可改變第一個蛋白質以增強其與作用蛋白質的結合。例如，據知，在受到配體刺激時，某些GPCR結合到arrestins上更穩定或具有更大的親和力，這一增強的相互作用是由分離的功能部位，如C終端尾部群集的絲胺酸和蘇胺酸殘基介導的(Oakley,et al,J. Biol. Chem.,274:32248-32257,1999 and Oakley,et al.,J. Biol. Chem.,276:19452-19460,2001)。利用這一實例，很清楚，受體編碼需裂本身可被改變，以增加膜結合蛋白質如受體，與其結合的蛋白質的親和力。這些變化的範例是膜結合蛋白質如7TMR的C終端區域的改變，其中涉及利用對結合蛋白質有更高的親和力但不會影響受體結合功能的另一個受體之對應的區域來替換其一部分。
此外，第二個蛋白質也可以改變以增強其與第一個蛋白質的相互作用。例如，本方法可能引入點突變、切斷或第二蛋白質的其他變體，如arrestins，已知arrestins能夠更穩定地或以獨立於磷酸化的方式結合到激動劑占位的GPCR(Kovoor,et al.,J. Biol. Chem.,274:6831-6834,1999)。這樣的改變可用本領域已知的方法進行。
分析格式
在幾個實施例中，本發明提供直接了當的方式來評估表現在同樣的細胞、單元或反應混合物中的兩個蛋白質的相互作用。第一個構築體可能由一個編碼第一個多肽的序列組成，該序列連結到一個編碼蛋白酶、蛋白酶部分或具有蛋白酶活性的多肽之裂解位點的多核甘酸上，其本身也連結到一個編碼報導子酶的多核苷酸上。“連結到”表示所述的序列被融合到一起，形成一個單獨完整的開放讀碼框，該讀碼框可轉化為包含所有元素的一個單一多肽。這些可以但並不必被另外的核苷酸所分離，該核苷酸可能編碼，也可能不編碼另外的蛋白質或肽。插入到重組細胞中的第二個構築體可能包含一個編碼第二蛋白質的多核苷酸和蛋白酶、蛋白酶部分或具有蛋白酶活性的多肽。這些基本要素加在一起，當與想瞭解對目標蛋白質相互作用效應的候選試劑結合起來時，則形成了一個基本的分析方法。
但是，透過採用不同的報導子，本發明還可以同時分析一個以上膜結合蛋白質，如受體，每個受體被一個此處描述的不同類別的蛋白質活化而激活。例如，這可透過混合用不同的受體構築體和不同的報導子活化蛋白質轉染的細胞來實現，或者也可以對每個測試的受體融合不同的酶並在用測試化合物處理時測量每個報導子的活性。例如，可能希望確定感興趣的分子是否活化第一個受體，並且希望確定是否因為與第二個受體作用而預期會出現副作用。在這種情況下，可能會涉及到第一細胞系編碼第一個受體和第一個受體活化蛋白質，如lacZ，第二個細胞系編碼第二受體活化蛋白質和第二受體，如GFP。在那種情況下，如本發明所採取的做法，GFP可能被置換。可以將兩個細胞系混合，並加入感興趣的化合物，然後希望在一個細胞系上見到陽性結果，在另一個細胞系上則不見效應。
本發明的另外形式係關於檢視一個單一對相互作用蛋白質的分析，另外也係關於此處所說的“多重”分析這些分析可以多種方式進行，但在所有情況下，有一對以上的蛋白質被同時測試。這可已透過提供一個以上的細胞樣品來實現，每個樣品均被轉化或轉染，以測試每一對相互作用蛋白質。可將不同的轉化的細胞合併並在同一個孔中同時測試，或者每種不同的轉化體可放在不同的孔中測試。另外，可對細胞進行處理使之帶有多個標記的第一蛋白質，如基於跨膜蛋白質，以確定一個配體或候選分子是否活化一個以上的受體。
此處所描述的用於多重分析的細胞可為相同，但是並不必須如此。類似地，每個樣品中所用的報導子系統可為相同，但是並不必須如此。當樣品放到孔中後，如微陣列孔中，可對照孔中的多對作用蛋白質篩選一種或多種化合物。
圖10表示用本發明的分析得到的常見結果。在低濃度和高濃度時(取決於調控作用是否被抑制或活化)，測試化合物可能會沒有效應。隨著測試化合物濃度的降低或提高，調控效果可能有變化。如圖10所示的劑量響應曲線可用來對調控進行評估。單個的點也可以評估。例如，單個點可能是與對照或本底不同的預先確定的值，通常是統計方法確定的，首先積累一定的資料或對“正常”樣品做多次測定，以獲得帶有標準誤差和偏差的樣品分佈平均值。可用一個常數作為預先確定的差值。一般來說，會使用比值，如至少偏離對照樣品10%，但是通常是對照樣品的倍數，如大約1.5,2,2.5,3,4,5,10,20,50,100,200,500,1000或更多(或其倒數)乘以在另一次分析中預先確定的對照值。確定調控發生的預先確定的閾值通常是由熟練的技術人員根據情況需要，考慮到1型和2型誤差後計算得到的。
試劑套組
此處所描述的任何組分及其任何組合均可以試劑套組的形式提供。因此，試劑套組將包括以適當容器包裝的一個或多個組分，如或本發明的載體或細胞，以及按照本發明可能要用到的任何額外的試劑。
該試劑套組可能包含本發明的一個或多個適當等分的組成。試劑套組的組分可以水溶液介質，或以凍乾形式或溶質的適當溶劑的濃縮液形式提供。試劑套組的容器一般至少包括一個小瓶、試管、容量瓶、瓶子、注射器或其他容器，其中可已裝入或已經裝入一個組分，且裝入的組分最好是適當的等分量。在試劑套組多於一種組分的情況下，該試劑套組同常還包含第二個、第三個或其他額外的容器，可將額外的組分分裝在這些容器中。但是，多種組分的各種組合也可以包含在一個單一的容器中，如一個小瓶中。另外，還可能提供適當的稀釋劑。本發明試劑套組典型情況下還包括封裝試劑容器的方式，供商業銷售。這樣的容器可包括注射器或吹塑的塑膠或泡沫容器，其中保存需要的試劑瓶以及說明書。
當試劑套組的組分是以一個或多各液體溶液提供的時候，該液體溶液可能是一水容液，如無菌的水容液則特別有用。但是，試劑套組的組分可能以乾粉或以固體形式提供。當試劑和/或組分以乾粉提供時，可透過加入適當的溶劑對乾粉進行重組。可以想見，該溶劑，如無菌水或適當的鹽水或緩衝溶液，也可能以另外的容器提供。
實例
下面給出描述本發明的一些特定的實施例，但是，本發明不應被理解為受這些實施例的限制。
實例1
圖1示一個實施例，包括一個置換的非活性螢光素酶，該非活性螢光素酶由TEV蛋白酶上包含的TEV蛋白酶辨識位點的重組作用而重新獲得活性。如圖中所示的第一蛋白質被融合到一個蛋白酶上。實例1設計使用TEV蛋白酶作為第二個蛋白質的實施來重組置換的螢光素酶的活性。所示的第二蛋白質融合到一個非活性置換的報導子活化蛋白質，即螢光素酶上。一個蛋白酶辨識和裂解位點(被一個融合到蛋白質的蛋白酶識別)被插入到置換的報導子活化蛋白質中。第一蛋白質和第二蛋白質被一個調控第一蛋白質和第二蛋白質之間相互作用的第三個分子帶到彼此的附近。置換的非活性報導子活化蛋白質被附近的融合蛋白酶水解造成置換的非活性報導子活化蛋白質的裂解，形成兩個片段，從而重新產生活性的報導子活化蛋白質。報導子活化蛋白質的活性可用適當的試劑和裝置來進行評估。
置換的螢光素酶透過重排螢火蟲螢光素酶N終端胺基酸2到233以及逆序的C終端胺基酸234到550而構建，並被一個TEV蛋白酶辨識位點ENLYFQX(SEQ ID NO:3)打斷。在這一位點的裂解導致置換的螢光素酶的重組活性。X的位置可為任何決定TEV蛋白酶辨識親和力和裂解效率的胺基酸。改變X已顯示可調控TEV的酶動力學。辨識序列中的其他位點類似的胺基酸置換也能改變酶動力學。調控動力學有利於優化諸如篩選過程中的培養時間和影響信/噪參數的背景活性。置換的螢光素酶(luc234X233，其中X是TEV七肽裂解位點N終端的特殊胺基酸，SEQ ID NO:3)然後被融合到一個GPCR，即ADRB2的C終端，從而產生GPCR-置換的螢光素酶ADRB2-luc234X233，即表現質粒。
實例2
透過將菸草蝕刻病毒蛋白酶A融合到β arrestin 2的C終端重組了人類β arrestin 2-TEV融合質粒。利用適當的模板由PCR生成了所有的DNA片段。GPCR-luc234X233融合基因在pcDNA3.1(＋)中被一個新黴素選擇標記物(Invitrogen)亞克隆，Arr-TE V融合基因在pcDNA3.1(＋)中被一個zeocin選擇標記物(Invitrogen Cat.#43-0018)亞克隆。
實例3
利用適當的市售的轉染試劑套組，以ADRB2-luc234R233(實例1)和Arr-TEV質粒(實例2)共轉染CHO-K1細胞。轉染48小時後，細胞用或不用1OμM ADRB2激動劑異丙腎上腺素處理2小時，向細胞中加入了Bright-GLOTM 或Steady-GLOTM (Promega)並用適當的發光讀出儀記錄了溶菌產物的相對發光。在異丙腎上腺素存在的情況下，觀察到發光增加了三倍以上。
圖5顯示加入合不加入Arr2-TEVp 時 GPCR/置換的螢光素酶的表現。圖中所示的資料中，構築體被引入到細胞中，但是，轉染的細胞沒有接觸到任何調控劑。因此，資料表明，當裂解位點含肴遜擬璧時，有一些自發的活性，但是當X是R或V時，基本上沒有背景噪音。如圖6中所指出的，當表現R或V裂解位點的細胞接觸激動劑時，則觀察到了響應。 圖7顯示瞬時和穩定表現GPCR-luc234V233和/或Arr-TEV的細胞中螢光素酶活性對劑量的響應。
實例4
圖8顯示5小時或1小時培養時間對分析蛋白質-蛋白質相互作用已經足夠。圖中清楚地顯示了劑量響應關係。
透過將菸草蝕刻病毒蛋白酶A融合到ADRB2的C終端並用一個zeocin選擇標記物(Invitrogen Cat#43-0018)將融合的基因插到pcDNA3.1(+)中，從而構建了ADRB2-TEV融合基因表現質粒。利用本領域適當的模板由PCR生成了所有的DNA片段。
透過將置換的螢光素酶luc234X233融合到β arrestin 2的C終端構建了β arrestin 2-置換的螢光素酶(Arr-luc234X233)的融合基因表現質粒。TEV蛋白酶裂解位點是ENLYFQ/X,(Rachel B. Kapust,et al. Biochemical & Biophysical Research Communications,294(2002)949-955)，E和Q一般是不變的，其中X可為任何胺基酸，僅管G和S是在該裂解位點發現的常見胺基酸。裂解出現在Q和X殘基之間。X可決定裂解的效率。在有些實施例中，TEV螢光素酶裂解位點被包括在置換的螢光素酶中。利用簡單的常規試驗可改善背景和信/噪比。例如，發現在有些應用中，在TEV的X水解位點用纈胺酸代替甘胺酸可降低背景。用一個新黴素選擇標記物(Invitrogen)在pcDNA3.1(+)中克隆了融合的融合基因。
利用適當的市售的轉染試劑套組，以ADRB2-TEV和Arr-luc234V233質粒共轉染HEK293細胞，其中TEV辨識序列為ENLYFQV(SEQ ID NO:12)。轉染48小時後，細胞用不同濃度的ADRB2激動劑異丙腎上腺素處理1小時和5小時，然後向細胞中加入Bright-GLOTM (Promega)，並在EnVison IITM 上記錄了相對發光單位。用異丙腎上腺素培養1小時和5小時後，觀察到了發光活性對劑量的依賴性。
實例5
圖9左邊顯示HEK293細胞中配體-誘發的螢光素酶活性穩定表現Arr-luc234V233以及瞬態表現ADRB2-TEV融合蛋白質。右邊顯示CHO細胞中arrestin報導子活化蛋白質構築體的穩定表現和7TMR-蛋白酶融合體的瞬態表現。
在HEK293或CHO細胞中，產生了GPCR-luc234R233或Arr-TEV的穩定細胞系表現。在一個12-孔板上用Lipofectamine(Invitrogen)以每個DNA 20ng/孔對HEK293和TranIT-CHO細胞進行轉染。
在per-luc分析中，通常使用384孔板。其他格式的板也是可接受的。穩定表現GPCR-luc234R233或Arr-TEV的CHO細胞在一個組織培養物處理過的表面384孔白色分析板(Becton Dickinson)上以每孔10,000個細胞涂佈。第二天，細胞用濃度為10μM到0.7pM的激動劑處理(在無血清的細胞介之中按3:1系列稀釋)。使用Steady-Glo Luciferase Assay System(Promega)來測量螢光素酶的活性。經過2小時激動劑處理後，介質被抽吸掉並向每孔中加入25μl螢光素酶分析試劑。相對發光單位(RLU)用Perkin Elmer公司的多標籤讀數儀EnVision讀取。資料用PRISM軟件繪圖並分析。
穩定表現Arr-luc234V233的HEK293細胞藉由選擇對新黴素的耐受性而生成。耐受新黴素的基因存在於Arr-luc234V233表現質粒載體pcDNA3.1中。
實例6
圖9右邊顯示CHO細胞系中異丙腎上腺素對劑量的響應。在CHO細胞中，產生了GPCR-luc234R233或Arr-TEV的穩定細胞系表現。利用TransfectIT-CHO轉染試劑套組(Mirus Bio,Madison,WI)在一個12孔板上以每個DNA 1 μg進行轉染。從轉染物中按照對新黴素和zeomycin的選擇性收穫了單個菌落。
利用適當的市售的轉染試劑套組，用ADRB2-TEV質粒轉染了Arr-luc234V233穩定表現細胞。用異丙腎上腺素培養瞬態表現ADRB2-TEV和穩定表現Arr-luc-234V233的細胞2小時，然後向細胞中加入Bright-GLOTM 螢光素酶試劑。劑量依賴的螢光素酶活性記錄在EnVison II上。
實例7
圖10顯示GPCR Per-Luc分析的激動劑、部分激動劑、拮抗劑以及非特異內生受體響應的評估。
利用Lipofectamine 2000轉染試劑(Invitrogen)以ADRB2-TEV質粒轉染了穩定表現Arr-luC234V233的HER293細胞。轉染48小時後，用不同濃度的已知激動劑異丙腎上腺素；部分激動劑BRL37344(Sigma-Aldrich)、拮抗劑ICI118551(ICI)、帶有200nM異丙腎上腺素的拮抗劑ICI118551，以及HER293內生EDG受體激動劑S1P(鞘胺醇-1-磷酸酯)培養細胞2小時，然後向細胞中加入Bright-GLOTM 螢光素酶試劑。劑量依賴的螢光素酶活性記錄在EnVisin II上，如圖10所示。
該分析的EC50和IC50值與FLIPR和CAMP分析得到的值類似。HER293細胞中的內生受體EDG及其配體S1P不影響螢光素醄活性，而其他分析，如FLIPR和CAMP卻產生陽性信號。激動劑異丙腎上腺素產生了一個響應。部分激動劑BRL37344產生了一個逐漸變化的響應。拮抗劑ICI18551抑制了異丙腎上腺素，但是單獨沒有活性。因此，本發明的分析方法是特異的，如圖10(與其他可比的資料結合考慮)所示，產生較少的和降低的假陽性。
實例8
圖14顯示一個實例，利用一個TEV蛋白酶辨識位點ENLYFQX並用V作為X，透過克隆螢火蟲螢光素酶N終端胺基酸2到456到C終端胺基酸234到550的後面，構建了一個置換的螢光素酶。該置換的螢光素酶(luc234V456)被融合到GPCR，即ADRB2的C終端，以產生GPCR置換的螢光素酶構築體，ADRB2-luc234V456表現質粒。
利用適當的模板由PCR生成了所有的DNA片段。用一個新霉素選擇標記物(Invitrogen)在pcD NA3.1(＋)中克隆了ADRB2-luc234V456融合基因。
利用適當的市售的轉染試劑套組，以ADRB2-luc234V456和Arr-TEV質粒共轉染CHO-Kl細胞。轉染48小時後，細胞用或不用10μMADRB2激動劑異丙腎上腺素處理2小時，向細胞中加入了Bright-GLOTM 或Steady-GLOTM (Promega)並用適當的發光讀出儀記錄了相對發光。對不同劑量的異丙腎上腺素的響應，觀察到了重組的螢光素酶活性。
穩定表現Arr-luc234V233的HEK293細胞根據對新黴素的耐受性而被選擇。耐受新黴素的基因存在於Arr-luc234V233表現質粒載體pcDNA3中。觀察到了對激動劑響應的螢光素酶活性。
實例9
圖13顯示V2反轉激動劑的劑量依賴性。
本例中，利用Lipofectamine 2000轉染試劑(Invitrogen)以V2-TEV質粒轉染了穩定表現Arr-luc234V233的HEK293細胞。轉染48小時後，細胞用不同濃度的SR121463(Sanofi Kecherch,Toulouse,FR)處理2小時，然後向細胞中加入Bright-GLOTM (Promega)，並在EnVison IITM 上記錄了相對發光單位。Bright-GLOTM 螢光素酶被加到了細胞中。劑量依賴的螢光素酶活性記錄在EnVison II上。也就是說，隨著反轉激動劑SR121463量的增加，發光水準也增加。
本分析中，反轉激動劑表現為激動劑，如同其他反轉激動劑一樣。現已瞭解，反轉激動劑可阻斷V2G蛋白質的信號通路，而促進β arrestin介導的MAPK的活化(Azzi et al.,PNAS,2003,100:11406-11411)。因此，本發明的這一分析方法可表明G蛋白偶聯受體獨特的活動構像。
相反，在經典的分析系統中，GPCR的反轉激動劑表現為拮抗劑。這是因為反轉激動劑可能結合到並穩定了GPCR的G蛋白信號的非活性構像。但是，有些反轉激動劑既能穩定GPCR的非活性形式進行G蛋白信號發送，也能促進收集β抑制蛋白到GPCR以活化β抑制蛋白信號通道。
實例10
[0157]圖6顯示激動劑-誘發的螢光素酶活性。
本例中，置換的螢光素酶透過重排螢火蟲螢光素酶N終端胺基酸2到233以及逆序的C終端胺基酸234到550而構建，並被一個TEV蛋白酶辨識位點ENLYFQX打斷。X可為任何胺基酸。已知這一位置的胺基酸決定TEV蛋白酶的辨識親合力和裂解效率。該置換的螢光素酶(luc234X233)被融合到GPCR，即ADRB2的C終端，以產生GPCR置換的螢光素酶，即ADRB2-luc234X233表現質粒。
透過將菸草蝕刻病毒蛋白酶A融合到β抑制蛋白2的C終端重組了人類β抑制蛋白2-TEV融合質粒。利用適當的模板由PCR生成了DNA片段。GPCR-luc234X233融合基因在pcDNA3.1(+)中被一個新霉素選擇標記物(Invitrogen)亞克隆，Arr-TEV融合基因在pcDNA3.1(+)中被一個zeocin選擇標記物(Invitrogen Cat.#43-0018)亞克隆。
利用適當的市售的轉染試劑套組，以ADRB2-luc234R233和Arr-TEV質粒共轉染CHO-K1細胞。轉染48小時後，細胞用或不用10μM ADRB2激動劑異丙腎上腺素處理2小時，向細胞中加入了Bright-GLOTM 或Steady-GLOTM (Promega)並用適當的發光讀出儀記錄了相對發光。在異丙腎上腺素存在的情況下，觀察到發光增加了三倍以上。
實例11
圖12顯示了本方法(左面)和另外的方法(有面)的激動劑、拮抗劑、和反轉激動劑結果。兩個圖顯示了激動劑、拮抗劑和反轉激動劑的區別和逆效應。本發明的方法提供很好的比活性。
實例12
圖7顯示帶有ADRB2-置換的螢光素酶和Arr-TEV的CHO細胞。左圖的ADRB2-luc234V233資料經過處理包含TEV辨識位點ENLYFQV。利用適當的市售的轉染試劑套組，以ADRB2-luc234V233和Arr-TEV質粒共轉染CHO-K1細胞。轉染48小時後，細胞用不同濃度的ADRB2激動劑異丙腎上腺素處理2小時，向細胞中加入了Bright-GLOTM 或Steady-GLOTM (Promega)並用適當的發光讀出儀記錄了相對發光。
實例13
圖7的右面總結了帶有不同裂解位點的穩定轉染細胞的資料。結果和左面的類似。因此，具有不同裂解位點的兩個GPCR-置換構築體均對激動劑有響應。
實例14
圖6顯示比較X為R和X為V時的激動劑-誘導的信號活性。結果是類似的，表明X通常可以改變。
本例中，置換的螢光素酶透過重排螢火蟲螢光素酶N終端胺基酸2到233以及逆序的C終端胺基酸233到550而構建，並被一個TEV蛋白酶辨識位點ENLYFQ/X打斷。X的位置可為任何決定TEV蛋白酶辨識親和力和裂解效率的胺基酸。顯示了V和R。該置換的螢光素酶(luc234X233)被融合到GPCR，即ADRB2的C終端，以產生GPCR置換的螢光素酶，即ADRB2-luc234X233表現質粒。
本例中，透過將菸草蝕刻病毒蛋白酶A融合到β抑制蛋白2的C終端重組了人類β抑制蛋白2-TEV融合質粒。利用適當的模板由PCR生成了所有的DNA片段。GPCR-luc234X233融合基因在pcDNA3.1(+)中被一個新霉素選擇標記物(Invitrogen)亞克隆，Arr-TEV融合基因在pcDNA3.1(+)中被一個zeocin選擇標記物(Invitrogen Cat. #43-0018)亞克隆。
利用適當的市售的轉染試劑套組，以ADRB2-luc234R233和Arr-TEV質粒共轉染CHO-K1細胞。48小時後，細胞用或不用10μM ADRB2激動劑處理2小時，向細胞中加入了Bright-GLOTM 或Steady-GLOTM (Promega)並用適當的發光讀出儀記錄了相對發光。在異丙腎上腺素存在的情況下，觀察到發光活性增加了三倍以上。
實例15
圖11左面顯示瞬態表現V2-TEV的細胞中8-AVP激動劑的結果。
本例中，利用Lipofectamine 2000轉染試劑(Invitrogen)以V2-TEV質粒轉染穩定表現Arr-luc234V233的HEK293細胞。48小時後，細胞用不同濃度的8-AVP(Arg8 後葉加壓素，一種已知的V2後葉加壓素受體的激動劑)處理2小時，並向細胞中加入了Bright-GLOTM 螢光素酶。劑量依賴的螢光素酶活性記錄在EnVison II上。
實例16
利用Lipofectamine 2000轉染試劑(Invitrogen)以V2-TEV質粒轉染了穩定表現Arr-luc234V233的HEK293細胞。48小時後，細胞用不同濃度的反轉激動劑培養2小時，並向細胞中加入了Bright-GLOTM 螢光素酶試劑。劑量依賴的螢光素酶活性記錄在EnVison II上。
本分析中，反轉激動劑表現出激動劑的行為。現已瞭解，有些反轉激動劑可阻斷V2G-蛋白質的信號通路，而促進β抑制蛋白介導的MAPK的活化(Azzi et al.,PNAS,2003,100:11406--11411)。因此，本分析可以評估G蛋白質偶聯的受體的獨特的活性構像。
實例17
圖11右面顯示V2反轉激動劑藉由促進β抑制蛋白與V2受體作用而產生的依賴於劑量的活性。
本例中，利用Lipofectamine 2000轉染試劑(Invitrogen)以V2-TEV質粒轉染了穩定表現Arr-luc234V233的HEK293細胞。48小時後，細胞用不同濃度的反轉激動劑培養2小時，並向細胞中加入了Bright-GLOTM 螢光素酶試劑。劑量依賴的螢光素酶活性記錄在EnVison II上。
本發明的其他特色對於本領域熟練的技術人員來說是很清楚的，此處無需贅述。熟練的技術人員可進行各種變動而不會偏離本發明的精神和範圍。
所有引用的參考文獻均透過引用而作為整體納入本文。
所附的圖式形成了本發明的說明之一部份，且被包括以進一步例示本發明的某些方面。參閱所附的一個或多個這些圖式以及本文提供特定具體實施例之詳細說明，將可更瞭解本發明。
圖1顯示本發明之應用的一個具體實施例的示意圖，其中調控劑4結合了一個與蛋白酶結合的蛋白質1，造成該蛋白質與第二蛋白質2作用，該蛋白質與一個報導子調控劑3結合，如一置換的非活性調控蛋白質。調控劑4代表一個調控蛋白質-蛋白質相互作用的化合物。在本例中，Ar或抑制蛋白2被融合到一個非活性置換的報導子調控或活化蛋白質3中。蛋白酶7與蛋白酶1相結合。裂解位點8示於報導子調控蛋白質3的兩段之間。與連結在蛋白質1，如一個7TMR上的調控劑4相互作用後而出現酶裂解時，報導子活化蛋白質的活性被重組，最終形成了一個如燈泡6代表的可檢測的信號。
圖2是本發明蛋白質-蛋白質相互作用分析的一個圖形表示。一個帶有細胞內蛋白酶22的膜結合蛋白質21與調控劑4作用。一個與蛋白質23結合的非活性報導子帶有一個非活性報導子3或報導子活化劑3。發生相互作用時，與蛋白質21結合的蛋白酶22裂解置換的報導子活化蛋白質23，因而在調控劑4與蛋白質21結合時，允許報導子活化蛋白質3的蛋白質部份重新排列5。報導子活化劑因此實現了報導子或報導子活化劑3的重組，以引出或活化一個報導子。
圖3顯示兩個跨膜蛋白質相互作用時的一個實施例的示意圖。分子4引起(調控)兩個膜蛋白質之間的相互作用，如至少一個報導子蛋白質。圖中，蛋白酶22，如TEV(圖1中的7)，連結到蛋白質1並用一個連結到第二個膜蛋白質33的置換報導子活化劑融合蛋白質3帶到了附近。由於蛋白質1、33接近而在裂解位點8處出現的蛋白質水解導致報導子活化蛋白質3的活化5。
圖3可被理解成顯示調控報導子同質二聚體或異質二聚體形成之分子的辨識技術的圖形應用。圖中蛋白質1和33為膜結合蛋白質。蛋白質1和33設計上使得每個蛋白質都包含一個蛋白酶22或一個為蛋白酶22激活的報導子3。調控相互作用的分子4結合蛋白質1和/或33。當1和33相互作用時，蛋白酶22作用於報導子活化劑3，形成一個改變了的信號。異質二聚化可被擴展包括傳統的同質二聚化。例如，1和33可能為同一報導子的兩個副本，但是在與蛋白酶或報導子的結合上有所不同。如別處指出，術語報導子和報導子活化劑通常可以互換使用以描述本發明不同的實施例。
圖4顯示涉及細胞內蛋白質的蛋白質-蛋白質相互作用的一個實例。蛋白質41為一個核荷爾蒙受體，被融合到一個活化劑22，如TEV上。一個置換的報導子活化分子43位於細胞核40中。可利用一種具有細胞核定位肽序列功能的基本多肽將報導子定位在細胞核中。在結合配體如荷爾蒙(此處未顯示)時，NHR融合體41轉位到細胞核中，並在細胞核中與報導子系統作用。
圖5顯示由細胞中的TEV蛋白酶從置換的螢光素酶融合蛋白質重新產生的螢光素酶活性可透過改變蛋白酶的裂解位點來控制。因此其中的信號-噪音比是可以控制的。此處顯示兩個構築體，ADRB2是β2腎上腺素能受體，Luc 234-550和2-233是由X，即帶有可變的端點胺基酸的TEV裂解位點連結的螢光素酶的兩個片段。例如，X可為絲胺酸S、精胺酸R、或纈胺酸V。當兩個構築體都出現在一個細胞中時，在哺乳動物細胞中從一個置換的螢光素酶融合蛋白質中觀察到了重組的螢光素酶活性。易為TEV裂解的傾向性取決於裂解位點的具體殘基。此處和別處的RLU表示相對發光(或光)單位。這一實驗中沒有使用配體。
圖6顯示在一個基於GPCR置換的螢光素酶細胞分析中，激動劑誘發的螢光素酶活性，該分析使用連結到置換的螢光素酶的ADBR2受體，置換的螢光素酶帶有不同的TEV蛋白酶裂解位點，在TEV裂解位點X位置為R(左圖)，在X位置為V(右圖)。TEV蛋白酶與抑制蛋白融合。每張圖的x-軸顯示一個零點(無激動劑)和10μM激動劑。
圖7顯示在一個共瞬態轉染和部份瞬態轉染系統的基於GPCR置換的螢光素酶細胞分析中之螢光素酶活性的劑量-依賴性反應。左邊的圖中，蛋白酶裂解位點構築體的纈胺酸被用在CHO細胞中。ADRB2-luc和Arr-TEV構築體均被瞬態轉染。在右邊的圖中，用融合到ADRB2且含有R的螢光素酶構築體穩定地轉染細胞，然後再用Arr-TEV構築體對細胞進行瞬態轉染。
圖8顯示另外一種GPCR-置換的螢光素酶分析。帶有ADRB2的表現構築體結合到報導子活化劑，抑制蛋白2結合到蛋白酶。這些構築體都被瞬態轉染到HEK293細胞中。反應動力學在圖中以1小時(▲)和5小時(■)反應培養時間表示。
圖9表示一個在X位點帶有V並為受體ADRB2-TEV瞬態轉染的穩定表現抑制蛋白/置換酶構築體的HEK細胞系(左圖)的生成和一個穩定表現Arr-luc234S233並為受體-TEV構築體瞬態轉染的CHO細胞系的生成。
圖10顯示穩定表現抑制蛋白/置換酶構築體且為ADRB2-TEV瞬態轉染的HEK細胞中激動劑(異丙腎上腺素)(■)、部份激動劑(▲)、拮抗劑加異丙腎上腺素(▼)、拮抗劑()以及一個非特異內生受體(●)反應的Per-Luc分析評估。
圖11顯示V2(後葉加壓素受體2)和反轉激動劑的GPCR Per-Luc分析評估。用抑制蛋白/置換螢光素酶構築體穩定轉染的HEK細胞被V2-TEV構築體瞬態轉染，並為激動劑、8AVP、精胺酸後葉加壓素瞬態轉染(左圖)。當這些細胞用反轉激動劑測試時，觀察到了劑量依賴性，信號由抑制蛋白介導，而不是由G蛋白質介導(右圖)。
圖12顯示ADRB2的幾個基於β抑制蛋白的分析。在右邊的圖中，DiscoveRX HEK細胞按製造商的說明用ADRB2瞬態轉染並用一個拮抗劑(普萘洛爾)(■)、激動劑(異丙腎上腺素)(▲)以及兩者的組合(●)轉染(左邊)，右邊用激動劑(■)、反轉激動劑(▲)，右邊)以及兩者的組合(●)轉染。將右邊的分析與對拮抗劑、異丙腎上腺素激動劑以及兩者的組合之反應的瞬時分析進行了對比。左邊的瞬時分析提供了更大的區別和更高的比活性。
圖13顯示V2的基於β抑制蛋白的分析。圖中，V2反轉激動劑(SR121463)誘導出了一個獨立於G蛋白質而依賴於抑制蛋白的信號。
圖14顯示包含一個基本上是全長、但不完整副本的螢光素酶按此處教示的方法結合重疊的表現構築體以形成一個置換的螢光素酶。CMV是一個巨細胞病毒啟動子。Luc2-456和Luc234-550基本上是全長的螢光素酶片段。本例中，GS是一個由甘胺酸和絲胺酸組成的肽連結物。TEV裂解位點在C-端有一個纈胺酸。
圖15顯示一個監控細胞內蛋白質-蛋白質相互作用的分析實例。雷帕霉素(Rapamycin)是一個免疫抑制藥物，可同時結合到與雷帕霉素結合的蛋白質(FKBP12或FKBP)和雷帕霉素哺乳動物目標(mTOR)激酶的FKBP-雷帕霉素(FRB)結合功能部位。mTOR是一個由一雷帕霉素結合功能部位151組成的鼠科絲胺酸/蘇胺酸蛋白激酶，雷帕霉素結合功能部位151是雷帕霉素哺乳動物目標154。FKBP 152是具有雷帕霉素結合位點的12 kDa FK506-結合的蛋白質。TEV蛋白酶被融合到mTOR,FRB 151的雷帕霉素結合功能部位上。置換的報導子活化蛋白質被融合到FKBP 152，即FKBP12.的雷帕霉素結合功能部位上。雷帕霉素154與FRB 151和FKBP 152反應、介導與它們的結合並使它們接近，結果導致置換的報導子活化。
圖16顯示一個分析的組態，其中蛋白質A21和B23是兩個膜結合報導子，在與配體結合時自發二聚化(從左到由)或分解(從右到左)。該分析可監控兩個受體的自發相互作用或誘導的相互作用，其中一個或兩個受體結合一個相同或不同的配體。另外，蛋白質A21和B23可自發二聚化，或不必結合一個配體或調控體(未示出)。在這一實施例中，蛋白酶和融合蛋白質的置換報導子活化劑部份在細胞表面或人造樣品包或單元的外表表現。還可以對分析進行組態以便監控無論是自發的或是由一個或多個分子介導的受體作用的中斷，如由信號衰減、減小或消失所表明的那樣。
圖17顯示一個細胞分析，其中蛋白質A 171及B 172存在於不同的細胞中，這些細胞可能結合、鄰接或相互作用等等。同樣地，A 171或B 172可以帶有蛋白酶177或置換的信號活化蛋白質173。該分析可檢測到兩個細胞上的兩個標記的受體之自發相互作用或誘發相互作用，其中一個或兩個受體結合一個可能為相同或不同的配體，如由細胞-細胞相互作用或接近性所表明。在這一實施例中，蛋白酶177和融合蛋白質的置換報導子活化劑部份173在細胞表面或人造樣品包或單元的外表表現。活化的置換報導子175得自蛋白質A 171和B 173的結合。另外，感興趣的受體融合和細胞內蛋白質融合可能存在於一個細胞中，被監控的誘發事件，配體等則表現在第二個細胞中或就是第二個細胞。還可以對分析進行組態以便監控無論是自發的或是由一個或多個分子介導的受體和細胞作用的中斷，如隨著細胞分離，由信號衰減、減小或消失所表明的那樣。

Claims (34)

  1. 一種識別調控第一蛋白質和第二蛋白質的相互作用的化合物的方法，該方法包含：i)提供一種連接到分裂的(split)及重排的(rearranged)報導子活化蛋白質上的第一蛋白質，其中該報導子活化蛋白質包含插入介於報導子活化蛋白質之兩部分的蛋白酶裂解位點，其中該報導子活化蛋白質之兩部分為重排序；ii)提供一種連接到蛋白酶的第二蛋白質，其中該蛋白酶能夠裂解位於該報導子活化蛋白質中的裂解位點，導致該報導子活化蛋白質之兩部分進行重排，因而活化該報導子活化蛋白質；以及其中該第一蛋白質與該第二蛋白質的結合導致藉由蛋白酶裂解該報導子活化蛋白質；iii)提供一種報導子，其信號藉由該報導子活化蛋白質的活性而改變；iv)提供一種測試化合物；v)允許該蛋白酶裂解該裂解位點；以及vi)監控該信號；其中報導子信號的改變則表明發生該蛋白質-蛋白質相互作用。
  2. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該第一蛋白質與第二蛋白質至少之一為膜結合蛋白質。
  3. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該第一蛋白質與 第二蛋白質至少之一為細胞質蛋白質。
  4. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該第一蛋白質與第二蛋白質至少之一經修飾以增加其對其他蛋白質的親和力。
  5. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該第一蛋白質係選自由下列所組成之群組：G蛋白偶聯受體、β-腎上腺素能受體、精胺酸後葉加壓素受體2、血清素受體1a、m2蕈毒鹼乙醯膽鹼受體、趨化素受體5、多巴胺D2受體、κ阿片受體、α1a-腎上腺素能受體、胰島素成長因子-1受體、雌激素受體1、雌激素受體2、捲曲(frizzled)受體、上皮成長因子受體、受體酪胺酸激酶、受體絲胺酸/蘇胺酸激酶、轉化成長因子-β受體、活化素、骨形成蛋白受體、細胞激素受體、干擾素受體、介白素受體、紅細胞生成素受體、腫瘤壞死因子受體、瘦素受體、顆粒細胞群落生長刺激因子受體或顆粒細胞-巨噬細胞群落生長刺激因子受體。
  6. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該第二蛋白質係選自由下列所組成之群組：arrestins及散亂(dishevelled)結合蛋白質。
  7. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該蛋白酶係選自由下列所組成之群組：菸草蝕刻病毒核包體A(TEV)蛋白酶、腸激酶、Xa因子蛋白酶、凝血酶、PUREACTTM 蛋白酶、CLEAN CUTTM 蛋白酶、PRECISSIONTM 蛋白酶、絲胺酸和/蘇胺酸蛋白酶、硫醇蛋白酶、天冬胺酸 蛋白酶、金屬蛋白酶、胺基酸蛋白酶、二肽酶、三肽酶、羧肽酶和肽基肽酶。
  8. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該報導子活化蛋白質為自活化(self activating)。
  9. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該報導子活化蛋白質為報導子。
  10. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該報導子活化蛋白質為酵素。
  11. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該報導子活化蛋白質為導致該報導子螢光改變的蛋白質。
  12. 如申請專利範圍第11項之方法，其中該螢光蛋白質為報導子。
  13. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該報導子活化蛋白質係選自由下列所組成之群組：螢光素、Gaussia螢光素酶、水母螢光素酶、螢光蛋白質、綠色螢光蛋白質、DsRed蛋白質、過氧化物酶、β內醯胺酶或β半乳糖苷酶。
  14. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該第一蛋白質與該報導子活化蛋白質形成融合蛋白質。
  15. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該報導子係選自由下列所組成之群組：半乳糖甘酶受質、過氧化物酶受質、螢光素酶受質及螢光素。
  16. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該報導子信號係選自由下列所組成之群組：化學發光及顏色變化。
  17. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該蛋白質-蛋白質相互作用需要該第一或第二蛋白質轉位(translocation)到一個細胞部位或胞器中。
  18. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該方法進一步包含提供一種已知可調控蛋白質-蛋白質相互作用的分子，其中該化合物調控該分子與該蛋白質-蛋白質相互作用的相互作用。
  19. 一種分析系統，其包含：i)一種連接到分裂的(split)及重排的(rearranged)報導子活化蛋白質上的第一蛋白質，其中該報導子活化蛋白質包含插入介於報導子活化蛋白質之兩部分的蛋白酶裂解位點，其中該報導子活化蛋白質之兩部分為重排序；ii)一種連接到蛋白酶的第二蛋白質，其中該蛋白酶能夠裂解位於該報導子活化蛋白質中的裂解位點，導致該報導子活化蛋白質之兩部分進行重排，因而活化該報導子活化蛋白質；以及iii)一種報導子，其信號藉由該報導子活化蛋白質的活性而改變，其中該第一蛋白質與第二蛋白質的結合導致藉由蛋白酶裂解該報導子活化蛋白質。
  20. 如申請專利範圍第19項之分析系統，其中該第一蛋白質與第二蛋白質至少之一為膜結合蛋白質。
  21. 如申請專利範圍第19項之分析系統，其中該第一蛋白 質與第二蛋白質至少之一為細胞質蛋白質。
  22. 如申請專利範圍第19項之分析系統，其中該第一蛋白質與第二蛋白質至少之一經修飾以增加其對其他蛋白質的親和力。
  23. 如申請專利範圍第19項之分析系統，其中該第一蛋白質係選自由下列所組成之群組：G蛋白偶聯受體、β-腎上腺素能受體、精胺酸後葉加壓素受體2、血清素受體1a、m2蕈毒鹼乙醯膽鹼受體、趨化素受體5、多巴胺D2受體、κ阿片受體、α1a-腎上腺素能受體、胰島素成長因子-1受體、雌激素受體1、雌激素受體2、捲曲(frizzled)受體、上皮成長因子受體、受體酪胺酸激酶、受體絲胺酸/蘇胺酸激酶、轉化成長因子-β受體、活化素、骨形成蛋白受體、細胞激素受體、干擾素受體、介白素受體、紅細胞生成素受體、腫瘤壞死因子受體、瘦素受體、顆粒細胞群落生長刺激因子受體或顆粒細胞-巨噬細胞群落生長刺激因子受體。
  24. 如申請專利範圍第19項之分析系統，其中該第二蛋白質係選自由下列所組成之群組：arrestins及散亂(dishevelled)結合蛋白質。
  25. 如申請專利範圍第19項之分析系統，其中該蛋白酶係選自由下列所組成之群組：菸草蝕刻病毒核包體A(TEV)蛋白酶、腸激酶、Xa因子蛋白酶、凝血酶、PUREACTTM 蛋白酶、CLEAN CUTTM 蛋白酶、PRECISSIONTM 蛋白酶、絲胺酸和/蘇胺酸蛋白酶、硫 醇蛋白酶、天冬胺酸蛋白酶、金屬蛋白酶、胺基酸蛋白酶、二肽酶、三肽酶、羧肽酶和肽基肽酶。
  26. 如申請專利範圍第19項之分析系統，其中該報導子活化蛋白質為自活化(self activating)。
  27. 如申請專利範圍第19項之分析系統，其中該報導子活化蛋白質為報導子。
  28. 如申請專利範圍第19項之分析系統，其中該報導子活化蛋白質為酵素。
  29. 如申請專利範圍第19項之分析系統，其中該報導子活化蛋白質為導致該報導子螢光改變的蛋白質。
  30. 如申請專利範圍第29項之分析系統，其中該螢光蛋白質為報導子。
  31. 如申請專利範圍第19項之分析系統，其中報導子活化蛋白質係選自由下列所組成之群組：螢光素、Gaussia螢光素酶、水母螢光素酶、螢光蛋白質、綠色螢光蛋白質、DsRed蛋白質、過氧化物酶、β內醯胺酶或β半乳糖苷酶。
  32. 如申請專利範圍第19項之分析系統，其中該第一蛋白質與該報導子活化蛋白質形成融合蛋白質。
  33. 如申請專利範圍第19項之分析系統，其中該報導子係選自由下列所組成之群組：半乳糖甘酶受質、過氧化物酶受質、螢光素酶受質及螢光素。
  34. 如申請專利範圍第19項之分析系統，其中該報導子信號係選自由下列所組成之群組：化學發光及顏色變化。
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