JP2022513606A - 宿主の生理機能を形成する微生物叢代謝産物 - Google Patents

Abstract

Ｇタンパク質共役型受容体などの融合タンパク質に結合する微生物叢からの試験化合物または試験化合物の混合物を同定する方法が記載される。また、Ｇタンパク質共役型受容体を活性化することができる微生物叢代謝産物のハイスループットスクリーニングの方法も記載される。

Description

関連出願の相互参照

この出願は、２０１８年１２月１０日に出願された米国仮出願第６２／７７７，４８０号の優先権を主張し、その出願は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

政府の支援

連邦政府が支援する研究に関する声明
本発明は、米国国立衛生研究所によって授与された助成金ＡＩ１２３４７７の下で政府の支援を受けてなされた。政府は本発明に一定の権利を有する。

微生物叢（マイクロバイオータ）メタボロームは、多様な微生物種および株と、環境入力（例えば食事など）と、宿主因子との間の複雑に絡み合う相互作用から生じる。高度なメタボローム、メタゲノムおよび機能ゲノムのアプローチは、ヒト微生物叢が数万のユニークな小分子を生成できることが明らかにした（非特許文献１～３）。しかしながら、腸内微生物叢のメタボロームの規模と複雑さは、種内および種間の微生物化学が宿主の生理機能にどのように影響するかを分析するのに大きな課題を生じさせる可能性がある（非特許文献１および４）。ヒト宿主に対する微生物叢のメタボロームの潜在的影響の理解はまだ未成熟のままである。

ＭＡＯＩは、ＦＤＡが承認した最初の抗うつ薬であった（非特許文献５）。しかしながら、それらは潜在的に致命的な食事とのおよび薬物間の相互作用のせいで支持を失ってきた（非特許文献６）。それにもかかわらず、ＭＡＯＩは、難治性うつ病やその他の精神障害（非特許文献６）、ならびにパーキンソン病（非特許文献７）の患者にとって重要な治療選択肢であり続けている。

ヒスタミンは、Ｌ－Ｈｉｓの脱炭酸によって生成される（非特許文献８）。ヒスタミンは炎症反応に関与しており、腸の生理学的機能を調節することができる。

Donia and Fischbach, 2015, Science 349, 1254766 Milshteyn et al., 2018, Cell Host Microbe 23, 725-736 Nicholson et al., 2012, Science 336, 1262-1267 Fischbach, 2018, Cell 174, 785-790 Ramachandraih, 2011, Indian J Psychiatry 53, 180-182 Fiedorowicz, 2004, J Psychiatr Pract 10, 239-248 Riederer and Laux, 2011, Exp Neurobiol 20, 1-17 Tannase, 1985, The Journal of Biological Chemistry 260, 6738-6746

一態様では、試験化合物がｉｎ ｖｉｖｏで第１のタンパク質の活性を調節（modulate）するかどうかを決定するための方法が提供され、その方法は、
（ａ）（ｉ）第１のタンパク質と、プロテアーゼの切断部位と、細胞におけるレポーター遺伝子の転写を活性化するタンパク質とを含む第１の融合タンパク質をコードする第１の核酸分子；（ｉｉ）前記第１のタンパク質が活性化されると該第１のタンパク質と相互作用する第２のタンパク質と、前記第１の融合タンパク質内のプロテアーゼ切断部位を切断することができるプロテアーゼまたはそのフラグメントとを含む第２の融合タンパク質をコードする第２の核酸分子；および（ｉｉｉ）レポーター遺伝子を含む第３の核酸分子であって、前記レポーター遺伝子は、その転写を活性化するタンパク質に応答するエレメントに作動可能に連結されたバーコード配列である、第３の核酸分子；を含む細胞に、前記化合物を接触させること、および
（ｂ）前記バーコード配列の転写レベルを決定すること
を含む。

いくつかの実施形態において、第１の核酸分子、第２の核酸分子、および第３の核酸分子は、特定の受容体の個々のバーコードへの連結を可能にするようにクローン的に発現される（clonally express）。いくつかの実施形態において、第１の核酸分子、第２の核酸分子、および第３の核酸分子は、コトランスフェクションを介してクローン的に発現される。いくつかの実施形態において、第１の核酸分子、第２の核酸分子、および第３の核酸分子は、安定発現を介してクローン的に発現される。いくつかの実施形態では、バーコード配列は４～５０塩基を含む。

いくつかの実施形態では、この方法は、
（ｃ）試験化合物が存在しない対照と比較して、試験化合物の存在下で前記バーコード配列の転写レベルが上昇した場合に、試験化合物が第１のタンパク質を活性化すると結論付けることをさらに含む。

いくつかの実施形態では、この方法は、
（ｃ）未処理の細胞と比較して、試験化合物の存在下で前記バーコード配列の転写レベルが上昇した場合に、試験化合物が第１のタンパク質を活性化すると結論付けることをさらに含む。

いくつかの実施形態では、この方法は、
（ｃ）第１のタンパク質のアンタゴニストと組み合わせて第１のタンパク質のアゴニストの単回投与で処理された細胞と比較して、試験化合物の存在下で前記バーコード配列の転写レベルが上昇した場合に、試験化合物が第１のタンパク質を活性化すると結論することをさらに含む。

いくつかの実施形態では、第１のタンパク質は膜貫通タンパク質である。いくつかの実施形態において、第１のタンパク質は、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）である。いくつかの実施形態において、ＧＰＣＲは、非嗅覚ＧＰＣＲである。いくつかの実施形態では、ＧＰＣＲはオーファンＧＰＣＲである。いくつかの実施形態において、ＧＰＣＲはヒトＧＰＣＲである。

様々な実施形態において、前記細胞におけるレポーター遺伝子の転写を活性化するタンパク質は、ｔＴＡ、ｃａｓ９融合タンパク質、ｇａｌ４／ＶＰ１６、エストロゲン受容体、アンドロゲン受容体、鉱質コルチコイド受容体、またはグルココルチコイド受容体である。いくつかの実施形態において、ｃａｓ９融合タンパク質はｃａｓ９－ｖｐ６４である。

様々な実施形態において、前記細胞におけるレポーター遺伝子の転写を活性化するタンパク質はｔＴＡである。いくつかの実施形態において、第１のタンパク質が活性化されると第１のタンパク質と相互作用する第２のタンパク質は、β－アレスチン、Ｇタンパク質受容体キナーゼ（ＧＲＫ）、またはＧ－アルファ（Ｇα）である。いくつかの実施形態において、第２のタンパク質は、β－アレスチンである。いくつかの実施形態において、プロテアーゼは、タバコエッチウイルス核内封入体Ａプロテアーゼ（Tobacco Etch Virus nuclear inclusion A protease）（ＴＥＶプロテアーゼ）である。いくつかの実施形態において、細胞は、非接着性哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、Ｅｘｐｉ ２９３Ｔ細胞、Ｊｕｒｋａｔ、Ｈｅｌａ Ｔ４、ｒａｊｉ、ｒａｍｏｓ、ｃｈｏ－ｓ、またはｔｈｐ１細胞である。

様々な実施形態において、前記バーコード配列の転写レベルは、ｃＤＮＡのシーケンシング（配列決定）によって決定される。いくつかの実施形態において、ｃＤＮＡは、ポリｄＴプライマーを使用した細胞から単離されたｍＲＮＡの逆転写によって生成される。いくつかの実施形態において、試験化合物は、対象の微生物叢内に含まれる細菌分類群によって産生される代謝産物である。いくつかの実施形態において、試験化合物は、対象の微生物叢内に含まれる細菌株によって産生される代謝産物である。いくつかの実施形態において、微生物叢（マイクロバイオータ）は、消化管内（ＧＩ）微生物叢である。いくつかの実施形態において、細菌株は、クローン的に配置され（arrayed）、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養される。いくつかの実施形態では、この方法は、細菌株を同定することをさらに含む。いくつかの実施形態において、細菌株は、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子シーケンシングまたは全ゲノムシーケンシングを使用して同定される。いくつかの実施形態では、対象はヒトである。

いくつかの実施形態では、この方法はハイスループットフォーマットで実施され、
（ｉ）トランスフェクトまたは形質導入された各細胞が第１のタンパク質とバーコード配列との特定の組み合わせを有するように、マルチウェルプレートの個々のウェルに分けられた複数の細胞に、第１、第２および第３の核酸分子をトランスフェクトまたは形質導入すること；
（ｉｉ）トランスフェクトされた細胞を混合すること；
（ｉｉｉ）混合された細胞をマルチウェルプレートの個々のウェルに再配置すること；
（ｉｖ）再配置された細胞混合物を１つまたは複数の試験化合物に曝すこと；
（ｖ）バーコードをシーケンシングすること；および
（ｖｉ）試験化合物が存在しない対照と比較して、試験化合物の存在下でどのバーコード配列が増加するかを決定すること
を含む。

いくつかの実施形態では、この方法はハイスループットフォーマットで実施され、
（ｉ）第２の核酸分子（Ｂａｒｒ－ＴＥＶ）を安定発現する複数の細胞に、第１および第３の核酸分子（受容体およびバーコード）をトランスフェクトまたは形質導入すること；
（ｉｉ）トランスフェクトされた細胞を混合すること；
（ｉｉｉ）混合された細胞をマルチウェルプレートの個々のウェルに再配置すること；
（ｉｖ）再配置された細胞混合物を１つまたは複数の試験化合物に曝すこと；
（ｖ）バーコードをシーケンシングすること；および
（ｖｉ）試験化合物が存在しない対照と比較して、試験化合物の存在下でどのバーコード配列が増加するかを決定すること
を含む。

いくつかの実施形態では、第１の核酸分子はＧＰＣＲをコードし、第２の核酸分子はＢａｒｒ－ＴＥＶをコードし、第３の核酸分子はバーコードを含む。

別の態様では、複数のＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）の活性を調節することができる微生物叢代謝産物のハイスループットスクリーニングのための方法が提供され、この方法は、
ａ）複数の非接着性哺乳動物細胞を提供することであって、各細胞は、（ｉ）タバコエッチウイルス核内封入体Ａプロテアーゼ（ＴＥＶプロテアーゼ）の切断部位を介して転写因子ｔＴＡに連結されたＧＰＣＲを含む第１の融合タンパク質をコードする第１の核酸分子、（ｉｉ）β－アレスチンと、第１の融合タンパク質のＴＥＶプロテアーゼ部位を切断するように構成されたＴＥＶプロテアーゼとを含む第２の融合タンパク質をコードする第２の核酸分子、および（ｉｉｉ）ｔＴＡ転写因子によって特異的に活性化されるプロモーターに作動可能に連結されたバーコード配列を含む第３の核酸分子を含み、それによって各バーコード配列が個々のＧＰＣＲに特異的に連結される、前記細胞を提供すること、
ｂ）前記複数の細胞を１つまたは複数の微生物叢代謝産物あるいは１つまたは複数の化合物と接触させること；
ｃ）バーコードをシーケンシングすること；および
ｄ）代謝産物が存在しない対照と比較して、代謝産物の存在下でどのバーコード配列の転写レベルが上昇または低下するかを決定すること；
を含む。

いくつかの実施形態において、ＧＰＣＲは非嗅覚ＧＰＣＲである。いくつかの実施形態では、ＧＰＣＲはオーファンＧＰＣＲである。いくつかの実施形態において、ＧＰＣＲはヒトＧＰＣＲである。いくつかの実施形態では、細胞はＥｘｐｉ ２９３Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、前記バーコード配列の転写レベルは、ｃＤＮＡのシーケンシングによって決定される。いくつかの実施形態において、ｃＤＮＡは、細胞から単離されたＲＮＡの逆転写によって生成される。いくつかの実施形態において、微生物叢は、消化管内（ＧＩ）微生物叢である。いくつかの実施形態では、この方法は、特定のＧＰＣＲを活性化する特定の代謝産物を産生する細菌株を同定することをさらに含む。いくつかの実施形態において、細菌株は、１６Ｓ ｒＲＮＡシーケンシングを使用して同定される。

別の態様では、対象におけるモノアミンオキシダーゼ阻害剤（ＭＡＯＩ）誘発毒性を予防または処置する方法が提供され、この方法は、フェネチルアミン産生遺伝子をコードする核酸配列を含む細菌株を標的とするのに有効な抗生物質を投与することを含む。さらに別の態様では、モルガネラ属菌種（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ ｓｐｐ）を標的とするのに有効な抗生物質を投与することを含む、対象におけるＭＡＯＩ誘発毒性を予防または処置する方法が提供される。

別の態様では、対象におけるＭＡＯ活性の低下によって引き起こされる疾患または状態を処置する方法が提供され、この方法は、フェネチルアミン産生遺伝子をコードする核酸配列を含む生物を標的とするのに有効な抗生物質を投与することを含む。

いくつかの実施形態では、生物は細菌株である。上記の態様のいくつかの実施形態では、細菌株はフェネチルアミンを産生する。いくつかの実施形態では、細菌株はフェネチルアミンを分泌する。いくつかの実施形態では、疾患はブルンナー症候群である。いくつかの実施形態では、状態は自閉症または反社会的行動である。いくつかの実施形態において、対象は、ＭＡＯＡ－Ｌ変異体を発現する。いくつかの実施形態において、抗生物質は、モルガネラ・モルガニー（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ ｍｏｒｇａｎｉｉ）を標的とするのに有効である。いくつかの実施形態において、抗生物質は、セフェピム、ピペラシリン、タゾバクタム、セフタジジム、セフォタキシム、セフチブテン、メロペネム、ドリペネム、エルタペネム、フルオロキノロン、またはアミノグリコシドである。

別の態様では、対象におけるうつ病を処置する方法が提供され、この方法は、フェネチルアミン産生遺伝子をコードする核酸配列を含む細菌株を投与することを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、対象に抗うつ剤を投与することをさらに含む。いくつかの実施形態では、抗うつ剤はＭＡＯＩである。いくつかの実施形態では、細菌株はフェネチルアミンを産生する。

別の態様では、対象におけるモノアミンオキシダーゼ阻害剤（ＭＡＯＩ）の潜在的毒性を評価するための方法が提供され、この方法は、
ａ）対象から消化管内微生物叢サンプルを取得すること；および
ｂ）フェネチルアミン産生遺伝子を含む細菌分類群または細菌株の存在についてサンプルをアッセイすること
を含む。

いくつかの実施形態において、フェネチルアミン産生酵素の量は、微生物叢によって産生される酵素の規定された割合（defined fraction）を超える。いくつかの実施形態において、消化管内微生物叢サンプルは糞便サンプルである。

別の態様では、対象におけるＭＡＯＩの潜在的有効性を評価するための方法が提供され、この方法は、
ａ）対象の糞便サンプルまたは胃腸管からのサンプルを採取すること、および
ｂ）フェネチルアミン産生遺伝子をコードする核酸配列を含む細菌株の存在についてアッセイすること
を含む。

いくつかの実施形態では、この方法は、胃腸管に存在する細菌株の量についてアッセイすることをさらに含む。いくつかの実施形態では、この方法は、ＭＡＯＩで対象を処置することをさらに含む。いくつかの実施形態では、この方法は、細菌株の存在および／または存在する細菌株の量に基づいてＭＡＯＩの投与量を調整または決定することをさらに含む。いくつかの実施形態において、細菌株は、モルガネラ属菌種の細菌である。いくつかの実施形態において、細菌株はモルガネラ・モルガニー（Ｍ．ｍｏｒｇａｎｉｉ）である。

別の態様では、対象におけるヒスタミン誘発性胃腸疾患を予防または処置する方法が提供され、この方法は、ヒスタミン産生遺伝子をコードする核酸配列を含む細菌株を標的とするのに有効な１つまたは複数の抗生物質を投与することを含む。いくつかの実施形態において、ヒスタミン産生遺伝子は、ヒスチジンデカルボキシラーゼ（ヒスチジン脱炭酸酵素）である。いくつかの実施形態において、ヒスチジンデカルボキシラーゼの存在量は、炎症性腸疾患のない対象と比較して、クローン病の患者において多い。いくつかの実施形態において、ヒスチジンデカルボキシラーゼの存在量は、炎症性腸疾患のない対象と比較して、潰瘍性大腸炎を有する患者において多い。いくつかの実施形態において、細菌株は、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ）、またはモルガネラ属菌種の細菌である。いくつかの実施形態では、胃腸疾患は下痢である。

別の態様では、対象におけるアレルギーを予防または処置する方法が提供され、この方法は、ヒスタミン産生遺伝子をコードする核酸配列を含む細菌株を標的とするのに有効な１つまたは複数の抗生物質を投与することを含む。いくつかの実施形態において、細菌株は、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ）、またはモルガネラ属菌種の細菌である。

別の態様では、対象における喘息を予防または処置する方法が提供され、この方法は、ヒスタミン産生遺伝子をコードする核酸配列を含む細菌株を標的とするのに有効な１つまたは複数の抗生物質を投与することを含む。いくつかの実施形態において、細菌株は、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ）、またはモルガネラ属菌種の細菌である。いくつかの実施形態において、抗生物質は、セフェピム、ピペラシリン、タゾバクタム、セフタジジム、セフォタキシム、セフチブテン、メロペネム、ドリペネム、エルタペネム、フルオロキノロン、またはアミノグリコシドである。いくつかの実施形態では、この方法は、ヒスチジンデカルボキシラーゼ阻害剤を投与することをさらに含む。いくつかの実施形態において、ヒスチジンデカルボキシラーゼ阻害剤は、ルゴシンＤ、ルゴシンＡメチルエステル、テリマグランジンＩＩ、ルゴシンＡ、ピノセムブリン、α－フルオロメチルヒスチジン、ブロクレシン、レカノール酸、２－ヒドロキシ－５－カルボメトキシベンジルオキシアミン、およびヒスタミンのアミノオキシ類似体である。

別の態様では、対象における胃腸の状態もしくは疾患、アレルギーまたは喘息を処置するための抗生物質の潜在的有効性を評価するための方法が提供され、この方法は、
ａ）対象の糞便サンプルまたは胃腸管からのサンプルを採取すること、および
ｂ）ヒスタミン産生遺伝子をコードする核酸配列を含む細菌株の存在についてアッセイすること
を含む。

いくつかの実施形態では、この方法は、胃腸管に存在する細菌株の量についてアッセイすることをさらに含む。いくつかの実施形態では、この方法は、対象を１つまたは複数の抗生物質で処置することをさらに含む。いくつかの実施形態において、抗生物質は、セフェピム、ピペラシリン、タゾバクタム、セフタジジム、セフォタキシム、セフチブテン、メロペネム、ドリペネム、エルタペネム、フルオロキノロン、またはアミノグリコシドである。いくつかの実施形態では、この方法は、細菌株の存在および／または存在する細菌株の量に基づいて抗生物質の投与量を調整または決定することをさらに含む。いくつかの実施形態において、細菌株はモルガネラ属菌種の細菌である。いくつかの実施形態において、細菌株はモルガネラ・モルガニー（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ ｍｏｒｇａｎｉｉ）である。

別の態様では、フェネチルアミンの産生に起因する疾患または状態を予防または処置する方法が提供され、この方法は、Ｌ－フェニルアラニンを産生する細菌株を標的とするのに有効な１つまたは複数の抗生物質を投与することを含む。さらに別の態様では、対象におけるフェニルケトン尿症（ＰＫＵ）を予防または処置する方法が提供され、この方法は、Ｌ－フェニルアラニンを産生する細菌株を標的とするのに有効な１つまたは複数の抗生物質を投与することを含む。

別の態様では、フェネチルアミンの産生に起因する疾患または状態を予防または処置する方法が提供され、この方法は、シキミ酸経路阻害剤、または芳香族Ｌ－アミノ酸デカルボキシラーゼのアンタゴニストを投与することを含む。さらに別の態様では、対象におけるフェニルケトン尿症（ＰＫＵ）を予防または処置する方法が提供され、この方法は、シキミ酸経路阻害剤、または芳香族Ｌ－アミノ酸デカルボキシラーゼのアンタゴニストを投与することを含む。

いくつかの実施形態において、アンタゴニストは、カルビドパ、ベンセラジド、メチルドパ、３’，４’，５，７－テトラヒドロキシ－８－メトキシイソフラボン（ＤＦＭＤ）、３－ヒドロキシベンジルヒドラジン、３－アミノ－１－メチル－５Ｈ－ピリド［４，３－ｂ］インドール（Ｔｒｐ－Ｐ－２）、またはα－ジフルオロメチルＤＯＰＡである。いくつかの実施形態において、細菌株は、バクテロイデス・テタイオタオミクロン（Ｂ．ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ）である。いくつかの実施形態において、細菌株は、Ｂ．ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎのＣ３４菌株である。

いくつかの実施形態において、抗生物質は、アンピシリン、クラブラン酸塩、タゾバクタム、セファマイシン、チカルシリン、ピペラシリン、セファロスポリン、カルバペネム、クリンダマイシン、リンコマイシン、クロラムフェニコール、ニトロイミダゾール、フルオロキノロンである。

いくつかの実施形態において、抗生物質は、（ａ）アンピシリンとスルバクタムの組み合わせ、（ｂ）チカルシリンとクラブラン酸塩の組み合わせ、または（ｃ）ピペラシリンとタゾバクタムの組み合わせを含む。

上記の様々な実施形態において、この方法は、プロバイオティクス組成物（probiotic composition）を投与することをさらに含む。いくつかの実施形態において、プロバイオティクス組成物は、抗生物質の投与後に投与される。

いくつかの実施形態において、抗生物質の投与およびプロバイオティクス組成物の投与は、周期的に繰り返される。

別の態様では、対象におけるＭＡＯＩの潜在的毒性を評価するためのキットが提供され、キットは、細菌株によって発現されるヌクレオチドまたはタンパク質に特異的に結合することができる核酸、抗体、または他の試薬を含み、細菌株は、フェネチルアミン産生遺伝子をコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、細菌株は、モルガネラ属菌種の細菌である。いくつかの実施形態において、細菌株はモルガネラ・モルガニー（Ｍ．ｍｏｒｇａｎｉｉ）である。

別の態様において、対象における胃腸の状態もしくは疾患、アレルギーまたは喘息を処置するための抗生物質の潜在的有効性を評価するためのキットが提供され、キットは、細菌株によって発現されるヌクレオチドまたはタンパク質に特異的に結合することができる核酸、抗体、または他の試薬を含み、細菌株は、ヒスタミン産生遺伝子をコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、細菌株は、ラクトバチルス・ロイテリ(Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ)、またはモルガネラ属菌種の細菌である。

ＰＲＥＳＴＯ－Ｔａｎｇｏ技術を示す図である。 ＧＰＣＲの活性化を、ルシフェラーゼの産生ではなく特定の核酸バーコードの転写にリンクさせる、ＰＲＥＳＴＯ－Ｔａｎｇｏアッセイの変更を示す。 特定のＧＰＣＲ－バーコードペアをクローン的に発現する細胞をプールすることにより、Ｐｒｅｓｔｏ－ＳａｌｓａがＮＧＳを介して単一チューブ内で３００以上のＧＰＣＲの同時評価を可能にすることを示す。 ＰＲＥＳＴＯ－Ｓａｌｓａがプールされたライブラリでのバーコードカウントを介してＧＰＣＲの活性化を正確に検出することを示すヒートマップである。 ５つの門（phyla）、９つの網（class）、１１の目（order）、および２０の科（family）にまたがる１４４のユニークなヒト腸内細菌で実施したＰＲＥＳＴＯ－Ｔａｎｇｏ実験を説明する図である。 図３－１の続き。 ヒト腸内微生物叢から分離された１４４の細菌株からのメタボロームによるＧＰＣＲの活性化を示すチャートである。 図４－１の続き。 図４－２の続き。 図４－３の続き。 図４－４の続き。 図４－５の続き。 ＰＲＥＳＴＯ－Ｔａｎｇｏによって測定された１４４のヒト腸内細菌によるアミン作動性ＧＰＣＲの活性化を示す図である。 ＰＲＥＳＴＯ－Ｔａｎｇｏによって測定された、１４４のヒト腸内細菌からの代謝産物によるアミン作動性ＧＰＣＲの活性化を示すヒートマップである。 ＰＲＥＳＴＯ－Ｔａｎｇｏによって測定された、選択された種および株によるＤＲＤ２－４およびＨＲＨ２－４の活性化を示す棒グラフを表す（分離株あたりｎ＝３の技術的複製）。 モルガネラ・モルガニー（Ｍ．ｍｏｒｇａｎｉｉ）によるドーパミン、フェネチルアミンおよびチラミンの産生の定量化を示す棒グラフである。 ヒト腸内細菌の１４４の分離株によるヒスタミン産生の定量化を示すプロットである。 Ｌ－ＰｈｅとＬ－Ｈｉｓをそれぞれフェネチルアミンとヒスタミンに直接変換できるＭ．ｍｏｒｇａｎｉｉによる代謝産物の生成の質量分析トレースを示す。 Ｍ．ｍｏｒｇａｎｉｉ由来のフェネチルアミンとヒスタミンがそれぞれＤＲＤ２－４とＨＲＨ２－４を活性化することを示すヒートマップである。 多様なヒト腸内細菌がＤＲＤを活性化することを表す棒グラフを示す。 多様なヒト腸内細菌がＨＲＨを活性化することを表す棒グラフを示す。 ＰＲＥＳＴＯ－Ｔａｎｇｏによって測定された、アセチルコリンとドーパミンの用量を滴定することによるＣＨＲＭとＤＲＤの活性化を示すチャートである。 図７Ａ－１の続き。 ＰＲＥＳＴＯ－Ｔａｎｇｏによって測定された、定義済みのＧＰＣＲリガンドによるＧＰＣＲの活性化を示すヒートマップである。 図７Ｂ－１の続き。 図７Ｂ－２の続き。 哺乳類のドーパミン代謝を説明する。 フェネチルアミンとチラミンが選択的ＤＲＤ２／ＤＲＤ３／ＤＲＤ４アゴニストとして機能することを表すデータを示す。 ＥＳＩ－ＱＱＱ－ＭＳ装置でのフェネチルアミンとチラミンの検量線である。 ＥＳＩ－ＱＱＱ－ＭＳ／ＭＳを介したＭ．ｍｏｒｇａｎｉｉ株によるフェネチルアミン産生の定量化を示すチャートである。 チラミン、ドーパミン、およびフェネチルアミンの用量を滴定することによるＤＲＤ１－５の活性化をＰＲＥＳＴＯ－Ｔａｎｇｏ（８Ｄ）によって測定したことを示す。 Ｌ－Ｐｈｅ、Ｌ－Ｔｙｒ、Ｌ－ＤＯＰＡ、またはＬ－Ｈｉｓを含むまたは含まない最小培地（ＭＭ）において増殖させたＭ．ｍｏｒｇａｎｉｉの２４時間培養物のＯＤ値を示す。 Ｍ．ｍｏｒｇａｎｉｉおよびＬ．ｒｅｕｔｅｒｉによるヒスタミンの産生が追加のＬ－Ｈｉｓによって増強されることを示す。 ｉｎ ｖｉｖｏでのヒスタミン産生、および結腸運動に対するヒスタミン産生細菌の影響を試験するための実験計画を示す。 無菌Ｃ５７Ｂｌ／６マウスの群に、９または１０の系統発生的に多様なヒト腸内細菌のＭｏｃｋ（モック）コミュニティ（ＭｏｃｋコミュニティＡまたはＢ）を定着させた（colonized）、あるいはＭ．ｍｏｒｇａｎｉｉ、Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ Ｃ８８またはＣ９３を単独定着させた（monocolonized）結果の棒グラフを示す。 Ｍ．ｍｏｒｇａｎｉｉまたはＬ．ｒｅｕｔｅｒｉ Ｃ９３由来のヒスタミンが結腸運動を高めることを示す棒グラフである。 Ｍ．ｍｏｒｇａｎｉｉがｉｎ ｖｉｖｏでフェネチルアミンを産生することを示すトレースである。 Ｍ．ｍｏｒｇａｎｉｉを定着させたマウスが、ＭＡＯＩフェネルジンでの処置後に致死的なフェネチルアミン中毒を示すことを表す。 フェネルジンで処置されたＭ．ｍｏｒｇａｎｉｉ定着マウスが、盲腸、結腸、血清、および脳にフェネチルアミンを蓄積したことを示す。 フェネルジンで処置されたＭ．ｍｏｒｇａｎｉｉ定着マウスが、盲腸、結腸、血清、および脳にフェネチルアミンを蓄積したことを示す。 無菌Ｃ５７Ｂｌ／６マウスの群に、９または１０の系統発生的に多様なヒト腸内細菌のｍｏｃｋ（モック）コミュニティ（ＭｏｃｋコミュニティＡまたはＢ）を定着させるか、あるいはＭ．ｍｏｒｇａｎｉｉ、Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ Ｃ８８またはＣ９３を単独定着させた。マウスに、１％のＬ－Ｈｉｓを添加したまたは添加していない通常の食餌を自由に与えた。血清中のヒスタミン濃度をＥＬＩＳＡによって測定した。 Ｍ．ｍｏｒｇａｎｉｉが主に盲腸と結腸に生息していることを示す。 Ｍ．ｍｏｒｇａｎｉｉが主に盲腸と結腸に生息していることを示す。 Ｍ．ｍｏｒｇａｎｉｉが主に盲腸と結腸に生息していることを示す。 Ｍ．ｍｏｒｇａｎｉｉを単独定着させてフェネルジン（ＭＡＯＩ）有りまたは無しで処置したマウスの盲腸、結腸、および血清中のフェネチルアミン（ＰＥＡ）のＥＳＩ－ＱＱＱ－ＭＳ／ＭＳによる定量化を示す。 ＥＳＩ－ＱＱＱ－ＭＳ／ＭＳにより測定した、Ｍ．ｍｏｒｇａｎｉｉを定着させてフェネルジン（ＭＡＯＩ）有りまたは無しで処置したマウスの血清および脳におけるフェネチルアミン（ＰＥＡ）の蓄積を示す。 ＰＲＥＳＴＯ－Ｔａｎｇｏで測定した、腸内微生物叢培地で増殖させた１４４の多様なヒト腸内細菌からの上清によるオーファンＧＰＣＲの活性化を示す図である。 図１１Ａ－１の続き。 ＰＲＥＳＴＯ－Ｔａｎｇｏで測定した、Ｇｉｆｕ培地で増殖させた１４４の多様なヒト腸内細菌からの上清によるオーファンＧＰＣＲの活性化を示す図である。 図１１Ｂ－１の続き。 Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ種に割り当てられた単一の分離株Ｃ３４が、腸内微生物叢培地（ＧＭＭ）またはＧｉｆｕ培地で培養したときにＧＰＲ５６／ＡＧＲＧ１を活性化することを表す棒グラフを示す。 Ｂ．ｔｈｅｔａ Ｃ３４株がＧＰＲ５６／ＡＧＲＧ１を独自に活性化することを示す棒グラフである。 Ｂ．ｔｈｅｔａ Ｃ３４が産生したＬ－ＰｈｅがＧＰＲ５６／ＡＧＲＧ１を活性化することを示す棒グラフである。 図１１Ｅ－１の続き。 Ｌ－Ｐｈｅがオーファン受容体ＧＰＲ５６／ＡＧＲＧ１を優先的に活性化することを示すグラフである。 ＧＰＲ５６／ＡＧＲＧ１の細胞外ドメインが、Ｌ－ＰｈｅによるＧＰＲ５６／ＡＧＲＧ１の活性化に不可欠であることを示すグラフである。 腸内微生物叢培地（ＧＭＭ）で２４時間培養した、指定のバクテロイデス属およびパラバクテロイデス属の菌株のＯＤ_６００値を示す。 ＭｅＯＤでの活性画分１１の^１Ｈ ＮＭＲスペクトルを示し、Ｐｈｅが主成分であることを明らかにした。 画分１１中のＰｈｅの立体化学がＬ－Ｐｈｅであることを確認した改良Ｍａｒｆｅｙ法分析の結果を示す。 Ｌ－Ｐｈｅがオーファン受容体ＧＰＲ５６／ＡＧＲＧ１を立体選択的に活性化することを示す。 Ｌ－ＰｈｅがＧＰＲ５６／ＡＧＲＧ１およびＧＰＲ９７／ＡＧＲＧ３を活性化することを示すヒートマップである。 図１３Ａ－１の続き。 Ｌ－ＰｈｅがＧＰＲ９７／ＡＧＲＧ３を特異的に活性化することを示すグラフである。 ＧＰＲ９７／ＡＧＲＧ３の細胞外ドメインが、Ｌ－ＰｈｅによるＧＰＲ９７／ＡＧＲＧ３の活性化に不可欠であることを示すグラフである。 ＧＰＲ５６／ＡＧＲＧ１とＧＰＲ９７／ＡＧＲＧ３が進化的に関連していることを示す系統樹である。 図１３Ｄ－１の続き。 Ｂ．ｔｈｅｔａ Ｃ３４がＬ－Ｐｈｅを直接合成できることを示すデータである。 Ｂ．ｔｈｅｔａ Ｃ３４がＬ－Ｐｈｅを直接合成できることを示すデータである。 Ｂ．ｔｈｅｔａ Ｃ３４がｉｎ ｖｉｖｏでＬ－Ｐｈｅを産生することを示すグラフである。 Ｍ．ｍｏｒｇａｎｉｉがＢ．ｔｈｅｔａ Ｃ３４由来のＬ－Ｐｈｅを消費して、ｉｎ ｖｉｔｒｏでフェネチルアミンを産生することを示すトレースである。 Ｂ．ｔｈｅｔａ Ｃ３４およびＭ．ｍｏｒｇａｎｉｉが活発な代謝交換に参加してｉｎ ｖｉｖｏでフェネチルアミンを産生できることを示すグラフである。 クローン病患者が腸内マイクロバイオームにおいてヒスチジンデカルボキシラーゼ遺伝子の存在および相対存在量(relative abundance)の増加を示すことを表すグラフである。 クローン病患者がその腸内マイクロバイオームにおいてＭ．ｍｏｒｇａｎｉｉ（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ属）によってコードされるヒスチジンデカルボキシラーゼ遺伝子の存在および相対存在量の増加を示すことを表すグラフである。 新しい超ハイスループットコンビナトリアルＧＰＣＲスクリーニング技術であるＰＲＥＳＴＯ－Ｓａｌｓａが９６ウェルプレートの単一ウェルで数百ものＧＰＣＲを同時にスクリーニングすることを可能にする実験の結果を示すグラフである。

図１Ａ～１Ｃは、単一チューブ内で数百のＧＰＣＲに対し代謝産物混合物を並行してスクリーニングするための新しいハイスループット技術であるＰＲＥＳＴＯ－Ｓａｌｓａを示す図である。図１Ａは、ＰＲＥＳＴＯ－Ｔａｎｇｏ技術を示す図である。簡単に説明すると、ＧＰＣＲにリガンドが結合すると、β－アレスチン－タバコエッチウイルス核内封入体エンドペプチダーゼ（Ｂａｒｒ－ＴＥＶ）融合体の動員が、転写因子ｔＴＡの放出とルシフェラーゼの産生を引き起こす。図１Ｂは、ＧＰＣＲの活性化を、ルシフェラーゼの産生ではなく特定の核酸バーコードの転写にリンクさせる、ＰＲＥＳＴＯ－Ｔａｎｇｏアッセイの変更を示す。図１Ｃは、特定のＧＰＣＲ－バーコードペアをクローン的に発現する細胞をプールすることにより、Ｐｒｅｓｔｏ－ＳａｌｓａがＮＧＳを介して単一チューブでの３００以上のＧＰＣＲの同時評価を可能にすることを示す。この例では、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養した細菌株は「ＧＰＣＲ２」のリガンドを産生しており、それが対応するＧＰＣＲ２バーコードの転写の増加をもたらす。

図２は、ＰＲＥＳＴＯ－Ｓａｌｓａがプールされたライブラリでのバーコードカウントを介してＧＰＣＲの活性化を正確に検出することを示すヒートマップである。ＧＰＣＲ－バーコードペアを発現するプールされたＥｘｐｉ ２９３細胞の活性化は、既知のＧＰＣＲリガンドで刺激され、活性化は次世代シーケンシングとバーコードカウントによって決定された。

図３は、５つの門（phyla）、９つの網（class）、１１の目（order）、および２０の科（family）にまたがる１４４のユニークなヒト腸内細菌で実施したＰＲＥＳＴＯ－Ｔａｎｇｏ実験を説明する図である：これらの細菌は、１１人の炎症性腸疾患患者の糞便サンプルからハイスループット嫌気性カルチュロミクス（anaerobic culturomics）によって分離され、大規模バーコード付け１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子シーケンシング（massively barcoded 16S rRNA gene sequencing）によって同定された。各分離株を、ヒト腸内細菌の培養に特化した培地（腸内微生物叢培地）において単培養で増殖させた。個々の細菌単培養からの上清を、ハイスループットアッセイＰａｒａｌｌｅｌ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｏｍｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｖｉａ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ Ｏｕｔｐｕｔ－Ｔａｎｇｏ（ＰＲＥＳＴＯ－Ｔａｎｇｏ）を使用して、ほぼ完全な非嗅覚ＧＰＣＲｏｍｅ（３１４の従来のＧＰＣＲ）に対してスクリーニングした。

図４は、ヒト腸内微生物叢から分離された１４４の細菌株からのメタボロームによるＧＰＣＲの活性化を示すチャートである。データは、クラス、リガンドタイプ、および受容体ファミリー毎に編成されたＧＰＣＲの階層ツリーに表示される。陰影の強さは、データセット全体にわたるバックグラウンドを超える活性化の最大の大きさ（ｌｏｇ２）、すなわち、コレクション内の任意の微生物メタボロームによる所与のＧＰＣＲの最大の活性化を表す。

図５Ａは、ＰＲＥＳＴＯ－Ｔａｎｇｏによって測定された１４４のヒト腸内細菌によるアミン作動性ＧＰＣＲの活性化を示す図である。スクリーニング結果は、アミン作動性ＧＰＣＲの系統樹に表示される。５－ＨＴ受容体は、５ＨＴ１Ａ、５ＨＴ１Ｂ、５ＨＴ１Ｄ、５ＨＴ１Ｅ、５ＨＴ１Ｆ、５ＨＴ７Ｒ、５ＨＴ５Ａ、５ＨＴ２Ｂ、５ＨＴ２Ｃ、５ＨＴ２Ａ、および５ＨＴ６Ｒである。アセチルコリン受容体は、ＡＣＭ２、ＡＣＭ４、ＡＣＭ３、ＡＣＭ１、およびＡＣＭ５である。アドレナリン受容体は、ＡＤＲＢ３、ＡＤＲＢ２、ＡＤＲＢ１、ＡＤＡ２Ａ、ＡＤＡ２Ｃ、ＡＤＡ２Ｂ、ＡＤＡ１Ｄ、ＡＤＡ１Ａ、およびＡＤＡ１Ｂである。ドーパミン受容体は、ＤＲＤ１、ＤＲＤ５、ＤＲＤ３、ＤＲＤ２、およびＤＲＤ４である。ヒスタミン受容体はＨＲＨ２、ＨＲＨ１、ＨＲＨ３およびＨＲＨ４である。微量アミン受容体はＴＡＡＲ１である。陰影の強さは、培地のみを超える活性化の大きさを表し、円の半径は、培地のみよりも所与のＧＰＣＲを２倍超活性化した細菌の数を表す。

図５Ｂは、ＰＲＥＳＴＯ－Ｔａｎｇｏによって測定された、１４４のヒト腸内細菌からの代謝産物によるアミン作動性ＧＰＣＲの活性化を示すヒートマップである。細菌培地のみでの刺激に対する倍数誘導をｌｏｇ２スケールで示す。

図５Ｃは、ＰＲＥＳＴＯ－Ｔａｎｇｏによって測定された、選択された種および株によるＤＲＤ２－４およびＨＲＨ２－４の活性化を示す棒グラフを表す（分離株あたりｎ＝３の技術的複製）。

図５Ｄは、モルガネラ・モルガニー（Ｍ．ｍｏｒｇａｎｉｉ）によるドーパミン、フェネチルアミンおよびチラミンの産生の定量化を示す棒グラフである。腸内微生物叢培地でのＭ．ｍｏｒｇａｎｉｉの２４時間培養からの上清を、エレクトロスプレーイオン化－トリプル四重極－質量分析（ＥＳＩ－ＱＱＱ－ＭＳ）によって分析し、培地対照と比較した。

図５Ｅは、ヒト腸内細菌の１４４の分離株によるヒスタミン産生の定量化を示すプロットである。すべての細菌を腸内微生物叢培地で４８時間増殖させた後、ＥＬＩＳＡにより上清のヒスタミン産生を調べた。

図５Ｆは、Ｌ－ＰｈｅとＬ－Ｈｉｓをそれぞれフェネチルアミンとヒスタミンに直接変換できるＭ．ｍｏｒｇａｎｉｉによる代謝産物の生成の質量分析トレースを示す。ただし、Ｌ－Ｔｙｒからチラミンへの変換またはＬ－ＤＯＰＡからドーパミンへの変換は観察されなかった。追加のＬ－Ｐｈｅ、Ｌ－Ｈｉｓ、Ｌ－Ｔｙｒ、またはＬ－ＤＯＰＡを含むまたは含まない最小培地（ＭＭ）でＭ．ｍｏｒｇａｎｉｉを４８時間培養した。代謝産物の生成は、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ－ＭＳ）によって分析した。

図５Ｇは、Ｍ．ｍｏｒｇａｎｉｉ由来のフェネチルアミンとヒスタミンがそれぞれＤＲＤ２－４とＨＲＨ２－４を活性化することを示すヒートマップである。Ｍ．ｍｏｒｇａｎｉｉを図５Ｆに記載のように培養し、ＰＲＥＳＴＯ－ＴａｎｇｏによってＤＲＤおよびＨＲＨに対する活性について上清をスクリーニングした。

図６Ａおよび６Ｂは、多様なヒト腸内細菌がＤＲＤおよびＨＲＨを活性化することを表す棒グラフを示す。チャートは、ＰＲＥＳＴＯ－Ｔａｎｇｏによって測定された、腸内微生物叢培地（ＭＭ）で培養した１４４のヒト腸内細菌からの上清によるＤＲＤ１－５（図６Ａ）およびＨＲＨ１－４（図６Ｂ）の活性化を示す。

図７Ａは、ＰＲＥＳＴＯ－Ｔａｎｇｏによって測定された、アセチルコリンとドーパミンの用量を滴定することによるＣＨＲＭとＤＲＤの活性化を示すチャートである。

図７Ｂは、ＰＲＥＳＴＯ－Ｔａｎｇｏによって測定された、定義済みのＧＰＣＲリガンドによるＧＰＣＲの活性化を示すヒートマップである。活性化は、リガンドに対する３１４のＧＰＣＲのヒートマップとしてｌｏｇ２スケールで表される。

図８Ａ～８Ｆは、ＤＲＤおよびＨＲＨを活性化するＭ．ｍｏｒｇａｎｉｉ由来の化合物の同定を示す。データは、少なくとも２つの独立した実験を表す。図８Ａは、哺乳類のドーパミン代謝を説明する。図８Ｂは、フェネチルアミンとチラミンが選択的ＤＲＤ２／ＤＲＤ３／ＤＲＤ４アゴニストとして機能することを表すデータを示す。哺乳類のドーパミン代謝経路の代謝産物によるＤＲＤ１－５の活性化をＰＲＥＳＴＯ－Ｔａｎｇｏにより測定した。図８Ｃは、ＥＳＩ－ＱＱＱ－ＭＳ装置でのフェネチルアミンとチラミンの検量線である。図８Ｄは、ＥＳＩ－ＱＱＱ－ＭＳ／ＭＳを介したＭ．ｍｏｒｇａｎｉｉ株によるフェネチルアミン産生の定量化を示すチャートである。図８Ｅは、チラミン、ドーパミン、およびフェネチルアミンの用量を滴定することによるＤＲＤ１－５の活性化をＰＲＥＳＴＯ－Ｔａｎｇｏ（８Ｄ）によって測定したことを示す。図８Ｆは、Ｌ－Ｐｈｅ、Ｌ－Ｔｙｒ、Ｌ－ＤＯＰＡ、またはＬ－Ｈｉｓを含むまたは含まない最小培地（ＭＭ）において増殖させたＭ．ｍｏｒｇａｎｉｉの２４時間培養物のＯＤ値を示す。

図９Ａ～９Ｈは、常在菌（commensal）由来のヒスタミンが結腸運動を促進し、ＭＡＯＩと組み合わせたＭ．ｍｏｒｇａｎｉｉ由来のフェネチルアミンが致死的なフェネチルアミン中毒を引き起こすことを示す。すべてのパネルのデータは、少なくとも２つの独立した実験を表す。

図９Ａは、Ｍ．ｍｏｒｇａｎｉｉおよびＬ．ｒｅｕｔｅｒｉによるヒスタミンの産生が追加のＬ－Ｈｉｓによって増強されることを示す。Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉの４つの菌株およびＭ．ｍｏｒｇａｎｉｉの１つの菌株を、補給的なＬ－Ｈｉｓを含むまたは含まないＧｉｆｕ培地で培養し（群あたりｎ＝３）、４８時間後に上清中のヒスタミン濃度をＥＬＩＳＡで測定した。Ｌ－Ｈｉｓを追加すると、Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ Ｃ９３、Ｃ９４、およびＭ．ｍｏｒｇａｎｉｉ Ｃ１３５（すべてヒスタミン産生菌）によるヒスタミン産生が増加したが、Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ Ｃ８８およびＣ８９では増加しなかった。図９Ｂは、ｉｎ ｖｉｖｏでのヒスタミン産生、および結腸運動に対するヒスタミン産生細菌の影響を試験するための実験計画を示す。

図９Ｃは、無菌Ｃ５７Ｂｌ／６マウスの群に、９または１０の系統発生的に多様なヒト腸内細菌のＭｏｃｋ（モック）コミュニティ（ＭｏｃｋコミュニティＡまたはＢ）を定着させた（colonized）、あるいはＭ．ｍｏｒｇａｎｉｉ、Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ Ｃ８８またはＣ９３を単独定着させた（monocolonized）結果の棒グラフを示す。マウスに、１％Ｌ－Ｈｉｓを添加したまたは添加していない通常の食餌を自由に与えた。盲腸および結腸の抽出物ならびに糞便中のヒスタミン濃度をＥＬＩＳＡにより測定した。図９Ｄは、Ｍ．ｍｏｒｇａｎｉｉまたはＬ．ｒｅｕｔｅｒｉ Ｃ９３由来のヒスタミンが結腸運動を高めることを示す棒グラフである。Ｂに記載のように処置されたマウスの糞便排出量を、１時間に１匹のマウスによって生成された糞便ペレットの数を数えることによって測定した。

図９Ｅは、Ｍ．ｍｏｒｇａｎｉｉがｉｎ ｖｉｖｏでフェネチルアミンを産生することを示すトレースである。無菌マウスにＭ．ｍｏｒｇａｎｉｉを定着させ、ＭＡＯＩフェネルジン有りまたは無しで処置した。ＥＳＩ－ＱＱＱ－ＭＳ／ＭＳを使用して結腸抽出物中のフェネチルアミン濃度を調べた。図９Ｆのグラフにおいて、Ｍ．ｍｏｒｇａｎｉｉを定着させたマウスは、ＭＡＯＩフェネルジンでの処置後に致死的なフェネチルアミン中毒を示す。無菌Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに、飲料水中のフェネルジンでの処置前１週間、Ｍ．ｍｏｒｇａｎｉｉを単独定着させた。生存はカプランマイヤー曲線で表される。群あたりｎ＝４匹のマウス。図９Ｇおよび９Ｈでは、フェネルジンで処置されたＭ．ｍｏｒｇａｎｉｉ定着マウスが、盲腸、結腸、血清、および脳にフェネチルアミンを蓄積した。モルガネラ・モルガニー（Ｍ．ｍｏｒｇａｎｉｉ）およびバクテロイデス・テタイオタオミクロン（Ｂ．ｔｈｅｔａ）を定着させたＣ５７Ｂｌ／６マウスを、飲料水中にＭＡＯＩフェニルジンを含めてまたは含めないで処置した。ＥＳＩ－ＱＱＱ－ＭＳ（図９Ｇ）またはＤＲＤ２ ＰＲＥＳＴＯ－Ｔａｎｇｏ（図９Ｈ）により、盲腸、結腸、血清、または脳でフェネチルアミンを検出した。

図１０Ａ～１０Ｆは、図９Ａ～９Ｈに関連して、Ｍ．ｍｏｒｇａｎｉｉの局在性と、ｉｎ ｖｉｖｏでの全身性フェネチルアミンの産生および蓄積を示す。データは、少なくとも２つの独立した実験を表す。図１０Ａでは、無菌Ｃ５７Ｂｌ／６マウスの群に、９または１０の系統発生的に多様なヒト腸内細菌のｍｏｃｋ（モック）コミュニティ（ＭｏｃｋコミュニティＡまたはＢ）を定着させるか、あるいはＭ．ｍｏｒｇａｎｉｉ、Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ Ｃ８８またはＣ９３を単独定着させた。マウスに、１％のＬ－Ｈｉｓを添加したまたは添加していない通常の食餌を自由に与えた。血清中のヒスタミン濃度をＥＬＩＳＡによって測定した。図１０Ｂ～１０Ｄは、Ｍ．ｍｏｒｇａｎｉｉが主に盲腸と結腸に生息していることを示す。無菌マウスに、Ｍ．ｍｏｒｇａｎｉｉと共にまたは無しで、９または１０の系統発生的に多様な腸内微生物のＭｏｃｋコミュニティ（それぞれＭｏｃｋコミュニティＡおよびＢ）を定着させた。Ｍ．ｍｏｒｇａｎｉｉのＣＦＵは、改変Ｎｉｖｅｎ寒天培地に播種した場合、紫色のハロー（ｈａｌｏ）に基づいて他の細菌と区別できる。ＭｏｃｋコミュニティＡまたはＢ、およびＭ．ｍｏｒｇａｎｉｉを定着させたマウスの胃、小腸、盲腸、および結腸の内容物を、改変Ｎｉｖｅｎ寒天培地に播種して、様々な腸の位置でのＭ．ｍｏｒｇａｎｉｉの定着レベル（colonization level）を決定した。図１０Ｅは、Ｍ．ｍｏｒｇａｎｉｉを単独定着させてフェネルジン（ＭＡＯＩ）有りまたは無しで処置したマウスの盲腸、結腸、および血清中のフェネチルアミン（ＰＥＡ）のＥＳＩ－ＱＱＱ－ＭＳ／ＭＳによる定量化を示す。図１０Ｆは、ＥＳＩ－ＱＱＱ－ＭＳ／ＭＳにより測定した、Ｍ．ｍｏｒｇａｎｉｉを定着させてフェネルジン（ＭＡＯＩ）有りまたは無しで処置したマウスの血清および脳におけるフェネチルアミン（ＰＥＡ）の蓄積を示す。

図１１Ａ～１１Ｇは、Ｂ．ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ Ｃ３４のユニークな菌株がＬ－Ｐｈｅの大量産生菌であり、ＧＰＲ５６／ＡＧＲＧ１を活性化することを示す。図１１Ａ、１１Ｂおよび１１Ｅを除いて全ての図面のデータは、少なくとも３つの独立した実験を示す。

図１１Ａおよび１１Ｂは、ＰＲＥＳＴＯ－Ｔａｎｇｏで測定した、腸内微生物叢培地（図１１Ａ）またはＧｉｆｕ培地（図１１Ｂ）で増殖させた１４４の多様なヒト腸内細菌からの上清によるオーファンＧＰＣＲの活性化を示す図である。スクリーニング結果は、ｇｐｃｒｄｂ．ｏｒｇ、ＰＨＹＬＩＰ、およびｊｓＰｈｙｌｏＳＶＧを使用して、等しい枝の長さで構築および視覚化されたオーファンＧＰＣＲの系統樹に表示される。クラスＡオーファンは、ＧＰＲ２１、ＧＰＲ５２、ＧＰ１４３、ＧＰＲ３２、ＧＰＲ１、ＧＰＲ１５２、ＭＡＳ、ＭＲＧＲＦ、ＭＲＧＸ２、ＭＲＧＸ４、ＭＲＧＸ１、ＭＲＧＸ３、ＭＲＧＲＤ、ＭＡＳ１Ｌ、ＭＲＧＲＥ、ＭＲＧＲＧ、ＧＰ１８２、ＧＰＲ１５、ＧＰＲ２５、ＧＰＲ８２、ＧＰＲ３４、ＧＰＲ８７、ＧＰ１７１、ＧＰ１８３、ＧＰ１３２、ＰＳＹＲ、ＧＰＲ４、ＯＧＲ１、ＧＰＲ１７、ＧＰＲ１７４、ＧＰＲ３５、ＧＰＲ２０、ＧＰＲ３１、ＧＰＲ８８、ＭＴＲ１Ｌ、ＧＰＲ８４、ＧＰ１４８、ＧＰ１４２、ＧＰＲ１９、ＧＰＲ８２、ＧＰＲ２７、ＧＰ１７２、ＧＰＲ８５、ＧＰ１５０、ＧＰＲ６、ＧＰ１４６、ＧＰＲ２６、ＧＰＲ７８、ＧＰ１３５、ＧＰ１６１、ＧＰ１０１、ＧＰＲ１２、ＧＰＲ３、ＧＰＲ６、ＴＡＡＰ２、ＴＡＡＰ５、ＴＡＡＰ９、ＴＡＡＰ６、ＴＡＡＰ８、ＧＰ１５１、ＥＴＢＲ２、ＧＰＲ３７、ＧＰＲ３９、ＧＰＲ７５、ＧＰＲ４５、ＧＰＲ６３、ＧＰＲ２２、ＧＰ１４１、ＧＰ１６０、ＧＰ１５３、ＧＰ１６２、およびＧＰ１４９である。クラスＣオーファンは、ＧＰ１５６、ＧＰ１５８、ＧＰＣ６Ａ、ＧＰＣ５Ｂ、ＧＰＣ５Ｃ、ＧＰＣ５Ｄ、およびＲＡＩ３である。ＡＤＧＲＡ群は、ＡＧＲＡ１、ＡＧＲＡ２、およびＡＧＲＡ３である。ＡＧＲＧＤ群は、ＡＧＲＤ１およびＡＧＲＤ２である。ＡＤＧＲＧ群は、ＡＧＲＧ１、ＡＧＲＧ２、ＡＧＲＧ３、ＡＧＲＧ５、およびＡＧＲＧ６である。ＡＤＧＲＦ群は、ＡＧＲＦ１、ＡＧＲＦ２、ＡＧＲＦ３、ＡＧＲＦ４、およびＡＧＲＦ５である。他のＧＰＣＲオーファンはＧＰ１５７である。陰影の強さは培地を超える活性化の大きさを表し、円の半径は所与のＧＰＣＲを２倍超活性化した細菌の数を表す。図１１Ｃは、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ種に割り当てられた単一の分離株Ｃ３４が、腸内微生物叢培地（ＧＭＭ）またはＧｉｆｕ培地で培養したときにＧＰＲ５６／ＡＧＲＧ１を活性化することを表す棒グラフを示す。ＧＰＲ５６ＰＲＥＳＴＯ－Ｔａｎｇｏにより、１４４のヒト腸内分離株からの上清によるＧＰＲ５６／ＡＧＲＧ１の活性化を測定した。

図１１Ｄは、Ｂ．ｔｈｅｔａ Ｃ３４株がＧＰＲ５６／ＡＧＲＧ１を独自に活性化することを示す棒グラフである。ＧＰＲ５６ ＰＲＥＳＴＯ－Ｔａｎｇｏにより、ＧＭＭでのバクテロイデス属およびパラバクテロイデス属の多様な種および株の培養物からの上清によるＧＰＲ５６／ＡＧＲＧ１の活性化を測定した。図１１Ｅは、Ｂ．ｔｈｅｔａ Ｃ３４が産生したＬ－ＰｈｅがＧＰＲ５６／ＡＧＲＧ１を活性化することを示す棒グラフである。Ｂ．ｔｈｅｔａ Ｃ３４の上清を逆相ＨＰＬＣで分画し、ＧＰＲ５６ ＰＲＥＳＴＯ－ＴａｎｇｏによりＧＰＲ５６／ＡＧＲＧ１の活性化について画分を評価した。活性画分（Ｆ１１）は、ＬＣ－ＭＳ、ＨＲＭＳ－ＥＳＩ－ＱＴＯＦ、ＮＭＲ、および改良Ｍａｒｆｅｙ法分析（advanced Marfey’s analysis）によってＬ－Ｐｈｅとして同定された主成分を含んでいた。図１１Ｆは、Ｌ－Ｐｈｅがオーファン受容体ＧＰＲ５６／ＡＧＲＧ１を優先的に活性化することを示すグラフである。純粋なＬ－Ｐｈｅ、Ｌ－Ｔｙｒ、Ｌ－Ｔｒｐ、およびＬ－Ｈｉｓの用量を滴定することによるＧＰＲ５６／ＡＧＲＧ１の活性化を、ＧＰＲ５６ ＰＲＥＳＴＯ－Ｔａｎｇｏにより測定した。図１１Ｇは、ＧＰＲ５６／ＡＧＲＧ１の細胞外ドメインが、Ｌ－ＰｈｅによるＧＰＲ５６／ＡＧＲＧ１の活性化に不可欠であることを示すグラフである。Ｌ－Ｐｈｅの用量を滴定することによるＧＰＲ５６またはＧＰＲ５６－ΔＮＴ（細胞外ドメインを欠く変異体）の活性化を、ＰＲＥＳＴＯ－Ｔａｎｇｏにより測定した。

図１２Ａ～１２Ｄは、図１１Ａ～１１Ｇに関連して、細菌の増殖およびＧＰＲ５６／ＡＧＲＧ１の活性化に対する様々な細菌および培地の影響、ならびにＢ．ｔｈｅｔａ Ｃ３４のアゴニストＬ－Ｐｈｅの構造特性を示す。図１２Ａは、腸内微生物叢培地（ＧＭＭ）で２４時間培養した、指定のバクテロイデス属およびパラバクテロイデス属の菌株のＯＤ_６００値を示す。図１２Ｂは、ＭｅＯＤでの活性画分１１の^１Ｈ ＮＭＲスペクトルを示し、Ｐｈｅが主成分であることを明らかにした。図１２Ｃは、画分１１中のＰｈｅの立体化学がＬ－Ｐｈｅであることを確認した改良Ｍａｒｆｅｙ法分析の結果を示す。活性画分中にＤ－Ｐｈｅは検出されなかった。ＦＤＡＡは、１－フルオロ－２，４－ジニトロフェニル－５－Ｌ－アラニンアミド（Ｍａｒｆｅｙ試薬）（Marfey’s Reagent）である。図１２Ｄは、Ｌ－Ｐｈｅがオーファン受容体ＧＰＲ５６／ＡＧＲＧ１を立体選択的に活性化することを示す。純粋なＬ－Ｐｈｅ、Ｌ－Ｔｙｒ、Ｌ－Ｔｒｐ、Ｌ－Ｈｉｓ、Ｄ－Ｐｈｅ、Ｄ－Ｔｙｒ、Ｄ－Ｔｒｐ、およびＤ－Ｈｉｓの用量を滴定することによるＧＰＲ５６／ＡＧＲＧ１の活性化を、ＧＰＲ５６ ＰＲＥＳＴＯ－Ｔａｎｇｏにより測定した。

図１３Ａ～１３Ｄは、Ｌ－ＰｈｅがＧＰＲ５６／ＡＧＲＧ１の近縁種であるＧＰＲ９７／ＡＧＲＧ３を活性化することを表すデータを示す。データは、少なくとも３つの独立した実験を表す。図１３Ａは、Ｌ－ＰｈｅがＧＰＲ５６／ＡＧＲＧ１およびＧＰＲ９７／ＡＧＲＧ３を活性化することを示すヒートマップである。Ｌ－ＰｈｅによるすべてのオーファンＧＰＣＲ、細胞接着型ＧＰＣＲ（ａｄｈｅｓｉｏｎ－ＧＰＣＲ）、およびその他の潜在的なアミノ酸感知性ＧＰＣＲ（amino acid-sensing GPCR）の活性化を、ＰＲＥＳＴＯ－Ｔａｎｇｏにより評価した。図１３Ｂは、Ｌ－ＰｈｅがＧＰＲ９７／ＡＧＲＧ３を特異的に活性化することを示すグラフである。Ｌ－Ｐｈｅ、Ｌ－Ｔｙｒ、Ｌ－Ｔｒｐ、およびＬ－Ｈｉｓの用量を滴定することによるＧＰＲ９７／ＡＧＲＧ３の活性化を、ＧＰＲ９７ ＰＲＥＳＴＯ－Ｔａｎｇｏにより測定した。図１３Ｃは、ＧＰＲ９７／ＡＧＲＧ３の細胞外ドメインが、Ｌ－ＰｈｅによるＧＰＲ９７／ＡＧＲＧ３の活性化に不可欠であることを示すグラフである。Ｌ－Ｐｈｅの用量を滴定することによるＧＰＲ９７またはＧＰＲ９７－ΔＮＴ（細胞外ドメインを欠く変異体）の活性化を、ＰＲＥＳＴＯ－Ｔａｎｇｏにより測定した。図１３Ｄは、ＧＰＲ５６／ＡＧＲＧ１とＧＰＲ９７／ＡＧＲＧ３が進化的に関連していることを示す系統樹である。すべての細胞接着型ＧＰＣＲを含むＧＰＣＲのサブセットの系統樹が、ｇｐｃｒｄｂ．ｏｒｇ、ＰＨＹＬＩＰ、およびｊｓＰｈｙｌｏＳＶＧを使用して等しい枝の長さで構築および視覚化された。

図１４Ａ～１４Ｅは、２つの常在菌間の活発な代謝交換がフェネチルアミンの産生を支援することを表すデータを示す。データは、少なくとも２つの独立した実験を表す。図１４Ａおよび１４Ｂは、Ｂ．ｔｈｅｔａ Ｃ３４がＬ－Ｐｈｅを直接合成できることを示すデータである。Ｌ－Ｐｈｅを欠く最小培地（ＳＡＣＣ）で増殖させたＣ３４の上清中のＬ－Ｐｈｅの濃度を、ＬＣ－ＭＳ（図１４Ａ）で評価し、ＥＳＩ－ＱＱＱ－ＭＳ／ＭＳ（図１４Ｂ）で定量化した。図１４Ｃは、Ｂ．ｔｈｅｔａ Ｃ３４がｉｎ ｖｉｖｏでＬ－Ｐｈｅを産生することを示すグラフである。通常の食餌またはＬ－Ｐｈｅを欠く定義された食餌を与えた無菌Ｃ５７Ｂｌ／６マウスの群に、Ｂ．ｔｈｅｔａ Ｃ３４を定着させたまたはさせなかった。糞便中のＬ－Ｐｈｅ濃度を、定着の１週間後にＥＳＩ－ＱＱＱ－ＭＳ／ＭＳによって測定した。図１４Ｄは、Ｍ．ｍｏｒｇａｎｉｉがＢ．ｔｈｅｔａ Ｃ３４由来のＬ－Ｐｈｅを消費して、ｉｎ ｖｉｔｒｏでフェネチルアミンを産生することを示すトレースである。Ｂ．ｔｈｅｔａ Ｃ３４培養物をＬ－Ｐｈｅを欠くＳＡＣＣ培地で増殖させた。Ｃ３４培養物の上清を、後でＭ．ｍｏｒｇａｎｉｉとインキュベートした。これらの培養物におけるＬ－Ｐｈｅおよびフェネチルアミン（ＰＥＡ）のレベルのＥＳＩ－ＱＱＱ－ＭＳ／ＭＳトレースをここに示す。図１４Ｅは、Ｂ．ｔｈｅｔａ Ｃ３４とＭ．ｍｏｒｇａｎｉｉが活発な代謝交換に参加してｉｎ ｖｉｖｏでフェネチルアミンを産生できることを示すグラフである。無菌Ｃ５７Ｂｌ／６マウスの群に、Ｍ．ｍｏｒｇａｎｉｉを単独定着させるか、あるいはＢ．ｔｈｅｔａ Ｃ３４およびＭ．ｍｏｒｇａｎｉｉを共定着させ、Ｌ－Ｐｈｅを含まない食餌を与え、さらにＭＡＯＩフェネルジンで処置した。盲腸および結腸の抽出物中のフェネチルアミンによるＤＲＤ２の活性化を、ＰＲＥＳＴＯ－Ｔａｎｇｏにより測定した。

図１５Ａは、クローン病患者が腸内マイクロバイオームにおいてヒスチジンデカルボキシラーゼ遺伝子の存在および相対存在量の増加を示すことを表すグラフである。健康な対照（ｎｏｎＩＢＤ）、クローン病（ＣＤ）、および潰瘍性大腸炎（ＵＣ）から収集した糞便サンプルのメタゲノムデータを、ＮＩＨが資金提供したヒトマイクロバイオームプロジェクト（NIH-funded Human Microbiome Project）からダウンロードし、ヒスチジンデカルボキシラーゼ遺伝子の存在および相対存在量について分析した。検出可能なヒスチジンデカルボキシラーゼ遺伝子を含んでいた全サンプル数と、サンプル中に検出可能な遺伝子を含む患者の数が表示される（すべての参加者が異なる時点で複数のサンプルを提供した）。

図１５Ｂは、クローン病患者がその腸内マイクロバイオームにおいてＭ．ｍｏｒｇａｎｉｉ（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ属）によってコードされるヒスチジンデカルボキシラーゼ遺伝子の存在および相対存在量の増加を示すことを表すグラフである。健康な対照（ｎｏｎＩＢＤ）、クローン病（ＣＤ）、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）から収集した糞便サンプルのメタゲノムデータを、ＮＩＨが資金提供したヒトマイクロバイオームプロジェクトからダウンロードし、Ｍ．ｍｏｒｇａｎｉｉのヒスチジンデカルボキシラーゼ遺伝子の存在および相対存在量について分析した。検出可能なヒスチジンデカルボキシラーゼ遺伝子を含む全サンプル数と、サンプル中に検出可能な遺伝子を含む患者の数が表示される（すべての参加者が異なる時点で複数のサンプルを提供した）。

図１６は、新しい超ハイスループットコンビナトリアルＧＰＣＲスクリーニング技術であるＰＲＥＳＴＯ－Ｓａｌｓａが９６ウェルプレートの単一ウェルで数百ものＧＰＣＲを同時にスクリーニングすることを可能にする実験の結果を示すグラフである。データは、実施例９に記載されたプロトコルに従って作製された。

一態様では、単一チューブ内で複数のＧＰＣＲ（例えば、３００以上の従来のＧＰＣＲすべて）の並行スクリーニングを可能にする方法が提供される。この方法の例示的な実施形態は、本明細書ではＰＲＥＳＴＯ－Ｓａｌｓａと呼ばれ、ルシフェラーゼレポーターの代わりに、一意の（unique）核酸バーコードをコードするレポータープラスミドが使用される。

理論に縛られることを望まないが、ヒトの腸に構成的に定着する何兆もの細菌（腸内微生物叢）は、腸内の免疫の調節から気分や行動の形成まで、人体の生理機能のほぼすべての側面に影響を与える可能性のある数万のユニークな小分子を産生する。しかしながら、この複雑さは、他の化学物質の海に隠されている生物学的に関連する微生物叢（マイクロバイオータ）代謝産物を特定することを困難にする可能性がある。言い換えれば、微生物叢メタボロームに何万ものユニークな注釈のない代謝産物が存在することを考えると、詳細な調査および特性評価のためにどの特徴を優先すべきかを決定するのは困難であり得る。

本発明者らは、これらの問題に対する革新的な新しいアプローチを提案する。理論に拘束されることを望まないが、本発明者らは、生物活性微生物叢メタボロームの大部分を構成する「暗黒物質（ｄａｒｋ ｍａｔｔｅｒ）」を照らすレンズとしての微生物叢代謝産物の宿主センシング（host sensing）について説明する。本発明者らは、ヒトゲノムにコードされている何百ものＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）を使用して、複雑な混合物から新規の生物活性微生物叢代謝産物を同定できると仮定する。

個々の腸内微生物によって産生される生物活性代謝産物を照らすレンズとして宿主ＧＰＣＲによる微生物叢代謝産物のセンシングを使用した、生物活性微生物叢メタボロームを調査するための新しいアプローチが本明細書に記載されている。本明細書に記載の例は、そのアプローチが、潜在的な生理学的に重要である多数の新規微生物叢代謝産物－ＧＰＣＲ相互作用をどのように明らかにしたかを説明する。例えば、本発明者らは、ヒスタミンの微生物産生を介して腸の運動性に影響を与える食事－微生物－宿主軸および強力な微量アミンであるフェネチルアミンの産生をもたらす微生物－微生物－宿主軸を明らかにした。これらの軸は両方とも、局所および全身の宿主生理機能に重大な影響を与える可能性がある。本明細書に記載の人体の生理機能への微生物叢（マイクロバイオータ）の寄与を理解するための機能的プロファイリングベースのアプローチは、生物活性微生物叢メタボロームの多様な特徴を理解および明らかにすることに広く適用可能であり得る。

本発明者らは、既存の低スループットＧＰＣＲスクリーニング技術（ＰＲＥＳＴＯ－Ｔａｎｇｏ）を使用して、発がん、気分調整および免疫に関与するＧＰＣＲ、ならびに天然リガンドが何十年もの間発見を逃れてきた「オーファン」ＧＰＣＲを活性化した、個々のヒト腸内細菌からの代謝産物混合物を特定した。しかしながら、固有の技術的制限により、ＰＲＥＳＴＯ－Ｔａｎｇｏは、大量に容易に入手できる比較的少数の代謝産物混合物（たとえば、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養できる細菌株によって産生される代謝産物）にのみ適用可能である。したがって、ＰＲＥＳＴＯ－Ｔａｎｇｏは、生物活性微生物叢メタボローム全体のごく一部しか捕捉できず、これは通常、多様な微生物と、食事性化合物と、宿主自体との間の複雑なｉｎ ｖｉｖｏ相互作用に起因する。

本発明者らは、次世代シーケンシングおよび核酸バーコード分析における最近の開発を活用して、ＰＲＥＳＴＯ－Ｓａｌｓａを開発した。

一態様では、複数のＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）を活性化することができる微生物叢代謝産物のハイスループットスクリーニングのための方法が提供される。複数の非接着性哺乳動物細胞が提供される。各細胞は、（ｉ）タバコエッチウイルス核内封入体Ａプロテアーゼ（ＴＥＶプロテアーゼ）の切断部位を介して転写因子ｔＴＡに連結されたＧＰＣＲを含む第１の融合タンパク質をコードする第１の核酸分子、（ｉｉ）β－アレスチンと第１の融合タンパク質のＴＥＶプロテアーゼ部位を切断するように構成されたＴＥＶプロテアーゼとを含む第２の融合タンパク質をコードする第２の核酸分子、および（ｉｉｉ）ｔＴＡ転写因子によって特異的に活性化されるプロモーターに作動可能に連結されたバーコード配列を含み、各バーコード配列が個々のＧＰＣＲに特異的である、第３の核酸分子を含む。複数の細胞を複数の微生物叢代謝産物と接触させる。バーコードの配列が決定される（シーケンシング）。代謝産物が存在しない対照と比較して、代謝産物の存在下でどのバーコード配列が増加するかについての決定がなされる。

バーコードの転写は、ＧＰＣＲの活性化を示すことができる。理論に縛られることを望まないが、ＧＰＣＲが活性化されると、ＧＰＣＲのコンフォメーション（立体配座）が変化し、β－アレスチンとＴＥＶプロテアーゼを含む融合タンパク質が動員される。次に、ＴＥＶプロテアーゼは、ｔＴＡ転写因子とＧＰＣＲを連結しているプロテアーゼ部位を切断して、ｔＴＡ転写因子を放出し、これは次に、プロモーターに作動可能に連結されたバーコードの転写を駆動する。

様々なＧＰＣＲを使用できる。ＧＰＣＲは、非嗅覚ＧＰＣＲ、オーファンＧＰＣＲ、またはヒトＧＰＣＲであり得る。好ましい実施形態において、ＧＰＣＲは、本明細書に記載される３１４の従来のＧＰＣＲのうちの１つである。

微生物叢代謝産物は、糞便サンプルまたは胃腸管からのサンプルなど、任意の数のサンプルに由来し得る。糞便サンプルまたは胃腸管からのサンプルは、特定の微生物叢代謝産物の産生を増強するように培養されおよび／または栄養素に曝露され得る。たとえば、追加のＬ－ＰｈｅおよびＬ－Ｈｉｓを供給して、Ｌ－ＰｈｅとＬ－Ｈｉｓをそれぞれフェネチルアミンとヒスタミンに直接変換できるＭ．ｍｏｒｇａｎｉｉの検出感度を高めることができる。サンプルは、例えば逆相ＨＰＬＣによって、化学的特性に基づいて分画され得る。

理論に縛られることを望まないが、バーコードの使用は、検出感度を大幅に改善し、ハイスループットスクリーニングを可能にすることができる。多種多様な一意のＧＰＣＲ－バーコードペアを発現する多数の細胞を使用できる。例えば、実施例１に記載のように、高感度の定量的方法を使用してすべてのバーコードの発現についてアッセイすることができる。

図１Ａに示すように、従来のＰＲＥＳＴＯ－Ｔａｎｇｏアプローチは、リガンド結合後のβ－アレスチンの動員を、対象ＧＰＣＲにつながれた転写因子（ｔＴＡ）の放出にリンクさせることにより、ＧＰＣＲの活性化をルシフェラーゼ発現に結び付ける。本発明者らは、図１Ｂに示されるように、ルシフェラーゼレポーターを、一意の核酸バーコードをコードするレポータープラスミドで置き換えることにより、このシステムを改変した。ＰＲＥＳＴＯ－Ｓａｌｓａの主な目新しさは、一意のバーコードの転写を使用して、単一ウェルでの数百ものＧＰＣＲの多重化を可能にすることである。これは、潜在的なスループットを数桁増加させ、かつ以前の少量サンプルの検査を可能にすることにより、ＰＲＥＳＴＯ－Ｔａｎｇｏ技術に改良を加える。実施例１ならびに図３および４に示すようにＰＲＥＳＴＯ－Ｓａｌｓａをテストした。

一意のＧＰＣＲ－バーコードペアを発現する細胞をプールし、刺激後の特定バーコードの発現を定量化することにより、単一チューブ内で数百のＧＰＣＲの活性化または阻害を同時にスクリーニングすることができる。図１Ｃを参照されたい。

この方法は、特定のＧＰＣＲを活性化する特定の代謝産物を産生する細菌株を同定することをさらに含んでいてよい。細菌株は、たとえば１６Ｓ ｒＲＮＡシーケンシング、または全ゲノムシーケンシングによって分類できる。

個々の細菌株は、目的の特定サンプルから分離および培養することができ、各培養株からの代謝産物を、本明細書に記載の様々なＰＲＥＳＴＯ－Ｓａｌｓａの実施形態でさらに試験する。あるいは、細菌株を微生物叢サンプルに添加して、所与のマイクロバイオームの状況下でその細菌株によって産生される代謝産物を評価することができる。次に、微生物叢サンプルを培養して、添加された細菌株が追加の代謝産物を産生することを可能にする。ＰＲＥＳＴＯ－Ｓａｌｓａ法によって生成されたバーコードの差異分析（differential analysis）が行われ得る。

多様な門、科、種、および株からの数十のヒト腸内細菌が、十分に特徴付けられたＧＰＣＲとオーファンＧＰＣＲの両方を含む様々なＧＰＣＲを活性化する小分子を産生することがわかった。系統発生ならびに所与の種内の菌株固有の違いに基づいて大部分が予測可能であった代謝産物生成のパターンが観察された。いつおよびなぜ特定経路が異なる種および株で保存されているかまたはされていないかを判断するには、将来の研究が必要である。所与の微生物に不可欠なコア代謝プロセスから生じる代謝産物は高度に保存される可能性があるが、競合プロセスに関与する代謝産物は、占有されるニッチ（niche）、ならびに他の細菌種、非細菌微生物、または宿主と競合する必要性に依存し得るかなりの菌株変動（strain variation）を示す可能性がある。微生物代謝産物発現の最初の誘発要因に関係なく、本明細書に記載のデータは、ヒト関連微生物が印象的な調節能力を示し、ヒト生物学に影響を与える小分子の最も豊富な供給源の１つである可能性が高いという考えを支持する。

ＰＲＥＳＴＯ－Ｓａｌｓａのハイスループットは、すべてのサンプルについて、生物学的または技術的な複製を容易に検査したり、用量反応曲線を実行したりすることを可能にする。最後に、ＰＲＥＳＴＯ－Ｓａｌｓａは、ルシフェラーゼの安定性に対する特定の化学物質のよく知られたオフターゲット効果に抵抗性であり得るため、擬陽性を減らすこともできる。

ＰＲＥＳＴＯ－Ｓａｌｓａは、少量のサンプル投入量を使用して、単一チューブ内で数百の受容体を同時にスクリーニングできるという大きな技術的利点をもたらす。ＰＲＥＳＴＯ－Ｓａｌｓａはモジュール式で柔軟性があるため、他の受容体ファミリーを含めるように拡張できる。また、ＰＲＥＳＴＯ－Ｓａｌｓａは、同じ受容体の下流にある複数のシグナル伝達出力（たとえば、Ｇタンパク質ベースのシグナル伝達とβ－アレスチンベースのＧＰＣＲによるシグナル伝達）を同時にモニターして、バイアス型（biased）アゴニストおよびアンタゴニストの同定を可能にするように簡単に変更できる。ＰＲＥＳＴＯ－Ｓａｌｓａは、数百のセンサーに対して貴重な少量サンプルをスクリーニングすることを可能にするが、ＰＲＥＳＴＯ－Ｔａｎｇｏで使用される同様のサンプル量は、１つまたは２つの受容体への影響を調べるのに十分であるにすぎない。ＰＲＥＳＴＯ－Ｓａｌｓａは、差し迫ったスケーラビリティと自動化を提供できる。ＰＲＥＳＴＯ－Ｓａｌｓａの主な経済的利点は、ＰＲＥＳＴＯ－Ｓａｌｓａが、少ない投入量を用いて単一チューブ内で数百の受容体を同時にスクリーニングできることである：以前の技術では、これと同じ目標を達成するために、複数の細胞プレートと大量の投入サンプルが必要であった。ＰＲＥＳＴＯ－Ｓａｌｓａでの最終読み出しとしての次世代シーケンシングの使用は、以前のルシフェラーゼベースのスクリーニングよりもかなり安価である（特に次世代シーケンシングのコストが下がり続けているため）。ＰＲＥＳＴＯ－Ｓａｌｓａを使用したスクリーニングのコストは、確立されたアッセイのコストよりも少なくとも１桁低い可能性がある。

微生物叢（マイクロバイオータ）メタボロームは、多様な微生物種および株と、環境入力（例えば食事など）と、宿主因子との間の複雑に絡み合う相互作用から生じる。還元主義的アプローチを使用して、発明者らは、同じ小分子を交換する（traffic in）２つの細菌分離株を発見した：Ｌ－Ｐｈｅの豊富な産生菌であるＢ．ｔｈｅｔａのユニークな菌株とＬ－Ｐｈｅをフェネチルアミンに効率的に変換するＭ．ｍｏｒｇａｎｉｉである。本明細書に記載のアプローチは、複雑な微生物の混合物（例えば、完全な腸内微生物コミュニティ）によって産生されるエンドポイント微生物叢メタボロームを調べるときに見逃される得る代謝交換を明らかにすることができる。

本明細書に記載の方法の様々な実施形態において、例えば、特定の微生物によるＧＰＣＲアゴニストの産生がｉｎ ｖｉｖｏで宿主の生理機能を形成する可能性を調べるために、任意のＧＰＣＲアゴニストをｉｎ ｖｉｖｏでさらに試験することができる。実施例のデータは、Ｍ．ｍｏｒｇａｎｉｉまたはＬ．ｒｅｕｔｅｒｉによるヒスタミン産生が結腸運動性の増加を促進し、外因性ヒスチジンを与えるとヒスタミンの微生物産生および結腸運動性がさらに増加することを示す。ヒスチジンを与えられたＭ．ｍｏｒｇａｎｉｉ単独定着マウスは、全身性ヒスタミンのレベルの上昇を示し、微生物叢由来のヒスタミンも全身性免疫応答を形成し得ることを示す。

本発明者らの研究はまた、高レベルの必須アミノ酸Ｌ－Ｐｈｅを独自に産生する特定のバクテロイデス属の菌株を明らかにし、Ｌ－ＰｈｅがオーファンＧＰＣＲ、ＧＰＲ５６およびＧＰＲ９７を活性化できることを明らかにした。ＧＰＲ５６は小腸およびヒト膵島で高発現され（Amisten et al., 2013; Duner et al., 2016）、空腸のＬ－Ｐｈｅ濃度は食後に最大２ｍＭの濃度に達することができる（Adibi, 1973）。したがって、ＧＰＲ５６は消化と満腹感を調節する栄養素センサーとして機能し得る。

血清中のＬ－Ｐｈｅレベルは通常、ＧＰＲ５６／９７を活性化するのに必要なレベルをはるかに下回っているが、Ｌ－Ｐｈｅを分解できないフェニルケトン尿症（ＰＫＵ）の患者は、１ｍＭを超えるＬ－Ｐｈｅの血清濃度を示す（Williams, 2008）。したがって、ＧＰＲ５６および／またはＧＰＲ９７の活性化は、ＰＫＵの症状のいくつかに寄与する可能性がある。特に、ＧＰＲ５６は神経前駆細胞、オリゴデンドロサイト（または希突起膠細胞）、アストロサイト（または星状膠細胞）、ミクログリア（または小膠細胞）で高発現しており(Giera et al., 2018; Haitina et al., 2008）、ＧＰＲ５６／ＡＧＲＧ１欠損症は両側性前頭頭頂多小脳回（ＢＦＰＰ）などの重度の神経発達障害を引き起こし得る（Sotnikova et al., 2004）。

理論に縛られることを望まないが、食事性アミノ酸の利用可能性は、宿主の生理機能を形作ることができる生体アミンの産生において重要であり得る。本明細書での研究は、主に食事に由来すると考えられることが多い基質（例えば、必須アミノ酸）の代替供給源としての微生物叢の他のメンバーを強調することができる。微生物により産生されるアミノ酸は、微生物変換（microbial biotransformation）における食事性アミノ酸を補うかあるいは置き換える可能性さえある。微生物由来のＬ－Ｐｈｅは、Ｌ－Ｐｈｅを欠く単純化され高度に人工的な食事を使用して、Ｍ．ｍｏｒｇａｎｉｉによる微生物変換の基質として使用され得る。しかしながら、細菌性Ｌ－Ｐｈｅは生理学的条件下でも重要であり得る。たとえば、食事性アミノ酸は主に小腸で吸収される（Adibi, 1973）；したがって、Ｍ．ｍｏｒｇａｎｉｉなどの結腸微生物は、小腸生物と比較して、食事性アミノ酸へのアクセスが比較的制限されている。また、低タンパク食は、食事性アミノ酸への微生物のアクセスを自然に減少させ、絶食は腸内アミノ酸の利用可能性をさらに低下させる可能性がある（Pezeshki et al., 2016）。したがって、結腸でのアミノ酸の微生物産生は、様々な生理学的に適切な条件下での様々な生物活性微生物叢代謝産物の産生において重要な役割を果たし得る。

様々な治療および診断方法も提供される。

一態様では、対象におけるモノアミンオキシダーゼ阻害剤（ＭＡＯＩ）誘発毒性を予防または処置する方法が提供される。フェネチルアミン産生遺伝子をコードする核酸配列を含む細菌株を標的とするのに有効な抗生物質が投与される。

関連する態様では、対象におけるモノアミンオキシダーゼ阻害剤（ＭＡＯＩ）誘発毒性を予防または処置する方法が提供される。細菌のフェネチルアミン合成酵素の小分子アンタゴニストが投与される。

様々な実施形態において、対象におけるＭＡＯＩ誘発毒性を予防または処置する方法は、モルガネラ属菌種を標的とするのに有効な抗生物質を投与することを含む。

モルガネラ・モルガニー（Ｍ．ｍｏｒｇａｎｉｉ）がドーパミンを産生することは以前に報告されているが、本発明者らは、Ｍ．ｍｏｒｇａｎｉｉのすべての分離株が、ドーパミンまたはチラミンではなく、強力な微量アミンであるフェネチルアミンを主に産生することを見出した。本発明者らはまた、Ｍ．ｍｏｒｇａｎｉｉの単独定着マウスをＭＡＯＩで処置すると、フェネチルアミンの全身蓄積および死亡がもたらされることを見出した。フェネチルアミンは、ドーパミンやチラミンとは異なり、血液脳関門を容易に通過できる強力な神経活性化学物質である（Oldendorf, 1971）。フェネチルアミンの効果は、主に微量アミン関連受容体の活性化とそれに続くノルエピネフリンとドーパミンの放出によって媒介されると考えられている（(Borowsky et al., 2001; Bunzow, 2001; Sotnikova et al., 2004）。ただし、ここでのデータは、フェネチルアミンがＤＲＤ２－４の選択的アゴニストとしても作用できることを示唆する。微生物叢由来のフェネチルアミンが局所的および全身的に宿主生物学に影響を与えることができる細胞および分子メカニズムを詳細に分析することは魅力的である。

理論に拘束されることを望まないが、本発明者らの発見は、フェネチルアミンの微生物産生の個体間変動が、うつ病に対するＭＡＯＩの可変的な効果（variable effect）の一部を説明し得ることを示唆する：この可能性は、気分に対するフェネチルアミンの報告された有益な効果と、血液脳関門を通過するフェネチルアミンの能力を考えると、特に興味深いものである（Irsfeld et al., 2013）。さらに、腸内微生物による生体アミンの産生は、ＭＡＯＩの副作用の一部を説明する可能性がある。

ＭＡＯＩに関連する最も重要な有害事象の１つは「チラミン中毒」であり、これは通常、特定のチーズなど、高レベルのチラミンを含む食品の摂取に起因する（Fiedorowicz, 2004）。本明細書のデータは、特定の腸内微生物が、宿主の生理機能に同様の影響を与え得る生体アミンの供給源としても機能し、また特定部位（例えば、脳）で作用することが意図された生体アミン受容体の薬理学的阻害剤が、自然の宿主－微生物叢相互作用にも影響を与える可能性があることを示す。

対象におけるＭＡＯ活性の低下によって引き起こされる疾患または状態を処置する方法も提供される。フェネチルアミン産生遺伝子をコードする核酸配列を含む細菌株を標的とするのに有効な抗生物質が投与される。

関連する態様では、対象におけるＭＡＯ活性の低下によって引き起こされる疾患または状態を処置する方法が提供される。細菌フェネチルアミン合成酵素の小分子アンタゴニストが投与される。

細菌株は、モルガネラ・モルガニー（Ｍ．ｍｏｒｇａｎｉｉ）などのように、フェネチルアミンを産生し得る。細菌株はフェネチルアミンを分泌し得る。ブルンナー症候群、自閉症、反社会的行動など、ＭＡＯ活性の低下によって引き起こされる様々な疾患または状態を処置することができる。対象はＭＡＯＡ－Ｌ変異体を表現し得る。

セフェピム、ピペラシリン、タゾバクタム、セフタジジム、セフォタキシム、セフチブテン、メロペネム、ドリペネム、エルタペネム、フルオロキノロン、またはアミノグリコシドなど、Ｍ．ｍｏｒｇａｎｉｉを標的とするのに有効な様々な抗生物質を使用することができる。

フェネチルアミン産生遺伝子をコードする核酸配列を含む細菌株を投与することを含む、対象におけるうつ病を処置する方法も提供される。ＭＡＯＩなどの抗うつ剤も対象に投与することができる。

対象におけるモノアミンオキシダーゼ阻害剤（ＭＡＯＩ）の潜在的毒性を評価するための方法も提供される。消化管内微生物叢のサンプルを対象から取得する。モルガネラ・モルガニー（Ｍ．ｍｏｒｇａｎｉｉ）などのフェネチルアミン産生遺伝子を含む細菌株の存在についてサンプルをアッセイする。潜在的ＭＡＯＩ毒性のリスクをさらに評価するために細菌株のレベルを定量的に分析することもできる。細菌株の存在および／またはレベルを使用して、ＭＡＯＩ毒性のリスクを評価することができる。この情報から、ＭＡＯＩの他に異なる抗うつ薬または治療薬を投与することができる。あるいは、ＭＡＯＩの投与量レベルを調整または低減してもよい。

対象におけるＭＡＯＩの潜在的有効性を評価するための方法も提供される。この方法は、対象の糞便サンプルまたは胃腸管からのサンプルを採取し、フェネチルアミン産生遺伝子をコードする核酸配列を含む細菌株（例えば、モルガネラ・モルガニー（Ｍ．ｍｏｒｇａｎｉｉ））の存在についてアッセイすることを含む。細菌株の量の定量的アッセイも実施することができる。その後、対象をＭＡＯＩで処置してもよい。ＭＡＯＩの投与量またはタイプを、細菌株の存在および／または量に基づいて調整することができる。

対象におけるヒスタミン誘発性胃腸疾患を予防または処置するための方法も提供される。特に、本発明者らは、モルガネラ・モルガニー（Ｍ．ｍｏｒｇａｎｉｉ）のヒスチジンデカルボキシラーゼなどのヒスチジンデカルボキシラーゼが、健康な対照またはＵＣ患者と比較してクローン病の患者で富んでいることを発見し（図１５Ａおよび１５Ｂを参照）、これは、ＣＤでの細菌によるヒスタミン産生を暗示し得る。ヒスタミン産生遺伝子をコードする核酸配列を含む細菌株を標的とするのに有効な１つまたは複数の抗生物質が対象に投与される。関連する態様では、対象におけるヒスタミン誘発性胃腸疾患を予防または処置することが提供され、ヒスタミン合成酵素の小分子アンタゴニストが投与される。ヒスタミン合成酵素の例示的な小分子アンタゴニストには、例えば、ルゴシンＤ、ルゴシンＡメチルエステル、テリマグランジンＩＩ、ルゴシンＡ、ピノセンブリン、α－フルオロメチルヒスチジン、ブロクレシン、レカノール酸、２－ヒドロキシ－５－カルボメトキシベンジルオキシアミン、およびヒスタミンのアミノオキシ類似体などの、ヒスチジンデカルボキシラーゼ阻害剤が含まれるが、これらに限定されない。Ｍ．ｍｏｒｇａｎｉｉのヒスチジンデカルボキシラーゼは、ルゴシンＤ、ルゴシンＡメチルエステル、テリマグランジンＩＩ、およびルゴシンＡによって阻害され得る。関連する側面では、一般的なまたは特定のヒスタミン受容体アンタゴニストが投与される。

代表的な疾患はヒスタミン不耐症であり、それは食物アレルギーの症状を模倣し得る。もう一つは下痢である。ヒスタミン誘発性胃腸疾患は、酵素ＤＡＯおよびＨＮＭＴの活性への干渉によって引き起こされるかまたは悪化し得る。理論に拘束されることを望まないが、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ）、またはモルガネラ属菌種の細菌の存在または過剰量は、腸疾患を引き起こすかまたは悪化させる可能性がある。これら細菌はＬ－Ｈｉｓを直接ヒスタミンに変換することができる。

別の例示的な疾患は炎症性腸疾患である。ヒスチジンデカルボキシラーゼをコードするモルガネラ属菌種の存在量（abundance）は、健康な対照および潰瘍性大腸炎と対比してクローン病で増加している（図１５Ｂ）。理論に拘束されることを望まないが、モルガネラ属菌種またはヒスチジンデカルボキシラーゼの存在または過剰量は、クローン病を引き起こすまたは悪化させる可能性がある。モルガネラ属菌種またはヒスチジンデカルボキシラーゼをコードする他の細菌あるいはヒスチジンデカルボキシラーゼをコードする過剰量の細菌を保有する患者を処置する方法も提供される。ヒスタミン産生遺伝子をコードする核酸配列を含む細菌株を標的とするのに有効な１つまたは複数の抗生物質が投与される。関連する態様では、対象において、ヒスタミン誘発性胃腸疾患を予防または処置することが提供され、ヒスタミン合成酵素の小分子アンタゴニストが投与される。関連する態様において、一般的なまたは特定のヒスタミン受容体アンタゴニストが投与される。

対象におけるアレルギーまたは喘息を予防または処置する方法も提供される。ヒスタミン産生遺伝子をコードする核酸配列を含む細菌株を標的とするのに有効な１つまたは複数の抗生物質が投与される。細菌株は、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌ． ｒｅｕｔｅｒｉ）、またはモルガネラ属菌種の細菌であり得る。理論に拘束されることを望まないが、いずれかまたは両方の菌株の存在は、対象における全体的なヒスタミンレベルを上昇させる可能性があり、それはアレルギーまたは喘息を誘発または悪化させるであろう。例示的な抗生物質には、セフェピム、ピペラシリン、タゾバクタム、セフタジジム、セフォタキシム、セフチブテン、メロペネム、ドリペネム、エルタペネム、フルオロキノロン、またはアミノグリコシドが含まれる。

抗生物質は、対象における胃腸の状態もしくは疾患、アレルギーまたは喘息を処置するための抗生物質の潜在的有効性を評価するための方法のアウトカムに基づいて選択され得る。この方法は、ａ）対象の糞便サンプルまたは胃腸管からのサンプルを採取すること、およびｂ）ヒスタミン産生遺伝子をコードする核酸配列を含む細菌株（例えば、モルガネラ属菌種の細菌）の存在についてアッセイすることを含む。この方法は、胃腸管に存在する細菌株の量についてアッセイすることを含んでいてよい。対象は抗生物質で処置され得る。いくつかの実施形態において、抗生物質の投与量の調整または決定は、存在する細菌株の存在および／または量に基づいて行われる。

フェネチルアミンの産生に起因する疾患または状態を予防または処置する方法も提供され、この方法は、Ｌ－フェニルアラニンを産生する細菌株を標的とするのに有効な１つまたは複数の抗生物質を投与することを含む。関連する態様では、フェネチルアミンの産生に起因する疾患または状態を予防または処置する方法が提供され、この方法は、フェネチルアミン合成酵素の小分子アンタゴニストを投与することを含む。小分子アンタゴニストは、シキミ酸経路阻害剤であり得る。小分子アンタゴニストは、カルビドパ、ベンセラジド、メチルドパ、３’，４’，５，７－テトラヒドロキシ－８－メトキシイソフラボン（ＤＦＭＤ）、３－ヒドロキシベンジルヒドラジン、３－アミノ－１－メチル－５Ｈ－ピリド［４，３－ｂ］インドール（Ｔｒｐ－Ｐ－２）、およびα－ジフルオロメチルＤＯＰＡなどの芳香族Ｌ－アミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣまたはＡＡＡＤ）のアンタゴニストであり得る。

対象におけるフェニルケトン尿症（ＰＫＵ）を予防または処置する方法がさらに提供され、この方法は、Ｌ－フェニルアラニンを産生する細菌株を標的とするのに有効な１つまたは複数の抗生物質を投与することを含む。対象におけるフェニルケトン尿症（ＰＫＵ）を予防または処置する関連方法も提供され、この方法は、Ｌ－フェニルアラニンの過剰産生に起因する疾患の処置または予防のために、Ｌ－フェニルアラニンを分泌する細菌株の細菌性フェニルアラニン合成酵素を標的とする小分子を投与することを含む。

例示的な細菌株には、バクテロイデス・テタイオタオミクロン（Ｂ．ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ）（例えば、株Ｃ３４）が含まれる。この方法は、アンピシリン、クラブラン酸塩、タゾバクタム、セファマイシン、チカルシリン、ピペラシリン、セファロスポリン、カルバペネム、クリンダマイシン、リンコマイシン、クロラムフェニコール、ニトロイミダゾール、フルオロキノロンなどの、細菌株を標的とするのに有効な抗生物質の投与を含み得る。あるいは、（ａ）アンピシリンとスルバクタムの組み合わせ、（ｂ）チカルシリンとクラブラン酸塩の組み合わせ、または（ｃ）ピペラシリンとタゾバクタムの組み合わせなどの抗生物質の組み合わせが投与され得る。

抗生物質の投与を含む上記の方法の様々な実施形態において、プロバイオティクス組成物を投与してもよい。プロバイオティクス組成物は、例えば、一連の抗生物質が投与された後に投与され得る。理論に縛られることを望まないが、プロバイオティクス組成物は、腸に異なる細菌を定着させて標的細菌がそれ自体を迅速に再確立するのを防ぐのに有効であり得る。追加の実施形態では、抗生物質は、プロバイオティクス組成物と共に周期的に投与され得る。抗生物質は、プロバイオティクス組成物と同時に投与してもよい。

対象におけるＭＡＯＩの潜在的毒性を評価するためのキットも提供される。キットは、細菌株によって発現されるヌクレオチドまたはタンパク質に特異的に結合することができる核酸、抗体、または他の試薬を含むことができ、細菌株は、フェネチルアミン産生遺伝子をコードする核酸配列を含む。

対象における胃腸の状態もしくは疾患、アレルギーまたは喘息を処置するための抗生物質の潜在的有効性を評価するためのキットも提供される。キットは、細菌株によって発現されるヌクレオチドまたはタンパク質に特異的に結合することができる核酸、抗体、または他の試薬を含み、細菌株は、ヒスタミン産生遺伝子（図１５Ａおよび１５Ｂに示されるデータに従ってクローン病患者で検出されるものなど）をコードする核酸配列を含む。キットは、ヒスタミン産生遺伝子の酵素産物の小分子阻害剤（例えば、ヒスタミンデカルボキシラーゼ阻害剤）での処置から利益を得るであろう患者を選択するために使用され得る。

本発明はまた、以下の実施例によって説明および実証される。しかしながら、本明細書のどこかでこれらおよび他の例を使用することは例示にすぎず、本発明または任意の例示された用語の範囲および意味を決して限定するものではない。同様に、本発明は、本明細書に記載の特定の好ましい実施形態に限定されない。実際、本発明の多くの修正および変形は、本明細書を読むと当業者に明らかであり、そのような変形は、精神または範囲において本発明から逸脱することなく行うことができる。したがって、本発明は、添付の特許請求の範囲と、それら請求項が権利を有する同等物の全範囲によってのみ限定されるべきである。

次の表は、以下の実施例で使用される試薬を示す：

実施例１．ＰＲＥＳＴＯ－Ｓａｌｓａのテスト
ＧＰＣＲ－バーコードペアのプールを容易にするために、Ｂａｒｒ－ＴＥＶ融合タンパク質を安定発現するＥｘｐｉ ２９３Ｔ細胞株を作製した。これら細胞は、所与のＧＰＣＲ－ｔＴＡ融合体をコードするプラスミド、およびｔｅｔ応答エレメントの下流に定義されたバーコードをコードするレポータープラスミドで効率的にコトランスフェクトすることができる。すべてのＧＰＣＲの同時スクリーニングを可能にするために、９６ウェルプレートの個々のウェルにおいて、安定なＥｘｐｉ ２９３Ｔ細胞株を、３１４個すべての定義済みＧＰＣＲ－バーコードレポータープラスミドペアでコトランスフェクトした。約２４時間後、すべての細胞を単一チューブ内で混合した後、細胞混合物を約４枚の９６ウェルプレートに再分配した。重要なことに、Ｅｘｐｉ ２９３Ｔ細胞は非接着性であり、それによって細胞のプールおよび再分配が容易になる。

再分配後、各ウェルを所与の代謝産物混合物で刺激した後、ＲＮＡを回収し、ｃＤＮＡを合成し、イルミナアンプリコンシーケンシングを介してバーコードの配列を決定する。所与のバーコードの相対的発現レベルを対照サンプルと比較することにより、その代謝産物または代謝産物混合物による所与のＧＰＣＲの相対的活性化を表す。ＰＲＥＳＴＯ－Ｓａｌｓａの感度および特異性を評価するために、本発明者らは、図２に示すように、既知のＧＰＣＲリガンド、または既知のＧＰＣＲアゴニストを含む微生物代謝産物混合物を使用して、このシステムを最初に確立した。

これらのデータは、ＰＲＥＳＴＯ－Ｓａｌｓａ技術の特異性および感度を実証する。重要なことに、ルシフェラーゼ発現と対比したシーケンシングの相対的感度を考えると、ＰＲＥＳＴＯ－Ｓａｌｓａに使用されるシーケンシングベースの読み出しは、ＰＲＥＳＴＯ－Ｔａｎｇｏよりもかなり感度が高かった。

実施例２．フォワードケミカル遺伝子スクリーニングは、ＧＰＣＲを活性化するヒト腸内微生物を特定する
５つの門、９つの網、１１の目、および２０の科にまたがる１４４のユニークなヒト腸内細菌を、１１人の炎症性腸疾患患者から、ハイスループット嫌気性カルチュロミクスによって分離し、大規模バーコード付け１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子シーケンシングによって同定した。すべての菌株を、腸内微生物叢培地（Goodman et al., 2011）またはＧｉｆｕブイヨンにおいて３７℃で嫌気性条件下において培養し、すべての菌株の同一性を１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子シーケンシングによって確認した。分離されたヒト腸内細菌を表１に示す。各分離株は、ヒト腸内細菌の培養に特化した培地（腸内微生物叢培地；ＧＭＭ）において単培養で増殖させた。

個々の細菌単培養物からの上清を、ハイスループットアッセイＰａｒａｌｌｅｌ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｏｍｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｖｉａ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ Ｏｕｔｐｕｔ－Ｔａｎｇｏ（ＰＲＥＳＴＯ－Ｔａｎｇｏ）を使用して、ほぼ完全な非嗅覚ＧＰＣＲｏｍｅ（３１４の従来のＧＰＣＲ）に対してスクリーニングした。

ＰＲＥＳＴＯ－Ｔａｎｇｏアッセイは次のように実施した。β－アレスチン－ＴＥＶおよびｔＴＡ－ルシフェラーゼを安定発現するＨＥＫ２９３細胞株であるＨＴＬＡ細胞（ブラウン大学のＧｉｌａｄ Ｂａｒｎｅａから親切に贈られたもの）を、１０％ＦＢＳおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ中、９６ウェル組織培養プレート（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）に播種した。播種の１日後（約９０％コンフルエンスに達した後）、ポリエチレンイミン（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を使用してＴａｎｇｏプラスミドをＨＴＬＡ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの１６～２４時間後、１％ペニシリン／ストレプトマイシンおよび１０ｍＭ ＨＥＰＥＳを含む１８０μｌの新鮮なＤＭＥＭ＋２０μｌの細菌培地のみまたは細菌上清で培地を交換した。ＰＲＥＳＴＯ－Ｔａｎｇｏスクリーニングでは、すべての常在菌を腸内微生物叢培地またはＧｉｆｕブイヨンにおいて嫌気性チャンバー（Ｃｏｙ）で２日間培養した。常在菌培養上清（commensal supernatant）を、高速遠心分離およびそれに続く滅菌ろ過（０．２２μｍ）によって滅菌した。ｉｎ ｖｉｔｒｏ研究のために、モルガネラ・モルガニー（Ｍ．ｍｏｒｇａｎｉｉ）を最小培地（ＭＭ）、あるいは１０ｍＭ Ｌ－Ｐｈｅ、２．５ｍＭ Ｌ－Ｔｙｒ、１０ｍＭ Ｌ－ＤＯＰＡ、または１０ｍＭ Ｌ－Ｈｉｓを含むＭＭで２４時間培養した。細菌上清をＬＣ－ＭＳで分析した。

刺激の１６～２４時間後、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳを含むＰＢＳで２０倍に希釈したＢｒｉｇｈｔ－Ｇｌｏ溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ社）をウェルあたり５０μｌずつ各ウェルに添加した。室温で２０分間インキュベートした後、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ ｉ３ｘ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社）を使用して発光を定量した。各サンプルの活性化倍率は、各条件での相対発光単位（ＲＬＵ）を培地のみ対照のＲＬＵで割ることによって計算した。

ヒト腸内微生物叢から分離された１４４の細菌株からのメタボロームによるＧＰＣＲの活性化をＰＲＥＳＴＯ－Ｔａｎｇｏによって測定した。データは、ヒートマップ（図３）として、あるいは、クラス、リガンドタイプ、および受容体ファミリー毎に編成されたＧＰＣＲの階層ツリー（図４）に表示される。陰影の強さは、データセット全体にわたるバックグラウンドを超える活性化の最大の大きさ（ｌｏｇ２）、すなわち、コレクション内の任意の微生物メタボロームによる所与のＧＰＣＲの最大の活性化を表す。各先端の円の半径は、所与の受容体または受容体ファミリーを活性化した菌株の数（すなわち、完全なデータセット全体のヒット数）に基づいてスケーリングされている。ヒットは、バックグラウンドの２倍を超える所与の受容体の活性化として定義される。図形は、ｄ３．ｊｓを使用してＶｉｓａｖｉｓｌｌｃと共同で作製した。

カルチャーコレクションは、系統発生的に多様な分類群の影響を調べることを可能にすると同時に、同じ種のメンバー間の潜在的な菌株特異的差異への洞察を提供することができる。

上記の培養物の分析は、ヒト腸内微生物が、十分に特徴付けられたＧＰＣＲとオーファンＧＰＣＲの両方を活性化する化合物を産生することを示した。ＰＲＥＳＴＯ－Ｔａｎｇｏスクリーニングは、十分に特徴づけられたＧＰＣＲを活性化した細菌由来の代謝産物混合物、ならびにオーファン受容体を活性化した混合物を含めて、多種多様なヒットを明らかにした。図４のデータによると、少なくとも１つの代謝産物混合物によるすべてのクラスの少なくとも１つのＧＰＣＲの活性化が完全なデータセット全体で観察された。

ＧＰＣＲ活性化の具体的パターンが全体の系統発生に基づいて明らかになった。表２および表３は、それぞれＧＭＭ培地とＧｉｆｕ培地の各培地でのＰＲＥＳＴＯ－Ｔａｎｇｏ分析による各細菌の受容体活性化の程度を示す。たとえば、バクテロイデス門（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）およびプロテオバクテリア門（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）に属するほとんどの菌株はコハク酸受容体（Ｓｕｃｒ１）を強力に活性化したが、フィルミクテス門（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）、フソバクテリウム門（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉａ）、およびアクチノバクテリア（放線菌）門（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）に属する菌株はこの受容体をほとんど活性化しなかった（表２および３）。しかしながら、同じ種に割り当てられているにもかかわらず、独自のＧＰＣＲアゴニスト活性を示した細菌株の複数の例を含め、多くの活性化パターンは系統発生と相関しなかった（表２および３）。

実施例３．ヒト腸内細菌はアミン作動性受容体を活性化する化合物を産生する
コハク酸受容体に加えて、腸内常在菌（gut commensal）によって活性化される次に最も一般的なＧＰＣＲのクラスはアミン作動性受容体であり、これは多様な組織や細胞タイプで発現され、神経伝達から免疫に至るまでの多種多様なコアの生理的プロセスを調節する。図４を参照されたい。(Albuquerque et al., 2009; Beaulieu and Gainetdinov, 2011; Thurmond et al., 2008)。これらのヒットには、ドーパミン（ＤＲＤ）、ヒスタミン（ＨＲＨ）、およびアドレナリン受容体ファミリーの細菌由来活性化因子が含まれていた。図５Ａ、６Ａ、および６Ｂに示すように、１２を超える常在菌上清がＤＲＤ２－４またはＨＲＨ２－４を活性化した。たとえば、プロテオバクテリア門からの１０株は、モルガネラ・モルガニー（Ｍ．ｍｏｒｇａｎｉｉ）菌種からの８株を含めて、ＤＲＤとＨＲＨの両方を活性化した。図５Ｂ、５Ｃ、６Ａ、および６Ｂを参照されたい。結果は、ＤＲＤおよびＨＲＨアゴニストの産生がＭ．ｍｏｒｇａｎｉｉの保存された特徴であることを示唆する。

対照的に、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ）の２つの菌株はＨＲＨを活性化することがわかったが、Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉの２つの別の菌株は、同様の増殖速度を示したにもかかわらず、ＨＲＨを活性化できなかった。図５Ｃ、６Ａ、および６Ｂを参照されたい。ストレプトコッカス属の１つの菌株はＤＲＤ２－４を活性化したが、２つの関連する分離株は活性化せず、一方、腸内細菌科の２つの未分類の菌株はＨＲＨ１－４およびＤＲＤ２を活性化したが、他のＤＲＤは活性化しなかった。図５Ｃ、６Ａ、および６Ｂを参照されたい。

モルガネラ・モルガニー（Ｍ．ｍｏｒｇａｎｉｉ）は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で測定して、ドーパミンを産生することが以前に報告されている（Ozogul, 2004）。しかしながら、図５Ａ、５Ｂ、６Ａ、および６Ｂに示すように、すべてのＭ．ｍｏｒｇａｎｉｉの上清が、ＤＲＤ２－４を強力に活性化したが、ＤＲＤ１およびＤＲＤ５は活性化しないことが観察された。これに対して、ＰＲＥＳＴＯ－Ｔａｎｇｏで測定したところ、ドーパミン自体は５つのドーパミン受容体すべてを効率的に活性化した。図７Ａを参照されたい。したがって、Ｍ．ｍｏｒｇａｎｉｉは、むしろ、ドーパミンに構造的に関連しかつＤＲＤ２－４の選択的リガンドとして機能できるがＤＲＤ１またはＤＲＤ５のリガンドとしては機能しない代謝産物を産生する可能性がある。図８Ａを参照されたい。

次に、本発明者らは、ＰＲＥＳＴＯ－Ｔａｎｇｏにより、哺乳動物のドーパミン経路におけるすべての潜在的な上流および下流の代謝産物がＤＲＤ１－５を活性化する能力について調べた（図８Ａ、８Ｂ）。この経路における様々な化合物が、様々なドーパミン受容体を活性化することがわかった：特に、フェネチルアミンとチラミンは、Ｍ．ｍｏｒｇａｎｉｉの上清と同じ活性化パターンを示した。図８Ｂおよび８Ｅを参照されたい。Ｍ．ｍｏｒｇａｎｉｉの上清中のドーパミン、フェネチルアミン、およびチラミンの濃度についてアッセイした。Ｍ．ｍｏｒｇａｎｉｉは微量のドーパミンしか産生せず、検出可能なチラミンを産生しないことがわかった。代わりに、Ｍ．ｍｏｒｇａｎｉｉは、ドーパミンやチラミンとは異なり血液脳関門を容易に通過できる強力な微量アミンであるフェネチルアミンを大量に分泌した。図５Ｄ、８Ｃ、および８Ｄを参照されたい（Oldendorf, 1971）。

以前の報告は、モルガネラ・モルガニー（Ｍ．ｍｏｒｇａｎｉｉ）がヒスタミンも産生することを示唆している（Ozogul,2004）。ＥＬＩＳＡで確認されたように、Ｍ．ｍｏｒｇａｎｉｉ株は確かにかなりの量のヒスタミンを分泌した（図５Ｅ）。ヒスタミンＥＬＩＳＡは以下のように行った。すべての菌株を１％Ｌ－Ｈｉｓを含むまたは含まない腸内微生物叢培地で２４時間培養し、高速遠心分離により上清を回収した。盲腸内容物、結腸内容物、および糞便サンプルを収集し、秤量した；すべてのサンプルを１：２（ｗ／ｖ）の比率でＰＢＳに懸濁し、ボルテックスでホモジナイズした。血清および脳を採取し、秤量し、１：２（ｗ／ｖ）の比率でＰＢＳに懸濁した。脳を２１Ｇの針に５０回通すことにより均質化した。製造元のプロトコルに従ってヒスタミンＥＬＩＳＡ用にすべてのサンプルを遠心分離して上清を収集した。

同様に、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ）の２つの菌株とヒスタミン受容体を活性化した腸内細菌科の２つの菌株もヒスタミンを分泌した（図５Ｅ）。まとめて、これらのデータは、モルガネラ・モルガニー（Ｍ．ｍｏｒｇａｎｉｉ）が、ドーパミン受容体の定義済みサブセットに対する強力かつ選択的なアゴニストとして作用する高レベルのフェネチルアミンを分泌すること、およびＭ．ｍｏｒｇａｎｉｉとＬ．ｒｅｕｔｅｒｉの選択株とがヒスタミンを分泌することを明らかにする。

哺乳動物では、フェネチルアミン、ドーパミン、およびチラミンは、芳香族Ｌ－アミノ酸デカルボキシラーゼによる、Ｌ－Ｐｈｅ、Ｌ－ＤＯＰＡ、およびＬ－Ｔｙｒの脱炭酸によってそれぞれ産生される（ＡＡＤＣ；図８Ａ）（Lovenberg, 1962）。本発明者らは、モルガネラ・モルガニー（Ｍ．ｍｏｒｇａｎｉｉ）がこれら３つのアミノ酸を対応する生体アミンに同様に加工するかどうかを試験した。Ｌ－Ｐｈｅ、Ｌ－ＤＯＰＡ、Ｌ－Ｔｙｒ、およびＬ－Ｈｉｓを欠く定義済みの最小培地（ＭＭ）を使用して、Ｍ．ｍｏｒｇａｎｉｉを培養した。正常なＭ．ｍｏｒｇａｎｉｉの増殖にもかかわらず、発明者らは、液体クロマトグラフィー－質量分析（ＬＣ－ＭＳ）によって、フェネチルアミン、チラミン、ドーパミン、またはヒスタミンの産生を検出できなかった（図５Ｆ）。

ただし、図５Ｆおよび５Ｇに示すように、Ｌ－ＰｈｅまたはＬ－Ｈｉｓの補給により、高レベルのフェネチルアミンまたはヒスタミンの産生、ならびにＤＲＤ２－４またはＨＲＨ２－４の活性化がもたらされた。対照的に、図８Ｆに示すように、Ｌ－ＤＯＰＡまたはＬ－Ｔｙｒの補給は、すべての条件における同様の細菌増殖にもかかわらず、ドーパミンまたはチラミンの産生も、Ｍ．ｍｏｒｇａｎｉｉの上清によるＤＲＤの活性化も引き起こさなかった。この結果は、哺乳動物のＡＡＤＣとは異なり、Ｍ．ｍｏｒｇａｎｉｉは、Ｌ－Ｐｈｅを選択的にフェネチルアミンに変換し、Ｌ－ＤＯＰＡまたはＬ－Ｔｙｒをドーパミンまたはチラミンに効率的に変換することはできないことを示唆する。

実施例４．微生物叢由来のヒスタミンは結腸の運動性の増加を促進する
ヒスタミンは、Ｌ－Ｈｉｓの脱炭酸によって生成される（Tannase, 1985）。モルガネラ・モルガニー（Ｍ．ｍｏｒｇａｎｉｉ）の８つの菌株とラクトバチルス・ロイテリ（Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ）の２つの菌株はｉｎ ｖｉｔｒｏでヒスタミンを産生した。Ｌ－Ｈｉｓの補給は、これらの菌株によるヒスタミン産生を有意に増加させた。対照的に、図９Ａに示す結果によると、Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉの２つの別の菌株は、Ｌ－Ｈｉｓの補給に関係なくヒスタミンを産生できなかった。Ｍ．ｍｏｒｇａｎｉｉを好気的または嫌気的に複数の培地で培養した場合、Ｍ．ｍｏｒｇａｎｉｉの上清は培養条件に関係なくＤＲＤおよびＨＲＨを活性化した。

モルガネラ・モルガニー（Ｍ．ｍｏｒｇａｎｉｉ）とラクトバチルス・ロイテリ（Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ）がｉｎ ｖｉｖｏでもヒスタミンを産生できるかどうかを試験するために、無菌マウスに、（ｉ）９または１０の多様なヒト腸内微生物を含む２つの異なるＭｏｃｋコミュニティ、あるいは（ｉｉ）Ｍ．ｍｏｒｇａｎｉｉを定着させ、その際にＬ－Ｈｉｓが豊富な食事（たとえば肉が多い食事）の効果に近づけるために、１％のＬ－Ｈｉｓを補給したまたは補給していない飲料水を自由にとらせた。雌雄の６～１２週齢の無菌野生型Ｃ５７Ｂｌ／６マウスをすべての実験で使用した。無菌のＣ５７Ｂｌ／６マウスに、２００μｌの個々の細菌培養物または混合細菌共生体（mixed bacterial consortia）を強制経口投与することにより定着させた。ＭｏｃｋコミュニティＡおよびＢは、次の分類群で構成されていた：コミュニティＡ：ストレプトコッカス属（または連鎖球菌属）菌種（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ）；ウェルシュ菌（Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）；バクテロイデス・フラジリス（Ｂ．ｆｒａｇｉｌｉｓ）；エリュシペロトリクス綱菌種（Ｅｒｉｓｉｐｅｌｏｔｒｉｃｈａｃｅａｅ ｓｐｐ）；コリンセラ・アエロファシエンス（Ｃ．ａｅｒｏｆａｃｉｅｎｓ）；バクテロイデスＵＣ（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ＵＣ）；ブラウティア・プロダクタ（Ｂ．ｐｒｏｄｕｃｔａ）；アロバキュラム属菌種（Ａｌｌｏｂａｃｕｌｕｍ ｓｐｐ）、およびオシロスピラ属菌種（Ｏｓｃｉｌｌｏｓｐｉｒａ ｓｐｐ）；コミュニティＢ：バクテロイデス属菌種（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｓｐｐ）；パラバクテロイデス・ディスタソニス（Ｐ．ｄｉｓｔａｓｏｎｉｓ）；ペプトニフィラス属菌種（Ｐｅｐｔｏｎｉｐｈｉｌｕｓ ｓｐｐ）；バクテロイデス・オバツス（Ｂ．ｏｖａｔｕｓ）；クロストリジウム目（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌｅｓ ＵＣ／ＵＣ）；ラクノスピラ科（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ＵＣ／ＵＣ）；コリンセラ・ステルコリス（Ｃ．ｓｔｅｒｃｏｒｉｓ）；バクテロイデス・ ユニフォルミス（Ｂ．ｕｎｉｆｏｒｍｉｓ）、およびパラバクテロイデス属菌種（Ｐａｒａｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｓｐｐ）。実験期間中、すべてのノトバイオートマウスをＴｅｃｈｎｉｐｌａｓｔ Ｐ Ｉｓｏｃａｇｅｓで維持し、無菌的に操作した。

データを図９Ｂに示す。さらに、本発明者らは、異なるヒスタミン産生能力を有するラクトバチルス・ロイテリ（Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ）の２つの株、すなわち、ｉｎ ｖｉｔｒｏで有意なヒスタミンを産生したＬ．ｒｅｕｔｅｒｉ Ｃ９３、およびｉｎ ｖｉｔｒｏでヒスタミンを産生しなかったＬ．ｒｅｕｔｅｒｉ Ｃ８８をマウスに単独定着させた。図９Ｃに示すように、Ｍ．ｍｏｒｇａｎｉｉまたはＬ．ｒｅｕｔｅｒｉ Ｃ９３を定着させたマウスは、高レベルの腸ヒスタミン産生を示したが、２つのＭｏｃｋコミュニティまたはＬ．ｒｅｕｔｅｒｉ Ｃ８８を定着させたマウスはほとんど検出できない腸ヒスタミンを示した。さらに、Ｍ．ｍｏｒｇａｎｉｉの単独定着マウスにおけるヒスタミン産生は、食餌性Ｌ－Ｈｉｓの補給により有意に増加した。図９Ｃを参照されたい。図１０Ａに示すように、追加のＬ－Ｈｉｓの供給の有無にかかわらず、Ｍ．ｍｏｒｇａｎｉｉ定着マウスの血清においてヒスタミンの増加が検出された。

次に、Ｍ．ｍｏｒｇａｎｉｉの所在位置をｉｎ ｖｉｖｏで決定した。改変Ｎｉｖｅｎ寒天培地を使用して、９または１０の多様なヒト腸内微生物の２つのＭｏｃｋコミュニティ＋Ｍ．ｍｏｒｇａｎｉｉを定着させたノトバイオートマウスにおいてＭ．ｍｏｒｇａｎｉｉのＣＦＵを数えた（Mavromatis, 2002）。本発明者らは、Ｍ．ｍｏｒｇａｎｉｉが主に盲腸および結腸に生息し、小腸にはほとんど存在しないことを見出した。図１０Ｂ～１０Ｄを参照されたい。ヒトでの以前の研究では、Ｍ．ｍｏｒｇａｎｉｉが結腸の組織または粘液に関連するニッチ（niche）に優先的に局在することも示されている（Eun et al., 2016）。

ヒスタミンの強制経口投与は、げっ歯類において結腸運動性を高めることが報告されている（Kim et al., 2011; Tyagi et al., 2009）。したがって、本発明者らは、腸内微生物由来のヒスタミンも腸の運動性を高め得ると仮定した。本発明者らは、水中の１％のＬ－Ｈｉｓの投与ありまたはなしで、系統発生的に多様なヒト腸内微生物を含む２つのＭｏｃｋコミュニティ、またはモルガネラ・モルガニー（Ｍ．ｍｏｒｇａｎｉｉ）を定着させたマウスの腸の運動性を評価した。腸の運動性は、以下のように糞便排出量を測定することによって評価した。個々のマウスを空の容器（１／４ガロン）に１時間収容し、その後、糞便ペレットを数え、秤量した。Ｌ－Ｈｉｓを与えたマウスの場合、糞便排出量を測定する前に、マウスに１％のＬ－Ｈｉｓを含む水を２週間自由に与えた。

Ｍ．ｍｏｒｇａｎｉｉの定着は、糞便排出量の有意な増加をもたらし、それはＬ－Ｈｉｓの補給によりさらに増加した。図９Ｄを参照されたい。同様に、Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ Ｃ９３を定着させたマウスは、Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ Ｃ８８を定着させたマウスと比較して、糞便排出量の増加を示した。図９Ｄを参照されたい。これらのデータは、微生物叢由来のヒスタミンが腸の運動性を制御できること、および食事性のヒスチジンがこれらの効果を高めることができることを示す。

実施例５．モルガネラ・モルガニー（Ｍ．ｍｏｒｇａｎｉｉ）はモノアミンオキシダーゼ阻害と組み合わせた場合に「フェネチルアミン中毒」を引き起こす可能性がある
Ｍ．ｍｏｒｇａｎｉｉによる豊富なヒスタミン産生がｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの両方で検出されたが、Ｍ．ｍｏｒｇａｎｉｉ定着マウスの結腸で低レベルのフェネチルアミンしか検出されなかった（図９Ｅ）。この観察結果の考えられる説明は、ドーパミン、チラミン、フェネチルアミンなどの生体アミンが、哺乳類のモノアミンオキシダーゼ（ＭＡＯ）によって腸内で急速に分解されることである（Glover, 1977）。ｉｎ ｖｉｖｏでのフェネチルアミンの潜在的産生を明らかにするために、本発明者らは、無菌マウス、あるいはＭ．ｍｏｒｇａｎｉｉまたはＤＲＤアゴニストを産生しないバクテロイデス・テタイオタオミクロン（Ｂ．ｔｈｅｔａ）株を単独定着させたマウスを、不可逆的ＭＡＯ阻害剤（ＭＡＯＩ）フェネルジンで処置した。

トリプル四重極ＭＳにより、Ｍ．ｍｏｒｇａｎｉｉ定着マウスの結腸でフェネチルアミンの増加が観察された（図９Ｅ）；対照的に、無菌マウスおよびＢ．ｔｈｅｔａを定着させかつＭＡＯＩで処置したマウスでは結腸のフェネチルアミンは検出できなかった（図９Ｅ）。トリプル四重極（ＱＱＱ）ＭＳは次のように実施した。エレクトロスプレーイオン化－トリプル四重極－タンデム質量分析ＥＳＩ－ＱＱＱ－ＭＳ／ＭＳは、マルチプルリアクションモニタリング（ＭＲＭ）モードを使用して実行した。Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｋｉｎｅｔｅｘ １．７μｍ Ｃ１８ １００Å（１００ｘ２．１０ｍｍ）カラムを備えたＡｇｉｌｅｎｔ ６４９０ ＥＳＩ－ＱＱＱ－ＭＳ／ＭＳ装置を定量および較正に使用した。Ａｇｉｌｅｎｔ Ｍａｓｓ Ｈｕｎｔｅｒ Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒを使用して各標準（Ｌ－フェニルアラニン、フェネチルアミン、ヒスタミン、チラミン、ドーパミン）を最適化した。三重で様々な濃度（０～２５μＭの範囲）を使用して各標準の検量線を作成した。グラジエントは、ｄｄＨ_２Ｏ（０．１％ギ酸を含む）中の１０～１００％のアセトニトリル、その後に１００％アセトニトリルでの洗浄ステップで構成された。次に、三重のデータを線形回帰分析にかけ、線形検量線を作成した。実験サンプルの処理は、サンプルを注入する前に、凍結乾燥および１００％ＭｅＯＨ（元の培養物体積の２０％体積）での抽出を伴う。サンプルの吸光度を線形較正（liner calibration）にかけて濃度を計算した。

他の多くの不可逆的ＭＡＯＩとは異なり、フェネルジンは依然として大うつ病性障害、ならびにパニック、社会不安、心的外傷後ストレス障害などの他の様々な精神障害の処置に臨床的に使用されている（Fiedorowicz, 2004）。本発明者らは、Ｍ．ｍｏｒｇａｎｉｉ定着マウスが、ＭＡＯＩでの処置後数日以内に無気力になり、Ｍ．ｍｏｒｇａｎｉｉ定着マウス全体の半数より多くが処置後７日目より前に死亡したことが分かった。図９Ｆを参照されたい。対照的に、バクテロイデス・テタイオタオミクロン（Ｂ．ｔｈｅｔａ）を定着させ、さらにＭＡＯＩで処置したマウスは健康に見えた。

ＭＡＯＩ処置後の罹患率および死亡率は、ＱＱＱ ＭＳで測定して、フェネルジンで処置したＭ．ｍｏｒｇａｎｉｉ単独定着マウスの結腸、血清、および脳のフェネチルアミンレベルの上昇と相関していた。結果を図９Ｇ、１０Ｅ、および１０Ｆに示す。最後に、本発明者らは、ＭＡＯＩで処置したＭ．ｍｏｒｇａｎｉｉ定着マウスからの盲腸および結腸の内容物および血清が、ＤＲＤ２を活性化することを見出した。図９Ｈを参照されたい。これらのデータは、Ｍ ｍｏｒｇａｎｉｉ由来のフェネチルアミンが全身に蓄積し、ＭＡＯＩで処置されたマウスにおいて劇的な生物学的効果を発揮できることを示す。

実施例６．ユニークなバクテロイデス分離株がＧＰＲ５６／ＡＧＲＧ１を活性化する
特定の細菌上清が選択オーファンＧＰＣＲを活性化することが観察された（図１１Ａ）。確認するために、発明者らは、我々のカルチャーコレクション中のヒト腸内微生物のほとんどのより堅牢な増殖を支援する富栄養培地（Ｇｉｆｕ培地）を使用して、我々のＰＲＥＳＴＯ－Ｔａｎｇｏスクリーニング手順を繰り返した。この改変手順により、オーファンＧＰＣＲに対するポジティブヒットの数が大幅に増加した：図１１Ｂに示すように、１７のオーファンＧＰＣＲが、少なくとも１つの細菌上清に応答して培地のみの対照よりも４倍を超える活性化を示した。Ｂ．ｔｈｅｔａ種に割り当てられた菌株（Ｂ．ｔｈｅｔａ Ｃ３４）からの代謝産物は、両方の培養条件下でＧＰＲ５６／ＡＧＲＧ１を活性化した（図１１Ｃ）。対照的に、Ｂ．ｔｈｅｔａの市販株および他の多様なバクテロイデス属の菌種を含むＢ．ｔｈｅｔａの他の菌株は、同様の細菌増殖（図１２Ａ）にもかかわらず、ＧＰＲ５６／ＡＧＲＧ１を活性化できなかった（図１１Ｄ）。

実施例７．必須アミノ酸Ｌ－ＰｈｅはＧＰＲ５６／ＡＧＲＧ１およびＧＰＲ９７／ＡＧＲＧ３を活性化する
ＧＰＲ５６／ＡＧＲＧ１の既知の内因性小分子リガンドがないため（Ｐｕｒｃｅｌｌ，２０１８）、本発明者らは次に、ＧＰＲ５６／ＡＧＲＧ１を活性化するＢ．ｔｈｅｔａ Ｃ３４によって産生される特定の代謝産物を同定することを試みた。Ｂ．ｔｈｅｔａ Ｃ３４の上清を凍結乾燥し、メタノールで抽出し、逆相ＨＰＬＣで分画した。得られたすべての画分をＧＰＲ５６ ＰＲＥＳＴＯ－Ｔａｎｇｏによって活性について分析し、画分１１を活性画分として同定した。図１１Ｅを参照されたい。

メタボロミクスアッセイは以下のように実施した。ＮＭＲスペクトルは、クライオプローブを備えたＡｇｉｌｅｎｔ ６００ ＭＨｚ ＮＭＲシステムを使用して取得した。高分解能ＭＳおよびタンデムＭＳ（ＭＳ／ＭＳ）データは、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｋｉｎｅｔｅｘ ５μｍ Ｃ１８ １００Å（４．６ｘ２５０ｍｍ）カラムでＡｇｉｌｅｎｔ ｉＦｕｎｎｅｌ ６５５０ ＥＳＩ－ＨＲＭＳ－ＱＴＯＦ（エレクトロスプレーイオン化－高分解能質量分析－四重極飛行時間型（Electron Spray Ionization-High Resolution Mass Spectrometry-Quadrupole Time-of-Flight））装置を使用して取得した。Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｋｉｎｅｔｅｘ ５μｍ Ｃ１８ １００Å（４．６ｘ２５０ｍｍ）カラムまたはＡｇｉｌｅｎｔ Ｐｏｒｏｓｈｅｌｌ １２０ ＥＣ－Ｃ１８ ２．７μｍ（３．０ｘ５０ｍｍ）カラムとフォトダイオードアレイ（ＰＤＡ）検出器を備えたＡｇｉｌｅｎｔ １２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙシステムをルーチンサンプル分析に使用した。サンプルの分画および精製には、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｐｏｌａｒｉｓ Ｃ１８－Ａ ５μｍ（２１．２ｘ２５０ｍｍ）カラムを備えたＡｇｉｌｅｎｔ Ｐｒｅｐｓｔａｒ ＨＰＬＣシステムを使用した。

Ｆ１１の高分解能質量分析、ＮＭＲ、および同時注入分析により、必須アミノ酸であるフェニルアラニン（Ｐｈｅ）がＦ１１の主成分であることが示された（図１１Ｅおよび１２Ｂ）。最後に、改良Ｍａｒｆｅｙ法分析を使用した構造の特性評価により、Ｌ－Ｐｈｅが生物活性リガンドである可能性が高いことが確認された（図１２Ｃ）（Bhushan and Bruckner, 2011）。

次に、本発明者らは、ＧＰＲ５６－Ｔａｎｇｏを使用して、純粋なＬ－Ｐｈｅまたは構造的に関連するアミノ酸が、ＧＰＲ５６／ＡＧＲＧ１を活性化できるかどうかを試験した。バクテロイデス・テタイオタオミクロン（Ｂ．ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ）株Ｃ１１を、１０ｍＬの腸内微生物叢培地中において３７℃で２４時間嫌気性条件下において増殖させた。上清を回収し、凍結乾燥し、２ｍＬのメタノールで抽出した。次に、粗抽出物を乾燥し、分取Ｃ１８ ＨＰＬＣシステムを使用して分画した。使用したグラジエントは、水中の１０～５０％アセトニトリル（０．０１％トリフルオロ酢酸を含む）で３０分間、その後１００％で５分間であった。１分ごとに収集された画分を乾燥させ、ＰＢＳバッファーに再懸濁し、ＰＲＥＳＴＯ－Ｔａｎｇｏを使用して生物活性を試験した。活性画分を、ＥＳＩ－ＨＲＭＳ－ＱＴＯＦおよびＮＭＲ分析を使用して特徴付けした。立体化学は、改良Ｍａｒｆｅｙ法分析によって確認した（図１２Ｄ）（Bhushan and Bruckner, 2011）。

Ｌ－Ｐｈｅおよび程度は低いがＬ－ＴｙｒはＧＰＲ５６／ＡＧＲＧ１を立体選択的に活性化したが、Ｌ－ＴｒｐおよびＬ－Ｈｉｓ、Ｄ－Ｐｈｅ、Ｄ－Ｔｒｐ、Ｄ－ＨｉｓおよびＤ－Ｔｙｒは活性を示さなかった。図１１Ｆおよび１２Ｄを参照されたい。

ＧＰＲ５６／ＡＧＲＧ１は、接着型ＧＰＣＲファミリー（adhesion GPCR family）のメンバーである。接着型ＧＰＣＲは、細胞外マトリックスの成分などの様々なタンパク質リガンドとの相互作用を媒介する大きな細胞外ドメインを特徴的に有している（Purcell, 2018）。本発明者らは、ＧＰＲ５６／ＡＧＲＧ１のトランケーション変異体を構築することにより、ＧＰＲ５６／ＡＧＲＧ１の細胞外ドメインが小分子Ｌ－Ｐｈｅによる活性化に必要であるかどうかを評価した。この変異体は正常に発現される（Kishoreetak, 2016）が、Ｌ－Ｐｈｅに応答しなかった。図１１Ｇを参照されたい。データは、ＧＰＲ５６／ＡＧＲＧ１の細胞外ドメインがＬ－Ｐｈｅによる活性化に重要であり、Ｂ．ｔｈｅｔａのユニークな株が高レベルのＬ－Ｐｈｅを分泌し、Ｌ－Ｐｈｅが接着型ＧＰＣＲ（ＧＰＲ５６／ＡＧＲＧ１）の新規アゴニストであることを示唆する。

次に、本発明者らは、他のオーファンＧＰＣＲもＬ－Ｐｈｅに応答し得るどうかを調べた。Ｌ－Ｐｈｅで刺激されたすべての接着型ＧＰＣＲおよびオーファンＧＰＣＲでＰＲＥＳＴＯ－Ｔａｎｇｏスクリーニングを実施した。図１３Ａに示すように、ＧＰＲ９７／ＡＧＲＧ３もこの化合物によって活性化されることがわかった。さらに分析すると、ＧＰＲ９７／ＡＧＲＧ３は、ＧＰＲ５６／ＡＧＲＧ１－Ｌ－ＰｈｅよりもＬ－Ｐｈｅに対して高い選択性を示したが感度はより低く、Ｌ－Ｔｙｒ、Ｌ－Ｔｒｐ、またはＬ－ＨｉｓはＧＰＲ９７／ＡＧＲＧ３を活性化しなかった（図１３Ｂ）。この結果は、Ｂ．ｔｈｅｔａ Ｃ３４の上清によるＧＰＲ９７／ＡＧＲＧ３の有意な活性化が最初に観察されなかった理由を説明している可能性がある。ＧＰＲ５６／ＡＧＲＧ１と同様に、ＧＰＲ９７／ＡＧＲＧ３の細胞外ドメインは、Ｌ－Ｐｈｅに応答する能力に必要であった（図１３Ｃ）。特に、ＧＰＲ５６／ＡＧＲＧ１とＧＰＲ９７／ＡＧＲＧ３は両方とも接着型ＧＰＣＲのＧファミリーに属し、図１３Ｄに示すように、進化的に密接に関連している。これは、必須アミノ酸Ｌ－Ｐｈｅを検出する共通の能力を説明している可能性がある。

実施例８．細菌の代謝交換はフェネチルアミンのｉｎ ｖｉｖｏ産生に寄与することができる
上記の還元主義的研究は、Ｂ．ｔｈｅｔａ Ｃ３４は大量のＬ－Ｐｈｅを産生するが、一方、Ｍ．ｍｏｒｇａｎｉｉはＬ－Ｐｈｅを微量アミンのフェニルアラニンに加工できることを明らかにした。次に、本発明者らは、これらの２つの細菌がｉｎ ｖｉｖｏで活発な代謝交換に参加し得るかどうかを検討するためのアッセイを実施した。この仮説を調査する最初のステップは、Ｂ．ｔｈｅｔａ Ｃ３４がＬ－Ｐｈｅを直接合成できるかどうかを決定することであった。Ｌ－Ｐｈｅを欠く定義済み最小培地（ＳＡＣＣ）を使用して、本発明者らは、Ｂ．ｔｈｅｔａ Ｃ３４がｉｎ ｖｉｔｒｏでかなりの量のＬ－Ｐｈｅを直接合成できることを観察した（図１４Ａ、１４Ｂ）。したがって、本発明者らは、Ｂ．ｔｈｅｔａ Ｃ３４を単独定着させたマウスにＬ－Ｐｈｅ欠乏食を与え、ＱＱＱＭＳを介してＬ－Ｐｈｅのｉｎ ｖｉｖｏ産生を評価した。Ｌ－Ｐｈｅ欠乏食を与えたＧＦマウスは、通常の食餌を与えたＧＦマウスと比較して、糞便中のＬ－Ｐｈｅ濃度の低下を示した（図１４Ｃ）。対照的に、Ｂ．ｔｈｅｔａ Ｃ３４を定着させ、Ｌ－Ｐｈｅ欠乏食を与えたマウスは、Ｌ－Ｐｈｅ欠乏食を与えたＧＦマウスと比較して有意に高められたＬ－Ｐｈｅレベルを示した。

次に、本発明者らは、Ｍ．ｍｏｒｇａｎｉｉがＢ．ｔｈｅｔａ Ｃ３４由来のＬ－Ｐｈｅをフェネチルアミンに直接加工するかどうかを調べた。Ｂ．ｔｈｅｔａ Ｃ３４をＳＡＣＣ培地で培養した後、Ｂ．ｔｈｅｔａの上清をＭ．ｍｏｒｇａｎｉｉ培養物に移した。図１４Ｄに示すように、Ｂ．ｔｈｅｔａ Ｃ３４由来のＬ－Ｐｈｅは、Ｍ．ｍｏｒｇａｎｉｉによって効率的にフェネチルアミンに変換された。Ｃ３４とＭ．ｍｏｒｇａｎｉｉとの間の代謝交換がフェネチルアミンのｉｎ ｖｉｖｏ産生に寄与するかどうかを試験するために、ＧＦマウスに（ｉ）Ｍ．ｍｏｒｇａｎｉｉ単独、または（ｉｉ）Ｂ．ｔｈｅｔａ Ｃ３４とＭ．ｍｏｒｇａｎｉｉの両方を定着させた。そのマウスに、Ｌ－Ｐｈｅを欠く単純化された食餌を与えた。

次に、これらのマウスをフェネルジンで処置して、フェネチルアミンの潜在的産生を明らかにした。Ｍ．ｍｏｒｇａｎｉｉのみを定着させ、Ｌ－Ｐｈｅ欠乏食を与えたマウスは、ＭＡＯＩ処置にもかかわらず、健康を維持し、最小限のフェネチルアミン（盲腸および結腸抽出物によるＤＲＤ２活性化によって測定）を生成した（図１４Ｅ）。対照的に、Ｃ３４とＭ．ｍｏｒｇａｎｉｉを定着させ、Ｌ－Ｐｈｅ欠乏食を与え、ＭＡＯＩで処置したマウスは、４日目までに無気力になり、盲腸および結腸抽出物によるＤＲＤ２活性化によって測定した場合に、有意なレベルのフェネチルアミンを生成した（図１４Ｅ）。これらの結果は、Ｃ３４およびＭ．ｍｏｒｇａｎｉｉがｉｎ ｖｉｖｏで活発な代謝交換に参加できること、およびこの交換が宿主の生理機能に強力な影響を与える生物活性微量アミンの生成に寄与できることを示す。

実施例９．新規の超ハイスループットコンビナトリアルＧＰＣＲスクリーニング技術ＰＲＥＳＴＯ－Ｓａｌｓａにより、９６ウェルプレートの単一ウェルで数百のＧＰＣＲを同時にスクリーニングできる
１００μＬのＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋１％ペニシリン／ストレプトマイシンを有するポリ－Ｄ－リジン前処理９６ウェルプレートに、Ｓａｌｓａレポーター細胞（β－アレスチンとＴＥＶプロテアーゼの融合タンパク質を発現する安定細胞株）を播種した。細胞密度が９０％に達したときに、各ウェルにおいて、各ＧＰＣＲをコードする１００ｎｇのプラスミドと１００ｎｇのユニークなＳａｌｓａレポータープラスミドを細胞にトランスフェクトした（ＧＰＣＲあたり１ウェル、合計３１４ウェル）。トランスフェクションの６時間後、細胞培地を捨て、続いて５０μｌのトリプシンを添加し、３７℃で１０分間インキュベートした。消化後、さらに５０μＬの細胞培地を加え、細胞を１５回ピペッティングして、細胞クラスターを単細胞に分離した。次に、トランスフェクトされた細胞すべてを１本の１５ｍＬチューブにプールして混合細胞ライブラリを作製し、３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。

上清を捨て、細胞を同量の新鮮な細胞培地に再懸濁した。細胞ペレットを１５回ピペッティングして細胞を再懸濁させ、次にポリ－Ｄ－リジン前処理９６ウェルプレートに１００μＬ／ウェルで細胞を再播種した。再播種の１２時間後、細胞培地を捨て、１００μＬの新鮮なＤＭＥＭ＋１％ペニシリン／ストレプトマイシンと交換し、その後、示されたＧＰＣＲリガンドの段階希釈物で刺激した。リガンド刺激の９時間後、ｍＲＮＡを各ウェルから抽出し、次世代シーケンシング用のアンプリコンＤＮＡライブラリを調製するために使用した。リガンド刺激後のバーコード読み取りをリガンド刺激なしのバーコード読み取りで割った値を計算し、各ＧＰＣＲおよび各サンプルの活性化倍率を算出した。

データを図１６に示す。

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本出願は、本発明のいくつかの例および実施形態を説明する。それでもなお、原則として本発明の範囲および本質から逸脱することなく、記載された実施例および実施形態の様々な修正を開発することができることに留意しなければならない。これを念頭に置いて、他の実施形態が以下に列挙された項目の範囲に含まれる。その際、本明細書に記載のすべての数値範囲は、そこに含まれるすべてのサブ範囲、ならびにこれらの範囲の範囲内の任意の個々の値を含む。本明細書に記載されているすべての刊行物、特許、および特許出願は、参照により本明細書に組み込まれる。

Claims (104)

1. 試験化合物がｉｎ ｖｉｖｏで第１のタンパク質の活性を調節するかどうかを決定するための方法であって、
   （ａ）（ｉ）第１のタンパク質と、プロテアーゼの切断部位と、細胞におけるレポーター遺伝子の転写を活性化するタンパク質とを含む第１の融合タンパク質をコードする第１の核酸分子；（ｉｉ）前記第１のタンパク質が活性化されると該第１のタンパク質と相互作用する第２のタンパク質と、前記第１の融合タンパク質内のプロテアーゼ切断部位を切断することができるプロテアーゼまたはそのフラグメントとを含む第２の融合タンパク質をコードする第２の核酸分子；および（ｉｉｉ）レポーター遺伝子を含む第３の核酸分子であって、前記レポーター遺伝子は、その転写を活性化するタンパク質に応答するエレメントに作動可能に連結されたバーコード配列である、第３の核酸分子；を含む細胞に、前記化合物を接触させること、および
   （ｂ）前記バーコード配列の転写レベルを決定すること
   を含む、方法。
2. 前記第１の核酸分子、第２の核酸分子、および第３の核酸分子が、特定の受容体が個々のバーコードに連結することを可能にするようにクローン的に発現される、請求項１に記載の方法。
3. 前記第１の核酸分子、第２の核酸分子、および第３の核酸分子が、コトランスフェクションを介してクローン的に発現される、請求項２に記載の方法。
4. 前記第１の核酸分子、第２の核酸分子、および第３の核酸分子が、安定発現を介してクローン的に発現される、請求項２に記載の方法。
5. 前記バーコード配列が４～５０塩基を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
6. （ｃ）試験化合物が存在しない対照と比較して、試験化合物の存在下で前記バーコード配列の転写レベルが上昇した場合に、前記試験化合物が前記第１のタンパク質を活性化すると結論付けることをさらに含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
7. （ｃ）未処理の細胞と比較して、試験化合物の存在下で前記バーコード配列の転写レベルが上昇した場合に、前記試験化合物が前記第１のタンパク質を活性化すると結論付けることをさらに含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
8. （ｃ）前記第１のタンパク質のアンタゴニストと組み合わせて前記第１のタンパク質のアゴニストの単回投与で処理された細胞と比較して、試験化合物の存在下で前記バーコード配列の転写レベルが上昇した場合に、前記試験化合物が前記第１のタンパク質を活性化すると結論づけることをさらに含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
9. 前記第１のタンパク質が膜貫通タンパク質である、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
10. 前記第１のタンパク質がＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）である、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
11. 前記ＧＰＣＲが非嗅覚ＧＰＣＲである、請求項１０に記載の方法。
12. 前記ＧＰＣＲがオーファンＧＰＣＲである、請求項１０または１１に記載の方法。
13. ＧＰＣＲがヒトＧＰＣＲである、請求項１０～１２のいずれか一項に記載の方法。
14. 前記細胞におけるレポーター遺伝子の転写を活性化するタンパク質が、ｔＴＡ、ｃａｓ９融合タンパク質、ｇａｌ４／ＶＰ１６、エストロゲン受容体、アンドロゲン受容体、鉱質コルチコイド受容体、またはグルココルチコイド受容体である、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
15. ｃａｓ９融合タンパク質がｃａｓ９－ｖｐ６４である、請求項１４に記載の方法。
16. 前記細胞におけるレポーター遺伝子の転写を活性化するタンパク質がｔＴＡである、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
17. 前記第１のタンパク質が活性化されると該第１のタンパク質と相互作用する前記第２のタンパク質が、β－アレスチン、Ｇタンパク質受容体キナーゼ（ＧＲＫ）、またはＧ－アルファ（Ｇα）である、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
18. 前記第２のタンパク質がβ－アレスチンである、請求項１７に記載の方法。
19. 前記プロテアーゼがタバコエッチウイルス核内封入体Ａプロテアーゼ（ＴＥＶプロテアーゼ）である、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。
20. 前記細胞が非接着性哺乳動物細胞である、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法。
21. 前記細胞が、Ｅｘｐｉ ２９３Ｔ細胞、Ｊｕｒｋａｔ、Ｈｅｌａ Ｔ４、ｒａｊｉ、ｒａｍｏｓ、ｃｈｏ－ｓ、またはｔｈｐ１細胞である、請求項２０に記載の方法。
22. 前記バーコード配列の転写レベルが、ｃＤＮＡのシーケンシングによって決定される、請求項１～２１のいずれか一項に記載の方法。
23. ｃＤＮＡが、ポリｄＴプライマーを使用した細胞から単離されたｍＲＮＡの逆転写によって生成される、請求項２２に記載の方法。
24. 前記試験化合物が、対象の微生物叢内に含まれる細菌分類群によって産生される代謝産物である、請求項１～２３のいずれか一項に記載の方法。
25. 前記試験化合物が、対象の微生物叢内に含まれる細菌株によって産生される代謝産物である、請求項１～２３のいずれか一項に記載の方法。
26. 前記微生物叢が消化管内（ＧＩ）微生物叢である、請求項２４または２５に記載の方法。
27. 細菌株がクローン的に配置され、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養される、請求項２５または２６に記載の方法。
28. 細菌株を同定することをさらに含む、請求項２４～２７のいずれか一項に記載の方法。
29. 細菌株が、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子シーケンシングまたは全ゲノムシーケンシングを使用して同定される、請求項２８に記載の方法。
30. 前記対象がヒトである、請求項２５～２９のいずれか一項に記載の方法。
31. 前記方法がハイスループットフォーマットで実施され、
    （ｉ）トランスフェクトまたは形質導入された各細胞が第１のタンパク質とバーコード配列との特定の組み合わせを有するように、マルチウェルプレートの個々のウェルに分けられた複数の細胞に、第１、第２および第３の核酸分子をトランスフェクトまたは形質導入すること；
    （ｉｉ）トランスフェクトされた細胞を混合すること；
    （ｉｉｉ）混合された細胞をマルチウェルプレートの個々のウェルに再配置すること；
    （ｉｖ）再配置された細胞混合物を１つまたは複数の試験化合物に曝すこと；
    （ｖ）バーコードをシーケンシングすること；および
    （ｖｉ）試験化合物が存在しない対照と比較して、試験化合物の存在下でどのバーコード配列が増加するかを決定すること
    を含む、請求項１～３０のいずれか一項に記載の方法。
32. 前記方法がハイスループットフォーマットで実施され、
    （ｉ）前記第２の核酸分子（Ｂａｒｒ－ＴＥＶ）を安定発現する複数の細胞に、前記第１および第３の核酸分子（受容体およびバーコード）をトランスフェクトまたは形質導入すること；
    （ｉｉ）トランスフェクトされた細胞を混合すること；
    （ｉｉｉ）混合された細胞をマルチウェルプレートの個々のウェルに再配置すること；
    （ｉｖ）再配置された細胞混合物を１つまたは複数の試験化合物に曝すこと；
    （ｖ）バーコードをシーケンシングすること；および
    （ｖｉ）試験化合物が存在しない対照と比較して、試験化合物の存在下でどのバーコード配列が増加するかを決定すること
    を含む、請求項１～３０のいずれか一項に記載の方法。
33. 前記第１の核酸分子がＧＰＣＲをコードし、前記第２の核酸分子がＢａｒｒ－ＴＥＶをコードし、前記第３の核酸分子がバーコードを含む、請求項３２に記載の方法。
34. 複数のＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）の活性を調節することができる微生物叢代謝産物のハイスループットスクリーニングのための方法であって、
    ａ）複数の非接着性哺乳動物細胞を提供することであって、各細胞は、（ｉ）タバコエッチウイルス核内封入体Ａプロテアーゼ（ＴＥＶプロテアーゼ）の切断部位を介して転写因子ｔＴＡに連結されたＧＰＣＲを含む第１の融合タンパク質をコードする第１の核酸分子、（ｉｉ）β－アレスチンと、前記第１の融合タンパク質のＴＥＶプロテアーゼ部位を切断するように構成されたＴＥＶプロテアーゼとを含む第２の融合タンパク質をコードする第２の核酸分子、および（ｉｉｉ）ｔＴＡ転写因子によって特異的に活性化されるプロモーターに作動可能に連結されたバーコード配列を含む第３の核酸分子を含み、それによって各バーコード配列が個々のＧＰＣＲに特異的に連結される、前記細胞を提供すること、
    ｂ）前記複数の細胞を１つまたは複数の微生物叢代謝産物あるいは１つまたは複数の化合物と接触させること；
    ｃ）バーコードをシーケンシングすること；および
    ｄ）代謝産物が存在しない対照と比較して、代謝産物の存在下でどのバーコード配列の転写レベルが上昇または低下するかを決定すること；
    を含む、方法。
35. 前記ＧＰＣＲが非嗅覚ＧＰＣＲである、請求項３４に記載の方法。
36. 前記ＧＰＣＲがオーファンＧＰＣＲである、請求項３４または３５に記載の方法。
37. 前記ＧＰＣＲがヒトＧＰＣＲである、請求項３４～３６のいずれか一項に記載の方法。
38. 前記細胞がＥｘｐｉ ２９３Ｔ細胞である、請求項３４～３７のいずれか一項に記載の方法。
39. 前記バーコード配列の転写レベルが、ｃＤＮＡのシーケンシングによって決定される、請求項３４～３８のいずれか一項に記載の方法。
40. ｃＤＮＡが、細胞から単離されたＲＮＡの逆転写によって生成される、請求項３９に記載の方法。
41. 微生物叢が消化管内（ＧＩ）微生物叢である、請求項３４～４０のいずれか一項に記載の方法。
42. 特定のＧＰＣＲを活性化する特定の代謝産物を産生する細菌株を同定することをさらに含む、請求項３４～４１のいずれか一項に記載の方法。
43. 前記細菌株が、１６Ｓ ｒＲＮＡシーケンシングを使用して同定される、請求項４２に記載の方法。
44. 対象におけるモノアミンオキシダーゼ阻害剤（ＭＡＯＩ）誘発毒性を予防または処置する方法であって、フェネチルアミン産生遺伝子をコードする核酸配列を含む細菌株を標的とするのに有効な抗生物質を投与することを含む、方法。
45. 対象におけるＭＡＯＩ誘発毒性を予防または処置する方法であって、モルガネラ属菌種を標的とするのに有効な抗生物質を投与することを含む、方法。
46. 対象におけるＭＡＯ活性の低下によって引き起こされる疾患または状態を処置する方法であって、フェネチルアミン産生遺伝子をコードする核酸配列を含む生物を標的とするのに有効な抗生物質を投与することを含む、方法。
47. 前記生物が細菌株である、請求項４６に記載の方法。
48. 前記細菌株がフェネチルアミンを産生する、請求項４４、４６または４７に記載の方法。
49. 前記細菌株がフェネチルアミンを分泌する、請求項４８に記載の方法。
50. 前記疾患がブルンナー症候群である、請求項４４および４６～４８のいずれか一項に記載の方法。
51. 前記状態が自閉症または反社会的行動である、請求項４４および４６～４８のいずれか一項に記載の方法。
52. 前記対象がＭＡＯＡ－Ｌ変異体を発現する、請求項４４～５１のいずれか一項に記載の方法。
53. 前記抗生物質がモルガネラ・モルガニー（Ｍ．ｍｏｒｇａｎｉｉ）を標的とするのに有効である、請求項４４～５２のいずれか一項に記載の方法。
54. 前記抗生物質が、セフェピム、ピペラシリン、タゾバクタム、セフタジジム、セフォタキシム、セフチブテン、メロペネム、ドリペネム、エルタペネム、フルオロキノロン、またはアミノグリコシドである、請求項４４～５３のいずれか一項に記載の方法。
55. 対象におけるうつ病を処置する方法であって、フェネチルアミン産生遺伝子をコードする核酸配列を含む細菌株を投与することを含む、方法。
56. 抗うつ剤を前記対象に投与することをさらに含む、請求項５５に記載の方法。
57. 前記抗うつ剤がＭＡＯＩである、請求項５６に記載の方法。
58. 前記細菌株がフェネチルアミンを産生する、請求項５６または５７に記載の方法。
59. 対象におけるモノアミンオキシダーゼ阻害剤（ＭＡＯＩ）の潜在的毒性を評価するための方法であって、
    ａ）対象から消化管内微生物叢サンプルを取得すること、および
    ｂ）フェネチルアミン産生遺伝子を含む細菌分類群または細菌株の存在について前記サンプルをアッセイすること
    を含む、方法。
60. フェネチルアミン産生酵素の量が、微生物叢によって産生される酵素の量の規定された割合を超える、請求項５９に記載の方法。
61. 前記消化管内微生物叢サンプルが糞便サンプルである、請求項５９または６０に記載の方法。
62. 対象におけるＭＡＯＩの潜在的有効性を評価するための方法であって、
    ａ）対象の糞便サンプルまたは胃腸管からのサンプルを採取すること、および
    ｂ）フェネチルアミン産生遺伝子をコードする核酸配列を含む細菌株の存在についてアッセイすること
    を含む、方法。
63. 胃腸管に存在する細菌株の量についてアッセイすることをさらに含む、請求項５９～６２のいずれか一項に記載の方法。
64. 前記対象をＭＡＯＩで処置することをさらに含む、請求項５９～６３のいずれか一項に記載の方法。
65. 細菌株の存在および／または存在する細菌株の量に基づいてＭＡＯＩの投与量を調整または決定することをさらに含む、請求項５９～６４のいずれか一項に記載の方法。
66. 前記細菌株がモルガネラ属菌種の細菌である、請求項５９～６５のいずれか一項に記載の方法。
67. 前記細菌株がモルガネラ・モルガニー（Ｍ．ｍｏｒｇａｎｉｉ）である、請求項５９～６５のいずれか一項に記載の方法。
68. 対象におけるヒスタミン誘発性胃腸疾患を予防または処置する方法であって、ヒスタミン産生遺伝子をコードする核酸配列を含む細菌株を標的とするのに有効な１つまたは複数の抗生物質を投与することを含む、方法。
69. 前記ヒスタミン産生遺伝子がヒスチジンデカルボキシラーゼである、請求項６８に記載の方法。
70. ヒスチジンデカルボキシラーゼの存在量が、炎症性腸疾患のない対象と比較して、クローン病の患者において多い、請求項６９に記載の方法。
71. ヒスチジンデカルボキシラーゼの存在量が、炎症性腸疾患のない対象と比較して、潰瘍性大腸炎の患者において多い、請求項６９に記載の方法。
72. 前記細菌株がラクトバチルス・ロイテリ（Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ）、またはモルガネラ属菌種の細菌である、請求項６８に記載の方法。
73. 前記胃腸疾患が下痢である、請求項６８～７２のいずれか一項に記載の方法。
74. 対象におけるアレルギーを予防または処置する方法であって、ヒスタミン産生遺伝子をコードする核酸配列を含む細菌株を標的とするのに有効な１つまたは複数の抗生物質を投与することを含む、方法。
75. 前記細菌株が、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ）、またはモルガネラ属菌種の細菌である、請求項７４に記載の方法。
76. 対象における喘息を予防または処置する方法であって、ヒスタミン産生遺伝子をコードする核酸配列を含む細菌株を標的とするのに有効な１つまたは複数の抗生物質を投与することを含む、方法。
77. 前記細菌株が、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ）、またはモルガネラ属菌種の細菌である、請求項７６に記載の方法。
78. 前記抗生物質が、セフェピム、ピペラシリン、タゾバクタム、セフタジジム、セフォタキシム、セフチブテン、メロペネム、ドリペネム、エルタペネム、フルオロキノロン、またはアミノグリコシドである、請求項６８～７７のいずれか一項に記載の方法。
79. ヒスチジンデカルボキシラーゼ阻害剤を投与することをさらに含む、請求項６８～７８のいずれか一項に記載の方法。
80. 前記ヒスチジンデカルボキシラーゼ阻害剤が、ルゴシンＤ、ルゴシンＡメチルエステル、テリマグランジンＩＩ、ルゴシンＡ、ピノセンブリン、α－フルオロメチルヒスチジン、ブロクレシン、レカノール酸、２－ヒドロキシ－５－カルボメトキシベンジルオキシアミン、またはヒスタミンのアミノオキシ類似体である、請求項７９に記載の方法。
81. 対象における胃腸の状態もしくは疾患、アレルギーまたは喘息を処置するための抗生物質の潜在的有効性を評価するための方法であって、
    ａ）対象の糞便サンプルまたは胃腸管からのサンプルを採取すること、および
    ｂ）ヒスタミン産生遺伝子をコードする核酸配列を含む細菌株の存在についてアッセイすること
    を含む、方法。
82. 胃腸管に存在する細菌株の量についてアッセイすることをさらに含む、請求項８１に記載の方法。
83. 前記対象を１つまたは複数の抗生物質で処置することをさらに含む、請求項８１または請求項８２に記載の方法。
84. 前記抗生物質が、セフェピム、ピペラシリン、タゾバクタム、セフタジジム、セフォタキシム、セフチブテン、メロペネム、ドリペネム、エルタペネム、フルオロキノロン、またはアミノグリコシドである、請求項８３に記載の方法。
85. 細菌株の存在および／または存在する細菌株の量に基づいて抗生物質の投与量を調整または決定することをさらに含む、請求項８１～８４のいずれか一項に記載の方法。
86. 前記細菌株がモルガネラ属菌種の細菌である、請求項８１～８５のいずれか一項に記載の方法。
87. 前記細菌株がモルガネラ・モルガニー（Ｍ．ｍｏｒｇａｎｉｉ）である、請求項８１～８６のいずれか一項に記載の方法。
88. フェネチルアミンの産生に起因する疾患または状態を予防または処置する方法であって、Ｌ－フェニルアラニンを産生する細菌株を標的とするのに有効な１つまたは複数の抗生物質を投与することを含む、方法。
89. 対象におけるフェニルケトン尿症（ＰＫＵ）を予防または処置する方法であって、Ｌ－フェニルアラニンを産生する細菌株を標的とするのに有効な１つまたは複数の抗生物質を投与することを含む、方法。
90. フェネチルアミンの産生に起因する疾患または状態を予防または処置する方法であって、シキミ酸経路阻害剤、または芳香族Ｌ－アミノ酸デカルボキシラーゼのアンタゴニストを投与することを含む、方法。
91. 対象におけるフェニルケトン尿症（ＰＫＵ）を予防または処置する方法であって、シキミ酸経路阻害剤、または芳香族Ｌ－アミノ酸デカルボキシラーゼのアンタゴニストを投与することを含む、方法。
92. 前記アンタゴニストが、カルビドパ、ベンセラジド、メチルドパ、３’，４’，５，７－テトラヒドロキシ－８－メトキシイソフラボン（ＤＦＭＤ）、３－ヒドロキシベンジルヒドラジン、３－アミノ－１－メチル－５Ｈ－ピリド［４，３－ｂ］インドール（Ｔｒｐ－Ｐ－２）、またはα－ジフルオロメチルＤＯＰＡである、請求項９０または９１に記載の方法。
93. 前記細菌株がバクテロイデス・テタイオタオミクロン（Ｂ．ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ）である、請求項８８～９２のいずれか一項に記載の方法。
94. 前記細菌株がバクテロイデス・テタイオタオミクロン（Ｂ．ｔｈｅｔａｉｏｔａｏｍｉｃｒｏｎ）のＣ３４株である、請求項９３に記載の方法。
95. 抗生物質が、アンピシリン、クラブラン酸塩、タゾバクタム、セファマイシン、チカルシリン、ピペラシリン、セファロスポリン、カルバペネム、クリンダマイシン、リンコマイシン、クロラムフェニコール、ニトロイミダゾール、フルオロキノロンである、請求項８８～９４のいずれか一項に記載の方法。
96. 前記抗生物質が、（ａ）アンピシリンとスルバクタムの組み合わせ、（ｂ）チカルシリンとクラブラン酸塩の組み合わせ、または（ｃ）ピペラシリンとタゾバクタムの組み合わせを含む、請求項８８～９４のいずれか一項に記載の方法。
97. プロバイオティクス組成物を投与することをさらに含む、請求項４４～５４および請求項６８～９６のいずれか一項に記載の方法。
98. 前記プロバイオティクス組成物が抗生物質の投与後に投与される、請求項９７に記載の方法。
99. 抗生物質の投与およびプロバイオティクス組成物の投与が周期的に繰り返される、請求項９７または９８に記載の方法。
100. 対象におけるＭＡＯＩの潜在的毒性を評価するためのキットであって、細菌株によって発現されるヌクレオチドまたはタンパク質に特異的に結合することができる核酸、抗体、または他の試薬を含み、前記細菌株はフェネチルアミン産生遺伝子をコードする核酸配列を含む、キット。
101. 前記細菌株がモルガネラ属菌種の細菌である、請求項１００に記載のキット。
102. 前記細菌株がモルガネラ・モルガニー（Ｍ．ｍｏｒｇａｎｉｉ）である、請求項１００に記載のキット。
103. 対象における胃腸の状態もしくは疾患、アレルギーまたは喘息を処置するための抗生物質の潜在的有効性を評価するためのキットであって、細菌株によって発現されるヌクレオチドまたはタンパク質に特異的に結合することができる核酸、抗体、または他の試薬を含み、前記細菌株はヒスタミン産生遺伝子をコードする核酸配列を含む、キット。
104. 前記細菌株が、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ）、またはモルガネラ属菌種の細菌である、請求項１０３に記載のキット。
     

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