CN110358738A - 一种稳定测定抗IgE抗体药物生物学活性的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种稳定测定抗IgE抗体药物生物学活性的方法，所述方法是基于构建稳定表达FcεRIα与NFAT报告基因的效应细胞系所建立的生物活性检测方法，该方法可以快速方便的检测抗IgE抗体的生物活性，具有较高的特异性、敏感性、准确性和精密性。本发明同时公开了构建含有报告基因的高表达FcεRIα的细胞株的构建方法以及含有该细胞株的产品。

Description

一种稳定测定抗IgE抗体药物生物学活性的方法
技术领域
本发明涉及生物药物活性检测领域，涉及一种稳定测定抗IgE抗体药物生物学活性的方法。
背景技术
单克隆抗体(单抗)是一种重要的生物技术产品，具有特异性高、靶向性强、疗效确切等优点，目前已经成为全球医药市场的重要组成部分，并贡献了主要的市场扩容力量。单抗的适应症除了集中在肿瘤外，也已经扩展到自身免疫性疾病、I型超敏反应等疾病领域，并获得良好的治疗效果。
I型超敏反应又称速发型超敏反应，主要由针对特异变应原的IgE所主导，其反应发生迅速，通常引起效应器官功能紊乱，具有明显的个体差异和遗传倾向，包括过敏性哮喘、特应性皮炎、过敏性鼻炎、食物过敏等。I型超敏反应分为致敏阶段和激发阶段，变应原进入机体后可刺激B细胞产生特异性IgE抗体，其Fc段与肥大细胞和嗜碱性粒细胞表面的IgE高亲和力受体FcεRI结合，使机体处于致敏状态。当相同变应原再次进入机体后，特异性IgE抗体的Fab段识别并结合变应原，激发下游一系列信号蛋白的磷酸化，最终促发靶细胞的膜通透性变化，释放脱颗粒效应介质，如组胺、花生白三烯、前列腺素D2等，引起一系列病理效应。
奥马珠单抗(Omalizumab，商品名茁乐)是一种IgG1κ型人源化抗IgE抗体，于2002年、2003年、2005年、2009年先后在澳大利亚、美国、欧盟、日本上市，用于治疗中-重度持续性哮喘(6岁及6岁以上皮试阳性或体外常年发生过敏原反应且吸入型糖皮质激素控制不佳的中度至重度持续性哮喘)。2014年3月在欧洲和美国批准用于12岁及12岁以上H1抗组胺药治疗后仍有慢性特发性荨麻疹症状的成年和青少年患者。
奥马珠单抗与可溶性IgE的Cε3结构域结合，阻断其与肥大细胞和嗜碱性粒细胞细胞上的FcεRI结合，使下游信号通路不能被激活，从而抑制过敏反应相关炎性介质的释放，有效改善过敏反应的症状；此外，奥马珠单抗还能降低嗜碱性粒细胞表面FcεRI的表达量，从而降低细胞对IgE的反应性，起到减轻过敏反应的作用。
生物学活性测定是对药物的有效成分和含量以及药物效价的测定，应能反映药物的主要作用机制，同时也是确保抗体类药物有效性的重要质控指标。目前，奥马珠单抗的生物学活性测定方法主要有竞争ELISA法、脱颗粒酶活性抑制法等，前者是主要反映的是奥马珠单抗与IgE的结合活性，并不能有效反映抗体的作用机制；后者是建立稳定表达人IgE受体α亚基(FcεRIα)的大鼠嗜碱性白血病细胞系RBL-2H3，加入奥马珠单抗和生物素(Biotin)标记的人IgE，两者竞争结合细胞表面的FcεRIα，孵育过夜后，加入链酶亲和素刺激细胞产生脱颗粒反应，通过测定β-己糖胺酶活性作为奥马珠单抗抑制细胞脱颗粒反应的指标。该方法虽然能反映奥马珠单抗的作用机制，但变异较大，稳定性差，无法灵敏指示奥马珠单抗的活性变化。
本发明在脱颗粒酶活性检测法的基础上，引入转基因细胞测活技术，实验结果稳定，精密度高，准确性好，能灵敏地反应出抗IgE抗体的活性改变。
发明内容
为了弥补现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种能够稳定测定抗IgE抗体的生物活性的细胞株的构建方法。
本发明的目的之二在于提供一种稳定、简单、准确、特异性的抗IgE抗体的生物活性的方法。
本发明的目的之三在于提供一种稳定特异性检测抗IgE抗体药物生物活性的产品。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案；
本发明的第一方面提供了一种稳定测定抗IgE抗体药物生物学活性的细胞株的构建方法，包括步骤：
1)含有FcεRIα的质粒转染效应细胞，加压筛选出稳定表达FcεRIα的细胞株；
2)含有报告基因NFAT的质粒转染步骤1)得到的细胞株，加压筛选出稳定表达报告基因的细胞株。
进一步，步骤1)中所述的效应细胞为白细胞，优选的，所述细胞为肥大细胞或嗜碱性粒细胞；更为优选的，所述细胞为嗜碱性粒细胞。在本发明的具体实施方式中，所述嗜碱性粒细胞为RBL-2H3细胞。
在本文中，进行目标基因转染时通常进行加压筛选，以使细胞稳定的高表达目的基因，所述加压筛选试剂包括但不限于G418、潮霉素、嘌呤霉素、6-硫鸟嘌呤、氨苄青霉素。作为优选的实施方案，所述加压试剂为G418、嘌呤霉素。
作为本发明的一种优选的实施方案，含有FcεRIα的质粒为pcDNA3.1[FcεRIα/G418]质粒，加入G418加压筛选稳定高表达FcεRIα的细胞株。
作为本发明的一种优选的实施方案，含有报告基因NFAT的质粒为pGL4.30[luc2P/NFAT-RE/Puro]质粒，加入嘌呤霉素加压筛选稳定高表达FcεRIα/NFAT-luc的细胞株。
本发明的第二方面提供了一种稳定测定抗IgE抗体药物生物学活性的方法，所述方法包括：
1)采用本发明第一方面所述的方法构建稳定表达FcεRIα与NFAT报告基因的效应细胞；
2)将步骤1)中的效应细胞进行稀释，加入到96孔白板中；
3)将抗IgE抗体药物样品进行稀释，将稀释后的抗体分别与IgE-生物素(IgE-Biotin)混合，混合液转移至步骤2)中的细胞中，在37℃培养箱中进行孵育；
4)加入链霉亲和素，在37℃培养箱中进行孵育；
5)加入荧光素酶底物，根据测定的报告基因信号值拟合四参数曲线确定抗体生物学活性。
进一步，步骤2)中的稀释后的细胞密度为2.5×104-2×105个/孔，优选的，细胞密度为1×105-2×105个/孔，更为优选的，细胞密度为1×105个/孔。
进一步，步骤3)中抗IgE抗体的稀释起始浓度为10μg/ml-250μg/ml，优选的，抗IgE抗体的稀释起始浓度为250μg/ml。
进一步，抗体稀释的比例为1:2-1:6，优选为1:4。
进一步，步骤3)中IgE-Biotin的浓度为25ng/mL-150ng/mL，优选的，IgE-Biotin的浓度为100ng/mL-150ng/mL，更为优选的，IgE-Biotin的浓度为100ng/mL。
进一步，步骤3)中的孵育时间为3-24h，优选的，孵育时间为15-24h，更为优选的，孵育时间为15-21h
进一步，步骤4)中的孵育时间为1-12h，优选的，孵育时间为3-9h，更为优选的，孵育时间为3h。
本发明的第三方面提供了一种稳定检测抗IgE抗体药物生物学活性的产品，所述产品包括本发明第一方面所述的方法构建的细胞株。
进一步，所述产品还包括IgE-Biotin。
进一步，所述产品还可包括链霉亲和素。
本发明的第四方面提供了本发明第三方面所述的产品的使用方法，包括：
1)将产品中的细胞株进行稀释，加入到96孔白板中；
2)将抗IgE抗体药物样品进行稀释，将稀释后的抗体分别与IgE-Biotin混合，混合液转移至步骤1)中的细胞中，在37℃培养箱中进行孵育；
3)加入链霉亲和素，在37℃培养箱中进行孵育；
4)加入荧光素酶底物，根据测定的报告基因信号值拟合四参数曲线确定抗体生物学活性。
在本发明中，抗IgE抗体药物为市售及在研的针对IgE的单克隆抗体，如奥马珠单抗(Omalizumab)、上海泰因生物技术有限公司的注射用重组人源化抗IgE单克隆抗体等。
本发明的优点和有益效果：
本发明首次提供了一种可检测检测抗IgE抗体生物活性的方法，该方法成本低，操作简便，周期短，不需要进行动物实验，结果稳定可靠，准确度高，特异性好，有利于促进药品的研究开发，质量控制与临床应用，具有较高的应用价值。
本发明提供了一种稳定测定抗IgE抗体药物生物学活性的细胞株的构建方法以及包含该细胞株的产品，使用该产品，可快速检测抗IgE抗体的生物活性，具有较高的准确性、安全性。
附图说明
图1是RBL-2H3/FcεRIα/NFAT-luc细胞在不同IgE浓度下的四参数曲线图；其中，图a为不同IgE-Biotin浓度下的四参数曲线图，图b是不同IgE抗体浓度下的四参数曲线图；
图2是RBL-2H3/FcεRIα/NFAT-luc细胞在不同抗体浓度下的四参数曲线图；
图3是RBL-2H3/FcεRIα/NFAT-luc细胞在不同细胞密度下的四参数曲线图；
图4是RBL-2H3/FcεRIα/NFAT-luc细胞在不同孵育时间下的四参数曲线图；
图5是RBL-2H3/FcεRIα/NFAT-luc细胞在不同脱颗粒时间下的四参数曲线图；
图6是不同的单抗药物的生物活性图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。
实施例1稳定表达FcεRIα与NFAT-luc的RBL-2H3细胞株筛选
1、实验材料
RBL-2H3细胞来源于ATCC；pcDNA3.1[FcεRIα/G418]质粒购买于金唯智生物科技有限公司；pGL4.30[luc2P/NFAT-RE/Puro]质粒购买于金唯智生物科技有限公司；实验用IgE-生物素(IgE-Biton)由上海泰因生物技术有限公司提供；Bright-Glo荧光素酶试剂盒购买于Promega公司。
2、pcDNA3.1[FcεRIα/G418]质粒转染
采用Lipofectamine 3000转染试剂(Invitrogen)对RBL-2H3细胞进行pcDNA3.1[FcεRIα/G418]质粒转染。转染24h后，加入1mg/mL G418进行加压筛选。待细胞密度和活力恢复后，通过有限稀释法，按照1个/孔的密度，铺96孔板筛选单克隆。在细胞生长期间，观察并标记哪些孔是单克隆，当单克隆孔内细胞汇合度达到80％以上时，将此孔内细胞转移至24孔板，逐步扩大培养。
3、RBL-2H3/FcεRIα细胞株筛选
每孔1×105个细胞铺至96孔板，IgE稀释至终浓度40μg/mL，37℃，5％CO2培养过夜，第二天弃去孔内液体，每孔加入100μL链霉亲和素进行脱颗粒反应1h，再加入β-己糖胺酶底物4-methylumbelliferyl-N-acetyl-β-D-glucosaminide，检测荧光信号值，结果见表1，RBL-2H3/FcεRIα-18与RBL-2H3/FcεRIα-36具有较高的信噪比，选择RBL-2H3/FcεRIα-18细胞用于后续构建。
表1 RBL-2H3/FcεRIα克隆荧光信号值
+：加入40μg/mL IgE，-：未加入40μg/mL IgE
4、pGL4.30[luc2P/NFAT-RE/Puro]质粒转染
采用PEI转染试剂(Sigma)对RBL-2H3/FcεRIα-18细胞进行pGL4.30[luc2P/NFAT-RE/Puro]质粒转染。转染24h后，加入1.5μg/mL Puromycin进行加压筛选。待细胞密度和活力恢复后，通过有限稀释法，按照1个/孔的密度，铺96孔板筛选单克隆。在细胞生长期间，观察并标记哪些孔是单克隆，当单克隆孔内细胞汇合度达到80％以上时，将此孔内细胞转移至24孔板，逐步扩大培养。5、RBL-2H3/FcεRIα/NFAT-luc细胞株筛选
每孔1×105个细胞铺至96孔板，IgE-Biotin稀释至终浓度100ng/mL，37℃，5％CO2培养过夜，第二天弃去孔内液体，每孔加入100μL链霉亲和素进行脱颗粒反应3h，再加入荧光素酶底物，检测化学发光值，结果见表2，RBL-2H3/FcεRIα/NFAT-luc-93具有较高的信噪比，选取该克隆进行后续的实验，命名为RBL-2H3/FcεRIα/NFAT-luc。
表2 RBL-2H3/FcεRIα/NFAT-luc克隆化学发光值
+：加入100ng/mL IgE，-：未加入100ng/mL IgE
实施例2检测方法优化
1、IgE-Biotin浓度优化
IgE-Biotin可结合到RBL-2H3/FcεRIα/NFAT-luc细胞上，经由链霉亲和素交联后可刺激细胞发生脱颗粒和NFAT-luc报告基因表达，抗IgE抗体可抑制该过程的发生。因此，需要选择一个合适的IgE-Biotin浓度，使细胞在受刺激后既能产生充分的脱颗粒反应，又不至于因浓度达到平台而造成试剂的浪费。
方法：将RBL-2H3/FcεRIα/NFAT-luc细胞按1×105个/孔加入到96孔白板中，IgE-Biotin浓度以10000ng/mL为起始点，1:2倍比稀释15个浓度点，加入上述细胞板，37℃，5％CO2孵箱中培养过夜。次日弃去板内液体，加入20μg/mL链霉亲和素100μL/孔，37℃，5％CO2孵箱中3h，加入Bright-Glo，检测化学发光值，根据测定的化学发光值拟合四参数曲线，选择曲线上的EC90-EC50之间的四个浓度(150ng/mL，100ng/mL，50ng/mL，25ng/mL)进行进一步优化。
将RBL-2H3/FcεRIα/NFAT-luc细胞按1×105个/孔加入到96孔白板中，IgE-Biotin浓度分别为150ng/mL，100ng/mL，50ng/mL，25ng/mL，奥马珠单抗(由中国食品药品检定研究院单克隆抗体产品室留存)以250μg/mL为起始点，1:5稀释10个浓度梯度，混合后加入上述细胞板；37℃，5％CO2孵箱中培养过夜。次日弃去板内液体，加入20μg/mL链霉亲和素100μL/孔，37℃，5％CO2孵箱中3h，加入Bright-Glo，检测化学发光值，根据测定的化学发光值拟合的四参数曲线，确定一个较为合适的IgE-Biotin浓度。
结果：IgE-Biotin刺激细胞脱颗粒反应呈现良好的四参数曲线(见图1a)，选取EC90-EC50之间的四个浓度150ng/mL，100ng/mL，50ng/mL，25ng/mL用于抗IgE抗体抑制脱颗粒反应中IgE-Biotin浓度的进一步优化。随着IgE-Biotin浓度的增加，四参数曲线下平台基本一致，上平台逐渐升高(见图1b)，但150ng/mL与100ng/mL的曲线上平台差别不大，因此，我们选择100ng/mL，既能保证信噪比，也能节省试剂用量。
2、抗体浓度优化
在IgE-Biotin 100ng/mL的条件下，加入不同浓度梯度的奥马珠对脱颗粒反应进行抑制，根据测定的化学发光值拟合的四参数曲线确定奥马珠的使用浓度。
方法：将RBL-2H3/FcεRIα/NFAT-luc细胞按1×105个/孔加入到96孔白板中；奥马珠单抗(由中国食品药品检定研究院单克隆抗体产品室留存)初始浓度为250μg/mL，1:2.5梯度稀释20个浓度点，分别与IgE-Biotin混合，加入上述细胞板中；37℃，5％CO2孵箱中培养过夜。次日弃去板内液体，加入20μg/mL链霉亲和素100μL/孔，37℃，5％CO2孵箱中3h，加入Bright-Glo，检测化学发光值。
结果：如图2所示，根据IC50值及上下平台计算，确定奥马珠单抗起始点终浓度为250μg/mL，1:4稀释，设置十个浓度点，能够保证上下平台各有两个浓度点，线性部分至少三个点。
3、细胞密度优化
设置2.5×104个/孔、5×104个/孔、1×105个/孔、2×105个/孔四个不同的细胞密度，分别进行抗IgE单抗的抑制实验，根据测定的化学发光值拟合的四参数曲线确定最优细胞密度。
方法：将RBL-2H3/FcεRIα/NFAT-luc细胞分别按2.5×104个/孔、5×104个/孔、1×105个/孔、2×105个/孔加入到96孔白板中；IgE-Biotin终浓度100ng/mL，奥马珠单抗初始浓度为250μg/mL，1:4稀释10个浓度梯度，混合后转移至上述细胞板中；37℃，5％CO2培养过夜。次日弃去板内液体，加入20μg/mL链霉亲和素100μL/孔，37℃，5％CO2孵箱中3h，加入Bright-Glo，检测化学发光值。
结果：结果如图3所示，当RBL-2H3/FcεRIα/NFAT-luc细胞密度1×105个/孔至2×105个/孔范围内时，信噪比接近，两种细胞密度对信噪比影响不大，选择细胞密度1×105个/孔进行后续实验。
4、孵育时间优化
RBL-2H3/FcεRIα/NFAT-luc、IgE-Biotin与抗IgE单抗在一起的孵育时间分别设置为3h、6h、15h、18h、21h、24h，进行抗IgE单抗的抑制实验，根据测定的化学发光值拟合的四参数曲线确定最优孵育时间。
方法：将RBL-2H3/FcεRIα/NFAT-luc细胞1×105个/孔加入到96孔白板中；IgE-Biotin终浓度100ng/mL，奥马珠单抗初始浓度为250μg/mL，1:4稀释10个浓度梯度，混合后转移至上述细胞板中；37℃，5％CO2分别培养3h、6h、15h、18h、21h、24h。弃去板内液体，加入20μg/mL链霉亲和素100μL/孔，37℃，5％CO2孵箱中3h，加入Bright-Glo，检测化学发光值。
结果如图4所示，随着孵育时间延长，信噪比呈增高趋势，为了兼顾试验操作方便与信噪比的要求，选择15-21h的孵育时间进行后续实验。
5、脱颗粒时间优化
加入链霉亲和素后的脱颗粒时间分别设置为1h、3h、6h、9h、12h、24h，进行抗IgE单抗的抑制实验，根据测定的化学发光值拟合的四参数曲线确定最优脱颗粒时间。
方法：将RBL-2H3/FcεRIα/NFAT-luc细胞1×105个/孔加入到96孔白板中；IgE-Biotin终浓度100ng/mL，奥马珠单抗初始浓度为250μg/mL，1:4稀释10个浓度梯度，混合后转移至上述细胞板中；37℃，5％CO2分别培养15-21h。弃去板内液体，加入20μg/mL链霉亲和素100μL/孔，37℃，5％CO2孵箱中分别孵育1h、3h、6h、9h、12h，加入Bright-Glo，检测化学发光值。
结果如图5所示，随着脱颗粒时间延长，信噪比呈先上升后下降的趋势，这是由于脱颗粒时间过长会导致细胞死亡，信号降低，而3h的信噪比最高，因此，选择脱颗粒时间为3h进行后续实验。
实施例3检测方法的验证
1、专属性验证
本方法是针对抗IgE抗体的生物学活性方法，因此，对其专属性的验证采用了不同靶点的单抗药物：奥马珠单抗(Omalizumab，靶点为IgE)、利妥昔单抗(Rituximab，靶点为CD20)、帕妥珠单抗(Pertuzumab，靶点为HER2)和托珠单抗(Tocilizumab，靶点为IL-6R)。在相同的实验条件下，利用RBL-2H3/FcεRIα/NFAT-luc报告基因测活体系，测定这四种单抗药物的活性。
方法：将RBL-2H3/FcεRIα/NFAT-luc细胞按1×105个/孔加入到96孔白板中；IgE-Biotin终浓度100ng/mL，四种单抗分别稀释至初始浓度250μg/mL，1:4稀释10个浓度梯度，与IgE-Biotin混合后转移至上述细胞板中；37℃，5％CO2培养15-21h。次日弃去板内液体，加入20μg/mL链霉亲和素100μL/孔，37℃，5％CO2孵箱中3h，加入Bright-Glo，检测化学发光值。
结果如图6所示，本方法对CD20、HER2、IL-6R靶点的抗体药物均没有剂量效应曲线，说明本方法不适于除了IgE靶点以外的其他药物，证明本方法专属性较好。
2、与传统方法的方法学比较
目前，能反映奥马珠单抗作用机制的生物学活性测定方法主要是脱颗粒酶活性抑制法，即IgE-Biotin与RBL-2H3/FcεRIα细胞结合并被链霉亲和素交联后，可刺激细胞脱颗粒释放β-己糖胺酶；加入抗IgE单抗后，可竞争结合IgE-Biotin，使结合到细胞表面的IgE-Biotin减少，进而使β-己糖胺酶释放减少，通过测定该酶的活性反映抗IgE单抗的活性。我们对该方法和报告基因法的多次试验结果进行了总结。
转基因细胞法：将RBL-2H3/FcεRIα/NFAT-luc细胞按1×105个/孔加入到96孔白板中；IgE-Biotin终浓度100ng/mL，奥马珠单抗初始浓度250μg/mL，1:4稀释10个浓度梯度，与IgE-Biotin混合后转移至上述细胞板中；37℃，5％CO2培养15-21h。次日弃去板内液体，加入20μg/mL链霉亲和素100μL/孔，37℃，5％CO2孵箱中3h，加入Bright-Glo，检测化学发光值。
脱颗粒酶活性抑制法：将RBL-2H3/FcεRIα细胞按1×105个/孔接种于96孔板中；IgE-Biotin终浓度100ng/mL，奥马珠单抗初始浓度25μg/mL，1:2稀释10个浓度梯度，与IgE-Biotin混合后转移至上述细胞板中；37℃，5％CO2培养15-21h。次日弃去板内液体，加入20μg/mL链霉亲和素100μL/孔，37℃，5％CO2孵箱中1h，加入酶底物，检测荧光信号值。
结果如表3所示，转基因细胞法的相对变异系数(CV)要低于脱颗粒酶活性抑制法，能够更加灵敏地反映抗体活性的变化，此外，转基因细胞法的曲线拟合度更优，信噪比更高、线性范围更宽。
表5转基因细胞法与脱颗粒酶活性抑制法比较
参数 转基因细胞法 脱颗粒酶活性抑制法
R<sup>2</sup> ＞0.99 ＞0.90
最大信噪比 ～15 ～5
线性范围 0.01μg/mL-10μg/mL 0.1μg/mL-10μg/mL
CV ＜15％ ＞30％

Claims (10)

1.一种稳定测定抗IgE抗体药物生物学活性的细胞株的构建方法，其特征在于，包括步骤：
1)含有FcεRIα的质粒转染效应细胞，加压筛选出稳定表达FcεRIα的细胞株；
2)含有报告基因NFAT的质粒转染步骤1)得到的细胞株，加压筛选出稳定表达报告基因的细胞株。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述效应细胞为白细胞，优选的，所述细胞为肥大细胞或嗜碱性粒细胞；更为优选的，所述细胞为嗜碱性粒细胞；更为优选的，所述嗜碱性粒细胞为RBL-2H3细胞。
3.一种稳定测定抗IgE抗体药物生物学活性的方法，其特征在于，所述方法包括：
1)采用权利要求1或2所述的方法构建稳定表达FcεRIα与NFAT报告基因的效应细胞；
2)将步骤1)中的效应细胞进行稀释，加入到96孔白板中；
3)将抗IgE抗体药物样品进行稀释，将稀释后的抗体分别与IgE-Biotin混合，混合液转移至步骤2)中的细胞中，在37℃培养箱中进行孵育；
4)加入链霉亲和素，在37℃培养箱中进行孵育；
5)加入荧光素酶底物，根据测定的报告基因信号值拟合四参数曲线确定抗体生物学活性。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤2)中的细胞密度为2.5×104-2×105个/孔，优选的，细胞密度为1×105-2×105个/孔，更为优选的，细胞密度为1×105个/孔。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤3)中抗IgE抗体的稀释起始浓度为10μg/ml-250μg/ml，优选的，抗IgE抗体的稀释起始浓度为250μg/ml。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，抗体稀释的比例为1:2-1:6，优选为1:4。
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤3)中IgE-Biotin的浓度为25ng/mL-150ng/mL，优选的，IgE-Biotin的浓度为100ng/mL-150ng/mL，更为优选的，IgE-Biotin的浓度为100ng/mL。
8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤3)中的孵育时间为3-24h，优选的，孵育时间为15-24h，更为优选的，孵育时间为15-21h。
9.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤4)中的孵育时间为1-12h，优选的，孵育时间为3-9h，更为优选的，孵育时间为3h。
10.一种稳定检测抗IgE抗体药物生物学活性的产品，其特征在于，所述产品包括权利要求1或2所述的方法构建的细胞株。
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