KR20100058526A - 프로테아제 활성화된 리포터를 사용한 단백질-단백질 상호작용 조절 분자의 확인 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명의 시험방법 및 시스템은 리포터를 조절(활성화 또는 불활성화)하기 위해서 단백질-단백질 상호작용으로 인한 효소적 분열을 사용한다.

Description

프로테아제 활성화된 리포터를 사용한 단백질-단백질 상호작용 조절 분자의 확인 방법{Identifying molecules that modulate protein-protein interactions using protease activated reporters}

본 발명은 관심이 있는 분자들 사이의 상호작용을 측정하는 물질 및 방법에 관한 것이다. 더욱 특히, 본 발명은 특정의 물질, 예를 들어, "시험 화합물"이 관심이 있는 두 개 또는 그 이상의 특정의 단백질의 상호작용을 조절하는지 여부를 측정하는데 관한 것이다. 측정은 세포 내, 용액 내, 또는 하나 또는 그 이상의 관심이 있는 반응물을 함유하는 인공 패키지 또는 유니트 내에 있을 수 있는 리포터 유전자의 활성화를 모니터링하는 것을 수반하는데, 여기에서 활성화 또는 이의 결여는 조절 또는 조절의 결여로 인한 것이다. 측정은 일반적으로, 세포를 형질전환 또는 형질감염시키기 위해서 사용된 성분과 같이 본 발명의 관점으로서 역시 특징이 되는 형질전환되거나 형질감염된 세포를 사용하여 일어난다. 세포-부재 시스템, 또는 바이러스, 바이러스-유사 입자, 리포좀 등과 같은 관심이 있는 하나 또는 그 이상의 시약을 갖는 인공적 패키지 또는 유니트를 사용하는 시스템이 또한 사용될 수도 있다.

예를 들어, 수용체에 대한 리간드의 확인에 의해서 예시되는 것과 같은 단백질/단백질 상호작용의 시험은 매우 흥미로운 분야이다. 소정의 수용체에 대한 리간드 또는 리간드들이 공지되어 있는 경우에도, 더 효과적이거나 더 선택적인 리간드를 확인하는데 관심이 있다. 7회 막관통 (seven transmembrane) 수용체 (7TMR)로 또한 공지되어 있는 G-단백질 커플링된 수용체 GPCR이 본 발명에서 이러한 방식으로 특정화될 수 있는 단백질의 클래스 (class)의 비-독점적인 예로서 거론될 수 있다. 그러나, 상호작용하는 모든 단백질, 예를 들어, 대사성 경로 또는 캐스케이드 (cascade)의 구성원은 본 시험방법에 의해서 사용하기에 적합하다.

GPCR은 인간에 대해서 알려진 세포 표면 수용체의 가장 큰 클래스이며, 따라서 본 발명의 가장 중요한 적용예로 간주된다. GPCR에 의한 시그날링을 조절하는 리간드에는 호르몬, 신경전달물질, 펩타이드, 당단백질, 지질, 뉴클레오타이드, 및 이온이 포함된다. GPCR은 또한, 감각 수용체, 예를 들어, 광선, 냄새, 페로몬 및 미각에 대한 수용체인 것으로 알려져 있다. 이들 다양하고 수많은 역할을 고려하여, GPCR은 예를 들어, 화학적 방어 및 생물학적-방어 적용 및 다양한 상태를 치료하는데 유용한 약물에 대한 격렬한 연구의 대상이 된다. 다수의 약물 발견 성공이 이미 이루어졌다. 예를 들어, 문헌 [Howard, et al., Trends Pharmacol . Sci ., 22:132 140 (2001)]에서는 시판되는 약물 중의 50% 이상이 이러한 수용체에 작용하는 것으로 추정하였다.

본 발명에서 사용된 것으로서, "GPCR"은 수용체의 GPCR 슈퍼패밀리 (superfamily)의 모든 구성원을 나타낸다. 이 슈퍼패밀리는 7회-막관통 영역 (7TM) 구조를 특징으로 한다. 이들 수용체의 예로는 클래스 A 또는 "로돕신 (rhodopsin)-유사" 수용체; 클래스 B 또는 "시크리틴 (secretin)-유사" 수용체; 클래스 C 또는 "대사성 (metabotropic) 글루타메이트-유사" 수용체; 프리즐드 (Frizzled) 및 스무든드 (Smoothened)-관련된 수용체; 부착 수용체 패밀리 또는 EGF-7TM/LNB-7TM 수용체; 아디포넥틴 수용체 및 관련된 수용체; 및 취기제, 미각, 서비골, 및 페로몬 수용체를 포함하는 화학적 감각 수용체가 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다. 예로서, 인간에게서 GPCR 슈퍼패밀리에는 문헌 [Vassilatis, et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 100:4903 4908 (2003); Takeda, et al., FEBS Letters , 520:97 101 (2002); Fredricksson, et al., Mol . Pharmacol ., 63:1256 1272 (2003); Glusman, et al., Genome Res ., 11:685 702 (2001); 및 Zozulya, et al., Genome Biol ., 2:0018.1 0018.12 (2001)]에 기술된 수용체 분자가 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다.

간략하면, GPCR 기능의 일반적인 작용 기전은 다음과 같다: 1) GPCR이 리간드에 결합하여 2) 구조적 변화를 야기하고, 이에 의해서 3) 세포 생리학의 변화를 유도하는 세포성 현상의 캐스케이드를 자극한다. GPCR은 헤테로트라이머성 구아닌 뉴클레오타이드 결합 단백질 (G 단백질) 및 β 어레스틴과 같은 다수의 세포내 단백질의 활성을 조절함으로써 시그날을 변환시킨다. G 단백질의 경우에, 리간드-수용체 콤플렉스는 구아닌 뉴클레오타이드 교환 및 G 단백질 헤테로트라이머의 α 및 βγ 서브유니트로의 해리를 자극한다. 다른 상황에서, β 어레스틴은 G 단백질을 대신하고, G 단백질 시그날링의 반대로 작용하며, G 단백질 시그날링을 상승시키는 등의 작용을 할 수 있다.

GTP-결합된 α 서브유니트 및 βγ 헤테로다이머는 둘 다 아데닐릴 사이클라제 및 포스포리파제　C (PLC)를 포함한 다양한 세포성 효과기 단백질을 조절하는 것으로 관찰되었다. GPCR에 대한 통상적인 세포-기본 시험에서, 수용체 활성은 아데닐릴 사이클라제에 의해서 생산된 cAMP의 축적; 또는 예를 들어, PLC 활성에 의해서 자극된 세포내 칼슘의 방출과 같은 G 단백질-조절된 효과기 경로의 아웃풋 (output)을 측정함으로써 모니터링한다.

통상적인 G 단백질-기본 시그날 전달 시험은 다양한 이유로 몇 가지의 표적에 대해서는 개발하기가 어려웠다. 예를 들어, 우선 여러 가지의 GPCR을 여러 가지의 G 단백질-조절된 시그날 전달 경로에 커플링시킨다. 전통적인 G　단백질-기본 시험은 표적 수용체의 G 단백질 특이성을 아는 것에 따라 좌우되거나, 시험은 선택된 G 단백질 효과기 경로에 표적 수용체가 강제 커플링하도록 하는 세포성 시스템의 엔지니어링 (engineering)을 필요로 한다. 둘 째로, GPCR 슈퍼패밀리는 대단히 크기 때문에, 모든 세포는 다수의 내인성 GPCR (뿐만 아니라 다른 수용체 및 시그날링 인자)을 발현한다. 따라서, 측정된 효과기 경로는 표적 GPCR 이외에도 내인성 분자에 의해서 조절될 수 있다. 이 현상은 예를 들어, 표적 GPCR의 선택적 조절물질을 확인하기 위해서 시도하는 경우에 거짓 양성 (false positive) 또는 거짓 음성 결과를 야기할 수 있다.

G 단백질 활성의 조절은 리간드/GPCR 결합의 유일한 결과는 아니다 [참조: 예를 들어, Luttrell, et al., J. Cell Sci ., 115:455 465 (2002), 및 Ferguson, Pharmacol . Rev ., 53:1 24 (2001); 이들은 GPCR 시그날의 약화 또는 종결을 유도할 수 있는 활성을 검토한다]. 이들 종결 과정은 과도한 세포 자극을 방지하고, 세포외 시그날과 상응하는 세포내 경로 사이의 일시적인 연결을 실시하는데 유용하다.

일반적으로, GPCR에 대한 아고니스트의 결합은 수용체 분자의 C 말단에서 세린 및 트레오닌 잔기가 GPCR 키나제에 의해서 포스포릴화되도록 한다. 그 후, 아고니스트-콤플렉스화된 C 말단-포스포릴화된 GPCR은 수용체 시그날링을 하향 조절하거나 억제하는 어레스틴 패밀리 구성원, 예를 들어, α 어레스틴, β 어레스틴 또는 β 어레스틴 2와 상호작용한다. 결합은 G 단백질에 대한 수용체의 커플링을 억제함으로써 내재화에 이어서 분해 및/또는 재순환을 위해 수용체를 표적화시킬 수 있다. 예를 들어, 포스포릴화된 GPCR에 대한 β 어레스틴 2와 같은 어레스틴의 결합은 다양한 경로에서 표적 GPCR의 활성을 감소시킬 수 있다. 이의 표적의 활성화를 억제하는 어레스틴에 대한 가장 간단한 기전은 GPCR의 세포내 영역에 결합함으로써 헤테로트라이머성 G 단백질에 대한 결합부위를 차단하고, 세포외 시그날이 경로를 활성화시키는 것을 방지 (탈감작)하는 것이다. 어레스틴에 의해서 사용된 또 다른 조절 기전은 엔도좀과의 융합을 위해 코팅된 비히클 내에서 수용체의 내재화를 개시하는 막 내재화 기전 (예를 들어, 클라트린-매개된 엔도사이토시스)의 요소에 대한 수용체의 연결이다. 일단 엔도좀에서, 수용체는 분해 (예를 들어, 리소좀에 의해)에 대해서 표적화될 수 있거나, 이것이 다시 한번 활성화될 수 있는 세포질막으로 재순환될 수 있다.

따라서, GPCR에 대한 리간드의 결합은 어레스틴이 GPCR에 결합하도록 함으로써 이의 활성을 조절하기 때문에, GPCR에 대한 리간드의 결합은 GPCR과 어레스틴 단백질 사이의 상호작용을 "조절한다"고 말할 수 있다. 여기에서, 용어 "조절한다" 또는 이의 어떤 형태가 상호작용 또는 결합에 관하여 사용되는 경우에, 이것은 단순히, 예를 들어, 시험 화합물 또는 리간드의 부재 하에서 두 개의 단백질이 어떻게 상호작용하는지에 비해서, 이들이 존재하는 경우에 이들 본 발명의 두 개의 단백질이 상호작용하는 방법에 있어서의 약간의 변화를 나타낸다. 따라서, 조절한다는 것은 두 개의 분자의 단순한 결합을 포함한다. 예를 들어, 시험 화합물의 존재는 두 개의 단백질의 상호작용을 강화 또는 증진시킬 수 있거나, 이것을 약화시킬 수 있거나, 이것을 차단할 수 있거나, 이것을 억제할 수 있거나, 이것의 방향을 바꿀 수 있거나, 이것을 완화시킬 수 있거나, 이것을 검출가능한 일부의 방법, 방식 또는 형태에서 변형시킬 수 있거나, 시험 화합물은 상호작용 등의 가능성을 촉진시킬 수 있다.

일부의 환경에서, 7TMR 시그날링은 G 단백질과는 무관하게 일어날 수 있다. 따라서, 리간드의 7TMR 결합 시에 G 단백질 대신에 β 어레스틴을 동원하여 침전시키거나 세포 내의 시그날링 캐스케이드를 개시시킨다. 예를 들어, 문헌 [Violin & Lefkowitz, Trends Pharm Sciences 28(8)416-422, 2007 및 DeFea, Br J Pharm 1-12, doi:10.1038/sj.bjp.0707508, 2007]을 참고로 하는데, 여기에는 활성화된 7TMR에서 시작하고, G 단백질 및 β 어레스틴 둘 다를 수반하거나, G 단백질 또는 β 어레스틴을 수반할 수 있는 두 개의 독립적 및 상호의존적인 시그날링 경로가 요약되어 있다.

따라서, 예를 들어, 7TMR의 공지된 길항제는 β 어레스틴 시그날링을 활성화시킨다. β₂ 아드레날린성 수용체 (ADRB2) 및 G 단백질 시그날링의 공지된 길항제인 프로프라놀롤은 본 발명을 실시하여 관찰되는 바와 같이, β 어레스틴-개시된 경로를 활성화시키는 β 어레스틴 시그날링의 부분적 아고니스트인 것으로 밝혀졌다.

세포외 자극에 대한 반응하는 세포 시그날링 현상은 일반적으로, 단백질-단백질 상호작용에 의해서 매개된다. 따라서, 단백질-단백질 상호작용은 세포 생리학자에게 매우 흥미로운 것이다. 이들 상호작용을 모니터하는 하나의 도구는 담배 식각 바이러스 (tobacco etch virus; TEV) 프로테아제와 같은 분열 (split) 또는 변환된 (permuted) 리포터 활성화 단백질을 사용하는 것을 포함한다. 프로테아제의 분열 부분은 상호작용 단백질과 융합 구조물로 공동-발현되는 경우에 활성을 회복한다 [Wehr, et al., "Monitoring Regulated Protein-protein Interactions Using Split TEV", Nature Methods , 3:985-993 (2006)]. 이 특성은 전사-커플링된 리포터 시스템과 함께 사용되었다.

이러한 이해는 GPCR의 활성화 및 억제를 시험하는 대체 방법을 유도하였다. 이들 방법 중의 하나는 전사 기전을 가지고 있는 온전한 세포 내에서 어레스틴과의 상호작용을 모니터하는 것을 수반한다. 이러한 접근방법의 이점은 G 단백질 경로를 아는 것이 필요하지 않다는 점이다 [참조: 예를 들어, 미국 특허 제7,049,076호: "Method for Assaying Protein-Protein Interaction" to Lee at al]. 리 (Lee) 등은 전사-커플링된 리포터 시스템을 필요로 하는 리포터 시스템을 가르치고 있다. 리 등에 따르면, 펩타이드성 전사 인자는 두 개의 단백질이 상호작용하는 경우에 제1 단백질로부터 분할된다. 제2 단백질은 리포터 유전자를 활성화시키는 전사 인자이다. 그 후, 인자는 핵에 수송하여 검출가능한 리포터의 전사를 실행시킴으로써 리포터 기능을 달성한다. 이 방법은 전사에 대해 의존적이기 때문에, 이 방법은 혈소판, 인공적 패키지 또는 유니트, 예를 들어, 리포좀, 코크리트 (cochleates), 바이러스-유사 입자 및 바이러스 입자에서는 가동할 수 없다.

문헌 [Oakley, et al., Assay Drug Dev . Technol ., 1:21 30 (2002), 및 미국 특허 제5,891,646 및 6,110,693호, "Methods Of Assaying Receptor Activity and Constructs Useful in Such Methods" to Barak et al.]에는 세포 표면 상의 활성화된 수용체에 대한 세포질 내의 형광적으로-표지된 어레스틴 분자의 재분포가 측정되는 시험방법이 기술되어 있다. 이들 방법은 어레스틴 재국재화 (relocalization) 및 수용체 활성화에 대한 세포의 고해상도 영상화를 근거로 한다. 이것이 바람직한 조절물질-유도된 상호작용과 경쟁할 수 있는, 그 안에서 사용된 상보적 효소 단편의 친화성 및 상호작용에 의해서 매복될 수 있는 복잡하고, 혼란스러운 과정이라는 것은 숙련된 전문가에 의해서 인식된다. 따라서, 이 방법은 리간드 결합과는 무관한 효소의 자가-재회합 (auto-reassociation)에 기인하는 거짓 양성의 문제가 있다. 거짓 양성의 발생율이 더 작고, 고처리량 스크리닝에 더 쉽게 적용할 수 있는 더 간단하고, 더 확고한 시험방법이 바람직할 수 있다.

이들 문제를 취급하는 다양한 다른 미국 특허 및 특허출원이 허여 및 출원되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 제6,528,271호 ["Inhibition Of β-Arrestin Mediated Effects Prolongs and Potentiates Opioid Receptor-Mediated Analgesia" to Bohn et al.]는 통증-조절용 의약에 대해서 스크리닝하는 시험방법을 특징으로 하며, 여기에서는 β 어레스틴 결합의 억제가 측정된다. 제2004/0002119, 2003/0157553 및 2003/0143626호와 같은 공개된 미국 특허출원; 및 미국 특허 제6,884,870호는 GPCR을 포함하는 시험방법의 다양한 형태를 기술하고 있다. 미국 특허 제7,128,915호는 유사한 GPCR 기술을 특징으로 한다. 일반적으로 GPCR 활성 또는 스크리닝 시험방법을 특징으로 하는 상기 언급된 미국 특허 제7,049,076호는 GPCR 연구의 중요성을 입증하였다.

따라서, 본 발명의 한가지 특징, 즉 특정의 단백질/단백질 상호작용, 예를 들어, GPCR-매개된 세포성 반응과 같은 수용체-매개된 생리학의 조절을 모니터링하고/하거나 측정하는 더 간단한 시험방법 (여기에서, 단백질은 일반적으로 수용체를 포함하는 막-결합된 단백질, 및 중요한 예로서 GPCR을 포함하나, 이들로 제한되지는 않는다)을 제공하는 것이 본 기술분야에서 바람직한 필요성에 대처하는데 충분하다.

본 발명은, 시험 화합물이 관심이 있는 특정의 단백질-단백질 상호작용을 조절하는지 여부를 측정하는 방법을 제공한다. 단백질-단백질 상호작용은 수용체에 대한 리간드 결합과 같이 그에 의해서 세포가 이의 주변, 세포외 현상과 상호작용할 수 있는 생물학의 통상적인 기전이며, 리간드의 내재화가 있거나 없이 내부 반응을 생성할 수 있다. 내재화는 막 상의 또는 그 외부의 부분을 갖는 두 개 또는 그 이상의 단백질을 포함할 수 있다. 따라서, 다이머, 헤테로다이머 또는 멀티머 형성이 내부 반응을 생성시킬 수 있다. 세포내 단백질-단백질 상호작용은 또한, 시그날링 캐스케이드에 포함될 수도 있다. 본 발명의 일반적인 계획은 어떤 유형의 단백질-단백질 상호작용에도 적용할 수 있다. 상호작용은 예를 들어, 두 개의 막-결합된 단백질 사이, 막-결합된 단백질과 세포질성 단백질 사이, 세포질성 단백질 사이 등에서 있을 수 있다. 한가지 구체예는 리포터가 활성화되어 시그날을 생성하는 핵과 같은 또 다른 세포기관에 전위하는 세포질성 단백질을 특징으로 한다. 바람직하게는, 세포-기본 시험방법이 사용되지만, 예를 들어, 용해물, 막 분획, 핵 분획 등을 사용하는 세포-부재 시스템이 사용될 수 있다. 리포좀, 바이러스-유사 입자 등과 같은 하나 또는 그 이상의 시약을 함유하는 인공적 패키지 또는 유니트가 포함된다. 본 발명은 전사가 필요하지 않다는 점에서 상기 거론된 리 (Lee) 등을 개량한 것이다. 따라서, 결과는 더 빠르게 수득될 수 있고, 세포-기본 또는 세포-부재 시스템으로부터 수득될 수 있다. 몇 가지의 특히 바람직한 구체예의 일반적인 설명은 이하에 나타낸다. 이들 구체예는 단순히 설명적인 것이며, 결코 본 발명에 기술되고 특허청구된 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.

본 발명에 의해서 제공된 한가지 특징은 적어도 하나의 시험 화합물을 관심이 있는 단백질을 발현하는 세포 표면과 접촉시키는 것을 포함한다. 시험 화합물은 관심이 있는 단백질, 예를 들어, 수용체 단백질의 활성을 조절하는 이의 능력에 대해서 평가될 수 있다. 세포 내에서 관심이 있는 단백질의 발현은 (1) (a) 관심이 있는 제1 단백질을 암호화한 폴리뉴클레오타이드 및 (b) 프로테아제에 민감한 분열부위 또는 프로테아제의 활성 또는 활성화 가능한 부분과 함께 배열된 리포터 활성화 단백질을 암호화한 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 핵산 분자 또는 분자들, 및 (2) (a) 조절물질, 예를 들어, 양성 시험 화합물이 존재하는 경우에, 관심이 있는 제1 단백질과 이의 상호작용이 변화하는 제2 단백질을 암호화한 폴리뉴클레오타이드, 및 (b) 핵산 (1)에 의해서 암호화된 분열부위에 대해서 특이적인 프로테아제 또는 프로테아제의 활성 또는 활성화 가능한 부분을 암호화한 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 핵산 분자 또는 분자들에 의한 선택된 세포, 예를 들어, 곤충 또는 포유동물 세포주의 형질전환 또는 형질감염으로부터 유래할 수 있다. 관심이 있는 단백질-단백질 상호작용 (관심이 있는 두 개의 단백질 사이의)을 조절하는 분자, 예를 들어, 양성 시험 화합물은 예를 들어, 필요한 경우에, 관심이 있는 제1 및 2 단백질을 발현하는 세포 내에서 리포터 활성화 단백질의 기질 및 본 발명에 기술된 바와 같은 리포터 시스템을 첨가함으로써 평가 또는 시험할 수 있다.

따라서, 본 발명으로부터 유래하는 방법은 관심이 있는 단백질-단백질 상호작용에 대한 리드아웃 (readout)으로서 변환가능한 (permutable) 효소의 사용일 수 있다. 리포터 또는 리포터 활성화 단백질로서 사용된 효소와 같은 변환가능한 활성화 단백질은 분열에 의해서, 예를 들어, 관심이 있는 제2 단백질과 연관된 효소적 활성에 의해서 활성화될 수 있는 불활성 상태일 수 있다. 또 다른 선택은 관심이 있는 제1 및 2 단백질이 상호작용하는 경우에 활성화되는 불활성 리포터 활성화 단백질을 포함한다. 따라서, 관심이 있는 제1 및 2 단백질의 상호작용을 조절하는 화합물이 스크리닝될 수 있다. 이 시스템의 한가지 성과는 선택된 단백질-단백질 상호작용을 조절하는 분자의 고처리량 확인을 허용하는 것이다.

리드아웃 "펩타이드 A"를 생산할 수 있는 효소 (단독으로 또는 하나 또는 그 이상의 연관된 분자와 함께)는 이의 활성이 변화될 수 있는 형태로 존재한다. 효소는 이 변화에 의해서 활성화되거나 불활성화될 수 있다. 예를 들어, 분열부위는 예를 들어, 관심이 있는 제2 단백질과 커플링된 제2 효소에 의한 분열 시에 이것을 불활성화시키는 효소 내에 조립될 수 있다.

대신으로, 분열이 활성화를 야기할 수 있다. 선택된 효소(들)는 하나 또는 그 이상의 핵산을 사용하여 바람직한 숙주 세포 내로 엔지니어링될 수 있다. 예를 들어, 벡터는 분열부위에서 불활성 효소를 분열시킴으로써 활성화될 수 있는 불활성 효소로서 선택된 분자를 암호화한 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 분열부위는 천연적으로 존재할 수 있지만, 바람직하게는 분열부위는 이것이 변환된 효소로서 발현되도록 폴리뉴클레오타이드 내로 엔지니어링된다. 예를 들어, 그 세포의 단백질에 대해서 천연적이 아닌 분열부위 및/또는 숙주 세포에 대해서 천연적이 아닌 단백질이 숙주 세포 내로 형질감염될 수 있다. 대체 구체예에는 차단 펩타이드를 제거함으로써, 또는 이들이 재배열하여 효소적 활성을 활성화하도록 두 개의 폴리펩타이드가 배열이 변화하게 함으로써 활성화된 효소가 포함된다.

따라서, 한가지 구체예는 활성 폴리펩타이드, 예를 들어, 효소를 특징으로 한다. "효소"는 분열에 의해서 불활성화될 수 있다. 특이성을 위해서는, 숙주 세포에 대해서 천연적이 아닌 프로테아제에 의해서 인식된 효소 내로 분열부위를 엔지니어링하는 것이 바람직할 수 있다. 분열부위는 "효소"의 두 개의 부분 또는 모티브를 결합시키는, 즉 접촉하도록 유지시키는 링커의 형태로 도입될 수 있으며, 링커는 "효소"에 대해서 천연적이 아닌 분열부위일 수 있으며, 예를 들어, 분열부위를 갖는 효소는 또 다른 세포 유형 또는 또 다른 종으로부터 유래하며, 숙주 세포 내에서 발견되지 않을 수 있거나, 분열부위는 하나 또는 그 이상의 아미노산의 보존적 치환에 의해서 생성될 수 있다. 보존적 치환은 본 기술분야에서 공지되어 있다. 예를 들어, 활성을 유지하도록 전하, 크기, 방향족성 또는 그 밖의 다른 형질이 보존될 수 있다. 활성은 비-변환된 "효소"와 동일할 필요는 없지만, 분열부위에서의 분열에 의해 변화되어야 한다. 분열부위는 효소의 두 개의 부분 사이에 개입될 수 있다. 이러한 분열부위는 효소를 붕괴시킴으로써 불활성화를 야기할 수 있거나, 결합 또는 촉매적 부위를 차단하는 펩타이드 부분을 제거하거나, 변환된 효소의 두 개의 부분이 활성을 회복시키는 방식으로 상호작용하도록 함으로써 촉매적 활성이 나타나도록 할 수 있다.

따라서, 분열부위에서의 분열은 리드아웃을 생성하는 단백질을 불활성화시키거나 활성화시킬 수 있다. 분열은 시험 화합물의 존재 하에서, 예를 들어, 관심이 있는 제2 단백질을 암호화한 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 핵산 분자의 발현 생성물이 관심이 있는 제1 단백질과 상호작용함으로써 변환된 리포터 활성화 단백질에서 프로테아제 민감성 분열 서열을 인식하고, 분열시키는 프로테아제의 활성을 개시시키는 경우에 달성될 수 있다.

관심이 있는 제2 단백질은 제3 분자의 존재 하에서, 또는 대신으로 이의 부재 하에서 관심이 있는 제1 단백질과 상호작용한다. 따라서, 이 제3 분자는 폴리펩타이드 A 및 B 사이의 단백질-단백질 상호작용을 조절한다고 말한다. 따라서, 제3 분자, 예를 들어, 시험 화합물에 의해서 조절되는 단백질-단백질 또는 펩타이드-펩타이드 상호작용 (검토를 목적으로 단백질 및 펩타이드는 상호 교환하여 사용된다)은 본 발명의 시스템에 의해서 효율적으로 보고된다. 단백질-단백질 상호작용 (1 및 2, 제1 및 제2, A 및 B 등 (이들 문구 및 용어들은 본 발명에서 상호 교환하여 사용된다)으로 지정된 폴리펩타이드 사이에서)을 조절하는 분자는 활성 리포터 활성화 분자에 의해서, 또는 활성 리포터 활성화 단백질의 기질을 관심이 있는 단백질을 포함하는 시스템을 발현하는 세포에 첨가함으로써 측정될 수 있다.

단백질 A 및 B의 선택은 회합, 상호작용 등을 하는 것으로 공지되거나 추측되는 분자의 쌍이 사용될 수 있는 것과 같은 디자인 선택이다. 본 발명에서 검토된 바와 같이, 적합한 쌍은 G 단백질 또는 β 어레스틴과 7TMR이다. 또 다른 예는 프리즐드 수용체 및 디쉐벨드 (Dishevelled) 결합 단백질 등이다. 또 다른 예는 세포-세포 상호작용 중에 및 그 후에 작동하는 것일 수 있다. 따라서, 단백질 A 및 B는 세포 1 내에 있다. 세포 1이 세포 2에 의해 또는 세포 2와 접촉하는 경우에, 이 상호작용은 회합, 상호작용 등을 하는 단백질 A 및 B에 의해서 밝혀지고, 또한 식별가능하며 검출가능한 시그날을 제공하는 본 발명의 시약에 의해서 더 밝혀진 세포 1에 의한, 및 세포 1에서의 작용을 유발한다.

또 다른 예는 세포 1 상에서 발현되는 단백질 A 및 세포 2 상에서 발현된 단백질 B에 대한 것이다. 이것은 예를 들어, 세포외 영역을 갖도록 G　단백질 또는 β 어레스틴을 엔지니어링함으로써, 또는 리간드 또는 약물 후보물질에 의한 세포 1의 활성화에 이어서 세포 1 상에서, 예를 들어, 세포 1에 의해서 또는 세포 1과 작용하는 세포외 영역을 갖도록 리포터 활성화 단백질을 엔지니어링함으로써 성취될 수 있다. 대신으로, 두 개의 세포 상의 내인성 분자가 자발적으로 회합할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 프로테아제 및 리포터 활성화 분자는 세포 또는 유니트의 표면 상에서 세포외 영역으로 발현되도록 배열된다.

또 다른 구체예에서, 회합, 조립 등에 의해 복합 구조를 형성하는 단백질은 단백질 A 및 B를 포함한다. 본 발명의 시험방법을 사용하여 회합 또는 조립을 촉진시키거나 방지하는 분자를 확인할 수 있다. 그 예는 바이러스 캡시드 (capsid)의 형성, 바이러스-유사 입자 조립체 또는 리보좀 형성일 수 있다.

G 단백질-커플링된 수용체 (7TMR로 또한 공지된 GPCR, 이들 용어는 본 발명에서 상호 교환하여 사용된다)의 공통 기전에서, GPCR의 아고니스트 활성화는 개시, 종결, 상승, 대항 등과 같은 시그날링 경로에 포함되는 세포내 분자, 예를 들어, G　단백질 또는 β 어레스틴의 동원을 야기한다. 따라서, G 단백질-커플링된 수용체 키나제는 활성화된 수용체 상에서 작용하여 수용체의 포스포릴화를 제공한다. 포스포릴화된 수용체는 수용체에 대한 β 어레스틴 결합을 용이하게 한다. 이 기전은 일부의 GPCR에 대해서 잘 보존된다. 다른 상황에서는, 활성화된 수용체가 대신에 β 어레스틴과 상호작용한다.

GPCR 활성화와 같은 단백질-단백질 상호작용을 조절하는 분자를 평가하기 위해서, 시스템은 단백질-단백질 상호작용을 시험하도록 디자인되고, GPCR-변환된 리포터 분자 시스템에서 시험하였다. 예를 들어, 리포터 분자 시스템은 루시퍼라제/루시페린 시험 시스템일 수 있다. 일반적으로, 리포터 분자는 숙주 세포 또는 시그날링 기전에 대해서 이종인 외인성 분자이다. 이것은 숙주 세포에 의한, 및 숙주 세포 내에서의 리포터 분자의 자발적 활성화를 최소화하며, 이에 의해 시그날 생성, 및 따라서 거짓 양성을 최소화한다. 리포터 활성화 분자는 영역 구조를 갖는 것이거나, 조작할 때에 리포터 활성의 잠재력을 갖는 불활성 리포터 활성화 단백질을 수득하도록 변환될 수 있는 것일 수 있다. 따라서, 본 출원은 잠복성 리포터 활성화 분자의 사용을 포함한다. 변환된 리포터 활성화 분자는 자발적인 리포터 활성화 분자 활성을 최소화하며, 따라서 거짓 양성을 최소화한다. 예를 들어, 효소 단편 상보성 시험에서 효소 단편의 친화성은 표적 분자, 리간드 또는 스크리닝되는 분자와의 반응 속도에 우선할 수 있어서 기능적 분자 내로의 효소 단편의 자발적 재회합이 일어남으로써 더 큰 배경 및/또는 거짓 양성의 원인이 된다. 관심이 있는 변환된 리포터 활성화 단백질은 작용하는 경우에 변환된 리포터 활성화 분자가 기능적 분자를 형성하도록 하는 부위를 갖도록 엔지니어링될 수 있다. 그 부위는 프로테아제 부위일 수 있다. 프로테아제 부위는 바람직하게는, 관심이 있는 방법의 성분 또는 성분들이 갖추어진 숙주 세포 또는 유니트 내에 드물게 존재하거나 존재하지 않는 독특한 부위의 것이다. 이것은 온전한 리포터 활성화 분자의 자발적 재회합을 피하고, 따라서 거짓 양성을 최소화하는 또 다른 수단을 제공한다. 특정의 시그날은 점유된 리간드가 결국에는 불활성 리포터 활성화 단백질의 근접부로 프로테아제를 유도하여 이것을 분열시키는 경우에만 수득되며, 단지 그 시점에서 활성 시그날 활성화 또는 생성 실체가 실현될 수 있다. 본 발명을 실시하는데 사용될 수 있는, 본 기술분야에서 공지된 다수의 프로테아제가 있다. 예를 들어, 바이러스 공급원으로부터의 프로테아제는 일반적으로 온전한 숙주 세포에 대해서 이종인 것으로 유용할 수 있다. 한가지 응용은 반딧불이 루시퍼라제에 대한 암호화 서열이 GPCR 서열의 C 종결 말단 상에 또는 그에 의해서 태깅되고 (tagged), β 어레스틴 2 (Ar2 또는 Arr2)가 담배 식각 바이러스 (TEV) 프로테아제 유전자에 연결된, 변환된 리포터 활성화 단백질 유전자를 포함한다. 또 다른 구체예에서는, 변환된 루시퍼라제를 β 어레스틴 (Ar 또는 Arr)에 태깅하고, TEV 유전자를 β 어레스틴 상에 작용하거나 그와 연관된 시그날링 경로의 하류 단백질에, 또는 G 단백질과 무관하게 작용하는 것으로 추측되는 7TMR과 같은 수용체에 연결시킨다. 상기 두 가지 모두를 발현하도록 엔지니어링된 플라스미드가 세포 내에서 발현될 때, GPCR-어레스틴-2 상호작용을 조절하는 화합물은 변환된 루시퍼라제 내의 프로테아제 인식부위로 Arr2-프로테아제 융합 단백질을 동원하며, TEV 프로테아제는 변환된 루시퍼라제를 분열시킨다. 시험 화합물의 효과는 리포터 활성화 단백질의 재구성에 의해서 야기되는 효소 활성에 있어서의 변화를 통해서 측정될 수 있으며, 이 경우에 루시퍼라제는 활성이 되고, 루시페린과 같은 적합한 기질 상에 작용함으로써 검출가능한 시그날을 생성할 수 있다.

본 발명은 루시퍼라제로 제한되지 않거나 효소로도 제한되지 않는다. 분열에 의한 활성화는 공지된 현상으로, 예를 들면, 프로-효소이다. 비-효소적 리포터 시스템도 또한 적용될 수 있다. 예를 들어, 녹색 형광성 단백질 (GFP)이 사용될 수 있다. 변환된 GFP, 예를 들어, 재배열된 부분을 갖는 GFP가 리포터 활성화 단백질 및 리포터로서의 역할을 할 수 있다. 변환된 폴리펩타이드 내에 포함된 TEV 또는 이의 인식부위를 갖는 다른 프로테아제와 같은 프로테아제에 의한 작용은 변환된 리포터 활성화 단백질/리포터를 분열시킴으로써 시그날을 생성하는 재배열이 이루어지도록 한다. GFP는 그 자체가 검출가능한 리포터 시그날링 분자라는 이점을 갖는다. 대신으로, 분열부위가 시그날을 상당히 동요시키지 않는 리포터 분자 내로 도입될 수 있다. 그러면, 단백질-단백질 상호작용으로 인한 분열은 감소된 리포터 시그날을 야기한다. 다수의 분열부위가 리포터 구조물 내에 도입될 수 있다.

삼차 단백질 구조를 사용하여 숙련된 전문가에게 어디에 분열부위가 가장 잘 배치되는지에 대한 안내를 제공할 수 있다. 예를 들어, 폴리펩타이드의 두 개의 부분이 강한 접촉을 갖는 경우에, 서열을 동요시킴으로써 이들 부분을 분리시키는 것은 활성을 감소 또는 제거하는 것으로 예상될 수 있다. 분열 시에, 이들 부분은 상호작용함으로써 활성을 회복하는 것으로 예상될 수 있다.

관심이 있는 제1 단백질은 막관통 수용체와 같은 막-결합된 단백질, 예를 들어, GPCR일 수 있다. 막관통 수용체의 예로는 β-아드레날린성 수용체 (ADRB2), 아르기닌 바소프레신 수용체 2 (AVPR2 또는 V2). 세로토닌 수용체 1a (HTR1 A), m2 무스카린성 아세틸콜린 수용체 (CHRM2), 케모킨 (C-C 모티브) 수용체 5 (CCR5), 도파민 D2 수용체 (DRD2), 카파 아편양 수용체 (OPRK), 또는 α1a-아드레날린성 수용체 (ADRA1A) 등이 포함된다. 막-결합된 수용체는 본 기술분야에서 잘 알려져 있다. 모든 경우에, 본 발명은 본 발명의 예로 기술된 특정의 구체예로 제한되지는 않는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 티로신 키나제인 인슐린 성장인자-1 수용체 (IGF-1R), 및 에스트로겐 수용체 1 (ESR1) 및 에스트로겐 수용체 2 (ESR2) 등의 통상적으로 막 결합되지 않는 단백질과 같은 분자가 본 발명에서 사용될 수 있다. 단백질 B와 회합된 프로테아제 또는 프로테아제의 일부분은 담배 식각 바이러스 핵 봉입 A (TEV) 프로테아제일 수 있다. TEV는 7 개의 잔기 인식부위를 가지며, 따라서 더 작고, 통계학적으로 더 통상적인 인식부위를 갖는 프로테아제보다 더 특이적이다. 그 밖의 다른 프로테아제도 본 발명에서 사용하기에 적절하다. 예를 들어, 각각 5 개의 잔기 인식서열을 갖는 엔테로키나제 및 인자 Xa 프로테아제, 각각 6 개의 잔기 인식서열을 가는 트롬빈 및 퓨어액트 (PureAct^TM) 또는 클린 컷 (Clean Cut^TM), 및 7 개의 잔기 인식서열을 갖는 프레시존 (PreScission^TM)도 또한 본 발명에서 사용하기 위한 프로테아제이다. 본 발명은 어떤 특정의 프로테아제의 사용으로 제한되지 않는다. 그러나, 프로테아제는 수용체로부터 생성되거나 변화된 시그날을 제공하는 부위에서 분열하여야 한다.

리포터를 활성화하는 단백질은 기질 상에 작용하여 검출가능한 시그날을 생성할 수 있는 모든 효소일 수 있다. 예를 들어, 효소는 형광 또는 화학발광을 직접 또는 간접적으로 증가 또는 감소시킬 수 있거나, 색상 변화를 야기할 수 있다. 리포터 기질은 단백질과 같은 생물학적 물질일 수 있거나, 이의 반응이 리포터 효소에 의해서 촉매되는 화학물질일 수 있다. 관심이 있는 제2 단백질은 어레스틴과 같은 억제성 단백질일 수 있다. 어레스틴은 통상적으로 GPCR과 상호작용하여 리간드/수용체 상호작용에 대한 반응으로 활성을 조절한다. 세포는 진핵성 또는 원핵성일 수 있다. 리포터는 β 갈락토시다제 또는 루시퍼라제와 같은 외인성 성분일 수 있다. 간편하기 위해서, "리포터 효소"는 리포터 활성화 분자, 리포터 활성화제, 리포터 조절성 분자, 리포터 조절성 단백질 또는 리포터 활성화 단백질의 동의어로서, 및 리포터 산출에서의 변화를 초래하는 분자에 대한 속기로서 사용된다. 예를 들어, 리포터 효소는 효소적으로 리포터 시그날의 변화를 야기할 수 있거나, 예를 들어, 효소적으로 또는 비-효소적으로 형광 시그날과 같은 시그날의 변화를 야기할 수 있을 것이다. 숙련된 전문가는 리포터 시그날을 조절하거나 활성화하는 다양한 리포터 시스템 및 단백질을 알고 있다.

제1 단백질을 암호화한 뉴클레오타이드 서열은 제2 단백질과의 상호작용이 증가하도록 변형될 수 있다. 이러한 변형에는 제1 단백질의 C 말단 부분의 뉴클레오타이드 서열의 전부 또는 일부를 원래의 서열보다 제2 단백질에 대해서 더 큰 친화성을 갖는 아미노산 서열을 암호화한 뉴클레오타이드 서열로 치환시키는 것이 포함되나, 이것으로 제한되지는 않는다. 예를 들어, C 말단 부분은 AVPR2, AGTRLI, F2RL1, CXCR2/IL-8b 또는 CCR4의 C 말단 부분을 암호화한 뉴클레오타이드 서열에 의해서 치환시킬 수 있다. 이러한 변형은 본 기술분야에서 공지되어 있으며, 본 발명의 임의의 특징이다.

본 발명의 방법은 다수의 시험 화합물을 세포 또는 유니트의 다수의 샘플과 접촉시키는 것을 포함할 수 있다. 각각의 샘플을 하나 또는 그 이상의 시험 화합물에 의해서 접촉시킬 수 있다. 또 다른 구체예에서, 세포 또는 유니트는 둘 다 β 어레스틴과 상호작용하는 상이한 리포터 활성화 분자를 보유하는 세포외 영역을 갖는 두 개의 상이한 분자를 보유한다. 스크리닝은 리포터의 활성을 측정함으로써, 예를 들어, 샘플 내에서 효소적 활성을 모니터링하여 어떤 화합물 또는 화합물의 혼합물이 특정의 단백질/단백질 상호작용을 조절하는지 여부를 측정함으로써 이루어질 수 있다. 이 방법은 각각의 시험 샘플을 단일 시험 화합물과 접촉시키는 것을 포함할 수 있거나, 각각의 시험 샘플을 시험 화합물의 혼합물과 접촉시키는 것을 포함할 수 있거나, 이들 특징을 조합할 수 있다. 단백질 A에 대한 화합물의 결합을 억제하는 화합물을 본 발명을 사용하여 시험하거나 스크리닝할 수 있다. 예를 들어, 단백질 A의 공지된 리간드가 시험에 포함될 수 있으며, 단백질에 대한 리간드의 결합을 조절하는 화합물이 경쟁-유형 시험에서와 같이 확인 및/또는 특정화될 수 있다. 대조 샘플이 각각의 시험에 존재할 수 있거나, 평행 시험으로 시행될 수 있다.

일부의 구체예에서, 본 발명은 시험 화합물이 관심이 있는 다수의 단백질 상호작용 중의 하나 또는 그 이상을 조절하는지 여부를 측정하는 방법을 제공한다. 이들 구체예는 일반적으로, 시험 화합물을 (a) (i) 제1 단백질을 암호화한 폴리뉴클레오타이드, 및 프로테아제에 대한 분열부위를 암호화한 폴리뉴클레오타이드 서열, 및 (ii) 세포 내에서 리포터를 활성화하는 단백질을 암호화한 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 제1 핵산 분자; 및 (b) (i) 관심이 있는 시험 화합물의 존재 하에서 제1 단백질과 이의 상호작용이 측정될 제2 단백질을 암호화한 폴리뉴클레오타이드, 및 (ii) 분열부위에서 폴리펩타이드를 분열시키는데 특이적인 프로테아제 또는 폴리펩타이드를 암호화한 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 제2 핵산 분자에 의해서 형질전환 또는 형질감염된 세포의 다수의 샘플과 접촉시키는 것을 특징으로 한다. 제1 단백질은 다수의 샘플 내의 다른 제1 단백질과 상이할 수 있다. 따라서, 이 방법은 하나 또는 그 이상의 관심이 있는 단백질 상호작용의 조절의 측정으로서 다수의 샘플 중의 하나 또는 그 이상에서 리포터의 활성을 측정하는 것을 포함한다.

제2 단백질은 각각의 샘플에서 상이할 수 있거나, 각각의 샘플에서 동일할 수 있다. 모든 샘플은 공통 용기 내에서 조합될 수 있으며, 각각의 샘플은 제1 및 2 단백질의 상이한 쌍을 포함할 수 있다. 대신으로, 각각의 샘플은 상이한 용기 내에서 시험할 수 있다. 소정의 샘플 내의 리포터는 다른 샘플 내의 리포터와 상이할 수 있다. 시험 화합물의 혼합물은 뇌척수액, 소변, 혈액, 혈청, 고름, 복수, 활액, 조직 추출물, 식물 또는 약초 (herbal) 추출물 또는 삼출액과 같은 생물학적 샘플을 포함하거나, 그 안에 존재할 수 있다.

다른 구체예에서, 본 발명은 (a) (i) 제1 단백질을 암호화한 폴리뉴클레오타이드, (ii) 프로테아제, 프로테아제의 일부분 또는 프로테아제 활성을 갖는 폴리펩타이드에 대한 분열부위를 암호화한 폴리뉴클레오타이드, 및 (iii) 세포 내에서 리포터를 활성화하는 단백질을 암호화한 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 핵산 분자; 및 (b) (i) 시험 화합물의 존재 하에서 제1 단백질과 이의 상호작용이 측정될 제2 단백질을 암호화한 폴리뉴클레오타이드, 및 (ii) 상기 분열부위에 대해서 특이적인 프로테아제, 프로테아제의 일부분 또는 프로테아제 활성을 갖는 폴리펩타이드를 암호화한 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 핵산 분자에 의해서 형질전환 또는 형질감염된 재조합 세포를 제공한다.

핵산 분자 중의 하나 또는 둘 다는 숙주 시험 세포의 게놈 내에 안정적으로 혼입될 수 있다. 세포는 또한, 리포터에 의해서 형질전환되거나 형질감염될 수도 있다. 제1 단백질은 막관통 수용체와 같은 막-결합된 단백질, 예를 들어, GPCR일 수 있다. 예시적인 막관통 수용체에는 ADRB2, AVPR2, HTR1A, CHRM2, CCR5, DRD2, OPRK, 또는 ADRA1A이 포함된다.

프로테아제 또는 프로테아제의 일부분은 상기 언급한 바와 같을 수 있으며, 담배 식각 바이러스 핵 봉입 A 프로테아제로 제한되지는 않지만, 리포터 활성화 단백질을 활성화하는 어떤 단백질이라도 될 수 있으며, 기질 상에 작용하여 유용하거나 검출가능한 시그날을 생성시키는 어떤 효소라도 될 수 있다. 제2 단백질은 억제성 단백질일 수 있다. 세포는 진핵성 또는 원핵성일 수 있으며, 일반적으로 약제에 대한 스크리닝을 위해서는 원핵성 세포가 바람직할 것이다. 약제의 궁극적인 표적과 유사한 방식으로 글리코실화한 세포가 특히 바람직할 수 있다. 세포를 배양하거나 엔지니어링하여 바람직한 글리코실화 특징을 제공할 수 있다. 궁극적인 제안된 표적의 글리코실화 특성과 부합하지 않는 원핵성 세포의 사용이 스크리닝 및 특정화에 유용할 수 있다.

리포터는 외인성일 수 있으며, 예를 들어, β 갈락토시다제, GFP 또는 루시퍼라제이다. 제1 단백질을 암호화한 뉴클레오타이드 서열은 예를 들어, 상기 제1 단백질의 C 말단 부분의 뉴클레오타이드 서열의 전부 또는 일부를 원래의 서열보다 제2 단백질에 대해서 더 큰 친화성을 갖는 아미노산 서열을 암호화한 뉴클레오타이드 서열로 치환시킴으로써, 제2 단백질과의 상호작용이 증가하도록 변형될 수 있다. C 말단 부분은 예를 들어, AVPR2, AGTRLI, F2RL1, CXCR2/IL-8B, CCR4, 또는 GRPR의 C 말단 부분을 암호화한 뉴클레오타이드 서열에 의해서 치환될 수 있다.

본 발명은 구체예로서, (i) 단백질을 암호화한 폴리뉴클레오타이드, (ii) 프로테아제, 프로테아제의 일부분 또는 프로테아제 활성을 갖는 폴리펩타이드에 대한 분열부위를 암호화한 폴리뉴클레오타이드, 및 (iii) 세포 또는 다른 시험 시스템에서 리포터를 활성화하는 단백질을 암호화한 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 분리된 핵산 분자를 제공하는 것을 포함한다. 단백질은 막관통 수용체와 같은 막-결합된 단백질, 예를 들어, GPCR일 수 있다. 예시적인 막관통 수용체로는 ADRB2, AVPR2, HTR1A, CHRM2, CCR5, DRD2, OPRK, 또는 ADRA1A가 포함된다. 프로테아제 또는 프로테아제의 일부분은 담배 식각 바이러스 핵 봉입 A 프로테아제일 수 있다. 상기 언급한 바와 같이, 리포터를 활성화하는 단백질은 기질과 상호작용하여 시그날을 생성시키는 어떤 단백질이라도 될 수 있으며, 본 발명에서 거론된 TEV 예로 제한할 필요는 없다. 본 발명의 이러한 예 또는 또 다른 예는 본 발명을 특정한 구체예로 제한하는 것으로 간주되지 않는다.

일부의 구체예에서, 본 발명은 (i) 단백질을 암호화한 폴리뉴클레오타이드, (ii) 프로테아제, 프로테아제의 일부분 또는 프로테아제 활성을 갖는 폴리펩타이드에 대한 분열부위를 암호화한 폴리뉴클레오타이드, 및 (iii) 세포 내의 리포터를 활성화하는 단백질을 암호화한 폴리뉴클레오타이드를 포함하며, 또한 프로모터에 작동적으로 연결된 분리된 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터를 특징으로 한다.

일부의 구체예에서, 본 발명은 (i) 시험 화합물의 존재 하에서 또 다른 단백질과 이의 상호작용이 측정될 단백질을 암호화한 폴리뉴클레오타이드, 및 (ii) 분열부위에 대해서 특이적인 프로테아제, 프로테아제의 일부분 또는 프로테아제 활성을 갖는 폴리펩타이드를 암호화한 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 분리된 핵산 분자를 특징으로 한다. 단백질 또는 다른 단백질은 어레스틴과 같은 억제성 단백질일 수 있다.

일부의 구체예에서, 본 발명은 또한, (i) 시험 화합물의 존재 하에서 또 다른 단백질과 이의 상호작용이 측정될 단백질을 암호화한 폴리뉴클레오타이드, 및 (ii) 분열부위에 대해서 특이적인 프로테아제 또는 프로테아제의 일부분을 암호화한 폴리뉴클레오타이드를 포함하며, 또한, 프로모터에 작동적으로 연결된 분리된 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터를 특징으로 한다.

추가의 구체예는 (i) 단백질을 암호화한 폴리뉴클레오타이드, (ii) 프로테아제, 프로테아제의 일부분 또는 프로테아제 활성을 갖는 폴리펩타이드에 대한 분열부위를 암호화한 폴리뉴클레오타이드, 및 (iii) 세포 내의 리포터를 활성화하는 단백질을 암호화한 폴리뉴클레오타이드를 포함하며, 또한, 프로모터에 작동적으로 연결된 분리된 핵산 분자; 또는 (i) 시험 화합물의 존재 하에서 또 다른 단백질과 이의 상호작용이 측정될 단백질을 암호화한 폴리뉴클레오타이드, 및 (ii) 분열부위에 대해서 특이적인 프로테아제 또는 프로테아제의 일부분을 암호화한 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 분리된 핵산 분자의 발현에 의해서 생산된 융합 단백질을 특징으로 한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명은 시험 화합물이 관심이 있는 특정의 단백질/단백질 상호작용을 조절하는지 여부를 측정하는데 유용한 시험 키트를 특징으로 한다. 시험 키트는 (a) (i) 프로테아제, 프로테아제의 일부분 또는 프로테아제 활성을 갖는 폴리펩타이드에 대한 분열부위를 암호화한 폴리뉴클레오타이드, (ii) 세포 내에서 리포터 유전자를 활성화하는 단백질을 암호화한 폴리뉴클레오타이드인 제1 단백질을 암호화한 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 핵산 분자, 및 (b) (i) 시험 화합물의 존재 하에서 상기 제1 단백질과 이의 상호 작용이 측정될 제2 단백질을 암호화한 폴리뉴클레오타이드, (ii) 분열부위에 대해서 특이적인 프로테아제 또는 프로테아제의 일부분을 암호화한 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 핵산 분자의 각각의 독립적인 부분 중의 하나 또는 그 이상, 및 임의로 (a) 및 (b)를 각각 서로 독립적으로 유지시키기 위한 수단을 포함한다. 키트는 사용에 대한 설명서를 포함할 수 있다. 대신으로, 키트는 관심이 있는 융합된 단백질 중의 하나 또는 둘 다를 발현하도록 엔지니어링된 세포를 함유할 수 있다.

제1 단백질은 막관통 수용체와 같은 막-결합된 단백질일 수 있다. 막관통 수용체의 특정한 유형은 GPCR이다. 특정한 막관통 단백질은 GPCR이다. 예시적인 막관통 수용체에는 ADRB2, AVPR2, HTR1A, CHRM2, CCR5, DRD2, OPRK, 또는 ADRA1A가 포함된다. 프로테아제, 프로테아제의 일부분, 또는 프로테아제 활성을 갖는 폴리펩타이드는 담배 식각 바이러스 핵 봉입 A 프로테아제일 수 있다. 상기 리포터를 활성화하는 단백질은 예를 들어, 분열에 의한 활성화에 대한 반응으로 검출가능한 리포터 활성화 분자 상에 작용하는 어떤 프로테아제라도 될 수 있다. 리포터는 분열 생성물에 의해 검출가능한 시그날을 산출하는 어떤 분자라도 될 수 있다. 제2 단백질은 어레스틴과 같은 억제성 단백질일 수 있다. 키트는 추가로, 리포터 활성화 유전자를 암호화한 분리된 핵산 분자의 별도의 부분을 더 포함할 수 있다. 리포터 활성화제는 예를 들어, β 갈락토시다제 또는 루시퍼라제일 수 있다. 상기 제1 단백질을 암호화한 뉴클레오타이드 서열은, 상기 제1 단백질의 C 말단 부분의 뉴클레오타이드 서열의 전부 또는 일부를 원래의 서열보다 제2 단백질에 대해 더 큰 친화성을 갖는 아미노산 서열을 암호화한 뉴클레오타이드 서열로 치환시키는 것과 같은 방법에 의해서 제2 단백질과의 상호작용이 증가하도록 변형될 수 있다. 상기 C 말단 부분의 뉴클레오타이드 서열은 예를 들어, AVPR2, AGTRLI, F2RL1, CXCR2/IL-8B, 및 CCR4의 C 말단 부분을 암호화한 뉴클레오타이드 서열에 의해서 치환될 수 있다.

본 발명에 기술된 어떤 방법 또는 조성물이라도 본 발명에 기술된 어떤 다른 방법 또는 조성물에 관해서도 수행될 수 있는 것으로 생각된다. 특허청구범위 및/또는 명세서에서 용어 "포함하는"과 함께 사용되는 경우에, 단어 "a" 또는 "an"의 사용은 "하나 (one)"를 의미할 수 있지만, 이것은 또한 "하나 또는 그 이상", "적어도 하나" 및 "하나 또는 하나 이상"의 의미와 일치한다. 상응하는 성분이 약간 다른 표현으로 기술되는 경우에, 이들은 다양한 구체예를 구별 짓는 것을 의미하지는 않을 것이며, 그러나 함께 종합해서 다양한 표현들이 광범하게 상응하는 요소를 기술한다.

본 발명의 이들 및 그 밖의 다른 구체예는 이하의 설명 및 첨부된 도면과 함께 고려되는 경우에 더 잘 인식되고 이해될 것이다. 그러나, 본 발명의 다양한 구체예 및 이의 다수의 특정한 상세한 사항을 시사하는 이하의 설명은 제한이 아니라 설명을 위해서 제공된 것으로 이해되어야 한다. 다수의 치환, 변형, 부가 및/또는 재배열이 본 발명의 취지를 벗어나지 않고 본 발명의 범위 내에서 만들어질 수 있으며, 본 발명은 이러한 치환, 변형, 부가 및/또는 재배열을 모두 포함한다.

첨부된 도면은 본 명세서의 일부분을 형성하며, 본 발명의 특정한 관점을 더 설명하기 위해서 포함된다. 본 발명은 본 명세서에 제시된 특정의 구체예의 상세한 설명과 함께 이들 도면 중의 하나 또는 그 이상을 참고로 하여 더 잘 이해될 수 있다.
도 1은 적용의 한가지 구체예의 개략도를 나타내며, 여기에서 조절물질 4는 프로테아제-회합된 단백질 1과 결합하여 단백질이 변환된 불활성 조절성 단백질과 같은 수용체 조절물질 3과 연관된 제2 단백질 2와 상호작용하도록 한다. 조절물질 4는 단백질-단백질 상호작용을 조절하는 화합물을 나타낸다. 이 예에서는, 예를 들어, Ar 또는 어레스틴 2가 불활성의 변환된 리포터 조절성 또는 활성화 단백질 3에 융합된다. 프로테아제 7은 단백질 1과 회합된다. 분열부위 8은 리포터 조절성 단백질 3의 두 개의 절편 사이에 표시된다. 프로테아제 분열이 단백질 1, 예를 들어, 7TMR에 부착된 조절물질 4와의 상호작용에 따라서 일어나면, 리포터 활성화 단백질 활성이 재구성되어, 궁극적으로는 백열전구 6으로 표시된 검출가능한 시그날을 제공한다.
도 2는 본 발명의 한가지 단백질-단백질 상호작용 시험을 개략적으로 표현한 것이다. 부착된 세포내 프로테아제 22를 갖는 막-결합된 단백질 21은 조절물질 4와 상호작용한다. 불활성화된 리포터 회합된 단백질 23은 불활성 리포터 3 또는 리포터 활성화제 3을 보유한다. 상호작용하면, 단백질 21과 회합된 프로테아제 22는 변환된 리포터 활성화 단백질 23의 분열부위를 분열시킴으로써, 조절물질 4가 단백질 21을 점유하는 경우에 리포터 활성화 단백질 3의 단백질 부분의 재배열 5가 일어나도록 한다. 이에 의해서 리포터 활성화제는 리포터 또는 리포터 활성화제 3의 재구성을 초래하여 리포트를 유발하거나 활성화시킨다.
도 3은 두 개의 막관통 단백질이 상호작용하는 경우의 구체예의 개략도를 나타낸다. 분자 4는 두 개의 막 단백질, 예를 들어, 적어도 하나의 수용체 단백질 사이의 상호작용을 야기한다 (조절한다). 이 도면에서, 프로테아제 22, 예를 들어, TEV (도 1에서의 7)는 단백질 1에 부착되고, 제2 막 단백질 33에 부착된 변환된 리포터 활성화제 융합 단백질 3에 근접하게 유도된다. 단백질 1, 33의 근접에 의해서 가능하게 된 분열부위 8에서의 단백질 분해는 리포터 활성화 단백질 3의 활성화 5를 제공한다.
도 3은 또한, 수용체 호모다이머 또는 헤테로다이머 형성을 조절하는 분자의 확인을 위한 기술의 개략적 적용을 나타내는 것으로 해석될 수도 있다. 이 도면에서 단백질 1 및 33은 막-결합된 단백질이다. 단백질 1 및 33은 각각이 프로테아제 22 또는 프로테아제 22에 의해서 활성화된 리포터 3을 포함하도록 엔지니어링된다. 상호작용을 조절하는 분자 4는 예를 들어, 단백질 1 및/또는 33을 결합시킨다. 1 및 33이 상호작용하는 경우에, 프로테아제 22는 리포터 활성화제 3에 작용함으로써 변화된 시그날을 제공한다. 헤테로다이머화는 전통적인 호모다이머화를 포함하도록 확장될 수 있다. 예를 들어, 1 및 33은 동일한 수용체의 두 개의 카피 (copies)이지만, 프로테아제 또는 리포터와의 회합이 상이한 것일 수 있다. 다른 경우에서 언급한 바와 같이, 용어 리포터 및 리포터 활성화제는 본 발명의 상이한 구체예를 기술하기 위해서 종종 상호교환하여 사용될 수 있다.
도 4는 세포내 단백질의 단백질-단백질 상호작용을 포함하는 예를 나타낸 것이다. 단백질 41은 예를 들어, 활성화제 22, 예를 들어, TEV에 융합된 핵 호르몬 수용체이다. 변환된 리포터 활성화 분자 43은 세포 핵 40내에 국재화된다. 수용체는 기본적인 폴리펩타이드 기능을 사용하여 핵 국재화 펩타이드 서열로서 핵 내에 국재화될 수 있다. 리간드, 예를 들어, 호르몬 (나타내지 않음) 결합 시에, NHR 융합물 41은 핵에 전좌하여, 여기에서 리포터 시스템과 상호작용한다.
도 5는 세포 내에서 TEV 프로테아제에 의해 변환된 루시퍼라제 융합 단백질로부터 재생된 루시퍼라제 활성이 프로테아제 분열부위를 변형시킴으로써 조절될 수 있음을 나타낸다. 그에 따라 시그널-대-잡음 비율이 조절될 수 있다. 두 개의 구조물이 도시되어 있으며, ADRB2는 β2 아드레날린성 수용체이고, Luc 234-550 및 2-233은 가변성 C 말단 아미노산을 갖는 TEV 분열부위인, X에 의해서 연결된 루시퍼라제의 두 개의 단편이다. X는 예를 들어, 세린, S, 아르기닌, R, 또는 발린, V일 수 있다. 재구성된 루시퍼라제 활성은 두 개의 구조물이 모두 세포 내에 존재하는 경우에, 포유동물 세포 내의 변환된 루시퍼라제 융합 단백질로부터 관찰되었다. TEV에 의한 분열에 대한 감수성은 분열부위의 특정한 잔기에 따라 좌우될 수 있다. 여기 및 다른 경우에서 RLU는 상대 발광 (또는 광) 유니트를 나타낸다. 리간드는 실험에 사용되지 않았다.
도 6은 TEV 분열부위의 X 위치에서 R (좌측 그래프) 이고, X 위치에서 V (우측 그래프)인 상이한 TEV 프로테아제 분열부위를 갖는 변환된 루시퍼라제에 부착된 ADBR2 수용체를 사용하는 GPCR-변환된 루시퍼라제 세포-기본 시험에서의 아고니스트-유도된 루시퍼라제 활성을 나타낸다. TEV 프로테아제는 어레스틴에 융합되었다. 각 그래프의 x-축은 제로 값 (아고니스트 없음) 및 10 μM 아고니스트를 나타낸다.
도 7은 공동-일시적 형질감염 및 부분 일시적 형질감염된 시스템에서의 GPCR-변환된 루시퍼라제 세포-기본 시험에서 루시퍼라제 활성의 용량-의존적 반응을 나타낸다. 좌측 그래프에서는, 프로테아제 분열부위 구조물에서 발린이 CHO세포에서 사용되었다. ADRB2-luc 및 Arr-TEV 구조물은 둘 다 일시적으로 공동-형질감염되었다. 우측 그래프에서, 세포는 ADRB2에 융합된 R-함유 루시퍼라제 구조물에 의해서 안정적으로 형질감염되었으며, 그 다음에 Arr-TEV 구조물에 의해서 일시적으로 형질감염되었다.
도 8은 대체 GPCR-변환된 루시퍼라제 시험을 나타낸다. 발현 구조물은 리포터 활성화제에 결합된 ADRB2 및 프로테아제에 결합된 어레스틴 2를 보유하였다. 구조물은 일시적으로 HEK 293 세포 내로 형질감염되었다. 반응 속도는 그래프에서 1 시간 (▲) 및 5 시간 (■) 반응 배양에 의해서 도시되었다.
도 9는 수용체 ADRB2-TEV에 의해서 일시적으로 형질감염되고, X 부위에 V를 보유하는 어레스틴/변환된 효소 구조물을 안정적으로 발현하는 HEK 세포주 (좌측 그래프), 및 Arr-luc234S233을 안정적으로 발현하며, 수용체-TEV 구조물에 의해서 일시적으로 형질감염된 CHO 세포주의 생성을 도시한 것이다.
도 10은 어레스틴/변환된 효소 구조물을 안정적으로 발현하며, ADRB2-TEV에 의해서 일시적으로 형질감염된 HEK 세포에서 아고니스트 (이소프로테레놀) (■), 부분적 아고니스트 (▲), 길항제 + 이소프로테레놀 (▼), 길항제 (◆) 및 비-특이적 내인성 수용체 (●) 반응에 대한 Per-Luc 시험의 평가를 나타낸다.
도 11은 V2 (바소프레신 수용체 2) 아고니스트 및 역 아고니스트 (inverse agonist)에 의한 GPCR Per-Luc 시험의 평가를 나타낸다. 어레스틴/변환된 루시퍼라제 구조물에 의해서 안정적으로 형질감염된 HEK 세포를 V2-TEV 구조물에 의해서 일시적으로 형질감염시키고, 아고니스 8AVP, 아르기닌 바소프레신에 의해서 유도하였다 (좌측 그래프). 이들 세포를 역 아고니스트로 시험하는 경우에, 용량 의존성이 G 단백질이 아니라 어레스틴에 의해서 매개된 시그날에 의해서 관찰되었다 (우측 그래프).
도 12는 ADRB2에 대한 몇 가지의 β 어레스틴-기본 시험을 나타낸다. 우측의 그래프에서, DiscoveRX HEK 세포를 제조자의 지시에 따라서 ADRB2에 의해 일시적으로 형질감염시키고, 좌측에서는 길항제 (프로프라놀롤) (■), 아고니스트 (이소프로테레놀) (▲) 및 이들의 조합물 (●), 및 우측에서는 아고니스트 (■), 역 아고니스트 (▲), 및 이들의 조합물 (●)을 사용하여 시험하였다. 우측에 나타낸 시험을 길항제, 이소프로테레놀 아고니스트 및 이들의 조합에 대한 반응에 관한 본 발명의 시험 (좌측 그래프) 과 비교하였다. 좌측에서의 본 발명의 시험은 더 큰 식별 및 더 큰 특이적 활성을 제공하였다.
도 13은 V2에 대한 β 어레스틴-기본 시험을 나타낸다. 그래프에서, V2 역 아고니스트 (SR121463)는 G 단백질-독립적, 어레스틴-의존적 시그날을 유도하였다.
도 14는 변환된 루시퍼라제를 생산하도록 본 발명에 교시된 바와 같이 결합된 루시퍼라제의 본질적으로 전체 길이지만, 완전하지는 않은 카피의 중첩 (overlap)을 함유하는 발현 구조물을 나타낸다. CMV는 사이토메갈로바이러스 프로모터이다. Luc2-456 및 Luc234-550은 본질적으로 전체 길이 루시퍼라제 단편이다. 이 예에서, GS는 글리신 및 세린으로 구성된 펩타이드 링커이다. TEV 분열부위는 C-말단에서 발린을 갖는다.
도 15는 세포내 단백질-단백질 상호작용을 모니터하는 시험의 예를 나타낸 것이다. 라파마이신은 라파마이신-결합 단백질 (FKBP12, 또는 FKBP) 및 라파마이신 (mTOR) 키나제의 포유동물 표적의 FKBP-라파마이신 결합 (FRB) 영역에 동시에 결합하는 면역억제성 약물이다. mTOR은 라파마이신 154의 포유동물 표적인 라파마이신 결합 영역 151을 포함하는 쥐 세린/트레오닌 단백질 키나제이다. FKBP 152는 라파마이신 결합부위를 갖는 12 kDa FK506-결합 단백질이다. TEV 프로테아제는 mTOR의 라파마이신 결합 영역인 FRB 151에 융합된다. 변환된 리포터 활성화 단백질은 FKBP12의 라파마이신 결합 영역인 FKBP 152에 융합된다. 라파마이신 154는 FRB 151 및 FKBP 152와 반응하고, 그와의 결합을 매개하여 이들을 근접부로 유도하여 변환된 리포터 활성화를 제공한다.
도 16은 단백질 A 21 및 B 23이 리간드 결합 시에 자발적으로 다이머화하거나 (좌측에서 우측으로) 해리하는 (우측에서 좌측으로) 두 개의 막-결합된 수용체인 시험 배열을 도시한 것이다. 시험은 두 개의 수용체의 자발적 상호작용 또는 유도된 상호작용을 모니터링할 수 있으며, 여기에서 수용체 중의 하나 또는 둘 다는 동일하거나 상이할 수 있는 리간드를 결합시킨다. 대신으로, 단백질 A 21 및 B 23은 자발적으로, 또는 리간드 또는 조절물질을 결합시킴이 없이 다이머화할 수 있다 (나타내지 않음). 이 구체예에서, 융합 단백질의 프로테아제 및 변환된 리포터 활성화제 부분은 세포 표면 또는 인공적 패키지 또는 유니트의 외부에서 발현된다. 시험은 또한, 시그날의 쇠퇴, 감소 또는 상실에 의해서 입증되는 것으로서, 자발적이든 하나 또는 그 이상의 분자에 의해서 매개되었든지 상호작용된 수용체의 붕괴를 모니터링하도록 배열될 수 있다.
도 17은 단백질 A 171 및 B 172가 결합, 접촉, 상호작용 등을 할 수 있는 독립적인 세포 내에 또는 그 위에 존재하는 경우의 세포성 시험을 도시한 것이다. 또한, A 171 또는 B 172는 프로테아제 177 또는 변환된 시그날 활성화 단백질 173을 보유한다. 이 시험은 세포-세포 상호작용 또는 근접성의 증거로서, 두 개의 세포 상에서의 두 개의 표지된 수용체의 자발적 상호작용, 또는 수용체 중의 하나 또는 둘 다가 동일하거나 상이할 수 있는 리간드에 결합하는 유도된 상호작용을 검출할 수 있다. 이 구체예에서, 융합 단백질의 프로테아제 177 및 변환된 리포터 활성화제 부분 173은 세포 표면, 또는 인공적 패키지의 외부에서 발현된다. 활성화된 변환된 리포터 175는 서로와 회합하는 단백질 A 171 및 B 173으로부터 유래한다. 대신으로, 수용체 융합 및 관심이 있는 세포내 단백질 융합이 하나의 세포에 존재할 수 있으며, 모니터링되는 유도성 현상, 리간드 등은 제2 세포 상에서 발현되거나, 제2 세포이다. 시험은 또한, 세포를 분리함에 따른 시그날의 쇠퇴, 감소 또는 상실에 의해서 입증되는 것으로서, 자발적이든 하나 또는 그 이상의 분자에 의해서 매개되었든지 상호작용된 수용체 및 세포의 붕괴를 모니터링하도록 배열될 수도 있다.

본 발명의 시험은 상호작용에 의해서 개시된 상호작용 또는 세포 경로를 조절하는 화합물에 대한 사전 지식을 필요로 함이 없이 단백질-단백질 상호작용을 검출한다. 이 시험은 막 단백질의 상호작용, 예를 들어, 호모다이머 또는 헤테로다이머의 형성을 검출할 수 있다. 이 시험은 막 단백질과 세포질성 단백질의 상호작용을 검출할 수 있다. 이 시험은 두 개의 세포질성 단백질의 상호작용을 검출할 수 있다. 이 시험은 단백질의 세포내 공간으로 또는 세포 내의 세포기관으로의 전좌를 검출할 수 있다. 시험은 두 개의 세포 또는 패키지 또는 유니트의 상호작용을 검출할 수 있다. 단백질 A 또는 B는 단백질-단백질 상호작용에 절대적 또는 필수적일 수 있거나 없는 리간드, 보조인자 또는 다른 화합물, 분자 또는 물질을 결합시킬 수 있다.

용어 "서열"은 전문가에게 공지된 것으로서 유전자 엔지니어링, 핵산 및 단백질 기술 분야에서 몇 가지의 용도를 가지며, 문장, 단락, 개념, 사상, 절 등의 맥락에서 상이한 의미를 가질 수 있다. 예를 들어, 서열은 폴리펩타이드의 아미노산 잔기(일차 구조) 또는 폴리뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 염기의 특정한 목록을 나타낼 수 있다. 또 다른 맥락에서, 서열은 일차 아미노산 구조에 대한 지식을 필요로 함이 없이, 전체 분자를 나타내는 폴리펩타이드 서열과 같은 일반적 개념에서의 복합 분자를 나타낼 수 있다. 유전자 서열은 유전자와 동의어일 수 있으며, 폴리뉴클레오타이드 그 자체 또는 전체를 나타낸다. 서열은 개별적인 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드, 또는 이의 일부분을 나타낼 수 있다. 따라서, 문구 "서열이 작동적으로 연결된다"가 사용되는 경우에, 이 문구는 개별적인 유전자, 영역 또는 전사 유니트가 접합 (joining) 또는 리게이션 (ligation)으로부터 유래하는 개별적인 유전자(들), 영역(들), 전사 유니트(들) 등의 발현을 가능하게 하는 기능적 방식으로 리게이트 또는 접합될 수 있음을 의미한다. 서열은 또한, 다수의 기능적 부분 또는 영역들을 갖는 단백질의 영역(들)과 같은 특정의 발현된 유전자 또는 단백질의 일부분일 수 있다. 본 기술분야에서 알려진 바와 같이, 관심이 있는 폴리뉴클레오타이드는 DNA 또는 RNA, 또는 이들의 혼합물일 수 있으며, 본 발명의 실시에서 이들을 제조 및 사용하는 방법은 본 기술분야에서 공지되어 있다.

예를 들어, 도 4는 핵 호르몬 수용체의 조절된 활성에 대한 시험을 나타낸다. 핵 호르몬 수용체의 핵으로의 수송은 활성화 단백질, 예를 들어, 루시퍼라제의 활성에 대한 반응으로 형광 변화 또는 존재와 같은, 리포터 활성화 단백질, 및 임의로, 검출가능하며, 따라서 리포터로 작용할 수 있는 분자의 재배열에 의한 시그날을 야기하거나 유발한다. 생성된 시그날은 모든 검출가능한 변화, 예를 들어, 강도의 변화 또는 여기/방사 파라메터의 변화일 수 있다. 화학발광은 또 다른 공통적 리포터 시그날이다. 숙련된 전문가는, 프로테아제 또는 변환된 리포터가 핵 또는 다른 표적화 폴리펩타이드를 갖도록 엔지니어링될 수 있음을 이해할 것이다. 이러한 표적화 폴리펩타이드는 염기성 아미노산을 포함할 수 있다. 시그날은 표적화된 부분에서 둘의 상호작용에 의해서 조절될 수 있다.

GPCR의 경우에, 본 시험은 특이적이고, 민감하며, 커플링을 위한 특정의 G 단백질에 대한 사전 지식을 필요로 하지 않기 때문이다. 이 시험은 내인성 GPCR에 의해서 영향을 받지 않으며, 아고니스트, 길항제 및 역 아고니스트 (일부 수용체의 경우)를 포함한 분자를 확인하기 위해서 적용될 수 있다. 본 발명의 시험은 전사 증폭에 대한 필요성을 피하면서 리 (Lee) 등의 시험방법에 비해 개선된 것이다. 본 발명은 더 즉각적이며, 직접적인 리드아웃을 제공한다.

본 발명은 부분적으로 리 등의 방법보다 더 간단하고, 더 확고한 시험 시스템을 제공하는데, 이는 본 발명의 시스템은 시약의 핵으로의 전좌 및 그 다음에, 시그날을 증폭시키기 위한 전사를 필요로 하지 않는다. 따라서, 리드아웃은 수용체 조절 현상에 대해서 근접할 수 있다. 본 발명은 리 등의 시험에서와 같이 핵을 필요로 하지 않는다. 실제로, 본 발명의 한가지 적용은 분비된 단백질의 검출이다. 세포질 내의 리포터 또는 프로테아제는 분비된 파트너 (partner) 단백질로부터의 시그날을 활성화 (또는 불활성화)시킬 수 있다. 또 다른 구체예는 탈핵된 세포에서, 또는 인공적 세포, 패키지 또는 유니트에서의 사용이다.

본 발명은 특히, 어떤 단백질-단백질 상호작용을 조절하는 분자를 확인하는데 유용하다. β 어레스틴을 사용하는 시험인 DiscoveRX^TM 시험은 시그날 생성을 위해서 언제든지 함께 유지되도록 두 개의 상호작용성 단백질 성분을 필요로 한다. 대부분의 선행 GPCR 시험은 FLIPR 및 cAMP 시험과 같이 G 단백질 시그날링을 기본으로 한다. Ca⁺⁺ 또는 cAMP 레벨에 영향을 미치는 어떤 분자라도 거짓 양성 시그날을 생성시키는 경향이 있다. 다른 한편으로, 본 발명의 시험방법은 민감성 및 특이성에 영향을 미칠 수 있는 효소 성분 회합 또는 G 단백질 시그날링과는 무관하면서 빠르고, 확고하며, 비용이 적게 든다.

본 발명은 단백질 A (또는 단백질 B)를 리포터 활성화 단백질 (리포터 조절성 단백질/분자 또는 리포터 활성화 단백질/분자는 이와 동등하다)과 융합시킴으로써 어떤 단백질-단백질 상호작용이라도 시험 또는 스크리닝하는 수단을 제공한다. 이러한 것의 예는 단백분해적 분열부위를 함유하는 변화된 효소이다. 단백질　B는 프로테아제와 융합된다. 단백질 A와 단백질 B의 상호작용은 구성적일 수 있거나, 제3 분자에 의해서 유도될 수 있다. 숙련된 전문가는 단백질 단백질 상호작용을 증가시키거나 동요시키는 분자를 확인하기 위해서 본 발명의 시험을 사용할 수 있다. 대신으로, 단백질 A는 프로테아제와 융합될 수 있으며, 단백질 B는 리포터 활성화 단백질과 융합될 수 있다.

본 발명의 리포터 활성화 단백질은 잠복성이며, 제2 단백질의 프로테아제와의 상호작용 시에 활성화될 수 있는 것이다. 관심이 있는 접근방법은 프로테아제 분열부위를 함유하도록 구성된 변화된 분자인 리포터 활성화 단백질을 생산하는 것이다. 분열시키면, 리포터 활성화 단백질의 일부분은 회합, 조립 등에 의해서 활성 리포터 활성화 폴리펩타이드 또는 조립체를 생산할 수 있다. 그 후, 이러한 활성, 예를 들어, 효소적으로 활성인 리포터 활성화 단백질은 적합한 기질, 예를 들어, 리포터에 작용하여 검출가능한 시그날을 수득할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 변환된 경우에, 불활성 분자는 분열하면 생물학적으로 활성인 루시퍼라제를 형성하는 루시퍼라제이고, 이 루시퍼라제는 루시페린과 같은 적합한 기질 상에 작용하여 검출가능한 시그날, 이 경우에는 발광을 생성시킬 수 있다.

또 다른 구체예에서, 리포터 활성화 단백질은 리포터이다. 따라서, 이것은 분열 시에 리포터 활성화 단백질에 의한 자체 활성화로 간주될 수 있다. 그 예는 리포터 활성화제가 루시퍼라제인 경우에 루시페린을 제공하는 시약과 같은, 분열되는 경우에 재배열하여 리포터 시스템과는 무관한, 검출가능한 시그날을 생성시키는 GFP일 수 있다.

변화된 리포터 활성화 유전자는 활성 또는 불활성 형태로 구성될 수 있다. 예를 들어, 이 기술의 개발에 있어서는 루시퍼라제 아미노산 서열 순서가 변화된 GPCR-불활성 변환된 루시퍼라제 융합물이 구성되었다. 원래의 N 말단 단편을 C 말단으로 이동시키고, 원래의 C 말단 단편을 N 말단으로 이동시키고, 프로테아제 인식부위를 사용하여 두 개의 순서-변경된 단편을 융합시켰다. GPCR-불활성 변환된 루시퍼라제 융합 단백질과 β 어레스틴 2-TEV 프로테아제 융합 단백질의 상호작용은 불활성 변환된 루시퍼라제의 분열 및 재구성된 루시퍼라제 활성의 생성을 야기한다. 대체 전략을 사용하여, 본 발명자는 루시퍼라제 활성에 상당한 영향이 없이 프로테아제 인식부위가 루시퍼라제 서열의 원래 순서에 도입된 GPCR-활성 변화된 루시퍼라제 융합 구조물을 구성하였다. GPCR-활성 변환된 루시퍼라제 융합 단백질과 β　어레스틴 2-TEV 프로테아제 융합 단백질의 상호작용은 활성 변환된 루시퍼라제의 분열을 야기하고, 두 개의 불활성 루시퍼라제 단편을 생산하여 활성의 상실, 및 따라서 시그날의 감소 또는 상실을 야기한다.

리포터 활성화 단백질은 변환된 단백질 기본 리포터, 예를 들어, 가우시아 (Gaussia) 루시퍼라제; 레닐라 (renilla) 루시퍼라제; β 락타마제, β 갈락토시다제; 및 예를 들어, TEV 분열부위와 같은 단백분해적 분열부위를 함유하는 녹색 형광 단백질 (GFP) 또는 DsRed 단백질 등 중의 하나와 같은 형광 단백질로부터 선택될 수 있다. "효소"는 일반적 용어로 사용되지만, 리포터 활성화 단백질은 그 자체가 "효소"로 제한되지 않으며, 시그날에서 변화를 가져올 수 있는 어떤 리포터 활성화 단백질이라도 된다. 예를 들어, 형광 단백질을 결합 또는 격리시키는 것은 분자 구조를 변화시키는 화학적 반응이 없이 충분한 시그날 변화가 있을 수 있다.

본 발명의 한가지 특징으로, 변환된 루시퍼라제 변이체는 숙련된 분자 생물학자 또는 단백질 화학자에 의해서, 상이한 파괴점을 사용하고, 프로테아제 활성, 기본적 루시퍼라제 활성 또는 재구성된 루시퍼라제 활성이 감소 또는 증가하도록 다양한 중첩성 부분을 사용하여 구성될 수 있다 [Rachel B. Kapust, et al. Biochemical & Biophysical Research Communications, 294 (2002) 949-955].

프로테아제는 본 기술분야에서 공지되어 있으며, 다양한 공급원, 예를 들어, 박테리아, 효모, 진균, 식물, 곤충, 포유동물 등으로부터 선택될 수 있다. 유기체는 펩타이드를 처리하기 위해서 프로테아제를 필요로 하며, 따라서 생물계는 본 발명에서 사용하기에 적합한 다수의 다양한 프로테아제를 나타낸다. 원하는 효소에 대한 적절한 분열부위의 선택은 일반적으로, 문헌에서 또는 제품 카탈로그에서 찾을 수 있다. 이러한 프로테아제 분열부위는 두 개의 아미노산, 3 개의 아미노산, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 개 또는 그 이상의 아미노산 등과 같은 다양한 길이의 올리고펩타이드이다.

변환된 리포터 활성화 단백질은 또한, 대체 프로테아제 분열부위로 치환시킬 수 있거나, 분열 후에 활성 효소로 전환될 수 있는 하나 또는 그 이상의 불활성 프리-프로-효소 (pre-pro-enzyme)에 연결될 수 있다. 예를 들어, 프리-프로-효소의 분열부위는 야생형과는 상이한 서열을 인식하는 효소에 대해서 민감하도록 변형될 수 있다. 대신으로, 분열부위는 더 큰 특이성, 분열에 대한 더 큰 감수성 등과 같은 특정의 바람직한 효과를 위해서 변형될 수 있다.

시험은 또한, 분열 후에 불활성 효소로 전환되는, 프로테아제 분열부위를 갖는 활성 효소를 사용하여 이루어질 수도 있다. 이 특징은 상이한 특이성을 갖는 다수의 단백분해 효소가 따라서, 필요에 따라 재-엔지니어링이 없거나 단지 최소로 하여 활성 효소에 작용할 수 있는 것과 같이 약간의 단순성을 제공한다.

효모 세포뿐만 아니라 HEK293, COS-7, NIH3T3 등과 같은 포유동물 세포를 사용하여 단백질-단백질 상호작용 변환된 리포터 활성화 단백질 시험을 확립할 수 있다. 세포-부재 시스템이 사용될 수도 있다. 이러한 세포-부재 시스템에는 용해물, 막 제제, 바이러스 스톡 (stock), 바이러스-유사 입자, 리포좀, 혈소판, 막 제제, 코크리트, 막관통 단백질과 같은 생물학적 실체를 봉입, 부착, 보유, 포함 등을 할 수 있는 구조를 형성하도록 생물학적 막을 모방한 다른 인공적 지질-기본 유니트 또는 패키지가 포함된다. 유전자이식 유기체와 같은 유기체가 관심이 있는 시험에서 사용될 수 있거나, 관심이 있는 시험에서 사용될 수 있는 세포 또는 시약을 제공할 수 있다.

본 발명의 시험은 또한, 검출가능한 리포터를 제공한다. 이 리포터는 관심이 있는 리포터 활성화 단백질에 대한 기질인 것이다. 따라서, 변환된 루시퍼라제의 경우에 적합한 리포터는 루시퍼라제에 의해서 작용하는 경우에 검출가능한 발광 시그날을 수득하는 루시페린이다. 리포터는 세포 용해를 피하는 시험방법을 제공하기 위해서 세포 내의 것일 수 있다. 예를 들어, 말토즈 결합 단백질 (MBP)의 카복실 말단에 융합된 GFP는, MBP 시그날 서열이 존재하는 경우에 형광성이 아니다. MBP 시그날 펩타이드가 제거되면, 형광이 관찰된다 [Feilmeier et al., J Bacteriol 182(14)4068-4076, 2000]. 따라서, 프로테아제 분열부위는 본 발명에 교시된 바와 같이 MBP 시그날 펩타이드의 하류에 도입되어 생존 세포를 사용하여 수행될 수 있는 시험을 제공할 수 있다.

시험방법은 변환된 루시퍼라제 또는 형광 단백질을 사용함으로써 단백질 상호작용 컴플렉스의 세포하 위치 (subcellular location) 및 전좌를 모니터하기 위해서 적용될 수 있다. 도 4는 이러한 구체예의 개략도를 나타낸다.

본 발명은 관심이 있는 물질이 i) 막-결합 단백질과 같은 제1 단백질, 예를 들어, 막관통 수용체와 같은 수용체와 ii) 세포내 분자, 또 다른 막관통 단백질 등과 같은 제2 단백질, 예를 들어, 어레스틴 패밀리의 구성원의 상호작용을 조절하는지 여부를 측정하는 방법에 관한 것이다. 한가지 방법은 원핵성이거나 진핵성일 수 있는 세포를 두 개의 구조물로 공동-형질전환시키거나 공동-형질감염시키는 것을 포함한다. 제1 구조물은 (a) 막관통 수용체와 같은 제1 단백질, 및 (b) 프로테아제에 대한 분열부위를 암호화한 제1 핵산, 및 (c) 리포터를 활성화하는 단백질을 암호화한 제2 핵산을 포함한다. 제2 구조물은 (a) 제1 단백질과 그와의 상호작용이 측정 및/또는 결정되는 제2 단백질을 암호화한 핵산, 및 (b) 프로테아제, 프로테아제의 일부분 또는 제1 구조물의 분열부위에 작용하는 프로테아제 활성을 갖는 폴리펩타이드를 암호화한 핵산을 포함한다. 일부의 구체예에서, 이들 구조물 중의 하나 또는 그 이상은 세포 내에 안정적으로 통합될 수 있다.

본 발명의 구체예의 특징은 도 1에 그림으로 나타내었다. 간략하면, 관심이 있는 제1 단백질을 발현하는 세포를 수득한다. 관심이 있는 단백질은 단백분해적 부분을 포함할 수 있거나, 단백분해적 부분은 결합된 리간드의 결합 또는 방출 시에 콤플렉스와 회합할 수 있다. 불활성 효소는 리간드 결합에 있어서의 변화에 대한 반응으로 관심이 있는 제1 단백질과 회합하는 펩타이드 부분에 부착된다. 이 구체예에서, 불활성 효소에 대한 프로테아제의 근접은 효소, 예를 들어, 루시퍼라제의 활성의 재구성을 허용한다. 재구성된 활성은 단백질-단백질 상호작용의 리포트에 영향을 미친다.

도 1에 나타낸 예는 막관통 단백질, TEV 분열 효소, 변환된 루시퍼라제 및 루시퍼라제에 대한 기질, 예를 들어, 루시페린을 도시한다. 단백질　"A"는 본 예에서 어레스틴일 수 있다. 관심이 있는 제1 단백질은 GPCR일 수 있다. 루시퍼라제의 N 및 C 말단은 재배열될 수 있고, TEV 프로테아제 분열부위와 연결되어 불활성 변환된 루시퍼라제를 생성할 수 있다. 나타낸 바와 같은 변환된 루시퍼라제는 β 어레스틴 2와 융합된다.

단백질 A는 프로테아제와 융합될 수 있다. 단백질 B는 불활성 변환된 리포터 활성화 단백질과 융합될 수 있다. 프로테아제 인식 및 분열부위 (단백질 A에 융합된 프로테아제에 의해서 인식됨)는 변환된 리포터 활성화 단백질 내에 삽입된다. 단백질 A 및 단백질 B는 예를 들어, 단백질 A 및 단백질 B 상호작용을 조절하는 제3 분자에 의해서 근접부로 유도된다. 근접부에서 융합 프로테아제에 의한, 변화된 불활성 리포터 활성화 단백질의 단백분해는 변환된 리포터 활성화 단백질의 두 개의 단편의 융합을 제공하여 활성 리포터 활성화 단백질 활성을 재생시킨다. 리포터 활성화 단백질의 활성은 시판품으로 이용할 수 있는 시약 및 키트를 사용하여, 루시페린과 같은 적합한 리포터를 사용하는 적절한 시약 및 장치에 의해서 평가될 수 있다.

단백질 A로서의 GPCR은 TEV 프로테아제와 융합될 수 있다. 대신으로, 이 GPCR은 변환된 리포터 활성화 단백질과 융합될 수 있다.

도 1에서, GPCR에 결합한 분자는 GPCR과 β 어레스틴 상호작용을 야기한다. 단백질 A에 결합되거나, 이의 근접부에 있는 TEV 프로테아제에 의한, 변환된 루시퍼라제 내의 분열부위의 단백분해는 루시퍼라제 단백질 단편을 생성한다. 단편은 활성 루시퍼라제를 재구성하며, 이것이 검출되거나, 이의 존재는 세포 또는 용해물 내의 루시페린과 같은, 루시퍼라제 활성에 대한 적합한 리포터를 사용하여 추론된다.

이 방법은 G 단백질 또는 β 어레스틴과 작용할 수 있는 GPCR과 같은 수용체 단백질에 대한 특이적 시그날을 생성할 수 있다.

도 1에 나타낸 일반적 방법은 일반적으로, GPCR에 대해 적용할 수 있는데, 이는 베타 어레스틴 동원이 통상적인 현상이기 때문이다. 그러나, 상호작용하거나, 결합하거나, 회합하는 등의 작용을 하는 어떤 분자의 쌍이라도 본 발명의 실시에 사용될 수 있는 상호작용, 결합, 회합 등을 하는 것으로 의심된다.

예시된 방법은 β 어레스틴 시그날링 경로를 사용하며, 본 시험방법이 GPCR에 대해서 또는 수반된 G 단백질에 대해서 특이적이 아니기 때문에, 특이적 G 단백질 커플링에 대한 사전 지식을 필요로 하지 않는다. 따라서, 이 시험방법은 G 단백질 커플링 경로를 모르는 고아 (orphan) GPCR에 대해서 바람직하다. 이 방법은 미국 특허 제7,049,076호 (Lee et al.)의 시험방법에서와 같은 전사 증폭이 없이 즉각적이고 생리학적으로 적절한 리드아웃을 제시한다.

물질 및 방법은 또한, G 단백질 독립적 현상을 모니터링할 수 있게 한다. 이 경우에, β 어레스틴은 변환된 리포터 활성화 단백질로 표지될 수 있다. β 어레스틴과 상호작용하는 것으로 공지되거나 의심되는 분자는 β 어레스틴 바이어스 (bias)를 나타내는 GPCR과 같은 적합한 프로테아제에 의해서 표지될 수 있다.

본 발명은 상호작용 파트너가 점유된 채로 남아있거나, 함께 효소 단편 상보화를 보장하도록 해야 하는 효소 단편 상보화 시험 (예를 들어, DiscoveRX PathHunter^TM β 어레스틴 시험)에 비해서 이점을 갖는다. 다른 한편, 본 발명의 시험방법에서 시약의 근접에 기인하여 일단 단백분해가 일어나면, 활성 리포터 활성화제가 생성되고, 단백질 상호작용 파트너는 적절한 정보적 시험을 수득하도록 회합된 채로 유지되는 것을 필요하지 않다.

이러한 제1 융합 단백질 및 다른 펩타이드 성분을 암호화한 핵산이 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 이러한 세포 엔지니어링은 본 기술분야에서 잘 알려져 있다. 다양한 펩타이드에 대한 핵산은 단일 분자로 엔지니어링될 수 있거나, 직렬로 또는 병렬로 도입될 수 있다. 구조물의 일부는 숙주 염색체 내로 통합되어, 예를 들어, 본 기술분야에서 공지된 물질 및 방법을 실행하는 안정적인 형질감염을 수득할 수 있다.

대체 시스템에서는, 관심이 있는 두 개의 단백질을 리간드 또는 시험 화합물의 부재 하에서 상호반응시킬 수 있다. 리간드 또는 시험 화합물은 두 개의 단백질이 해리하거나, 입체배좌를 변화시키거나, 다른 식으로 이들의 상호작용을 감소 또는 억제하도록 할 수 있다. 이러한 경우에, 세포 내의 유리된 기능적 활성 단백분해적 효소의 레벨은 양성 시험 화합물의 존재 하에서 감소하여 단백분해의 감소 및 리포터 활성화 단백질의 활성에 있어서의 측정가능한 감소를 유도한다.

예시적 구체예에서, 어레스틴은 아고니스트의 존재 하에서 막관통 수용체에 결합하는 제2 단백질이다; 그러나, 수용체는 단지 한가지 유형의 단백질이기 때문에, 시험은 수용체 분자의 사용에 의존적이지 않으며, 아고니스트 결합은 수반될 수 있는 유일한 상호작용이 아니다. 제2 단백질과 상호작용하는 어떤 단백질이라도 충분할 수 있지만, 세포 결합된 수용체를 활성 상태로 침전시키는 조절물질에 대한 수용체의 노출 시에 세포, 기관 및 조직 반응을 유발하는데 있어서의 그들의 역할로 인하여 관심이 있는 것은 막관통 단백질이다. 추가로, 수용체에 대한 아고니스트 결합이 시험할 수 있는 결합의 유일한 유형은 아니다. 역 아고니스트도 또한, 본 발명의 시험방법에서 시험할 수 있다. 전문가는 길항제 그 자체를 결정할 수 있으며, 또한 본 발명에 따라 다양한 길항제 및/또는 아고니스트의 상대적 강도를 결정할 수 있다.

이의 대상을 제조 및 사용하는 특정의 방법 및 기술을 포함한 본 발명의 다른 상세한 사항은 이하에 기술된다.

본 발명에 기술된 방법과 마찬가지로, 본 발명의 특징인 생성물을 간단하게 기술할 수 있다. 예를 들어, "3 부분 구조물", 즉 i) 단백질, ii) 분열부위, 및 iii) 리포터 활성화 단백질을 암호화한 서열을 갖는 구조물에서, 단백질은 예를 들어, 세포내 단백질, 또는 막관통 수용체와 같은 막-결합된 단백질, 예를 들어, GPCR 패밀리의 구성원일 수 있다. 분열부위는 이의 가수분해가 단백질-단백질 상호작용의 파트너 단백질의 프로테아제의 작용에 의해서 성취될 수 있는 어떤 가수분해 가능한 부위라도 될 수 있다. 분열은 직접적으로 리포트를 생성시킬 수 있거나, 분열은 리포터 활성화 단백질의 재배열이 또 다른 분자로부터의 리포트를 초래하도록 할 수 있다. 제3 부분은 대신에, 프로테아제 또는 프로테아제 활성을 갖는 폴리펩타이드일 수 있다.

이들 서열은 이들이 암호화한 단백질의 C 말단이 제2 단백질과 더 잘, 그리고 더 강력한 상호작용을 하도록 변형될 수 있다. 변형은 예를 들어, GPCR과 같은 단백질의 C 말단 암호화 서열을 AVPR2, AGTRLI, F2PLI, CCR4, CXCR2/IL-8 등에 대한 C 말단 암호화 부분으로 치환시키는 것을 포함할 수 있다. 유전자 서열은 관심이 있는 숙주 세포 내에서 관심이 있는 단백질의 해독을 최적화하도록 재암호화될 수 있다.

리포터를 활성화하는 단백질은 세포질 내에서, 또는 핵과 같은 세포기관 내에서 작용하는 단백질일 수 있거나, 이것은 반응의 캐스케이드를 진행하도록 하여 또 다른 단백질에 의한 작용을 제공할 수 있다. 이러한 캐스케이드는 잘 연구된 세포성 현상이기 때문에 숙련된 전문가는 이들에 대해 잘 정통하고 있다. 예를 들어, 핵 전좌 서열과 같은 전좌 시그날이 리포터 효소 내에 혼입될 수 있다. 국재화 서열은 본 기술분야에서 공지되어 있다.

상기에 기술된 바와 같은 제2 구조물은 제1 단백질과 상호작용하여 일부의 측정가능한 현상을 유도하는 단백질을 암호화한 부분을 포함한다. 단백질은 활성화제, 경쟁물질, 억제제, 상승적 반응을 제공하는 것 등일 수 있으며, 더욱 일반적으로는 제1 단백질의 "조절물질"일 수 있다. 특히, 제1 단백질이 GPCR인 경우에는 어레스틴 패밀리의 구성원이 예시되지만, 특히 제1 단백질이 GPCR이 아닌 경우에는 다른 단백질 암호화 서열이 사용될 수도 있다. 이들 두 개의 부분 구조물의 제2 부분은 제1 구조물에 의해서 암호화된 리포터 활성화 단백질을 분열하여 직접 또는 간접적으로 검출가능한 시그날을 수득할 수 있는 리포터 활성화 단백질을 수득하도록 작용하는 프로테아제, 프로테아제의 일부분 또는 프로테아제 활성을 갖는 폴리펩타이드를 암호화한다.

그러나, 이들 예시된 구체예는 본 발명에 제시된 이하의 추가의 구체예에서 거론된 바와 같이 본 발명을 제한하는 것이 아니며, 예를 들어, 프로테아제는 디자인 선택으로서 단백질 A 또는 단백질 B에 융합될 수 있다.

숙주 세포

본 발명에서 사용된 것으로서, 용어 "세포", "세포주" 및 "세포 배양물"은 상호교환하여 사용될 수 있다. 숙주 세포는 또한, 용해물이 수득될 수 있는 공급원 세포를 나타낼 수도 있다. 이들 모든 용어는 또한, 어떤 및 모든 후속 세대인 그들의 자손을 포함한다. 모든 자손은 신중하거나 부주의한 돌연변이, 선택 또는 분화에 기인하여 동일하지 않을 수 있는 것으로 이해된다. 숙주 세포는 제2 구조물의 융합 단백질의 일부분인 프로테아제에 의해서 분열되는 제1 구조물의 리포터 활성화 단백질에 의해서 작용하는 경우에 시그날을 제공하는, 스크린 가능하거나 선택가능한 마커 또는 리포터를 발현하도록 엔지니어링될 수 있다. 스크린 가능한 마커 또는 리포터는 어떤 방식으로든 숙주 세포 또는 시험 시스템에 도입될 수 있다.

다수의 세포주 및 배양물이 숙주 세포로 사용하기 위해서 이용될 수 있다. 예를 들어, 대부분은 생존 배양물 및 유전자 물질에 대한 보관소로 작용하는 기관인 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (American Type Culture Collection; ATCC)을 통해서 수득될 수 있다. 적절한 숙주는 벡터 골격 및 원하는 결과를 기초로 하여 본 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해 결정될 수 있다. 플라스미드 또는 코스미드는 예를 들어, 다수의 벡터의 복제를 위해서 원핵성 숙주 세포 내에 도입될 수 있다. 벡터 복제 및/또는 발현을 위해서 이용할 수 있는 세포 유형에는 슈어 (SURE® 적격 세포 및 솔로팩 (SOLOPACK^TM) 골드 세포 (스트라타젠 (STRATAGENE®, La Jolla)와 같은 다수의 상업적으로 이용할 수 있는 박테리아 숙주뿐만 아니라 이. 콜라이 (E. coli) (예를 들어, 이. 콜라이 균주 RR1, 이. 콜라이 LE392, 이. 콜라이 B, 이. 콜라이 X 1776 (ATCC No. 31537), 이. 콜라이 W3110 (F^-, 람다^-, 원영양균성 (prototrophic), ATCC No. 273325), DH5α, JM109, 및 KC8)와 같은 박테리아, 바실루스 서브틸리스 (Bacillus subtilis)와 같은 바실루스; 및 살모넬라 티피뮤리움 (Salmonella typhimurium), 세라티아 마르세센스 (Serratia marcescens), 다양한 슈도모나스 (Pseudomonas) 종과 같은 다른 엔테로박테리아가 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다. 특정의 구체예에서는, 이. 콜라이 LE392와 같은 박테리아 세포가 파아지 바이러스를 위한 숙주 세포로 사용될 수 있다.

벡터의 복제 및/또는 발현을 위한 진핵성 숙주 세포의 예로는 HeLa, NIH3T3, 저캣 (Jurkat), 293 (HEK), COS, CHO, 사오스 (Saos), 및 PC12가 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다. 효모 세포 또는 곤충 세포와 같은 다른 세포, 예를 들어, Sf9 세포도 또한 적합하다. 그들이 의도된 목적에 따라 사용하기를 바라는 숙주 세포를 사용하는 것은 숙련된 전문가에게 임의로 결정할 수 있는 것이다. 다양한 세포 유형 및 유기체로부터의 다수의 숙주 세포가 이용될 수 있으며, 본 기술분야에서 숙련된 전문가에게 공지되어 있다.

마찬가지로, 바이러스 벡터 (파아지를 포함)를 진핵성 또는 원핵성 숙주 세포, 특히 벡터의 복제 또는 발현을 허용하는 것과 함께 사용될 수 있다. 숙주 세포는 반드시 불멸화된 세포주는 아니다. 숙주 세포는 조혈성 줄기세포, 혈관, 상피, 평활근, 비장, T 세포, B 세포, 단핵세포 등과 같은 줄기세포 배양물 또는 일차 세포 배양물로부터 유래할 수 있다. 숙주 세포는 예를 들어, 다른 유기체로부터의 유전자 물질을 포함하는 유전자 이식성일 수 있다. 리 등의 방법에서 사용할 수 없는 세포가 본 발명의 시험에 적합한데, 이는 활성 전가가 필요하지 않기 때문이다. 예를 들어, 적혈구 또는 혈소판과 같은 탈핵된 세포가 본 발명에서 사용할 수 있다.

본 시험과 관련하여, 숙주 세포는 예를 들어, 리포좀 및 바이러스-유사 입자와 같은 인공적 패키지 및 유니트를 포함하는 것을 의미한다. 이러한 구조는 종종, 필름, 막 또는 다른 구조에 의해서 외부로부터 완전히 또는 부분적으로 분리된 내부 공극을 갖는 봉입체를 제공하는, 세포 또는 이의 일부분을 모사 또는 모방한 것이다. 언급된 바와 같이, 이러한 인공적 패키지 및 유니트에는 리포좀, 코크리트, 바이러스-유사 입자, 바이러스 등이 포함된다.

단백질

본 발명은 그에 대한 물리적 상호작용이 공지되거나 의심되는 어떤 두 개의 단백질의 사용이라도 고려한다. 일부의 구체예에서, 단백질은 잠복성 또는 불활성 리포터 활성화 폴리펩타이드에 융합된 제1 단백질, 및 제1 융합 단백질 내의 분열부위 (이의 분열은 리포터 활성화 폴리펩타이드를 방출하거나 이의 활성을 가능하게 한다)를 인식하는 프로테아제에 융합된 제2 단백질인 융합 단백질로서 존재하거나, 융합 단백질로 존재하도록 엔지니어링될 수 있다.

관심이 있는 제1 단백질에 관해서, 제1 단백질은 예를 들어, 천연적으로 존재하는 막-결합된 단백질, 또는 막-결합되도록 엔지니어링된 것일 수 있다. 예를 들어, 제1 단백질은 GPCR과 같은 막관통 수용체, 또는 수용체 타이로신 키나제, 수용체 세린/트레오닌 키나제, 사이토킨 수용체 등을 포함하는 (단, 이들로 제한되지는 않는다), 관심이 있는 어떤 다른 막관통 수용체일 수 있다. 추가로, 단백질의 일부분이 전체 길이 제1 단백질과 동일한 방식으로 기능할 것이라고 잘 알려진 바와 같이, 세포외 영역 및 막관통 영역과 같은 제1 단백질의 이러한 활성 부분은 본 발명에 기술된 단백질의 정의에 포함된다.

숙련된 전문가에게 명백할 수 있는 것으로서, 본 발명은 어떤 단백질과의 상호작용에 대한 시험을 위해서 사용될 수 있으며, 이의 범위가 GPCR과 같은 막-결합된 수용체를 시험하는 것으로 제한되지는 않는다. 예를 들어, 막관통 수용체의 다른 클래스의 활성에는 수용체 타이로신 키나제 (RTK), 예를 들어, IGF1R, 예를 들어, 표피성장인자 수용체 (EGFR), ErbB2/HER2/Neu 또는 관련된 RTK; 수용체 세린/트레오닌 키나제, 예를 들어, 전환성장인자-β (TGFβ), 액티빈, 또는 골 형태형성 단백질 (BMP) 수용체; 사이토킨 수용체, 예를 들어, 인터류킨을 위한 인터페론 패밀리, 에리트로포이에틴, G-CSF, GM-CSF 또는 종양성장인자 (TNF)에 대한 수용체; 렙틴 수용체; 및 에스트로겐 수용체 1 (ESR1), 및 에스트로겐 수용체 2 (ESR2)와 같이, 통상적으로 반드시 막-결합되지는 않는 다른 수용체가 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다. 각각의 경우에, 방법은 세포를 관심이 있는 수용체, 프로테아제 분열부위 및 리포터 활성화 폴리펩타이드를 포함하는 키메릭 또는 융합 단백질의 발현을 지시하는 변형된 수용체 폴리뉴클레오타이드로 형질감염시키는 것을 포함할 수 있다. 세포는 제2 폴리뉴클레오타이드, 예를 들어, 제1 단백질의 분열부위를 인식하고 분열하는 프로테아제에 융합된 상호작용 단백질을 포함하는 키메릭 또는 융합 단백질의 발현을 지시하는 벡터로 공동-형질감염시킬 수 있다. 제1 및 2 폴리뉴클레오타이드는 단일 분자 내에 포함되어 공동-형질감염을 피할 수 있다. EGFR과 같은 RTK의 경우에, 이 상호작용 단백질은 포스포리파제 C (PLC)와 같은 SH2 (Src 상동성 영역 2) 함유 폴리펩타이드 또는 Src 상동성 2 영역 함유 전환 단백질 1 (SHC1)로 구성될 수 있다. TGFβ, 액티빈 및 BMP 수용체와 같은 수용체 세린/트레오닌 키나제의 경우에, 이 상호작용 폴리펩타이드는 Smad 단백질 또는 이의 일부분일 수 있다. 인터페론α, 인터페론 β 또는 인터페론 γ 수용체와 같은 사이토킨 수용체의 경우에, 이 상호작용 단백질은 시그날 변환제 및 전사 활성화제 (STAT) 단백질, 예를 들어, Stat1 또는 Stat2; 또는 야누스 (Janus) 키나제 (JAK) 단백질, Jak1, Jak2 또는 Tyk2; 또는 이의 일부분 등일 수 있으나, 이들로 제한되지는 않는다. 형질감염된 세포는 리포터 활성화 단백질에 의해서 작용하게 되는 리포터를 함유할 수 있다. 그 후, 형질감염된 세포를 특정 기간 동안 시험 화합물로 처리하고, 리포터 활성을 시험 기간의 종료 시에 측정하는 시험이 수행된다. 시험 화합물이 관심이 있는 수용체를 활성화시키면, 관심이 있는 수용체와 상호작용 단백질 사이의 상호작용이 자극되어 프로테아제 부위의 분열 및 리포터 활성화 단백질의 활성화를 유도하고, 이것은 다시 리포터 활성에 있어서의 측정가능한 변화 또는 증가를 제공한다.

그 밖의 다른 이용가능한 단백질 쌍에는 항체-항원, 효소-기질, 다이머화 단백질, 시그날 전달 캐스케이드의 성분들, 리보좀 또는 바이러스와 같은 복합 구조의 성분(들), T 세포, B 세포, NK 세포, 수상돌기 세포, 단핵세포, 대식세포 등과 같은 항원 제시 세포 및 반응에 대한 면역세포와 같은 다양한 세포 상의 세포내 상호작용 분자, 및 본 기술분야에서 공지된 그 밖의 다른 단백질 쌍이 포함된다. 프로테아제 및 프로테아제 인식부위를 갖는 단백질은 이들 각각이 부착되거나 연합된 어떤 단백질, 예를 들어, A 또는 B에 관해서 상호교환이 가능하다.

리포터

리포터는 활성 리포터 활성화 분자의 활성에 대한 반응으로 외관 또는 기능을 변화시키며, 검출가능한 시그날을 제공하거나, 이들 변화를 추적하기 위해서 쉽게 모니터링할 수 있는 어떤 분자라도 될 수 있다. 이들 용어는 느슨하게 적용되는 것을 의미한다. 리포터 활성화 단백질은 일단 활성화되면 (또는 일부의 가능한, 불활성화된 구체예의 경우에) 리포터에서 검출가능한 변화를 야기한다. 이 변화의 검출을 사용하여 예를 들어, 시험 화합물이 단백질-단백질 상호작용을 조절했는지 여부를 측정한다. 검출가능한 시그날이 생성되는 한은 다른 비-효소 리포터 활성화 단백질이 사용될 수 있다. 따라서, 갈락토시다제, 퍼옥시다제, 루시퍼라제 등과 같은 공지의 리포터 활성화 단백질이 사용될 수 있다. 갈락토시다제 기질, 퍼옥시다제 기질, 루시퍼라제 기질, GFP 등과 같은 공지된 리포터가 사용될 수 있다.

프로테아제 및 분열부위

프로테아제는 특정 부위에서 다른 단백질을 분열시키는 잘 특정화된 효소이다. 한가지 패밀리인 Ser/Thr 프로테아제 패밀리는 세린 및/또는 트레오닌 잔기에서 분열시킨다. 다른 프로테아제에는 시스테인 또는 티올 프로테아제, 아스파르틱 프로테아제, 메탈로프로테이나제, 아미노펩티다제, 디 및 트리펩티다제, 카복시펩티다제, 및 펩티딜 펩티다제가 포함된다. 이들의 선택은 숙련된 전문가에게 맡겨지며, 본 발명에 기술된 분자로 제한될 필요는 없다. 효소가 촉매적 영역을 갖고, 이들 영역이 전체 길이 프로테아제 대신에 사용될 수 있다는 것은 잘 알려져 있다. 이러한 것도 역시 본 발명에 포함된다. 특정의 구체예는 담배 식각 바이러스 핵 봉입 A 프로테아제 (TEV), 또는 이의 활성 부분이다. 숙련된 전문가에 의해서 이해되는 바와 같이, 프로테아제에 대한 그 밖의 다른 특정의 분열부위가 또한 사용될 수도 있다.

단백질의 변형

제1 단백질은 이 시험방법의 일부의 구체예에서 상호작용 단백질에 대한 이의 결합을 증진시키기 위해서 변형될 수 있다. 예를 들어, 특정의 GPCR은 리간드 자극에 의해서 더 안정적으로, 및 더 큰 친화성으로 어레스틴에 결합하며, 이러한 증진된 상호작용은 분리된 영역, 예를 들어, C 말단 꼬리에서의 세린 및 트레오닌 잔기의 클러스터에 의해서 매개되는 것으로 공지되어 있다 [Oakley, et al, J. Biol . Chem., 274:32248-32257, 1999; 및 Oakley, et al., J. Biol . Chem., 276:19452-19460, 2001]. 이것을 예로 사용하여, 수용체 암호화 서열 자체가 수용체와 같은 막 결합된 단백질과 이것이 결합하는 단백질의 친화성이 증가하도록 변형될 수 있음은 명백하다. 이러한 변화의 예는 이의 일부분을 결합 단백질에 대해서 더 큰 친화성을 갖지만 수용체 결합 기능에 영향을 미치지 않는 또 다른 수용체의 상응하는 부분으로 치환시키는 것을 포함할 수 있는, 막 결합된 단백질, 예를 들어, 7TMR의 C 말단 부분의 변형이다.

또한, 또는 대신으로, 제2 단백질은 제1 단백질과 이의 상호작용이 증가하도록 변형될 수 있다. 예를 들어, 시험방법은 아고니스트-점유된 GPCR을 더 안정적으로, 또는 포스포릴화-독립적 방식으로 결합시키는 것으로 공지된 제2 단백질, 예를 들어, 어레스틴의 점 돌연변이, 절단, 또는 다른 변이체를 포함할 수 있다 [Kovoor, et al., J. Biol . Chem., 274:6831-6834, 1999]. 이러한 변화는 본 기술분야에서 공지된 방법을 실시하여 이루어질 수 있다.

시험 형식

본 발명은 몇 가지 구체예에서, 두 개의 단백질이 동일한 세포, 유니트 또는 반응 혼합물 내에서 발현되는 경우에 이들의 상호작용을 평가하기 위한 간단한 방법을 제공한다. 제1 구조물은 그 자체가 리포터 효소를 암호화한 폴리뉴클레오타이드에 연쇄 연결된 프로테아제, 프로테아제 부분, 또는 프로테아제 활성을 갖는 폴리펩타이드의 분열부위를 암호화한 폴리뉴클레오타이드에 연쇄 연결된 제1 폴리펩타이드를 암호화한 서열을 포함할 수 있다. "연쇄 연결된 (Concatenated)"은 기술된 서열이 융합되어 모든 요소를 함유하는 단일 폴리펩타이드로 해독될 수 있는 단일의 온전한 개방 판독 프레임을 생산하는 상황을 설명하는 것이다. 이들은 추가의 단백질 또는 펩타이드를 암호화할 수 있거나 할 수 없는 추가의 뉴클레오타이드에 의해서 분리될 수 있거나, 분리될 필요가 없을 수 있다. 재조합 세포에 삽입된 제2 구조물은 제2 단백질 및 프로테아제, 프로테아제 일부분 또는 프로테아제 활성을 암호화한 폴리펩타이드를 암호화한 폴리뉴클레오타이드 둘 다를 함유할 수 있다. 이들 요소는 함께, 표적 단백질 상호작용에 대한 이의 효과를 탐색하는 후보 약제와 조합되는 경우에 기본 시험 형식을 형성한다.

그러나, 본 발명은 또한, 각각 본 발명에 기술된 단백질의 클래스와 같은 단백질의 활성화에 의해서 자극된 다양한 리포터를 사용하여 동시에 수용체와 같은 하나 이상의 막-결합된 단백질을 시험하기 위해서 사용될 수 있다. 예를 들어, 이것은 다양한 수용체 구조물 및 다양한 리포터 활성화 단백질에 의해서 형질감염된 세포를 혼합시킴으로써, 또는 각각의 시험 수용체에 대한 다양한 효소를 융합시키고, 시험 화합물(들)로 처리한 후에 각각의 리포터 유전자의 활성을 측정함으로써 성취될 수 있다. 예를 들어, 이것은 관심이 있는 분자가 제1 수용체를 활성화시키는지 여부를 측정하고, 또한 제2 수용체와의 상호작용의 결과로 부작용이 예상될 수 있는지 여부를 측정하는데 바람직할 수 있다. 이러한 경우에는, 예를 들어, 제1 수용체 및 lacZ와 같은 제1 리포터 활성화 단백질을 암호화한 제1 세포주, 및 제2 리포터 활성화 단백질 및 GFP와 같은 제2 리포터를 암호화한 제2 세포주를 포함할 수 있다. 이 상황에서, GFP는 본 발명에서 실시되는 바와 같이 변환될 수 있다. 이 경우에 두 개의 세포주를 혼합시키고, 관심이 있는 화합물을 첨가하고, 다른 것에 대해 효과가 없으면서 하나에 대한 양성 효과를 관찰할 수 있다.

대체 형식에서 본 발명은 상호작용 단백질의 단일 쌍을 검사하는 시험방법뿐만 아니라 본 발명에서 "다중적 (multiplex)" 시험방법으로 불릴 수 있는 것이 어떤 것인지에 관한 것이다. 이러한 시험은 다양한 방법으로 수행될 수 있지만, 모든 경우에 단백질의 하나 이상의 쌍을 동시에 시험한다. 이것은 예를 들어, 각각 형질전환되거나 형질감염된 세포의 하나 이상의 샘플을 제공하여 단백질의 각각의 상호작용 쌍을 시험함으로써 성취될 수 있다. 다양한 형질전환된 세포를 하나의 용기 내에서 조합하여 동시에 시험할 수 있거나, 형질전환체의 각각의 상이한 유형을 상이한 웰에 배치한 다음에 시험할 수 있다. 대신으로, 세포는 막관통-기본 단백질과 같은 다수의 표지된 제1 단백질을 보유하도록 조작하여 리간드 또는 후보 분자가 하나 이상의 수용체를 활성화시키는지 여부를 측정하도록 할 수 있다.

본 발명에 기술된 다중 시험방법을 위해서 사용된 세포는 동일할 수 있지만, 동일할 필요는 없다. 마찬가지로, 사용된 리포터 시스템은 각각의 샘플에서 동일할 수 있지만, 동일할 필요는 없다. 샘플 또는 샘플들을 마이크로어레이 (microarray)의 웰과 같은 용기 내에 배치한 후에, 하나 또는 그 이상의 화합물을 아마도 용기 내에 배치된 다수의 상호작용 단백질 쌍에 대해서 스크리닝할 수 있다.

도 10은 본 발명의 시험방법을 사용하여 수득된 통상적인 결과를 나타내는 것이다. 저 또는 고 농도에서 (조절이 억제성인지 활성화성인지 여부에 따름) 시험 화합물은 효과가 없을 수 있다. 시험 화합물의 농도가 감소하거나 증가함에 따라서, 조절효과가 변화할 수 있다. 도 10에 나타낸 것과 같은 용량 반응 곡선을 사용하여 조절작용을 평가할 수 있다. 단일 점이 또한 평가될 수 있다. 예를 들어, 점은 종종 데이터를 축적하거나, "표준" 대상체의 다수의 샘플을 처리하여 표준 오차 및 편차를 갖는 샘플 집단 평균값을 수득함으로써 통계학적 기준으로 결정된, 대조군 또는 배경과는 상이한 선결된 값일 수 있다. 일 상수가 선결된 차이 값으로서 사용될 수 있다. 일반적으로, 전문가는 예를 들어, 대조군의 적어도 10%, 더욱 흔하게는 대조군의 배수, 예를 들어, 또 다른 시험 처리에서 선결될 수 있는 대조군 값의 약 1.5, 2, 2.5, 3, 4, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 500, 1000배 또는 그 이상 (또는 이의 역수)의 비를 사용한다. 조절을 나타내기 위한 선결된 역치는 상황이 암시하거나 필요로 하는 바에 따라 제1 및 2 형 오차를 고려하여 숙련된 전문가에 의해서 일상적으로 계산된다.

키트

본 발명에 기술된 조성물 및 이의 조합물 중의 어떤 것이라도 키트 내에 제공될 수 있다. 따라서, 키트는 적합한 용기(들) 내에 하나 또는 그 이상의 성분들, 예를 들어, 본 발명의 벡터 또는 세포, 및 본 발명에 따라 사용될 수 있는 어떤 추가의 약제를 포함할 수 있다.

키트는 본 발명의 하나 또는 그 이상의 적합하게 등분된 조성물을 포함할 수 있다. 키트의 성분들은 수성 매질 내에, 또는 동결건조된 형태로 또는 용질에 대한 적합한 용매 중의 농축물로서 포장될 수 있다. 키트의 용기(들)는 일반적으로, 성분이 배치될 수 있거나, 배치되고 바람직하게는 적합하게 등분된 적어도 하나의 바이알, 시험관, 플라스크, 병, 시린지 또는 그 밖의 다른 용기를 포함한다. 키트 내에 하나 이상의 성분이 존재하는 경우에, 키트는 또한, 일반적으로 추가의 성분이 별도로 배치될 수 있는 제2, 3 또는 그 밖의 다른 추가의 용기를 포함할 수 있다. 그러나, 성분들의 다양한 조합이 바이알과 같은 단일 용기 내에 포함될 수 있다. 또한, 적합한 희석제가 제공될 수 있다. 본 발명의 키트는 또한, 일반적으로 상업적 판매를 위한 밀폐된 차단체 (close confinement) 내에 시약 용기를 함유시키기 위한 수단을 포함할 수 있다. 이러한 용기는 인쇄된 설명서와 함께, 원하는 바이알이 그 안에 보존되는 사출 또는 취입-성형된 플라스틱 또는 포움 용기를 포함할 수 있다.

키트의 성분들이 하나 및/또는 그 이상의 액체 용액으로 제공되는 경우에, 액체 용액은 특히 유용한 멸균 수용액과 같은 수용액일 수 있다. 그러나, 키트의 성분들은 건조 분말(들)로서, 또는 고체 지지체 상에 제공될 수 있다. 시약 및/또는 성분들이 건조 분말로 제공되는 경우에, 분말은 적합한 용매를 첨가함으로써 재구성될 수 있다. 멸균수 또는 적합한 식염수 또는 완충액과 같은 용매가 또한 또 다른 용기 내에 제공될 수도 있는 것으로 생각된다.

실시예

본 발명을 설명하는 특정의 구체예는 이하의 실시예에 제시될 수 있지만, 본 발명은 이들로 제한되는 것으로 생각되지는 않아야 한다.

실시예 1

도 1은 이의 활성이 그 안에 함유된 TEV 프로테아제 인식부위 상에 TEV 프로테아제를 작용시킴으로써 재구성되는 변환된 불활성 루시퍼라제를 포함하는 구체예를 나타낸다. 나타낸 바와 같은 제1 단백질은 프로테아제와 융합된다. 실시예 1은 TEV 프로테아제 활성을 사용하여 제2 단백질의 구체예로서 변환된 루시퍼라제의 활성을 재구성하도록 디자인되었다. 나타낸 바와 같은 제2 단백질은 불활성, 변환된 리포터 활성화 단백질인 루시퍼라제와 융합된다. 관심이 있는 단백질에 융합된 프로테아제에 의해서 인식된 프로테아제 인식 및 분열부위를 변환된 리포터 활성화 단백질 내에 삽입한다. 제1 단백질 및 제2 단백질을 제1 단백질과 제2 단백질 사이의 상호작용을 조절하는 제3 분자에 근접하게 유도한다. 근접부에서 융합 프로테아제에 의한 변환된, 불활성 리포터 활성화 단백질의 단백분해는 변환된 리포터 활성화 단백질의 두 개의 단편을 형성하는 분열을 야기하여 활성 리포터 활성화 단백질을 재생시킨다. 리포터 활성화 단백질의 활성은 적절한 시약 및 장치에 의해서 평가될 수 있다.

변환된 루시퍼라제는 TEV 프로테아제 인식부위 ENLYFQX (서열번호 3)에 의해서 단속된 반딧불이 루시퍼라제 N 말단 아미노산 2 내지 233 및 C 말단 아미노산 234 내지 550을 역순으로 재배열함으로써 구성되었다. 이 부위에서의 분열은 변환된 루시퍼라제의 재구성된 활성을 제공한다. 위치 X는 TEV 프로테아제 인식 친화성 및 분열 효율을 지시하는 어떤 아미노산이라도 될 수 있다. 다양한 X는 TEV의 효소 반응속도를 조절하는 것으로 나타났다. 인식 서열의 다른 부위에서의 유사한 아미노산 치환도 또한 반응속도를 변화시킬 수 있다. 반응속도를 조절하는 것은 스크리닝 과정에서의 배양 시간, 및 시그날/노이즈 (noise) 파라메터에 영향을 미치는 배경 활성을 최적화시키는데 유리하다. 그 후, 변환된 루시퍼라제 (luc234X233, 여기에서 X는 TEV 헵타펩타이드 분열부위, 서열번호 3의 N 말단에서의 특정한 아미노산이다)를 GPCR, ADRB2의 C 말단에 융합시켜 GPCR-변환된 루시퍼라제, ADRB2-luc234X233, 발현 플라스미드를 생성시켰다.

실시예 2

인간 β 어레스틴 2-TEV 융합 플라스미드는 담배 식각 바이러스 프로테아제 A를 β 어레스틴 2의 C 말단에 융합시킴으로써 구성되었다. 모든 DNA 단편은 적절한 주형을 사용하여 PCR에 의해서 생성되었다. GPCR-luc234X233 융합 유전자는 네오마이신 선택 마커를 갖는 pcDNA3.1(+) (Invitrogen) 내에 서브클로닝하고, Arr-TEV 융합 유전자는 제오신 선택 마커를 갖는 pcDNA3.1(+) (Invitrogen Cat. #43-0018) 내에 서브클로닝하였다.

실시예 3

CHO-K1 세포를 적절한 상업용 형질감염 키트를 사용하여 ADRB2-luc234R233 (실시예 1) 및 Arr-TEV 플라스미드 (실시예 2)로 공동-형질감염시켰다. 형질감염시킨지 48 시간 후에, 세포를 2 시간 동안 10 μM ADRB2 아고니스트, 이소프로테레놀에 의해서, 또는 이것이 없이 처리하고, 세포에 브라이트 (Bright)-GLO^TM 또는 스테디 (Steady)-GLO^TM (Promega)를 첨가하고, 용해물의 상대 발광을 적절한 발광 판독장치에 의해서 기록하였다. 발광 활성에 있어서의 3배 이상의 증가가 이소프로테레놀의 존재 하에서 관찰되었다.

도 5는 Arr2-TEVp의 존재 및 부재 하에서의 GPCR/변환된 루시퍼라제의 발현을 나타낸다. 그래프에 나타낸 데이터에서, 구조물은 세포 내로 도입되었지만, 형질감염된 세포는 어떤 조절물질에도 노출되지 않았다. 따라서, 데이터는 분열부위가 세린을 함유하는 경우에는 약간의 자발적 활성이 있지만, X가 R 또는 V인 경우에는 본질적으로 배경 노이즈가 발생하지 않음을 나타낸다. 도 6에 나타낸 바와 같이, R 또는 V 분열부위를 발현하는 세포가 아고니스트에 노출된 경우에, 반응이 관찰되었다. 도 7은 일시적으로 또는 안정적으로 GPCR-luc234V233 및/또는 Arr-TEV를 발현하는 세포에서 루시퍼라제 활성의 용량-의존적 반응을 나타낸다.

실시예 4

도 8은 5 시간 또는 1 시간 배양기간이 단백질-단백질 상호작용을 시험하는데 충분함을 보여준다. 용량 반응 관계가 명백하게 나타난다.

ADRB2-TEV 융합 유전자 발현 플라스미드는 담배 식각 바이러스 프로테아제 A를 ADRB2의 C 말단에 융합시키고, 융합 유전자를 제오신 선택 마커를 갖는 pcDNA3.1(+) (Invitrogen Cat #43-0018) 내에 삽입함으로써 구성되었다. 모든 DNA 단편은 본 기술분야에서 공지된 바와 같이 적절한 주형을 사용한 PCR에 의해서 생성되었다.

β 어레스틴 2-변환된 루시퍼라제 (Arr-luc234X233) 융합 유전자 발현 플라스미드는 변환된 루시퍼라제 luc234X233을 β 어레스틴 2의 C 말단에 융합시킴으로써 구성되었다. TEV 프로테아제 분열부위는 ENLYFQ/X [Rachel B. Kapust, et al. Biochemical & Biophysical Research Communications, 294 (2002) 949-955]이며, 여기에서 E 및 Q는 일반적으로 불변하고, X는 어떤 아미노산이라도 될 수 있지만, G 및 S는 그 부위에서 발견되는 통상적인 아미노산이다. 분열은 Q 및 X 잔기 사이에서 일어난다. X는 분열 효율을 결정할 수 있다. 일부의 구체예에서, TEV 프로테아제 분열부위는 변환된 루시퍼라제 내에 포함되었다. 배경 및 시그날/노이즈 비는 단순한 일상적 실험에 의해서 개선될 수 있다. 예를 들어, TEV에 대한 X 가수분해 부위에서 글리신 대신에 발린을 사용하는 것은 일부의 적용에서 배경을 저하시키는 것으로 나타났다. 융합된 융합 유전자는 네오마이신 선택 마커를 갖는 pcDNA3.1(+) (Invitrogen) 내에 클로닝되었다.

HEK293 세포를 적절한 상업용 형질감염 키트를 사용하여 플라스미드 ADRB2-TEV 및 Arr-luc234V233 (여기에서, TEV 인식 서열은 ENLYFQV (서열번호 12)이다)에 의해서 공동-형질감염시켰다. 형질감염시킨지 48 시간 후에, 세포를 다양한 농도의 ADRB2 아고니스트, 이소프로테레놀로 1 및 5 시간 동안 처리하고, 브라이트 (Bright)-GLO^TM (Promega)를 세포에 첨가하고, 상대 발광 유니트를 엔비젼 (EnVison) II^TM 상에 기록하였다. 용량-의존적 발광 활성이 이소프로테레놀과의 1 시간 및 5 시간 배양 후 모두에서 관찰되었다.

실시예 5

도 9의 좌측 패널은 Arr-luc234V233을 안정적으로 발현하고, ADRB2-TEV 융합 단백질을 일시적으로 발현하는 HEK293 세포 내에서의 리간드-유도된 루시퍼라제 활성을 나타낸다. 우측 패널은 CHO 세포 내에서 어레스틴-리포터 활성화 단백질 구조물의 안정적 발현 및 7TMR-프로테아제 융합물의 일시적 발현을 나타낸다.

GPCR-luc234R233 또는 Arr-TEV를 발현하는 안정한 세포주를 HEK293 또는 CHO 세포에서 생성시켰다. 20 ng/웰의 각각의 DNA를 HEK293 및 TranIT-CHO 세포를 위해 리포펙타민 (Invitrogen)과 함께 12-웰 플레이트 내에서의 형질감염을 위해서 사용하였다.

per-luc 시험에서는, 384-웰 플레이트 형식이 일상적으로 사용되었다. 그 밖의 다른 플레이트 형식이 허용될 수 있는 형식으로 생각되었다. GPCR-luc234R233 또는 Arr-TEV를 안정적으로 발현하는 CHO 세포를 조직 배양-처리된 표면 384-웰 화이트 시험 플레이트 (Becton Dickinson) 내에서 웰당 10,000 세포로 플레이팅하였다. 다음날, 세포를 10 μM 내지 0.7 pM (혈청-부재 세포 배지 내에서 만들어진 3:1 계열 희석액으로) 농도의 아고니스트로 처리하였다. 스테디-글로 (Steady-Glo) 루시퍼라제 시험 시스템 (Promega)이 루시퍼라제 활성을 측정하기 위해서 사용되었다. 아고니스트 처리한지 2 시간 후에, 배지를 흡인하고, 25 μl 루시퍼라제 시험 시약을 각각의 웰에 첨가하였다. 상대 발광 유니트 (RLU)는 퍼킨 엘머 (Perkin Elmer)의 멀티라벨 판독장치인 엔비젼 (EnVision) 상에서 판독하였다. 데이터는 PRISM 소프트웨어에 의해서 도시하고, 분석하였다.

Arr-luc234V233을 안정적으로 발현하는 HEK293 세포는 네오마이신에 대한 내성에 관한 선택에 의해서 생성되었다. 네오마이신 내성 유전자는 Arr-luc234V233 발현 플라스미드 벡터 pcDNA3.1 내에 존재한다.

실시예 6

도 9, 우측 패널은 CHO 세포주에서 이소프로테레놀에 대한 용량 반응을 나타낸다. GPCR-luc234R233 또는 Arr-TEV를 발현하는 안정한 세포주를 CHO 세포에서 생성시켰다. 12-웰 플레이트 내의 각 웰당 1 μg의 각각의 DNA를 트랜스펙트IT (TransfectIT)-CHO 형질감염 키트 (Mirus Bio, Madison, WI)와 함께 형질감염에 사용하였다. 단일 콜로니를 네오마이신 또는 제오마이신에 의한 선택 하에서 형질감염체로부터 수확하였다.

Arr-luc234V233를 안정하게 발현하는 세포를 적절한 상업용 형질감염 키트를 사용하여 ADRB2-TEV 플라스미드로 형질감염시켰다. ADRB2-TEV를 일시적으로 발현하고, Arr-luc-234V233을 안정적으로 발현하는 세포를 이소프로테레놀과 함께 2 시간 동안 배양하고, 브라이트 (Bright-GLO^TM) 루시퍼라제 시약을 세포에 첨가하였다. 용량-의존적 루시퍼라제 활성을 엔비젼 (EnVison) II 상에서 기록하였다.

실시예 7

도 10은 아고니스트, 부분적 아고니스트, 길항제, 및 비-특이적 내인성 수용체 반응에 대한 GPCR Per-Luc 시험의 평가를 나타낸다.

Arr-luc234V233을 안정적으로 발현하는 HEK293 세포를 리포펙타민 (Lipofectamine) 2000 형질감염 시약 (Invitrogen)을 사용하여 ADRB2-TEV 플라스미드로 형질감염시켰다. 형질감염시킨지 48 시간 후에, 세포를 HEK293 내인성 EDG 수용체에 대한 다양한 농도의 공지된 아고니스트, 이소프로테레놀; 부분적 아고니스트 BRL37344 (Sigma-Aldrich); 길항제 ICI118551 (ICI); 200 nM의 이소프로테레놀을 갖는 길항제 ICI118551; 및 아고니스트 S1P (스핑고신-1-포스페이트)와 함께 2 시간 동안 배양하고, 브라이트 (Bright)-GLO^TM 루시퍼라제 시약을 세포에 첨가하였다. 용량-의존적 루시퍼라제 활성은 도 10에 나타낸 바와 같이 엔비젼 (EnVison) II 상에서 기록하였다.

시험의 EC50 및 IC50 값은 FLIPR 및 cAMP 시험에서 수득된 값과 유사하였다. HEK293 세포에서 내인성 수용체 EDG 및 이의 리간드 S1P는 루시퍼라제 활성에 영향을 미치지 않은 반면에, FLIPR 및 cAMP와 같은 다른 시험은 양성 시그날을 생성시켰다. 아고니스트인 이소프로테레놀은 반응을 야기하였다. 부분적 아고니스트 BRL37344는 단계적인 반응을 나타내었다. 길항제 ICI18551은 이소프로테레놀을 억제하였지만, 단독으로 활성을 나타내지는 않았다. 따라서, 본 시험은 특이적이며, 도 10에 나타낸 바와 같이 (다른 비교 데이터와 함께 고려하여) 보다 적고 감소된 거짓 양성 시그날을 제공한다.

실시예 8

도 14는 변환된 루시퍼라제가 반딧불이 루시퍼라제 N 말단 아미노산 2 내지 456을 X에 대해서 V를 사용하여 TEV 프로테아제 인식부위 ENLYFQX를 갖는 C 말단 아미노산 234 내지 550 뒤에 클로닝함으로써 구성된 경우의 예를 나타낸다. 변환된 루시퍼라제 (luc234V456)를 GPCR, ADRB2의 C 말단에 융합시켜 GPCR-변환된 루시퍼라제 구조물, ADRB2-luc234V456 발현 플라스미드를 생성시켰다.

모든 DNA 단편은 적절한 주형을 사용한 PCR에 의해서 생성되었다. ADRB2-luc234V456 융합 유전자는 네오마이신 선택 마커를 갖는 pcDNA3.1(+) (Invitrogen) 내에 클로닝하였다.

CHO-K1 세포를 적절한 상업용 형질감염 키트를 사용하여 ADRB2-luc234V456 및 Arr-TEV 플라스미드로 공동-형질감염시켰다. 형질감염시킨지 48 시간 후에, 세포를 10 μM ADRB2 아고니스트, 이소프로테레놀에 의해서, 또는 이것이 없이 2 시간 동안 처리하고, 브라이트 (Bright)-GLO^TM 또는 스테디 (Steady)-GLO^TM (Promega)를 세포에 첨가하고, 상대 발광을 적절한 발광 판독장치에 의해서 기록하였다. 재구성된 루시퍼라제 활성은 다양한 용량의 이소프로테레놀에 대한 반응으로 관찰되었다.

Arr-luc234V233을 안정적으로 발현하는 HEK293 세포를 네오마이신에 대한 내성에 관해서 선택하였다. 네오마이신 내성 유전자는 Arr-luc234V233 발현 플라스미드 벡터 pcDNA3 내에 존재하였디. 아고니스트에 대한 반응으로 루시퍼라제 활성이 관찰되었다.

실시예 9

도 13은 V2 역 아고니스트에 의한 용량 의존성을나타낸다.

본 실시예에서는, Arr-luc234V233을 안정적으로 발현하는 HEK293 세포를 리포펙타민 2000 형질감염 시약 (Invitrogen)을 사용하여 V2-TEV 플라스미드로 형질감염시켰다. 형질감염시킨지 48 시간 후에, 세포를 표준 시험방법을 사용하여 길항제로 생각되는 화합물, SR121463 (sanofi Recherche, Toulouse, FR)의 다양한 농도와 함께 2 시간 동안 배양하였다. 브라이트 (Bright)-GLO^TM 루시퍼라제 시약을 세포에 첨가하였다. 용량-의존적 루시퍼라제 활성은 엔비젼 (EnVison) II 상에 기록하였다. 즉, 발광의 상승 레벨은 더욱 적절하게 정의된 역 아고니스트인 SR121463의 증가량에 의해서 관찰되었다.

이 시험에서, 역 아고니스트는 다른 역 아고니스트와 마찬가지로 아고니스트로서 행동한다. 역 아고니스트는 V2 G 단백질 시그날 경로를 차단할 수 있는 반면에 MAPK의 β 어레스틴-매개된 활성화를 촉진하는 것으로 공지되어 있다 [Azzi et al., PNAS, 2003, 100:11406-11411]. 따라서, 본 발명의 시험방법은 G 단백질-커플링된 수용체에 대한 뚜렷한 활성 입체배좌를 나타낼 수 있다.

반대로, 전통적인 시험 시스템에서 GPCR의 역 아고니스트는 길항제로서 행동한다. 이것은 역 아고니스트가 아마도 G 단백질 시그날링을 위한 GPCR의 불활성 입체배좌에 결합하여 이것을 안정화시키기 때문이다. 그러나, 일부의 역 아고니스트는 G 단백질 시그날링을 위한 GPCR의 불활성 형태를 안정화시킬 뿐만 아니라, 또한 GPCR에 대한 β 어레스틴 동원을 촉진시켜 β 어레스틴 시그날링 경로를 활성화시켰다.

실시예 10

도 6은 아고니스트-유도된 루시퍼라제 활성을 나타낸다.

본 실시예에서, 변환된 루시퍼라제는 TEV 프로테아제 인식부위, ENLYFQX에 의해서 단속된 반딧불이 루시퍼라제 N 말단 아미노산 2 내지 233 및 C 말단 아미노산 234 내지 550을 재배열함으로써 구성되었다. 위치 X는 어떤 아미노산이라도 될 수 있다. 이 위치에서의 아미노산은 TEV 프로테아제 인식 친화성 및 분열 효율을 결정하는 것으로 알려져 있다. 그 후, 변환된 루시퍼라제 (luc234X233)를 GPCR, 즉 ADRB2의 C 말단에 융합시켜 GPCR-변환된 루시퍼라제, 즉 ADRB2-luc234X233 발현 플라스미드를 생성시켰다.

인간 β 어레스틴 2-TEV 융합 플라스미드는 담배 식각 바이러스 A를 β 어레스틴 2의 C 말단에 융합시킴으로써 구성되었다. DNA 단편은 적절한 주형을 사용한 PCR에 의해서 생성되었다. GPCR-luc234X233 융합 유전자는 네오마이신 선택 마커를 갖는 pcDNA3.1(+) (Invitrogen) 내에 서브클로닝하고, Arr-TEV 융합 유전자는 제오신 선택 마커를 갖는 pcDNA3.1(+) (Invitrogen Cat #43-0018) 내에 서브클로닝하였다.

CHO-K1 세포를 적절한 상업용 형질감염 키트를 사용하여 ADRB2-luc234R233 및 Arr-TEV 플라스미드로 공동-형질감염시켰다. 형질감염시킨지 48 시간 후에, 세포를 10 μM의 ADRB2 아고니스트, 이소프로테레놀에 의해서, 또는 이것이 없이 2 시간 동안 처리하고, 브라이트 (Bright)-GLO^TM 또는 스테디 (Steady)-GLO^TM (Promega)를 세포에 첨가하고, 상대 발광을 적절한 발광 판독장치에 의해서 기록하였다. 발광 활성에 있어서의 3배 이상의 증가가 이소프로테레놀의 존재 하에서 관찰되었다.

실시예 11

도 12는 본 발명 (좌측 패널) 및 또 다른 시험방법 (우측 패널)을 사용한 아고니스트, 길항제 및 역 아고니스트의 결과를 나타낸다. 두 개의 플롯은 아고니스트, 길항제 및 역 아고니스트의 구별 및 반작용을 나타낸다. 본 시험방법은 우수한 특이적 활성을 제공한다.

실시예 12

도 7은 ADRB2-변환된 루시퍼라제 및 Arr-TEV 둘 다를 갖는 CHO 세포를 나타낸다. 좌측 패널, ADRB2-luc234V233의 데이터는 TEV 인식부위, ENLYFQV를 함유하도록 만들어졌다. CHO-K1 세포를 적절한 상업용 형질감염 키트를 사용하여 ADRB2-luc234V233 및 Arr-TEV 플라스미드로 공동-형질감염시켰다. 형질감염시킨지 48 시간 후에, 세포를 다양한 농도의 ADRB2 아고니스트 이소프로테레놀로 2 시간 동안 처리하고, 브라이트 (Bright)-GLO^TM 또는 스테디 (Steady)-GLO^TM (Promega)를 세포에 첨가하고, 상대 발광을 적절한 발광 판독장치에 의해서 기록하였다.

실시예 13

도 7의 우측 패널은 상이한 분열부위에 의해서 안정적으로 형질감염된 세포를 사용한 데이터를 요약한 것이다. 결과는 좌측 패널의 결과와 유사하다. 따라서, 상이한 분열부위를 갖는 두 개의 GPCR-루시퍼라제 구조물은 아고니스트에 대해 반응하였다.

실시예 14

도 6은 R로서 X 및 V로서 X를 비교한 아고니스트-유도된 시그날 활성을 나타낸다. 결과는 유사하며, X가 일상적으로 변화될 수 있음을 보여준다.

본 실시예에서, 변환된 루시퍼라제는 TEV 프로테아제 인식부위, ENLYFQ/X에 의해서 단속된 반딧불이 루시퍼라제 N 말단 아미노산 2 내지 233 및 C 말단 아미노산 233 내지 550을 재배열함으로써 구성되었다. 위치 X는 TEV 프로테아제 인식 친화성 및 분열 효율을 결정하는 어떤 아미노산이라도 될 수 있다. V 및 R이 표시된다. 그 후, 변환된 루시퍼라제 (luc234X233)를 GPCR, 즉 ADRB2의 C 말단에 융합시켜 GPCR-변환된 루시퍼라제, 즉 ADRB2-luc234X233 발현 플라스미드를 생성시켰다.

본 실시예에서, 인간 β 어레스틴 2-TEV 융합 플라스미드는 담배 식각 바이러스 A를 β 어레스틴 2의 C 말단에 융합시킴으로써 구성되었다. 모든 DNA 단편은 적절한 주형을 사용한 PCR에 의해서 생성되었다. GPCR-luc234X233 융합 유전자는 네오마이신 선택 마커를 갖는 pcDNA3.1(+) (Invitrogen) 내에 서브클로닝하고, Arr-TEV 융합 유전자는 제오신 선택 마커를 갖는 pcDNA3.1(+) (Invitrogen Cat #43-0018) 내에 서브클로닝하였다.

CHO-K1 세포를 적절한 상업용 형질감염 키트를 사용하여 ADRB2-luc234R233 및 Arr-TEV 플라스미드로 공동-형질감염시켰다. 형질감염시킨지 48 시간 후에, 세포를 10 μM의 ADRB2 아고니스트에 의해서, 또는 이것이 없이 2 시간 동안 처리하고, 브라이트 (Bright)-GLO^TM 또는 스테디 (Steady)-GLO^TM (Promega)를 세포에 첨가하고, 상대 발광을 적절한 발광 판독장치에 의해서 기록하였다. 발광 활성의 3배 이상 더 높은 레벨은 이소프로테레놀의 존재 하에서 관찰되었다.

실시예 15

도 11의 좌측 패널은 V2-TEV를 일시적으로 발현하는 세포에서 8-AVP 아고니스트에 의한 결과를 나타낸다.

본 실시예에서는, Arr-luc234V233을 안정적으로 발현하는 HEK293 세포를 리포펙타민 2000 형질감염 시약 (Invitrogen)을 사용하여 V2-TEV 플라스미드로 형질감염시켰다. 48 시간 후에, 세포를 다양한 농도의 아고니스트 8-AVP (Arg⁸ 바소프레신, V2 바소프레신 수용체의 공지된 아고니스트)와 함께 2 시간 동안 배양하고, 브라이트 (Bright)-GLO^TM 루시퍼라제 시약을 세포에 첨가하였다. 용량-의존적 루시퍼라제 활성은 엔비젼 (EnVison) II 상에 기록하였다.

실시예 16

Arr-luc234V233을 안정적으로 발현하는 HEK293 세포를 리포펙타민 2000 형질감염 시약 (Invitrogen)을 사용하여 V2-TEV 플라스미드로 형질감염시켰다. 48 시간 후에, 세포를 다양한 농도의 역 아고니스트와 함께 2 시간 동안 배양하고, 브라이트 (Bright)-GLO^TM 루시퍼라제 시약을 세포에 첨가하였다. 용량-의존적 루시퍼라제 활성은 엔비젼 (EnVison) II 상에 기록하였다.

본 시험에서, 역 아고니스트는 아고니스트로 행동한다. 일부의 역 아고니스트는 V2 G-단백질 시그날 경로를 차단하지만, MAPK의 β 어레스틴-매개된 활성화를 촉진시키는 것으로 알려져 있다 [Azzi et al., PNAS, 2003 100:11406-11411]. 따라서, 이 시험은 G 단백질-커플링된 수용체의 뚜렷한 활성 입체배좌를 평가할 수 있다.

실시예 17

도 11의 우측 패널은 V2 수용체와의 β 어레스틴 상호작용을 촉진시킴으로써 V2 역 아고니스트-생성된 용량-의존적 루시퍼라제 활성을 나타낸다.

본 실시예에서는, Arr-luc234V233을 안정적으로 발현하는 HEK293 세포를 리포펙타민 2000 형질감염 시약 (Invitrogen)을 사용하여 V2-TEV 플라스미드로 형질감염시켰다. 48 시간 후에, 세포를 다양한 농도의 역 아고니스트와 함께 2 시간 동안 배양하고, 브라이트 (Bright)-GLO^TM 루시퍼라제 시약을 세포에 첨가하였다. 용량-의존적 루시퍼라제 활성은 엔비젼 (EnVison) II 상에 기록하였다.

본 발명의 다른 특징은 숙련된 전문가에게 명백할 것이며, 여기에서 반복할 필요는 없다. 전문가는 본 발명의 취지 및 범주를 벗어남이 없이 다양한 변형을 만들 수 있다.

본 발명에서 인용된 모든 참고문헌은 본 발명에 온전히 참고로 포함된 것이다.

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1 5 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> DNA for cleavage site /V <400> 13 gagaacctgt acttccaggt c 21 <210> 14 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> recognition site <400> 14 Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Arg 1 5 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> recognition site <400> 15 gagaacctgt acttccagcg c 21

Claims (30)

1. i) 불활성 리포터 활성화 단백질에 부착된 제1 단백질, 및 상기 리포터 활성화 단백질 내의 분열부위를 분열시킴으로써 상기 리포터 활성화 단백질을 활성화시킬 수 있는 프로테아제에 부착된 제2 단백질을 제공하고;
   ii) 제1 단백질과 제2 단백질의 상호작용을 조절하는 화합물, 및 임의로 리포터를 제공하고;
   iii) 상기 프로테아제가 상기 분열부위를 분열시키도록 하고;
   iv) 이의 시그날이 상기 리포터 활성화 단백질의 활성에 의해서 변화된 상기 활성화된 리포터 활성화 단백질 또는 상기 리포터로부터의 리포터 시그날을 모니터링 (여기에서, 리포터 시그날에서의 변화는 상기 단백질-단백질 상호작용을 나타낸다)하는 것을 포함하여, 제1 단백질과 제2 단백질의 상호작용을 조절하는 화합물을 확인하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 리포터 활성화 단백질이 리포터인 방법.
3. 제1항에 있어서, 제1 단백질이 상기 리포터 활성화 단백질과의 융합 단백질을 형성하는 방법.
4. 제1항에 있어서, 추가로 단백질-단백질 상호작용을 조절하는 것으로 공지된 분자를 제공하는 것을 포함하며, 여기에서 상기 화합물은 상기 분자와 상기 단백질-단백질 상호작용의 상호작용을 조절하는 방법.
5. 제1항에 있어서, 리포터 활성화 단백질이 효소인 방법.
6. 제1항에 있어서, 리포터 활성화 단백질이 리포터의 형광의 변화를 야기하는 단백질인 방법.
7. 제1항에 있어서, 제1 단백질이 막 단백질인 방법.
8. i) 잠복성 리포터 활성화 단백질을 포함하는 제1 단백질; 및
   ii) 프로테아제를 포함하는 제2 단백질; 및 임의로,
   iii) 이의 시그날이 상기 리포터 활성화 단백질에 의해서 변화되는 리포터를 포함하며,
   여기에서, 상기의 잠복성 리포터 활성화 단백질은 상기 프로테아제에 의한 분열에 의해서 활성화되고, 상기 제1 단백질과 제2 단백질의 회합은 상기 리포터 활성화 단백질의 분열을 허용하는 시험 시스템.
9. 제8항에 있어서, 상기 리포터 활성화 단백질이 상기 리포터인 시스템.
10. 제8항에 있어서, 상기 리포터가 상기 리포터 활성화 단백질의 폴리펩타이드 단편의 재배열에 의해서 활성화 또는 불활성화되는 시스템.
11. 제8항에 있어서, 상기 제1 단백질, 제2 단백질 또는 둘 다가 막 단백질인 시스템.
12. 제11항에 있어서, 상기 막 단백질이 수용체 단백질인 시스템.
13. 제12항에 있어서, 상기 수용체 단백질이 7회 막관통 수용체 (7TMR)인 시스템.
14. 제8항에 있어서, 상기 프로테아제가 적어도 4 개의 아미노산을 갖는 인식 서열을 갖는 시스템.
15. 제8항에 있어서, 상기 프로테아제가 적어도 5 개의 아미노산을 갖는 인식 서열을 갖는 시스템.
16. 제8항에 있어서, 상기 프로테아제가 적어도 6 개의 아미노산을 갖는 인식 서열을 갖는 시스템.
17. 제8항에 있어서, 상기 프로테아제가 적어도 7 개의 아미노산을 갖는 인식 서열을 갖는 시스템.
18. 제8항에 있어서, 상기 프로테아제가 담배 식각 바이러스 (TEV) 프로테아제인 시스템.
19. 제8항에 있어서, 상기 리포터가 루시페린인 시스템.
20. 제8항에 있어서, 상기 리포터가 형광 단백질인 시스템.
21. 제20항에 있어서, 상기 리포터가 녹색 형광 단백질 (GFP)인 시스템.
22. 제11항에 있어서, 상기 제1 단백질 및 상기 제2 단백질이 막 단백질인 시스템.
23. 제8항에 있어서, 상기 제1 단백질, 상기 제2 단백질 또는 둘 다가 세포질성 단백질인 시스템.
24. 제23항에 있어서, 상기 제1 및 상기 제2 단백질이 세포질성 단백질인 시스템.
25. 제8항에 있어서, 상기 제2 단백질이 상기 리포터를 포함하는 시스템.
26. 제25항에 있어서, 상기 리포터 단백질이 상기 제1 단백질과 접촉에 의해서 활성화 또는 불활성화되는 변환된 리포터 단백질인 시스템.
27. 제8항에 있어서, 회합이 상기 제1 단백질 또는 상기 제2 단백질의 세포성 구획 또는 세포기관으로의 전좌를 필요로 하는 시스템.
28. 제27항에 있어서, 상기 제1 단백질 또는 상기 제2 단백질의 핵으로의 전좌가 리포터 시그날의 변화를 야기하는 시스템.
29. 제8항에 있어서, 상기 리포터 또는 상기 프로테아제가 핵 표적화 폴리펩타이드를 포함하는 시스템.
30. 제29항에 있어서, 상기 표적화 폴리펩타이드가 염기성 아미노산을 포함하는 시스템.

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