JP2010537669A - プロテアーゼ活性化レポーターを使用してのタンパク質−タンパク質相互作用を調節する分子の同定 - Google Patents
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Abstract
Description
例えば、受容体についてのリガンドの同定によって例示されるような、タンパク質/タンパク質相互作用の研究は、大きな関心のある領域である。所定の受容体についての1つ又は複数のリガンドが公知である場合でさえ、より有効な又はより選択的なリガンドを同定することへの関心が存在する。7回膜貫通型受容体(7TMR)としても公知の、Gタンパク質共役型受容体、GPCRが、この様式でキャラクタライズされ得るクラスのタンパク質のそれだけに限られない例として本明細書において議論される。しかし、相互作用する任意のタンパク質、例えば代謝経路又はカスケードのメンバーが、本発明のアッセイでの使用に適している。
に結合し、2)コンホメーション変化が引き起こされ、それによって、3)細胞生理学の変化へ至る細胞事象のカスケードが刺激される。GPCRは、複数の細胞内タンパク質、例えばヘテロ三量体グアニンヌクレオチド結合タンパク質(Gタンパク質)及びβアレスチンの活性を調節することによって、シグナルを変換する。Gタンパク質の場合、リガンド−受容体複合体が、グアニンヌクレオチド交換、及びα及びβγサブユニットへのGタンパク質ヘテロ三量体の解離を刺激する。他の状況において、βアレスチンは、Gタンパク質と置き換わること、Gタンパク質シグナル伝達を妨害すること、Gタンパク質シグナル伝達に相乗作用を与えることなどができる。
本発明のアッセイは、相互作用を調節する化合物又は相互作用によって開始される細胞経路の予備知識を必要とすることなく、タンパク質−タンパク質相互作用を検出する。アッセイは、膜タンパク質の相互作用、例えば、ホモ二量体又はヘテロ二量体の形成を検出し得る。アッセイは、膜タンパク質と細胞質タンパク質との相互作用を検出し得る。アッセイは、2つの細胞質タンパク質の相互作用を検出し得る。アッセイは、細胞内空間への又は細胞内の小器官へのタンパク質のトランスロケーションを検出し得る。アッセイは、2つの細胞又はパッケージ又はユニットの相互作用を検出し得る。タンパク質A又はBのいずれかが、リガンド、補因子、又は他の化合物、分子若しくは物質に結合し得、これは、タンパク質−タンパク質相互作用に必須又は不可欠である場合及びそうでない場合がある。
本明細書において使用される場合、用語「細胞」、「細胞株」、及び「細胞培養物」は、交換可能に使用され得る。宿主細胞はまた、それから溶解物が得られ得る源細胞を指し得る。これらの用語の全てはまた、ありとあらゆる次世代である、それらの後代を含む。当然ながら、意図的な若しくは偶然の突然変異、選択又は分化に起因して、全ての後代が同一でない場合がある。第2の構築物の融合タンパク質の部分であるプロテアーゼによって切断される第1の構築物のレポーター活性化タンパク質によって作用されるとシグナルを生じるスクリーニング可能な又は選択可能なマーカー又はレポーターを発現するように、宿主細胞は遺伝子操作されている場合がある。スクリーニング可能なマーカー又はレポーターは、任意の様式で、宿主細胞又はアッセイシステムに導入され得る。
本発明は、それらについて物理的な相互作用が公知であるか又は疑われる任意の2つのタンパク質の使用を意図している。いくつかの実施態様において、タンパク質は、以下の融合タンパク質として存在するか又は存在するように遺伝子操作される:潜伏的又は不活性レポーター活性化ポリペプチドへ融合された第1のタンパク質、及びその切断がレポーター活性化ポリペプチドを放出するか又はこれの活性を可能にする、第1の融合タンパク質中の切断部位を認識するプロテアーゼに融合された第2のタンパク質。
レポーターは、活性なレポーター活性化分子の活性に応答して外観又は機能を変化させ、検出可能なシグナルを生じさせるか、又はそれらの変化を追跡するために容易にモニタリングされ得る、任意の分子であり得る。これらの用語は、緩く適用されるように意味される。レポーター活性化タンパク質は、いったん活性化されると(又はいくつかの可能性のある実施態様においては、不活性化されると)、レポーターの検出可能な変化を引き起こす。この変化を検出することは、例えばテスト化合物がタンパク質−タンパク質相互作用を調節しているかどうかを測定するために使用される。検出可能なシグナルが生成される限り、他の非酵素レポーター活性化タンパク質が使用され得る。従って、公知のレポーター活性化タンパク質、例えばガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼなどが、使用され得る。公知のレポーター、例えばガラクトシダーゼ基質、ペルオキシダーゼ基質、ルシフェラーゼ基質、GFPなどが使用され得る。
プロテアーゼは、特定の部位で他のタンパク質を切断する十分にキャラクタライズされた酵素である。1つのファミリーである、Ser/Thrプロテアーゼファミリーは、セリン及び/又はスレオニン残基で切断する。他のプロテアーゼとしては、システイン又はチオールプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、アミノペプチダーゼ、ジ及びトリペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、並びにペプチジルペプチダーゼが挙げられる。これらの選択は、当業者に委ねられ、本明細書に記載される分子に限定される必要はない。酵素が触媒ドメインを有し、これらのドメインは全長プロテアーゼの代わりに使用され得ることは、よく知られている。このようなものは、本発明に同様に包含される。特定の実施態様は、タバコエッチウイルス核内封入体Aプロテアーゼ(TEV)、
又はその活性部分である。プロテアーゼについての他の特異的な切断部位がまた、当業者によって理解されるように、使用され得る。
第1のタンパク質は、このアッセイのいくつかの実施態様において、相互作用タンパク質へのその結合を増強するように修飾され得る。例えば、一定のGPCRは、リガンド刺激の際により安定に又はより高い親和性でアレスチンに結合し、この増強された相互作用は、不連続ドメイン、例えばC末端テイル中のセリン及びスレオニン残基のクラスターによって仲介されることが公知である(Oakley, et al, J. Biol. Chem., 274:32248−32257, 1999及びOakley, et al., J. Biol. Chem., 276:19452−19460, 2001)。例としてこれを使用すると、受容体などの膜結合タンパク質とそれが結合するタンパク質との親和性を増加させるために、受容体コード配列自体を修飾し得ることが明らかである。このような変更の例は、膜結合タンパク質、例えば7TMR、のC末端領域の修飾であり、これは、その一部を、結合タンパク質にとってより高い親和性を有するが受容体結合機能に影響を与えない別の受容体の対応の領域で置き換えることを含み得る。
本発明は、いくつかの実施態様において、同一の細胞、ユニット又は反応混合物中において発現される場合の、2つのタンパク質の相互作用を評価する直接的な方法を提供する。第1の構築物は、レポーター酵素をコードするポリヌクレオチドにそれ自体が連結された、プロテアーゼ、プロテアーゼ部分又はプロテアーゼ活性を有するポリペプチドについての切断部位をコードするポリヌクレオチドに連結された(concatenated)、第1のポリペプチドをコードする配列を含み得る。「連結された」は、全てのエレメントを含有する単一のポリペプチドに翻訳され得る、単一のインタクトなオープンリーディングフレームを産生するように、表わされた配列が、融合されている状況を表わす。これらは、さらなるタンパク質又はペプチドをコードしても及びしなくてもよいさらなるヌクレオチドによって分離され得るが、分離される必要はない。組換え細胞中に挿入された第2の構築物は、第2のタンパク質、及びプロテアーゼ、プロテアーゼ部分又はプロテアーゼ活性をコードするポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを両方含有し得る。共に、これらのエレメントは、標的タンパク質相互作用に対する効果が求められる候補薬剤と組み合わされると、基本的なアッセイフォーマットを形成する。
本明細書に記載される組成物及びそれらの組み合わせのいずれもが、キットで提供され得る。従って、キットは、適した容器中に、1つ又はそれ以上の成分、例えば本発明のベクター又は細胞、及び本発明に従って使用され得る任意の追加の薬剤を含む。
本発明を説明する具体的な実施態様が、下記の実施例で理解されるであろうが、本発明は、それらに限定されると考えるべきではない。
図1は、活性が中に含有されるTEVプロテアーゼ認識部位に対するTEVプロテアーゼの作用によって再構成される、順列変異不活性ルシフェラーゼを含む実施態様を示す。第1のタンパク質は、示されるように、プロテアーゼと融合されている。TEVプロテアーゼ活性を使用し、第2のタンパク質の実施態様としての順列変異ルシフェラーゼの活性を再構成するように、実施例1を設計した。第2のタンパク質は、示されるように、不活性順列変異レポーター活性化タンパク質である、ルシフェラーゼと融合されている。関心あるタンパク質に融合されたプロテアーゼによって認識されるプロテアーゼ認識及び切断部位を、順列変異レポーター活性化タンパク質中に挿入した。第1のタンパク質及び第2のタンパク質は、第1のタンパク質と第2のタンパク質との相互作用を調節する第3の分子によって近接させられる。近接した融合プロテアーゼによる順列変異不活性レポーター活性化タンパク質のタンパク質分解によって、切断が生じ、順列変異レポーター活性化タンパク質への2つのフラグメントが形成され、活性なレポーター活性化タンパク質活性が再生される。レポーター活性化タンパク質の活性は、適切な試薬及び装置によって評価され得る。
TEVプロテアーゼ認識部位、ENLYFQX(配列番号3)によって分断された状態で、逆の順序に蛍ルシフェラーゼN末端アミノ酸2〜233及びC末端アミノ酸234〜550を再配列することによって、順列変異ルシフェラーゼを構築した。この部位での切断によって、順列変異ルシフェラーゼの再構成された活性が生じる。位置Xは、TEVプロテアーゼ認識親和性及び切断効率を決定付ける任意のアミノ酸であり得る。種々のXが、TEVの酵素反応速度を調節することが示されている。認識配列の他の部位での類似のアミノ酸置換もまた、反応速度を変化させ得る。反応速度を調節することは、例えばスクリーニングプロセスにおけるインキュベーション時間及びシグナル/ノイズパラメータに影響を与えるバックグラウンド活性を最適化するために有利である。次いで、順列変異ルシフェラーゼ(luc234X233、ここで、Xは、TEVヘプタペプチド切断部位、配列番号3のN末端での特定のアミノ酸である)を、GPCR、ADRB2のC末端に融合し、GPCR−順列変異ルシフェラーゼ、ADRB2−luc234X233、発現プラスミドを作製した。
ヒトβアレスチン2−TEV融合プラスミドを、βアレスチン2のC末端にタバコエッチウイルスプロテアーゼAを融合することによって構築した。全てのDNAフラグメントを、適切なテンプレートを使用してPCRによって作製した。GPCR−luc234X233融合遺伝子を、ネオマイシン選択マーカー(Invitrogen)を有するpcDNA3.1(+)にサブクローニングし、Arr−TEV融合遺伝子を、ゼオシン選択マーカー(Invitrogenカタログ番号43−0018)を有するpcDNA3.1(+)にサブクローニングした。
適切な市販のトランスフェクションキットを使用して、CHO−K1細胞に、ADRB2−luc234R233(実施例1)及びArr−TEVプラスミド(実施例2)を同時トランスフェクトした(co-transfected)。トランスフェクションの48時間後、細胞を、2時間、10μM ADRB2アゴニストであるイソプロテレノールで処理したか又は処理せず、Bright−GLOTM又はSteady−GLOTM(Promega)を細胞へ添加し、溶解物の相対的ルミネセンスを、適切なルミネセンスリーダーによって記録した。ルミネセンス活性の3倍を超える増加が、イソプロテレノールの存在下で観察された。
図5は、Arr2−TEVp有り及び無しでのGPCR/順列変異ルシフェラーゼの発現を示す。グラフで表わされたデータにおいて、構築物を細胞中に導入したが、トランスフェクトされた細胞は、いずれのモジュレータにも曝露しなかった。従って、データは、切断部位がセリンを含有する場合、いくらかの自然活性が存在するが、XがR又はVである場合、バックグラウンドノイズは本質的に発生しないことを示している。図6において注目されるように、R又はV切断部位を発現する細胞がアゴニストに曝露された場合、反応が観察された。図7は、GPCR−luc234V233及び/又はArr−TEVを一過性に又は安定に発現する細胞中のルシフェラーゼ活性の用量依存的反応を示す。
図8は、5時間又は1時間インキュベーション期間が、タンパク質−タンパク質相互作用をアッセイするのに十分であることを示している。用量反応関係が明らかに示されている。
ADRB2のC末端にタバコエッチウイルスプロテアーゼAを融合し、該融合遺伝子を、ゼオシン選択マーカー(Invitrogenカタログ番号43−0018)を有するpcDNA3.1(+)中に挿入することによって、ADRB2−TEV融合遺伝子発現プラスミドを構築した。全てのDNAフラグメントを、当技術分野において公知の適切なテンプレートを使用して、PCRによって、作製した。
βアレスチン2−順列変異ルシフェラーゼ(Arr−luc234X233)融合遺伝子発現プラスミドを、βアレスチン2のC末端に順列変異ルシフェラーゼluc234X233を融合することによって構築した。TEVプロテアーゼ切断部位はENLYFQ/X(Rachel B. Kapust, et al. Biochemical & Biophysical Research Communications, 294 (2002) 949−955)であり、ここで、E及びQは、一般的に不変であり、ここで、Xは任意のアミノ酸であり得、しかしG及びSが、その部位で見出される一般的なアミノ酸である。切断は、Q残基とX残基との間で生じる。Xは、切断効率を決定し得る。いくつかの実施態様において、TEVプロテアーゼ切断部位を、順列変異ルシフェラーゼ中に含めた。バックグラウンド及びシグナル/ノイズ比は、単純でルーチンな実験によって改善され得る。例えばTEVについてのX加水分解部位でグリシンの代わりにバリンを使用することによって、いくつかの適用においてバックグラウンドを低下させることを見出した。融合した融合遺伝子を、ネオマイシン選択マーカー(Invitrogen)を有するpcDNA3.1(+)にクローニングした。
適切な市販のトランスフェクションキットを使用して、HEK293細胞に、プラスミドADRB2−TEV及びArr−luc234V233を同時トランスフェクトし、ここで、TEV認識配列はENLYFQV(配列番号12)であった。トランスフェクションの48時間後に、細胞を、1及び5時間、種々の濃度のADRB2アゴニスト、イソプロテレノールで処理し、Bright−GLOTM(Promega)を細胞へ添加し、相対的ルミネセンス単位をEnVison IITMで記録した。用量依存的なルミネセンス活性が、イソプロテレノールと共に1時間及び5時間インキュベーションした後の両方で観察された。
図9、左パネルは、Arr−luc234V233を安定的に発現し、ADRB2−TEV融合タンパク質を一過性で発現するHEK293細胞中の、リガンド誘導ルシフェラーゼ活性を示す。右パネルは、CHO細胞中の、アレスチン−レポーター活性化タンパク質構築物の安定発現、及び7TMR−プロテアーゼ融合体の一過性発現を示す。
GPCR−luc234R233又はArr−TEVを発現する安定細胞株を、HEK293又はCHO細胞で作製した。各DNA 20ng/ウエルを、HEK293及びTranIT−CHO細胞についての、Lipofectamine(Invitrogen)での、12ウエルプレート中のトランスフェクションのために使用した。
per−lucアッセイにおいて、384ウエルプレートフォーマットをルーチンに使用した。他のプレートフォーマットも許容可能なフォーマットと考えられる。GPCR−luc234R233又はArr−TEVを安定的に発現するCHO細胞を、組織培養処理表面384ウエルホワイトアッセイプレート(Becton Dickinson)中、10,000細胞/ウエルで平板培養した。翌日、細胞をアゴニストで処理した;10μM〜0.7pMの濃度(無血清細胞培地中作製した3:1連続希釈で)。Steady−Gloルシフェラーゼアッセイシステム(Promega)を、ルシフェラーゼ活性を測定するために使用した。アゴニスト処理の2時間後に、培地を吸引し、ルシフェラーゼアッセイ試薬25μlを各ウエルへ添加した。相対的ルミネセンス単位(RLU)を、Perkin Elmer製のマルチラベルリーダーであるEnVisionで読み取った。PRISMソフトウエアを用いて、データをプロットし、解析した。
Arr−luc234V233を安定的に発現するHEK293細胞を、ネオマイシンに対する耐性についての選択によって作製した。ネオマイシン耐性遺伝子は、Arr−luc234V233発現プラスミドベクターpcDNA3.1に提示された。
図9、右パネルは、CHO株中におけるイソプロテレノールに対する用量反応を示す。GPCR−luc234R233又はArr−TEVを発現する安定細胞株を、CHO細胞中作製した。TransfectIT−CHOトランスフェクションキット(Mirus Bio, Madison, WI)を用いて、12ウエルプレート中、1ウエル当たり、各DNA 1μgをトランスフェクションのために使用した。単一コロニーを、ネオマイシン又はゼオマイシンでの選択下でトランスフェクタントから採取した。
適切な市販のトランスフェクションキットを使用して、Arr−luc234V233安定発現細胞に、ADRB2−TEVプラスミドをトランスフェクトした。ADRB2−TEVを一過性で発現し、Arr−luc−234V233を安定的に発現する細胞を、2時間、イソプロテレノールと共にインキュベートし、Bright−GLOTMルシフェラーゼ試薬を細胞へ添加した。用量依存的なルシフェラーゼ活性がEnVison IIにおいて記録された。
図10は、アゴニスト、部分アゴニスト、アンタゴニスト、及び非特異的内在性受容体反応についてのGPCR Per−Lucアッセイの評価を示す。
Lipofectamine 2000トランスフェクション試薬(Invitrogen)を使用して、Arr−luc234V233を安定的に発現するHEK293細胞に、ADRB2−TEVプラスミドをトランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後、種々の濃度の公知のアゴニスト、イソプロテレノール;部分アゴニストBRL37344(Sigma−Aldrich);アンタゴニストICI118551(ICI);アンタゴニストICI118551及び200nMのイソプロテレノール;並びに、HEK293内因性EDG受容体についてのアゴニストS1P(スフィンゴシン−1−ホスフェート)と共に、細胞を2時間インキュベートし、Bright−GLOTMルシフェラーゼ試薬を細胞へ添加した。図10に示されるように、用量依存的なルシフェラーゼ活性がEnVison IIにおいて記録された。
アッセイのEC50及びIC50値は、FLIPR及びcAMPアッセイにおいて得られた値と類似していた。HEK293細胞中の内在性受容体EDG、及びそのリガンドS1Pは、ルシフェラーゼ活性に影響を与えなかったが、FLIPR及びcAMPなどの他のアッセイは、陽性シグナルを生じさせた。アゴニストである、イソプロテレノールは、反応を生じさせた。部分アゴニストである、BRL37344は、段階的な反応を示した。アンタゴニストである、ICI18551は、イソプロテレノールを阻害したが、それ単独では活性を持たなかった。従って、本発明のアッセイは特異的であり、図10に示されるように(他の比較データと併せて考えて)、偽陽性シグナルはよりわずかしか生ぜず、低下した。
図14は、XについてVを使用する、TEVプロテアーゼ認識部位、ENLYFQXと共に、C末端アミノ酸234〜550の後ろにホタルルシフェラーゼN末端アミノ酸2〜456をクローニングすることによって、順列変異ルシフェラーゼを構築した例を示す。順列変異ルシフェラーゼ(luc234V456)を、GPCR、ADRB2のC末端へ融合し、GPCR−順列変異ルシフェラーゼ構築物、ADRB2−luc234V456発現プラスミドを作製した。
全てのDNAフラグメントを、適切なテンプレートを使用して、PCRによって作製した。ADRB2−luc234V456融合遺伝子を、ネオマイシン選択マーカー(Invitrogen)を有するpcDNA3.1(+)にクローニングした。
適切な市販のトランスフェクションキットを使用して、CHO−K1細胞に、ADRB2−luc234V456及びArr−TEVプラスミドを同時トランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後に、細胞を、2時間、10μM ADRB2アゴニスト、イソプロテレノールで処理したか又は処理せず、Bright−GLOTM又はSteady−GLOTM(Promega)を細胞へ添加し、相対的ルミネセンスを適切なルミネセンスリーダーによって記録した。再構成されたルシフェラーゼ活性が、種々の用量のイソプロテレノールに反応して観察された。
Arr−luc234V233を安定的に発現するHEK293細胞を、ネオマイシンに対する耐性について選択した。ネオマイシン耐性遺伝子は、Arr−luc234V233発現プラスミドベクターpcDNA3中に提示された。アゴニストに反応してルシフェラーゼ活性が観察された。
図13は、V2インバースアゴニストでの用量依存性を示す。
この実施例のため、Lipofectamine 2000トランスフェクション試薬(Invitrogen)を使用して、Arr−luc234V233を安定的に発現するHEK293細胞に、V2−TEVプラスミドをトランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後、標準的なアッセイを使用してアンタゴニストと考えられている、種々の濃度の化合物、SR121463(sanofi Recherche, Toulouse, FR)と共に、細胞を2時間インキュベートした。Bright−GLOTMルシフェラーゼ試薬を、細胞に添加した。用量依存的なルシフェラーゼ活性がEnVison IIにおいて記録された。即ち、ルミネセンスのレベルの増加が、より適切に定義されたインバースアゴニストである、SR121463の量の増加に伴って観察された。
このアッセイにおいて、インバースアゴニストは、他のインバースアゴニストと同様に、アゴニストとして作用した。インバースアゴニストは、MAPKのβアレスチン仲介活性化を促進する一方で、V2 Gタンパク質シグナル伝達経路を遮断し得ることが公知である(Azzi et al., PNAS, 2003, 100:11406−11411)。従って、本発明のアッセイは、Gタンパク質共役型受容体についての明確な活性コンフォメーションを示し得る。
対照的に、古典的なアッセイシステムにおいては、GPCRのインバースアゴニストは、アンタゴニストとして作用する。これは、インバースアゴニストが、Gタンパク質シグナル伝達のためのGPCRの不活性コンフォメーションに恐らく結合し、これを安定化するためである。しかし、いくつかのインバースアゴニストは、Gタンパク質シグナル伝達のためのGPCRの不活性形態を安定させ、かつβアレスチンシグナル伝達経路を活性化するようにGPCRへのβアレスチンリクルートメントを促進させる。
図6は、アゴニスト誘導ルシフェラーゼ活性を示す。
この実施例において、順列変異ルシフェラーゼを、TEVプロテアーゼ認識部位、ENLYFQXによって分断された状態で、逆の順序にホタルルシフェラーゼN末端アミノ酸2〜233及びC末端アミノ酸234〜550を再配列することによって構築した。位置Xは、任意のアミノ酸であってよい。この位置でのアミノ酸は、TEVプロテアーゼ認識親和性及び切断効率を決定付けることが公知である。次いで、順列変異ルシフェラーゼ(luc234X233)を、GPCR、即ちADRB2、のC末端へ融合し、GPCR−順列変異ルシフェラーゼ、即ちADRB2−luc234X233発現プラスミドを作製した。
ヒトβアレスチン2−TEV融合プラスミドを、βアレスチン2のC末端にタバコエッチウイルスプロテアーゼAを融合することによって構築した。DNAフラグメントを、適切なテンプレートを使用してPCRによって作製した。GPCR−luc234X233融合遺伝子を、ネオマイシン選択マーカー(Invitrogen)を有するpcDNA3.1(+)にサブクローニングし、Arr−TEV融合遺伝子を、ゼオシン選択マーカー(Invitrogenカタログ番号43−0018)を有するpcDNA3.1(+)にサブクローニングした。
適切な市販のトランスフェクションキットを使用して、CHO−K1細胞に、ADRB2−luc234R233及びArr−TEVプラスミドを同時トランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後、細胞を、2時間、10μMのADRB2アゴニスト、イソプロテレノールで処理したか又は処理せず、Bright−GLOTM又はSteady−GLOTM(Promega)を細胞へ添加し、相対的ルミネセンスを、適切なルミネセンスリーダーによって記録した。ルミネセンス活性の3倍を超える増加が、イソプロテレノールの存在下で観察された。
図12は、本発明のアッセイ(左パネル)及び別のアッセイ(右パネル)を使用しての、アゴニスト、アンタゴニスト及びインバースアゴニストの結果を示す。その2種のプロットは、アゴニスト、アンタゴニスト及びインバースアゴニストの区別及び逆の効果を示す。本発明のアッセイは、良好な特異的活性を与えた。
図7は、ADRB2−順列変異ルシフェラーゼ及びArr−TEVの両方を有するCHO細胞を示す。左パネルのデータ:TEV認識部位、ENLYFQVを含有するように、ADRB2−luc234V233を作製した。適切な市販のトランスフェクションキットを使用して、CHO−K1細胞に、ADRB2−luc234V233及びArr−TEVプラスミドを同時トランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後、細胞を、2時間、種々の濃度のADRB2アゴニスト、イソプロテレノールで処理し、Bright−GLOTM又はSteady−GLOTM(Promega)を細胞へ添加し、相対的ルミネセンスを、適切なルミネセンスリーダーによって記録した。
図7、右パネルは、異なる切断部位を有する安定的なトランスフェクトされた細胞を使用してのデータを要約する。結果は、左パネルのそれと類似している。従って、異なる切断部位を有する2つのGPCR−ルシフェラーゼ構築物が、アゴニストに反応した。
図6は、RとしてのX及びVとしてのXを比較する、アゴニスト誘導シグナル活性を示す。結果は、類似しており、Xがルーチンに変え得ることを示す。
この実施例において、TEVプロテアーゼ認識部位、ENLYFQ/Xによって割り込まれた状態で、逆の順序にホタルルシフェラーゼN末端アミノ酸2〜233及びC末端アミノ酸234〜550を再配列することによって、順列変異ルシフェラーゼを構築した。位置Xは、TEVプロテアーゼ認識親和性及び切断効率を決定付ける、任意のアミノ酸であってよい。V及びRが示されている。次いで、順列変異ルシフェラーゼ(luc234X233)を、GPCR、即ちADRB2、のC末端へ融合し、GPCR−順列変異ルシフェラーゼ、即ちADRB2−luc234X233発現プラスミドを作製した。
この実施例において、ヒトβbアレスチン2−TEV融合プラスミドを、βアレスチン2のC末端へタバコエッチウイルスプロテアーゼAを融合することによって構築した。全てのDNAフラグメントを、適切なテンプレートを使用して、PCRによって作製した。GPCR−luc234X233融合遺伝子を、ネオマイシン選択マーカー(Invitrogen)を有するpcDNA3.1(+)にサブクローニングし、Arr−TEV融合遺伝子を、ゼオシン選択マーカー(Invitrogenカタログ番号43−0018)を有するpcDNA3.1(+)にサブクローニングした。
適切な市販のトランスフェクションキットを使用して、CHO−K1細胞に、ADRB2−luc234R233及びArr−TEVプラスミドを同時トランスフェクトした。48時間後、細胞を、2時間、10μMのADRB2アゴニストで処理したか又は処理せず、Bright−GLOTM又はSteady−GLOTM(Promega)を細胞へ添加し、相対的ルミネセンス単位を、適切なルミネセンスリーダーによって記録した。3倍を超えるより高いレベルのルミネセンス活性が、イソプロテレノールの存在下で観察された。
図11、左パネルは、V2−TEVを一過性で発現する細胞における8−AVPアゴニストを用いた結果を示す。
この実施例において、Lipofectamine 2000トランスフェクション試薬(Invitrogen)を使用して、Arr−luc234V233を安定的に発現するHEK293細胞に、V2−TEVプラスミドをトランスフェクトした。48時間後、種々の濃度のアゴニスト8−AVP(Arg8バソプレシン;V2バソプレシン受容体の公知のアゴニスト)と共に、細胞を2時間インキュベートし、Bright−GLOTMルシフェラーゼ試薬を細胞へ添加した。用量依存的なルシフェラーゼ活性がEnVison IIにおいて記録された。
Lipofectamine 2000トランスフェクション試薬(Invitrogen)を使用して、Arr−luc234V233を安定的に発現するHEK293細胞に、V2−TEVプラスミドをトランスフェクトした。48時間後、種々の濃度のインバースアゴニストと共に、細胞を2時間インキュベートし、Bright−GLOTM ルシフェラーゼ試薬を細胞へ添加した。用量依存的なルシフェラーゼ活性がEnVison IIにおいて記録された。
このアッセイにおいて、インバースアゴニストは、アゴニストとして作用した。いくつかのインバースアゴニストは、V2 Gタンパク質シグナル伝達経路を遮断するが、MAPKのβアレスチン仲介活性化を促進することが公知である(Azzi et al., PNAS, 2003, 100:11406−11411)。従って、本アッセイは、Gタンパク質共役型受容体の明確な活性コンフォメーションを評価し得る。
図11、右パネルは、V2受容体とのβアレスチン相互作用を促進することによる、V2インバースアゴニストに誘導用量依存的ルシフェラーゼ活性を示す。
この実施例において、Lipofectamine 2000トランスフェクション試薬(Invitrogen)を使用して、Arr−luc234V233を安定的に発現するHEK293細胞に、V2−TEVプラスミドをトランスフェクトした。48時間後、種々の濃度のインバースアゴニストと共に、細胞を2時間インキュベートし、Bright−GLOTMルシフェラーゼ試薬を細胞へ添加した。用量依存的なルシフェラーゼ活性がEnVison IIにおいて記録された。
Claims (30)
- 第1のタンパク質と第2のタンパク質との相互作用を調節する化合物を同定する方法であって、
i)不活性レポーター活性化タンパク質に結合した第1のタンパク質、及びプロテアーゼに結合した第2のタンパク質を備えること、ここで、該プロテアーゼは、上記レポーター活性化タンパク質中の切断部位を切断し、それによって該レポーター活性化タンパク質を活性化することができる;
ii)上記化合物、及び場合によりレポーターを備えること;
iii)上記プロテアーゼに上記切断部位を切断させること;及び
iv)上記レポーター活性化タンパク質の活性によって変化する、その活性化したレポーター活性化タンパク質又はそのレポーターからのレポーターシグナルをモニタリングすること;
を含み、
ここで、レポーターシグナルの変化は、上記タンパク質−タンパク質相互作用を示す、方法。 - レポーター活性化タンパク質がレポーターである、請求項1に記載の方法。
- 第1のタンパク質が、レポーター活性化タンパク質と共に融合タンパク質を形成する、請求項1に記載の方法。
- タンパク質−タンパク質相互作用を調節することが公知の分子を備えることをさらに含み、ここで、化合物が、該分子と該タンパク質−タンパク質相互作用との相互作用を調節する、請求項1に記載の方法。
- レポーター活性化タンパク質が酵素である、請求項1に記載の方法。
- レポーター活性化タンパク質が、レポーターの蛍光の変化を引き起こすタンパク質である、請求項1に記載の方法。
- 第1のタンパク質が膜タンパク質である、請求項1に記載の方法。
- アッセイシステムであって、
i)潜伏性のレポーター活性化タンパク質を含む第1のタンパク質;及び
ii)プロテアーゼを含む第2のタンパク質;及び場合により
iii)シグナルが上記レポーター活性化タンパク質によって変化されるレポーター;
を含み、
ここで、上記潜伏性のレポーター活性化タンパク質は、上記プロテアーゼによる切断によって活性化され、該第1のタンパク質と該第2のタンパク質との結合が、そのレポーター活性化タンパク質の切断を可能にする、システム。 - レポーター活性化タンパク質がレポーターである、請求項8に記載のシステム。
- レポーターが、レポーター活性化タンパク質のポリペプチドフラグメントの再配列によって活性化される又は不活性化される、請求項8に記載のシステム。
- 第1のタンパク質、第2のタンパク質、又は両方が、膜タンパク質である、請求項8に記載のシステム。
- 膜タンパク質が受容体タンパク質である、請求項11に記載のシステム。
- 受容体タンパク質が7回膜貫通型受容体(7TMR)である、請求項12に記載のシステム。
- プロテアーゼが、少なくとも4つのアミノ酸を有する認識配列を有する、請求項8に記載のシステム。
- プロテアーゼが、少なくとも5つのアミノ酸を有する認識配列を有する、請求項8に記載のシステム。
- プロテアーゼが、少なくとも6つのアミノ酸を有する認識配列を有する、請求項8に記載のシステム。
- プロテアーゼが、少なくとも7つのアミノ酸を有する認識配列を有する、請求項8に記載のシステム。
- プロテアーゼがタバコエッチウイルス(TEV)プロテアーゼである、請求項8に記載のシステム。
- レポーターがルシフェリンである、請求項8に記載のシステム。
- レポーターが蛍光タンパク質である、請求項8に記載のシステム。
- レポーターが緑色蛍光タンパク質(GFP)である、請求項20に記載のシステム。
- 第1のタンパク質及び第2のタンパク質が膜タンパク質である、請求項11に記載のシステム。
- 第1のタンパク質、第2のタンパク質、又は両方が、細胞質タンパク質である、請求項8に記載のシステム。
- 第1の及び第2のタンパク質が、細胞質タンパク質である、請求項23に記載のシステム。
- 第2のタンパク質がレポーターを含む、請求項8に記載のシステム。
- ータータンパク質が、第1のタンパク質との接触によって活性化される又は不活性化される、順列変異レポータータンパク質である、請求項25に記載のシステム。
- 結合が、細胞コンパートメント又は細胞小器官への第1のタンパク質又は第2のタンパク質のトランスロケーションを必要とする、請求項8に記載のシステム。
- 核への第1のタンパク質又は第2のタンパク質のトランスロケーションが、レポーターシグナルの変化を引き起こす、請求項27に記載のシステム。
- レポーター又はプロテアーゼが、核ターゲッティングポリペプチドを含む、請求項8に記載のシステム。
- ターゲッティングポリペプチドが、塩基性アミノ酸を含む、請求項29に記載のシステム。
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