CN105218673A - Tcr复合物免疫治疗剂 - Google Patents

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Abstract

提供特异性结合TCR复合物或其组分，例如TCRα、TCRβ或CD3ε的单链融合蛋白，及其组合物和使用方法。

Description

TCR复合物免疫治疗剂
相关申请的交叉引用
本申请根据35U.S.C.§119(e)，要求以下美国临时专利申请的优先权：2008年10月10日提交的61/104,608、2009年1月29日提交的61/148,341，这些临时申请通过引用全文纳入本文。
关于序列表的声明
本申请的相关序列表以文本格式代替纸件副本提供，并由此通过引用纳入说明书。包含序列表的文本名称为910180_416PC_SEQUENCE_LISTING.txt。所述文本文件为622KB，创建于2009年10月9日，通过EFS-Web以电子方式提交，与说明书一并提交申请。
背景
技术领域
本发明涉及免疫学活性的重组结合蛋白，具体涉及TCR复合物或其组分，例如CD3的特异性单链融合蛋白。本发明还涉及治疗自身免疫疾病和其它病症或疾病(例如，移植物排斥)的组合物和方法。
相关领域描述
用抗CD3单克隆抗体使TCR复合物靶向人T细胞业已用于治疗器官同种异体移植物排斥。人CD3的特异性小鼠单克隆抗体，例如OKT3(Kung等(1979)Science206:347-9)是第一代此类治疗药物。虽然OKT3具有很强的免疫抑制能力，但因它有免疫原性和丝裂原性相关的严重副作用阻碍了它的临床应用(Chatenoud(2003)NatureReviews3:123-132)。它可诱导抗球蛋白应答，从而促进了它本身的快速被清除和中和(Chatenoud等.(1982)Eur.J.Immunol.137:830-8)。此外，OKT3体外可诱导T-细胞增殖和产生细胞因子，体内可导致细胞因子大规模释放(Hirsch等.(1989)J.Immunol142:737-43,1989)。细胞因子释放(也称为“细胞因子风暴”)进而导致“流感样”综合征，其特征有发热、寒颤、头痛、恶心、呕吐、腹泻、呼吸窘迫、脓毒性脑膜炎和高血压(Chatenoud,2003)。此类严重副作用限制了OKT3更广泛地应用于移植以及扩展至其它临床领域，例如自身免疫(疾病)的应用(同上)。
为减少第一代抗CD3单克隆抗体的副作用，开发了第二代遗传工程改造的抗CD3单克隆抗体，这种抗体不仅将鼠抗CD3单克隆抗体的互补决定区(CDR)嫁接入人IgG序列，而且在Fc中引入了非-FcR-结合突变(Cole等.(1999)Transplantation68:563；Cole等.(1997)J.Immunol.159:3613)。这种鼠单克隆抗体的人源化导致其免疫原性降低和mAb半衰期改善(同上)。此外，非-FcR-结合性mAb降低了诱导体内细胞因子释放和急毒性的可能性(Chatenoud等.(1989)N.Engl.J.Med.320:1420)。然而，即使细胞因子释放水平降低但仍是剂量限制的，在非常低的药物剂量(微生物/患者)下仍有毒性(Plevy等.,(2007)Gastroenterology133:1414-1422)。
改进抗CD3/TCR抗体的治疗有几个难点。例如，抗CD3单克隆抗体介导免疫抑制的机制复杂，尚未完全了解。据信，此类抗体通过四种机制起作用：包被细胞(cellcoating)、消耗细胞(celldepletion)、下调TCR和细胞信号传导，后二者是主要机制(Chatenoud(2003)NatureReviews:123-132)。还认为，细胞因子风暴的诱导和体内T细胞激活是CD3/TCR-抗体治疗效果所必需(Carpenter等.(2000)J.Immunology165:6205-13)。最后，据报道在体外是“非激活性”的第二代抗CD3单克隆抗体在体内仍能诱导细胞因子风暴。
目前正检验许多抗CD3指导的抗体在自身免疫疾病、炎性疾病和移植患者中的临床应用。这些抗体包括hOKT3γ1(Ala-Ala)(MG公司(Macrogenics))、维喜单抗(visilizumab)(PDL)、TRX-4(托雷克斯公司(Tolerx))和NI-0401(诺伏免疫公司(NovImmune))。然而，用这些抗体各自治疗的患者经历细胞因子释放相关的不利事件(中等到严重)，有时在患者群体中常见到病毒重激活。
鉴于细胞因子释放相关不良事件涉及目前的T细胞抗体和其它生物学疗剂，不断需要备选疗剂。本发明满足此类需求并进一步提供其它相关优点。
发明简述
本发明提供结合TCR复合物或其组分的融合蛋白、包含此类融合蛋白的组合物和单位剂型、编码此类融合蛋白的多核苷酸和表达载体、减少实体器官移植物排斥或治疗自身免疫疾病的方法和检测T细胞活化的方法。
本发明一方面提供一种融合蛋白，其从氨基末端到羧基末端包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：(a)特异性结合TCR复合物或其组分的结合域，(b)接头多肽，(c)任选的免疫球蛋白CH2区多肽，其包含(i)297位天冬酰胺的氨基酸取代；(ii)234-238位的一个或多个氨基酸取代或缺失；(iii)253、310、318、320、322或331位的至少一个氨基酸取代或缺失；(iv)297位天冬酰胺的氨基酸取代和234-238位的一个或多个取代或缺失；(v)297位天冬酰胺的氨基酸取代和253、310、318、320、322或331位的至少一个取代或缺失；(vi)234-238位的一个或多个氨基酸取代或缺失，和253、310、318、320、322或331位的至少一个氨基酸取代或缺失；或(vi)297位天冬酰胺的氨基酸取代，234-238位的一个或多个氨基酸取代或缺失，和253、310、318、320、322或331位的至少一个氨基酸取代或缺失，和(d)免疫球蛋白CH3区多肽；其中该融合蛋白不诱导细胞因子风暴，或诱导最少的可检测细胞因子释放，该免疫球蛋白CH2区的氨基酸残基根据EU编号系统编号。其它融合蛋白见权利要求2-20和本文所述。
本发明另一方面提供包含本文提供的融合蛋白和药学上可接受的运载体、稀释剂或赋形剂的组合物。
本发明的另一方面提供包含上述药物组合物的单位剂型。
本发明的另一方面提供编码本文提供的融合蛋白的多核苷酸。
本发明的另一方面提供一种表达载体，其包含编码本文提供的融合蛋白的多核苷酸，所述多核苷酸操作性连接于表达调控序列。
本发明另一方面提供降低实体器官移植物排斥的方法，包括给予实体器官移植物受者有效量的本文提供的融合蛋白。
本发明另一方面提供治疗自身免疫疾病(例如，炎性肠病，包括克罗恩病和溃疡性结肠炎、糖尿病、哮喘和关节炎)的方法，包括给予有此需要的患者有效量的本文提供的融合蛋白。
本发明另一方面提供检测蛋白质诱导细胞因子释放的方法，所述蛋白质包含特异性结合TCR复合物或其组分的结合域，该方法包括：(a)提供丝裂原-致敏的T细胞，(b)用包含特异性结合TCR复合物或其组分的结合域的蛋白质(例如，融合蛋白和抗体)处理步骤(a)的致敏T细胞，和(c)检测在步骤(b)中处理的致敏T细胞的细胞因子释放。
本发明另一方面提供检测蛋白质诱导T细胞活化的方法，所述蛋白质包含特异性结合TCR复合物或其组分的结合域，该方法包括：(a)提供丝裂原-致敏的T细胞，(b)用包含特异性结合TCR复合物或其组分的结合域的蛋白质(例如，融合蛋白和抗体)处理步骤(a)的致敏T细胞，和(c)检测在步骤(b)中处理的致敏T细胞的活化。
附图简述
图1显示用各种抗体和小调节性免疫药物(SMIPTM)产品处理PHA致敏人T细胞所产生的活化T细胞百分数。“NoRx”指未处理，用作阴性对照。
图2显示在混合淋巴细胞反应试验中用各种抗体和SMIP融合蛋白处理应答细胞所产生的活化T细胞百分数。“MLR”指不作任何额外处理的混合淋巴细胞反应。“仅有应答细胞”指仅存在应答细胞的反应。“IgG2a”指用10μg/mlIgG2amAb处理的应答细胞。
图3显示在混合淋巴细胞反应试验中用各种抗体和SMIP融合蛋白处理应答细胞所产生的活化T细胞百分数。“MLR”指不作任何额外处理的混合淋巴细胞反应。“仅有应答细胞”指仅存在应答细胞的反应。
图4显示用单克隆种抗体和各种SMIP融合蛋白处理记忆T细胞所产生的活化T细胞百分数。“应答细胞(无TT)”指没有破伤风类毒素时的反应细胞。
图5A和5B是(A)分离后立即(第0天)染色或(b)用OKT3单克隆抗体或各种OKT3SMIP融合蛋白处理后4天染色的人T细胞TCR和CD3班点的FACS分析图。
图6A和6B是(A)分离后立即(第0天)染色或(B)用OKT3IgG1AA或OKT3HM1SMIP融合蛋白处理后4天染色的人T细胞TCR和CD3班点的FACS分析图。
图7显示用单克隆抗体、组合抗体或各种OKT3SMIP融合蛋白处理纯化的人T细胞产生的钙流出指示剂染料荧光随时间的变化。
图8A和8B显示用单克隆抗体(2C11mAb和H57mAb)或SMIP融合蛋白(2C11Null2和H57Null2)处理ConA-致敏小鼠T细胞后的(A)IFNγ或(B)IP-10释放。
图9显示在混合淋巴细胞反应试验中用各种抗体或SMIP融合蛋白处理应答细胞产生的活化T细胞百分数。“仅有R”指仅有应答细胞存在的反应；“仅有S”指仅有刺激细胞存在的反应；和“R:S”指应答和刺激细胞同时存在的反应。
图10A和10B显示静脉内给予不同浓度抗体(H57mAb)和H57Null2SMIP融合蛋白后(A)体重和(B)临床评分随时间的变化。PBS和IgG2a用作阴性对照。
图11A和11B显示将抗-TCR抗体(H57mAb)或不同浓度抗-TCRSMIP融合蛋白(H57Null2)静脉内给予正常BALB/c小鼠后2小时、24小时、72小时的血清(A)IL-6和(B)IL-4浓度。小鼠IgG2a抗体和PBS(稀释剂)用作阴性对照。
图12显示静脉内给予不同浓度抗-TCRSMIP融合蛋白(H57Null2)后第1或3天用H57Null2SMIP包被的小鼠脾细胞中发现的T细胞百分数。PBS和IgG2a用作阴性对照。
图13显示在急性移植物抗宿主病(aGVHD)模型中转移供体细胞后，受者小鼠在14天期间初始体重改变的百分数。“原初受者”表示不接受供体细胞转移的阴性对照小鼠。用H57Null2SMIP融合蛋白、地塞米松(DEX)或对照(PBS或IgG2a)治疗受者小鼠。
图14A-14C分别显示供体细胞转移后第14天、第14天或第7天的(A)G-CSF、(B)KC或(C)IFNγ血清浓度。
图15显示供体细胞转移后第14天的供体:宿主淋巴细胞比例。“无细胞转移”表示未接受供体细胞的阴性对照小鼠。PBS和IgG2a用作对照处理。
图16显示人IgG1、人IgG2、人IgG4和小鼠IGHG2c的CH2区之间的序列比对(分别是SEQIDNO:64、66、68和73)。采用ClustalW方法进行比对，采用DNASTAR5.03(DNA星公司(DNASTARInc.))的MegAlign程序的默认参数。人IgG1CH2的氨基酸位置依据Kabat的EU编号(参见Kabat,《免疫学感兴趣蛋白质的序列》(SequencesofProteinsofImmunologicalInterest),第5版，Bethesda,马里兰州:公共卫生服务部(PublicHealthService),国立卫生研究院(NationalInstitutesofHealth)(1991))。即，人IgG1重链可变区视作长128个氨基酸，因此，人IgG1该恒定区中氨基最末端的氨基酸残基在129位。所示的其它CH2区的氨基酸位置依据与之比对的人IgG1的氨基酸残基位置。297位的Asn残基(N297)如下划线和黑体字所示。
图17显示在混合淋巴细胞反应(MLR)试验中用抗体或SMIP融合蛋白处理应答细胞所产生的活化T细胞百分数。“R”指仅有应答细胞存在的反应；“S”指仅有刺激细胞存在的反应；“R+S”指不作任何其它处理的混合淋巴细胞反应，“muIgG2b”指用10μg/ml小鼠IgG2b处理的应答细胞。“对照SMIP”是含有不结合T细胞的scFv结合域的SMIP融合蛋白。用Cris-7IgG1N297A(SEQIDNO:265)测试这些细胞。
图18显示分离后立即染色的人T细胞TCR和CD3班点的FACS分析图。上两幅显示用Cris-7单克隆抗体处理，下两幅图显示用Cris-7IgG1N297A(SEQIDNO:265)处理的人T细胞。左侧图显示处理日(第0天)的细胞分布，右侧图显示处理后2天(第2天)的细胞分布。
图19显示用BC3IgG1-N297A(SEQIDNO:80，含有接头87作为scFv与CH2CH3结构域之间的绞链)处理人T细胞所产生的钙流出指示剂染料荧光随时间的变化，与绞链接头87换为各种长度的其它绞链(具体说，分别对应于SEQIDNO:212-218的接头115-120和122)的该同一融合蛋白产生的钙流出指示剂染料荧光随时间变化作比较。
图20显示在MLR试验中用抗体或SMIP融合蛋白处理应答细胞所产生的活化T细胞百分数。“对照SMIP”指具有不结合T细胞的scFV结合域的SMIP融合蛋白。“仅有应答细胞”指仅有应答细胞存在的反应。括号内的数字是SMIP融合蛋白的序列鉴定编号。
图21显示在MLR试验中用含有各种绞链接头的BC3IgG1-N297ASMIP融合蛋白处理应答细胞所产生的活化T细胞百分数。
图22显示在MLR试验中用单克隆抗体Cris7、嵌合型或人源化Cris7SMIP融合蛋白或嵌合型BC3SMIP融合蛋白(SEQIDNO:80)处理应答细胞所产生的活化T细胞百分数。“对照SMIP”指具有不结合T细胞的scFV结合域的SMIP融合蛋白，“仅有应答细胞”指仅有应答细胞存在的反应。括号内的数字是SMIP融合蛋白的序列鉴定编号。
图23显示在MLR试验中用人源化Cris7IgG1-N297、IgG2-AA-N297A和IgG4-AA-N297A以及HM1SMIP融合蛋白或嵌合型Cris7IgG1-N297A和HM1SMIP融合蛋白处理应答细胞所产生的活化T细胞百分数。“母体mAb”指Cris7mAb，“对照SMIP”指含有不结合T细胞的scFV结合域的SMIP融合蛋白。
图24显示用人源化Cris7(VH3-VL1)IgG1-N297A或人源化Cris7(VH3-VL2)IgG1-N297ASMIP融合蛋白处理PHA-致敏人T细胞后活化T细胞的百分数。“对照SMIP”指非T细胞结合性SMIP融合蛋白。
图25A和25B显示用各种人源化和嵌合型Cris7SMIP融合蛋白、BC3SMIP融合蛋白(SEQIDNO:80)和各种抗体(BC3mAb,母体Cris7mAb,和NuvionFL)再刺激PHA-致敏T细胞后24小时(第1天)和72小时(第3天)的血清(A)IFNγ和(B)IL-17浓度。括号内的数字是SMIP融合蛋白的序列鉴定编号。
图26A-26H显示用人源化Cris7(VH3-VL1)IgG4-AA-N297ASMIP融合蛋白、人源化Cris7(VH3-VL2)IgG4-AA-N297ASMIP融合蛋白或Cris7mAb处理24小时(第1天)、48小时(第2天)或72小时(第3天)的原代PBMC释放的(A)IFNγ、(B)IL-10、(C)IL-1B、(D)IL-17、(E)IL-4、(F)TNF-α、(G)IL-6和(H)IL-2水平。
图27显示静脉内给予IgG2amAb(411μg)、H57mAb(5μg)、H57Null2SMIP融合蛋白(300μg)、H57halfnullSMIP融合蛋白(300μg)或H57HM2SMIP融合蛋白(300μg)后体重随时间的变化。
图28显示静脉内给予图27所示剂量的IgG2amAb、H57mAb、H57Null2、H57halfnull或H57HM2后2小时的外周血T细胞浓度。
图29显示静脉内给予图27所示剂量的IgG2amAb、H57mAb、H57Null2、H57halfnull或H57HM2后72小时的外周T细胞浓度。
图30A-30C显示静脉内给予图27所示剂量的IgG2amAb、H57mAb、H57Null2、H57halfnull或H57HM2后(A)2小时、(B)24小时和(C)72小时的血清IL-2浓度。
图31A-31C显示静脉内给予图27所示剂量的IgG2amAb、H57mAb、H57Null2、H57halfnull或H57HM2后(A)2小时、(B)24小时和(C)72小时的血清IL-10浓度。
图32A-32C显示静脉内给予图27所示剂量的IgG2amAb、H57mAb、H57Null2、H57halfnull或H57HM2后(A)2小时、(B)24小时和(C)72小时的血清IP-10浓度。
图33A-33C显示静脉内给予图27所示剂量的IgG2amAb、H57mAb、H57Null2、H57halfnull或H57HM2后(A)2小时、(B)24小时和(C)72小时的血清TNFα浓度。
图34A-34C显示静脉内给予图27所示剂量的IgG2amAb、H57mAb、H57Null2、H57halfnull或H57HM2后(A)2小时、(B)24小时和(C)72小时的血清IL-4浓度。
图35A-35C显示静脉内给予图27所示剂量的IgG2amAb、H57mAb、H57Null2、H57halfnull或H57HM2后(A)2小时、(B)24小时和(C)72小时的血清MCP-1浓度。
图36A-36C显示静脉内给予图27所示剂量的IgG2amAb、H57mAb、H57Null2、H57halfnull或H57HM2后(A)2小时、(B)24小时和(C)72小时的血清KC浓度。
图37A-37C显示静脉内给予IgG2a、H57mAb和H57Null2、halfnull及HM2SIMP后(A)2小时、(B)24小时和(C)72小时的IL-17浓度。
图38A-38C显示静脉内给予图27所示剂量的IgG2amAb、H57mAb、H57Null2、H57halfnull或H57HM2后(A)2小时、(B)24小时和(C)72小时的血清IP-10浓度。
图39A和39B是H57-HM2与H57halfnull的平均血清浓度对时间的图。结果表示为观察到的数据集和用WinNonLinTM软件计算的预测值。Rsq值和调整后的Rsq值对用于估计HL_Lambdaz的点数校正前后(6.6和40.7小时)、最终消除阶段有良好的拟合统计。
图40显示静脉内给予H57-HM2或H57Null2(各200μg)后15分钟、2小时、6小时、24小时和48小时的血清G-CSF浓度。
图41显示静脉内给予H57-HM2或H57Null2(各200μg)后15分钟、2小时、6小时、24小时和48小时的血清IFN-γ浓度。
图42显示静脉内给予H57-HM2或H57Null2(各200μg)后15分钟、2小时、6小时、24小时和48小时的血清IL-2浓度。
图43显示静脉内给予H57-HM2或H57Null2(各200μg)后15分钟、2小时、6小时、24小时和48小时的血清IL-5浓度。
图44显示静脉内给予H57-HM2或H57Null2(各200μg)后15分钟、2小时、6小时、24小时和48小时的血清IL-6浓度。
图45显示静脉内给予H57-HM2或H57Null2(各200μg)后15分钟、2小时、6小时、24小时和48小时的血清IL-10浓度。
图46显示静脉内给予H57-HM2或H57Null2(各200μg)后15分钟、2小时、6小时、24小时和48小时的血清IL-17浓度。
图47显示静脉内给予H57-HM2或H57Null2(各200μg)后15分钟、2小时、6小时、24小时和48小时的血清IP-10浓度。
图48显示静脉内给予H57-HM2或H57Null2(各200μg)后15分钟、2小时、6小时、24小时和48小时的血清KC15浓度。
图49显示静脉内给予H57-HM2或H57Null2(各200μg)后15分钟、2小时、6小时、24小时和48小时的血清MCP-1浓度。
图50显示用H57Null2、H57halfnull、H57-HM2、小鼠IgG2amAb或H57mAb处理应答细胞后所产生的活化T细胞百分数。
图51显示用按(R+S)标准化的H57Null2、H57halfnull、H57-HM2或H57mAb处理应答细胞后所产生的活化T细胞百分数-未处理＝100％。
图52显示通过H57Null2、H57halfnull、H57-HM2、小鼠IgG2amAb、H57mAb或2C11mAb处理后，活化的ConA-致敏T细胞的百分数。
发明详述
本发明提供含有针对TCR复合物的一个或多个结合域的融合蛋白，其形式为小调节性免疫药物(SMIPTM)产品或含有N-末端到C-末端逆向取向的Fc区和结合域的SMIP分子(PIMS)，能诱导独特模式的T细胞信号传导。该信号传导模式的特征在于：检测不到或只检测到少量、最低量或微不足道的细胞因子释放(即不产生或产生最小量的细胞因子风暴)、能诱导钙流出、能磷酸化TCR信号传导蛋白而不活化T细胞，或它们的其任何组合。用单克隆抗体不能复制此类信号传导模式，表明SMIP或PIMS蛋白与它们的靶标结合可导致出乎意料的信号传导特征。迄今为止，针对TCR复合物的蛋白质分子均能诱导强烈的T细胞信号(例如，细胞因子风暴)并活化T细胞，或者在没有交联时对细胞几乎没作用。
此外，本发明提供编码此类融合蛋白的核酸分子以及能重组产生此类蛋白质的载体和宿主细胞，和将本发明的融合蛋白用于各种治疗应用的组合物及方法，包括治疗以及缓解疾病或病症(例如，自身免疫疾病、炎性疾病和器官移植排斥)的至少一种症状。
在更详细地阐述本发明之前，提供本文所用某些术语的定义可能有助于理解本发明。其它定义在本说明书全文中列出。
在本说明书中，任何浓度范围、百分数范围、比例范围或整数范围应理解为包括所述范围内的任何整数值，适当时也包括其分数值(如整数的十分之一和百分之一)，除非另有说明。另外，本文所述的有关物理特征，例如聚合物亚基、大小或厚度的任何数值范围应理解为包括所述范围内的任何整数，除非另有说明。本文所用术语"约"或"由…组成"表示所述范围、数值或结构的±20％，除非另有说明。在本文中，术语“包含”和“包括”可作为同义词使用。应理解，本文所用术语“一个”和“一种”指一个或多个所列举的组件。另选方式的使用(如“或”)应理解为所述另选方式中的一个、两个或任何组合。此外，应理解本申请公开衍生自本文所述结构和取代基的各种组合的单个化合物或化合物组时，就好像每种化合物或每组化合物单独列出那样。因此，具体结构或具体取代基的选择属于本发明范围。
除非另有表述，根据EU编号系统对本发明免疫球蛋白CH2和CH3区中的氨基酸残基编号(参见，Kabat等.,《免疫学感兴趣蛋白质的序列》,第5版，Bethesda,马里兰州:公共卫生服务部,国立卫生研究院(1991))。
“小调节性免疫药物(SMIPTM)蛋白”指单链融合蛋白，其氨基到羧基末端包含：特异性结合靶分子的结合域、接头多肽(例如，免疫球蛋白绞链或其衍生物)、免疫球蛋白CH2多肽和免疫球蛋白CH3多肽(参见，美国专利公布号2003/0133939、2003/0118592和2005/0136049)。
“PIMS蛋白质”是一种逆向SMIP分子，其中所述结合域位于该融合蛋白的羧基末端。制备PIMS蛋白的构建物和方法描述见PCT公布号WO2009/023386。PIMS分子通常是单链多肽，其氨基末端到羧基末端包含：任选的CH2区多肽、CH3结构域、接头肽(例如，免疫球蛋白绞链区)和特异性结合域。
本文所用的蛋白质基本上由几个结构域组成(例如，特异性结合TCR复合物或其组分的结合域、接头多肽、免疫球蛋白CH2区和免疫球蛋白CH3区)，如果该蛋白质的其它部分(例如，氨基或羧基末端或两个结构域之间的氨基酸)组合最多占该蛋白质长度的20％(例如，最多15％、10％、8％、6％、5％、4％、3％、2％或1％)，并且基本上不实质性影响(即，不降低其活性50％以上，例如不超过40％、30％、25％、20％、15％、10％或5％)该蛋白质的活性，例如对TCR复合物或其组分的亲和力、不诱导(或诱导最低可检测的)细胞因子释放的能力、诱导钙流出或T细胞受体信号传导途径分子磷酸化的能力、阻断T细胞对同种抗原应答的能力、阻断记忆T细胞对抗原应答的能力和下调T细胞的TCR复合物。在某些实施方式中，该融合蛋白基本上由特异性结合TCR复合物或其组分的结合域、接头多肽、任选的免疫球蛋白CH2区多肽和免疫球蛋白CH3区多肽组成。此类分子还可在该蛋白质的氨基或羧基末端或在两个不同结构域之间(例如在所述结合域与接头多肽之间，接头多肽与免疫球蛋白CH2区多肽之间，或免疫球蛋白CH2区多肽与免疫球蛋白CH3区多肽之间)包含连接氨基酸。
除非本文另有明确的不同定义，抗体领域技术人员理解的术语各自具有该领域所知的意义。已知抗体含有可变区、绞链区和恒定区。免疫球蛋白结构和功能的综述可参见，例如Harlow等编.,《抗体：实验室手册》(Antibodies:ALaboratoryManual),第14章(冷泉港实验室,冷泉港,1988)。例如，术语“VL”和“VH”分别指抗体轻链和重链的可变结合区。可变结合区由称为“互补决定区”(CDR)和“构架区”(FR)的不连续、已充分明确的子区域组成。术语“CL”指“免疫球蛋白轻链恒定区”或“轻链恒定区”，即抗体轻链的恒定区。术语“CH”指“免疫球蛋白重链恒定区”或“重链恒定区”，还可根据抗体同种型再分成CH1、CH2和CH3(IgA、IgD、IgG)或CH1、CH2、CH3和CH4结构域(IgE、IgM)。恒定区结构域的一部分组成了抗体的Fc区(“可结晶片段”区)，负责免疫球蛋白的效应器功能，例如ADCC(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性)、ADCP(抗体依赖性细胞吞噬)、CDC(补体依赖性细胞毒性)和补体结合、结合Fc受体(例如，CD16、CD32、FcRn)，体内半衰期比缺乏Fc区的多肽更长、结合A蛋白和甚至可能经胎盘转移(参见Capon等.,Nature,337:525(1989))。
此外，抗体通常含有位于Fab与Fc区之间的绞链序列(但绞链的下部可包含Fc区的末端氨基部分)。作为背景，免疫球蛋白绞链用作灵活间隔臂以使Fab部分在空间中自由移动。与恒定区相反，绞链在结构上不同，各类免疫球蛋白甚至亚类之间的绞链序列和长度各异。例如，人IgG1的绞链区是自由灵活的，从而Fab片段可围绕其对称轴旋转并在以两个重链间二硫键的首个为中心的球形内移动。相比之下，人IgG2的绞链较短，含有受4个重链间二硫键稳定的刚性聚脯氨酸双螺旋，从而灵活性受限。人IgG3的绞链与其它亚类不同在于其为独特的延伸绞链区(约是IgG1绞链的4倍长)，含有62个氨基酸(包括21个脯氨酸和11个半胱氨酸)，形成不灵活的聚脯氨酸双螺旋并提供更高的灵活性，因为Fab片段相对远离Fc片段。人IgG4的绞链短于IgG1的，但与IgG2的长度相同，其灵活性介于IgG1与IgG2之间。
根据晶体图研究，可按功能和结构将IgG绞链区再分成以下三个区域：上部绞链区、核心或中部绞链区和下部绞链区(Shin等，ImmunologicalReviews130:87(1992))。示范性的上部绞链区包括IgG1中发现的EPKSCDKTHT(SEQIDNO：359)、IgG2中发现的ERKCCVE(SEQIDNO：360)、IgG3中发现的ELKTPLGDTTHT(SEQIDNO：361)或EPKSCDTPPP(SEQIDNO：362)、以及IgG4中发现的ESKYGPP(SEQIDNO：363)。示范性的中部或核心绞链区包括IgG1和IgG2中发现的CPPCP(SEQIDNO：364)、IgG3中发现的CPRCP(SEQIDNO：365)和IgG4中发现的CPSCP(SEQIDNO：366)。而IgG1、IgG2和IgG4抗体各自含有一个上部和中部铰链区，IgG3含有四个串联铰链区––一个是ELKTPLGDTTHTCPRCP(SEQIDNO：367)，三个是EPKSCDTPPPCPRCP(SEQIDNO：368)。
IgA和IgD抗体看来缺少IgG-样的核心区，IgD看来含有两个串联的上部绞链区(参见ESPKAQASSVPTAQPQAEGSLAKATTAPATTRNT(SEQIDNO:369)和GRGGEEKKKEKEKEEQEERETKTP(SEQIDNO:370))。VPSTPPTPSPSTPPTPSPS(SEQIDNO:371)和VPPPPP(SEQIDNO:372)分别是IgA1和IgA2抗体中发现的示范性野生型上部绞链区。
相反，IgE和IgM抗体缺乏典型的绞链区，而是含有绞链样性能的CH2结构域。IgE和IgM的示范性野生型CH2上部绞链样序列分别见SEQIDNO:373(VCSRDFTPPTVKILQSSSDGGGHFPPTIQLLCLVSGYTPGTINITWLEDGQVMDVDLSTASTTQEGELASTQSELTLSQKHWLSDRTYTCQVTYQGHTFEDSTKKCA)和SEQIDNO:374(VIAELPPKVSVFVPPRDGFFGNPRKSKLICQATGFSPRQIQVSWLREGKQVGSGVTTDQVQAEAKESGPTTYKVTSTLTIKESDWLGQSMFTCRVDHRGLTFQQNASSMCVP)。
本文所用的“绞链区”或“绞链”指(a)免疫球蛋白绞链区(由例如上部和核心区组成)或其功能变体，(b)凝集素结构域间区域(lectininterdomainregion)或其功能变体，或(c)分化群(CD)分子主茎区域(stalkregion)或其功能性变体。
免疫球蛋白绞链区可以是野生型免疫球蛋白绞链区或改变的野生型免疫球蛋白绞链区或改变的免疫球蛋白绞链区。
本文所用的“野生型免疫球蛋白绞链区”指插入CH1与CH2结构域之间或连接二者(对于IgG、IgA和IgD)或插入CH1与CH3结构域之间或连接二者(对于IgE和IgM)的天然产生的上部和中部绞链氨基酸序列。
“改变的野生型免疫球蛋白绞链区”或“改变的免疫球蛋白绞链区”指(a)含有最多30％氨基酸改变(如最多25％、20％、15％、10％或5％氨基酸取代或缺失)的野生型免疫球蛋白绞链区，或(b)野生型免疫球蛋白绞链区的一部分，该部分长约5个氨基酸(例如，约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸)到最多约120个氨基酸(优选长约10-40个氨基酸或约15-30个氨基酸或约15-20个氨基酸或约20-25个氨基酸)，含有最多约30％氨基酸改变(例如，最多约25％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％或1％氨基酸取代或缺失或其组合)、和含有例如SEQIDNO:364、365或366所示的IgG核心区。
“可变区连接序列”是连接重链可变区与轻链可变区的氨基酸序列，提供了与两个亚结合域相互作用相容的间隔臂功能，从而与包含相同轻链和重链可变区的抗体一样，得到的多肽保留对同一靶分子相同的特异性结合亲和力。在某些实施方式中，用于连接结合域与免疫球蛋白CH2或CH3区多肽的绞链可用作可变区连接序列。
“接头多肽”指融合蛋白中连接结合域与免疫球蛋白CH2或CH3区多肽的氨基酸序列。在某些实施方式中，接头多肽是本文定义的绞链。在某些实施方式中，用于连接重链可变区与轻链可变区的可变区连接序列可用作接头多肽。
在某些实施方式中，融合蛋白的两个结构域之间，例如结合域与接头多肽之间，接头多肽与免疫球蛋白CH2区多肽之间，免疫球蛋白CH2区多肽与免疫球蛋白CH3区多肽之间可以有1个或几个(例如，2-8个)氨基酸残基，例如设计的融合蛋白构建物所产生的氨基酸残基(例如，在构建编码单链多肽的核酸分子期间利用限制性酶得到的氨基酸残基)。本文所用的此类氨基酸残基可称为“连接氨基酸”或“连接氨基酸残基”。
本文所用的“衍生物”指化学或生物学改性的化合物(例如，蛋白质)，其结构类似于母体化合物且(实际或理论上)衍生自该母体化合物。
本文所用的“氨基酸”指天然氨基酸(天然产生)、取代的天然氨基酸、非天然氨基酸、取代的非天然氨基酸或它们的任何组合。在本文中，用标准的单字母或三字母码表示天然氨基酸。天然的极性氨基酸包括天冬酰胺(Asp或N)和谷胺酰胺(Gln或Q)；以及碱性氨基酸如精氨酸(Arg或R)、赖氨酸(Lys或K)、组氨酸(His或H)和其衍生物；以及酸性氨基酸如天冬氨酸(Asp或D)和谷氨酸(Glu或E)及其衍生物。天然疏水性氨基酸包括色氨酸(Trp或W)、苯丙氨酸(Phe或F)、异亮氨酸(Ile或I)、亮氨酸(Leu或L)、甲硫氨酸(Met或M)、缬氨酸(Val或V)和其衍生物；以及其它非极性氨基酸如甘氨酸(GIy或G)、丙氨酸(Ala或A)、脯氨酸(Pro或P)和其衍生物。中等极性的天然氨基酸包括丝氨酸(Ser或S)、苏氨酸(Thr或T)、酪氨酸(Tyr或Y)、半胱氨酸(Cys或C)和其衍生物。除非另有说明，本文所述的任何氨基酸可以是D-或L-构型。
可按照物理特性以及在蛋白质二级和三级结构中的贡献分类氨基酸。本领域认为“保守取代”是用一种氨基酸取代另一种特性相似的氨基酸。本领域熟知示范性保守取代(参见，例如WO97/09433,第10页,1997年3月13日公布；Lehninger,《生物化学》(Biochemistry),第二版；沃斯出版公司(WorthPublishers,Inc).纽约:纽约(1975),第71-77页；Lewin,《基因第四版》(GenesIV),牛津大学出版社,纽约和细胞出版社(CellPress),剑桥,马萨诸塞州(1990),第8页。在某些实施方式中，保守性取代包括亮氨酸到丝氨酸的取代。
除非另有提供，假定人IgG1重链可变区由128个氨基酸残基构成，按照Kabat编号惯例编号氨基酸残基在人IgG1重链恒定区中的位置。然后将编号的人IgG1重链恒定区用作编号其它免疫球蛋白重链恒定区中氨基酸残基的参照。除人IgG1重链以外的免疫球蛋白重链恒定区中感兴趣的氨基酸残基位置是可与感兴趣氨基酸残基作比对的人IgG1重链中的氨基酸残基位置。可利用本领域已知的软件程序，例如DNA星公司的Megalign程序，采用默认参数的ClustalW方法对人IgG1重链与其它免疫球蛋白重链恒定区之间作比对。示范性序列的比对见图16。根据本文所述的编号系统，虽然与图16中的其它CH2区相比，人IgG2CH2区在其氨基末端附近含有氨基酸缺失，但人IgG2CH2中下划线表示的“N”位置仍是297位，因为该残基与人IgG1CH2297位的“N”可比对。
针对TCR复合物的融合蛋白
本发明一方面提供SMIP融合蛋白形式的单链融合蛋白，其从氨基末端到羧基末端包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：(a)特异性结合TCR复合物或其组分的结合域，(b)接头多肽，(c)任选的免疫球蛋白CH2区多肽，和(d)免疫球蛋白CH3区多肽。当存在免疫球蛋白CH2区多肽时，其可包含(1)297位天冬酰胺的氨基酸取代；(2)234-238位的一个或多个氨基酸取代或缺失；(3)253、310、318、320、322或331位的至少一个氨基酸取代或缺失；(4)297位天冬酰胺的氨基酸取代和234-238位的一个或多个取代或缺失；(5)297位天冬酰胺的氨基酸取代和253、310、318、320、322或331位的至少一个取代或缺失；(6)234-238、253、310、318、320、322或331位的一个或多个氨基酸取代或缺失；或(7)297位天冬酰胺的氨基酸取代，234-238、253、310、318、320、322或331位的至少一个氨基酸取代或缺失。
在优选的实施方式中，本发明的单链融合蛋白，从氨基末端到羧基末端包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：(a)特异性结合TCR复合物或其组分的结合域，(b)接头多肽，(c)免疫球蛋白CH2区多肽，和(d)免疫球蛋白CH3区多肽，其中免疫球蛋白CH2区多肽包含(i)297位天冬酰胺的氨基酸取代和234-238位的一个或多个取代或缺失；(ii)297位天冬酰胺的氨基酸取代，234、235和237位的取代及236位的缺失；(iii)234-238、253、310、318、320、322或331位的至少一个氨基酸取代或缺失；(iv)234、235、237、318、320和322位的氨基酸取代和236位的缺失；(v)297位天冬酰胺的氨基酸取代和234-238、253、310、318、320、322或331位的至少一个取代或缺失；或(vi)297位天冬酰胺的氨基酸取代，234、235、237、318、320和322位的氨基酸取代及236位的缺失。在这些优选实施方式各自中，用于取代的氨基酸优选丙氨酸或丝氨酸。
在进一步优选的实施方式中，本发明的单链融合蛋白，从氨基末端到羧基末端包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：(a)特异性结合TCR复合物或其组分的结合域，(b)接头多肽，和(c)免疫球蛋白CH3区多肽，其中所述免疫球蛋白CH3区多肽包含人IgM的CH3区和人IgG(优选IgG1)的CH3区。
所述融合蛋白仅仅不可检测地、微不足道地、最低地或低水平地诱导细胞因子释放(即细胞因子风暴)，或激活T细胞，还具有以下一种或多种活性：(1)诱导钙流出，(2)诱导TCR信号传导途径分子磷酸化，(3)阻断T细胞对同种抗原的应答反应，(4)阻断记忆T细胞对同种抗原的应答反应，和(5)下调TCR复合物。
在一优选实施方式中，所述融合蛋白包含SEQIDNO:293、294、298或299所示氨基酸序列。在相关的优选实施方式中，用SEQIDNO:379-434所示绞链氨基酸序列替换SEQIDNO:293、294、298和299的氨基酸247-261的绞链序列。在进一步优选的实施方式中，按照EU编号，SEQIDNO:293、294、298和299的免疫球蛋白CH2区多肽在318、320和322位包含氨基酸取代。
在一相关方面，本发明提供PIMS蛋白形式的单链融合蛋白，其从氨基末端到羧基末端包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：(a)任选的免疫球蛋白CH2区多肽，(b)免疫球蛋白CH3区多肽，(c)接头多肽，和(d)特异性结合TCR复合物或其组分的结合域。存在时，免疫球蛋白CH2区多肽可包含与本文提供的SMIP融合蛋白中相同类型的突变。此外，PIMS蛋白具有本文所述SMIP蛋白的一种或多种所需生物学活性。
结合域
本文所述的本发明融合蛋白包含特异性结合TCR复合物或其组分(例如，CD3、TCRα、TCRβ或它们的任何组合)的结合域。
本发明的“结合域”或“结合区”可以是，例如能特异性识别和结合生物分子(例如，TCR复合物或其组分)的任何蛋白质、多肽、寡肽或肽。结合域包括感兴趣生物分子的任何天然产生的、合成、半合成或重组产生的结合伴侣。例如，结合域可以是抗体轻链和重链可变区，或者可以是任一取向(例如，VL-VH或VH-VL)的轻链和重链可变区连接成单链。已知有各种试验鉴定特异性结合特定靶标的本发明结合域，包括蛋白质印迹、ELISA、流式细胞术或BiacoreTM分析。
如果本发明的结合域(或其融合蛋白)结合靶分子的亲和力或Ka(即，特定结合相互作用的平衡结合常数，单位是1/M)(例如)大于或等于约105M-1，其特异性结合靶分子。在某些实施方式中，结合域(或其融合蛋白)结合靶标的Ka大于或等于约106M-1、107M-1、108M-1、109M-1、1010M-1、1011M-1、1012M-1或1013M-1。“高亲和力”结合域(或其单链融合蛋白)指Ka为至少107M-1、至少108M-1、至少109M-1、至少1010M-1、至少1011M-1、至少1012M-1、至少1013M-1或更高的那些结合域。或者，亲和力可定义为特定结合相互作用的平衡解离常数(Kd)，单位是M(如10-5M至10-13M或更低)。本发明结合域多肽和融合蛋白的亲和力不难用常规技术测定(参见例如，Scatchard等(1949)Ann.N.Y.Acad.Sci.51:660；和美国专利号5,283,173；5,468,614；或等同文献)。
“T细胞受体”(TCR)是在T细胞表面发现的分子，其连同CD3负责识别与主要组织相容性复合物(MHC)分子结合的抗原。在大多数T细胞中，其由二硫键连接的高度可变α和β链构成异质二聚体。在其它T细胞中，表达的可变γ和δ链构成另一种受体。TCR的各链是免疫球蛋白超家族的成员，含有一个N-末端免疫球蛋白可变区、一个免疫球蛋白恒定区、跨膜区和C-末端的短胞质尾(参见，Abbas和Lichtman,《细胞和分子免疫学》(CellularandMolecularImmunology)(第5版.),Saunders编,费城,2003；Janeway等.,《免疫学：健康和疾病中的免疫系统》(Immunobiology:TheImmuneSysteminHealthandDisease),第4版.,最新生物学出版社(CurrentBiologyPublications),第148,149,和172页,1999)。本发明所用的TCR可以来自各种动物，包括人、小鼠、大鼠或其它哺乳动物。
“抗-TCR融合蛋白、SMIP或抗体”指特异性结合TCR分子或其各链之一(例如，TCRα、TCRβ、TCRγ或TCRδ链)的融合蛋白、SMIP或抗体。在某些实施方式中，抗-TCR融合蛋白、SMIP或抗体特异性结合TCRα、TCRβ或二者。
本领域已知“CD3”是6条链组成的多重蛋白复合物(参见，Abbas和Lichtman,2003；Janeway等.,第172和178页,1999)。在哺乳动物中，该复合物为包含CD3γ链、CD3δ链、两个CD3ε链、和CD3ζ链的同质二聚体。CD3γ、CD3δ和CD3ε链是免疫球蛋白超家族中含有一个免疫球蛋白结构域的高度相关细胞表面蛋白质。CD3γ、CD3δ和CD3ε链的跨膜区带负电荷，该特征使得这些链结合于带正电荷的T细胞受体链。CD3γ、CD3δ和CD3ε链的胞内尾各自含有一个保守性基序，称为免疫受体酪氨酸激活基序或ITAM，而各CD3ζ链有3个。不想受理论的束缚，据信ITAM对于TCR复合物的信号传导能力至关重要。用于本发明的CD3可以来自各种动物，包括人、小鼠、大鼠或其它哺乳动物。
本文所用的“抗-CD3融合蛋白、SMIP或抗体”指特异性结合各CD3链(例如，CD3γ链、CD3δ链、CD3ε链)，或两个或多个CD3链形成的复合物(例如，一条以上CD3ε链的复合物、CD3γ和CD3ε链的复合物或CD3δ和CD3ε链的复合物)的融合蛋白、SMIP或抗体。在某些优选实施方式中，抗-CD3融合蛋白、SMIP或抗体特异性结合CD3γ、CD3δ、CD3ε或它们的任何组合，更优选CD3ε。
本文所用的“TCR复合物”指CD3与TCR结合形成的复合物。例如，TCR复合物可以是由CD3γ链、CD3δ链、两个CD3ε链、CD3ζ链构成的、TCRα链和TCRβ链构成的同质二聚体。或者，TCR复合物可以是由CD3γ链、CD3δ链、两个CD3ε链、CD3ζ链构成的、TCRγ链和TCRδ链构成的同质二聚体。
本文所用的“TCR复合物的组分”指TCR链(即，TCRα,TCRβ,TCRγ或TCRδ)、CD3链(即，CD3γ,CD3δ,CD3ε或CD3ζ)或两条或多条TCR链或CD3链形成的复合物(例如，TCRα和TCRβ的复合物、TCRγ和TCRδ的复合物、CD3ε和CD3δ的复合物、CD3γ和CD3ε的复合物或TCRα、TCRβ、CD3γ、CD3δ和两条CD3ε链的亚-TCR复合物)。
作为背景，TCR复合物通常负责启动T细胞对结合于MHC分子的抗原应答。据信，肽:MHC配体可结合TCR和辅受体(即，CD4或CD8)，使TCR复合物、辅受体和CD45酪氨酸磷酸酶结合在一起。因此除去了CD45的抑制性磷酸基团，从而活化Lck和Fyn蛋白质激酶。这些蛋白质激酶的活化导致CD3ζ链的ITAM磷酸化，进而使得这些链能结合胞质酪氨酸激酶ZAP-70。磷酸化后活化结合的ZAP-70触发了三种信号传导通路，其中两种由PLC-γ的磷酸化和活化所启动，然后将磷脂酰肌醇磷酸(PIP)切割成二酰基甘油(DAG)和肌醇三磷酸(IP3)。DAG可活化蛋白激酶C导致转录因子NFκB活化。IP3作用导致胞内游离Ca2+突然升高而活化胞质磷酸酶、钙调磷酸酶，从而使转录因子NFAT(活化T细胞的核因子)从胞质易位至核。完全转录活化NFAT还需要转录因子AP-1家族成员，转录调节剂Fos和Jun家族成员的二聚体。活化的ZAP-70启动第三信号传导途径，活化Ras，然后活化MAP激酶级联反应。这在Fos活化和因此AP-1转录因子活化中达到顶点。NFκB、NFAT和AP-1一起作用于T细胞染色体，启动新基因转录导致T细胞分化、增殖和效应作用。参见Janeway等.,第178页,1999。
在某些实施方式中，本发明的结合域能特异性结合各CD3链(例如，CD3γ、CD3δ或CD3ε)或各CD3链的两个或多个组合(例如，CD3γ和CD3ε形成的复合物或CD3δ和CD3ε形成的复合物)。在某些实施方式中，所述结合域特异性结合各个人CD3链(例如，人CD3γ链、人CD3δ链和人CD3ε链)或各个人CD3链的两个或多个的组合(例如，人CD3γ和人CD3ε的复合物或人CD3δ和人CD3ε的复合物)。在某些优选的实施方式中，所述结合域特异性结合人CD3ε链。
在某些其它实施方式中，本发明的结合域特异性结合TCRα、TCRβ或TCRα和TCRβ形成的异质二聚体。在某些优选实施方式中，结合域特异性结合人TCRα、人TCRβ或人TCRα和人TCRβ形成的异质二聚体的一个或多个。
在某些实施方式中，本发明的结合域结合一个或多个CD3链与一个或多个TCR链形成的复合物，例如CD3γ链、CD3δ链、CD3ε链、TCRα链或TCRβ链或它们的任何组合形成的复合物。在其它实施方式中，本发明的结合域结合一个CD3γ链、一个CD3δ链、两个CD3ε链、一个TCRα链和一个TCRβ链形成的复合物。在进一步优选的实施方式中，本发明的结合域结合一个或多个人CD3链与一个或多个人TCR链形成的复合物，例如人CD3γ链、人CD3δ链、人CD3ε链、人TCRα链或人TCRβ链或它们的任何组合形成的复合物。在某些实施方式中，本发明的结合域结合一个人CD3γ链、一个人CD3δ链、两个人CD3ε链、一个人TCRα链和一个人TCRβ链形成的复合物。
可如本文所述或用本领域已知的各种方法产生本发明的结合域(参见，例如美国专利号6,291,161；6,291,158)。结合域的来源包括各种物种的抗体可变区核酸序列(其形式可以是抗体、sFv、scFv或Fab，例如噬菌体文库)，包括人、驼类(骆驼、单峰骆驼或羊驼；Hamers-Casterman等(1993)Nature,363:446和Nguyen等(1998)J.Mol.Biol.,275:413)、鲨鱼(Roux等(1998)Proc.Nat′l.Acad.Sci.(USA)95:11804)、鱼(Nguyen等(2002)Immunogenetics,54:39)、啮齿类、禽类或绵羊。可产生本发明结合域的示范性抗-CD3抗体包括：Cris-7单克隆抗体(Reinherz,E.L.等(编),《II型白细胞》(LeukocytetypingII).,SpringerVerlag,纽约,(1986)),BC3单克隆抗体(Anasetti等(1990)J.Exp.Med.172:1691)、OKT3(正多中心移植研究组(OrthomulticenterTransplantStudyGroup)(1985)N.Engl.J.Med.313:337)和它们的衍生物，例如OKT3ala-ala(Herold等(2003)J.Clin.Invest.11:409)、维喜单抗(Carpenter等(2002)Blood99:2712)和145-2C11单克隆抗体(Hirsch等(1988)J.Immunol.140:3766)。示范性抗-TCR抗体是H57单克隆抗体(Lavasani等(2007)ScandinavianJournalofImmunology65:39-47)。
本发明结合域的其它来源包括编码随机肽文库的序列或编码其它非抗体支架环区域的经工程改造的多样性氨基酸序列，例如，血纤蛋白原结构域(参见，例如Weisel等(1985)Science230:1388)、Kunitz结构域(参见，例如美国专利号6,423,498)、脂质运载蛋白(lipocalin)结构域(参见，例如WO2006/095164)、V-样结构域(参见，例如美国专利申请公布号2007/0065431)、C-型凝集素结构域(Zelensky和Gready(2005)FEBSJ.272:6179)、mAb2或FcabTM(参见，例如PCT专利申请公布号WO2007/098934；WO2006/072620)等。例如，可通过筛选Fab噬菌体文库中特异性结合CD3链的Fab片段来鉴定本发明结合域(参见Hoet等(2005)NatureBiotechnol.23:344)。
此外，可采用以CD3链作为方便系统(例如，小鼠、HuMAbTCmouseTM、羊驼、鸡、大鼠、仓鼠、家兔等)的免疫原，开发杂交瘤的传统方案可用来开发本发明结合域。
在一些实施方式中，结合域是包含对TCR复合物或其组分具有特异性的VH和VL结构域的单链Fv片段(scFv)。在优选的实施方式中，所述VH和VL结构域是人或人源化VH和VL结构域。示范性VH结构域包括：BC3VH、OKT3VH、H57VH和2C11VH结构域，分别如SEQIDNO:2、6、49和58所示。其它示范性VH结构域包括：Cris-7VH结构域，例如SEQIDNO:220、243、244和245所示的那些。示范性VL结构域包括：BC3VL、OKT3VL、H57VL和2C11VL结构域，分别如SEQIDNO:4、8、51和60所示。其它示范性VL结构域包括：Cris-7VL结构域，例如SEQIDNO:222、241和242所示的那些。在某些实施方式中，结合域包含或是与轻链可变区(VL)(例如，SEQIDNO:4、8、51、60、222、241或242)或与重链可变区(VH)(例如，SEQIDNO:2、6、49、58、220、243、244或245)的氨基酸序列有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％相同性的序列，或者二者来自能特异性结合TCR复合物或其组分，例如CD3ε、TCRα、TCRβ、TCRγ和TCRδ，或它们组合的单克隆抗体或其片段或衍生物。
本文所用的“序列相同性”指序列比对并引入空位(如需要)以获得最大百分比序列相同性后，一条序列与另一条参比多肽序列的氨基酸残基相同的氨基酸残基百分数，不考虑任何保守性取代作为序列相同性的一部分。可采用Altschul等((1997)"空位BLAST和PSI-BLAST：新一代蛋白质数据库检索程序(GappedBLASTandPSI-BLAST:anewgenerationofproteindatabasesearchprograms)",NucleicAcidsRes.25:3389-3402)定义的NCBIBLAST2.0软件产生序列相同性百分数值，参数设定为默认值。
在某些实施方式中，本发明结合域的VH区可衍生自或基于已知的单克隆抗体(例如，Cris-7、BC3、OKT3，包括它们的衍生物)的VH，与已知单克隆抗体的VH相比，其含有一个或多个插入、一个或多个缺失、一个或多个氨基酸取代(例如，保守性氨基酸取代或非保守性氨基酸取代)或上述改变的组合。所述一个或多个插入、一个或多个缺失或一个或多个取代可以在VH区的任何位置，包括该区域的氨基或羧基末端或两端，只要含有修饰的VH区的结合域特异性结合其靶标的亲和力仍类似于野生型结合域。
在某些实施方式中，本发明结合域的VL区衍生自或基于已知的单克隆抗体(例如，Cris-7、BC3、OKT3，包括它们的衍生物)的VL，与已知单克隆抗体的VL相比，其含有一个或多个插入、一个或多个缺失、一个或多个氨基酸取代(例如，保守性氨基酸取代)或上述改变的组合。所述一个或多个插入、一个或多个缺失或一个或多个取代可以在VL区的任何位置，包括该区域的氨基或羧基末端或两端，只要含有修饰的VL区的结合域特异性结合其靶标的亲和力仍类似于野生型结合域。
可采用任一取向安排VH和VL结构域(即，从氨基末端到羧基末端，VH-VL或VL-VH)，可间隔有可变区连接序列。在某些实施方式中，可变区连接序列包括属于以下家族的那些序列：GlySer、Gly2Ser(SEQIDNO:339)、Gly3Ser(SEQIDNO:340)、Gly4Ser(SEQIDNO:341)和Gly5Ser(SEQIDNO:342)，包括(Gly3Ser)1(Gly4Ser)1(SEQIDNO:343)、(Gly3Ser)2(Gly4Ser)1(SEQIDNO:344)、(Gly3Ser)3(Gly4Ser)1(SEQIDNO:345)、(Gly3Ser)4(Gly4Ser)1(SEQIDNO:346)、(Gly3Ser)5(Gly4Ser)1(SEQIDNO:347)、(Gly3Ser)1(Gly4Ser)1(SEQIDNO:348)、(Gly3Ser)1(Gly4Ser)2(SEQIDNO:349)、(Gly3Ser)1(Gly4Ser)3(SEQIDNO:350)、(Gly3Ser)1(Gly4Ser)4(SEQIDNO:351)、(Gly3Ser)1(Gly4Ser)5(SEQIDNO:352)、(Gly3Ser)3(Gly4Ser)3(SEQIDNO:353)、(Gly3Ser)4(Gly4Ser)4(SEQIDNO:354)、(Gly3Ser)5(Gly4Ser)5(SEQIDNO:355)或(Gly4Ser)2(SEQIDNO:356)、(Gly4Ser)3(SEQIDNO:145)、(Gly4Ser)4(SEQIDNO:357)或(Gly4Ser)5(SEQIDNO:358)。在某些实施方式中，这种可变区连接序列是GGGGSGGGGSGGGGSAQ(SEQIDNO:98)。在优选的实施方式中，利用这些基于(GlyxSer)的接头连接可变区，而不用于连接结合域(例如，scFv)至Fc尾(例如，IgGCH2CH3)。在某些实施方式中，可变区连接序列包含约5-35个氨基酸，优选包含约15-25个氨基酸。
如本文所述，特定结构域或区域的氨基或羧基末端处的任何插入、缺失或取代可以是，例如，如何工程改造一个可变区使之连接于另一可变区(例如，VH与VL区之间或VL与VH区之间接合处的氨基酸改变)，如何工程改造结合域使之连接于恒定区(例如，结合域与绞链接头之间接合处的氨基酸改变)所产生的。例如，可在一个或多个融合蛋白连接处加入、删除或取代一个或多个(例如，2-8个)氨基酸，如下文详述的那样。
示范性的本发明结合域包括SEQIDNO:18、20、48、62和258-264所示那些。在某些优选实施方式中，本发明的单链融合蛋白包含具有SEQIDNO:258-264中任一所示氨基酸序列的结合域。
接头多肽
本文所述的本发明融合蛋白包含连接能特异性结合TCR复合物或其组分的结合域与免疫球蛋白CH2区或免疫球蛋白CH3区的接头多肽。除了在融合蛋白的结合域与其余部分之间提供间隔功能外，接头还可为融合蛋白结合域的适当取向提供合适的灵活性或刚性以利于与其靶标(即，TCR复合物或其组分，例如CD3)相互作用。此外，接头可支持全长融合蛋白的表达并在给予有此需要的对象后为纯化蛋白提供体外和体内稳定性，优选在此类对象中无免疫原性或免疫原性差。
本发明考虑的接头包括，例如衍生自以下区域的肽：免疫球蛋白超家族成员的结构域间区域、免疫球蛋白的结构域间区域(例如，抗体绞链区)，或C-型凝集素(II型膜蛋白家族)的主茎区域(参见，例如示范性凝集素主茎区域序列，见通过引用纳入本文的PCT申请公布号WO2007/146968，例如该出版物的SEQIDNO:111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、271、273、275、277、279、281、287、289、297、305、307、309-311、313-331、346、373-377、380或381)，和分化群(CD)分子主茎区域。
适合用于本发明融合蛋白的接头包括选自IgG绞链、IgA绞链、IgD绞链、IgECH2、IgMCH2或它们的片段或变体的抗体绞链区。在某些优选的实施方式中，接头可以是选自人IgG1、人IgG2、人IgG3、人IgG4或它们的片段或变体的抗体绞链区。在一些实施方式中，所述接头是野生型免疫球蛋白绞链区，例如野生型人免疫球蛋白绞链区。示范性接头是野生型人IgG1绞链区和野生型小鼠IGHG2c绞链区，其序列分别见SEQIDNO:63和72。
在某些实施方式中，可将一个或多个氨基酸残基加入野生型免疫球蛋白绞链区的氨基或羧基末端作为融合蛋白构建物设计的一部分。代表性的修饰接头可在氨基末端含有额外的连接氨基酸残基，例如“RT”(如SEQIDNO:100和52所示)、“RSS”(如SEQIDNO:328和331-338所示)、"TG"(如SEQIDNO:177所示)或"T"(如SEQIDNO:300所示)；在羧基末端含有额外的连接氨基酸残基，例如"SG"(如SEQIDNO:212和213所示)；或缺失与添加的组合，例如ΔP与在羧基末端加入"SG"(如SEQIDNO:212所示)。
在优选的实施方式中，接头是突变的免疫球蛋白绞链区，例如突变的IgG免疫球蛋白绞链区。例如，野生型人IgG1绞链区含有3个半胱氨酸残基。氨基最末端半胱氨酸称为第一半胱氨酸，而绞链区的羧基最末端半胱氨酸称为第三半胱氨酸。在某些实施方式中，接头是仅含两个半胱氨酸残基的突变型人IgG1绞链区，例如第一半胱氨酸被丝氨酸取代的人IgG1绞链区。在某些其它实施方式中，接头是仅含一个半胱氨酸残基，例如第一、或第二或第三半胱氨酸的突变型人IgG1绞链区。在某些实施方式中，人IgG1绞链区中第三半胱氨酸羧基末端的第一脯氨酸被(例如)丝氨酸取代。可在融合蛋白的结合域与其余部分之间用作接头多肽的示范性突变型人IgG1绞链区见序列表所示，例如接头47-49、51和53-60(分别是SEQIDNO:99、146-148和150-157)。在某些实施方式中，可将一个或多个氨基酸残基加入突变型免疫球蛋白绞链区的氨基或羧基末端作为融合蛋白构建物设计的一部分。此类修饰接头的例子见SEQIDNO:10、335和300所示，其中氨基酸残基“RT”、“RSS”或"T"分别加入突变型人IgG1绞链区的氨基末端。
在某些实施方式中，接头可含有一个或一个以上半胱氨酸残基，但有一个半胱氨酸残基用于形成链间二硫键，例如IgG的第二或第三半胱氨酸。在其它实施方式中，接头可含有两个或多个半胱氨酸残基，但有两个半胱氨酸残基用于形成链间二硫键。
在某些实施方式中，与野生型免疫球蛋白绞链区相比，本发明的接头多肽衍生自野生型免疫球蛋白绞链区(例如，IgG1绞链区)，含有一个或多个(例如，1、2、3或4)插入、一个或多个(例如，1、2、3或4)缺失、一个或多个(例如，1、2、3或4)氨基酸取代(例如，保守性氨基酸取代或非保守性氨基酸取代)或以上突变的组合，只要该修饰的绞链为融合蛋白结合域的适当取向保留了合适的灵活性或刚性而仍能与其靶标相互作用即可。所述一个或多个插入、一个或多个缺失或一个或多个取代可以在野生型免疫球蛋白绞链区的任何位置，包括氨基或羧基末端或两端。在某些实施方式中，接头多肽包含或是与野生型免疫球蛋白的绞链区，例如与野生型人IgG1绞链、野生型人IgG2绞链或野生型人IgG4绞链有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同性的序列。
可嫁接连接IgV-样或IgC-样结构域的细胞表面受体部分的备选绞链或接头序列。含有多个串联IgV-样结构域的细胞表面受体IgV-样结构域之间的区域，和含有多个串联IgC样区域的细胞表面受体IgC-样结构域之间的区域也可用作连接区域或接头肽。IgV-样与IgC-样之间，或IgC-样或IgV-样结构域之间的结构域间区域的代表性绞链或接头序列见于CD2、CD4、CD22、CD33、CD48、CD58、CD66、CD80、CD86、CD96、CD150、CD166和CD244中。可嫁接非免疫球蛋白超家族成员II型受体，例如CD69、CD72和CD161的含二硫键区域的多个备选绞链。
在某些实施方式中，绞链或接头序列含有2-150个氨基酸、5-60个氨基酸、2-40个氨基酸，优选含有8-20个、更优选含有12-15个氨基酸，所述序列可以是灵活的，但也可提供更刚性的特征或可主要含有α螺旋结构与最少的β片层结构。绞链和接头优选在血浆和血清中稳定并耐受蛋白酶水解切割。在某些实施方式中，突变IgG1的上部绞链区的第一赖氨酸，以尽可能减少蛋白酶水解切割，该赖氨酸优选用甲硫氨酸、苏氨酸、丙氨酸或甘氨酸取代，或缺失(参见，例如SEQIDNO:379-434，可在氨基端包含连接氨基酸，优选RT)。在一些实施方式中，序列可含有天然产生的或加入的基序，例如核心结构CPPC(SEQIDNO:330)，从而能形成二硫键或多个二硫键以稳定分子的羧基末端。在其它实施方式中，序列可含有一个或多个糖基化位点。绞链长度改变后的出乎意料特征是能调节本发明单链融合蛋白导致的钙流出水平(参见实施例5)。能调节钙流出的示范性绞链包括SEQIDNO:212-218。此外，绞链长度和/或序列还可影响融合蛋白阻断T细胞对同种抗原应答反应的活性(参见实施例10)。可用作本发明融合蛋白连接区域的接头见SEQIDNO:379-434。
免疫球蛋白C H2 区多肽
本文所述的本发明融合蛋白可包含297位天冬酰胺处含有氨基酸取代(例如，天冬酰胺变为丙氨酸)的免疫球蛋白CH2区。此类氨基酸取代可减少或消除糖基化位点并消除Fc与FcγR和C1q的有效结合。
在某些实施方式中，本发明的融合蛋白可包含234-238位含有至少一个取代或缺失的免疫球蛋白CH2区。例如，免疫球蛋白CH2区可包含234、235、236、237或238位，234和235位，234和236位、234和237位，234和238位，234-236位，234、235和237位、234、236和238位、234、235、237和238位，236-238位取代，或234-238位有2、3、4或5个氨基酸(取代)的任何其它组合。此外，突变的CH2区可包含234-238位，优选236位或237位之一的一个或多个(例如，2、3、4或5)氨基酸缺失，同时含其它位置的取代。上述突变可减少或消除融合蛋白的抗体依赖性细胞介导的细胞毒(ADCC)活性或Fc受体结合能力。在某些优选的实施方式中，234-238位一个或多个氨基酸残基被一个或多个丙氨酸残基取代。在进一步优选的实施方式中，234-238位仅有一个氨基酸残基缺失同时234-238位有一个或多个其它氨基酸被另一氨基酸(例如，丙氨酸或丝氨酸)取代。
在某些其它实施方式中，本发明的融合蛋白可包含253、310、318、320、322和331位含有一个或多个氨基酸取代的免疫球蛋白CH2区。例如，免疫球蛋白CH2区可包含253、310、318、320、322或331位，318和320位，318和322位，318、320和322位取代，或253、310、318、320、322和331位2、3、4、5或6个氨基酸(取代)的任何其它组合。上述突变可减少或消除该融合蛋白的补体依赖细胞毒性(CDC)。
在某些其它实施方式中，除297位氨基酸取代外，本发明融合蛋白中的突变CH2区可包含234-238位一个或多个(例如，2、3、4或5)额外取代。例如，免疫球蛋白CH2区可包含234和297位，234、235和297位，234、236和297位，234-236和297位，234、235、237和297位、234、236、238和297位、234、235、237、238和297位、236-238和297位取代，或包含除297位外234-238位2、3、4或5个氨基酸(取代)的任何组合。此外，突变的CH2区可包含234-238位，例如236位或237位一个或多个(例如，2、3、4或5)氨基酸缺失。这些额外的突变可减少或消除该融合蛋白的抗体依赖性细胞介导的细胞毒(ADCC)活性或Fc受体结合能力。在某些实施方式中，234-238位一个或多个的氨基酸残基被一个或多个丙氨酸残基取代。在进一步的实施方式中，234-238位仅有一个氨基酸残基缺失同时234-238位一个或多个其它氨基酸被另一氨基酸(例如，丙氨酸或丝氨酸)取代。
在某些实施方式中，除234-238位一个或多个(例如，2、3、4或5)氨基酸取代外，本发明融合蛋白中突变的CH2区在参与补体结合的一个或多个位置(例如，在I253、H310、E318、K320、K322或P331位)可含有一个或多个(例如，2、3、4、5或6)额外的氨基酸取代(例如，用丙氨酸取代)。优选的突变免疫球蛋白CH2区包括在234、235、237(如果存在的话)、318、320和322位含有丙氨酸取代的人IgG1、IgG2、IgG4的和小鼠IgG2a的CH2区。示范性的突变免疫球蛋白CH2区是在L234、L235、G237、E318、K320和K322位含有丙氨酸取代的小鼠IGHG2c的CH2区(SEQIDNO:50)。
在还要进一步的实施方式中，除297位氨基酸取代和234-238位的一个或多个额外缺失或取代外，本发明融合蛋白的突变CH2区还可包含235、310、318、320、322和331位一个或多个(例如，2、3、4、5或6)额外的取代。例如，免疫球蛋白CH2区可包含(1)297位取代，(2)234-238位一个或多个取代或缺失或其组合，和I253、H310、E318、K320、K322和P331位一个或多个(例如，2、3、4、5或6)氨基酸取代，例如E318、K320和K322位的1、2、3个取代。上述位置的氨基酸优选被丙氨酸或丝氨酸取代。
在某些实施方式中，免疫球蛋白CH2区多肽可包含：(i)297位天冬酰胺的氨基酸取代和234、235、236或237位的一个氨基酸取代；(ii)297位天冬酰胺的氨基酸取代和234-237位中两个的氨基酸取代；(iii)297位天冬酰胺的氨基酸取代和234-237位中三个的氨基酸取代；(iv)297位天冬酰胺的氨基酸取代，234、235和237位的氨基酸取代，和236位的氨基酸缺失；(v)234-237位中三个的氨基酸取代，和318、320和322位的氨基酸取代；或(vi)234-237位中三个的氨基酸取代，236位的氨基酸缺失，和318、320和322位的氨基酸取代。
在本发明融合蛋白含297位天冬酰胺氨基酸取代的示范性突变免疫球蛋白CH2区包括：L234、L235、G237和N297位含丙氨酸取代和G236缺失的人IgG1CH2区(SEQIDNO:103)、V234、G236和N297位含丙氨酸取代的人IgG2CH2区(SEQIDNO:104)、F234、L235、G237和N297位含丙氨酸取代和G236缺失的人IgG4CH2区(SEQIDNO:75)、F234和N297位含丙氨酸取代的人IgG4CH2区(SEQIDNO:375)、L235和N297位含丙氨酸取代的人IgG4CH2区(SEQIDNO:376)、G236和N297位含氨酸取代的人IgG4CH2区(SEQIDNO:377)、和在G237和N297位含丙氨酸取代的人IgG4CH2区(SEQIDNO:378)。
在某些实施方式中，除上述氨基酸取代外，本发明融合蛋白中的突变CH2区除上述位置外可含有一个或多个位置的一个或多个额外的氨基酸取代。此类氨基酸取代可以是保守性或非保守性氨基酸取代。例如，在某些实施方式中，突变的IgG2CH2区的P233可改变为E233(参见，例如SEQIDNO:104)。此外，在某些实施方式中，本发明融合蛋白中的突变CH2区可含有一个或多个氨基酸插入、缺失或二者。所述一个或多个插入、一个或多个缺失或一个或多个取代可以在免疫球蛋白CH2区的任何位置，例如野生型免疫球蛋白CH2区的N-或C-末端，这是由于通过接头使CH2区与另一区域(例如可变区)相连所致。
在某些实施方式中，本发明融合蛋白中的突变CH2区包含，或与野生型免疫球蛋白CH2区，例如野生型人IgG1、IgG2或IgG4或小鼠IgG2a(例如IGHG2c)的CH2区有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同性的序列。
本发明融合蛋白中的突变免疫球蛋白CH2区可衍生自各种物种(包括人、小鼠、大鼠和其它哺乳动物)的各种免疫球蛋白同种型，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2和IgD的CH2区。在某些优选的实施方式中，本发明融合蛋白中的突变免疫球蛋白CH2区可衍生自人IgG1、IgG2或IgG4或小鼠IgG2a(例如IGHG2c)的CH2区，它们的序列见SEQIDNO:64、66、68和73。
本领域知道在Fc结构域内或外制作突变的方法，这种突变能改变Fc与Fc受体(CD16、CD32、CD64、CD89、FcεR1、FcRn)或补体组分C1q的相互作用(参见，例如美国专利号5,624,821；Presta(2002)Curr.Pharma.Biotechnol.3:237)。
在某些实施方式中，本发明的融合蛋白不包含任何免疫球蛋白CH2区。
免疫球蛋白C H3 区多肽
本文所述的本发明融合蛋白包含一个或多个免疫球蛋白CH3区多肽。在某些实施方式中，本发明的融合蛋白不含有任何CH2区。在此类实施方式中，特异性结合TCR复合物或其组分的结合域通过接头(例如，绞链)多肽直接连接于免疫球蛋白CH3区。在CH2区不存在的某些实施方式中，本发明的融合蛋白可仅包含一个CH3区。其它实施方式包括含有两个CH3区，不含CH2区的本发明融合蛋白。
在融合蛋白同时包含突变的免疫球蛋白CH2区和免疫球蛋白CH3区的实施方式中，CH2和CH3区可衍生自相同的或不同的免疫球蛋白、抗体同种型或等位基因变体。CH2区优选直接连接于CH3区的氨基末端。包含直接连接于CH3区氨基末端的CH2区的示范性序列见SEQIDNO:11-14和101所示。或者，CH2区可通过一个或多个氨基酸或通过接头(例如，序列表中所列的接头)连接于CH3区。
在某些实施方式中，本发明的融合蛋白可包含两个免疫球蛋白CH3区。这些CH3区可以是相同免疫球蛋白同种型的野生型或突变CH3区，或者可来自不同的免疫球蛋白同种型。例如，在某些实施方式中，融合蛋白包含人IgM的CH3区和人IgG1的CH3区。其中人IgM的CH3区和人IgG1的CH3区连接在一起的示范性序列包括SEQIDNO:15和74。在某些其它实施方式中，融合蛋白包含小鼠CH3μ区和小鼠CH3γ区。其中小鼠CH3μ区和小鼠CH3γ区连接在一起的示范性序列包括SEQIDNO:308和309。
在融合蛋白包含两个免疫球蛋白CH3区的实施方式中，位于另一CH3区氨基末端的CH3区称为“第一CH3区”，另一CH3区称为“第二CH3区”。在此类实施方式中，所述两个免疫球蛋白CH3区可彼此直接融合。换言之，第一CH3区的C-末端直接连接于第二CH3区的氨基末端，没有任何间插氨基酸残基(即无接头)。或者，两个CH3区可通过一个或多个(例如，2-8)氨基酸或通过接头(参见，例如序列表所列的接头)相连。
在某些实施方式中，本发明融合蛋白中的免疫球蛋白CH3区可含有一个或多个(例如，2-8)额外氨基酸取代。此类氨基酸取代可以是保守性或非保守性氨基酸取代。此外，在某些实施方式中，本发明融合蛋白中的CH3区可含有不同位置的一个或多个(例如，2-8)氨基酸插入、缺失或二者。所述一个或多个插入、一个或多个缺失或一个或多个取代可以在免疫球蛋白CH3区的任何位置，包括氨基-或羧基-末端或二者。
在某些实施方式中，本发明融合蛋白中的免疫球蛋白CH3区包含，或与野生型免疫球蛋白CH3区，例如野生型人IgM、IgG1、IgG2或IgG4的CH3区有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同性的序列。
在某些实施方式中，免疫球蛋白CH3区多肽是野生型免疫球蛋白CH3区多肽，包括各种物种(即，人、小鼠、大鼠或其它哺乳动物)的任何免疫球蛋白同种型(例如，IgA、IgD、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgE或IgM)的野生型CH3区。例如，免疫球蛋白CH3区可以是野生型人IgG1CH3区(例如，SEQIDNO:65)、野生型人IgG2CH3区(例如，SEQIDNO:67)、野生型人IgG4CH3区(例如，SEQIDNO:69)、野生型人IgMCH3区(例如，SEQIDNO:71)、小鼠CH3μ区(例如，SEQIDNO:329)或野生型小鼠IGHG2cCH3区(例如，SEQIDNO:54)。在进一步的实施方式中，免疫球蛋白CH3区多肽是突变的免疫球蛋白CH3区多肽。免疫球蛋白CH3区中的突变可发生在参与补体结合的一个或多个位置，例如H433或N434位。
额外的序列和修饰
如本文所述，本发明的单链融合蛋白从氨基末端到羧基末端可包含：(a)特异性结合CD3(例如，CD3ε)的结合域，(b)接头多肽，(c)任选的免疫球蛋白CH2区多肽，和(d)免疫球蛋白CH3区多肽。此外，本发明的融合蛋白可包含一个或多个额外的区域，例如氨基末端含用于融合蛋白表达的前导序列、额外的Fc亚区(例如，IgM或IgE的野生型或突变的CH4区)，或羧基末端含用于鉴定或纯化目的的尾序列。示范性的尾序列可包含用于检测或纯化的表位标签，例如6-组氨酸区域或FLAG表位。
例如，该融合蛋白可含有能利用特定表达系统的额外氨基酸残基。例如，利用市售可购得的载体将所需多肽表达为谷胱甘肽-S转移酶(GST)融合产物的一部分而提供所需多肽，在切去所需多肽的GST组分后含有1位额外的甘氨酸残基。也考虑包括在其它载体系统中表达所产生的变体，包括在氨基酸序列中，通常在该序列的羧基和/或氨基末端掺入组氨酸标签的那些变体。融合蛋白羧基或氨基末端可能存在的示范性额外序列包括三拷贝的FLAG表位、一拷贝的AVI标签和六个组氨酸，如SEQIDNO:70所示。
在某些实施方式中，本发明的融合蛋白N-末端包含前导肽。该前导肽能促进所表达融合蛋白的分泌。预计采用任何常规的前导肽(信号序列)能引导新表达的多肽或融合蛋白进入分泌途径，导致从成熟融合蛋白或在前导肽与融合蛋白之间接合处附近切除该前导肽。可根据本领域所知的考虑选择具体的前导肽，例如采用易于将限制性内切核酸酶切割位点包含在前导肽编码序列起始端或末端的核酸分子编码的序列，以利于分子的工程改造，只要此类引入的序列涉及的氨基酸对新表达蛋白的前导肽所需加工的干扰或对多肽或融合蛋白所需功能的干扰可以接受(如果多肽或融合蛋白成熟期间此前导肽不被切去的话)。本发明的示范性前导肽包括天然的前导序列或其它前导序列，例如H3N-MDFQVQIFSFLLISASVIMSRG-CO2H(SEQIDNO:9)。
在某些实施方式中，本发明的融合蛋白被糖基化，其糖基化模式取决于各种因素，包括表达该蛋白质的宿主细胞(如果用重组宿主细胞制备的话)和培养条件。
在进一步的实施方式中，相对于免疫球蛋白参比序列的CH2或CH3区，本发明融合蛋白的免疫球蛋白CH2或CH3区可含有改变的糖基化模式。例如，可采用各种遗传技术改变形成糖基化位点的一个或多个具体氨基酸残基(参见Co等(1993)Mol.Immunol.30:1361；Jacquemon等(2006)J.Thromb.Haemost.4:1047；Schuster等(2005)CancerRes.65:7934；Warnock等(2005)Biotechnol.Bioeng.92:831)。或者，可工程改造产生本发明融合蛋白的宿主细胞以产生改变的糖基化模式。
在某些实施方式中，本发明还提供本文所述融合蛋白的衍生物。这种衍生物包括携带除氨基酸残基插入、缺失或取代以外的修饰的融合蛋白。所述修饰性质上优选共价修饰，包括，例如与聚合物、脂质、其它有机和无机分子的化学键合。可制备本发明的衍生物以延长特定融合蛋白的循环半衰期，或可设计出靶向所需细胞、组织或器官能力提高的融合蛋白。
在某些实施方式中，可采用本领域已知的方法提高本发明融合蛋白的体内半衰期以延长大分子的半衰期。例如，本发明包括经共价修饰或衍生而包含附着于一个或多个水溶性聚合物的融合蛋白，所述聚合物例如有聚乙二醇、聚氧乙烯二醇或聚丙二醇(参见，例如美国专利号4,640,835；4,496,689；4,301,144；4,670,417；4,791,192；4,179,337)。本领域已知的其它有用聚合物包括：单甲氧基-聚乙二醇、葡聚糖、纤维素和其它糖基聚合物、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)-聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇(如甘油)和聚乙烯醇、以及这些聚合物的混合物。特别优选的是聚乙二醇(PEG)衍生的蛋白质。可使水溶性聚合物在特定位置，例如在本发明融合蛋白的氨基末端键合或者随机键合连接于所述多肽的一个或多个侧链。美国专利6,133,426中描述了利用PEG来提高治疗性能。
在一些实施方式中，本发明融合蛋白是还含有位于氨基末端的免疫球蛋白绞链区的PIMS分子。此氨基末端绞链区可以与见于免疫球蛋白CH3区与结合域之间的接头相同或不同。在一些实施方式中，置于氨基末端的接头含有天然产生的或加入的基序(例如CPPC，SEQIDNO:330)以促进形成至少一个二硫键而稳定二聚或多聚化分子的氨基末端。
制备和纯化融合蛋白的方法
可根据本领域已知的方法制备本发明的融合蛋白。例如，制备SMIP融合蛋白的方法描述于美国专利公布号2003/0133939、2003/0118592和2005/0136049，制备PIMS蛋白的方法描述于，例如PCT申请公布号WO2009/023386。
在某些实施方式中，本发明提供本文所述的纯化融合蛋白。本文所用的术语“纯化”指与其它组分分离的组合物，其中该融合蛋白相对于其天然可获得的状态纯化至任何程度。因此，“纯化的蛋白质”也指与其天然产生的环境分离的此类蛋白质。在某些实施方式中，本发明提供基本纯的本文所述融合蛋白。“基本纯”指蛋白质构成该组合物主要成分的蛋白质组合物，例如占组合物中蛋白质重量的约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％、约99％或更高。
蛋白质纯化技术是本领域技术人员众所周知的。这些技术包括在某一水平上对多肽和非多肽组分进行粗分级。常常需要用层析和电泳技术进行进一步纯化，以实现部分或完全纯化(或纯化至均一)。特别适合制备纯融合蛋白的分析方法是离子交换色谱、排阻色谱、聚丙烯酰胺凝胶电泳和等电聚焦。特别有效的肽纯化方法是快速蛋白质液相色谱和HPLC。
本领域技术人员知道可借鉴本发明来定量测定纯化程度的各种方法。它们包括例如，测定活性组分的特异性结合活性，或通过SDS/PAGE分析评估组分中蛋白的含量。评估蛋白质组分纯度的优选方法是计算该组分的结合活性，将其与初始提取物的结合活性作比较，从而计算出纯化程度，在本文中通过“纯化倍数”评价。当然，用于代表结合活性水平的实际单位取决于所选择的跟踪纯化的具体测定技术和表达的蛋白是否显示了可检测的结合活性。
示范性融合蛋白
本发明的示范性单链融合蛋白包括：BC3IgG1N297、BC3IgG1AA、BC3IgG2AA、BC3IgG4AA、BC3HM1、BC3ΔCH2、OKT3IgG1AA、OKT3IgG2AA、OKT3IgG4AA、OKT3HM1、OKT3ΔCH2、H57null2和2C11null2，分别如SEQIDNO:80-85、88-93、96和97所示。本发明的示范性优选单链融合蛋白包括：嵌合型Cris-7IgG1AA、嵌合型Cris-7IgG2AA、嵌合型Cris-7IgG4AA、嵌合型Cris-7HM1、人源化Cris-7IgG1AA、人源化Cris-7IgG2AA、人源化Cris-7IgG4AA和人源化Cris-7HM1，分别如SEQIDNO:265-299所示。其它示范性单链融合蛋白包括不含羧基末端标签的BC3HM1、BC3ΔCH2、OKT3HM1和OKT3ΔCH2，分别如SEQIDNO:86、87、94和95所示。其它示范性融合蛋白包括氨基末端含前导序列的上述融合蛋白，如SEQIDNO:22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、47、56、76-79、224、226、228、230、232、234、236、238、240、247、249、251、253、255和257所示。氨基末端含前导序列的其它示范性融合蛋白包括H57halfnull(SEQIDNO:304)和H57HM2(SEQIDNO:306)。其它示范性融合蛋白是含有各种接头序列的BC3IgG1N297，如SEQIDNO:311、313、315、317、319、321、323、325和327所示。这些示范性单链融合蛋白中的几种详述见以下实施例章节。
功能特征
本文所述的本发明单链融合蛋白可具有一个或多个(例如，2、3、4、5、6、7)或它们任何组合的以下特征或功能特征：(1)不激活T细胞，(2)不诱导细胞因子释放或诱导最低的细胞因子释放，(3)诱导TCR信号传导途径分子磷酸化，(4)增加钙流出超过相应的单克隆抗体，(5)阻断T细胞对同种抗原的应答反应，(6)阻断记忆T细胞对抗原的应答反应，和(7)下调TCR复合物。
在某些优选的实施方式中，本发明的单链融合蛋白不活化或最小活化T细胞。在本发明实施例提供的至少一个体外或体内试验中，如果用于处理T细胞(例如，PHA-或ConA-致敏T细胞)时，与未处理细胞相比，某融合蛋白不导致活化T细胞百分比有统计学的显著增加，则该融合蛋白“不活化或最小活化或微不足道地活化T细胞”。优选在实施例1描述的体外致敏T细胞活化试验中检测T细胞的活化。
在进一步优选的实施方式中，本发明的融合蛋白不诱导细胞因子风暴或不诱导临床相关的细胞因子风暴。在本领域已知或本发明实施例提供的至少一个体外或体内试验中，如果用于处理T细胞时，某融合蛋白不导致处理细胞的至少一种细胞因子释放量比未处理者有统计学的显著增加，则该融合蛋白“不诱导细胞因子风暴”(也称为“诱导不可检测的、微不足道或最小的细胞因子释放”或“不诱导或诱导最低的可检测细胞因子释放”)，所述细胞因子包括IFNγ；优选至少两种细胞因子，包括IFNγ和TNFα，或IL-6和TNFα；优选三种细胞因子，包括IL-6、IFNγ和TNFα；优选四种细胞因子，包括IL-2、IL-6、IFNγ和TNFα；优选至少五种细胞因子，包括IL-2、IL-6、IL-10、IFNγ和TNFα。优选在实施例1描述的致敏T细胞体外释放细胞因子试验中检测细胞因子风暴。临床上，细胞因子释放综合征的特征在于发热、寒颤、皮疹、恶心和有时呼吸窘迫及心动过速，伴有某些细胞因子，例如IFNγ以及IL-2、IL-6和TNFα的最大释放。可在体外或体内试验中检验的细胞因子包括：G-CSF、GM-CSF、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13、IL-17、IP-10、KC、MCP1、IFNγ和TNFα；更优选包括IL-2、IL-6、IL-10、IFNγ和TNFα的释放。
在进一步优选的实施方式中，本发明的融合蛋白导致细胞，例如T细胞钙流出的增加。如果用于处理T细胞时，在本领域已知或本文提供的体外试验中，某融合蛋白导致处理细胞的钙流出比用相应抗体(即，含有与本发明单链融合蛋白相同结合域的抗体)处理的细胞有统计学显著的快速增加(优选在处理的300秒内，更优选在200秒内，最优选在100秒内)，则该融合蛋白可导致“钙(流出)增加”。优选在实施例5所述体外钙流出试验中将本发明单链融合蛋白导致的钙流出与相应抗体导致的钙流出作比较，并至少在处理的最初100-300秒内观察或检测。
在进一步的实施方式中，本发明的单链融合蛋白诱导TCR信号转导途径分子的磷酸化。“TCR信号转导途径”指通过肽:MHC配体与TCR及其辅受体(CD4或CD8)结合而启动信号转导的途径。“TCR信号转导途径分子”指直接参与TCR信号转导途径的分子，例如在对肽:MHC配体与TCR及其辅受体结合的信号应答反应中，其磷酸化状态(例如，该分子是否磷酸化)、对另一分子的结合亲和力或酶活性发生改变的分子。TCR信号转导途径的示范性分子包括：TCR复合物或其组分(例如，CD3ζ链)、ZAP-70、Fyn、Lck、磷脂酶c-γ、蛋白激酶C、转录因子NFκB、钙调磷酸酶、转录因子NFAT、鸟嘌呤核苷酸交换因子(GEF)、Ras、MAP激酶的激酶的激酶(MAPKKK)、MAP激酶的激酶(MAPKK)、MAP激酶(ERK1/2)和Fos。
在本发明实施例描述的体外或体内试验中或本领域已知的受体信号传导试验中，如果用于处理T细胞时，本发明的某单链融合蛋白导致TCR信号转导途径分子(例如，CD3ζ链、ZAP-70和ERK1/2)的磷酸化有统计学的显著增加，则该单链融合蛋白“诱导了TCR信号转导途径分子的磷酸化”。可采用免疫组化方法，例如蛋白质印迹或荧光显微术，测定本领域已知的大多数受体信号传导试验的结果。
在进一步的实施方式中，本发明的单链融合蛋白可阻断T细胞对同种抗原的应答反应。“同种抗原”是物种中存在的另一种(等位基因)形式的抗原，在一种形式转移给缺乏该同种抗原的该物种另一成员时可诱导免疫应答。示范性的同种抗原可见于，例如血细胞(即，血型抗原)或组织移植物(即，同种移植物)。
在本发明实施例提供的体外或体内试验，例如人混合淋巴细胞反应(MLR)试验和急性移植物抗宿主病(aGVHD)模型中，如果用于处理T细胞时，本发明的某单链融合蛋白导致对同种抗原应答反应而活化的T细胞百分比有统计学显著的降低，则该单链融合蛋白“能阻断T细胞对同种抗原的应答反应”。也可用本领域已知的其它试验，例如结合试验和皮肤试验，如检测迟发型超敏反应的小鼠足垫肿胀试验，来测定对同种抗原的反应。
在进一步的实施方式中，本发明的融合蛋白能阻断记忆T细胞对抗原的应答反应。在本发明实施例提供的体外或体内试验，例如利用破伤风类毒素分析记忆T细胞活化的试验中，如果用于处理记忆T细胞时，某单链融合蛋白导致对特定抗原(例如，破伤风类毒素)应答反应中活化T细胞百分比有统计学显著的降低，则该单链融合蛋白“能阻断记忆T细胞对抗原的应答反应”。也可用动物免疫模型通过体内和离体抗原呈递试验检测继发性抗原特异性T细胞应答。除了上述迟发型超敏反应试验外，可采用细胞毒性试验，例如51Cr-释放试验检测T细胞活性(Lavie等.,(2000)InternationalImmunology12(4):479-486)。
在进一步的实施方式中，本发明的融合蛋白下调T细胞表面的TCR复合物。在体外或体内试验中，如果用于处理T细胞时，某单链融合蛋白导致T细胞群表面的TCR复合物数量有统计学显著的降低，则该单链融合蛋白“下调TCR复合物”。有用的体外或体内试验包括本发明实施例提供的评估T细胞表面TCR和CD3下调的试验。此类试验通过本领域已知技术，例如流式细胞术和免疫荧光显微术检测，比较刺激前后细胞表面TCR或CD3的表达量。
检测T细胞活化或细胞因子释放的方法
在一相关的方面，本发明提供检测蛋白质诱导T细胞活化的方法，所述蛋白质包含特异性结合TCR复合物或其组分的结合域，该方法包括：(a)提供丝裂原-致敏的T细胞，(b)用包含特异性结合TCR复合物或其组分的结合域的蛋白质处理步骤(a)的致敏T细胞，和(c)检测在步骤(b)中处理的致敏T细胞的活化。
本文所用的术语“丝裂原”指诱导不同专一性或克隆来源的淋巴细胞有丝分裂的化学物质。可用于致敏T细胞的示范性丝裂原包括：植物血凝素(PHA)、伴刀豆球蛋白A(ConA)、脂多糖(LPS)、美洲商陆有丝分裂原(PWM)和肉豆蔻酸-佛波醇-乙酸酯(PMA)。
在本文提供的检测T细胞活化方法的某些实施方式中，包含特异性结合TCR复合物或其组分的结合域的蛋白质是本文提供的融合蛋白。在某些其它实施方式中，包含特异性结合TCR复合物或其组分的结合域的蛋白质是单克隆抗体。
可通过检测本领域已知的活化标记物，例如CD25、CD40配体和CD69的表达来检测T细胞活化。也可用细胞增殖试验，例如CFSE标记和胸苷摄取试验来检测T细胞活化(Adams(1969)Exp.CellRes.56:55)。
在一相关的方面，本发明提供检测蛋白质诱导细胞因子释放的方法，所述蛋白质包含特异性结合TCR复合物或其组分的结合域，该方法包括：(a)提供丝裂原-致敏的T细胞，(b)用包含特异性结合TCR复合物或其组分的结合域的蛋白质处理步骤(a)的致敏T细胞，和(c)检测在步骤(b)中处理的致敏T细胞的细胞因子释放。
在本文提供的检测细胞因子释放的方法的某些实施方式中，包含特异性结合TCR复合物或其组分的结合域的蛋白质是本文提供的融合蛋白。在某些其它实施方式中，包含特异性结合TCR复合物或其组分的结合域的蛋白质是单克隆抗体。
多核苷酸、表达载体和宿主细胞
本发明提供编码本发明融合蛋白的多核苷酸(分离或纯化的或纯的多核苷酸)、包含这类多核苷酸的载体(包括克隆载体和表达载体)以及用本发明多核苷酸或载体转化或转染的细胞(如宿主细胞)。
在某些实施方式中，考虑了编码本发明融合蛋白的多核苷酸(DNA或RNA)。示范性的多核苷酸包括SEQIDNO:21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、46、55、303、306、310、312、314、316、318、320、322、324和326。
本发明还涉及包含本发明多核苷酸的载体，特别是重组表达构建物。在一个实施方式中，本发明考虑了一种载体，其包含编码本发明融合蛋白的多核苷酸，以及启动或促进该融合蛋白转录、翻译和加工的其它多核苷酸序列。
适合用于原核和真核宿主的克隆载体和表达载体可参见例如，Sambrook等，《分子克隆：实验室手册》(MolecularCloning:ALaboratoryManual)，第二版，冷泉港(ColdSpringHarbor)，纽约，(1989)。示范性的克隆/表达载体包括基于质粒、噬菌粒、噬粒、粘粒、病毒、人工染色体或本领域已知适用于扩增、转移和/或表达所含多核苷酸的任何核酸运载体的克隆载体、穿梭载体和表达构建物。
本文所用的“载体”指能够输送所连接的另一核酸的核酸分子。示范性的载体包括质粒、酵母人工染色体和病毒基因组。某些载体能够在宿主细胞中自行复制，而其它载体可整合入宿主细胞基因组中随宿主基因组一起复制。此外，某些载体在本文中称为"重组表达载体"(或简称为"表达载体")，其所含的核酸序列操作性连接于表达调控序列，因此能够指导这些序列的表达。
在某些实施方式中，表达构建物衍生自质粒载体。说明性构建物包括：修饰的pNASS载体(加利福尼亚州帕洛阿尔托的克隆泰克公司(Clontech,PaloAlto,CA))，其含有编码氨苄青霉素抗性基因、聚腺苷酸化信号和T7启动子位点的核酸序列；pDEF38和pNEF38(CMCICOS生物技术公司(CMCICOSBiologics，Inc.))，其含有CHEF1启动子；和pEE12.4(隆萨公司(Lonza))，其含有CMV启动子。其它合适的哺乳动物表达载体是众所周知的(参见例如，Ausubel等，1995；Sambrook等，同上；也参见，例如，加州圣地亚哥的英杰公司(Invitrogen,SanDiego,CA)、威斯康星州麦迪逊的诺华基公司(Novagen,Madison,WI)、新泽西州皮斯卡塔韦的法玛西亚公司(Pharmacia,Piscataway,NJ))的产品目录。可制备包含在合适调控下的二氢叶酸还原酶(DHFR)-编码序列用于提高融合蛋白产量水平的有用构建物，所述产量水平取决于施加合适选择制剂(如甲氨蝶呤)后的基因扩增。
通常，重组表达载体包含允许转化宿主细胞的复制起点和选择性标记，和衍生自高表达基因的能指导下游结构序列转录的启动子，如上所述。与本发明多核苷酸操作性连接的载体可产生克隆构建物或表达构建物。示范性的克隆/表达构建物含有至少一个操作性连接于本发明多核苷酸的表达调控元件，如启动子。也考虑在该载体和本发明克隆/表达构建物中加入其它表达调控元件，如增强子、因子特异性结合位点、终止子和核糖体结合位点。可将本发明多核苷酸的异质结构序列以合适状态与翻译起始和终止序列组装在一起。因此，例如，本文提供的融合蛋白编码核酸可包含在各种表达载体构建物的任何一种中，形成在宿主细胞中表达这类蛋白质的重组表达构建物。
可用各种方法将合适的DNA序列插入载体中。通常，用本领域已知方法将DNA序列插入合适的限制性核酸内切酶切割位点。考虑了克隆、DNA分离、扩增和纯化的标准技术，涉及采用DNA连接酶、DNA聚合酶、限制性核酸内切酶等酶促反应的标准技术以及各种分离技术。许多标准技术的描述可参见例如，Ausubel等(1993《新编分子生物学实验指南》(CurrentProtocolsinMolecularBiology)，马萨诸塞州波士顿的格林出版联合公司和约翰韦利森公司(GreenePubl.Assoc.Inc.&JohnWiley&Sons，Inc.，Boston，MA))；Sambrook等(1989《分子克隆》(MolecularCloning)，第二版，纽约州普莱恩维尤的冷泉港实验室出版社(ColdSpringHarborLaboratory，Plainview，NY))；Maniatis等(1982《分子克隆》，纽约州普莱恩维尤的冷泉港实验室出版社)；Glover(Ed.)(1985《DNA克隆》(DNACloning)第I卷和第II卷，英国牛津的IRL出版社(IRLPress，Oxford，UK))；Hames和Higgins(编)(1985《核酸杂交》(NucleicAcidHybridization)，英国牛津的IRL出版社)；等等。
表达载体中的DNA序列操作性连接于至少一个合适的表达调控序列(如组成型启动子或调节性启动子)以指导mRNA合成。这类表达调控序列的代表性例子包括真核细胞或其病毒的启动子，如上所述。可利用CAT(氯霉素转移酶)载体或含选择性标记的其它载体，选择任何所需基因的启动子区域。真核启动子包括：CMV立即早期、HSV胸苷激酶、早期和晚期SV40、逆转录病毒的LTR和小鼠金属硫蛋白-I启动子。本领域普通技术人员熟知选择合适的载体和启动子，本文描述了某些特别优选的包含操作性连接于本发明蛋白质或多肽编码核酸的至少一个启动子或调节性启动子的重组表达构建物的制备。
也考虑了本发明多核苷酸的变体。变体多核苷酸与本文所述的确定序列的多核苷酸之一至少有90％相同，优选95％、99％或99.9％相同，或者能在严谨杂交条件(0.015M氯化钠、0.0015M柠檬酸钠，约65-68℃；或者0.015M氯化钠、0.0015M柠檬酸钠和50％甲酰胺，约42℃)下与确定序列的多核苷酸之一杂交。这种多核苷酸变体保留了编码具有本文所述功能的结合域或融合蛋白的能力。
术语“严谨”用于指本领域共同理解的严谨条件。杂交的严谨性主要取决于温度、离子强度和变性剂如甲酰胺的浓度。用于杂交和洗涤的严谨条件的例子是0.015M氯化钠、0.0015M柠檬酸钠，约65-68℃；或者0.015M氯化钠、0.0015M柠檬酸钠和50％甲酰胺，约42℃(参见Sambrook等，《分子克隆：实验室手册》(MolecularCloning:ALaboratoryManual)，第2版，纽约州冷泉港的冷泉港实验室出版社(ColdSpringHarborLaboratory，ColdSpringHarbor，N.Y.)，1989)。
也可采用更严谨的条件(如更高的温度、更低的离子强度、更高浓度的甲酰胺或另一变性剂)；然而，杂交速率会受影响。
在某些实施方式中，可采用低严谨条件(例如，较低的温度、较高的离子强度、较低浓度的甲酰胺或另一变性剂)。示范性低严谨杂交和洗涤条件是0.015M氯化钠、0.0015M柠檬酸钠，约42℃。这种多核苷酸变体保留了编码具有本文所述功能的结合域或融合蛋白的能力。
本发明另一方面提供用本发明任何多核苷酸或含它们的载体/表达构建物转化、转染的宿主细胞。可用本领域已知的任何方法，包括转化、转染和转导，将本发明的多核苷酸或克隆/表达构建物引入合适的细胞中。宿主细胞包括接受离体细胞治疗，包括例如离体基因治疗的对象的细胞。携带本发明多核苷酸、载体或蛋白质时，考虑作为本发明某一方面的真核宿主细胞，除对象自身细胞(如人患者的自身细胞)外还包括：VERO细胞、HeLa细胞、中华仓鼠卵巢(CHO)细胞系(包括能够修饰所表达多价结合分子糖基化模式的经修饰的CHO细胞，参见美国专利申请公开号2003/0115614)、COS细胞(如COS-7)、W138、BHK、HepG2、3T3、RIN、MDCK、A549、PC12、K562、HEK293细胞、HepG2细胞、N细胞、3T3细胞、草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)细胞(如Sf9细胞)、酿酒酵母细胞以及本领域已知可用于表达和任选地分离本发明蛋白质或肽的任何其它真核细胞。也考虑原核细胞，包括：大肠杆菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、鼠伤寒沙门菌(Salmonellatyphimurium)、链霉菌、或者本领域已知适合表达和任选地分离本发明蛋白质或肽的任何原核细胞。具体说，在分离原核细胞的蛋白质或肽时，考虑可采用本领域已知的技术提取包涵体蛋白质。选择合适的宿主属于本领域技术人员根据本文所述而所知的范围。考虑了能糖基化本发明融合蛋白的宿主细胞。
术语“重组宿主细胞”(或简称为“宿主细胞”)指含有重组表达载体的细胞。应理解，这类术语不仅指具体的对象细胞，而且指该细胞的后代。在连续传代过程中可能因突变或环境影响而发生某些改变，因此这类后代实际上可能与亲代细胞不完全相同，但仍属于本文所用术语“宿主细胞”的范围内。
可以用经过修饰而适合于激活启动子、能选择转化子或扩增特定基因的常规营养培养基培养重组宿主细胞。本领域普通技术人员不难明白选择用于表达的具体宿主细胞的培养条件，例如温度、pH等。也可用各种哺乳动物细胞培养系统来表达重组蛋白。哺乳动物表达系统的例子包括：Gluzman(1981)Cell23:175所述的猴肾成纤维细胞COS-7细胞系，以及能够表达相容性载体的其它细胞系，例如C127、3T3、CHO、HeLa和BHK细胞系。哺乳动物表达载体包含复制起点、合适的启动子和任选的增强子，还包含任何必需的核糖体结合位点、聚腺苷酸化位点、剪接供体和受体位点、转录终止序列和5′-侧接的非转录序列，例如，本文中关于多价结合蛋白表达构建物制备中所述。可利用衍生自SV40剪接的DNA序列和聚腺苷酸化位点来提供所需的非转录遗传元件。可用本领域技术人员熟悉的各种方法包括磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染或电穿孔将所述构建物引入宿主细胞中(Davis等(1986)《分子生物学基本方法》(BasicMethodsinMolecularBiology))。
在一个实施方式中，用能指导本发明蛋白质或多肽表达的重组病毒构建物转导宿主细胞。被转导的宿主细胞可产生含有所表达蛋白质或多肽的病毒颗粒，所表达的蛋白质或多肽来自病毒出芽期间掺入病毒颗粒中的宿主细胞膜部分。
组合物和使用方法
除了针对TCR复合物或其组分的融合蛋白外，本发明还提供包含该融合蛋白的药物组合物和单位剂型，以及使用该融合蛋白、药物组合物和单位剂型的方法。
为治疗患有TCR信号传导相关疾病状态或病症的人或非人哺乳动物，按照一次或多次给药方案将有效量的融合蛋白给予对象以缓解疾病状况或病症症状。作为多肽，可将本发明的蛋白质悬浮或溶解于药学上可接受的稀释液中，任选包含稳定剂或其它药学上可接受的赋形剂，从而可通过注射或输注用于静脉内给药，下文将更全面地讨论。
药学有效量或剂量是预防、抑制疾病状态或病症发生或治疗疾病状况或病症(在某种程度上缓解其症状，优选所有症状)的用量或剂量。在一优选的实施方式中，用药学有效量的本发明单链融合蛋白治疗T细胞介导疾病。药学有效剂量取决于疾病类型、所用的组合物、给药途径、所治疗对象的类型、要考虑所治疗具体对象的身体特征、同时用的药和医学领域技术人员认识到的其它因素。例如，可根据本发明融合蛋白的效力，给予0.1mg/kg至100mg/kg体重之间的活性成分用量(可作为一次剂量给予，每天、每周、每月给予一次，或间隔任何合适的时间给予)。
如上文和实施例所述，本文提供的针对TCR复合物或其组分(例如CD3)的融合蛋白能独特地参与TCR信号传导途径而不诱导T细胞有丝分裂。以前的研究证明可通过操控TCR-相关信号传导级联反应而驱动外周T细胞发挥功能和分化。例如，可通过强烈的非活化信号诱导T细胞无反应性和适应性T调节细胞。此外，某些T细胞亚组在递送强烈TCR信号后更易发生细胞死亡。因此，本文提供的融合蛋白可用于调节T细胞的功能和命运，从而治疗T细胞介导疾病，包括T细胞有显著作用的自身免疫疾病或炎性疾病。此外，由于本发明融合蛋白不活化T细胞和/或不诱导细胞因子释放，因此没有副作用或副作用减少(例如细胞因子释放综合征和急毒性)，它们优于针对TCR复合物的其它分子(例如，抗-CD3抗体)。
可用所述融合蛋白及其组合物和单位剂型治疗的示范性自身免疫或炎性疾病(AIID)包括但不限于：炎性肠病(例如，克罗恩病或溃疡性结肠炎)、糖尿病(例如，I型糖尿病)、皮肌炎、多肌炎、恶性贫血、原发性胆汁性肝硬化、急性播散性脑脊髓炎(ADEM)、阿狄森病、强直性脊柱炎、抗磷脂抗体综合征(APS)、自身免疫肝炎、古德帕斯彻综合征(Goodpasture'ssyndrome)、格雷夫斯病、格-巴综合征(Guillain-Barrsyndrome)(GBS)、桥本病(Hashimoto'sdisease)、特发性血小板减少性紫癜、全身性红斑狼疮、狼疮性肾炎、神经精神狼疮(neuropsychiatriclupus)、多发性硬化症(MS)、重症肌无力、寻常天疱疮、哮喘、银屑病关节炎、类风湿性关节炎、斯耶格伦综合征、颞动脉炎(也称为“巨细胞性动脉炎”)、自身免疫性溶血性贫血、大疱性类天疱疮、脉管炎、腹部疾病、慢性阻塞性肺病、子宫内膜异位症、化脓性汗腺炎、间质性膀胱炎、局限性硬皮病、硬皮病、发作性嗜睡病、神经肌强直、白癜风和自身免疫性内耳病。
在某些实施方式中，本文提供的融合蛋白和组合物及单位剂型可用作无细胞因子释放相关副作用或最小副作用或副作用减少的免疫抑制剂。例如，可利用本文提供的单链融合蛋白和组合物及单位剂型诱导和预防(即，降低风险)或减少实体器官移植物(例如，肾脏、肝脏、肺、心脏移植物)的急性排斥、移植物功能延迟和移植物丧失。此外，在某些实施方式中，本发明的单链融合蛋白作为免疫抑制剂比针对TCR复合物的已知的其它免疫抑制性和T细胞有丝分裂原更有效，而且不诱导T细胞活化。在进一步的实施方式中，本文提供的融合蛋白和组合物及单位剂型可用于治疗其它T细胞介导疾病，例如移植物抗宿主病(GVHD)和自身免疫及炎症疾病(AIID)。
在另一方面，本发明提供融合蛋白的组合物。本发明的药物组合物通常包含本文提供的融合蛋白，以及药学上可接受的运载体、赋形剂或稀释剂。这类载体在所用剂量和浓度下对接受者无毒。用于治疗的药学上可接受的运载体是药剂学领域众所周知的，参见例如《雷明顿药物科学》(麦克出版公司(MackPublishingCo.),A.R.Gennaro编，1985)。例如，可采用生理pH的无菌盐水和磷酸缓冲盐水。该药物组合物可包含防腐剂、稳定剂、染料等。例如，可加入苯甲酸钠、山梨酸或对羟基苯甲酸酯作为防腐剂，同上，1449。此外，也可采用抗氧化剂和助悬剂，同上。所用的本发明化合物可以是游离碱或盐形式，应认为这两种形式都属于本发明范围。
药物组合物还可含有稀释剂如缓冲液，抗氧化剂如抗坏血酸，低分子量(小于约10个残基)多肽，蛋白质，氨基酸，糖(如葡萄糖、蔗糖、糊精)，螯合剂(如EDTA)，谷胱甘肽和其它稳定剂和赋形剂。中性缓冲盐水或混有非特异性血清白蛋白的盐水是示范性的稀释剂。优选采用合适的赋形剂溶液(例如，蔗糖)作为稀释剂将产物配成冻干品。
也考虑给予本发明融合蛋白组合物时与第二种药物联用。第二种药物可以是本领域接受的特定疾病状况或病症(例如移植、炎症和自身免疫)的标准治疗药物。考虑的示范性第二药物包括：类固醇、NSAID、mTOR抑制剂(例如，雷帕霉素(西罗莫司)、泰罗莫司(temsirolimus)、德罗莫司(deforolimus)、埃罗莫司(everolimus)、佐罗莫司(zotarolimus)、姜黄、法尼基硫代水杨酸(farnesylthiosalicylicacid))、钙调磷酸酶抑制剂(例如，环孢菌素、他克莫司)、抗-代谢物(例如，麦考酚酸、麦考酚酸莫酯)、多克隆抗体(例如，抗-胸腺细胞球蛋白)、多克隆抗体(例如，达力单抗(daclizumab)、巴力单抗(basiliximab))或其它活性和辅助药物，或它们的任何组合。
“药学上可接受的盐”指药学上可接受的具有母体化合物所需药理活性的本发明融合蛋白、SMIP或抗体的盐。这类盐包括：(1)与以下酸形成的酸加成盐：无机酸如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等；或有机酸如乙酸、丙酸、己酸、环戊烷丙酸、乙醇酸、丙酮酸、乳酸、丙二酸、琥珀酸、苹果酸、马来酸、延胡索酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、3-(4-羟基苯甲酰)苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、1,2-乙二磺酸、2-羟基乙磺酸、苯磺酸、4-氯苯磺酸、2-萘磺酸、4-甲苯磺酸、樟脑磺酸、4-甲基双环[2.2.2]-辛-2-烯-1-羧酸、葡庚糖酸、月桂基硫酸、3-苯基丙酸、三甲基乙酸、叔丁基乙酸、葡糖酸、谷氨酸、羟基萘酸、水杨酸、硬脂酸、粘康酸等形成；或(2)母体化合物中存在的酸性质子被金属离子，如碱金属离子、碱土金属离子或铝离子取代时形成的盐；或与有机碱如乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、N-甲基葡糖胺等的配位化合物。
在具体的示范性实施方式中，通过(例如)推注或输注，静脉内给予本发明的融合蛋白。除静脉内给药外，给药途径包括：口服、外用、胃肠道外(如舌下或口颊)、舌下、直肠、阴道和鼻内途径。本文所用术语“胃肠道外”包括：皮下注射、静脉内、肌肉内、胸骨内、海绵体内、鞘内、耳道内(intrameatal)、尿道内注射或输注技术。配制该药物组合物，使之给予患者后其中所含的活性成分可被生物利用。给予患者的组合物可采取单剂量或多剂量单位形式，例如，片剂可以是单剂量单位，或者在气溶胶形式的一种或多种本发明化合物的容器中可装有多个剂量单位。
对于口服给药，可存在赋形剂和/或粘合剂，如蔗糖、高岭土、甘油、淀粉葡聚糖、环糊精、藻酸钠、羧甲基纤维素和乙基纤维素。任选存在甜味剂、防腐剂、染料/着色剂、口味增强剂或其任何组合。也任选采用包衣壳。
在注射给药的组合物中，可任选包含表面活性剂、防腐剂、湿润剂、分散剂、助悬剂、缓冲液、稳定剂、等张剂之一种或多种或它们的任何组合。
就基于核酸的制剂或包含本发明表达产物的制剂而言，可通过，例如，皮内、皮下、肌肉内或静脉内途径、或本领域已知适合在给定情况下使用的任何途径给予约0.01μg/kg至约100mg/kg体重的剂量。例如，优选剂量为约1μg/kg至20mg/kg，特别优选约5μg/kg至10mg/kg。本领域技术人员明白，给药的次数和频率取决于宿主的反应。
本发明的药物组合物可以是能够给予患者的任何形式，例如固体、液体或气体(气溶胶)形式。该组合物可以是液体形式，如酏剂、糖浆、溶液、乳液或混悬液。液体的两个例子可以是口服给药或通过注射递送。
本文所用的液体药物组合物，不论是溶液、混悬液或其它类似形式，均可包含一种或多种以下组分：无菌稀释剂如注射用水、盐水溶液(优选生理盐水)、林格溶液、等张氯化钠、非挥发性油如合成的甘油单酯或甘油二酯(用作溶剂或混悬介质)、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它溶剂；抗菌剂如苄醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂如乙二胺四乙酸；缓冲剂如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；和调节张力的物质如氯化钠或右旋糖。胃肠道外制剂可封装在安瓿、一次性注射器或玻璃或塑料制成的多剂量小瓶中。生理盐水是优选的添加剂。可注射药物组合物优选无菌。
该制剂中也可能需要包含其它组分，例如递送运载体，包括铝盐、油包水乳剂、可生物降解的油运载体、水包油乳剂、可生物降解的微胶囊和脂质体。这类载体中所用佐剂的例子包括：N-乙酰基胞壁酰基-L-丙氨酸-D-异谷胺酰胺(MDP)、脂多糖(LPS)、葡聚糖、IL-12、GM-CSF、γ干扰素和IL-15。
虽然本领域普通技术人员已知的任何合适运载体均可用于本发明药物组合物中，但可根据给药方式和是否需要缓释而采用不同类型的运载体。就胃肠道外给药而言，运载体包括：水、盐水、醇、脂肪、蜡、缓冲剂或它们的任何组合。就口服给药而言，可采用任何上述运载体或固体运载体，如甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁或它们的任何组合。
本发明考虑了包含本发明药物组合物的剂量单位。这种剂量单位包括例如，含单剂量或多剂量的药瓶或注射器，包括两室药瓶或注射器，一室含冻干形式的本发明药物组合物，另一室含用于重建的稀释液。多剂量的剂量单位也可以是，例如，可连接静脉内输注装置的(输液)药袋或药瓶。
本发明也考虑了含有装在单位剂量或多剂量容器(如药瓶)中的本发明药物组合物，以及关于将该组合物给予本文所述疾病(如上述疾病)患者的一套说明书的试剂盒。
实施例
单克隆抗体和示范性单链融合蛋白
这里简要描述了示范性的单克隆抗体(其结合域及其变体可用于制备示范性的单链融合蛋白)和单链融合蛋白。
Cris-7(也称为Cris-7mAb或Cris-7FL)是小鼠抗-人CD3εIgG2a单克隆抗体(mAb)(Reinherz,E.L.等(编),《II型白细胞》.,SpringerVerlag,纽约,(1986))。Cris-7mAb显示结合人、狒狒、短尾猴和恒河猴T细胞(数据未显示)。本文所述的各Cris-7单链融合蛋白还显示具有该物种交叉反应性(数据未显示)。
嵌合型和人源化Cris-7IgG1-N297A(SEQIDNO:265、270、275、280、285、290、295)的氨基末端到羧基末端包含：嵌合型或人源化Cris-7重链可变区、含三个串联连接的(Gly)4-Ser接头、嵌合型或人源化Cris-7轻链可变区、突变的IgG1绞链区(SCC-P)、含297位丙氨酸取代的人IgG1的CH2区和人IgG1的CH3区。
嵌合型和人源化Cris-7IgG1-AA-N297A(SEQIDNO:266、271、276、281、286、291、296)的氨基末端到羧基末端包含：嵌合型或人源化Cris-7重链可变区、含三个串联连接的(Gly)4-Ser接头、嵌合型或人源化Cris-7轻链可变区、突变的IgG1绞链区(SCC-P)、含L234、L235、G237和N297位四个丙氨酸取代和G236位缺失的人IgG1的CH2区(即，LLGG(234-237)AAA)和人IgG1的CH3区。
嵌合型和人源化Cris-7IgG2-AA-N297A(SEQIDNO:267、272、277、282、287、292、297)的氨基末端到羧基末端包含：嵌合型或人源化Cris-7重链可变区、含三个串联连接的(Gly)4-Ser接头、嵌合型或人源化Cris-7轻链可变区、突变的IgG1绞链区(SCC-P)、含V234、G236和N297位丙氨酸取代的人IgG2的CH2区和人IgG2的CH3区。
嵌合型和人源化Cris7IgG4-AA-N297A(SEQIDNO:268、273、278、283、288、293、298)日氨基末端到羧基末端包含：嵌合型或人源化Cris-7重链可变区、含三个串联连接的(Gly)4-Ser接头、嵌合型或人源化Cris-7轻链可变区、突变的IgG1绞链区(SCC-P)、含F234、L235、G237和N297位四个丙氨酸取代和G236位缺失的人IgG4的CH2区(即，FLGG(234-237)AAA)和人IgG4的CH3区。
嵌合型和人源化Cris-7HM1(SEQIDNO:269、274、279、284、289、294、299)的氨基末端到羧基末端包含：嵌合型或人源化Cris-7重链可变区、含至少三个串联连接的(Gly)4-Ser接头、Cris-7轻链可变区、野生型人IgG1绞链区、人IgM的CH3区、人IgG1的CH3区和含三拷贝FALG表位、一拷贝AVI标签和六个组氨酸的尾序列。
BC3(也称为BC3mAb或BC3FL)是非丝裂原性小鼠抗-人CD3εIgG2bmAb(Anasetti等.,J.Exp.Med.172:1691-1700,1990)。
BC3-HM1(也称为“BC3HM1”)(SEQIDNO:84)的氨基末端到羧基末端包含：BC3重链可变区、含至少三个串联连接的(Gly)4-Ser接头、BC3轻链可变区、野生型人IgG1绞链区、人IgM的CH3区和人IgG1的CH3区及含三拷贝FALG表位、一拷贝AVI标签和六个组氨酸的尾序列。
BC3-ΔCH2(也称为“BC3ΔCH2”)(SEQIDNO:85)的氨基末端到羧基末端包含：BC3重链可变区、含至少三个串联连接的(Gly)4-Ser接头、BC3轻链可变区、野生型IgG1绞链区、人IgG1的CH3区和含三拷贝FALG表位、一拷贝AVI标签和六个组氨酸的尾序列。
BC3-G1N297A(也称为“BC3N297A”)(SEQIDNO:80)的氨基末端到羧基末端包含：BC3重链可变区、含三个串联连接的(Gly)4-Ser接头、BC3轻链可变区、突变的IgG1绞链区(SCC-P)、297位天冬酰胺被丙氨酸取代的人IgG1的CH2区和人IgG1的CH3区。
BC3-G1AAN297A(也称为“BC3IgG1AA”)(SEQIDNO:81)的氨基末端到羧基末端包含：BC3重链可变区、含三个串联连接的(Gly)4-Ser接头、BC3轻链可变区、突变的IgG1绞链区(SCC-P)、含L234、L235、237和N297位四个丙氨酸取代和G236位缺失的人IgG1的CH2区(即，LLGG(234-237)AAA)和人IgG1的CH3区。
BC3-G2AAN297A(也称为“BC3IgG2AA”)(SEQIDNO:82)的氨基末端到羧基末端包含：BC3重链可变区、含三个串联连接的(Gly)4-Ser接头、BC3轻链可变区、突变的IgG1绞链区(SCC-P)、含V234、G236和N297位三个丙氨酸取代的人IgG2的CH2区和人IgG2的CH3区。
BC3-G4AAN297A(也称为“BC3IgG4AA”)(SEQIDNO:83)的氨基末端到羧基末端包含：BC3重链可变区、含三个串联连接的(Gly)4-Ser接头、BC3轻链可变区、突变的IgG1绞链区(SCC-P)、含F234、L235、G237和N297位四个丙氨酸取代和G236位缺失的人IgG4的CH2区(即，FLGG(234-237)AAA)和人IgG4的CH3区。
OKT3(也称为OKT3mAb或OKT3FL)是丝裂原性小鼠抗-人CD3εIgG2amAb(正多中心移植物研究组,N.Engl.J.Med.313:337,1985)。
OKT3-HM1(也称为“OKT3HM1”)(SEQIDNO:92)的氨基末端到羧基末端包含：OKT3重链可变区、含至少三个串联连接的(Gly)4-Ser接头、OKT3轻链可变区、野生型人IgG1绞链区、人IgM的CH3区和人IgG1的CH3区以及含三拷贝FALG表位、一拷贝AVI标签和六个组氨酸的尾序列。
OKT3-ΔCH2(也称为“OKTΔCH2”)(SEQIDNO:93)的氨基末端到羧基末端包含：OKT3重链可变区、含至少三个串联连接的(Gly)4-Ser接头、OKT3轻链可变区、野生型IgG1绞链区、人IgG1的CH3区和含三拷贝FALG表位、一拷贝AVI标签和六个组氨酸的附加尾序列。
OKT3-G1N297A(也称为“OKTN297A”)(SEQIDNO:88)的氨基末端到羧基末端包含：OKT3重链可变区、含三个串联连接的(Gly)4-Ser接头、OKT3轻链可变区、突变的IgG1绞链区(SCC-P)、297位丙氨酸取代的人IgG1的CH2区和人IgG1的CH3区。
OKT3-G1AAN297A(也称为“OKT3IgG1AA”)(SEQIDNO:89)的氨基末端到羧基末端包含：衍生自人2H7前导序列的前导序列、OKT3重链可变区、含三个串联连接的(Gly)4-Ser接头、OKT3轻链可变区、突变的IgG1绞链区(SCC-P)、含L234、L235、G237和N297位四个丙氨酸取代和G236位缺失的人IgG1的CH2区(即，LLGG(234-237)AAA)和人IgG1的CH3区。
OKT3-G2AAN297A(也称为“OKT3IgG2AA”)(SEQIDNO:90)的氨基末端到羧基末端包含：OKT3重链可变区、含三个串联连接的(Gly)4-Ser接头、OKT3轻链可变区、突变的IgG1绞链区(SCC-P)、含V234、G236和N297位三个丙氨酸取代的人IgG2的CH2区和人IgG2的CH3区。
OKT3-G4AAN297A(也称为“OKT3IgG4AA”)(SEQIDNO:91)的氨基末端到羧基末端包含：OKT3重链可变区、含三个串联连接的(Gly)4-Ser接头、OKT3轻链可变区、突变的IgG1绞链区(SCC-P)、含F234、L235、G237和N297位四个丙氨酸取代和G236位缺失的人IgG4的CH2区(即，FLGG(234-237)AAA)和人IgG4的CH3区。
也制备和测试了OKT3IgG4-N297A(即，仅含N297A取代的人IgG4的CH2区，也称为OKT3IgG4-WT-N297A或OKT3IgG4-FLGG-N297A；SEQIDNO:232，其序列包含不是成熟融合蛋白一部分的22个氨基酸前导序列)。还制备了四个位置(F234、L235、G236和G237)各自以一个丙氨酸取代联合N297A取代的突变(即，OKT3IgG4-ALGG-N297A、OKT3IgG4-FAGG-N297A、OKT3IgG4-FLAG-N297A和OKT3IgG4-FLGA-N297A，它们分别对应于SEQIDNO:234、236、238和240–这些序列还包含不是成熟融合蛋白一部分的22个氨基酸前导序列)。
OKT3ala-ala(也称为OKT3AA-FL或OKT3FL)是人源化、Fc突变的抗-CD3mAb，它含有234和235位丙氨酸取代(Herold等.(2003)J.Clin.Invest.11(3):409-18)。
维喜单抗(也称为“NuvionFL”)是针对TCR的CD3ε链的人源化、Fc突变的抗-CD3mAb。它是人IgG2同种型，含有234和237位突变(Carpenter等.,Blood99:2712-9,2002)。
H57-457mAb是仓鼠抗-TCR单克隆抗体。它有丝裂原性，功能类似于OKT3单克隆抗体(Lavasani等(2007)ScandinavianJournalofImmunology65:39)。H57-457mAb的VH和VL区序列见SEQIDNO:49和51。
H57halfnull(SEQIDNO:304)是含有H57结合域的小鼠IgG2a单链融合蛋白，除了N297A取代外CH2中的突变可导致ADCC活性丧失。它的氨基末端到羧基末端包含：H57重链可变区、含三个串联连接的(Gly)4-Ser接头、H57轻链可变区、野生型小鼠IGHG2c绞链区、含L234、L235、G237和N297位四个丙氨酸取代的小鼠IGHG2c的CH2区和小鼠IGHG2c的CH3区。
H57HM2(SEQIDNO:306)是小鼠单链融合蛋白，它的氨基末端到羧基末端包含：H57重链可变区、含三个串联连接的(Gly)4-Ser接头、H57轻链可变区、野生型小鼠IGHG2c绞链区、小鼠CH3μ区和小鼠CH3γ区。
H57Null2(SEQIDNO:96)是含有H57结合域的小鼠IgG2a单链融合蛋白，CH2中的突变可导致ADCC或CDC活性丧失。它的氨基末端到羧基末端包含：H57重链可变区、含三个串联连接的(Gly)4-Ser接头、H57轻链可变区、野生型小鼠IGHG2c绞链区、含L234、L235、G237、E318、K320和K322位六个丙氨酸取代的小鼠IGHG2c的CH2区和小鼠IGHG2c的CH3区。
145-2C11mAb(也称为2C11mAb)是针对鼠TCR复合物CD3ε链的仓鼠单克隆抗体(Hirsch等.,J.Immunol.140:3766,1988)。它也有丝裂原性，功能类似于OKT3单克隆抗体。145-2C11mAb的VH和VL区序列见SEQIDNO:58和60。
2C11Null2(SEQIDNO:56)是含有2C11结合域的小鼠IgG2a单链融合蛋白，CH2中的突变可导致ADCC或CDC活性丧失。它的氨基末端到羧基末端包含：2C11重链可变区、含三个串联连接的(Gly)4-Ser接头、2C11轻链可变区、野生型小鼠IGHG2c绞链区、含L234、L235、G237、E318、K320和K322位六个丙氨酸取代的小鼠IGHG2c的CH2区和小鼠IGHG2c的CH3区。
实施例1
融合蛋白不活化致敏T细胞或不诱导致敏T细胞或辅佐细胞的细胞因子释放
分离人外周血单核的细胞(PBMC)
用含肝素的30毫升注射器获得新鲜人全血(每支注射器最多25毫升血液)，室温下最多维持2小时，然后加工。室温用等体积RPMI-1640(无补充物)在50毫升锥形管中稀释血液。轻柔颠倒2-3次混合稀释的血液。用25毫升移液管，将20-25毫升稀释血液小心层叠在50毫升锥形管中15毫升淋巴细胞分离介质(MP生物医学公司(MPBiomedicals))上。室温400g离心试管30分钟。从密度梯度离心后的界面收集细胞，在50毫升锥形管中混合，每管细胞悬液不超过30毫升。向含细胞悬液的试管注入含10％FBS、100U/mL青霉素、100ug/mL链霉素和2mML-谷氨酰胺的RPMI-1640(完全RPMI-1640)液。室温1500rpm离心试管5分钟，吸弃上清液。通过以下方式洗涤细胞两次：将细胞重悬在20毫升完全RPMI中，室温1500rpm离心5分钟吸弃上清液。用血球计数器计数洗涤后的细胞，按照采用它们的试验方案重悬。
用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记人PBMC
用无菌PBS将小鼠脾细胞的密度调整到1x106/mL。取细胞分布在50毫升锥形管中，每管不超过25毫升(25x106个细胞)。优化使用条件后，用CELLTRACETMCFSE细胞增殖试剂盒(分子探针公司(MolecularProbes))以CFSE标记细胞。将18微升高级DMSO(试剂盒的组分B)加入含50微克冻干CFSE(试剂盒的组分A)的小瓶中，在即将使用前制备5mMCFSE的组织培养级DMSO溶液。将该CFSE溶液加入PBMC细胞悬液至终浓度50nMCFSE，然后37℃，5％CO2培育细胞悬液15分钟。各管加入完全RPMI(含有10％FBS、100U/mL青霉素、100ug/mL链霉素和2mML-谷氨酰胺的RPMI-1640)液以猝灭细胞标记反应。室温1500rpm离心细胞7分钟。吸弃各管上清液，将细胞重悬在完全RPMI中。计数细胞，用完全RPMI调整至所需密度用于试验。
用PHA-致敏T细胞分析丝裂原性和细胞因子释放
将人PBMC悬浮于完全RPMI培养基(含有10％人AB血清、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素和2mML-谷氨酰胺的RPMI-1640)中，浓度为2x106个细胞/毫升，37℃用2.5μg/mLPHA(西格玛公司(Sigma))刺激3天。培育后，用完全RPMI洗涤细胞两次，以约2x106个细胞/毫升的浓度重新接种新培养瓶，不作刺激。再将细胞置于37℃4天让T细胞休眠(rest)，然后接触二级刺激。4天休眠期结束时，如前所述收集细胞，用PBS洗涤，用CFSE标记。标记后，将细胞重悬于完全(人血清)RPMI(含有10％人AB血清、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素和2mML-谷氨酰胺的RPMI-1640)中，浓度为2x106个细胞/毫升。此时，分离同一供体的新鲜PBMC，用作再刺激的辅佐细胞。为制备该辅佐细胞，采用EasySep技术(干细胞技术公司(StemCellTechnologies)目录号18051)磁力分离T细胞与PBMC群。按照生产商方案，取磁性纳米颗粒与葡聚糖和抗CD3抗体混合液与新鲜分离的PBMC一起培育。然后将细胞与珠混合物留置在含EasySepPurple磁体的第一管中5分钟，随后取细胞悬液倒入第二个5毫升FASC管中。CD3+细胞(T细胞)留在第一管中，而将辅佐细胞转移入第二管。用丝裂霉素C(MMC，如下所述)处理这种阴性选择的辅佐细胞以抑制其增殖。将CFSE-标记的PHA母细胞(blast)和MMC处理的辅佐细胞以2x106个细胞/毫升悬浮于完全(人AB血清)RPMI中。将各细胞群加入48-孔组织培养板(0.5毫升/孔)，并作标记处理。37℃再培育细胞4天，收集刺激后24小时的50微升上清液。再刺激后第4天收集细胞和其余上清液。用抗CD5(340697,BD生物科学公司(BDBiosciences))、CD25(557741,BD生物科学公司)和抗7AAD(559925,BD生物科学公司)荧光标记抗体染色，通过流式细胞仪(LSRII,BD公司(BectonDickenson))收集细胞。利用FlowJo流式细胞术软件(三颗星公司(TreeStar))分析数据。门控方案如下：分析落入前向散射(FSC):侧散射(SSC)淋巴细胞门内细胞的7AAD表达。然后分析落入7AAD阴性门内细胞的CD5表达，再分析落入CD5+门内细胞的CFSE稀释度和CD25上调。CD5+、CFSE低和CD25高细胞视作活化的T细胞。用米力波尔公司(Millipore)定制的11-plexLuminex检测试剂盒(Milliplex系列)，按照生产商方案分析上清液样品中存在的细胞因子和趋化因子。该试剂盒检测的11种分析物是：IL-β、IL-1RA、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17、IP-10、MCP1、IFNγ和TNFα。
图1显示与已知抗体，维喜单抗和OKT3ala-ala相比，OKT3IgG2AA、OKT3IgG4AA和OKT3HM1融合蛋白不活化PHA-致敏的T细胞。用含有BC3结合域的分子产生了类似的数据。
表1显示与已知抗体，维喜单抗和OKT3ala-ala相反，OKT3IgG2AA、OKT3IgG4AA和OKT3HM1融合蛋白不诱导致敏T细胞或辅佐细胞释放细胞因子。
实施例2
融合蛋白阻断T细胞对同种抗原的应答反应
人混合淋巴细胞反应(MLR)
如前所述分离两个供者的人PBMC并保持分开。根据以前的研究，一个供者的PBMC作为刺激群，第二供者的PBMC用作反应群。如前所述用CFSE标记两供者的细胞。用丝裂霉素C(MMC)处理用作刺激细胞的供者PBMC以预防其细胞分裂。将MMC(西格玛公司)重悬于完全(HS)RPMI培养液(含有10％人AB血清、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素和2mML-谷氨酰胺的RPMI-1640)中，浓度为0.5mg/mL。重悬PBMC，浓度约1x106/mL，加入终浓度25μg/mL的MMC。然后37℃培育细胞和MMC混合物30分钟，随后用完全(HS)RPMI培养液洗涤细胞三次。用完全(人AB血清)RPMI液(含有10％人AB血清、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素和2mML-谷氨酰胺的RPMI-1640)重悬制备的刺激细胞和反应细胞，浓度约2x106/mL，将0.25mL各细胞群加入48-孔板各孔中。将所有处理试剂与细胞同时加入平板(浓度见图2、3和17所示；注意：给出的是抗体的浓度，融合蛋白采用摩尔当量浓度，见图17所示)，然后在实验期间37℃培育样品。此后7-8天收集实验细胞。用抗CD5(340697,BD生物科学公司)、CD25(555433,BD生物科学公司)和抗7AAD(559925,BD生物科学公司)荧光标记抗体染色，通过流式细胞仪(LSRII,BD公司)收集细胞。用FlowJo流式细胞术软件(三颗星公司)分析数据。门控方案如下：分析落入FSC:SSC淋巴细胞门内细胞的7AAD表达。然后分析落入7AAD阴性门内细胞的CD5+表达，再分析CD5+细胞的CFSE稀释度和CD25上调。CD5+、CFSE低和CD25高细胞视作活化的T细胞。
图2显示BC3IgG2AA和BC3IgG4AA融合蛋白阻断T细胞对同种抗原的应答反应优于已知的BC3mAB，这与OKT3ala-ala抗体相反。用表达OKT3结合域的分子产生了相似的数据。
图3显示BC3HM1和BC3ΔCH2融合蛋白也能阻断T细胞对同种抗原的应答反应。用表达OKT3结合域的分子产生了相似的数据。
图17显示部分纯化的Cris-7IgG1-N297A(50％是感兴趣峰)有效阻断了T细胞对同种抗原的应答反应。
实施例3
融合蛋白阻断记忆T细胞对回忆抗原的应答反应
分离得到以前筛选的对破伤风类毒素应答反应得到正评分供者的人PBMC。如前所述用CFSE标记PBMC，然后重悬于完全(人AB血清)RPMI液(含有10％人AB血清、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素和2mML-谷氨酰胺的RPMI-1640)中，浓度2x106/mL。在48-孔板中加入0.5mLCFSE-标记的细胞和1ug/mL破伤风类毒素(EMD)以及实验处理试剂。实验期间37℃，5％CO2培育样品。此后8天收集实验细胞。用抗CD5(340697,BD生物科学公司)和抗CD25(555433,BD生物科学公司)荧光标记抗体染色，通过流式细胞仪(LSRII,BD公司)收集细胞。用FlowJo流式细胞术软件(三颗星公司)分析数据。门控方案如下：分析落入FSC:SSC淋巴细胞门内细胞的CD5表达，然后分析落入CD5+门内细胞的CFSE稀释度和CD25上调。CD5+、CFSE低和CD25高细胞视作活化的T细胞。
图4显示BC3IgG2AA、BC3IgG4AA和BC3HM1融合蛋白能阻断记忆T细胞对回忆抗原破伤风类毒素的应答反应。用含有OKT3结合域的融合蛋白产生了相似的数据。
实施例4
融合蛋白诱导细胞表面TCR和CD3的下调
如实施例1所述分离人PBMC，重悬成浓度约2x106个细胞/毫升。取一部分PBMC立即作细胞表面染色，而其余PBMC与各种抗-CD3试剂培育4天然后分析。将待立即染色的PBMC放冰上冷却30分钟，然后4℃1500rpm离心10分钟，除去上清液。将细胞悬浮于冰冷却的FACS缓冲液(dPBS,2.5％FBS)中，浓度1x106/mL。对于待分析的各试剂，将1mL细胞转移入5mLFACS试管(BDFalcon)中。将额外的1mL冰冷却FACS缓冲液加入1mL等份细胞中，4℃1500rpm离心细胞5分钟。倒置试管，倾倒出上清液在试管中留下约0.1mLFACS缓冲液和细胞沉淀，然后将试管置于冰上。制备染色抗体(含90μL冰冷却FACS缓冲液，5μL抗-CD5抗体(电子生物科学公司(eBioscience))和5μL抗-TCR抗体(BD生物科学公司))的主储备物以分析分离后的立即样品。将主储备物(100μL)与1ug/mL、0.5μg/mL或0.1μg/mL指向CD3的融合蛋白或单克隆抗体加入各FACS试管(注意：给出的是抗体的浓度，融合蛋白采用摩尔当量浓度)中。然后将样品放冰上避光培育30分钟。培育期后，用2mL冰冷却的FACS缓冲液洗涤样品两次，加入指向CD3的试剂(PE-标记的特异性二抗)，最终稀释度1:400。然后将样品放冰上避光培育30分钟，再用2mL冰冷却的FACS缓冲液洗涤样品两次。用BD公司的LSRII流式细胞仪检测染色水平。
取处理4天、然后作细胞表面染色的PBMC以每孔0.5mL等份(细胞浓度约2x106个细胞/毫升，用完全(人AB血清)RPMI培养液配制)接种48-孔板。将指向CD3的试剂以1、0.5和0.1μg/mL加入细胞(注意：给出的是抗体的浓度，融合蛋白采用摩尔当量浓度)，37℃培育细胞2-4天。培育后，如上所述收集细胞并染色。
结果(图5A、5B、6A和6B)显示包含OKT3结合域的融合蛋白诱导了T细胞表面的TCR和CD3下调，而OKT3单克隆抗体仅下调TCR而不下调CD3。用含有BC3结合域的融合蛋白获得了相似的结果。
图18显示Cris-7IgG1-N297A融合蛋白诱导了T细胞表面的TCR和CD3下调，而Cris-7单克隆抗体仅下调TCR。用Cris-7IgG2-AA-N297A、Cris-7IgG4-AA-N297A和Cris-7HM1获得了相似的结果。
实施例5
融合蛋白诱导T细胞可靠的钙流出
如前所述分离人PBMC。用米氏公司(Miltenyi)的MACS技术公司磁力分离非T细胞与T细胞。用米氏公司的泛T细胞分离试剂盒II分离未接触的T细胞。按照生产商方案，将用针对除T细胞外所有PBMC细胞亚组的一组抗体包被的超级磁珠与新鲜分离的PBMC一起培育。然后取细胞和珠混合物加入含有基质的柱，当将该柱置于米氏公司的MACS分离仪(一种强永磁体)中时形成磁场。T细胞流过该柱，而所有其它细胞留在该柱中。T细胞纯度通常为87-93％之间。将纯化的T细胞悬浮于完全RPMI液(RPMI-1640，10％人AB血清、2mML-谷氨酰胺、丙酮酸钠、非必需氨基酸、青霉素/链霉素)中，浓度约2x106个细胞/毫升，37℃在大小合适的培养瓶中培育过夜。次日早晨，取100μl细胞(200,000个细胞)转移入96-孔黑色聚-D赖氨酸平板的孔中，37℃培育3小时。培育期间，按照生产商(分子装置公司(MolecularDevices)FLIPR钙4试验)的说明书制备钙流出指示染料。此外，在U-底平板中制备实验处理试剂。在处理平板中制备75微升体积、5x浓度的细胞处理试剂。检测一式三份的所有处理试剂(融合蛋白和交联剂)。取100微升指示染料加入细胞，1小时后进行平板读数。加入指示染料后，将平板放回孵育箱再培育45分钟。然后室温1200rpm离心平板5分钟，再放回孵育箱培育15分钟。培育期结束时，将处理平板和细胞平板加载在分子装置公司的集成了液体转移装置和便携式(benchtop)平板读数计的FlexStation3平台上。Flexstation将50微升处理试剂自动加入细胞平板，然后记录每7秒钙指示染料产生的荧光，共750秒。然后将捕获的数据输出到Excel(微软办公自动化软件)进行分析。
结果(图7)显示，与含有相同结合域的抗体相反，没有交联剂(即，结合两个或多个SMIP分子的分子，例如抗-IgG抗体)时，本发明的单链融合蛋白诱导了T细胞中可靠的钙流出。采用表达BC3结合域的分子以及致敏T细胞时获得了相似的结果。
图19显示了不同绞链对含BC3结合域的单链融合蛋白导致的钙流出水平的影响。此例中，在20秒时加入融合蛋白和对照，在600秒时加入交联剂。含最短绞链(接头122，衍生自IgA2绞链)的融合蛋白导致了最大的钙流出，而含较长绞链(接头115和116，分别衍生自IgECH2和UBA)的融合蛋白诱导了较低水平的钙流出。然而，在所有情况中，含有BC3结合域的单链融合蛋白导致的钙流出升高大于抗体。因此，可视需要调整绞链(长度)以调节钙流出。
实施例6
抗-小鼠TCR/CD3分子的体外评估
分离小鼠脾细胞
在无菌条件下切下脾脏，除去大片脂肪和组织。在组织培养柜中(tissueculturehood)，将脾脏置于含5毫升无菌1xPBS的小碟中，然后在两个单侧磨砂载玻片之间研磨。该过程中，载玻片与培养皿维持一定角度以使细胞和液体流回碟中。当脾被膜失去所有红色时即完成该步骤。将培养皿中的细胞悬液转移至15毫升锥形管中，旋振以打碎细胞团块。然后向该管注入12毫升无菌1xPBS，直立静置让内容物沉降5分钟。取上清液转移至第二个15毫升锥形管，未打散的沉降碎片留在第一管中。然后室温1500rpm离心5分钟收集细胞。除去上清液，将细胞沉淀悬浮于4毫升ACK红细胞裂解缓冲液(质量生物公司(QualityBiologics),目录号118-156-101)中，室温培育5分钟。然后向锥形管注入RPMI完全培养液(含10％FBS、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素和2mML-谷氨酰胺的RPMI-1640)。通过细胞滤网过滤细胞悬液，转移至另一15毫升锥形管。用完全RPMI洗涤细胞三次，然后用血球计数器计数。
用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记小鼠脾细胞
用无菌PBS将小鼠脾细胞的密度调整到1x106/mL。取细胞分布在50毫升锥形管中，每管不超过25毫升(25x106个细胞)。优化人PBMC和小鼠脾细胞所用条件后，用分子探针公司的CELLTRACETMCFSE细胞增殖试剂盒(目录号C34554)以CFSE标记细胞。取18微升高级DMSO(试剂盒的组分B)加入含50微克冻干CFSE品(试剂盒的组分A)的小瓶中，在使用前立即制备5mMCFSE的组织培养级DMSO溶液。由于CFSE对光敏感，试剂制备和随后的细胞标记过程需小心避光保护试剂。将CFSE溶液加入PBMC细胞悬液至终浓度50nMCFSE。将试管盖松松置于含有细胞悬液的试管上以利气体交换，将试管置于37℃，5％CO2孵育箱中15分钟。如血清猝灭标记反应那样，各管加入完全RPMI液(含10％FBS、100U/mL青霉素、100ug/mL链霉素和2mML-谷氨酰胺的RPMI-1640)以猝灭细胞标记反应。室温1500rpm离心细胞7分钟。吸弃各管上清液，将细胞重悬于完全RPMI液中。计数细胞(丧失最多25％的输入细胞是常见的)，用完全RPMI液调整至所需密度用于试验。
ConA母细胞
如前所述分离BALB/c小鼠的脾细胞，悬浮于完全RPMI培养液(RPMI，10％FBS、2mML-谷氨酰胺、丙酮酸钠、非必需氨基酸、青霉素/链霉素和1％BME)中，浓度2x106个细胞/毫升，用1微克/毫升伴刀豆球蛋白A(西格玛公司)刺激3天。3天后，用完全RPMI液洗涤细胞两次，重新接种在新培养瓶中4天，不刺激。4天休眠期结束时，如前所述收集细胞，用CFSE标记。
此时，收集BALB/c小鼠的第二个脾脏，分离脾细胞。在实验的再刺激期用这些新鲜分离的脾细胞作为辅佐细胞。为制备该辅佐细胞群，用米氏公司的MACS技术公司磁力分离去除新鲜脾细胞中的T细胞(CD5+细胞)。按照生产商方案，将用抗-CD5抗体包被的超级磁珠(米氏公司,目录号130-049-301)与新鲜分离的脾细胞一起培育。然后取细胞和珠的混合物加入含有基质的柱(米氏公司,目录号130-042-401)中，当该柱置于米氏公司(目录号130-042-301)的MACS分离仪(一种强永磁体)时形成磁场。CD5+细胞(T细胞)留在该柱中，未接触的辅佐细胞流出。用丝裂霉素C(如前所述)处理阴性选择到的辅佐细胞以抑制其增殖。
将CFSE-标记的ConA母细胞和MMC处理的辅佐细胞重悬于完全培养液中，浓度2x106个细胞/毫升。取0.5毫升的各细胞群和所示处理试剂一起加入48-孔组织培养板中。刺激后24小时收集50微升上清液，收集再刺激后第4天的细胞和留下的上清液。用抗CD5(45-0051,BD生物科学公司)和抗CD25(25-0251，电子生物科学公司)荧光标记抗体染色细胞，通过流式细胞仪(LSRII,BD公司)用FlowJo软件(三星公司)分析。门控方案如下：分析落入FSC:SSC淋巴细胞门内细胞的CD5表达，然后分析落入CD5+门内细胞的CFSE稀释度和CD25上调。CD5+、CFSE低和CD25高细胞视作活化的T细胞。按照以下修正的生产商方案，利用22种分析物、Linco-plex、Luminex检测试剂盒(林可研究公司(LincoResearch))分析上清液样品中存在的细胞因子和趋化因子：分析物珠、检测抗体和链霉亲和素-PE储备溶液先作1:2稀释再用于试验。该试剂盒检测的22种分析物是：MIP-1a、GMCSF、MCP-1、KC、RANTES、IFNγ、IL-1B、IL-1a、G-CSF、IP-10、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-10、IL-12、TNFα、IL-9、IL-13、IL-15和IL-17。
H57-457和145-2C11单克隆抗体而非H57Null2或2C11Null2SMIP诱导了ConA-致敏T细胞释放细胞因子。ConA-致敏T细胞经处理后示范性细胞因子IFNγ和IP-10释放的结果见图8A和8B。此外，H57Null2(与图9中的“H57MuNull”相同)和2C11Null2SMIP(与图9中的“2C11MunullSMIP”相同)而非H57-457或145-2C11单克隆抗体阻断了T细胞对抗原的应答反应(参见，图9)。检测其它细胞因子释放时获得了相似的结果。
实施例7
示范性抗-TCRSMIP的体内研究
将12周龄BALB/c雌鼠(Harlan)分成几组(每组6只)，通过尾侧静脉注射7.3μg、37μg、75vg或185μgH57Null2SMIP，5μg(最高耐受剂量)H57mAb，250μgIgG2a同种型对照(最高SMIP剂量的等摩尔量)或200μLPBS。所有注射体积均为200μL，所有注射材料的内毒素水平低于0.5EU/mg。注射后24小时每组随机选择3只小鼠处死，注射后三天实验结束时处死每组其余三只小鼠。监测小鼠的药物毒性相关临床症状，其表现形式为体重丧失和临床评分升高。评估临床评分的科学家不知道给予各组的治疗药物。根据以下关键因素指定评分：0分＝正常；1分＝轻度立毛；2分＝中度立毛和/或眼睛炎症或刺激；3分＝蜷缩姿态/精神萎靡；4分＝濒死。注射后两小时和临终时抽取所有小鼠的血液。临终时刻收集脾脏和腹股沟淋巴结。按照以下修正的生产商方案，用米力波尔公司定制的14-plexLuminex检测试剂盒(Milliplex系列)分析血清样品中存在的细胞因子和趋化因子：分析物珠、检测抗体和链霉亲和素-PE储备溶液先作1:2稀释再用于试验。此外，直接分析血清样品(相当于推荐的1:2稀释度)。该试剂盒检测的14种分析物是：G-CSF、GM-CSF、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13、IL-17、IP-10、KC、MCP1、IFNγ和TNFα。用抗CD5(电子生物科学公司，目录号45-0051)和小鼠IgG2a(BD生物科学公司，目录号553390)抗体染色脾和淋巴结细胞悬液测定这两个器官被SMIP包被的T细胞百分比。
图10A显示静脉内给予H57Null2SMIP不导致体重丧失。图10B显示此类处理也不导致临床评分升高。这些结果证明该Null2SMIP具有所需的安全特征。
图11显示静脉内给予H57Null2SMIP不诱导正常BALB/c小鼠的细胞因子风暴，这与亲代抗体相反。显示了14种分析物中的两个代表性细胞因子IL-6和IL-4。
图12显示静脉内给予H57Null2SMIP后测得的脾脏H57Null2SMIP包被的T细胞。
实施例8
融合蛋白体内抑制急性移植物抗宿主病
为测定替代分子在急性移植物抗宿主病(aGVHD)小鼠模型中是否有效，用示范性融合蛋白治疗小鼠，然后监测体重丧失、供体:宿主淋巴细胞比例和产生的细胞因子及趋化因子。
通过转移供体雌性C57BL/6鼠(Taconic)的脾细胞诱导雌性C57BL/6xDBA2F1小鼠(Taconic)的aGVHD。收集供体小鼠脾脏浸在含10％FBS的冷RPMI中。用无菌磨砂载玻片分离收集的脾细胞。收集上清液、离心，如前所述洗涤细胞。然后将洗涤的脾细胞重悬于无菌PBS中，浓度为每200μl65x106个。恰在注射前使脾细胞混合液通过100μm细胞滤网(BDFalcon)除去碎片和较大细胞团块。通过F1受者小鼠尾侧静脉，静脉内(IV)注射200微升供体脾细胞悬液。对于经尾侧静脉IV注射，使小鼠简单暴露于热灯下，束缚于塑料小鼠限制器中。用27.5号针头进行注射。转移供体细胞后14天受者小鼠明显发病，在此时间点，终止实验并作评估。疾病进展与体重丧失相关，转移动物脾脏中有供体细胞扩增，和因供体细胞介导的攻击导致的宿主细胞相伴丧失。血清生物学标记，例如IFNγ也与疾病进展相关。
对于效力研究，如上所述将供体细胞在研究的第0天转移给F1受者。第0、1、3、5、7、9和11天给予SMIP、IgG2a对照和PBS治疗，第14天收集实验(细胞)。除了供体细胞转移前第0天通过(眼)框后窦注射给药外，所有治疗经静脉内注射给药。每次注射给予100μl体积的100μgH57Null2SMIP或IgG2a，或100μlPBS。体内研究用的所有蛋白质内毒素低于0.5EU/mg。用免疫抑制剂地塞米松(DEX；西格玛公司)治疗的小鼠每天通过腹膜内注射(IP)接受10mgDEX/kg。
实验期间，每隔一天给小鼠称重，到它们开始丧失体重时每天称重。受者小鼠的起始体重丧失百分比见图13。与接受PBS或IgG2a对照治疗的小鼠相反，给予H57Null2SMIP防止了与aGVHD疾病进展相关的体重丧失。
第7天抽取小鼠血液作血清生物学标记分析。第14天(临终时刻)，收集各动物的脾脏和血样品。测定各脾脏的重量和细胞总数。按照生产商方案，用米力波尔公司定制的14-plexLuminex检测试剂盒(Milliplex系列)分析血清样品中存在的细胞因子和趋化因子。试剂盒检测的14种分析物是：G-CSF、GM-CSF、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13、IL-17、IP-10、KC、MCP1、IFNγ和TNFα。用SMIP治疗小鼠的细胞因子和趋化因子产生受到抑制，包括G-CSF(图14A)、KC(图14B)和IFNγ(图14C)。这些结果表明给予SMIP抑制了aGVHD相关细胞因子和趋化因子的产生，特别是IFNγ的产生(第7天aGVHD患病小鼠通常显著升高)。第14天，如前所述分离脾细胞，用抗H-2b(供体细胞)和抗H2-d(宿主来源的H2b+,H2-d+细胞)抗体染色，用BD生物科学公司的LSRII流式细胞仪分析。接受H57Null2融合蛋白的小鼠的供体淋巴细胞:宿主淋巴细胞比例类似于接受DEX的小鼠和未接受供体细胞的阴性对照小鼠(图15)。这些结果表明，本发明融合蛋白抑制了供体淋巴细胞的扩增，这与接受PBS和IgG2a对照治疗小鼠所观察到的aGVHD相关宿主淋巴细胞减少相符。
这些体内研究表明，本发明融合蛋白抑制了aGVHD进展，证据是没有供体淋巴细胞扩增、没有炎性细胞因子和趋化因子产生以及体重丧失。用慢性GVHD小鼠模型获得的初步结果也表明有类似的效力。
还完成了aGVHD实验模型以评估H57halfnull、H57null2和2C11null2。发现H57halfnull和H57null2有效，所检测的参数结果相似，虽然生物学标记研究显示有一些细胞因子早期释放。在aGVHD模型中，2C11null2融合蛋白也有效，发现能阻止供体细胞扩增。
实施例9
含N297A和IgG4CH2区额外单个丙氨酸取代的融合蛋白阻断T细胞对同种抗原的应答反应
如实施例2所述，用以下融合蛋白进行人MLR试验：OKT3IgG4-WT-N297A(SEQIDNO:232)、OKT3IgG4-ALGG-N297A(SEQIDNO:234)、OKT3IgG4-FAGG-N297A(SEQIDNO:236)、OKT3IgG4-FLAG-N297A(SEQIDNO:238)、OKT3IgG4-FLGA-N297A(SEQIDNO:240)、OKT3IgG4-AA-N297(SEQIDNO:91)、OKT3FL和OKT3mAb。
图20显示包含(a)只有N297位丙氨酸取代或(b)N297位丙氨酸取代和F234、L235、G236或F237位其它丙氨酸取代的OKT3IgG4融合蛋白阻断T细胞对同种抗原的应答反应，比已知的OKT3mAb和OKT3ala-ala抗体更好。
实施例10
绞链区的选择可能影响MLR反应
如实施例2所述，用衍生自BC3IgG1-N297A(SEQIDNO:80)并含有不同长度和序列的以下绞链的融合蛋白进行人MLR试验：接头125衍生自UBA(SEQIDNO:329)、接头126衍生自IgECH2(SEQIDNO:330)、接头127衍生自IgD绞链(SEQIDNO:331)、接头128衍生自IgA2绞链(SEQIDNO:332)和接头129衍生自IgG1绞链(SEQIDNO:333)。含有上述接头的BC3IgG2-N297ASMIP的氨基酸序列分别示于SEQIDNO:325、323、319、315和311。编码这些BC3IgG2-N297ASMIP的核苷酸序列分别示于SEQIDNO:324、322、318、314和310。
图21显示不同绞链对BC3IgG1-N297A融合蛋白阻断T细胞对同种抗原应答反应能力的影响。看来含较短绞链的融合蛋白更有效地阻断了T细胞应答反应。然而，在所有情况中，含BC3结合域的单链融合蛋白阻断T细胞对同种抗原的应答反应比HuIg1BC3(含BC3mAb的可变区和人IgG1恒定区的抗体分子)更有效。
实施例11
人源化Cris7融合蛋白的体外分析
如实施例2所述，用以下各种人源化Cris7融合蛋白进行人MLR试验：人源化Cris7(VH3-VL1)IgG1-N297A(SEQIDNO:290)、人源化Cris7(VH3-VL2)IgG1-N297A(SEQIDNO:295)、人源化Cris7(VH3-VL1)IgG2-AA-N297A(SEQIDNO:292)、人源化Cris7(VH3-VL2)IgG2-AA-N297A(SEQIDNO:297)、人源化Cris7(VH3-VL1)IgG4-AA-N297A(SEQIDNO:293)、人源化Cris7(VH3-VL2)IgG4-AA-N297A(SEQIDNO:298)、嵌合型Cris7IgG1-N297A(SEQIDNO:265)、人源化Cris7(VH3-VL1)HM1(SEQIDNO:294)、人源化Cris7(VH3-VL2)HM1(SEQIDNO:299)和嵌合型Cris7HM1(SEQIDNO:269)。
图22显示人源化Cris7IgG1-N297A、IgG2-AA-N297A和IgG4-AA-N297A融合蛋白及嵌合型Cris7IgG1-N297A融合蛋白阻断T细胞对同种抗原的应答反应比已知的Cris7mAb更好。
图23也显示人源化Cris7IgG1-N297A、IgG2-AA-N297A和IgG4-AA-N297A融合蛋白及嵌合型Cris7IgG1-N297A融合蛋白阻断T细胞对同种抗原的应答反应比已知的Cris7mAb更好。此外，人源化和嵌合型Cris7HM1融合蛋白阻断T细胞对同种抗原的应答反应也优于Cris7mAb。
用实施例1所述方法分析人源化Cris7(VH3-VL1)IgG1-N297A和人源化Cris7(VH3-VL2)IgG1-N297A融合蛋白再刺激的PHA-致敏T细胞的有丝分裂性和细胞因子释放。检验了以下细胞因子：IL-1b、IL-10、IL-17、IFNγ、TNFα、IL6、MCP-1、IP-10、IL-2和IL4。
图24显示人源化Cris7(VH3-VL1)IgG1-N297A和人源化Cris7(VH3-VL2)IgG1-N297A融合蛋白不活化PHA-致敏的T细胞。用人源化Cris7(VH3-VL1)IgG2-AA-N297A、人源化Cris7(VH3-VL2)IgG2-AA-N297A、人源化Cris7(VH3-VL1)IgG4-AA-N297A和人源化Cris7(VH3-VL2)IgG4-AA-N297A融合蛋白产生了类似数据。
细胞因子释放结果显示(1)人源化Cris7IgG1-N297A、人源化Cris7-IgG2-AA-N297A、人源化Cris7-IgG4-AA-N297A和嵌合型Cris7IgG1-N297A融合蛋白与对照非T细胞结合SMIP蛋白没有不同，(2)除了IL-17，亲代Cris7mAb与人源化Cris7IgG1-N297A、人源化Cris7-IgG2-AA-N297A和人源化Cris7-IgG4-AA-N297A融合蛋白相当(亲代Cris7mAb诱导的IL-17释放多于人源化Cris7融合蛋白)，(3)NuvionFL活化细胞产生了IL-10、IFNγ、IL-17、TNFα和IL-6，和(4)测试的所有分子(包括对照非-T细胞结合SMIP)均导致MCP-1分泌，水平与PHA再刺激一样高。IFNγ和IL-17释放的结果分别见图25A和25B。
在初步有丝分裂原性试验中，按以下步骤检测短尾猴PBMC的细胞因子水平：除了用PBS1X配制的90％淋巴细胞分离介质(CMF)和用15毫升锥形管进行密度梯度离心外，按实施例1所述，分离短尾猴的非人灵长类PBMC。将细胞重悬于RPMI完全培养液(含有10％人AB血清、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素和2mML-谷氨酰胺的RPMI-1640)中，浓度为4x106个细胞/毫升，取等份样品和所示的处理试剂一起加入96孔平底板，100微升/孔。37℃培育细胞。在第1、2和3天采集各孔上清液样品，按照生产商方案，用米力波尔公司定制的9-plexLuminex检测试剂盒分析存在的非人灵长类细胞因子。试剂盒检测的9种分析物是：IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17、MCP1、IFNγ和TNFα。
结果(图26A-H)显示人源化Cris7(VH3-VL1)IgG4-AA-N297A和人源化Cris7(VH3-VL2)IgG4-AA-N297A融合蛋白诱导的IFNγ、IL-17、IL-4、TNFα、IL-6和IL-10释放比Cris7mAb少，而用人源化Cris7IgG4-AA-N297A融合蛋白处理后与用Cris7mAb处理后的IL-1B和IL-2水平相当。
实施例12
含有H57结合域的示范性蛋白质的生物学标记研究
10周龄雌性C57BL/6xDBA2F1小鼠按重量匹配分成5组(每组8只)。通过(眼)框后窦给动物IV注射(200μL含摩尔等量的300μgH57Null2SMIP)IgG2a同种型对照、H57Null2SMIP(SEQIDNO:96)、H571/2NullSMIP(SEQIDNO:304)、H57HM2SMIP(SEQIDNO:306)或5μgH57mAb。注射后24小时对每组4只小鼠施以安乐死，注射后三天实验结束时对各组其余四只小鼠施以安乐死。如前所述，监测小鼠药物相关毒性的临床症状。注射后两小时和临终时刻抽取所有小鼠的血液。如前所述用米力波尔公司定制的14-plexLuminex检测试剂盒分析血清样品中存在的细胞因子和趋化因子。除了收集血液作血清分析外，还将等份血液收集入全血微量试管容器(含有EDTA)中作外周血白细胞染色。简言之，将5微升全血加入96-孔U-底平板各孔中。加入5μL(10μg/ml)大鼠抗-小鼠CD16/CD32FcBlock(BDP公司(BDPharmingen))，在中速平板振摇器上室温培育平板15分钟。加入10μL最终稀释度1:4000的抗CD5(PE-Cy5)、抗CD19(FITC,电子生物科学公司)和抗CD45(PE,电子生物科学公司)抗体混合液(或合适的单染色对照)。室温避光在中速平板振摇器上再培育平板20分钟。加入180μL1XBDPharm裂解缓冲液，彻底混合各孔，室温静置30分钟。然后用BDLSRII高通量取样器(HTS)分析50μL各样品。门控方案如下：分析落入FSC:SSC淋巴细胞门内细胞的CD45表达，然后分析落入CD45+门内细胞的CD5和CD19表达。根据收集的50微升样品和40稀释系数返回计算出每毫升细胞中的各类细胞数。
图27显示静脉内给予H57Null2、halfnull和HM2SMIP蛋白不导致体重丧失，而静脉内给予H57mAb导致体重丧失。在第0-3天之间，所有小鼠表现正常，没有明显的痛苦迹象。
图28显示，与IgG2a同种型对照相比，静脉内给予H57Null2、H57halfnull、H57HM2或H57mAb导致循环性CD5+T-细胞(细胞/毫升)瞬时降低。注射后72小时，各组之间循环性CD5+T-细胞(细胞/毫升)水平没有明显不同(图29)。
图30A-38C显示(1)与IgG2a相比，H57Null2和H57HM2不增加细胞因子产生，和(2)注射后2小时，H57halfnull治疗升高了IL-2、IL-10、IP-10、TNFα和IL-17水平，但注射后24小时IL-5水平回复至正常水平。
实施例13
含有H57结合域的示范性融合蛋白的药代动力学研究
在0时给雌性BALB/c小鼠静脉内注射(IV)含200μgH57Null2(SEQIDNO:96)、H57-HM2(SEQIDNO:306)或H57halfnullSMIP蛋白(SEQIDNO:304)的200μLPBS。各时间点每组注射3只小鼠：对于H57-HM2SMIP蛋白，获得第15分钟和第2、6、8、24、30、48、72、168和336小时的血清样品，对于H57Null2和H57halfnull，采集第96和504小时额外时间点的样品，但省略第8和30小时的样品。注射后，在所示时间点通过臂丛或心脏穿刺使麻醉的小鼠采血，如下所示收集血清。
分别用山羊抗-人IgGFc特异性抗体作为捕捉试剂，用偶联HRP的抗人IgG4或IgG2抗体检测结合的BC3IgG4-AA-N297A或BC3-IgG2-AA-N297ASMIP，用夹心ELISA测定BC3IgG4-AA-N297A和BC3IgG2-AA-N297A的血清浓度。在采用CD3+Jurkat细胞系的FACS结合试验中，测定OKT3IgG4-AA-N297A和BC3-HM1的血清浓度。在96孔平底板中培育Jurkat细胞与注射了OKT3IgG4-AA-N297A或BC3-HM1的小鼠血清样品。检测一种稀释度一式三份的各血清样品。不同时间点所用样品的稀释度不同，OKT3IgG4-AA-N297A的范围是1:20-1:15,000，BC3-HM1的范围是1:20-1:1000。(在初步试验中检测过注射了OKT3IgG2-AA-N297A或BC3-HM1小鼠的合并样品，从而知晓各样品的合适稀释度)。在稀释的血清样品或标准品存在下培育细胞1小时(见下文)，洗涤后加入检测试剂。用偶联PE的山羊抗-人IgGFcγ抗体检测OKT3Ig4-AA-N297A与Jurkat细胞的结合，用偶联PE的抗-His抗体检测BC3-HM1与Jurkat细胞的结合。利用EL4细胞(小鼠T细胞系)，通过FACS结合试验测定H57Null2、H57-HM2和H57halfnull的血清浓度。用抗-小鼠CD16/CD32抗体阻断EL4细胞，然后在96-孔平底板中与注射了H57-null2的小鼠血清样品一起培育。检测一种稀释度一式三份的各血清样品。不同时间点所用样品的稀释度不同，但范围在1:500-1:10,000。(在初步试验中检测过注射了H57-null2的小鼠合并样品，从而知晓各样品的合适稀释度)。绘制一式三份在FACS缓冲液中掺入已知不同浓度H57Null2组成的标准曲线。未将血清(的影响)加入标准曲线，因为开发工作显示血清稀释度大于1:50时对标准曲线没有影响，而PK样品所需的血清稀释度大得多(最低1:500)。
在稀释的血清样品或标准品存在下培育EL4细胞1小时，洗涤后加入检测试剂。用偶联PE的驴抗-小鼠IgG(H+L)抗体检测H57Null2和H57halfnull与EL4细胞的结合，用偶联PE的抗-His抗体检测H57-HM2与EL4细胞的结合。用流式细胞术分析样品。将平均荧光强度(MFI)输入SoftmaxPro软件计算出血清浓度并测定标准曲线的精确性和准确度。
如前所述用米力波尔公司定制的14-plexLuminex检测试剂盒分析血清样品中存在的细胞因子和趋化因子。用WinNonlinTM专业软件(5.0.1版)，将预编译的模型201应用于静脉内推注给药和稀疏取样，通过非隔室分析估计各蛋白质的药代动力学配置参数。PK结果见图40，计算的半衰期见下表2，而细胞因子结果见图40-49。
表2.PK结果
测试化合物 血清半衰期(小时)
H57 Null2(SEQ ID NO:96) 83.5
H57half null(SEQ ID NO:304) 40.7
H57-HM2(SEQ ID NO:306) 6.6
BC3-HM1(SEQ ID NO:84) 3.2
BC3 IgG2-AA-N297A(SEQ ID NO:82) 87.5
BC3IgG4-AA-N297A(SEQ ID NO:83) 99.7
OKT3 IgG2-AA-N297A(SEQ ID NO:90) 42.4
PK研究结果显示，含CH2CH3尾的SMIP蛋白质半衰期远长于仅含CH3尾的那些。
图39-48显示，在所有检测时间点，H57-HM2SMIP蛋白通常不导致大多数细胞因子(IFN-γ、IL-2、IL-5、IL-6或IL-17)水平升高。这可能部分归因于该分子的半衰期较短。此外，通常观察到细胞因子水平周期性略微升高，但总是低于用H57halfnullSMIP融合蛋白观察到的水平。
实施例14
含有H57结合域的示范性融合蛋白的体外研究
按照实施例6的方法进行MLR和ConA母细胞再刺激试验。
结果显示，H57Null2、H57halfnull和H57-HM2融合蛋白(分别是SEQIDNO:96、304和306)而非H57mAb阻断了原代T细胞对抗原的应答反应(图50和51)。此外，H57Null2、H57halfnull和H57-HM2融合蛋白及IgG2a不诱导ConA-致敏T细胞的活化，H57mAb略微诱导ConA-致敏T细胞的活化，2C11mAb诱导ConA-致敏T细胞的活化(图52)。在ConA母细胞再刺激试验中，H57Null2和H57-HM2融合蛋白不诱导细胞因子释放，而与H57Null2和H57-HM2融合蛋白相比，H57halfnull融合蛋白导致测试的一些细胞因子(例如，GM-CSF、IFN-γ、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-17、IP-10和TNF-α)的水平升高(数据未显示)。
可联合上述各种实施方式以提供进一步的实施方式。本说明书述及和/或在申请数据清单中列举的所有美国专利、公开的美国专利申请、美国专利申请、外国专利、外国专利申请和非专利出版物通过引用全文纳入本文。
可借鉴以上详述对实施方式作出这些和其它改变。以下权利要求中，所有术语通常不应理解成限制说明书和权利要求书中公开的具体实施方式的权利主张，而应理解成包括所有可能的实施方式和此类权利要求所赋予的等价方式的整体范围。因此，本文不限制权利要求的范围。

Claims (10)

1.一种重组结合蛋白，其特征在于，包含特异性结合TCR复合物的结合域，其中所述结合域包含与SEQIDNO:245具有至少90％相同性的氨基酸序列和与SEQIDNO:241具有至少90％相同性的氨基酸序列。
2.如权利要求1所述的蛋白，其特征在于，SEQIDNO:245和241所列的氨基酸由选自以下的接头连接：
GlySer、Gly2Ser(SEQIDNO:339)、Gly3Ser(SEQIDNO:340)、Gly4Ser(SEQIDNO:341)和Gly5Ser(SEQIDNO:342)，包括(Gly3Ser)1(Gly4Ser)1(SEQIDNO:343)、(Gly3Ser)2(Gly4Ser)1(SEQIDNO:344)、(Gly3Ser)3(Gly4Ser)1(SEQIDNO:345)、(Gly3Ser)4(Gly4Ser)1(SEQIDNO:346)、(Gly3Ser)5(Gly4Ser)1(SEQIDNO:347)、(Gly3Ser)1(Gly4Ser)1(SEQIDNO:348)、(Gly3Ser)1(Gly4Ser)2(SEQIDNO:349)、(Gly3Ser)1(Gly4Ser)3(SEQIDNO:350)、(Gly3Ser)1(Gly4Ser)4(SEQIDNO:351)、(Gly3Ser)1(Gly4Ser)5(SEQIDNO:352)、(Gly3Ser)3(Gly4Ser)3(SEQIDNO:353)、(Gly3Ser)4(Gly4Ser)4(SEQIDNO:354)、(Gly3Ser)5(Gly4Ser)5(SEQIDNO:355)或(Gly4Ser)2(SEQIDNO:356)、(Gly4Ser)3(SEQIDNO:145)、(Gly4Ser)4(SEQIDNO:357)、(Gly4Ser)5(SEQIDNO:358)或GGGGSGGGGSGGGGSAQ(SEQIDNO:98)。
3.如权利要求1所述的蛋白，其特征在于，所述结合域包含SEQIDNO:263所列的氨基酸序列。
4.如权利要求1所述的蛋白，其特征在于，所述蛋白包含免疫球蛋白CH2区多肽和免疫球蛋白CH3区多肽。
5.如权利要求4所述的蛋白，其特征在于，所述免疫球蛋白CH2区多肽包含：
(i)297位天冬酰胺的氨基酸取代，和234-238位的一个或多个取代或缺失，
(ii)234-238位的一个或多个取代或缺失，和253、310、318、320、322或331位的至少一个取代，
(iii)297位天冬酰胺的氨基酸取代，234-238位的一个或多个取代或缺失；和253、310、318、320、322或331位的至少一个取代。
6.如权利要求4所述的蛋白，其特征在于，所述免疫球蛋白CH2区多肽包含297位天冬酰胺的氨基酸取代，234、235和237位的氨基酸取代，和236位的氨基酸缺失。
7.如权利要求5所述的蛋白，其特征在于，所述297位的氨基酸序列是天冬酰胺到丙氨酸的取代。
8.如权利要求4所述的蛋白，其特征在于，连接结合域与免疫球蛋白CH2区多肽或免疫球蛋白CH3区多肽的是免疫球蛋白绞链区多肽。
9.如权利要求8所述的蛋白，其特征在于，所述免疫球蛋白铰链区多肽选自野生型人IgG1绞链、含至少一个半胱氨酸突变的人IgG1绞链，或野生型小鼠IGHG2c绞链，列于SEQIDNO:212-218、300和379-434，或SEQIDNO:10的氨基酸3-17所示的任何一条氨基酸序列。
10.如权利要求4所述的蛋白质，其特征在于，包含列于SEQIDNO:75、102-104、和375-378的免疫球蛋白CH2区多肽。
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