KR20180105736A - Ｔｃｒ 복합체 면역치료제 - Google Patents

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KR20180105736A
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발레리 오드가드
캐서린 제이. 맥마한
피터 알. 바움
피터 에이. 톰슨
필립 탄
존 더블유. 블랑켄십
사티쉬 쿠마르 나타라잔
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압테보 리서치 앤드 디벨롭먼트 엘엘씨
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Abstract

본원은 TCRα, TCRβ, 또는 CD3ε과 같은 TCR 복합체 또는 이의 성분에 특이적으로 결합하는 일본쇄 융합 단백질, 및 이의 조성물 및 이의 사용 방법을 제공한다.

Description

ＴＣＲ 복합체 면역치료제{TCR Complex immunotherapeutics}
[관련 출원에 대한 교차 참조]
본원은 2008년 10월 10일자로 출원된 미국 가특허출원 제61/104,608호, 및 2009년 1월 29일자로 출원된 미국 가특허출원 제61/148,341호의 35 U.S.C.§119(e)하의 이익을 청구하며, 이러한 가특허출원들은, 이들의 전문이 본원에 참조로 포함되어있다.
[서열 목록에 관한 설명]
본원과 관련된 서열 목록은 종이 복사물 대신에 텍스트 형식으로 제공되며, 여기서 본 명세서내에 참조로 포함된다. 서열 목록을 포함하는 텍스트 파일의 명칭은 910180_416PC_서열_LISTING.txt이다. 텍스트 파일은 622 KB이고, 2009년 10월 9일자로 생성되었으며, 본 명세서의 출원과 동시에 EFS-Web을 통해 전자문서로 제출되어 있다.
[기술 분야]
본 기재내용은 면역학적으로 활성인 재조합체 결합 단백질 및, 특히, CD3와 같은 TCR 복합체 또는 이의 성분에 대해 특이적인 일본쇄 융합 단백질에 관한 것이다. 본 기재내용은 또한 자가면역병 및 기타 질환 또는 상태(예를 들면, 이식 거부증)를 치료하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다.
관련 기술의 설명
항-CD3 모노클로날 항체를 사용하여 인간 T 세포 상에서 TCR 복합체를 표적화하는 것은 기관 동종이식 거부증의 치료에 오랫동안 사용되어 왔다. OKT3[참조: Kung et al. (1979) Science 206: 347-9]와 같은, 인간 CD3에 대해 특이적인 마우스 모노클로날 항체가 이러한 치료의 최초 생성이었다. 비록 OKT3가 강력한 면역억제 효능을 가지고 있다고 해도, 이의 임상적 용도는 이의 면역원성 및 분열촉진 효능과 연결된 심각한 부작용으로 인해 구속되어 왔다[참조: Chatenoud (2003) Nature Reviews 3:123-132]. 이는 이의 자체의 신속한 청소(clearance) 및 중화를 촉진하는, 항-글로불린 반응을 유도하였다[참조: Chatenoud et al. (1982) Eur. J. Immunol. 137:830-8]. 또한, OKT3 유도된 T-세포 증식 및 시험관내 사이토킨 생산을 유도하였고 생체내에서 사이토킨의 대규모 방출을 가져왔다[참조: Hirsch et al. (1989) J. Immunol 142: 737-43, 1989]. 사이토킨 방출[또한, "사이토킨 스톰(cytokine 스톰)"으로 언급됨]은 다시 열, 한기, 두통, 오심, 구토, 설사, 호흡곤란, 패혈성 수막염 및 저혈압으로 특징지워지는 "플루-유사(flu-like)" 증후군을 초래하였다(참조: Chatenoud, 2003). 이러한 심각한 부작용은 이식에서 OKT3의 보다 광범위한 용도 및 또한 자가면역성과 같은 다른 임상 분야로 이의 용도의 확장을 제한하였다(상기 문헌 참조).
항-CD3 모노클로날 항체의 첫번째 생성의 부작용을 감소시키기 위하여, 유전적으로 가공된 항-CD3 모노클로날 항체의 두번째 생성이 쥐 항-CD3 모노클로날 항체의 상보성-결정 영역(CDR)을 인간 IgG 서열내로 이식시킴에 의해서 뿐만 아니라, 또한 비-FcR-결합 돌연변이를 Fc내로 도입시킴에 의해서도 개발되어 왔다[참조: Cole et al. (1999) Transplantation 68: 563; Cole et al. (1997) J. Immunol. 159: 3613]. 쥐 모노클로날 항체의 인간화는 감소된 면역원성 및 증진된 mAb 반감기를 초래한다(상기 문헌 참조). 또한, 비-FcR-결합 mAb는 생체내에서 사이토킨 방출 및 급성 독성을 유도하기 위한 효능이 감소되어 있다[참조: Chatenoud et al. (1989) N. Engl. J. Med. 320:1420]. 그러나, 감소된 수준에서조차, 사이토킨 방출은 여전히 투여량-제한적이며 매우 낮은 약물 투여량(밀리그람/환자)에서도 독성이다[참조: Plevy et al., (2007) Gastroenterology 133:1414-1422].
항-CD3/TCR-지시된 치료요법을 증진시키기 위한 몇가지 난점이 존재한다. 예를 들어, 항-CD3 모노클로날 항체에 의해 매개된 면역억제의 메카니즘은 복잡하며 완전히 이해되어 있지 않다. 이러한 항체는 4개이 메카니즘: 세포 피복, 세포 고갈, TCR 하향-조절(down-modulation) 및 세포 시그날링(시그날링)을 통해 작용하는 것으로 여겨지고 있으며, 여기서, 후자 2개의 메카니즘은 주요 메카니즘이다[참조: Chatenoud (2003) Nature Reviews:123-132]. 사이토킨 스톰의 유도 및 생체내 T 세포 활성화의 유도는 CD3/TCR-지시된 치료요법의 효능에 필요한 것으로 또한 여겨지고 있다[참조: Carpenter et al. (2000) J. Immunology 165:6205-13]. 최종적으로, 시험관내에서 "비-활성화"인 것으로 보고된 제2 세대 항-CD3 모노클로날 항체는 생체내에서 여전히 사이토킨 스톰을 유도한다.
다수의 항-CD3 지시된 항체가 현재 자가면역병, 염증병 및 이식 환자에서 사용하기 위해 임상에서 시험중에 있다. 이들 항체는 hOKT3γ1(Ala-Ala)[제조원: 마크로게닉스(Macrogenics)], 비실리주마브(Nuvion　, PDL), TRX-4[톨레륵스(Tolerx)], 및 NI-0401[제조원: 노브임뮨(NovImmune)]을 포함한다. 그러나, 이들 항체 각각으로 치료한 환자는 사이토킨-방출 관련 부작용(경증 내지 중증) 및 때때로 환자 집단에서 대표적으로 관찰된 것 이상의 바이러스 재활성화를 경험해 왔다.
현재의 T 세포 항체 및 기타 생물학적 치료요법과 관련된 사이토킨-방출 관련 부작용의 발생으로, 대체 치료요법에 대한 요구가 지속되고 있다. 본 발명은 이러한 요구들을 충족시키며 다른 관련된 장점들을 추가로 제공한다.
간단한 요약
본 기재내용은 TCR 복합체 또는 이의 성분에 결합하는 융합 단백질, 이러한 융합 단백질을 포함하는 조성물 및 단위 용량형, 이러한 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및 발현 벡터, 실질 기관 이식(solid organ transplant)의 거부를 감소시키거나 자가면역병을 치료하는 방법, 및 T 세포 활성화를 검출하는 방법을 제공한다.
하나의 측면에서, 본 기재내용은 아미노-말단으로부터 카복시-말단까지: (a) TCR 복합체 또는 이의 성분에 특이적으로 결합하는 결합 도메인, (b) 링커 폴리펩타이드, (c) (i) 297번 위치에서의 아스파라긴에서 아미노산 치환; (ii) 234 내지 238번 위치에서 하나 이상의 아미노산 치환 또는 결실; (iii) 253, 310, 318, 322 또는 331번 위치에서 적어도 하나의 아미노산 치환 또는 결실; (iv) 297번 위치에서의 아스파라긴에서 아미노산 치환 및 234 내지 238번 위치에서 하나 이상의 치환 또는 결실; (v) 297번 위치의 아스파라긴에서 아미노산 치환 및 253, 310, 318, 320, 322 또는 331번 위치에서 적어도 하나의 치환 또는 결실; (vi) 234 내지 238번 위치에서 하나 이상의 아미노산 치환 또는 결실, 및 253, 310, 318, 320, 322 또는 331번 위치에서 적어도 하나의 아미노산 치환 또는 결실; 또는 (vi) 297번 위치의 아스파라긴에서 아미노산 치환, 234 내지 238번 위치에서 하나 이상의 아미노산 치환 또는 결실, 및 253, 310, 318, 320, 322 또는 331번 위치에서 적어도 하나의 아미노산 치환 또는 결실을 포함하는 임의로 면역글로불린 CH2 영역 폴리펩타이드, 및 (d) 면역글로불린 CH3 영역 폴리펩타이드를 포함하거나, 필수로적으로 이루어지거나, 또는 이루어진 융합 단백질을 제공하며, 여기서, 융합 단백질은 사이토킨 스톰을 유도하지 않거나 최소한의 검출가능한 사이토킨 방출을 유도하고, 여기서, 면역글로불린 CH2 영역내 아미노산 잔기는 EU 번호매김 시스템에 의해 번호매김되어 있다. 추가의 융합 단백질은 특허청구범위 제2항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따라 제공되며 본원에 기술되어 있다.
다른 국면에서, 본 기재내용은 본원에 제공된 융합 단백질 및, 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 부형제를 포함하는 조성물을 제공한다.
다른 국면에서, 본 기재내용은 위에 나타낸 약제학적 조성물을 포함하는 단위 용량제형을 제공한다.
다른 국면에서, 본 기재내용은 본원에 제공된 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.
다른 국면에서, 본 기재내용은 발현 조절 서열에 작동적으로 연결되는 본원에 제공된 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터를 제공한다.
다른 국면에서, 본 기재내용은 실질 기관 이식 수용체에게 유효량의 본원에 제공된 융합 단백질을 투여함을 포함하여, 실질 기관 이식 거부를 감소시키는 방법을 제공한다.
다른 국면에서, 본 기재내용은 자가면역병[예를 들면, 크론병(Crohn's disease) 및 궤양대장염을 포함하는 염증성 창자병, 진성 당뇨병, 천식 및 관절염]의 치료가 요구되는 환자에게 유효량의 본원에 제공된 융합 단백질을 투여함을 포함하여, 자가면역병[예를 들면, 크론병(Crohn's disease) 및 궤양대장염을 포함하는 염증성 창자병, 진성 당뇨병, 천식 및 관절염]을 치료하는 방법을 제공한다.
다른 국면에서, 본 기재내용은 (a) 유사분열촉진제-프라임된(primed) T 세포를 제공하는 단계, (b) 단계 (a)의 프라임된 T 세포를 TCR 복합체 또는 이의 성분(예를 들면, 융합 단백질 및 항체)에 특이적으로 결합하는 결합 도메인을 포함하는 단백질로 처리하는 단계, 및 (c) 단계 (b)에서 처리된 프라임된 T 세포로부터의 사이토킨의 방출을 검출하는 단계를 포함하여, TCR 복합체 또는 이의 성분에 특이적으로 결합하는 결합 도메인을 포함하는 단백질에 의해 유도된 사이토킨 방출을 검출하는 방법을 제공한다.
다른 국면에서, 본 기재내용은 (a) 유사분열촉진제-프라임된 T 세포를 제공하는 단계, (b) 단계 (a)의 프라임된 T 세포를 TCR 복합체 또는 이의 성분(예를 들면, 융합 단백질 및 항체)에 특이적으로 결합하는 결합 도메인을 포함하는 단백질로 처리하는 단계, 및 (c) 단계 (b)에서 처리된 프라임된 T 세포의 활성화를 검출하는 단계를 포함하여, TCR 복합체 또는 이의 성분에 특이적으로 결합하는 결합 도메인을 포함하는 단백질에 의해 유도된 T 세포 활성화를 검출하는 방법을 제공한다.
상세한 기술
본 기재내용은 소 모듈러 면역약제(small modular immunopharmaceutical: SMIPTM) 생성물의 형태 또는 유일한 T 세포 시그날링 프로파일을 유도하는 C-말단 배향(PMIS)에 대한 역 N-말단에서 Fc 및 결합 도메인을 갖는 SMIP 분자 형태의 TCR 복합체에 대해 지시된 하나 이상의 도메인을 함유하는 융합 단백질을 제공한다. 당해 시그날링 프로파일은 활성화 T 세포 또는 이의 어떠한 조합의 부재하에서 검출불가능하거나 작은, 소량 또는 명목 사이토킨 방출(즉, 사이토킨 스톰이 없거나 또는 소량)을 특징으로 한다. 이러한 시그날링 프로파일은 모노클로날 항체를 사용하여 복제되지 않으며, 이들의 표적에 대한 SMIP 또는 PIMS 단백질의 결합에 의해 유발된 예측하지 않은 시그날링 신호를 입증한다. 지금까지, TCR 복합체에 대해 지시된 단백질 분자는 T 세포 활성화와 함께 강력한 T 세포 시그날(예를 들면, 사이토킨 스톰)을 유도하거나 교차-연결의 부재하에서 세포에서 효과를 거의 가지지 않는다.
또한, 본 기재내용은 이러한 융합 단백질을 암호화하는 핵산 분자, 이러한 단백질을 재조합적으로 생산하는 벡터 및 숙주 세포, 및 본 기재내용의 융합 단백질을 질병 또는 상태(예를 들면, 자가면역병, 염증병 및 기관이식 거부증)의 적어도 하나의 증상의 치료 및 완화를 포함하는 각종 치료학적 적용에 사용하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다.
본 기재내용을 보다 상세히 나타내기 전에, 본원에 사용될 특정 용어들의 정의를 제공하는 것이 이의 이해에 도움이 될 수 있다. 추가의 정의는 본 기재내용 전체에 나타내어져 있다.
본 설명에서, 특정의 농도 범위, 비율 범위, 비 범위 또는 정수 범위는 달리 나타내지 않는 한, 인용된 범위내 특정 정수의 값 및, 경우에 따라서, 이의 분수(예를 들면, 정수의 1/10 및 1/100)을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 중합체 소단위, 크기 또는 두께와 같은 특정의 물리학적 특성과 관련된 본원에 인용된 특정의 수 범위는 달리 나타내지 않는 한, 인용된 범위내 특정 정수를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본원에 사용된 것으로서, "약" 또는 "~으로 필수적으로 이루어진"은 달리 나타내지 않는 한, 나타낸 범위, 값 또는 구조의 ㅁ 20%를 의미한다. 본원에 사용된 것으로서, 용어 "함유하다" 및 "포함하다"는 유사하게 사용된다. 본원에 사용된 것으로서 용어 "하나(a 및 an)"는 열거된 성분들 중의 "하나 또는 그 이상"을 말한다. 대체어(예를 들면, "또는")의 사용은 대체어들 중의 하나, 둘다 또는 이의 특정 조합을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 본원에 기술된 구조 및 치환체의 각종 조합으로부터 기원한, 개개의 화합물 또는 화합물들의 그룹은 본원에 의해 각각의 화합물 또는 화합물들의 그룹이 개별적으로 설정되었던 경우와 동일한 정도로 기술됨을 이해하여야 한다. 따라서, 특별한 구조 또는 특별한 치환체의 선택은 본 발명의 영역내에 있다.
본 발명의 면역글로불린 CH2 및 CH3 영역은 달리 나타내지 않는 한 EU 번호매김 시스템[참조: Kabat et al., Sequence of Proteins of Immunological Interest, 5th ed. Bethesda, MD: Public Health Service, National Institutes of Health (1991)]에 의해 번호매김된다.
"소 모듈러 면역약제(SMIPTM) 단백질"은 이의 아미노 말단으로부터 카복시 말단까지: 표적 분자에 특이적으로 결합하는 결합 도메인, 링커 폴리펩타이드(예를 들면, 면역글로불린 힌지 또는 이의 유도체), 면역글로불린 CH2 폴리펩타이드 및 면역글로불린 CH3 폴리펩타이드(참조: 미국 특허 공보 제2003/0133939호, 제2003/0118592호, 및 제2005/0136049호)를 포함하는 일본쇄 융합 단백질을 말한다.
"PIMS 단백질"은, 결합 도메인이 융합 단백질의 카복시-말단에 분포하는 역 SMIP 분자이다. PIMS 단백질을 제조하기 위한 작제물 및 방법은 PCT 공보 WO 2009/023386호에 기술되어 있다. 일반적으로, PIMS 분자는 아미노-말단 내지 카복시-말단 배향으로, 임의의 CH2 영역 폴리펩타이드 CH3 도메인, 링커 펩타이드(예를 들면, 면역글로불린 힌지 영역), 및 특이적인 결합 도메인을 포함하는 일본쇄 폴리펩타이드이다.
본원에 사용된 것으로서, 단백질은, 단백질의 다른 부위(예를 들면, 아미노- 또는 카복시-말단에서 또는 2개의 도메인 사이에서 아미노산)가 함께 단백질 길이의 최대한 20%(예를 들면, 최대한 15%, 10%, 8%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1%)에 기여하고 TCR 복합체 또는 이의 성분에 대한 친화성, 사이토킨 방출을 유도하지 않는(또는 최소한으로 검출가능하게 유도하는) 능력, 칼슘 유동 또는 T 세포 수용체 시그날링 경로에서 분자의 인산화를 유도하는 능력, 동종항원에 대한 T 세포 반응을 차단하는 능력, 항원에 대한 기억 T 세포 반응을 차단하는 능력, 및 세포의 TCR 복합체를 하향-조절하는 능력과 같은, 단백질의 활성에 실질적으로 영향을 미치지 않는(즉, 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 또는 5% 이상 등, 50% 이상까지 활성을 감소시키지 않는) 경우, 몇개의 도메인(예를 들면, TCR 복합체 또는 이의 성분에 특이적으로 결합하는 결합 도메인, 링커 폴리펩타이드, 면역글로불린 CH2 영역 및 면역글로불린 CH3 영역) "으로 필수적으로 이루어진다". 특정 양태에서, 융합 단백질은 TCR 복합체 또는 이의 성분, 링커 폴리펩타이드, 임의의 면역글로불린 CH2 영역 폴리펩타이드, 및 면역글로불린 CH3 영역 폴리펩타이드로 필수적으로 이루어진다. 이러한 분자는 단백질의 아미노- 또는 카복시-말단에서 또는 2개의 상이한 도메인 사이에(예를 들면, 결합 도메인과 링커 폴리펩타이드 사이에, 링커 폴리펩타이드와 면역글로불린 CH2 영역 폴리펩타이드 사이에, 또는 면역글로불린 CH2 영역 폴리펩타이드와 면역글로불린 CH3 영역 폴리펩타이드 사이에) 연결 아미노산을 추가로 포함할 수 있다.
항체 기술의 당해 분야의 숙련가에 의해 이해되는 용어들은, 본원에서 달리 표현하여 정의하지 않는 한, 당해 분야에서 인정되는 각각의 제공된 의미이다. 항체는 가변 영역, 힌지 영역 및 불변 도메인을 갖는 것으로 공지되어 있다. 면역글로불린 구조 및 기능은 예를 들면, 문헌[Harlow et al., Eds., Antibodies: A Laboratory Manual, Chapter 14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, 1988]에서 고찰된다. 예를 들면, 용어 "VL" 및 "VH"는 항체 경쇄 및 중쇄 각각으로부터의 가변 결합 영역을 말한다. 가변 결합 영역은 "상보성 결정 영역"(CDR) 및 "구조 영역"(FR)으로 공지된 별개의, 잘-정의된 서브-영역으로 구성된다. 용어 "CL"은 "면역글로불린 경쇄 불변 영역" 또는 "경쇄 불변 영역", 즉, 항체 경쇄로부터의 불변 영역을 말한다. 용어 "CH"는 "면역글로불린 중쇄 불변 영역" 또는 "중쇄 불변 영역"을 말하며, 이는 항체 동형(isotype)에 따라 CH1, CH2, 및 CH3 (IgA, IgD, IgG), 또는 CH1, CH2, CH3, 및 CH4 도메인(IgE, IgM)으로 추가 분리가능하다. 불변 영역 도메인의 부위는 항체로부터의 Fc 영역("단편 결정화가능한" 영역)으로 구성되며 ADCC (항체-의존성 세포-매개된 세포독성), ADCP (항체-의존성 세포 포식작용), CDC(상보체-의존성 세포독성) 및 상보체 고정, Fc 수용체(예를 들면, CD16, CD32, FcRn)에 대한 결합, Fc 영역을 결여한 폴리펩타이드와 비교하여 생체내 보다 큰 반감기, 단백질 A 결합, 및 아마도 심지어 태반 전달과 같은, 면역글로불린의 효과기 작용에 관여한다[참조: Capon et al., Nature, 337:525 (1989)].
그 외에, 항체는 Fab 및 Fc 영역 사이에 통상적으로 위치한 힌지 서열(그러나 힌지의 보다 작은 단면은 Fc 영역의 아미노-말단 부위를 포함할 수 있다)를 갖는다. 기초로서, 면역글로불린 힌지는, Fab 부위가 공간에서 자유로이 이동하도록 하는 굴곡성 스페이서(flexible spacer)로서 작용한다. 불변 영역과는 대조적으로, 힌지는 구조적으로 다양하며, 면역글로불린 부류 및 심지어 소부류 사이에서 서열 및 길이 둘다에 있어 변한다. 예를 들어, 인간 IgG1 힌지 영역은 자유롭게 굴곡될 수 있으며, 이는, Fab 단편이 이들의 대칭 축에 대해 회전하여 2개의 내부-중쇄 이황화물 브릿지들 중의 첫번째 것에서 중심을 둔 구체(sphere)내에서 이동한다. 비교하면, 인간 IgG2 힌지는 비교적 짧으며 굴곡성을 제한하는 4개의 중쇄간 이황화물 브릿지에 의해 안정화된 강한 폴리-프롤린 이중 나선을 함유한다. 인간 IgG3 힌지는 62개 아미노산(21개 프롤린 및 11개 시스테인 포함)을 함유하며, 비-굴곡성 폴리-프롤린 이중 나선을 형성하고, Fab 단편이 Fc 단편으로부터 비교적 멀리 떨어져 있기 때문에, 더 큰 굴곡성을 제공하는 이의 유일하게 연장된 힌지 영역(IgG1 힌지보다 약 4배 더 긴 영역)에 의해 다른 소부류와 상이하다. 인간 IgG4 힌지는 IgG1보다 짧으나 IgG2와 동일한 길이를 가지며, 이의 굴곡성은 IgG1 및 IgG2의 것 사이의 중간이다.
결정모델 연구에 따르면, IgG 힌지 도메인은 이의 3개 영역: 상부, 코어 또는 중간, 및 하부 힌지 영역으로 기능적 및 구조적으로 세분될 수 있다[Shin et al., Immunological Reviews 130:87 (1992)]. 예시적인 상부 힌지 영역은 IgG1에서 발견된 것으로서 EPKSCDKTHT(서열 번호: 359), IgG2에서 발견된 것으로서 ERKCCVE (서열 번호: 360), IgG3에서 발견된 것으로서 ELKTPLGDTT HT (서열 번호: 361) 또는 EPKSCDTPPP (서열 번호: 362), 및 IgG4에서 발견된 것으로서 ESKYGPP (서열 번호: 363)을 포함한다. 예시적인 중간 또는 코어 힌지 영역은 IgG1 및 IgG2에서 발견된 것으로서 CPPCP(서열 번호: 364), IgG3에서 발견된 것으로서 CPRCP (서열 번호: 365), 및 IgG4에서 발견된 것으로서 CPSCP (서열 번호: 366)을 포함한다. IgG1, IgG2, 및 IgG4 항체가 각각 단일의 상부 및 중간 힌지를 가지는 것으로 여겨진다고 해도, IgG3는 일렬로 4개-하나의 ELKTPLGDTTHTCPRCP (서열 번호: 367) 및 3개의 EPKSCDTPPPCPRCP(서열 번호: 368)을 가진다.
IgA 및 IgD 항체는 IgG-유사 코어 영역을 결여한 것으로 여겨지며, IgD는 일렬로 2개의 상부 힌지 영역[참조: ESPKAQASSVPTAQPQAEGSLAKATTAPATTRNT (서열 번호: 369) 및 GRGGEEKKKEKEKEEQEERETKTP (서열 번호: 370)]을 갖는 것으로 여겨진다. IgA1 및 IgA2 항체에서 발견된 예시적인 야생형 상부 힌지 영역은 각각 VPSTPPTPSPSTPPTPSPS(서열 번호: 371) 및 VPPPPP(서열 번호: 372)이다.
대조적으로, IgE 및 IgM 항체는 대표적인 힌지 영역을 결여하고 있으며 대신힌지-유사 특성을 갖는 CH2 도메인을 갖는다. IgE 및 IgM의 예시적인 야생형 CH2 상부 힌지-유사 서열은 각각 서열 번호: 373 (VCSRDFTPPTVKILQSSSDGGGHFPPTIQLLCLVSGYTPGTINITWLEDG QVMDVDLSTASTTQEGELASTQSELTLSQKHWLSDRTYTCQVTYQGHTFE DSTKKCA) 및 서열 번호: 374 (VIAELPPKVSVFVPPRDGFFGNPRKSKLIC QATGFSPRQIQVSWLREGKQVGSGVTTDQVQAEAKESGPTTYKVTSTLTI KESDWLGQSMFTCRVDHRGLTFQQNASSMCVP)에 설정되어 있다.
본원에 사용된 것으로서, "힌지 영역" 또는 "힌지"는 (a) 면역글로불린 힌지 영역(예를 들면, 상부 및 코어 영역으로 이루어짐) 또는 이의 작용적 변이체, (b) 렉틴 도메인간 영역 또는 이의 작용적 변이체, 또는 (c) 분화의 무리(CD) 분자 스택 영역 또는 이의 작용적 변이체를 말한다.
면역글로불린 힌지 영역은 야생형 면역글로불린 힌지 영역 또는 변경된 야생형 면역글로불린 힌지 영역 또는 변경된 면역글로불린 힌지 영역일 수 있다.
본원에 사용된 것으로서, "야생형 면역글로불린 힌지 영역"은 CH1 및 CH2 도메인(IgG, IgA, 및 IgD의 경우) 사이에 삽입되어 이들을 연결하거나 항체의 중쇄내에서 발견된 CH1 및 CH3 도메인(IgE 및 IgM에 있어서) 사이에 삽입되어 이들을 연결하는 천연적으로 존재하는 상부 및 중간 힌지 아미노산 서열을 말한다.
"변경된 야생형 면역글로불린 힌지 영역" 또는 "변경된 면역글로불린 힌지 영역"은 (a) 30% 이하의 아미노산 변화(예를 들면, 25%, 20%, 15%, 10%, 또는 5% 이하의 아미노산 치환 또는 결실)를 갖는 야생형 면역글로불린 힌지 영역, 또는 (b) 길이가 약 5개의 아미노산(예를 들면, 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개 아미노산) 내지 약 120개 이하의 아미노산(바람직하게는 길이가 약 10 내지 약 40개 아미노산 또는 약 15 내지 약 30개 아미노산 또는 약 15 내지 20개 아미노산 또는 약 20 내지 약 25개 아미노산)이고, 약 30% 이하의 아미노산 변화(예를 들면, 약 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 또는 1% 이하의 아미노산 치환 또는 결실 또는 이의 조합)를 가지며, 서열 번호: 364, 365, 또는 366로 서술된 IgG 코어 힌지 영역을 갖는 야생형 면역글로불린 힌지 영역의 일부를 말한다.
"가변 도메인 연결 서열"은 중쇄 가변 영역을 경쇄 가변 영역에 연결시키고 2개의 서브-결합 도메인의 상호작용과 혼용성인 스페이서 작용을 제공함으로써 수득되는 폴리펩타이드가 동일한 경쇄 및 중쇄 가변 영역을 포함하는 항체와 동일한 표적 분자에 대해 특이적인 결합 친화성을 보유하는 아미노산 서열이다. 특정 양태에서, 결합 도메인을 면역글로불린 CH2 또는 CH3 영역 폴리펩타이드에 연결하는데 유용한 힌지는 가변 도메인 연결 서열로서 사용될 수 있다.
"링커 폴리펩타이드"는 융합 단백질내 면역글로불린 CH2 또는 CH3 영역 폴리펩타이드에 결합 도메인을 연결하는 아미노산 서열을 말한다. 특정 양태에서, 링커 폴리펩타이드는 본원에서 정의한 바와 같은 힌지(hinge)이다. 특정 양태에서, 중쇄 가변 영역을 경쇄 가변 영역에 연결시키기에 유용한 가변 도메인 연결 서열은 링커 폴리펩타이드로서 사용될 수 있다.
특정 양태에서, 결합 도메인과 링커 폴리펩타이드 사이, 링커 폴리펩타이드와 면역글로불린 CH2 영역 폴리펩타이드 사이, 및 면역글로불린 CH2 영역 폴리펩타이드와 면역글로불린 CH3 영역 폴리펩타이드 사이와 같은, 융합 단백질의 2개의 도메인 사이의 하나 또는 약간(예를 들면, 2 내지 8개)의 아미노산 잔기, 예를 들면, 융합 단백질의 작제물 설계로부터 수득되는 아미노산 잔기(예를 들면, 일본쇄 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자의 작제 동안 제한 효소 부위의 사용으로부터 수득되는 아미노산 잔기)가 존재할 수 있다. 본원에 기술된 것으로서, 이러한 아미노산 잔기는 "연결 아미노산" 또는 "연결 아미노산 잔기"로 언급될 수 있다.
본원에 사용된 것으로서, "유도체"는 모 화합물과 구조적으로 유사하고 모 화합물로부터 (실제적으로 또는 이론적으로) 유도가능한 화합물(예를 들면, 단백질)의 화학적으로 또는 생물학적으로 변형된 버젼을 말한다.
본원에 사용된 것으로서, "아미노산"은 천연 아미노산(천연에 존재하는 것들), 치환된 천연 아미노산, 비-천연 아미노산, 치환된 비-천연 아미노산 또는 이의 특정 조합을 말한다. 천연 아미노산의 명칭은 표준 1- 또는 3-문자 코드 중의 하나로서 본원에 나타내어져 있다. 천연의 극성 아미노산은 아스파라긴(Asp 또는 N) 및 글루타민(Gln 또는 Q); 및 또한 아르기닌(Arg 또는 R), 라이신(Lys 또는 K), 히스티딘(His 또는 H), 및 이의 유도체와 같은 염기성 아미노산; 및 아스파르트산(Asp 또는 D) 및 글루탐산(Glu 또는 E), 및 이의 유도체와 같은 산성 아미노산을 포함한다. 천연의 소수성 아미노산은 트립토판(Trp 또는 W), 페닐알라닌(Phe 또는 F), 이소루이신(Ile 또는 I), 루이신(Leu 또는 L), 메티오닌(Met 또는 M), 발린(Val 또는 V), 및 이의 유도체; 및 글리신(Gly 또는 G), 알라닌(Ala 또는 A), 프롤린(Pro 또는 P), 및 이의 유도체와 같은 다른 비-극성 아미노산을 포함한다. 중간 극성의 천연 아미노산은 세린(Ser 또는 S), 트레오닌(Thr 또는 T), 타이로신(Tyr 또는 Y), 시스테인(Cys 또는 C), 및 이의 유도체를 포함한다. 달리 정의하지 않는 한, 본원에 기술된 특정의 아미노산은 D- 또는 L-형태이다.
아미노산은 물리적 특성 및 2차 및 3차 단백질 구조에 대한 기여도에 따라 분류될 수 있다. "보존적 치환"은 하나의 아미노산을, 유사한 특성을 갖는 다른 아미노산으로 치환하는 것으로 당해 분야에 인지되어 있다. 예시적인 보존적 치환은 당해 분야에 잘 공지되어 있다[예를 들면, WO 97/09433, page 10, published March 13, 1997; Lehninger, Biochemistry, Second Edition; Worth Publishers, Inc. NY:NY (1975), pp.71-77; Lewin, Genes IV, Oxford University Press, NY and Cell Press, Cambridge, MA (1990), p. 8]. 특정 양태에서, 보존적 치환은 세린에 대한 루이신 치환을 포함한다.
본원에 사용된 것으로서, 달리 제공하지 않는 한, 인간 IgG1 중쇄의 불변 영역내 아미노산 잔기의 위치는, 인간 IgG1의 가변 영역이 카바트 번호매김 협약(Kabat numbering convention)에 따라 128개 아미노산 잔기로 구성된 것으로 추정하여 번호매김된다. 이후에, 인간 IgG1 중쇄의 번호매김된 불변 영역은 다른 면역글로불린 중쇄의 불변 영역내 아미노산 잔기의 번호매김을 위한 참조로서 사용된다. 인간 IgG1 중쇄 이외의 면역글로불린 중쇄의 불변 영역내 흥미있는 아미노산 잔기의 위치는, 흥미있는 아미노산 잔기가 정렬하는 인간 IgG1 중쇄내 아미노산 잔기의 위치이다. 인간 IgG1 중쇄의 불변 영역과 다른 면역글로불린 중쇄 사이의 정렬은 디폴트 매개변수(default parameter)를 사용하는 클루스탈 W 방법(Clustal W method)을 이용하는 메그얼라인 프로그램(Megalign program)[공급원: 디앤에이스타 인코포레이티드(DNASTAR Inc.)]과 같이, 당해 분야에 공지된 소프트웨어 프로그램을 사용하여 수행할 수 있다. 예시적인 서열 정렬은 도 16에 나타낸다. 본원에 기술된 번호매김 시스템에 따라서, 인간 IgG2 CH2 영역이 도 16에서 다른 CH2 영역과 비교하여 이의 아미노-말단 근처에 아미노산 결실을 갖는다고 해도, 인간 IgG2 CH2내 밑줄친 "N"의 위치는, 당해 잔기가 인간 IgG1 CH2내 297번 위치에서 "N"으로 정렬되기 때문에, 여전히 297번 위치에 존재한다.
TCR 복합체에 대해 지시된 융합 단백질
하나의 국면에서, 본 기재내용은 이의 아미노-말단으로부터 이의 카보시-말단까지 (a) TCR 복합체 또는 이의 성분에 특이적으로 결합하는 결합 도메인, (b) 링커 폴리펩타이드, (c) 임의로 면역글로불린 CH2 영역 폴리펩타이드, 및 (d) 면역글로불린 CH3 영역 폴리펩타이드를 포함하거나, 필수적으로 이루어지거나, 또는 이루어진 SMIP 융합 단백질 형태의 일본쇄 융합 단백질을 제공한다. 존재하는 경우, 면역글로불린 CH2 영역 폴리펩타이드는 (1) 297번 위치의 아스파라긴에서 아미노산 치환; (2) 234 내지 238번 위치에서 하나 이상의 아미노산 치환 또는 결실; (3) 253, 310, 318, 320, 322, 또는 331번 위치에서 적어도 하나의 아미노산 치환 또는 결실; (4) 297번 위치의 아스파라긴에서 아미노산 치환 및 234 내지 238번 위치에서 하나 이상의 치환 또는 결실; (5) 297번 위치의 아스파라긴에서 아미노산 치환 및 253, 310, 318, 320, 322, 또는 331번 위치에서 하나 이상의 치환 또는 결실; (6) 234 내지 238, 253, 310, 318, 320, 322, 또는 331번 위치에서 하나 이상의 아미노산 치환 또는 결실; 또는 (7) 297번 위치의 아스파라긴에서 아미노산 치환 및 234 내지 238, 253, 310, 318, 320, 322, 또는 331번 위치에서 적어도 하나의 아미노산 치환 또는 결실을 포함할 수 있다.
바람직한 양태에서, 본 기재내용의 일본쇄 융합 단백질은 이의 아미노-말단으로부터 이의 카복시-말단까지 (a) TCR 복합체 또는 이의 성분에 특이적으로 결합하는 결합 도메인, (b) 링커 폴리펩타이드, (c) 면역글로불린 CH2 영역 폴리펩타이드, 및 (d) 면역글로불린 CH3 영역 폴리펩타이드를 포함하고, 여기서, 면역글로불린 CH2 영역 폴리펩타이드는 (i) 297번 위치의 아스파라긴에서 아미노산 치환 및 234 내지 238번 위치에서 하나 이상의 아미노산 치환 또는 결실; (ii) 297번 위치의 아스파라긴에서 아미노산 치환, 234, 235 및 237번 위치에서 치환 및 236번 위치에서 결실; (iii) 234 내지 238번, 253, 310, 318, 320, 322, 또는 331번 위치에서 하나 이상의 아미노산 치환 또는 결실; (iv) 234, 235, 237, 318, 320 및 322번 위치에서 아미노산 치환, 및 236번 위치에서 결실; (v) 297번 위치의 아스파라긴에서 아미노산 치환 및 234 내지 238, 253, 310, 318, 320, 322, 또는 331번 위치에서 하나 이상의 치환 또는 결실; 또는 (vi) 297번 위치의 아스파라긴에서 아미노산 치환, 234, 235, 237, 318, 320 및 322번 위치에서 아미노산 치환 및 236번 위치에서 결실을 포함하거나, 필수적으로 이루어지거나, 또는 이루어질 것이다. 이들 바람직한 양태 각각에서, 치환에 사용된 아미노산은 바람직하게는 알라닌 또는 세린이다.
추가의 바람직한 양태에서, 본 기재내용의 일본쇄 융합 단백질은 이의 아미노 말단에서 이의 카복시-말단까지 (a) TCR 복합체 또는 이의 성분에 특이적으로 결합하는 결합 도메인, (b) 링커 폴리펩타이드, 및 (c) 면역글로불린 CH3 영역 폴리펩타이드를 포함하거나, 필수적으로 이루어지거나 또는 이루어질 것이며, 여기서, 면역글로불린 CH3 영역 폴리펩타이드는 인간 IgM의 CH3 영역 및 인간 IgG(바람직하게는 IgG1)의 CH3 영역을 포함한다.
융합 단백질은 단지 검출가능하게, 명목상으로, 최소한으로 또는 낮은 수준에서 사이토킨 방출(즉, 사이토킨 스톰)을 유도하거나, T 세포를 활성화시킬 것이고, 추가로 다음 활성들 중 하나 이상을 지닐 수 있다: (1) 칼슘 유동의 유도, (2) TCR 시그날링 경로에서 분자의 인산화 유도, (3) 동종항원에 대한 T 세포 반응의 차단, (4) 항원에 대한 기억 T 세포 반응의 차단, 및 (5) TCR 복합체의 하향 조절.
바람직한 양태에서, 융합 단백질은 서열 번호: 293, 294, 298, 또는 299번으로 나타낸 설정된 아미노산 서열을 포함한다. 관련된 바람직한 양태에서, 서열 번호: 293, 294, 298, 및 299의 아미노산 247 내지 261에서 힌지 서열은 서열 번호: 379 내지 434로 나타난 힌지 아미노산 서열로 치환된다. 추가의 바람직한 양태에서, 서열 번호: 293, 294, 298, 및 299의 면역글로불린 CH2 영역 폴리펩타이드는 추가로 EU 번호매김에 따라 318, 320, 및 322번 위치에서 아미노산 치환을 포함한다.
관련 국면에서, 본 기재내용은 이의 아미노-말단으로부터 이의 카복시-말단까지 (a) 임의로 면역글로불린 CH2 영역 폴리펩타이드, (b) 면역글로불린 CH3 영역 폴리펩타이드, (c) 링커 폴리펩타이드, 및 (d) TCR 복합체 또는 이의 성분에 특이적으로 결합하는 결합 도메인을 포함하거나, 필수적으로 이루어지거나, 또는 이루어진 PIMS 단백질 형태의 일본쇄 융합 단백질을 제공한다. 존재하는 경우, 면역글로불린 CH2 영역 폴리펩타이드는 본원에 제공된 SMIP 융합 단백질에서와 동일한 유형의 돌연변이를 포함할 수 있다. 또한, PIMS 단백질은, SMIP 융합 단백질이 본원에 기술된 바와 같이 가지는 바람직한 생물학적 활성들 중의 하나 이상을 가질 것이다.
결합 도메인
본원에 기술된 바와 같이, 본 기재내용의 융합 단백질은 TCR 복합체 또는 이의 성분에 특이적으로 결합하는 결합 도메인(예를 들면, CD3, TCRα, TCRβ 또는 이의 특정 조합)을 포함한다.
본 기재내용에 따른 "결합 도메인" 또는 "결합 영역"은 예를 들면, 생물학적 분자(예를 들면, TCR 복합체 또는 이의 성분)을 특이적으로 인지하여 결합하는 능력을 지닌 특정 단백질, 폴리펩타이드, 올리고펩타이드 또는 펩타이드일 수 있다. 결합 도메인은 목적한 생물학적 분자에 대해 특정의 천연적으로 존재하는, 합성의, 반-합성의, 또는 재조합적으로 생산된 결합 파트너를 포함한다. 예를 들면, 결합 도메인은 항체 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 영역일 수 있거나, 또는 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 영역은 함께 일본쇄 및 한쪽 배향(예를 들면, VL-VH 또는 VH-VL)으로 결합될 수 있다. 웨스턴 블롯, ELISA, 유동 세포분석, 또는 BiacoreTM 분석을 포함하는, 특별한 표적과 특이적으로 결합하는 본 기재내용의 결합 도메인을 확인하기 위한 각종 검정이 공지되어 있다.
결합 도메인(또는 이의 융합 단백질)은 표적 분자에 결합하거나 이와 연합하는 경우, 표적 분자에 예를 들면, 약 105 M-1 이상의 친화성 또는 Ka (즉, 1/M의 단위의 특별한 결합 상호작용의 평형 해리 상수)로 "특이적으로 결합한다". 특정 양태에서, 결합 도메인(또는 이의 융합 단백질)은 약 106 M-1, 107 M-1, 108 M-1, 109 M-1, 1010 M-1, 1011 M-1, 1012 M-1, 또는 1013 M-1 이상의 Ka로 표적에 결합한다. "고 친화성" 결합 도메인(또는 이의 일본쇄 융합 단백질)은 적어도 107 M-1, 적어도 108 M-1, 적어도 109 M-1, 적어도 1010 M-1, 적어도 1011 M-1, 적어도 1012 M-1, 적어도 1013 M-1, 또는 그 이상의 Ka를 갖는 결합 도메인을 말한다. 이와는 달리, 친화성은 M 단위(예를 들면, 10-5 M 내지 10-13 M, 또는 그 미만)의 특수 결합 상호작용의 평형 해리 상수(Kd)로 정의될 수 있다. 본 기재내용에 따른 결합 도메인 폴리펩타이드 및 융합 단백질의 친화성은 통상의 기술[예를 들면, Scatchard et al. (1949) Ann. N.Y. Acad. Sci. 51:660; 및 미국 특허 제5,283,173호; 제5,468,614호, 또는 이의 균등물]을 사용하여 용이하게 측정할 수 있다.
"T 세포 수용체"(TCR)는 CD3와 함께 일반적으로 주요 조직적합성 복합체(MHC) 분자에 결합된 항원을 인지하는데 관여하는 T 세포의 표면상에서 발견된 분자이다. 이는 대부분의 T 세포에서 고도로 가변성인 α 및 β쇄의 이황화물-연결된 이종이합체로 이루어진다. 다른 T 세포에서, 가변성 γ 및 δ 쇄로 구성된 대안의 수용체가 발현된다. TCR의 각각의 쇄는 면역글로불린 상과의 구성원이며 C-말단 끝에 하나의 N-말단 면역글로불린 가변 도메인, 하나의 면역글로불린 불변 도메인, 막관통 영역, 및 짧은 세포질성 테일을 소유한다[Abbas and Lichtman, Cellular and Molecular Immunology (5th Ed.), Editor: Saunders, Philadelphia, 2003; Janeway et al., Immunobiology : The Immune System in Health and Disease, 4th Ed., Current Biology Publications, p148, 149, 및 172, 1999]. 본 기재내용에서 사용된 TCR은 인간, 마우스, 랫트 또는 다른 포유동물을 포함하는, 각종 동물 종으로부터 기원할 수 있다.
"항-TCR 융합 단백질, SMIP, 또는 항체"는 TCR 분자 또는 이의 개개 쇄(예를 들면, TCRα, TCRβ, TCRγ 또는 TCRδ 쇄) 중 하나에 특이적으로 결합하는 융합 단백질, SMIP, 또는 항체를 말한다. 특정 양태에서, 항-TCR 융합 단백질, SMIP, 또는 항체는 TCRα, TCRβ, 또는 이들 둘다에 특이적으로 결합한다.
"CD3"는 당해 분야에 6개 쇄의 다중-단백질 복합체로 공지되어 있다(참조: Abbas and Lichtman, 2003; Janeway et al., p172 and 178, 1999). 포유동물에서, 복합체는 CD3γ 쇄, CD3δ쇄, 2개의 CD3ε 쇄, 및 CD3ζ 쇄의 동종이합체를 포함한다. CD3γ, CD3δ, CD3ε 쇄는 단일의 면역글로불린 도메인을 포함하는 면역글로불린 상과의 고도로 관련된 세포 표면 단백질이다. CD3γ, CD3δ, 및 CD3ε 쇄의 막관통 영역은 음성으로 하전되어 있으며, 이는, 이들 쇄가 양성으로 하전된 T 세포 수용체 쇄와 연합하도록 하는 특성이 있다. CD3γ, CD3δ, 및 CD3ε 쇄 각각의 세포내 테일은 면역수용체 타이로신-계 활성화 모티프 또는 ITAM으로 공지된 단일의 보존된 모티프를 함유하는 반면, 각각의 CD3ζ 쇄는 3개를 갖는다. 이론에 얽메이지 않고, ITAM은 TCR 복합체의 시그날링 능력에 중요한 것으로 여겨진다. 본 기재내용에 사용된 것으로서 CD3는 인간, 마우스, 랫트 또는 기타 포유동물을 포함하는 각종 동물 종으로부터 기원할 수 있다.
본원에 사용된 것으로서, "항-CD3 융합 단백질, SMIP, 또는 항체"는 개개의 CD3 쇄(예를 들면, CD3γ 쇄, CD3δ 쇄, 및 CD3ε 쇄)에 특이적으로 결합하는 융합 단백질, SMIP 또는 항체, 또는 2개 이상의 개개의 CD3 쇄(예를 들면, 하나 이상의 CD3ε 쇄의 복합체, CD3γ 및 CD3ε 쇄의 복합체, CD3δ 및 CD3ε 쇄의 복합체)를 말한다. 특정의 바람직한 양태에서, 항-CD3 융합 단백질, SMIP, 또는 항체는 CD3γ, CD3δ, 및 CD3ε 또는 이의 특정 조합, 및 보다 바람직하게는 CD3ε에 특이적으로 결합한다.
본원에 사용된 것으로서, "TCR 복합체"는 CD3와 TCR의 연합으로 형성된 복합체를 말한다. 예를 들면, TCR 복합체는 CD3γ 쇄, CD3δ 쇄, 및 2개의 CD3ε 쇄, CD3ζ 쇄의 동종이합체, TCRα 쇄, 및 TCRβ 쇄로 구성될 수 있다. 달리는, TCR 복합체는 CD3γ쇄, CD3δ 쇄, 및 2개의 CD3ε 쇄, CD3ζ 쇄의 동종이합체, TCRγ쇄, 및 TCRδ 쇄로 구성된다.
본원에 사용된 것으로서, "TCR 복합체의 성분"은 TCR 쇄(즉, TCRα, TCRβ, TCRγ 또는 TCRδ), CD3 쇄(즉, CD3γ, CDδ, CD3ε 또는 CD3ζ), 또는 2개 이상의 TCR 쇄 또는 CD3 쇄에 의해 형성된 복합체(예를 들면, TCRα 및 TCRβ의 복합체, TCRγ 및 TCRδ의 복합체, CD3ε 및 CD3δ의 복합체, CD3γ 및 CD3ε의 복합체, 또는 TCRα, TCRβ, CD3γ, CD3δ 및 2개의 CD3ε 쇄의 소-TCR 복합체)를 말한다.
배경으로서, TCR 복합체는 일반적으로 MHC 분자에 결합한 항원에 대한 T 세포 반응을 개시하는데 관여한다. TCR 및 공-수용체(즉, CD4 또는 CD8)에 대한 펩타이드:MHC 리간드의 결합은 함께 TCR 복합체, 공-수용체 및 CD45 타이로신 포스파타제를 가져오는 것으로 여겨진다. 이는, CD45가 억제성 포스페이트 그룹을 제거함으로써 Lck 및 Fyn 단백질 키나제를 활성화시킨다. 이들 단백질 키나제의 활성화는 CD3ζ 쇄 상에서 ITAM의 인산화를 가져오고, 이는 다시 이들 쇄가 세포질성 타이로신 키나제 ZAP-70에 결합할 수 있도록 한다. 인산화에 의한 결합된 ZAP-70의 후속적인 활성화는 3개의 시그날링 경로를 개시하며, 이들 중 2개는 PLC-γ의 인산화 및 활성화에 의해 개시된 후, 포스파티딜이노시톨 포스페이트(PIP)를 디아실글리세롤(DAG) 및 이노시톨 트리포스페이트(IP3)로 분해한다. DAG에 의한 단백질 키나제 C의 활성화는 전사 인자 NFκB의 활성화를 초래한다. IP3 작용의 결과로서 세포내 유리된 Ca2 +에 있어서의 급격한 증가는 세포질성 포스파타제, 칼시네우린을 활성화시켜, 전사 인자 NFAT(활성화된 T 세포의 핵 인자)가 세포질에서 핵으로 전좌되도록 한다. NFAT의 완전한 전사 활성은 또한 전사 인자의 AP-1 계열의 구성원; 전사 조절인자의 Fos 및 Jun 계열의 구성원의 이합체를 필요로 한다. 활성화된 ZAP-70에 의해 개시된 제3 시그날링 경로는 Ras의 활성화 및 MAP 키나제 캐스케이드의 후속적인 활성화이다. 이는 Fos 및 이에 따른 AP-1 전사 인자의 활성화를 종결시킨다. 함께, NFκB, NFAT, 및 AP-1는 T 세포 염색체상에서 작용하여 T 세포의 분화, 증식 및 효과인자 작용을 초래하는 새로운 유전자 전사를 개시한다 (Janeway et al., p178, 1999).
특정 양태에서, 본 기재내용의 결합 도메인은 개개의 CD3 쇄(예를 들면, CD3γ, CD3δ 또는 CD3ε) 또는 2개 이상의 개개의 CD3 쇄의 조합(예를 들면, CD3γ및 CD3ε으로부터 형성된 복합체 또는 CD3δ 및 CD3ε으로부터 형성된 복합체)에 특이적으로 결합한다. 특정 양태에서, 결합 도메인은 개개의 인간 CD3 쇄(예를 들면, 인간 CD3γ쇄, 인간 CD3δ 쇄, 및 인간 CD3ε 쇄) 또는 2개 이상의 개개의 인간 CD3 쇄의 조합(예를 들면, 인간 CD3γ 및 인간 CD3ε의 복합체 또는 인간 CD3δ 및 인간 CD3ε의 복합체)에 특이적으로 결합한다. 특정의 바람직한 양태에서, 결합 도메인은 인간 CD3ε 쇄에 특이적으로 결합한다.
특정의 다른 양태에서, 본 기재내용의 결합 도메인은 TCRα, TCRβ, 또는 TCRα및 TCRβ로부터 형성된 이종이합체에 특이적으로 결합한다. 특정의 바람직한 양태에서, 결합 도메인은 하나 이상의 인간 TCRα, 인간 TCRβ, 또는 인간 TCRα및 인간 TCRβ로부터 형성된 이종이합체에 특이적으로 결합한다.
특정 양태에서, 본 기재내용의 결합 도메인은 하나 이상의 CD3 쇄와 하나 이상의 TCR 쇄로부터 형성된 복합체, 예를 들면, CD3γ 쇄, CD3δ 쇄, CD3ε 쇄, TCRα 쇄, 또는 TCR β쇄, 또는 이의 특정 조합으로부터 형성된 복합체에 결합한다. 다른 양태에서, 본 기재내용의 결합 도메인은 하나의 CD3γ 쇄, 하나의 CD3δ 쇄, 2개의 CD3ε 쇄, 하나의 TCRα 쇄, 및 하나의 TCR β쇄로부터 형성된 복합체에 결합한다. 추가의 바람직한 양태에서, 본 기재내용의 결합 도메인은 하나 이상의 인간 CD3 쇄와 하나 이상의 인간 TCR 쇄로부터 형성된 복합체, 예를 들면, 인간 CD3γ 쇄, 인간 CD3δ 쇄, 인간 CD3ε 쇄, 인간 TCRα 쇄, 또는 인간 TCR β쇄, 또는 이의 특정 조합으로부터 형성된 복합체에 결합한다. 특정 양태에서, 본 기재내용의 결합 도메인은 하나의 인간 CD3γ 쇄, 하나의 인간 CD3δ 쇄, 2개의 인간 CD3ε 쇄, 하나의 인간 TCRα 쇄, 및 하나의 인간 TCR β 쇄로부터 형성된 복합체에 결합한다.
본 기재내용의 결합 도메인은 본원에 기술된 바와 같이 또는 당해 분야에 공지된 각종 방법(예를 들면, 미국 특허 제6,291,161호; 제6,291,158호)에 의해 생성시킬 수 있다. 결합 도메인의 공급원은 인간, 카멜리드(camelid)[낙타, 단봉낙타 또는 라마; Hamers-Casterm et al. (1993) Nature, 363:446 and Nguyen et al. (1998) J. Mol. Biol., 275:413], 상어[Roux et al. (1998) Proc. Nat'l. Acad. Sci. (USA) 95:11804], 어류[Nguyen et al. (2002) Immunogenetics, 54:39], 설치류, 양서류, 또는 양을 포함하는 다양한 종(파아지 라이브러리에서와 같이, 항체, sFv, scFv 또는 Fab로 포맷팅될 수 있는 종)으로부터의 항체 가변 도메인 핵산 서열을 포함한다. 본 기재내용의 결합 도메인이 기원할 수 있는 예시적인 항-CD3 항체는 Cris-7 모노클로날 항체[Reinherz, E. L. et al. (eds.), Leukocyte typing II., Springer Verlag, New York, (1986)], BC3 모노클로날 항체[Anasetti et al. (1990) J. Exp. Med. 172:1691], OKT3[Ortho multicenter Transplant Study Group (1985) N. Engl. J. Med. 313:337] 및 OKT3 ala-ala[Herold et al. (2003) J. Clin. Invest. 11:409]와 같은 이의 유도체, 비실리주마브[Carpenter et al. (2002) Blood 99:2712], 및 145-2C11 모노클로날 항체[Hirsch et al. (1988) J. Immunol. 140: 3766]를 포함한다. 예시적인 항-TCR 항체는 H57 모노클로날 항체[Lavasani et al. (2007) Scandinavi an Journal of Immunology 65:39-47]이다.
본 기재내용의 결합 도메인의 대체 공급원은 피브리노겐 도메인[예를 들면, Weisel et al. (1985) Science 230:1388], 쿠니츠(Kunitz) 도메인[예를 들면, 미국 특허 제6,423,498호], 리포칼린 도메인(예를 들면, 제WO 2006/095164호), V-유사 도메인(예를 들면, 미국 특허원 공보 제2007/0065431호), C-형 렉틴 도메인[Zelensky and Gready (2005) FEBS J. 272:6179), mAb2 또는 FcabTM(예를 들면, PCT 특허원 공보 제WO 2007/098934호; 제WO 2006/072620호) 등과 같은 대체의 비-항체 스캐폴드(scaffold)의 루프 영역내 아미노산의 가공된 다양성을 암호화하는 무작위적인 펩타이드 라이브러리 또는 서열을 암호화하는 서열을 포함한다. 예를 들면, 본 기재내용의 결합 도메인은 CD3 쇄에 특이적으로 결합하는 Fab 단편에 대한 Fab 파지 라이브러리를 스크리닝함으로써 확인할 수 있다[Hoet et al. (2005) Nature Biotechnol. 23:344].
추가로, 편리한 시스템(예를 들면, 마우스, HuMAb mouse　, TC 마우스TM, KM-mouse　, 라마, 닭, 랫트, 햄스터, 토끼 등)에서 면역원으로서 CD3 쇄를 사용한 하이브리도마 개발을 위한 전통적인 전략을 사용하여 본 기재내용의 결합 도메인을 개발할 수 있다.
일부 양태에서, 결합 도메인은 TCR 복합체 또는 이의 성분에 대해 특이적인 VH 및 VL 도메인을 포함하는 일본쇄 Fv 단편 (scFv)이다. 바람직한 양태에서, VH 및 VL 도메인은 인간 또는 인간화된 VH 및 VL 도메인이다. 예시적인 VH 도메인은 각각 서열 번호: 2, 6, 49 및 58로 나타낸 것으로서 BC3 VH, OKT3 VH, H57 VH, 및 2C11 VH 도메인을 포함한다. 추가의 예시적인 VH 도메인은 서열 번호: 220, 243, 244, 및 245로 나타낸 바와 같은, Cris-7 VH 도메인을 포함한다. 예시적인 VL 도메인은 각각 서열 번호: 4, 8, 51 및 60로 나타낸 BC3 VL, OKT3 VL, H57 VL, 및 2C11 VL 도메인이다. 추가의 예시적인 VL 도메인은 서열 번호: 222, 241, 및 242로 나타낸 바와 같은 Cris-7 VL 도메인을 포함한다. 특정 양태에서, 결합 도메인은 경쇄 가변 영역 (VL)의 아미노산 서열(예를 들면, 서열 번호: 4, 8, 51, 60, 222, 241, 또는 242) 또는 중쇄 가변 영역 (VH)(예를 들면, 서열 번호: 2, 6, 49, 58, 220, 243, 244, 또는 245), 또는 CD3ε, TCRα, TCRβ, TCRγ 및 TCRδ, 또는 이의 조합물과 같은 TCR 복합체 또는 이의 성분에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체 또는 이의 단편 또는 유도체에 대해 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하거나 또는 이러한 서열이다.
본원에 사용된 것으로서, "서열 동일성"은 서열을 정렬하고, 최대 비율의 서열 동질성을 달성하기 위해, 경우에 따라, 갭을 도입시킨 후 서열 동일성의 일부로서 어떠한 보존적인 치환을 고려하지 않고 다른 참조 폴리펩타이드 서열내 아미노산 잔기와 동일한 하나의 서열내 아미노산 잔기의 비율을 말한다. 서열 동일성 값 비율은 문헌[Altschul et al. (1997) "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25:3389-3402]에 정의된 바와 같은 NCBI BLAST2.0 프로그램을 디폴트 값으로 설정된 매개변수를 사용하여 생성할 수 있다.
특정 양태에서, 본 기재내용의 결합 도메인 VH 영역은 공지된 모노클로날 항체(예를 들면, 이의 유도체를 포함하는 Cris-7, BC3, OKT3)의 VH로부터 또는 이를 기초로 유도시킬 수 있으며, 공지된 모노클로날 항체의 VH와 비교하는 경우 하나 이상의 삽입, 하나 이상의 결실, 하나 이상의 아미노산 치환(예를 들면, 보존적 아미노산 치환 또는 비-보존적 아미노산 치환), 또는 위에서 나타낸 변화의 조합을 함유한다. 삽입(들), 결실(들) 또는 치환(들)은 아미노- 또는 카복시-말단 또는 이들 영역의 말단 둘다를 포함하는 VH 영역내 어디에서도 존재할 수 있으며, 단, 변형된 VH 영역을 함유하는 결합 도메인은 야생형 결합 도메인과 유사한 친화성으로 이의 표적에 여전히 특이적으로 결합할 수 있다.
특정 양태에서, 본 기재내용의 결합 도메인내 VL 영역은 공지된 모노클로날 항체(예를 들면, 이의 유도체를 포함하는 Cris-7, BC3, OKT3)의 VL로부터 기원하거나 이를 기초로 하며, 공지된 모노클로날 항체의 VL와 비교하는 경우, 하나 이상의 삽입, 하나 이상의 결실, 하나 이상의 아미노산 치환 (예를 들면, 보존적 아미노산 치환), 또는 위에서 나타낸 변화의 조합을 함유한다. 삽입(들), 결실(들) 또는 치환(들)은 아미노- 또는 카복시-말단 또는 이들 영역의 말단 둘다를 포함하는 VL 영역내 어디에서도 존재할 수 있으며, 단, 변형된 VL 영역을 함유하는 결합 도메인은 야생형 결합 도메인과 유사한 친화성으로 이의 표적에 여전히 특이적으로 결합할 수 있다.
VH 및 VL 도메인은 아미노-말단으로부터 카복시-말단까지 하나의 배향(즉, 아미노-말단으로부터 카복시-말단까지, VH-VL 또는 VL-VH)으로 정렬될 수 있으며 가변 도메인 연결 서열에 의해 분리될 수 있다. 특정 양태에서, 가변 도메인 연결 서열은 GlySer의 계열, (Gly3Ser)1(Gly4Ser)1 (서열 번호: 343), (Gly3Ser)2(Gly4Ser)1 (서열 번호: 344), (Gly3Ser)3(Gly4Ser)1 (서열 번호: 345), (Gly3Ser)4(Gly4Ser)1 (서열 번호: 346), (Gly3Ser)5(Gly4Ser)1 (서열 번호: 347), (Gly3Ser)1(Gly4Ser)1 (서열 번호: 348), (Gly3Ser)1(Gly4Ser)2 (서열 번호: 349), (Gly3Ser)1(Gly4Ser)3 (서열 번호: 350), (Gly3Ser)1(Gly4Ser)4 (서열 번호: 351), (Gly3Ser)1(Gly4Ser)5 (서열 번호: 352), (Gly3Ser)3(Gly4Ser)3 (서열 번호: 353), (Gly3Ser)4(Gly4Ser)4 (서열 번호: 354), (Gly3Ser)5(Gly4Ser)5 (서열 번호: 355), 또는 (Gly4Ser)2 (서열 번호: 356), (Gly4Ser)3 (서열 번호: 145), (Gly4Ser)4 (서열 번호: 357), 또는 (Gly4Ser)5 (서열 번호: 358)을 포함하는 Gly2Ser(서열 번호: 339), Gly3Ser(서열 번호: 340), Gly4Ser(서열 번호: 341), 및 Gly5Ser(서열 번호: 342)에 속하는 것들을 포함한다. 특정 양태에서, 가변 도메인 연결 서열은 GGGGSGGGGSGGGGSAQ(서열 번호: 98)이다. 바람직한 양태에서, 이들 (GlyxSer)-계 링커는 가변 도메인을 연결하는데 사용되며 결합 도메인(예를 들면, scFv)을 Fc 테일(예를 들면, IgG CH2CH3)에 연결하는데 사용되지 않는다. 특정 양태에서, 가변 도메인 연결 서열은 약 5 내지 약 35개 아미노산 및 바람직하게는 약 15 내지 약 25개의 아미노산을 포함한다.
본원에 기술된 것으로서, 특수 도메인 또는 영역의 아미노- 또는 카복시-말단에서 특정의 삽입(들), 결실(들) 또는 치환(들)은 예를 들면, 하나의 가변 영역을 가공하여 다른 가변 영역에 연결시키는 방법(예를 들면, VH 및 VL 영역 사이, 또는 VL 및 VH 영역 사이의 연결부에서 아미노산 변화) 또는 결합 도메인을 가공하여 불변 영역에 연결시키는 방법(예를 들면, 결합 도메인 및 힌지 링커 사이의 연결부에서 아미노산 변화)의 결과일 수 있다. 예를 들어, 하나 이상(예를 들면, 2 내지 8개)의 아미노산을 하기에 보다 상세히 기술하는 바와 같이, 융합 단백질 연결부의 하나 이상에서 첨가하거나, 결실시키거나 치환할 수 있다.
본 기재내용의 예시적인 결합 도메인은 서열 번호: 18, 20, 48, 62, 및 258 내지 264로 나타낸 것들을 포함한다. 특정의 바람직한 양태에서, 본 기재내용의 일본쇄 융합 단백질은 서열 번호: 258 내지 264 중 어느 하나로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 결합 도메인을 포함한다.
링커 폴리펩타이드
본원에 기술된 바와 같이, 본 기재내용의 융합 단백질은 TCR 복합체 또는 이의 성분에 특이적으로 결합하는 결합 도메인을 면역글로불린 CH2 영역 또는 면역글로불린 CH3 영역에 연결시키는 링커 폴리펩타이드를 포함한다. 결합 도메인과 융합 단백질의 나머지 사이에 스페이싱 작용을 제공하는 것 외에, 링커는 융합 단백질의 결합 도메인을 적절히 배향시켜 이의 표적(즉, TCR 복합체, 또는 CD3와 같은 이의 성분)과 상호작용하도록 하기에 적합한 굴곡성 또는 강직성을 제공할 수 있다. 또한, 링커는 완전한 길이의 융합 단백질의 발현을 지지할 수 있으며 인간과 같은, 이를 필요로 하는 대상체에 투여한 후 시험관내 및 생체내 둘다에서 정제된 단백질에 대한 안정성을 제공하며, 바람직하게는 이러한 대상체에서 비-면역원성이거나 약간의 면역원성이다.
본 기재내용에서 고려된 링커는 예를 들면, 면역글로불린 상과 구성원, 면역글로불린 도메인간 영역(예를 들면, 항체 힌지 영역), 또는 C-유형 렉틴의 스택 영역, 제II형 막 단백질의 계열(예를 들면, 본원에 참조로 인용된 PCT 출원 공보 제WO　2007/146968호로부터의 서열 번호: 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 231, 233, 235, 237, 239, 241, 243, 245, 247, 249, 251, 253, 255, 257, 259, 261, 263, 265, 267, 269, 271, 273, 275, 277, 279, 281, 287, 289, 297, 305, 307, 309 내지 311, 313 내지 331, 346, 373 내지 377, 380, 또는 381과 같은, PCT 출원 공보 제WO　2007/146968호로 나타낸 바와 같은 예시적인 렉틴 스택 영역 서열), 및 덩어리 형태의 분화(CD) 분자 스택 영역을 포함한다.
본 기재내용의 융합 단백질에서 사용하기에 적합한 링커는 IgG 힌지, IgA 힌지, IgD 힌지, IgE CH2, IgM CH2 중에서 선택된 항체 힌지 영역 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함한다. 특정의 바람직한 양태에서, 링커는 인간 IgG1, 인간 IgG2, 인간 IgG3, 인간 IgG4 중에서 선택된 항체 힌지 영역, 또는 이의 단편 또는 변이체일 수 있다. 일부 양태에서, 링커는 야생형 인간 면역글로불린 힌지 영역과 같은 야생형 면역글로불린 힌지 영역이다. 예시적인 링커는 야생형 인간 IgG1 힌지 영역 및 야생형 마우스 IGHG2c 힌지 영역이며, 이의 서열은 각각 서열 번호: 63 및 72로 나타낸다.
특정 양태에서, 하나 이상의 아미노산 잔기는 융합 단백질 작제물 설계의 부분으로서 야생형 면역글로불린 힌지 영역의 아미노- 또는 카복시-말단에 가해질 수 있다. 대표적인 변형된 링커는 "RT"(예를 들면, 서열 번호: 100 및 52로 나타냄), "RSS"(예를 들면, 서열 번호: 328 및 331 내지 338로 나타냄), "TG" (예를 들면, 서열 번호: 177로 나타냄), 또는 "T" (예를 들면, 서열 번호: 300로 나타냄)과 같은 아미노-말단에서 추가의 연결부 아미노산 잔기; 카복시 말단에서 "SG"(예를 들면, 서열 번호: 212 및 213으로 나타냄); 또는 카복시 말단에서 가해진 "SG"(예를 들면, 서열 번호: 212로 나타냄)를 지닌 △P와 같은, 첨가와 결합된 결실을 가질 수 있다.
바람직한 양태에서, 링커는 돌연변이된 면역글로불린 힌지 영역, 예를 들면, 돌연변이된 IgG 면역글로불린 힌지 영역이다. 예를 들면, 야생형 인간 IgG1 힌지 영역은 3개의 시스테인 잔기를 함유한다: 대부분의 아미노-말단 시스테인은 제1 시스테인으로 언급되는 반면, 힌지 영역의 대부분의 카복시-말단 시스테인은 제3 시스테인으로 언급된다. 특정 양태에서, 링커는 세린으로 치환된 제1 시스테인을 갖는 인간 IgG1 힌지 영역과 같이, 단지 2개의 시스테인 잔기를 갖는 돌연변이된 인간 IgG1 힌지 영역이다. 특정의 다른 양태에서, 링커는 제1, 제2 및 제3 시스테인과 같이, 단지 하나의 시스테인 잔기를 갖는 돌연변이된 인간 IgG1 힌지 영역이다. 특정 양태에서, 인간 IgG1 힌지 영역내에서 제3 시스테인에 대한 제1 프롤린 카복시-말단은 예를 들면, 세린으로 치환된다. 결합 도메인과 융합 단백질의 나머지 사이의 링커 폴리펩타이드로서 사용될 수 있는 예시적인 돌연변이된 인간 IgG1 힌지 영역은 링커 47 내지 49, 51, 및 53 내지 60(각각 서열 번호: 99, 146 내지 148 및 150 내지 157)과 같이 서열 목록에 나열되어 있다. 특정 양태에서, 하나 이상의 아미노산 잔기는 융합 단백질 작제물 설계의 부분으로서 돌연변이된 면역글로불린 힌지 영역의 아미노- 또는 카복시-말단에 가해질 수 있다. 이러한 변형된 링커의 예는 서열 번호: 10, 335 및 300으로 나타내며, 여기서, 아미노산 잔기 "RT", "RSS" 또는 "T"는 각각 돌연변이된 인간 IgG1 힌지 영역의 아미노-말단에 가해진다.
특정 양태에서, 링커는 하나 이상의 시스테인 잔기를 가질 수 있으나, IgG1의 제2 또는 제3 시스테인과 같이, 쇄내 이황화물 결합의 형성을 위한 단일 시스테인 잔기를 가질 수 있다. 다른 양태에서, 링커는 2개 이상의 시스테인 잔기를 가질 수 있으나, 쇄간 이황화물 결합의 형성을 위한 2개의 시스테인 잔기를 갖는다.
특정 양태에서, 본 기재내용의 링커 폴리펩타이드는 야생형 면역글로불린 힌지 영역(예를 들면, IgG1 힌지 영역)으로부터 유래하며 야생형 면역글로불린 힌지 영역과 비교하는 경우 하나 이상(예를 들면, 1, 2, 3, 또는 4개)의 삽입, 하나 이상(예를 들면, 1, 2, 3, 또는 4개)의 결실, 하나 이상(예를 들면, 1, 2, 3, 또는 4개)의 아미노산 치환(예를 들면, 보존적 아미노산 치환 또는 비-보존적 아미노산 치환), 또는 상술한 돌연변이의 조합을 함유하며, 제공된 변형된 힌지는 이의 표적과 상호작용하기 위한 융합 단백질의 결합 도메인을 적절히 배향하는데 적합한 굴곡성 또는 강직성을 보유한다. 삽입(들), 결실(들) 또는 치환(들)은 아미노- 또는 카복시-말단 또는 말단 둘다에서를 포함하는, 야생형 면역글로불린 힌지 영역에서 어느 곳에도 존재할 수 있다. 특정 양태에서, 링커 폴리펩타이드는 야생형 인간 IgG1 힌지, 야생형 인간 IgG2 힌지, 또는 야생형 인간 IgG4 힌지와 같은 야생형 면역글로불린 힌지 영역에 대해 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 동일한 서열을 포함하거나, 이러한 서열이다.
대체의 힌지 또는 링커 서열은 IgV-유사 또는 IgC-유사 도메인을 연결하는 세포 표면 수용체의 일부로부터 크래프트(craft)될 수 있다. 세포 표면 수용체가 다중 IgV-유사 도메인을 동시에 함유하는 IgV-유사 도메인 사이 및 세포 표면 수용체가 다중 무작위적인 IgC-유사 영역을 함유하는 IgC-유사 도메인 사이의 영역을 또한 연결 영역 또는 링커 펩타이드로 사용할 수 있다. IgV-유사 및 IgC-유사 사이 또는 IgC-유사 또는 IgV-유사 도메인 사이의 도메인내 영역의 대표적인 힌지 또는 링커 서열은 CD2, CD4, CD22, CD33, CD48, CD58, CD66, CD80, CD86, CD96, CD150, CD166, 및 CD244에서 찾을 수 있다. 보다 대체가능한 힌지는 CD69, CD72, 및 CD161와 같은 비-면역글로불린 상과 구성원으로부터의 제II형 수용체의 이황화물-함유 영역으로부터 크래프트될 수 있다.
특정 양태에서, 힌지 또는 링커 서열은 2 내지 150개 아미노산, 5 내지 60개 아미노산, 2 내지 40 아미노산을 가지며, 바람직하게는 8 내지 20개 아미노산을 가지고, 보다 바람직하게는 12 내지 15개 아미노산을 가지며, 주로 굴곡성이지만, 보다 더 강직성을 제공할 수 있거나 주로 최소의 β 쉬트(sheet) 구조를 갖는 α 나선 구조를 함유할 수 있다. 바람직하게는, 힌지 및 링커 서열은 혈장 및 혈청 속에서 안정하며 단백질분해성 분해에 대해 내성이다. 특정 양태에서, IgG1 상부 힌지 영역내 제1 라이신은 돌연변이되어 단백질분해성 분해를 최소화하며, 바람직하게는 라이신은 메티오닌, 트레오닌, 알라닌 또는 글리신으로 치환되거나 결실된다( 예를 들면, 서열 번호: 379-434, 이는 아미노 말단에서 연결 아미노산, 바람직하게는 RT를 포함할 수 있다). 일부 양태에서, 서열은 이황화물 결합 또는 다중 이황화물 결합을 형성하여 분자의 카복시-말단을 안정화시키는 능력을 부여하는 코어 구조 CPPC (서열 번호: 330)와 같은 천연적으로 존재하거나 첨가된 모티프를 함유할 수 있다. 다른 양태에서, 서열은 하나 이상의 글리코실화 부위를 함유할 수 있다. 힌지 길이를 변경시키는 예측지못한 특징은 본 기재내용의 일본쇄 융합 단백질에 의해 유발된 칼슘 유동 수준의 조절을 허용한다는 것이다(참조; 실시예 5). 칼슘 유동을 조절하기 위한 예시적인 힌지는 서열 번호: 212 내지 218을 포함한다. 또한, 힌지 길이 및/또는 서열은 또한 동종 항원에 대한 T 세포 반응을 차단하는데 있어 융합 단백질의 활성에 영향을 미칠 수 있다(참조: 실시예 10). 본 기재내용의 융합 단백질내 연결 영역으로서 유용한 링커는 서열 번호: 379 내지 434로 서술되어 있다.
면역글로불린 C H2 영역 폴리펩타이드
본원에 기술된 바와 같이, 본 기재내용의 융합 단백질은 297번 위치의 아스파라긴에서 아미노산 치환(예를 들면, 아스파라긴에서 알라닌으로)을 포함하는 면역글로불린 CH2 영역을 포함할 수 있다. 이러한 아미노산 치환은 당해 부위에서 글리코실화를 감소시키거나 제거하며 Fcγr 및 C1q에 대한 효율적인 Fc 결합을 폐지한다.
특정 양태에서, 본 기재내용의 융합 단백질은 234 내지 238번 위치에서 적어도 하나의 치환 또는 결실을 포함하는 면역글로불린 CH2 영역을 포함할 수 있다. 예를 들면, 면역글로불린 CH2 영역은 234, 235, 236, 237 또는 238번 위치, 234 및 235번 위치, 234 및 236번 위치, 234 및 237번 위치, 234 및 238번 위치, 234 내지 236번 위치, 234, 235 및 237번 위치, 234, 236 및 238번 위치, 234, 235, 237, 및 238번 위치, 236 내지 238번 위치에서 치환, 또는 234 내지 238번 위치에서 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산의 특정의 다른 조합을 포함할 수 있다. 추가로 또한 이와는 달리, 돌연변이된 CH2 영역은 234 내지 238번 위치에서, 바람직하게는 236번 위치 또는 237번 위치에 하나 이상(예를 들면, 2, 3, 4 또는 5개)의 아미노산 결실을 포함하나 다른 위치는 치환된다. 위에서 나타낸 돌연변이(들)은 융합 단백질의 항체-의존성 세포-매개된 세포독성(ADCC) 활성 또는 융합 단백질의 Fc 수용체-결합능을 감소시키거나 제거한다. 특정의 바람직한 양태에서, 234 내지 238번 위치 중 하나 이상에서 아미노산 잔기는 하나 이상의 알라닌 잔기로 대체되었다. 추가로 바람직한 양태에서, 234 내지 238번 위치에서 아미노산 잔기들 중의 단지 하나는 결실되는 반면, 234 내지 238번 위치에서 나머지 아미노산들 중의 하나 이상은 또 다른 아미노산(예를 들면, 알라닌 또는 세린)으로 치환될 수 있다.
특정의 다른 양태에서, 본 기재내용의 융합 단백질은 253, 310, 318, 320, 322, 및 331번 위치에서 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 면역글로불린 CH2 영역을 포함할 수 있다. 예를 들면, 면역글로불린 CH2 영역은 253, 310, 318, 320, 322, 또는 331번 위치, 318 및 320번 위치, 318 및 322번 위치, 318, 320 및 322번 위치, 또는 253, 310, 318, 320, 322, 및 331번 위치에서 2, 3, 4, 5 또는 6개의 아미노산의 어떠한 다른 조합에서 치환을 포함할 수 있다. 위에-나타낸 돌연변이(들)은 융합 단백질의 상보체-의존성 세포독성(CDC)을 감소시키거나 제거한다.
특정의 다른 양태에서, 297번 위치에서 아미노산 치환 외에도, 본 기재내용의 융합 단백질내 돌연변이된 CH2 영역은 234 내지 238번 위치에서 추가로 하나 이상(예를 들면, 2, 3, 4 또는 5개)의 추가의 치환을 포함할 수 있다. 예를 들면, 면역글로불린 CH2 영역은 234 및 297번 위치, 234, 235, 및 297번 위치, 234, 236 및 297번 위치, 234 내지 236 및 297번 위치, 234, 235, 237 및 297번 위치, 234, 236, 238 및 297번 위치, 234, 235, 237, 238 및 297번 위치, 236 내지 238 및 297번 위치, 또는 297번 외에 234 내지 238번 위치에서 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산의 특정 조합에서 치환을 포함할 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, 돌연변이된 CH2 영역은 234 내지 238번 위치, 예를 들면, 236번 위치 또는 237번 위치에서 하나 이상(예를 들면, 2, 3, 4 또는 5개)의 아미노산 결실을 포함할 수 있다. 추가의 돌연변이(들)은 항체-의존성 세포-매개된 세포독성(ADCC) 활성 또는 융합 단백질의 Fc 수용체-결합능을 감소시키거나 제거한다. 특정 양태에서, 234 내지 238번 위치 중 하나 이상에서 아미노산 잔기는 하나 이상의 알라닌 잔기로 치환된다. 추가의 양태에서, 234 내지 238번 위치에서 아미노산 잔기들 중 단지 하나가 결실되는 한편, 234 내지 238번 위치에서 나머지 아미노산중 하나 이상은 다른 아미노산(예를 들어, 바람직하게는 알라닌 또는 세린)으로 치환될 수 있다.
특정 양태에서, 234 내지 238번 위치에서 하나 이상(예를 들면, 2, 3, 4, 또는 5개)의 아미노산 치환 외에도, 본 기재내용의 융합 단백질내 돌연변이된 CH2 영역은 상보체 고정에 포함된 하나 이상의 위치(예를 들면, I253, H310, E318, K320, K322, 또는 P331번 위치)에서 하나 이상(예를 들면, 2, 3, 4, 5, 또는 6개)의 추가의 아미노산 치환(예를 들면, 알라닌으로 치환)을 함유할 수 있다. 바람직한 돌연변이된 면역글로불린 CH2 영역은 234, 235, 237(존재하는 경우), 318, 320 및 322번 위치에서 알라닌 치환을 지닌 인간 IgG1, IgG2, IgG4 및 마우스 IgG2a CH2 영역을 포함한다. 예시적인 돌연변이된 면역글로불린 CH2 영역은 L234, L235, G237, E318, K320, 및 K322(서열 번호: 50)에서 알라닌 치환을 지닌 마우스 IGHG2c CH2 영역이다.
다른 추가의 양태에서, 297번 위치에서 아미노산 치환 및 234 내지 238번 위치에서 추가의 결실(들) 또는 치환(들) 외에, 본 기재내용의 융합 단백질내 돌연변이된 CH2 영역은 또한 253, 310, 318, 320, 322, 및 331번 위치에서 하나 이상(예를 들면, 2, 3, 4, 5, 또는 6개)의 추가의 치환을 포함할 수 있다. 예를 들면, 면역글로불린 CH2 영역은 (1) 297번 위치에서 치환, (2) 234 내지 238번 위치에서 하나 이상의 치환 또는 결실 또는 이의 조합 및 I253, H310, E318, K320, K322, 및 P331 위치에서 하나 이상(예를 들면, 2, 3, 4, 5, 또는 6개)의 아미노산 치환, 예를 들면, E318, K320 및 K322 위치에서 1, 2, 3개의 치환을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 나타낸 위치에서 아미노산은 알라닌 또는 세린으로 치환된다.
특정 양태에서, 면역글로불린 CH2 영역 폴리펩타이드는 (i) 297번 위치의 아스파라긴에서 아미노산 치환 및 234, 235, 236 또는 237번 위치에서 하나의 아미노산 치환; (ii) 297번 위치의 아스파라긴에서 아미노산 치환 및 234 내지 237번 위치 중 2개에서 아미노산 치환; (iii) 297번 위치의 아스파라긴에서 아미노산 치환 및 234 내지 237번 위치 중 3개에서 아미노산 치환; (iv) 297번 위치의 아스파라긴에서 아미노산 치환 및 234, 235 및 237번 위치에서 아미노산 치환, 및 236번 위치에서 아미노산 결실; (v) 234 내지 237번 위치 중 3개에서 아미노산 치환 및 318, 320 및 322번 위치에서 아미노산 치환; 또는 (vi) 234 내지 237번 위치 중 3개에서 아미노산 치환, 236번 위치에서 아미노산 결실, 및 318, 320 및 322번 위치에서 아미노산 치환을 포함한다.
본 발명의 기재내용의 융합 단백질내 297번 위치의 아스파라긴에서 아미노산 치환을 가진 예시적인 돌연변이된 면역글로불린 CH2 영역은 L234, L235, G237 및 N297에서 알라닌 치환 및 G236에서 결실을 가진 인간 IgG1 CH2 영역(서열 번호: 103), V234, G236, 및 N297에서 알라닌 치환을 가진 인간 IgG2 CH2 영역(서열 번호: 104), F234, L235, G237 및 N297에서 알라닌 치환 및 G236의 결실을 가진 인간 IgG4 CH2 영역(서열 번호: 75), F234 및 N297에서 알라닌 치환을 가진 인간 IgG4 CH2 영역(서열 번호: 375), L235 및 N297에서 알라닌 치환을 가진 인간 IgG4 CH2 영역(서열 번호: 376), G236 및 N297에서 알라닌 치환을 가진 인간 IgG4 CH2 영역(서열 번호: 377), 및 G237 및 N297에서 알라닌 치환을 가진 인간 IgG4 CH2 영역(서열 번호: 378)을 포함한다.
특정 양태에서, 위에서 기술한 아미노산 치환 외에도, 본 기재내용의 융합 단백질내 돌연변이된 CH2 영역은 위에 나타낸 위치 이외의 하나 이상의 위치에서 하나 이상의 추가의 아미노산 치환을 함유할 수 있다. 이러한 아미노산 치환은 보존적 또는 비-보존적 아미노산 치환일 수 있다. 예를 들면, 특정 양태에서, P233은 돌연변이된 IgG2 CH2 영역(참조: 예를 들면, 서열 번호: 104)에서 E233으로 치환될 수 있다. 추가로 또는 대안으로, 특정 양태에서, 본 기재내용의 융합 단백질내 돌연변이된 CH2 영역은 하나 이상의 아미노산 삽입, 결실, 또는 둘다를 함유할 수 있다. 삽입(들), 결실(들) 또는 치환(들)은 CH2 영역을 링커를 통해 다른 영역(예를 들면, 가변 영역)과 연결시키는 것으로부터 수득되는 야생형 면역글로불린 CH2 영역의 N- 또는 C-말단에서와 같은 면역글로불린 CH2 영역내 어느 곳일 수 있다.
특정 양태에서, 본 기재내용의 융합 단백질의 돌연변이된 CH2 영역은 야생형 인간 IgG1, IgG2, 또는 IgG4, 또는 마우스 IgG2a(예를 들면, IGHG2c)와 같은 야생형 면역글로불린 CH2 영역에 대해 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 동일한 서열을 포함하거나, 이러한 서열이다.
본 기재내용의 융합 단백질의 돌연변이된 면역글로불린 CH2 영역은 다양한 종(인간, 마우스, 랫트, 및 기타 포유동물 포함)으로부터 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, 및 IgD와 같은 각종 면역글로불린 동형의 CH2 영역으로부터 유래할 수 있다. 특정의 바람직한 양태에서, 본 기재내용의 융합 단백질의 돌연변이된 면역글로불린 CH2 영역은 인간 IgG1, IgG2 또는 IgG4, 또는 마우스 IgG2a(예를 들면, IGHG2c)의 CH2 영역으로부터 유래할 수 있으며, 이의 서열은 서열 번호: 64, 66, 68 및 73으로 서술되어 있다.
Fc 수용체(CD16, CD32, CD64, CD89, FcεR1, FcRn)과 또는 상보체 성분 C1q와의 Fc 상호작용을 변경시킬 수 있는 Fc 도메인 내부 또는 외부에 돌연변이를 제조하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다[참조: 미국 특허 제5,624,821호; Presta (2002) Curr. Pharma. Biotechnol. 3:237].
특정 양태에서, 본 기재내용의 융합 단백질은 어떠한 면역글로불린 CH2 영역도 포함하지 않는다.
면역글로불린 C H3 영역 폴리펩타이드
본원에 기술된 바와 같이, 본 기재내용의 융합 단백질은 하나 이상의 면역글로불린 CH3 영역 폴리펩타이드를 포함한다. 특정 양태에서, 본 기재내용의 융합 단백질은 어떠한 CH2 영역도 함유하지 않는다. 이러한 양태에서, TCR 복합체 또는 이의 성분에 특이적으로 결합하는 결합 도메인은 면역글로불린 CH3 영역에 링커(예를 들면, 힌지) 폴리펩타이드를 통해 직접 연결된다. CH2 영역이 부재하는 특정 양태에서, 본 기재내용의 융합 단백질은 단지 하나의 CH3 영역을 포함할 수 있다. 대안적인 양태는 2개의 CH3 영역을 포함하고 CH2 영역을 포함하지 않는 본 기재내용의 융합 단백질을 포함한다.
융합 단백질이 돌연변이된 면역글로불린 CH2 영역 및 면역글로불린 CH3 영역 둘다를 포함하는 양태에서, CH2 및 CH3 영역은 동일하거나 상이한 면역글로불린, 항체 동형, 또는 대립형질 변이체로부터 기원할 수 있다. 바람직하게는, CH2 영역은 CH3 영역의 아미노-말단에 직접 연결된다. CH3 영역의 아미노 말단에 직접 연결된 CH2 영역을 포함하는 예시적인 서열은 서열 번호: 11 내지 14 및 101로 서술되어 있다. 이와는 달리, CH2 영역은 CH3 영역에 하나 이상의 아미노산을 통해 또는 링커(참조: 예를 들면, 서열 목록에 설정된 링커)를 통해 연결될 수 있다.
특정 양태에서, 본 기재내용의 융합 단백질은 2개의 면역글로불린 CH3 영역을 포함할 수 있다. 이들 CH3 영역은 야생형 또는 동일한 면역글로불린 동형으로부터의 돌연변이된 CH3 영역이거나, 상이한 면역글로불린 동형으로부터 기원할 수 있다. 예를 들면, 특정 양태에서, 융합 단백질은 인간 IgM의 CH3 영역 및 인간 IgG1의 CH3 영역을 포함한다. 인간 IgM의 CH3 영역 및 인간 IgG1의 CH3 영역이 함께 연결되어 있는 예시적인 서열은 서열 번호: 15 및 74를 포함한다. 특정의 다른 양태에서, 융합 단백질은 마우스 CH3μ 영역 및 마우스 CH3γ 영역을 포함한다. 마우스 CH3μ 영역 및 마우스 CH3γ 영역이 함께 연결된 예시적인 서열은 서열 번호: 308 및 309를 포함한다.
융합 단백질이 2개의 면역글로불린 CH3 영역을 포함하는 양태에서, 다른 CH3 영역에 대해 아미노 말단에 위치한 CH3 영역은 "제1 CH3 영역"으로 언급된다. 다른 CH3 영역은 "제2 CH3 영역"으로 언급된다. 이러한 양태에서, 2개의 면역글로불린 CH3 영역은 서로 직접 융합될 수 있다. 다시 말해서, 제1 CH3 영역의 C-말단은 제2 CH3 영역의 아미노-말단에 이들 사이의 어떠한 방해하는 아미노산 잔기없이(즉, 링커의 부재하에) 직접 연결된다. 달리는, 2개의 CH3 영역은 하나 이상(예를 들면, 2 내지 8개)의 아미노산을 통해 또는 링커(참조: 예를 들면, 서열 목록에 설정된 링커)를 통해 연결될 수 있다.
특정 양태에서, 본 기재내용의 융합 단백질내 면역글로불린 CH3 영역은 하나 이상(예를 들면, 2 내지 8개)의 추가의 아미노산 치환을 함유할 수 있다. 이러한 아미노산 치환은 보존적이거나 비-보존적일 수 있다. 추가로 또는 대안으로, 특정 양태에서, 본 기재내용의 융합 단백질내 CH3 영역은 상이한 위치에서 하나 이상(예를 들면, 2 내지 8개)의 아미노산 삽입, 결실, 또는 둘다를 함유할 수 있다. 삽입(들), 결실(들) 또는 치환(들)은 아미노- 또는 카복시-말단 또는 둘다에서를 포함하는 면역글로불린 CH3 영역내 어디에도 존재할 수 있다.
특정 양태에서, 본 기재내용의 융합 단백질내 면역글로불린 CH3 영역은 야생형 인간 IgM, IgG1, IgG2, 또는 IgG4의 CH3 영역과 같은 야생형 면역글로불린 CH3 영역에 대해 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 동일한 서열을 포함하거나 이러한 서열이다.
특정 양태에서, 면역글로불린 CH3 영역 폴리펩타이드는 다양한 종(즉, 인간, 마우스, 랫트 또는 기타 포유동물)로부터의 다양한 면역글로불린 동형(예를 들면, IgA, IgD, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgE, 또는 IgM)의 야생형 CH3 영역을 포함하는 야생형 면역글로불린 CH3 영역 폴리펩타이드이다. 예를 들면, 면역글로불린 CH3 영역은 야생형 인간 IgG1 CH3 영역(예를 들면, 서열 번호: 65), 야생형 인간 IgG2 CH3 영역(예를 들면, 서열 번호: 67), 야생형 인간 IgG4 CH3 영역(예를 들면, 서열 번호: 69), 야생형 인간 IgM CH3 영역(예를 들면, 서열 번호: 71), 마우스 CH3μ 영역(예를 들면, 서열 번호: 329) 또는 야생형 마우스 IGHG2c CH3 영역(예를 들면, 서열 번호: 54)일 수 있다. 추가의 양태에서, 면역글로불린 CH3 영역 폴리펩타이드는 돌연변이된 면역글로불린 CH3 영역 폴리펩타이드이다. 면역글로불린 CH3 영역내 돌연변이는 H433 또는 N434와 같은 상보체 고정에 포함된 하나 이상의 위치에 존재할 수 있다.
추가의 서열 및 변형
본원에 기술된 바와 같이, 본 기재내용의 일본쇄 융합 단백질은 아미노-말단으로부터 카복시-말단까지: (a) CD3(예를 들면, CD3ε)에 특이적으로 결합하는 결합 도메인, (b) 링커 폴리펩타이드, (c) 임의로 면역글로불린 CH2 영역 폴리펩타이드, 및 (d) 면역글로불린 CH3 영역 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 또한, 본 기재내용의 융합 단백질은 융합 단백질의 발현을 위한 이의 아미노-말단에서 리더 서열과 같은 하나 이상의 추가의 영역, 추가의 Fc sub-영역(예를 들면, IgM 또는 IgE의 야생형 또는 돌연변이된 CH4 영역), 또는 확인 또는 정제 목적을 위한 이의 카복시-말단에서 테일 서열을 포함할 수 있다. 예시적인 테일 서열은 6-히스티딘 영역 또는 FLAG 에피토프와 같은, 검출 또는 정제용 에피토프 태그를 포함할 수 있다.
예를 들면, 융합 단백질은 특수 발현 시스템의 사용으로부터 기원한 추가의 아미노산 잔기를 가질 수 있다. 예를 들어, 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST) 융합 생성물의 일부로서 목적하는 폴리펩타이드를 발견하는 시판되는 벡터의 사용은 바람직한 폴리펩타이드로부터 GST 성분의 분해 후 1 위치에서 추가의 글리신 잔기를 갖는 바람직한 폴리펩타이드를 제공한다. 히스티딘 태그가 일반적으로 서열의 카복시 및/또는 아미노 말단에서 아미노산 서열내로 혼입된 것들을 포함하는 다른 벡터 시스템에서의 발현으로부터 수득된 변이체가 또한 고려된다. 융합 단백질의 카복시- 또는 아미노-말단에 존재할 수 있는 예시적인 추가의 단백질은 FLAG 에피토프의 3개의 카피, AVI 태그의 하나의 카피, 및 서열 번호: 70로 서술된 것으로서 6개의 히스티딘을 포함한다.
특정 양태에서, 본 기재내용의 융합 단백질은 이의 N-말단에서 리더 펩타이드를 포함하다. 리더 펩타이드는 발현된 융합 단백질의 분비를 촉진시킨다. 통상적인 리더 펩타이드(시그날 서열) 중의 어느 하나를 사용하는 것은 초기 발현된 폴리펩타이드 또는 융합 단백질을 분비 경로로 지향시키고 리더 펩타이드와 융합 단백질 사이의 접합부에서 또는 근처에서 성숙한 융합 단백질로부터의 리더 펩타이드의 분열을 일으키는 것으로 예측된다. 특별한 리더 펩타이드는 분자 조작을 촉진시키기 위한 리더 펩타이드에 대한 서열을 암호화하는 초기 또는 말기에 제한 엔도뉴클레아제 분열 부위의 용이한 포함을 허용하는 핵산 분자에 의해 암호화된 서열을 사용하는 것과 같은, 당해 분야에 공지된 고려사항을 기준으로 하여 선택될 것이며, 단, 이러한 도입된 서열은 초기 발현된 단백질로부터의 리더 펩타이드의 어떠한 바람직한 프로세싱을 허용하지않게 방해하지 않거나, 리더 펩타이드가 폴리펩타이드 또는 융합 단백질의 성숙 동안 분해되지 않는 경우, 폴리펩타이드 또는 융합 단백질의 어떠한 바람직한 기능도 허용가능하지 않게 방해하지 않는다. 본 기내내용의 예시적인 리더 펩타이드는 천연 리더 서열 또는 H3N-MDFQVQIFSFLLISASVIMSRG-CO2H (서열 번호: 9)와 같은 다른 것을 포함한다 .
특정 양태에서, 본 기재내용의 융합 단백질은 글리코실화되어 있으며, 여기서, 글리코실화 패턴은, 단백질이 발현되는(재조합체 숙주 세포내에서 제조되는 경우) 숙주 세포를 포함하는 다양한 인자 및, 배양 조건에 의존한다.
추가의 양태에서, 본 기재내용의 융합 단백질의 면역글로불린 CH2 또는 CH3 영역은 면역글로불린 참조 서열의 CH2 또는 CH3 영역에 대해 변경된 글리코실화 패턴을 가질 수 있다. 예를 들면, 다양한 유전학적 기술 중 어느 것을 사용하여 글리코실화 부위를 형성하는 하나 이상의 특수 아미노산 잔기를 변경시킬 수 있다[Co et al. (1993) Mol. Immunol. 30:1361; Jacquemon et al. (2006) J. Thromb. Haemost. 4:1047; Schuster et al. (2005) Cancer Res. 65:7934; Warnock et al. (2005) Biotechnol. Bioeng. 92:831]. 이와는 달리, 본 기재내용의 융합 단백질이 생산되는 숙주 세포를 가공하여 변경된 글리코실화 패턴을 생산할 수 있다.
특정 양태에서, 본 기재내용은 또한 본원에 기술된 융합 단백질의 유도체를 제공한다. 유도체는 아미노산 잔기의 삽입, 결실, 또는 치환 외에 변형을 지닌 융합 단백질을 포함한다. 바람직하게는, 변형은 천연적으로 공유결합성이며, 예를 들면, 중합체, 지질, 다른 유기 및 무기 잔기와의 화학적 결합을 포함한다. 본 기재내용의 유도체는 특정 융합 단백질의 순환하는 반감기를 증가시키기 위해 제조하거나, 바람직한 세포, 조직, 또는 기관에 대해 융합 단백질을 표적화하는 능력을 증진시키기 위해 설계할 수 있다.
특정 양태에서, 본 기재내용의 융합 단백질의 생체내 반감기는 거대 분자의 반감기를 증가시키기 위해 당해 분야에 공지된 방법을 사용하여 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 본 기재내용은 폴리에틸렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌 글리콜, 또는 폴리프로필렌 글리콜과 같은 하나 이상의 수용성 중합체 부착을 포함하도록 공유결합적으로 변형되거나 유도체화된 융합 단백질을 포함한다(예를 들면, 미국 특허 제4,640,835호; 제4,496,689호; 제4,301,144호; 제4,670,417호; 제4,791,192호; 제4,179,337호). 당해 분야에 공지된 여전히 다른 유용한 중합체는 모노메톡시-폴리에틸렌 글리콜, 덱스트란, 셀룰로오즈, 및 기타 탄수화물-계 중합체, 폴리-(N-비닐 피롤리돈)-폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 단독중합체, 폴리프로필렌 옥사이드/에틸렌 옥사이드 공-중합체, 폴리옥시에틸화된 폴리올(예를 들면, 글리세롤) 및 폴리비닐 알코올, 및 이들 중합체의 혼합물을 포함한다. 폴리에틸렌 글리콜(PEG)유도체화된 단백질이 특히 바람직하다. 수용성 중합체는 특수 위치, 예를 들면, 본 기재내용에 따른 융합 단백질의 아미노 말단에서 결합될 수 있거나, 폴리펩타이드의 하나 이상의 측쇄에 무작위적으로 부착될 수 있다. 치료학적 능력을 개선시키기 위한 PEG의 사용은 미국 특허 제6,133,426호에 기술되어 있다.
일부 양태에서, 본 기재내용에 따른 융합 단백질은 아미노-말단적으로 분포된 면역글로불린 힌지 영역을 추가로 함유한다. 아미노-말단 힌지 영역은 면역글로불린 CH3 영역과 결합 도메인 사이에서 발견된 링커와 동일하거나 상이할 수 있다. 일부 양태에서, 아미노-말단적으로 부착된 링커는 천연적으로 존재하거나 가해진 모티프(예를 들면, CPPC, 서열 번호: 330)를 포함함으로써 이량체화되거나 다량체화된 분자의 아미노-말단을 안정화시키기 위한 적어도 하나의 이황화물 결합의 형성을 촉진한다.
융합 단백질의 제조 및 정제 방법
본 기재내용의 융합 단백질은 당해 분야에 공지된 방법에 따라 제조할 수 있다. 예를 들어, SMIP 융합 단백질을 제조하는 방법은 미국 특허 출원 공개 제2003/0133939호, 제2003/0118592호 및 제2005/0136049호에 기술되어 있고, PIMS 단백질을 제조하는 방법은 예를 들면, PCT 출원 공보 WO 2009/023386호에 기술되어 있다.
특정 양태에서, 본 기재내용은 본원에 기술된 바와 같은 정제된 융합 단백질을 제공한다. 본원에 사용된 것으로서, 용어 "정제된"은 다른 성분들로부터 분리가능한 조성물을 말하며, 여기서, 융합 단백질은 이의 천연적으로 수득가능한 상태에 대해 특정 정도로 정제된다. 따라서, "정제된 단백질"은 또한 이것이 천연적으로 존재하는 환경으로부터 분리된 이러한 단백질을 말한다. 특정 양태에서, 본 기재내용은 본원에 기술된 바와 같은 실질적으로 정제된 융합 단백질을 제공한다. "실질적으로 정제된"은, 단백질이 조성물의 주성분을 형성하며, 예를 들어 조성물 중 적어도 약 50 중량%, 예를 들어 중량당 적어도 약 60중량%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95%, 약 99%의 단백질을 구성하는 단백질 조성물을 말한다.
단백질 정제 기술은 당해 분야의 숙련가에게 잘 공지되어 있다. 이들 기술은 하나의 수준에서 폴리펩타이드 및 비-폴리펩타이드 분획의 조 분획화(crude fractionation)를 포함한다. 부분 또는 완전한 정제(또는 상동성에 대한 정제)를 달성하기 위한 크로마토그래피 또는 전기영동 기술을 사용한 추가의 정제가 흔히 바람직하다. 순수한 융합 단백질의 제조에 특히 적합한 분석 방법은 이온 교환 크로마토그래피, 배제 크로마토그래피; 폴리아크릴아미드 겔 전기영동; 및 등전 포커싱(isoelectric focusing)이다. 펩타이드를 정제하는 특히 효율적인 방법은 신속한 단백질 액체 크로마토그래피 및 HPLC이다.
정제도를 정량화하기 위한 각종 방법이 본 기재내용의 측면에서 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있다. 이들은 예를 들면, 활성 분획의 특수 결합 활성의 측정, 또는 SDS/PAGE 분석에 의한 분획내 단백질의 양의 평가를 포함한다. 단백질 분획의 순도를 평가하는 바람직한 방법은 분획의 결합 활성을 계산하고, 이를 초기 추출물의 결합 활성과 비교함으로써, 본원에서 "-배 정제 수"로 평가된, 정제도(degree of purification)를 계산하는 것이다. 물론, 결합 활성의 양을 나타내기 위해 사용된 실제 단위는 정제를 수행하기 위해 선택된 특수 검정 기술 및, 발현된 단백질이 검출가능한 결합 활성을 나타내는지의 여부에 의존할 것이다.
예시적인 융합 단백질
본 기재내용의 예시적인 일본쇄 융합 단백질은 서열 번호: 80 내지 85, 88 내지 93, 96 및 97로 각각 나타낸 것으로서 BC3 IgG1 N297, BC3 IgG1AA, BC3 IgG2AA, BC3 IgG4AA, BC3 HM1, BC3 △CH2, OKT3 IgG1AA, OKT3 IgG2AA, OKT3 IgG4AA, OKT3 HM1, OKT3 △CH2, H57 null2, 및 2C11 null2를 포함한다. 본 기재내용의 예시적인 바람직한 일본쇄 융합 단백질은 각각 서열 번호: 265 내지 299로 나타낸 것으로서, 키메라 Cris-7 IgG1AA, 키메라 Cris-7 IgG2AA, 키메라 Cris-7 IgG4AA, 키메라 Cris-7 HM1, 인간화된 Cris-7 IgG1AA, 인간화된 Cris-7 IgG2AA, 인간화된 Cris-7 IgG4AA, 및 인간화된 Cris-7 HM1을 포함한다. 추가의 예시적인 일본쇄 융합 단백질은 각각 서열 번호: 86, 87, 94, 및 95로 나타낸 것으로서, 이들의 카복시-말단 태그가 없는 BC3 HM1, BC3 △CH2, OKT3 HM1, 및 OKT3 △CH2를 포함한다. 추가의 예시적인 융합 단백질은 서열 번호: 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 47, 56, 76-79, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 247, 249, 251, 253, 255, 및 257로 나타낸 것으로서 아미노-말단에서 이들의 리더 서열을 갖는 위에서 나타낸 융합 단백질을 포함한다. 아미노-말단에서 이들의 리더 서열을 갖는 추가의 예시적인 융합 단백질은 H57 half null(서열 번호: 304) 및 H57 HM2(서열 번호: 306)을 포함한다. 추가의 예시적인 융합 단백질은 서열 번호: 311, 313, 315, 317, 319, 321, 323, 325 및 327로 나타낸 것으로서 각종 링커 서열을 갖는 BC3 IgG1 N297이다. 이들 예시적인 일본쇄 융합 단백질 중 일부는 하기 실시예 단락에 상세히 기술되어 있다.
기능적 특징
본원에 기술된 바와 같이, 본 기재내용의 일본쇄 융합 단백질은, 다음과 같은 특징 또는 기능적 특징들 중의 하나 이상(예를 들면, 2, 3, 4, 5, 6, 7개), 또는 이의 특정 조합을 가질 수 있다: (1) T　세포를 활성화시키지 않음, (2) 최소 사이토킨 방출을 유도하지 않거나 유도함, (3) TCR 시그날링 경로에서 분자의 인산화를 유도함, (4) 상응하는 모노클로날 항체보다 칼슘 유동을 더 증가시킴, (5) 동종항원에 대한 T　세포 반응을 차단함, (6) 항원에 대한 기억 T 세포 반응을 차단함, 및 (7) TCR 복합체를 하향조절함.
특정의 바람직한 양태에서, 본 기재내용의 일본쇄 융합 단백질은 T 세포를 활성화시키지 않거나 최소로 활성화시킨다. 융합 단백질은 T 세포(예를 들면, PHA- 또는 ConA-프라임된 T 세포)를 치료하는데 사용되는 경우, "T 세포를 활성화시키지 않거나 최소로 또는 명목상으로 활성화시키며", 융합 단백질은 본 기재내용의 실시예에서 제공한 적어도 하나의 시험관내 또는 생체내 검정에서 처리되지 않은 세포와 비교하여 활성화된 T 세포의 비율에 있어 통계학적으로 상당한 증가를 유발하지 않는다. 바람직하게는, T 세포 활성화는 실시예 1에 기술된 시험관내 프라임된 T 세포 활성화 검정에서 측정된다.
추가의 바람직한 양태에서, 본 기재내용의 융합 단백질은 사이토킨 스톰을 유도하지 않거나 임상적으로 관련된 사이토킨 방출을 유도하지 않는다. "사이토킨 스톰을 유도하지 않는"(또한 "검출가능하지 않거나, 명목상이거나 최소의 사이토킨 방출을 유도하는" 또는 "최소로 검출가능한 사이토킨 방출을 유도하지 않거나 유도하는"으로 언급됨) 융합 단백질은, T 세포를 치료하는데 사용되는 경우, 당해 분야에 공지되거나 본 기재내용의 실시예에서 제공된 적어도 하나의 시험관내 또는 생체내 검정에서 비 치료와 비교된 것으로서 치료된 세포로부터 방출된 IFNγ를 포함하는 적어도 하나의 사이토킨의 양; 바람직하게는 IFNγ 및 TNFα 또는 IL-6 및 TNFα를 포함하는 적어도 2개의 사이토킨; 바람직하게는 IL-6, IFNγ 및 TNFα를 포함하는 3개의 사이토킨; 바람직하게는 IL-2, IL-6, IFNγ 및 TNFα를 포함하는 4개의 사이토킨; 및 바람직하게는 IL-2, IL-6, IL-10, IFNγ 및 TNFα를 포함하는 적어도 5개의 사이토킨의 양에 있어 통계학적으로 상당한 증가를 유발하지 않는다. 바람직하게는 사이토킨 스톰은 실시예 1에 기술된 프라임된 T 세포에 의한 시험관내 사이토킨 방출에서 측정된다. 임상적으로, 사이토킨 방출 증후군은 IFNγ, 및 또한 IL-2, IL-6, 및 TNFα와 같은 특정 사이토킨의 최대 방출과 동시에 존재하는 열, 오한, 발진, 오심, 및 때때로 호흡곤란 및 빈맥에 의해 특징화된다. 시험관내 검정 또는 생체내에서 방출에 대해 시험될 수 있는 사이토킨은 G-CSF, GM-CSF, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-13, IL-17, IP-10, KC, MCP1, IFNγ 및 TNFα를 포함하며; 보다 바람직하게는 IL-2, IL-6, IL-10, IFNγ 및 TNFα를 포함한다.
추가의 바람직한 양태에서, 본 기재내용의 융합 단백질은 T 세포와 같은 세포내에서 칼슘 유동에 있어서의 증가를 유발한다. 융합 단백질은 T 세포를 치료하는데 사용되는 경우 "칼슘에 있어서의 증가"를 유발하며, 이는 통계학적으로 상당하고, 당해 분야에 공지되거나 본원에 제공된 시험관내 검정에서 상응하는 항체(즉, 본 기재내용의 일본쇄 융합 단백질과 동일한 결합 도메인을 가진 항체)로 치료된 세포와 비교하여, 치료된 세포의 칼슘 유동에 있어서 신속한 증가(바람직하게는, 치료의 300 초 이내, 보다 바람직하게는 치료의 200 초 이내, 및 가장 바람직하게는 치료의 100 초 이내)를 유발한다. 바람직하게는, 본 기재내용의 일본쇄 융합 단백질에 의해 유발된 칼슘 유동은 실시예 5에 기술된 시험관내 칼슘 유동 검정에서 상응하는 항체에 의해 유발된 유동과 비교되거나 치료중 적어도 처음 100 내지 300초 내에서 측정된다.
추가의 양태에서, 본 기재내용의 일본쇄 융합 단백질은 TCR 시그날 형질도입 경로에서 분자의 인산화를 유도한다. "TCR 시그날 형질도입 경로"는 TCR 및 이의 공-수용체(CD4 또는 CD8)에 대한 펩타이드:MHC 리간드의 결합을 통해 개시된 시그날 형질도입 경로를 말한다. "TCR 시그날 형질도입 경로에서 분자"는, 이의 인산화 상태(예를 들면, 분자가 인산화되는지의 여부), 다른 분자에 대한 이의 결합 친화성, 또는 이의 효소 활성이 펩타이드:MHC 리간드의 TCR 및 이의 공-수용체에 대한 결합으로부터의 시그날에 대한 반응에서 변화된 분자와 같은, TCR 시그날 형질도입 경로에 직접적으로 관여된 분자를 말한다. TCR 시그날 형질도입 경로에서 예시적인 분자는 TCR 복합체 또는 이의 성분(예를 들면, CD3ζ 쇄), ZAP-70, Fyn, Lck, 포스포리파제 C-γ, 단백질 키나제 C, 전사 인자 NFκB, 포스파타제 칼시네우린, 전사 인자 NFAT, 구아닌 뉴클레오타이드 교환 인자(GEF), Ras, MAP 키나제 키나제 키나제(MAPKKK), MAP 키나제 키나제(MAPKK), MAP 키나제(ERK1/2), 및 Fos를 포함한다.
본 기재내용의 일본쇄 융합 단백질은 "TCR 시그날 형질도입 경로에서 분자의 인산화를 유도하며", T 세포를 치료하는데 사용되는 경우, 이는 본 기재내용의 실시예에서 기술된 바와 같은 시험관내 또는 생체내 검정 또는 당해 분야에 공지된 수용체 시그날링 검정에서 TCR 시그날 형질도입 경로(예를 들면, CD3ζ 쇄, ZAP-70, 및 ERK1/2)에서 분자의 인산화에 있어 통계적학으로 상당한 증가를 유발한다. 당해 분야에 공지된 대부분의 수용체 시그날링 검정으로부터의 결과는 웨스턴 블롯 또는 형광 현미경과 같은 면역조직화학 방법을 사용하여 측정한다.
추가의 양태에서, 본 기재내용의 일본쇄 융합 단백질은 동종항원에 대한 T 세포 반응을 차단할 수 있다. "동종항원"은 종에서 대안의(대립형질) 형태로 존재함으로써 형태가 동종항원을 결여한 종의 다른 구성원으로 이전되는 경우 면역반응을 유도하는 항원이다. 예시적인 동종항원은 예를 들면, 혈액 세포(즉, 혈액 그룹 항원) 또는 조직 이식편(즉, 동종이식편)에서 찾을 수 있다.
본 기재내용의 일본쇄 융합 단백질은 "동종항원에 대한 T 세포 반응을 차단하며", T 세포를 치료하는데 사용되는 경우, 이는 본 기재내용의 실시예에서 제공된 급성 이식편 대 숙주 병(aGVHD) 모델 및 인간 혼합된 림프세포 반응(MLR) 검정과 같은, 시험관내 또는 생체내 검정에서 동종항원에 대한 반응시 활성화된 T 세포의 비율에 있어서 통계학적으로 상당한 감소를 유발한다. 지연된 유형의 과민성 반응을 검출하는, 마우스내 발바닥 팽윤 검정과 같은, 결합 검정 및 피부 시험과 같이 당해 분야에 공지된 다른 검정을 또한 사용하여 동종항원에 대한 반응성을 측정할 수 있다.
추가의 양태에서, 본 기재내용의 융합 단백질은 항원에 대한 기억 T 세포 반응을 차단한다. 일본쇄 융합 단백질은 기억 T 세포를 치료하는데 사용되는 경우 "항원에 대한 기억 T 세포 반응을 차단하며", 이는 본 기재내용의 실시예에서 제공된 테타누스 독소를 사용하여 기억 T 세포 활성화를 분석하는 검정과 같은 심험관내 또는 생체내 검정에서 특이적인 항원(예: 테타누스 독소)에 대한 반응시 활성화된 T 세포의 비율에 있어 통계학적으로 현저한 감소를 유발한다. 동물 면역화 모델을 또한 사용하여 항원 제시 검정을 통해 생체내 및 생체외 둘다에서 제2 항원-특이적인 T 세포 반응을 검출할 수 있다. 위에서 기술된 지연된 유형의 과민성 검정 외에, 51Cr-방출 검정과 같은 세포독성 검정을 이용하여 T 세포 활성을 검출할 수 있다[Lavie et al., (2000) International Immunology 12(4):479-486].
추가의 양태에서, 본 기재내용의 융합 단백질은 T 세포의 표면으로부터 TCR 복합체를 하향조절한다. 일본쇄 융합 단백질은, T 세포를 치료하는데 사용되는 경우, "TCR 복합체를 하향조절하며", 이는 시험관내 또는 생체내 검정에서 T 세포 집단의 표면상의 다수의 TCR 복합체에 있어서 통계학적으로 상당한 감소를 유발한다. 유용한 시험관내 또는 생체내 검정은 본 기재내용의 실시예에서 제공된 T 세포 표면으로부터 TCR 및 CD3 하향조절을 평가하기 위한 검정을 포함한다. 이러한 검정은 유동 세포측정법 및 면역형광현미경검사법과 같이, 당해 분야에 공지된 기술에 의해 측정된 것으로서 자극 전 및 후에 세포 표면 발현된 TCR 또는 CD3의 양을 비교한다.
T 세포 활성화 또는 사이토킨 방출의 검출 방법
관련된 국면에서, 본 기재내용은 (a) 유사분열촉진제-프라임된 T 세포를 제공하는 단계, (b) 단계 (a)의 프라임된 T 세포를 TCR 복합체 또는 이의 성분에 특이적으로 결합하는 결합 도메인을 포함하는 단백질로 처리하는 단계, 및 (c) 단계 (b)에서 처리된 프라임된 T 세포의 활성화를 검출하는 단계를 포함하여, TCR 복합체 또는 이의 성분에 특이적으로 결합하는 결합 도메인을 포함하는 단백질에 의해 유도된 T 세포 활성화를 검출하는 방법을 제공한다.
본원에 사용된 것으로서 용어 "유사분열촉진제"는 상이한 특수성 또는 클론 기원의 림프세포에서 유사분열을 유도하는 화학 물질을 말한다. T 세포를 프라임하는데 사용될 수 있는 예시적인 유사분열촉진제는 피토해마글루티닌(PHA), 콘카나발린 A(ConA), 리포폴리사카라이드(LPS), 포크위드(pokeweed) 유사분열촉진제(PWM), 및 포르볼 미리스테이트 아세테이트(PMA)를 포함한다.
본원에 제공된 T 세포 활성화를 검출하기 위한 방법의 특정 양태에서, TCR 복합체 또는 이의 성분에 특이적으로 결합하는 결합 도메인을 포함하는 단백질은 본원에 제공된 융합 단백질이다. 특정의 다른 양태에서, TCR 복합체 또는 이의 성분에 특이적으로 결합하는 결합 도메인을 포함하는 단백질은 모노클로날 항체이다.
T 세포 활성화는 CD25, CD40 리간드, 및 CD69와 같이, 당해 분야에 공지된 활성화 마커의 발현을 측정함으로써 검출할 수 있다. 활성화된 T 세포는 또한 CFSE 표지화 및 티미딘 흡수 검정과 같은 세포 증식 검정으로 검출할 수 있다[Adams (1969) Exp. Cell Res. 56:55].
관련된 국면에서, 본 기재내용은 (a) 유사분열촉진제-프라임된 T 세포를 제공하는 단계, (b) 단계 (a)의 프라임된 T 세포를 TCR 복합체 또는 이의 성분에 특이적으로 결합하는 결합 도메인을 포함하는 단백질로 처리하는 단계, 및 (c) 단계 (b)에서 처리된 프라임된 T 세포로부터 사이토킨의 방출을 검출하는 단계를 포함하여, TCR 복합체 또는 이의 성분에 특이적으로 결합하는 결합 도메인을 포함하는 단백질에 의해 유도된 사이토킨 방출을 검출하는 방법을 제공한다.
본원에서 제공된 사이토킨 방출을 검출하는 방법의 특정 양태에서, TCR 복합체 또는 이의 성분에 특이적으로 결합하는 결합 도메인을 포함하는 단백질은 본원에서 제공된 융합 단백질이다. 특정의 다른 양태에서, TCR 복합체 또는 이의 성분에 특이적으로 결합하는 결합 도메인을 포함하는 단백질은 모노클로날 항체이다.
폴리뉴클레오타이드, 발현 벡터 및 숙주 세포
본 기재내용은 본 기재내용의 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드(분리되거나 정제되거나 또는 순수한 폴리뉴클레오타이드), 이러한 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터(클로닝 벡터 및 발현 벡터 포함), 및 본 기재내용에 따른 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터로 형질전환되거나 형질감염된 세포(예를 들면, 숙주 세포)를 제공한다.
특정 양태에서, 본 기재내용의 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 (DNA 또는 RNA)가 고려된다. 예시적인 폴리뉴클레오타이드는 서열 번호: 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 46, 55, 303, 306, 310, 312, 314, 316, 318, 320, 322, 324 및 326을 포함한다.
본 발명은 또한 본 기재내용의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터 및 특히, 재조합체 발현 작제물에 관한 것이다. 하나의 양태에서, 본 기재내용은 본 기재내용의 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드와 함께, 융합 단백질의 전사, 해독 및 프로세싱을 유발하거나 촉진할 수 있는 다른 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터를 고려한다.
원핵 및 진핵 숙주와 함께 사용하기 위한 적절한 클로닝 및 발현 벡터는 예를 들면, 문헌[Sambrook et al., Molecular 클로닝: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, NY, (1989)]에 기술되어 있다. 예시적인 클로닝/발현 벡터는 클로닝 벡터, 셔틀 벡터, 및 플라스미드, 파지미드, 파스미드, 코스미드, 바이러스, 인공 염색체 또는 이에 함유된 폴리뉴클레오타이드의 증폭, 전달 및/또는 발현에 적합한 당해 분야에 공지된 특정의 핵산 비히클를 기초로 할 수 있는 발현 작제물을 포함한다.
본원에 사용된 것으로서 "벡터"는 연결되어 있는 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 의미한다. 예시적인 벡터는 플라스미드, 효모 인공 염색체 및 바이러스 게놈을 포함한다. 특정 벡터는 숙주 세포내에서 자발적으로 복제할 수 있지만, 다른 벡터는 숙주 세포의 게놈내로 통합됨으로써 숙주 게놈과 함께 복제될 수 있다. 또한, 특정의 벡터는 본원에서 "재조합체 발현 벡터"(또는 단순히, "발현 벡터")로 언급되며, 이는 발현 조절 서열에 작동적으로 연결됨으로써 이들 서열의 발현을 지시할 수 있는 핵산 서열을 함유한다.
특정 양태에서, 발현 작제물은 플라스미드 벡터로부터 기원한다. 예시적인 작제물은 암피실린 내성 유전자, 폴리아데닐화 시그날 및 T7 프로모터 부위를 암호화하는 핵산 서열을 갖는 변형된 pNASS 벡터[제조원: 클론테크(Clontech), 캘리포니아 팔로 알토, 캐나다]; CHEF1 프로모터를 갖는 pDEF38 및 pNEF38[제조원: 씨엠씨 이코스 바이올로직스, 인코포레이티드(CMC ICOS Biologics, Inc.)] 프로모터; 및 CMV 프로모터를 갖는 pEE12.4[제조원: 론자(Lonza)]를 포함한다. 다른 적합한 포유동물 발현 벡터는 잘 공지되어 있다(예를 들면, Ausubel et al., 1995; Sambrook et al., 상기 참조; 또한, 참조: 예를 들면, catalogs from Invitrogen, S Diego, CA; Novagen, Madison, WI; Pharmacia, Piscataway, NJ). 적절한 선택제(예를 들면, 메토트렉세이트)의 적용에 이어 유전자 증폭으로부터 수득되는, 융합 단백질의 향상된 생산 수준을 증진시키기 위한, 적합한 조절 대조군하에 디하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR)-암호화 서열을 포함하는 유용한 작제물을 제조할 수 있다.
일반적으로, 재조합체 발현 벡터는 위에서 기술한 바와 같이, 숙주 세포의 형질전화을 허용하는 복제 오리진 및 선택가능한 마커, 및 하부 구조 서열의 전사를 지시하기 위한 고도로-발현된 유전자로부터 기원한 프로모터를 포함할 것이다. 본 기재내용에 따라 폴리뉴클레오타이드와 작동적으로 연결된 벡터는 클로닝 또는 발현 작제물을 생성한다. 예시적인 클로닝/발현 작제물은 적어도 하나의 발현 대조군 성분, 예를 들면, 본 기재내용의 폴리뉴클레오타이드에 작동적으로 연결된 프로모터를 함유한다. 인핸서(enhancer), 인자-특이적인 결합 부위, 터미네이터 및 리보소옴 결합 부위와 같은 추가의 발현 대조군 성분이 또한 본 기재내용에 따른 벡터 및 클로닝/발현 작제물내에서 고려된다. 본 기재내용에 따른 폴리뉴클레오타이드의 이종 구조 서열은 해독 개시 및 종결 서열과 함께 적절한 상으로 조립된다. 따라서, 예를 들면, 본원에 제공된 바와 같은 융합 단백질-암호화 핵산은 숙주 세포내에서 이러한 단백질을 발현시키기 위한 재조합체 발현 작제물로서 각종 발현 벡터 작제물 중 어느 하나에 포함될 수 있다.
적절한 DNA 서열(들)이 예를 들면, 각종 과정에 의해 벡터내로 삽입될 수 있다. 일반적으로, DNA 서열은 당해 분야에 공지된 과정에 의해 적절한 제한 엔도뉴클레아제 분해 부위(들)내로 삽입된다. 클로닝, DNA 분리, 증폭 및 정제를 위한, DNA 리가제, DNA 폴리머라제, 제한 엔도뉴클레아제 등을 포함하는 효소 반응, 및 각종 불리 기술을 위한 표준 기술이 고려된다. 다수의 표준 기술이 예를 들면, 문헌[예를 들면, Ausubel et al. (1993 Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publ. Assoc. Inc. & John Wiley & Sons, Inc., Boston, MA); Sambrook et al. (1989 Molecular cloning, Second Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, NY); Maniatis et al. (1982) Molecular cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, NY); Glover (Ed.) (1985 DNA cloning Vol. I 및 II, IRL Press, Oxford, UK); Hames and Higgins (Eds.), (1985 Nucleic Acid Hybridization, IRL Press, Oxford, UK 등]에 기술되어 있다.
발현 벡터내 DNA 서열은 적어도 하나의 적절한 발현 조절 서열(예를 들면, 구성적 프로모터 또는 조절된 프로모터)에 작동적으로 연결되어 mRNA 합성을 지시한다. 이러한 발현 조절 서열의 대표적인 예는 위에서 기술한 바와 같은, 진핵 세포 또는 이들의 바이러스의 프로모터를 포함한다. 프로모터 영역은 CAT(클로람페니콜 트랜스퍼라제) 벡터 또는, 선택가능한 마커를 갖는 다른 벡터 중에서 선택될 수 있다. 진핵세포 프로모터는 CMV 이미디어트 얼리(immediate early), HSV 티미딘 키나제, 얼리 및 레이트 SV40, 레트로바이러스로부터의 LTR, 및 마우스 메탈로티오네인-I를 포함한다. 적절한 벡터 및 프로모터의 선택은 당해 분야의 통상의 기술 수준내에 있으며, 본 기내내용에 따른 단백질 또는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산에 작동적으로 연결된 적어도 하나의 프로모터 또는 조절된 프로모터를 포함하는 특정의 특히 바람직한 재조합체 발현 작제물의 제조방법이 본원에 기술되어 있다.
본 기재내용의 폴리뉴클레오타이드의 변이체가 또한 고려된다. 변이체 폴리뉴클레오타이드는 본원에 기술된 것으로서 정의된 서열 중 하나에 대해 적어도 90%, 및 바람직하게는 95%, 99%, 또는 99.9% 동일하거나, 약 65 내지 68℃에서 0.015 M 염화나트륨, 0.0015 M 시트르산나트륨 또는 약 42℃에서 0.015 M 염화나트륨, 0.0015 M 시트르산나트륨, 및 50% 포름아미드의 엄격한(stringent) 하이브리드화 조건하에 정의된 서열의 폴리뉴클레오타이드 중 하나에 하이브리드화한다. 폴리뉴클레오타이드 변이체는 본원에 기술된 작용성을 갖는, 결합 도메인 또는 이의 융합 단백질을 암호화하는 능력을 보유한다.
용어 "엄격한"은 엄격한 것으로서 당해 분야에서 일반적으로 이해되는 조건을 말한다. 하이브리드화 엄격성은 원칙적으로 온도, 이온 강도, 및 포름아미드와 같은 변성제의 농도에 의해 측정된다. 하이브리드화 및 세척을 위한 엄격한 조건의 예는 약 65 내지 68℃에서 0.015M 염화나트륨, 0.0015M 시트르산나트륨, 또는 약 42℃에서 0.015M 염화나트륨, 0.0015M 시트르산나트륨, 및 50% 포름아미드이다(Sambrook et al., Molecular cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. 1989).
보다 엄격한 조건(예: 보다 높은 온도, 보다 낮은 이온 강도, 포름아미드 또는 다른 변성화제의 보다 높은 농도)을 또한 사용할 수 있으나; 하이브리드화 속도에 영향을 미칠 것이다.
특정 양태에서, 보다 덜 엄격한 조건(예: 보다 낮은 온도, 보다 높은 이온 강도, 포름아미드 또는 다른 변성화제의 보다 낮은 농도)을 사용할 수 있다. 하이브리드화 및 세척을 위한 예시적인 보다 덜 엄격한 조건은 약 42℃에서 0.015M 염화나트륨, 0.0015M 시트르산나트륨이다. 폴리뉴클레오타이드 변이체는 본원에 기술된 작용성을 갖는 결합 도메인 또는 이의 융합 단백질을 암호화하는 능력을 보유한다.
본 기재내용의 추가의 국면은 본 기재내용의 특정 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터/발현 작제물로 형질전환되거나 형질감염되거나, 또는 기타의 경우 이를 함유하는 숙주 세포를 제공한다. 본 기재내용의 폴리뉴클레오타이드 또는 클로닝/발현 작제물은 형질전환, 형질감염 및 형질도입을 포함하는, 당해 분야에 공지된 어떠한 방법을 사용하여 적합한 세포내로 도입시킨다. 숙주 세포는 예를 들면, 생체외 유전자 치료요법을 포함하는, 생체외 세포 치료요법을 겪는 대상체의 세포를 포함한다. 본 기재내용에 따른 폴리뉴클레오타이드, 벡터 또는 단백질을 지닌 경우 본 기재내용의 국면으로 고려되는 진핵 숙주 세포는, 대상체의 자체 세포(예를 들면, 인간 환자 자신의 세포) 외에도, VERO 세포, HeLa 세포, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포주(발현된 다가 결합 분자의 글리코실화 패턴을 변형시킬 수 있는 변형된 CHO 세포를 포함, 참조: 미국 특허출원 공개 제2003/0115614호), COS 세포(예를 들면, COS-7), W138, BHK, HepG2, 3T3, RIN, MDCK, A549, PC12, K562, HEK293 세포, HepG2 세포, N 세포, 3T3 세포, 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포(예를 들면, Sf9 세포), 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae ) 세포를 포함하는 원핵 세포, 및 본 기재내용에 따른 단백질 또는 펩타이드를 발현시키고, 임의로 분리하는데 유용한 것으로 당해 분야에 공지된 특정의 다른 원핵 세포가 고려된다. 또한, 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 스트렙토마이세테(Streptomycete), 또는 본 기재내용에 따라 단백질 또는 펩타이드를 발현하고, 임의로 분리하기에 적합한 것으로 당해 분야에 공지된 임의의 원핵 세포가 고려된다. 원핵 세포로부터 단백질 또는 펩타이드를 분리하는데 있어서, 특히, 봉입체로부터 단백질을 추출하기 위한 당해 분야에 공지된 기술이 사용될 수 있음이 고려된다. 적절한 숙주의 선택은 본원의 교시로부터 당해 분야의 숙련가의 영역내에 있다. 본 기재내용의 융합 단백질을 글리코실화하는 숙주 세포가 고려된다.
용어 "재조합체 숙주 세포"(또는 단순히 "숙주 세포")는 재조합체 발현 벡터를 함유하는 세포를 말한다. 이러한 용어는 특수 대상체 세포만이 아니라 이러한 세포의 후대세포를 언급하는 것으로 이해되어야 한다. 특정의 변형이 돌연변이 또는 환경적 영향으로 인해 후속 세대에서 발생할 수 있기 때문에, 이러한 후대 세포는 실제로, 모 세포와 동일하지는 않지만, 여전히 본원에 사용된 것으로서, 용어 "숙주 세포"의 영역내에 포함된다.
재조합체 숙주 세포는 프로모터를 활성화시키거나, 형질전환체를 선택하거나, 또는 특수 유전자를 증폭시키기에 적절하게 변형된 통상의 영양 배지 속에서 배양할 수 있다. 온도, pH 등과 같이, 발현을 위해 선택된 특수 숙주 세포용 배양 조건은 통상의 숙련가에게 명백할 것이다. 각종 포유동물 세포 배양 시스템을 또한 사용하여 재조합체 단백질을 발현할 수 있다. 포유동물 발현 시스템의 예는 문헌[Gluzmam (1981) Cell 23:175]에 기술된 원숭이 신장 섬유모세포의 COS-7 세포주, 및 혼화성 벡터를 발현할 수 있는 기타 세포주, 예를 들면, C127, 3T3, CHO, HeLa 및 BHK 세포주를 포함한다. 포유동물 발현 벡터는 복제 오리진, 적합한 프로모터 및 임의로, 인핸서, 및 또한 특정의 필수적인 리보소옴 결합 부위, 폴리아데닐화 부위, 스플라이스 공여체(splice donor) 및 수용체 부위, 전사 종결 서열, 및 예를 들면, 다가 결합 단백질 발현 작제물의 제조에 관해 본원에 기술된 바와 같은, 5'-플랭킹 비전사된 서열을 포함할 것이다. SV40 스플라이스, 및 폴리아데닐화 부위로부터 기원한 DNA 서열을 사용하여 요구되는 비전사된 유전 성분을 제공할 수 있다. 숙주 세포내로 작제물의 도입은 인산칼슘 형질감염, DEAE-덱스트란-매개된 형질감염, 또는 전기천공(electroporation)을 포함하는, 당해 분야의 숙련가가 익숙할 각종 방법으로 수행할 수 있다[Davis et al. (1986) Basic Methods in Molecular Biology].
하나의 양태에서, 숙주 세포는 본 기재내용에 따른 단백질 또는 폴리펩타이드의 발현을 지시하는 재조합체 바이러스 작제물에 의해 형질도입된다. 형질도입된 숙주 세포는 바이러스 버딩(budding) 동안 바이러스 입자에 의해 도입된 숙주 세포 막의 부위로부터 기원한 발현된 단백질 또는 폴리펩타이드를 함유하는 바이러스 입자를 생산한다.
조성물 및 사용 방법
TCR 복합체 또는 이의 성분에 대해 지시된 융합 단백질 외에도, 본 기재내용은 또한 융합 단백질을 포함하는 약제학적 조성물 및 단위 투여제형, 및 또한 융합 단백질을 사용하는 방법, 약제학적 조성물 및 단위 투여제형을 제공한다.
TCR 시그날링과 관련된 질병 상황(state) 또는 상태(condition)로 고생하는 인간 또는 비-인간 포유동물을 치료하기 위해서, 융합 단백질을 대상체에게 1회 이상의 투여 과정 후 질병 상황 또는 상태의 증상을 완화시키기에 효과적인 양으로 투여된다. 폴리펩타이드인 경우, 본 기재내용의 단백질은 임의로, 하기에 보다 완벽히 논의되는 바와 같이, 주사 또는 주입에 의한 정맥내 투여에 사용될 수 있는 안정화제 또는 다른 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는, 약제학적으로 허용되는 부형제 속에 현탁시키거나 용해시킬 수 있다.
약제학적 유효량 또는 투여량은 질병 상황 또는 상태의 발생을 예방하거나, 억제하거나 또는 치료하는(증상, 바람직하게는 이러한 질병 상황 또는 상태의 모든 증상들을 어느 정도까지 완화시키는)데 요구되는 양 또는 투여량이다. 바람직한 양태에서, 본 기재내용의 일본쇄 융합 단백질의 약제학적 유효량은 T 세포 매개된 질병을 치료하는데 사용된다. 약제학적 유효 투여량은 질병의 유형, 사용된 조성물, 투여 경로, 치료하는 대상체의 유형, 치료 조건하에서 구체적인 대상체의 물리적 특성, 현재 약물, 및 의학 분야에서 숙련가가 인지할 다른 인자에 의존한다. 예를 들어, 활성 성분 0.1 mg/kg 체중 내지 100 mg/kg 체중(이는 단일 투여량으로서 매일, 주당, 월당 또는 특정의 적절한 간격으로 투여될 수 있다)의 양을 본 기재내용의 융합 단백질의 효능에 따라 투여할 수 있다.
위에서 기술되고 실시예에 나열된 바와 같이, 본원에 제공된 CD3와 같은 TCR 복합체 또는 이의 성분에 대해 지시된 융합 단백질은 T 세포 유사분열촉진성을 유도하지 않고 TCR 시그날링 경로에 유일하게 관여한다. 앞서의 연구는, 말초 T 세포 기능 및 분화가 TCR-관련된 시그날링 캐스케이드의 조작에 의해 기원할 수 있음을 입증하다. 예를 들면, T 세포 아네르기(anergy) 및 적응성 조절 T 세포 둘다를 강력한, 비-활성 시그날에 의해 유도할 수 있다. 또한, T 세포의 특정 소세트는 강력한 TCR 시그날의 전달시 보다 더 세포 사멸되는 경향이 있을 수 있다. 따라서, 본원에 제공된 융합 단백질은 T 세포 기능 및 운명을 조절하는데 사용됨으로써, T 세포가 상당하게 기여하는 자가면역병 또는 염증병을 포함하는 T 세포 매개된 병의 치료학적 치료를 제공한다. 또한, 본 기재내용의 융합 단백질은 T 세포를 활성화시키지 않고/않거나 사이토킨 방출을 유도하지 않기 때문에, 이들은 사이토킨 방출 증후군 및 급성 독성과 같은 부작용을 가지지 않거나 부작용이 감소되도록 하기 위해 TCR 복합체(예를 들면, 항-CD3 항체)에 대해 지시된 다른 분자보다 유리하다.
융합 단백질 및 이의 조성물 및 단위 투여제형으로 치료될 수 있는 예시적인 자가면역 또는 염증 질환(AIID)은 염증성 창자병[예를 들면, 크론병(Crohn's disease) 또는 궤양 대장염), 진성당뇨병(예를 들면, 제I형 당뇨병), 피부근염, 다발근육염, 악성 빈혈, 원발쓸개관간경화증, 급성파종뇌척수염(ADEM), 애디슨병(Addison's disease), 강직척수염, 항인지질 항체 증후군(APS), 자가면역 간염, 굿파스처 증후군(Goodpasture's syndrome), 그레이브스병(Graves' disease), 길랭-바레 증후군(Guillain-Barre syndrome: GBS), 하시모토병(Hashimoto's disease), 특발저혈소판자색반병, 전신홍반루푸스, 루푸스신염, 신경정신병 루푸스, 다발경화증(MS), 중증근육무력증, 보통천포창, 천식, 건선 관절염, 류마티스 관절염, 소그렌 증후군(Sjogren's syndrome), 측두동맥염(또한 "거세포 동맥염"으로 공지됨), 자가면역 용혈빈혈, 물집유사천포창, 혈관염, 복강질환, 만성폐쇄폐병, 자궁내막증, 화농땀샘염, 사이질방광염, 국소피부경화증, 공피증, 발작수면, 신경근긴장증, 백반증, 및 자가면역 내부 귀병을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
특정 양태에서, 본원에서 제공된 융합 단백질 및 조성물 및 단위 투여제형은 사이토킨 방출과 관련된, 부작용없이, 또는 최소 또는 감소된 부작용과 함께 면역억제제로 사용될 수 있다. 예를 들면, 본원에서 제공된 일본쇄 융합 단백질 및 조성물 및 단위 투여제형은 급성 거부에 있어서의 유도 및 예방(즉, 위험 감소) 둘다, 지연된 이식 기능, 및 실질 기관 이식(예를 들면, 신장, 간, 폐, 심장 이식) 중 이식체 상실에 사용될 수 있다. 또한, T 세포 활성화를 유도하지 않으면서, 특정 양태에서, 본 기재내용의 일본쇄 융합 단백질은 면역억제성 및 T 세포 유사분열성 둘다가 존재하는 것으로 공지된 TCR 복합체에 대해 지시된 다른 분자보다 면역억제제로서 보다 더 효과적일 수 있다. 추가의 양태에서, 본원에서 제공된 융합 단백질 및 조성물 및 단위 투여제형은 이식체 대 숙주병(GVHD) 및 자가면역 및 염증 질환(AIID)과 같은, 다른 T 세포 매개된 질병을 치료하는데 사용될 수 있다.
다른 국면에서, 융합 단백질의 조성물이 본 기재내용에서 제공된다. 본 기재내용의 약제학적 조성물은 일반적으로 본원에서 제공된 융합 단백질과 함께 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제, 또는 희석제를 포함한다. 이러한 담체는 사용된 투여량 및 농도에서 부형제에 대하여 비독성일 것이다. 치료학적 용도를 위한 약제학적으로 허용되는 담체는 약제 분야에 잘 공지되어 있으며, 예를 들면, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A.R. Gennaro (Ed.) 1985]에 기술되어 있다. 예를 들면, 멸균 염수 및 생리학적 pH에서 포스페이트 완충된 염수를 사용할 수 있다. 방부제, 안정화제, 염료 등도 약제학적 조성물 속에 제공될 수 있다. 예를 들면, 벤조산나트륨, 소르브산, 또는 p-하이드록시벤조산의 에스테르를 방부제로서 가할 수 있다(참조: Id. at 1449). 또한, 항산화제 및 현탁화제를 사용할 수 있다(Id.). 본 발명의 화합물은 유리 염기 또는 염 형태로 사용될 수 있으며, 이들 형태 둘다는 본 발명의 영역내에 있는 것으로 고려된다.
약제학적 조성물은 또한 완충제, 아스코르브산과 같은 항산화제, 저분자량(약 10개 미만의 잔기) 폴리펩타이드, 단백질, 아미노산, 탄수화물(예를 들면, 글루코오즈, 슈크로오즈, 덱스트린), 킬레이트제(예를 들면, EDTA), 글루타티온 및 기타 안정화제 및 부형제를 포함할 수 있다. 중성의 완충된 염수 또는, 비특이적인 혈청 알부민과 혼합된 염수가 예시적인 희석제이다. 바람직하게는, 생성물은 적절한 부형제 용액(예를 들면, 수크로즈)를 희석제로서 사용하여 동결건조물로서 제형화한다.
또한, 제2 제제와 배합된 본 기재내용의 융합 단백질 조성물의 투여가 고려된다. 제2 제제는 이식, 염증 및 자가면역성과 같은 특수 질병 상태 또는 질환에 대한 표준 치료로서 당해 분야에서 허용된 것일 수 있다. 고려된 예시적인 제2 제제는 스테로이드, NSAID, mTOR 억제제[예를 들면, 라파마이신(시롤리무스), 템시롤리무스, 데포롤리무스, 에베롤리무스, 조타롤리무스, 쿠르쿠민, 파르네실티오살리실산), 칼시네우린 억제제(예를 들면, 사이클로스포린, 타크롤리무스), 항-대사제(예를 들면, 마이코페놀산, 마이코페놀레이트 모페틸), 폴리클로날 항체(예를 들면, 항-가슴샘세포 글로불린), 모노클로날 항체(예를 들면, 다클리주마브, 바실리주마브), 또는 다른 활성 및 보조제, 또는 이의 특정 조합물을 포함한다
"약제학적으로 허용되는 염"은 약제학적으로 허용되며 모 화합물의 바람직한 약리학적 활성을 소유하는 본 기재내용의 융합 단백질의 염, SMIP, 또는 항체를 말한다. 이러한 염은 (1) 염산, 브롬화수소산, 황산, 질산, 인산 등과 같은 무기 산과 함께 형성되거나; 아세트산, 프로피온산, 헥사노산, 사이클로펜탄프로피온산, 글리콜산, 피루브산, 락트산, 말론산, 석신산, 말산, 말레산, 푸마르산, 타르타르산, 시트르산, 벤조산, 3-(4-하이드록시벤조일)벤조산, 신남산, 만델산, 메탄설폰산, 에탄설폰산, 1,2-에탄-디솔폰산, 2-하이드록시에탄설폰산, 벤젠설폰산, 4-클로로벤젠설폰산, 2-나프탈렌설폰산, 4-톨루엔설폰산, 캄포르설폰산, 4-메틸비사이클로[2.2.2]-옥트-2-엔-1-카복실산, 글루코헵톤산, 라우릴 설푸르산, 3-페닐프로피온산, 트리메틸아세트산, 3급 부틸아세트산, 글루콘산, 글루탐산, 하이드록시나프토산, 살리사이클산, 스테아르산, 무콘산 등과 같은 유기 산과 함께 형성된 산 부가염; 또는 (2) 모 화합물 중에 존재하는 산성 양성자가 금속 이온, 예를 들면, 알칼리 금속 이온, 알칼리 토금속 이온, 또는 알루미늄 이온인 경우 형성되거나; 에탄올아민, 디에탄올아민, 트리에탄올아민, N-메틸글루카민 등과 같은 유기 염기와 함께 배위되는 경우 형성된 염을 포함한다.
특별한 설명적 양태에서, 본 기재내용의 융합 단백질은 예를 들면, 거환 주사 또는 주입에 의해 정맥내 투여된다. 정맥 투여 외의 투여 경로는 경구, 국소, 비경구(예를 들면, 설하 또는 볼내), 설하, 직장, 질내 및 비강내를 포함한다. 본원에 사용된 것으로서 용어 비경구는 피하 주사, 정맥내, 근육내, 흉골내, 음경해면체내, 경막내, 내이강내, 요도내 주사 또는 주입 기술을 포함한다. 약제학적 조성물은 이에 함유된 활성 성분이 환자에게 조성물의 투여시 생이용성이 되도록 제형화된다. 환자에게 투여된 조성물은 하나 이상의 단위 용량 단위의 형태를 취할 수 있으며, 여기서, 예를 들면, 정제는 단일 용량 단위일 수 있거나, 에어로졸 형태의 본 기재내용의 하나 이상의 화합물의 용기가 다수의 용량 단위를 유지할 수 있다.
경구 투여의 경우, 슈크로오즈, 카올린, 글리세린, 전분 덱스트란, 사이클로덱스트린, 나트륨 알기네이트, 카복시메틸셀룰로오즈, 및 에틸 셀룰로오즈와 같은 부형제 및/또는 결합제가 존재할 수 있다. 감미제, 방부제, 염료/착색제, 풍미 증진제, 또는 이의 특정조합이 임의로 존재할 수 있다. 피복 쉘을 또한 임의로 사용할 수 있다.
주사로 투여되도록 의도된 조성물에서, 하나 이상의 표면활성제, 방부제, 습윤제, 분산제, 현탁화제, 완충제, 안정화제, 등장성 제제 또는 이의 특정 조합을 임으로 포함시킬 수 있다.
핵산-계 제형, 또는 본 기재내용에 따른 발현 생성물을 포함하는 제형의 경우, 약 0.01 ㎍/kg 체중 내지 약 100　mg/kg 체중을 예를 들면, 피내, 피하, 근육내 또는 정맥내 경로에 의해, 또는 제공된 상황 세트하에 적합한 것으로 당해 분야에 공지된 특정 경로에 의해 투여할 것이다. 바람직한 용량은 예를 들면, 약 1　μg/kg 내지 약 20 mg/kg이며, 약 5 μg/kg 내지 약 10　mg/kg이 특히 바람직하다. 투여 횟수 및 빈도는 숙주의 반응에 의존할 것임은 당해 분야의 숙련가에게 명백할 것이다.
본 기재내용의 약제학적 조성물은 예를 들면, 고체, 액체 또는 가스(에어로졸)의 형태로 환자에게 투여하도록 하는 특정 형태일 수 있다. 조성물은 액체의 형태, 예를 들면, 엘릭서르, 시럽, 용액, 유액 또는 현탁액의 형태일 수 있다. 액체는 2가지 예로서, 경구 투여 또는 주사에 의한 전달을 위한 것일 수 있다.
본원에 사용된 것으로서 약제학적 조성물은, 용액, 현탁액 형태 또는 다른 유사 형태와 상관없이, 하나 이상의 다음 성분들을 포함할 수 있다: 주사용수, 염수 용액, 바람직하게는 생리학적 염수, 링거액(Ringer's solution), 등장성 염화나트륨, 용매 또는 현탁회 매질로서 작용할 수 있는 합성 모노 또는 디글리세라이드와 같은 고정 오일, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 기타 용매와 같은 멸균 희석제; 벤질 알코올 또는 메틸 파라벤과 같은 항세균제; 아스코르브산 또는 아황산수소나트륨과 같은 항산화제; 에틸렌디아민테트라아세트산과 같은 킬레이트제; 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트와 같은 완충제 및, 나트륨, 클로라이드 또는 덱스트로즈와 같은 강직 조절용 제제. 비경구 제제는 유리 또는 플라스틱으로 제조된 앰플, 1회용 주사기 또는 다중 투여 바이알 속에 봉입될 수 있다. 생리학적 염수는 바람직한 첨가제이다. 주사가능한 약제학적 조성물은 바람직하게는 멸균성이다.
알루미늄 염, 오일-중-수(water-in-oil) 유액, 생분해성 오일 비히클, 수-중-오일(oil-in-water) 유액, 생분해가능한 미세캅셀 및 리포좀과 같은 다른 성분들을 제제 속에 포함시키는 것 또한 바람직할 수 있다. 이러함 비히클에 사용하기 위한 보조제의 예는 N-아세틸무라밀-L-알라닌-D-이소글루타민(MDP), 리포폴리사카라이드(LPS), 글루칸, IL-12, GM-CSF, γ-인터페론 및 IL-15를 포함한다.
당해 분야의 숙련가에게 공지된 특정의 적합한 담체를 본 기재내용의 약제학적 조성물에 사용할 수 있지만, 담체의 유형은 투여 방식에 따라 및 지속적인 방출이 요구되는지의 여부에 따라 변할 것이다. 비경구 투여를 위해, 담체는 물, 염수, 알코올, 지방, 왁스, 완충액, 또는 이의 특정 조합을 포함할 수 있다. 경구 투여를 위해, 상기 담체, 또는 만니톨, 락토즈, 전분, 스테아르산마그네슘, 나트륨 사카린, 활석, 셀룰로오즈, 글루코즈, 슈크로오즈, 탄산마그네슘 또는 이의 특정 조합물과 같은 고체 담체 중 어느 것도 사용될 수 있다.
본 기재내용은 본 기재내용의 약제학적 조성물을 포함하는 용량 단위를 고려한다. 이러한 용량 단위는 예를 들면, 하나는 동결건조된 형태의 본 기재내용의 약제학적 조성물을 포함하고 다른 것은 재구성용 희석제를 포함하는, 2개-구획 바이알 또는 주사기를 포함하는, 다중-투여 바이알 또는 주사기, 또는 단일 투여 바이알 또는 주사기를 포함한다. 다중-투여 용량 단위는 또한 예를 들면, 정맥내 주입 장치에 연결하기 위한 튜브 또는 백일 수 있다.
본 기재내용은 또한 단위 투여량 또는 다중 투여량, 용기, 예를 들면 바이알 속에 본 기재내용의 약제학적 조성물, 및 위에서 기술한 질환과 같은 질환으로 고생하는 환자에게 상기 조성물을 투여하기 위한 지침 세트를 포함하는 키트(kit)를 고려한다.
본 발명은 면역학적으로 활성인 재조합체 결합 단백질 및, 특히, CD3와 같은 TCR 복합체 또는 이의 성분에 대해 특이적인 일본쇄 융합 단백질을 제공한다. 본 발명은 또한 자가면역병 및 기타 질환 또는 상태(예를 들면, 이식 거부증)를 치료하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다.
도 1은 PHA-프라임된 인간 T 세포를 각종 항체 및 소 모듈러 면역약제(SMIPTM) 생성물로 처리한 것으로부터 수득되는 활성화된 T 세포의 비율을 나타낸다. "No Rx"는 음성 대조군으로서 사용된, 비처리를 나타낸다.
도 2는 혼합된 림프구 반응 검정에서 반응인자 세포를 각종 항체 및 SMIP 융합 단백질로 처리한 것으로부터 수득되는 활성화된 T 세포의 비율을 나타낸다. "MLR"은 어떠한 추가의 처리없이 혼합된 림프세포의 반응을 말한다. "반응인자만"은 반응인자 세포만이 존재하는 반응물을 말한다. "IgG2a"는 10㎍/ml IgG2a mAb로 처리한 반응인자 세포를 말한다.
도 3은 혼합된 림프세포 반응 검정에서 반응인자 세포를 각종 항체 및 SMIP 융합 단백질로 처리한 것으로부터 수득되는 활성화된 T 세포의 비율을 나타낸다. "MLR"은 어떠한 추가의 처리없이 혼합된 림프세포 반응물을 나타낸다. "반응인자 만"은, 반응인자 세포만이 존재하는 반응물을 말한다.
도 4는 기억 T 세포를 모노클로날 항체 및 각종 SMIP 융합 단백질로 처리한 것으로부터 수득되는 활성화된 T 세포의 비율을 나타낸다. "반응인자(No TT)"는 테타누스 독소의 부재하에서의 반응을 말한다.
도 5a 및 5b는 OKT3 모노클로날 항체 또는 각종 OKT3 SMIP 융합 단백질로 처리한 후 (A)분리 직후(0일째) 또는 (b) 4일째에 염색된 인간 T 세포에서 TCR 및 CD3의 FACS 분석 도트 플롯(analysis dot plot)이다.
도 6a 및 6b는 OKT3 IgG1AA 또는 OKT3 HM1 SMIP 융합 단백질로 처리한 후 (A) 분리 직후(0일째) 또는 (B) 4일째에 염색된 인간 T 세포상의 TCR 및 CD3의 FACS 분석 도트 플롯이다.
도 7은 정제된 인간 T 세포를 모노클로날 항체, 항체의 조합물 또는 각종 OKT3 SMIP 융합 단백질로 처리한 것으로부터 수득되는, 시간에 따른 칼슘 유동 지시인자 염료의 형광성에 있어서의 변화를 나타낸다.
도 8a 및 8b은 ConA-프라임된 마우스 T 세포를 모노클로날 항체(2C11 mAb 및 H57 mAb) 또는 SMIP 융합 단백질(2C11 Null2 및 H57 Null2)로 처리한 후 (A) IFNγ 또는 (B) IP-10 방출을 나타낸다.
도 9는 혼합된 림프세포 반응 검정에서 반응인자 세포를 각종 항체 또는 SMIP 융합 단백질로 처리한 것으로부터 수득되는 활성화된 T 세포의 비율을 나타낸다. "R 만"은, 반응인자 세포만 존재하는 반응물을 말하고; "S 만"은, 자극인자 세포만 존재하는 반응물을 말하며; "R:S"는, 반응인자 및 자극인자 세포 둘다가 존재하는 반응물을 말한다.
도 10a 및 10b는각종 농도에서 항체(H57 mAb) 및 H57 Null2 SMIP 융합 단백질의 정맥내 투여 후 시간에 따른 (A) 체중 및 (B) 임상 점수에 있어서의 변화를 나타낸다. PBS 및 IgG2a는 음성 대조군으로서 사용되었다.
도 11a 및 11b는 정상 BALB/c 마우스내로 항-TCR 항체(H57 mAb) 또는 각종 농도의 항-TCR SMIP 융합 단백질(H57 Null2)의 정맥내 투여 후 2시간, 24시간, 72시간째에 혈청중 (A) IL-6 및 (B) IL-4의 농도를 나타낸다. 마우스 IgG2a 항체 및 PBS(희석제)는 음성 대조군으로서 사용되었다.
도 12는 각종 농도의 항-TCR SMIP 융합 단백질(H57 Null2)의 정맥내 투여 후 1 또는 3일 째에 H57 Null2 SMIP로 피복된 마우스 비장에서 발견된 T 세포의 비율을 나타낸다. PBS 및 IgG2a는 음성 대조군으로서 사용되었다.
도 13은 급성 이식 대 숙주병(aGVHD)의 모델에서 공여체 세포의 전달 후 14일에 걸친 수용체 마우스의 초기 체중의 변화 비율을 나타낸다. "미가공(naive) 수용체"는 음성 대조군으로서 공여체 세포 전달을 제공받지 않은 마우스를 나타낸다. 수용체 마우스는 H57 Null2 SMIP 융합 단백질, 덱사메타손(DEX), 또는 대조군(PBS 또는 IgG2a)으로 처리하였다.
도 14a 내지 14c는 공여체 세포의 전달 후, 14일, 14일 또는 7일째 각각에서 (A) G-CSF, (B) KC, 또는 (C) IFNγ의 혈청 농도를 나타낸다.
도 15는 공여체 세포의 전달 후 14일째에 공여체:숙주 림프세포 비율을 나타낸다. "세포 전달 없음"은 공여체 세포를 제공받지 않았던 음성 대조군 마우스를 나타낸다. PBS 및 IgG2a는 대조군 처리로 사용하였다.
도 16은 인간 IgG1, 인간 IgG2, 인간 IgG4, 및 마우스 IGHG2c(각각 서열 번호: 64, 66, 68 및 73)의 CH2 영역 중의 서열 정렬을 나타낸다. 정렬은 DNASTAR 5.03의 메그얼라인(MegAlign) 프로그램[공급원: 디엔에이스타 인코포레이티드(DNASTAR Inc.)]의 디폴트 매개변수를 사용하는 클루스탈(Clustal) W 방법을 사용하여 수행하였다. 인간 IgG1 CH2의 아미노산 위치는 카바트[참조: Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed. Bethesda, MD: Public Health Service, National Institutes of Health (1991)]에 따른 EU 번호매김을 기초로 하다. 즉, 인간 IgG1의 중쇄 가변 영역은, 길이가 128개 아미노산인 것으로 추정되므로, 인간 IgG1의 불변 영역내 대부분의 아미노-말단 아미노산 잔기는 129번 위치에 있다. 다른 CH2 영역의 아미노산 위치는 이들이 정렬하고 있는 인간 IgG1내 아미노산 잔기의 위치를 기초로 한다. 297번(n297) 위치에서의 Asn 잔기는 밑줄쳐져 있고 굵은 글자체이다.
도 17은 혼합된 림프세포 반응(MLR) 검정에서 반응인자 세포를 항체 또는 SMIP 융합 단백질로 처리한 것으로부터 수득되는 활성화된 T 세포의 비율을 나타낸다. "R"은, 반응인자 세포만이 존재하는 반응물을 나타내고, "S"는, 자극인자 세포만이 존재하는 반응물을 말하며, "R+S"는 어떠한 추가의 처리가 없는 혼합된 림프세포 반응물을 말하고, "muIgG2b"는 T 세포에 결합하지 않는 scFv 결합 도메인을 갖는 SMIP 융합 단백질이다. 세포는 Cris-7 IgG1 N297A(서열 번호: 265)로 시험하였다.
도 18은 분리 직후 염색된 인간 T 세포에서 TCR 및 CD3의 FACS 분석 도트 플롯을 나타낸다. 상부의 2개 패널은 Cris-7 모노클로날 항체로 처리한 인간 T 세포를 나타내고, 하부 2개의 패널은 Cris-7 IgG1 N297A(서열 번호: 265)로 처리한 것을 나타낸다. 좌측의 패널은 치료 당일(0일째)의 세포 분포를 나타내고 우측 패널은 처리 후 2일째(2일째)의 세포 분포를 나타낸다.
도 19는 각종 길이의 다른 힌지(특히, 서열 번호: 212 내지 218 각각에 상응하는, 링커 115 내지 120 및 122)에 대해 교환된 힌지 링커 87을 갖는 동일한 융합 단백질과 비교하여, 인간 T 세포를 BC3 IgG1-N297A(서열 번호: 80, 이는 scFv 및 CH2CH3 도메인 사이에 힌지로서 링커 87을 갖는다)로 처리한 것으로부터 수득되는 시간에 따른 칼슘 유동 지시인자 염료의 형광성에 있어서의 변화를 나타낸다.
도 20은 MLR 검정에서 반응인자 세포를 항체 또는 SMIP 융합 단백질로 처리한 것으로부터 수득되는 활성화된 T 세포의 비율을 나타낸다. "대조군 SMIP"는 T 세포에 결합하지 않는 scFv 결합 도메인을 갖는 SMIP 결합 단백질을 말한다. "반응인자 만"은, 반응인자 세포만이 존재한 반응물을 말한다. 괄호안의 수는 SMIP 융합 단백질의 서열 확인인자 번호이다.
도 21은 MLR 검정에서 반응인자 세포를 각종 힌지 링커를 함유하는 BC3 IgG1-N297A SMIP 융합 단백질로부터 수득되는 활성화된 T 세포의 비율을 나타낸다.
도 22는 MLR 검정에서 반응인자 세포를 모노클로날 항체 Cris7, 키메라 또는 인간화된 Cris7 SMIP 융합 단백질, 또는 키메라 BC3 SMIP 융합 단백질(서열 번호: 80)으로 처리한 것으로부터 수득되는 활성화된 T 세포의 비율을 나타낸다. "대조군 SMIP"는 T 세포에 결합하지 않는 scFv 결합 도메인을 갖는 SMIP 융합 단백질을 말하며 "반응인자 만"은, 반응인자 세포만 존재하는 반응물을 말한다. 괄호안의 수는 SMIP 융합 단백질의 서열 확인인자 번호이다.
도 23은 MLR 검정에서 반응인자 세포를 인간화된 Cris7 IgG1-N297, IgG2-AA-N297A 및 IgG4-AA-N297A, 및 HM1 SMIP 융합 단백질 또는 키메라 Cris7 IgG1-N297A 및 HM1 SMIP 융합 단백질로 처리한 것으로부터 수득되는 활성화된 T 세포의 비율을 나타낸다. "모 mAb"는 Cris7 mAb를 말하고 "대조군 SMIP"는 T 세포에 결합하지 않는 scFv 결합 도메인을 갖는 SMIP 융합 단백질을 말한다.
도 24는 PHA-프라임된 인간 T 세포를 인간화된 Cris7(VH3-VL1) IgG1-N297A 또는 인간화된 Cris7(VH3-VL2) IgG1-N297A SMIP 융합 단백질로 처리한 후 활성화된 T 세포의 비율을 나타낸다.
도 25a 및 25b는 PHA-프라임된 T 세포를 각종의 인간화된 및 키메라 Cris7 SMIP 융합 단백질, BC3 SMIP 융합 단백질(서열 번호: 80), 및 각종의 항체(BC3 mAb, 모 Cris7 mAb, 및 Nuvion FL)로 처리한 후 24시간(1일째) 및 72시간(3일째)째에 혈청중 (A) IFNγ 및 (B) IL-17의 농도를 나타낸다. 괄호안의 수는 SMIP 융합 단백질의 서열 확인인자 수이다.
도 26a 내지 26h는 24시간(d1), 48 시간(d2), 또는 72 시간(d3) 동안 인간화된 Cris7 (VH3-VL1) IgG4-AA-N297A SMIP 융합 단백질, 인간화된 Cris7 (VH3-VL2) IgG4-AA-N297A SMIP 융합 단백질, 또는 Cris7 mAb로 처리된 원시 PBMC에서 (A) IFNγ, (B) IL-10, (C) IL-1B, (D) IL-17, (E) IL-4, (F) TNF-α, (G) IL-6, 및 (H) IL-2의 수준을 나타낸다.
도 27은 IgG2a mAb (411㎍), H57 mAb (5㎍), H57 Null2 SMIP 융합 단백질 (300㎍), H57 half null SMIP 융합 단백질 (300 ㎍), 또는 H57 HM2 SMIP 융합 단백질 (300㎍)의 정맥내 투여 후 시간에 따른 체중에 있어서의 변화를 나타낸다.
도 28은 도 27에서 투여한 바와 같이, IgG2a mAb, H57 mAb, H57 Null2, H57 half null, 또는 H57 HM2의 정맥내 투여 후 2시간 째에 말초 혈액 T 세포 농도를 나타낸다.
도 29는 도 27에서 투여한 바와 같이 IgG2a mAb, H57 mAb, H57 Null2, H57 half null, 또는 H57 HM2의 정맥내 투여 후 72시간째에 말초 T 세포 농도를 나타낸다.
도 30a 내지 30c는 도 27에서 투여한 바와 같이 IgG2a mAb, H57 mAb, H57 Null2, H57 half null, 또는 H57 HM2의 정맥내 투여 후 (A) 2 시간, (B) 24 시간, 및 (C) 72 시간째에 혈청 중 IL-2의 농도를 나타낸다.
도 31a 내지 31c는 도 27에서 투여한 바와 같이 IgG2a mAb, H57 mAb, H57 Null2, H57 half null, 또는 H57 HM2의 정맥내 투여 후 (A) 2 시간, (B) 24 시간, 및 (C) 72 시간째에 혈청 중 IL-10의 농도를 나타낸다.
도 32a 내지 32c는 도 27에서 투여한 바와 같이 IgG2a mAb, H57 mAb, H57 Null2, H57 half null, 또는 H57 HM2의 정맥내 투여 후 (A) 2 시간, (B) 24 시간, 및 (C) 72 시간째에 헐청중 IP-10의 농도를 나타낸다.
도 33a 내지 33c는 도 27에서 투여한 바와 같이 IgG2a mAb, H57 mAb, H57 Null2, H57 half null, 또는 H57 HM2의 정맥내 투여 후 (A) 2 시간, (B) 24 시간, 및 (C) 72 시간째에 TNFα의 농도를 나타낸다.
도 34a 내지 34c는 도 27에서 투여한 바와 같이 IgG2a mAb, H57 mAb, H57 Null2, H57 half null, 또는 H57 HM2의 정맥내 투여 후 (A) 2 시간, (B) 24 시간, 및 (C) 72 시간째에 혈청중 IL-4의 농도를 나타낸다.
도 35a 내지 35c는 도 27에서 투여한 바와 같이 IgG2a mAb, H57 mAb, H57 Null2, H57 half null, 또는 H57 HM2의 정맥내 투여 후 (A) 2 시간, (B) 24 시간, 및 (C) 72 시간째에 혈청중 MCP-1의 농도를 나타낸다.
도 36a 내지 36c는 도 27에 나타낸 바와 같이 IgG2a mAb, H57 mAb, H57 Null2, H57 half null, 또는 H57 HM2의 정맥내 투여 후 (A) 2 시간, (B) 24 시간, 및 (C) 72 시간째에 혈청중 KC의 농도를 나타낸다.
도 37a 내지 37c는 IgG2a, H57 mAb 및 H57 Null2, half null 및 HM2 SMIP의 정맥내 투여 후 2 시간 (A), 24 시간 (B) 및 72 시간 (C)째에 IL-17의 농도를 나타낸다.
도 38a 내지 38c는 도 27에서 투여한 바와 같이, IgG2a mAb, H57 mAb, H57 Null2, H57 half null, 또는 H57 HM2의 정맥내 투여 후 (A) 2 시간, (B) 24 시간, 및 (C) 72 시간째에 IP-10의 농도를 나타낸다.
도 39a 및 39b는 H57-HM2 및 H57 half null에 대한 평균 혈청 농도 대 시간의 그래프이다. 결과는 WinNonLinTM 소프트웨어로 계산한 예측된 값 및 관측된 데이터 세트로 나타낸다. Rsq 값 및 Rsq 조정 값은 HL_람다 z(6.6 및 40.7 시간)의 추정에 사용된 점들의 수에 대해 조절하기 전 및 후에, 말단 제거 상에 대한 적합도 통계(goodness of fit statistic)이다.
도 40은 H57-HM2 또는 H57 Null2 (각각 200㎍)의 정맥내 투여 후 15 분, 2 시간, 6 시간, 24 시간 및 48 시간째에 혈청중 G-CSF의 농도를 나타낸다
도 41은 H57-HM2 또는 H57 Null2(각각 200㎍)의 정맥내 투여 후 15 분, 2 시간, 6 시간, 24 시간 및 48 시간째에 혈청 중 IFN-γ의 농도를 나타낸다.
도 42는 H57-HM2 또는 H57 Null2(각각 200㎍)의 정맥내 투여 후 15 분, 2 시간, 6 시간, 24 시간 및 48 시간째에 혈청중 IL-2의 농도를 나타낸다.
도 43은 H57-HM2 또는 H57 Null2(각각 200㎍)의 정맥내 투여 후 15 분, 2 시간, 6 시간, 24 시간 및 48 시간째에 혈청중 IL-5의 농도를 나타낸다.
도 44는 H57-HM2 또는 H57 Null2(각각 200㎍)의 정맥내 투여 후 15 분, 2 시간, 6 시간, 24 시간 및 48 시간째에 혈청중 IL-6의 농도를 나타낸다.
도 45는 H57-HM2 또는 H57 Null2(각각 200㎍)의 정맥내 투여 후 15 분, 2 시간, 6 시간, 24 시간 및 48 시간째에 혈청중 IL-10의 농도를 나타낸다.
도 46은 H57-HM2 또는 H57 Null2(각각 200㎍)의 정맥내 투여 후 15 분, 2 시간, 6 시간, 24 시간 및 48 시간째에 혈청중 IL-17의 농도를 나타낸다.
도 47은 H57-HM2 또는 H57 Null2(각각 200㎍)의 정맥내 투여 후 15 분, 2 시간, 6 시간, 24 시간 및 48 시간째에 혈청중 IP-10의 농도를 나타낸다.
도 48은 H57-HM2 또는 H57 Null2(각각 200㎍)의 정맥내 투여 후 15 분, 2 시간, 6 시간, 24 시간 및 48 시간째에 혈청중 KC 15의 농도를 나타낸다.
도 49는 H57-HM2 또는 H57 Null2(각각 200㎍)의 정맥내 투여 후 15 분, 2 시간, 6 시간, 24 시간 및 48 시간째에 혈청중 MCP-1의 농도를 나타낸다.
도 50은 반응인자 세포를 H57 Null2, H57 half null, H57-HM2, 마우스 IgG2a mAb, 또는 H57 mAb로 처리한 것으로부터 수득되는 활성화된 T 세포의 비율을 나타낸다.
도 51은 반응인자 세포를 (R+S)에 대해 정상화된 H57 Null2, H57 half null, H57-HM2, 또는 H57 mAb로 처리한 것으로부터 수득되는 활성화된 T 세포의 비율 - 비처리 = 100%임을 나타낸다.
도 52는 H57 Null2, H57 half null, H57-HM2, 마우스 IgG2a mAb, H57 mAb, 또는 2C11 mAb의 처리로 활성화된 ConA-프라임된 T 세포의 비율을 나타낸다.
실시예
모노클로날 항체 및 예시적인 일본쇄 융합 단백질
예시적인 모노클로날 항체(이로부터의 결합 도메인, 및 이의 변이체를 사용하여 예시적인 일본쇄 융합 단백질을 제조하였다) 및 일본쇄 융합 단백질을 본원에서 간단히 기술한다.
Cris-7(또한 Cris-7 mAb 또는 Cris-7 FL로 언급됨)는 마우스 항-인간 CD3ε IgG2a 모노클로날 항체(mAb)[참조: Reinherz, E. L. et al. (eds.), Leukocyte typing II., Springer Verlag, New York, (1986)]이다. Cris-7 mAb는 인간, 개코원숭이, 시노몰구스 원숭이, 및 레서스(rhesus) T 세포이다(데이타는 나타내지 않음). 본원에 기술된 각각의 Cris-7 일본쇄 융합 단백질은 이러한 교차-종 반응성을 나타내었다(데이타는 나타내지 않음).
키메라 및 인간화된 Cris-7 IgG1-N297A(서열 번호: 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295)는 아미노-말단으로부터 카복실-말단까지: 키메라 또는 인간화된 Cris-7 중쇄 가변 영역, 일렬로 연결된 3개의 (Gly)4-Ser을 포함하는 링커, 키메라 또는 인간화된 Cris-7 경쇄 가변 영역, 돌연변이된 IgG1 힌지 영역(SCC-P), 297번 위치에서 알라닌 치환을 갖는 인간 IgG1의 CH2 영역 및, 인간 IgG1의 CH3 영역을 포함한다.
키메라 및 인간화된 Cris-7 IgG1-AA-N297A(서열 번호: 266, 271, 276, 281, 286, 291, 296)는 아미노-말단으로부터 카복실-말단까지: 키메라 또는 인간화된 Cris-7 중쇄 가변 영역, 일렬로 연결된 3개의 (Gly)4-Ser을 포함하는 링커, 키메라 또는 인간화된 Cris-7 경쇄 가변 영역, 돌연변이된 IgG1 힌지 영역(SCC-P), L234, L235, G237 및 N297 위치에서 4개의 알라닌 치환을 갖고 G236에서 결실[즉, LLGG(234-237)AAA]을 갖는 인간 IgG1의 CH2 영역, 및 인간 IgG1의 CH3 영역을 포함한다.
키메라 및 인간화된 Cris-7 IgG2-AA-N297A(서열 번호: 267, 272, 277, 282, 287, 292, 297)는 아미노-말단으로부터 카복실-말단까지: 키메라 또는 인간화된 Cris-7 중쇄 가변 영역, 일렬로 연결된 3개의 (Gly)4-Ser을 포함하는 링커, 키메라 또는 인간화된 Cris-7 경쇄 가변 영역, 돌연변이된 IgG1 힌지 영역(SCC-P), V234, G236 및 N297 위치에서 3개의 알라닌 치환을 갖는 인간 IgG2의 CH2 영역, 및 인간 IgG2의 CH3 영역을 포함한다..
키메라 및 인간화된 Cris7 IgG4-AA-N297A(서열 번호: 268, 273, 278, 283, 288, 293, 298)는 아미노-말단으로부터 카복실-말단까지: 키메라 또는 인간화된 Cris-7 중쇄 가변 영역, 일렬로 연결된 3개의 (Gly)4-Ser을 포함하는 링커, 키메라 또는 인간화된 Cris-7 경쇄 가변 영역, 돌연변이된 IgG1 힌지 영역(SCC-P), F234, L235, G237 및 N297 위치에서 4개의 알라닌 치환 및 G236 위치에서 결실[즉, FLGG(234-237)AAA]을 갖는 인간 IgG4의 CH2 영역, 및 인간 IgG4의 CH3 영역을 포함한다.
키메라 및 인간화된 Cris-7 HM1(서열 번호: 269, 274, 279, 284, 289, 294, 299)는 아미노-말단으로부터 카복실-말단까지: 키메라 또는 인간화된 Cris-7 중쇄 가변 영역, 일렬로 연결된 적어도 3개의 (Gly)4-Ser를 포함하는 링커, Cris-7 경쇄 가변 영역, 야생형 인간 IgG1 힌지 영역, 인간 IgM로부터의 CH3 영역, 및 인간 IgG1로부터의 CH3 영역, 및 FLAG 에피토프의 3개의 카피, AVI 태그의 1개의 카피, 및 6개의 히스티딘을 포함하는 테일 서열을 포함한다.
BC3(또한 BC3 mAb 또는 BC3 FL로서 언급됨)는 비-유사분열촉진성 마우스 항-인간 CD3ε IgG2b mAb(참조: Anasetti et al., J. Exp . Med . 172: 1691-1700, 1990)이다.
BC3-HM1(또한, "BC3 HM1"으로 언급됨)(서열 번호: 84)은 이의 아미노-말단부터 카복실-말단까지: BC3 중쇄 가변 영역, 일렬로 연결된 적어도 3개의 (Gly)4-Ser을 포함하는 링커, BC3 경쇄 가변 영역, 야생형 인간 IgG1 힌지 영역, 인간 IgM으로부터의 CH3 영역, 및 인간 IgG1으로부터의 CH3 영역, 및 FLAG 에피토프의 3개 카피, AVI 태그의 1개 카피, 및 6개의 히스티딘을 포함하는 테일 서열을 포함한다.
BC3-△CH2(또한 "bc3△CH2"로 언급됨)(서열 번호: 85)는 이의 아미노-말단으로부터 카복실-말단까지: BC3 중쇄 가변 영역, 일렬로 연결된 적어도 3개의 (Gly)4-Ser을 포함하는 링커, BC3 경쇄 가변 영역, 야생형 IgG1 힌지 영역, 인간 IgG1의 CH3 영역, 및 FLAG 에피토프의 3개 카피, AVI 태그의 1개 카피, 및 6개의 히스티딘을 포함하는 테일 서열을 포함한다.
BC3-G1 N297A(또한, "BC3 N297A"로 언급됨)(서열 번호: 80)는 이의 아미노-말단으로부터 카복실-말단까지: BC3 중쇄 가변 영역, 일렬로 연결된 3개의 (Gly)4-Ser을 포함하는 링커, BC3 경쇄 가변 영역, 돌연변이된 IgG1 힌지 영역 (SCC-P), 297번 위치의 아스파라긴에서 알라닌 치환을 갖는 인간 IgG1의 CH2 영역, 및 인간 IgG1의 CH3 영역을 포함한다.
BC3-G1 AA N297A(또한 "BC3 IgG1AA"로 언급됨)(서열 번호: 81)는 이의 아미노 말단으로부터 카복실 말단까지: BC3 중쇄 가변 영역, 일렬로 연결된 3개의 (Gly)4-Ser을 포함하는 링커, BC3 경쇄 가변 영역, 돌연변이된 IgG1 힌지 영역(SCC-P), L234, L235, 237 및 N297 위치에서 4개의 알라닌 치환을 갖고 G236 위치에서 결실[즉, LLGG(234-237)AAA]을 갖는 인간 IgG1의 CH2 영역, 및 인간 IgG1의 CH3 영역을 포함한다.
BC3-G2 AA N297A(또한 "BC3 IgG2AA"로 언급됨)(서열 번호: 82)는 이의 아미노 말단으로부터 카복실 말단까지: BC3 중쇄 가변 영역, 일렬로 연결된 3개의 (Gly)4-Ser을 포함하는 링커, BC3 경쇄 가변 영역, 돌연변이된 IgG1 힌지 영역(SCC-P), V234, G236 및 N297 위치에서 3개의 알라닌 치환을 갖는 인간 IgG2의 CH2 영역, 및 인간 IgG2의 CH3 영역을 포함한다.
BC3-G4 AA N297A(또한 "BC3 IgG4AA"로서 언급됨)(서열 번호: 83)는 이의 아미노 말단으로부터 카복실 말단까지: BC3 중쇄 가변 영역, 일렬로 연결된 3개의 (Gly)4-Ser을 포함하는 링커, BC3 경쇄 가변 영역, 돌연변이된 IgG1 힌지 영역 (SCC-P), F234, L235, G237 및 N297 위치에서 4개의 알라닌 치환을 갖고 G236 위치에서 결실[즉, FLGG(234-237)AAA]을 갖는 인간 IgG4의 CH2 영역, 및 인간 IgG4의 CH3 영역을 포함한다.
OKT3(또한 OKT3 mAb 또는 OKT3 FL로서 언급됨)은 유사분열촉진성 마우스 항-인간 CD3εIgG2a mAb[참조: Ortho Multicencer Transplant Study Group, N. Engl . J. Med. 313: 337, 1985]이다.
OKT3-HM1(또한 "OKT3 HM1"로서 언급됨)(서열 번호: 92)은 이의 아미노-말단으로부터 카복실-말단까지: OKT3 중쇄 가변 영역, 일렬로 연결된 적어도 3개의 (Gly)4-Ser을 포함하는 링커, OKT3 경쇄 가변 영역, 야생형 인간 IgG1 힌지 영역, 인간 IgM로부터의 CH3 영역, 및 인간 IgG1으로부터의 CH3 영역, 및 FLAG 에피토프의 3개의 카피, AVI 태그의 1개의 카피, 및 6개의 히스티딘을 포함하는 테일 서열을 포함한다.
OKT3-△CH2(또한 "OKT △CH2"로서 언급됨)(서열 번호: 93)는 이의 아미노-말단으로부터 카복실-말단까지: OKT3 중쇄 가변 영역, 일렬로 연결된 적어도 3개의 (Gly)4-Ser을 포함하는 링커, OKT3 경쇄 가변 영역, 야생형 IgG1 힌지 영역, 인간 IgG1의 CH3 영역, 및 FLAG 에피토프의 3개 카피, AVI 태그의 1개 카피, 및 6개의 히스티딘을 포함하는 추가의 테일 서열을 포함한다.
OKT3-G1 N297A(또한 "OKT N297A"로서 언급됨)(서열 번호: 88)는 이의 아미노-말단으로부터 카복실-말단까지: OKT3 중쇄 가변 영역, 일렬로 연결된 3개의 (Gly)4-Ser을 포함하는 링커, OKT3 경쇄 가변 영역, 돌연변이된 IgG1 힌지 영역(SCC-P), 297번 위치에서 알라닌 치환을 갖는 인간 IgG1의 CH2 영역, 및 인간 IgG1의 CH3 영역을 포함한다.
OKT3-G1 AA N297A(또한 "OKT3 IgG1AA"로서 언급됨)(서열 번호: 89)는 이의 아미노 말단으로부터 카복실 말단까지: 인간 2H7 리더 서열로 부터 기원한 리더 서열, OKT3 중쇄 가변 영역, 일렬로 연결된 3개의 (Gly)4-Ser을 포함하는 링커, OKT3 경쇄 가변 영역, 돌연변이된 IgG1 힌지 영역(SCC-P), L234, L235, G237 및 N297 위치에서 4개의 알라닌 치환을 갖고 G236 위치에서 결실[즉, LLGG(234-237)AAA]을 갖는 인간 IgG1의 CH2 영역, 및 인간 IgG1의 CH3 영역을 포함한다.
OKT3-G2 AA N297A(또한 "OKT3 IgG2AA"로서 언급됨)(서열 번호: 90)은 이의 아미노 말단으로부터 카복실 말단까지: OKT3 중쇄 가변 영역, 일렬로 연결된 3개의 (Gly)4-Ser을 포함하는 링커, OKT3 경쇄 가변 영역, 돌연변이된 IgG1 힌지 영역(SCC-P), V234, G236 및 N297 위치에서 3개의 알라닌 치환을 갖는 인간 IgG2의 CH2 영역, 및 인간 IgG2의 CH3 영역을 포함한다.
OKT3-G4 AA N297A (또한 "OKT3 IgG4AA"로서 언급됨)(서열 번호: 91)는 이의 아미노 말단으로부터 카복실 말단까지: OKT3 중쇄 가변 영역, 일렬로 연결된 3개의 (Gly)4-Ser를 포함하는 링커, OKT3 경쇄 가변 영역, 돌연변이된 IgG1 힌지 영역 (SCC-P), F234, L235, G237 및 N297 위치에서 4개의 알라닌 치환을 갖고 G236 위치에서 결실[즉, FLGG(234-237)AAA]을 갖는 인간 IgG4의 CH2 영역, 및 인간 IgG4의 CH3 영역을 포함한다.
또한 OKT3 IgG4-N297A(즉, 단지 N297A 치환을 갖는 인간 IgG4의 CH2 영역, 또한 OKT3 IgG4-WT-N297A 또는 OKT3 IgG4-FLGG-N297A로서 공지됨; 서열 번호: 232, 당해 서열은 성숙한 융합 단백질의 부분이 아닌 22 아미노산 리더 서열을 포함한다)를 제조하고 시험하였다. 또한 4개의 위치(F234, L235, G236 및 G237)의 각각에서 단일의 알라닌 치환 돌연변이를 N297A 치환과 함께 제조하였다(즉, 각각 서열 번호: 234, 236, 238, 및 240에 상응하는 OKT3 IgG4-ALGG-N297A, OKT3 IgG4-FAGG-N297A, OKT3 IgG4-FLAG-N297A, 및 OKT3 IgG4-FLGA-N297A - 이들은 또한 성숙한 융합 단백질의 부분이 아닌 22 아미노산 리더 서열을 포함한다).
OKT3 ala-ala(또한 OKT3 AA-FL 또는 OKT3 FL로서 언급됨)는 234 및 235 위치에서 알라닌 치환을 함유하는 인간화된, Fc 돌연변이된 항-CD3 mAb이다[참조: Herold et al. (2003) J. Clin. Invest. 11(3): 409-18].
비실리주마브(또한 "Nuvion FL"로서 언급됨)은 TCR의 CD3ε 쇄에 대해 지시된 인간화된, Fc 돌연변이된 항-CD3 mAb이다. 이는 인간 IgG2 동형이며 234 및 237번 위치에서 돌연변이를 함유한다(참조: Carpenter et al., Blood 99: 2712-9, 2002).
H57-457 mAb는 햄스터 항-TCR 모노클로날 항체이다. 이는 유사분열촉진성이며 OKT3 모노클로날 항체와 유사하게 작용한다[참조: Lavasani et al. (2007) Scandinavi Journal of Immunology 65:39]. H57-457 mAb의 VH 및 VL 영역은 서열 번호: 49 및 51에 서술되어 있다.
H57 half null(서열 번호: 304)은 H57 결합 도메인을 갖고 N297A 치환 외에도 ADCC 활성의 손실을 유발하는 CH2내 돌연변이를 갖는 마우스 IgG2a 일본쇄 융합 단백질이다. 이는 이의 아미노 말단으로부터 카복시 말단까지: H57 중쇄 가변 영역, 일렬로 연결된 3개의 (Gly)4-Ser을 포함하는 링커, H57 경쇄 가변 영역, 야생형 마우스 IGHG2c 힌지 영역, L234, L235, G237, 및 N297 위치에서 4개의 알라닌 치환을 갖고 마우스 IGHG2c의 CH3 영역을 갖는 마우스 IGHG2c의 CH2 영역을 포함한다.
H57 HM2(서열 번호: 306)는 이의 아미노 말단으로부터 카복시 말단까지: H57 중쇄 가변 영역, 일렬로 연결된 3개의 (Gly)4-Ser을 포함하는 링커, H57 경쇄 가변 영역, 야생형 마우스 IGHG2c 힌지 영역, 마우스 CH3 영역, 및 마우스 CH3 영역을 포함하는 마우스 일본쇄 융합 단백질이다.
H57 Null2(서열 번호: 96)는 H57 결합 도메인을 갖고 ADCC 및 CDC 활성의 손실을 유발하는 CH2 내 돌연변이를 갖는 마우스 IgG2a 일본쇄 융합 단백질이다. 이는 이의 아미노 말단으로부터 카복시 말단가지: H57 중쇄 가변 영역, 일렬로 연결된 3개의 (Gly)4-Ser을 포함하는 링커, H57 경쇄 가변 영역, 야생형 마우스 IGHG2c 힌지 영역, L234, L235, G237, E318, K320, 및 K322 위치에서 6개의 알라닌 치환을 갖는 마우스 IGHG2c의 CH2 영역, 및 마우스 IGHG2c의 CH3 영역을 포함한다.
145-2C11 mAb(또한 2C11 mAb로서 언급됨)는 쥐 TCR 복합체의 CD3ε 쇄에 대한 햄스터 모노클로날 항체이다(참조: Hirsch et al., J. Immunol. 140: 3766, 1988). 이는 또한 유사분열촉진성이고 OKT3 모노클로날 항체와 유사하게 작용한다. 145-2C11 mAb의 VH 및 VL 영역의 서열은 서열 번호: 58 및 60으로 서술되어 있다.
2C11 Null2(서열 번호: 56)은 2C11 결합 도메인을 갖고 ADCC 및 CDC 활성의 손실을 유발하는 CH2내 돌연변이를 갖는 마우스 IgG2a 일본쇄 융합 단백질이다. 이는 이의 아미노 말단으로부터 카복시 말단까지: 2C11 중쇄 가변 영역, 일렬로 연결된 3개의 (Gly)4-Ser를 포함하는 링커, 2C11 경쇄 가변 영역, 야생형 마우스 IGHG2c 힌지 영역, L234, L235, G237, E318, K320, 및 K322 위치에서 6개의 알라닌 치환을 갖는 마우스 IGHG2c의 CH2 영역, 및 마우스 IGHG2c의 CH3 영역을 포함한다.
실시예 1
융합 단백질은 프라임된 T 세포를 활성화하지 않거나 프라임된 T 세포 또는 보조 세포에 의한 사이토킨 방출을 유도하지 않는다.
인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 분리
신선한 인간 전혈을 헤파린(25 mL 이하의 혈액/주사기)을 함유하는 30 mL의 주사기 속에 수득하고 가공하기 전 2시간까지 실온에서 유지시켰다. 혈액을 50 mL의 원추형 튜브 속에 동일한 용적의 RPMI-1640(보충물 없음)으로 실온에서 희석시켰다. 희석된 혈액을 약하게 역전시켜 2 및 3회 혼합하였다. 25 mL의 피펫을 사용하여, 20 내지 25 mL의 희석된 혈액을 50 mL의 원추형 튜브 속에 함유된 15 mL의 림프세포 분리 매질[제조원: 엠피 바이오메디칼스(MP Biomedicals)] 위에서 조심스럽게 층화하였다. 튜브를 400g에서 30분 동안 실온에서 원심분리하였다. 세포를 밀도 구배의 계면으로부터 수집하고 50 mL의 원추형 튜브 속에서 튜브당 30 mL이하의 세포 현탁액과 합하였다. 세포 현탁액을 함유하는 튜브를 10% FBS, 100 U/mL의 페니실린, 100 ㎍/mL의 스트렙토마이신, 및 2 mM L-글루타민(완전 RPMI-1640)을 함유하는 RPMI-1640으로 충전시켰다. 튜브를 1500 rpm에서 5분 동안 실온에서 원심분리하고 상층액을 흡인하였다. 세포를 20 mL의 완전 RPMI 속에 재현탁시키고, 1500 rpm에서 5분 동안 실온에서 원심분리함으로써 2회 세척하였다. 세척된 세포를 혈구계로 계수하고 이들이 사용된 검정 프로토콜에 따라 재현탁시켰다.
카복시플루오레세인 석신이미딜 에스테르( CFSE )를 사용한 인간 PBMC의 표지화
마우스 비장세포의 밀도를 멸균 PBS 속에서 1x106/mL로 조절하였다. 세포를 50 mL의 원추형 튜브 속에 튜브당 25 mL(25 x 106 세포) 이하로 분배시켰다. 세포를 사용하기 위해 조건을 최적화한 후, CELLTRACETM CFSE 세포 증식 키트[제조원: 몰레큘러 프로브스(Molecular Probes)]를 사용하여 CFSE로 표지하였다. 조직 배양 등급 DMSO중 CFSE의 5　mM의 용액을 18　μL의 고 등급 DMSO(키트의 성분 B)를 50㎍의 동결건조된 CFSE(키트의 성분 A)를 함유하는 바이알에 가함으로써 사용 직전에 제조하였다. CFSE 용액을 PBMC 세포 현탁액에 50　nM CFSE의 최종 농도로 가한 후, 세포 현탁액을 37℃에서 5% CO2 속에 15분 동안 항온처리하였다. 세포 표지화 반응을 튜브에 RPMI 완전 배지(10% FBS, 100 U/mL 페니실린, 100 ㎍/mL 스트렙토마이신, 및 2 mM L-글루타민을 함유하는 RPMI-1640)를 충전시켜 퀀칭(quenching)시켰다. 세포를 1500　rpm에서 7분 동안 실온에서 회전시켰다. 상층액을 각각의 튜브로부터 흡인시키고 세포를 RPMI 완전배지에 재현탁시켰다. 세포를 계수하고 RPMI 완전 배지 속에서 검정에 사용하기 위한 바람직한 밀도로 조절하였다.
PHA-프라임된 T 세포를 사용한 유사분열촉진성 및 사이토킨 방출의 분석
인간 PBMC를 2x106 세포/mL의 농도에서 완전 RPMI 배지(10% 인간 AB 혈청, 100　U/mL의 페니실린, 100 ㎍/mL의 스트렙토마이신, 및 2 mM의 L-글루타민을 함유하는 RPMI-1640) 속에 현탁시키고 2.5㎍/mL의 PHA[제조원: 시그마(Sigma)]로 37℃에서 3일 동안 자극하였다. 항온처리한 후, 세포를 완전 RPMI로 2회 세척하고 약 2x106 세포/mL의 농도에서 새로운 플라스크 속에 자극없이 재-플레이팅하였다. 이후에, 세포를 37℃에서 추가로 4일 동안 두어, T 세포가 제2 자극에 노출되기 전에 휴식하도록 하였다. 4일의 휴식 기간의 말기에, 세포를 수거하고, PBS로 세척하고, 앞서 기술한 바와 같이 CFSE로 표지화하였다. 표지화한 후, 세포를 2x106 세포/ml의 농도로 완전(인간 혈청) RPMI(10% 인간 AB 혈청, 100 U/mL의 페니실린, 100 ㎍/mL의 스트렙토마이신, 및 2 mM의 L-글루타민을 함유하는 RPMI-1640) 배지속에 현탁시켰다. 이때, 신선한 PBMC를 동일한 공여체로부터 분리하여 재자극용 보조 세포로서 사용하였다. 보조 세포를 제조하기 위해, T 세포를 PBMC 집단으로부터 EasySep 기술[제조원: 스템 셀 테크놀로지즈(Stem Cell Technologies) 제품 번호 18051]를 사용하여 자기적으로 분리하였다. 덱스트란 및 CD3에 대해 지시된 항체의 칵테일과 함께 자기성 나노입자를 새로이 분리한 PBMC와 함께 제조업자의 프로토콜에 따라 항온처리하였다. 이후에, 세포 및 비드 혼합물을 EasySep Purple magnet이 들어있는 제1 튜브 속에 5분 동안 둔 후, 세포 현탁액을 제2의 5　mL의 FACS 튜브 속에 부었다. CD3+ 세포(T 세포)를 제1 튜브 속에 유지시키는 한편, 보조 세포를 제2 튜브로 이동시켰다. 음성적으로 선택된 보조 세포를 미토마이신 C(MMC, 하기 기술한 바와 같음)로 처리하여 증식을 억제하였다. CFSE-표지된 PHA 모세포 및 MMC 처리된 보조 세포 둘다를 완전(인간 AB 혈청) RPMI 배지 속에 2x106 세포/mL에서 현탁시켰다. 각각의 세포 집단을 48-웰 조직 배양 플레이트(0.5 mL/웰)에, 위에서 나타낸 처리물과 함께 가하였다. 세포를 추가로 4일 동안 37℃에서 항온처리하고 50μL의 상층액을 자극 후 24시간 동안 수거하였다. 세포 및 나머지 상층액을 재자극 후 4일째에 수거하였다. 수거된 세포를 CD5[340697, 제조원: 비디 바이오사이언시즈(BDBiosciences)] CD25(557741, 제조원: 비디 바이오사이언시즈) 및 7AAD(559925, 제조원: 비디 바이오사이언시즈)에 대해 형광성 표지된 항체로 염색하고 유동 세포계산기[LSRII, 제조원: 벡톤 디킨슨(Becton Dickenson)]을 통해 이동시켰다. 데이타를 FlowJo 유동 세포계산기 소프트웨어[제조원: 트리스타(TreeStar)]를 사용하여 분석하였다. 게이팅 전략(gating strategy)은 다음과 같다: 진행 스캐터(FSC)내에 속한 세포 : 측면 스캐터(SSC) 림프세포 게이트를 7AAD 발현에 대해 분석하였다. 이후에, 7AAD 음성 게이트에 속한 세포를 CD5 발현에 대해 분석한 후, CD5+ 게이트에 있는 세포를 CFSE 희석 및 CD25 상향조절에 대해 분석하였다. CD5+, CFSElo 및 CD25hi에 있는 세포를 활성화된 T 세포로 고려하였다. 상층액 시료를 사이토킨 및 케모킨의 존재에 대해 커스텀(custom) 11-plex Luminex-계 검출 키트[제조원: 밀리포어(Millipore)(밀리포어 시리즈)]를 제조업자의 프로토콜에 따라 분석하였다. 키트에 의해 검출된 11개 분석물은 IL-β, IL-1RA, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-17, IP-10, MCP1, IFNγ, 및 TNFα이었다.
도 1은, OKT3 IgG2AA, OKT3 IgG4AA, 및 OKT3 HM1 융합 단백질이 공지된 항체 비실리주마브 및 OKT3 ala-ala와 비교한 것으로서 PHA-프라임된 T 세포를 활성화시키지 않았음을 나타낸다. 유사한 데이타가 BC3 결합 도메인을 함유하는 분자로 생성되었다.
표 1은, OKT3 IgG2AA, OKT3 IgG4AA 및 OKT3 HM1 융합 단백질이, 공지된 항체 비실리주마브 및 OKT3 ala-ala와는 대조적으로, 프라임된 T 세포 또는 보조 세포에 의해 사이토킨 방출을 유도하지 않았음을 나타낸다.
Figure pat00001
실시예 2
융합 단백질은 동종항원에 대한 T 세포 반응을 차단한다.
인간 혼합된 림프세포 반응(MLR)
2명의 공여체로부터의 인간 PBMC를 앞서 기술한 바와 같이 분리하고 별도로 유지시켰다. 앞서의 연구를 기초로 하여, 1명의 공여체로부터의 PBMC는 자극인자가 되도록 슬레이트(slate)하고 제2 공여체에 대한 PBMC를 반응인자 집단으로 사용하였다. 공여체 둘다로부터의 세포를 앞서 기술한 바와 같이 CFSE로 표지하였다. 자극인자로서 사용될 공여체로부터의 PBMC를 미토마이신 C(MMC)로 처리하여 세포 분열을 방지하였다. MMC[제조원: 시그마(Sigma)]를 완전(HS) RPMI 배지(10% 인간 AB 혈청, 100 U/mL의 페니실린, 100 ㎍/mL의 스트렙토마이신, 및 2 mM의 L-글루타민을 함유하는 RPMI-1640) 속에 0.5 mg/mL의 농도로 재현탁시켰다. PBMC를 약 1x106/mL이 농도에서 재현탁시키고 MMC를 25㎍/mL의 최종 농도로 가하였다. 이어서, 세포 및 MMC 혼합물을 37℃에서 30분 동안 항온처리한 후 세포를 완전(HS) RPMI 배지로 3회 세척하였다. 제조된 자극인자 및 반응인자 세포를 약 2x106/mL의 농도로 완전(인간 AB 혈청) RPMI(10% 인간 AB 혈청, 100 U/mL의 페니실린, 100㎍/mL의 스트렙토마이신, 및 2 mM의 L-글루타민을 함유하는 RPMI-1640) 속에 현탁시키고 0.25 mL의 각각의 세포 집단을 48-웰 플레이트의 웰당 가하였다. 모든 처리물을 플레이트에 세포와 동시에(도 2, 3, 및 17에 나타낸 농도에서; 제공된 농도는 항체에 대한 것이며 몰 당량 농도가 도 17에 나타낸 바와 같이 융합 단백질에 대해 사용되었음에 주목한다) 가한 후 시료를 37℃에서 실험 동안 항온처리하였다. 실험물을 셋팅한 후 7 및 8일째에 수거하였다. 수거된 세포를 CD5(340697, 제조원: 비디 바이오사이언시즈), CD25(555433, 제조원: 비디 바이오사이언시즈), 및 7AAD (559925, 제조원: 비디 바이오사이언시즈)에 대해 형광 태그된 항체로 염색하고, 유동 세포계산기(LSRII, 제조원: 벡톤 디킨슨) 상에서 이동시켰다. 데이타를 FlowJo 유동 세포계산기 소프트웨어(제조원: 트리스타)를 사용하여 분석하였다. 게이팅 전략은 다음과 같았다: FSC:SSC 림프세포 게이트내에 속한 세포를 7AAD 발현에 대해 분석하였다. 이후에, 음성 7AAD 게이트내에 속한 세포를 CD5+ 발현에 대해 분석한 후, CD5+인 세포를 CFSE 희석 및 CD25 상향조절에 대해 분석하였다. CD5+, CFSElo 및 CD25hi에 있던 세포를 활성화된 T 세포로 고려하였다.
도 2는, BC3 IgG2AA 및 BC3 IgG4AA 융합 단백질이 공지된 BC3 mAB보다 우수하게 및 OKT3 ala-ala 항체와는 대조적으로 동종항원에 대한 T 세포 반응을 차단하였다. 유사한 데이타를 OKT3 결합 도메인을 발현하는 분자를 사용하여 생성시켰다.
도 3은, BC3 HM1 및 BC3 △CH2 융합 단백질이 또한 동종항원에 대한 T 세포 반응을 차단하였음을 나타낸다. 유사한 데이타를 OKT3 결합 도메인을 발현하는 분자를 사용하여 생성시켰다.
도 17은 부분적으로 정제된 Cris-7 IgG1-N297A(50%는 목적한 피크이다)가 동종항원에 대한 T 세포 반응을 효과적으로 차단하였음을 나타낸다.
실시예 3
융합 단백질은 기억 T 세포 반응을 차단하여 항원을 회복한다.
인간 PBMC를 테타누스 독소에 대한 반응성에 대한 앞서의 스크리닝에서 양성으로 기록된 공여체로부터 분리하였다. PBMC를 앞서 기술한 바와 같이 CFSE로 표지한 후 2x106/mL의 농도에서 완전(인간 AB 혈청) RPMI(10% 인간 AB 혈청, 100 U/mL 페니실린, 100㎍/mL의 스트렙토마이신, 및 2 mM의 L-글루타민을 함유하는 RPMI-1640) 속에 재현탁시켰다. 0.5 mL의 CFSE-표지된 세포 및 1㎍/mL의 테타누스 독소(EMD)를 실험 처리물과 함께 48-웰 플레이트에 가하였다. 세포를 37℃에서 5% CO2와 함께 실험 과정 동안 항온처리하였다. 실험물을 셋팅한 후 8일째에 수거하였다. 수거된 세포를 CD5(340697, 제조원: 비디 바이오사이언시즈) 및 CD25(555433, 제조원: 비디 바이오사이언시즈)에 대해 형광 태그된 항체로 염색하고 유동 세포계산기(LSRII, 제조원: 벡톤 디킨슨) 상에서 이동시켰다. 데이타를 FlowJo 유동 세포계산기 소프트웨어(제조원: 트리스타)를 사용하여 분석하였다. 게이팅 전략은 다음과 같다: FSC:SSC 림프세포 게이트내에 속한 세포를 CD5 발현에 대해 분석하였다; 이후에, CD5+ 게이트내에 후속적으로 속한 세포를 CFSE 희석 및 CD25 상향조절에 대해 분석하였다. CD5+, CFSElo 및 CD25hi에 있던 세포를 활성화된 T 세포로 고려하였다.
도 4는, BC3 IgG2AA, BC3 IgG4 AA 및 BC3 HM1 융합 단백질이 회복 항원, 테타누스 독소에 대한 기억 T 세포 반응을 차단할 수 있음을 나타낸다. 유사한 데이타를 OKT3 결합 도메인을 포함하는 융합 단백질을 사용하여 생성시켰다.
실시예 4
융합 단백질은 세포 표면 TCR 및 CD3의 하향조절을 유도한다.
인간 PBMC를 실시예 1에 기술된 바와 같이 분리하고 약 2x106 세포/mL의 농도에서 현탁하였다. PBMC의 일부를 즉시 세포 표면 염색을 위해 옆에 두고, 나머지 PBMC를 각종의 항-CD3 시약과 함께 분석 전 4일 동안 항온처리하였다. 즉시 염색되는 PBMC를 빙상에서 30분 동안 냉각시킨 후, 이를 1500rpm에서 10분 동안 4℃에서 회전시키고 수득되는 상층액을 제거하였다. 세포를 빙냉 FACS 완충액(dPBS, 2.5% FBS) 속에 1x106/mL의 농도로 현탁시켰다. 1mL의 세포를 분석될 각각의 시약에 대한 5mL의 FACS 튜브[제조원: 비디 팔콘(BD Falcon)]내로 이전시켰다. 추가로 1mL의 빙냉 FACS 완충액을 1mL 분취량의 세포에 가한 후 당해 세포를 1500 rpm에서 5분 동안 4℃에서 회전시켰다. 튜브를 거꾸로 두고 상층액을 부어 대략 0.1 mL의 FACS 완충액이 튜브 속에 세포 펠렛과 함께 남도록 한 후 튜브를 빙상에 두었다. 염색 항체(90μL의 빙냉 FACS 완충액, 5μL의 항-CD5 항체[제조원: 이바이오사이언스(eBioscience)], 및 5μL의 항-TCR 항체(제조원: 비디 바이오사이언시즈)를 제조하여 분리한 직후 시료를 분석하였다. 마스타 스톡(100μL)을 각각의 FACS 튜브에 1㎍/mL, 0.5㎍/mL, 또는 0.1㎍/mL의 CD3-지시된 융합 단백질 또는 모노클로날 항체(제공된 농도는 항체에 대한 것이며 몰 당량 농도가 융합 단백질에 대해 사용되었음을 주목한다)와 함께 가하였다. 이후에, 시료를 빙상에서, 암실 속에서 30분 동안 항온처리하였다. 항온처리 기간 후, 시료를 2 mL의 빙냉 FACS 완충액으로 2회 세척하고 CD3-지시된 시약에 대해 특이적인 PE-표지된 제2 항체를 1:400의 최종 희석비로 가하였다. 이후에, 시료를 빙상에서, 암실 속에서 30분 동안 항온처리한 후, 2 mL의 빙냉 FACS 완충액으로 2회 세척하였다. 염색 수준은 LSRII 유동 세포계산기(제조원: 벡톤 디킨슨) 상에서 측정하였다.
PBMC를 4일 동안 처리한 후 염색된 세포 표면을 0.5mL의 분취량/웰(세포 농도는 완전(인간 AB 혈청) RPMI 배지 속에서 약 2x106 세포/mL이었다)로 48-웰 플레이트 속에 플레이팅하였다. CD3-지시된 시약을 세포에 1, 0.5 및 0.1㎍/mL(제공된 농도는 항체에 대한 것이고 등몰 농도는 융합 단백질에 대해 사용되었음에 주목한다)에서 가하고 세포를 37℃에서 2 내지 4일 동안 항온처리하였다. 항온처리한 후, 세포를 수거하고 위에서 기술한 바와 같이 염색하였다.
상기 결과(도 5A, 5B, 6A 및 6B)는, OKT3 결합 도메인을 포함하는 융합 단백질이 T 세포의 표면으로부터 TCR 및 CD3 둘다의 하향조절을 유도한 반면, OKT3 모노클로날 항체 만이 TCR을 하향조절하고 CD3는 하향조절하지 않았음을 나타낸다. 유사한 결과가 BC3 결합 도메인을 포함하는 융합 단백질을 사용하여 수득되었다.
도 18은, Cris-7 IgG1-N297A 융합 단백질이 T 세포 표면으로부터 TCR 및 CD3 둘다의 하향조절을 유도한 반면, Cris-7 모노클로날 항체만이 TCR을 하향조절함을 나타낸다. 유사한 결과가 Cris-7 IgG2-AA-N297A, Cris-7 IgG4-AA-N297A, 및 Cris-7 HM1을 사용하여 수득되었다.
실시예 5
융합 단백질은 T 세포에서 강력한 칼슘 유동을 유도한다.
인간 PBMC를 앞서 기술한 바와 같이 분리하였다. 비-T 세포를 T 세포로부터 MACS 기술[공급원: 밀테나이(Miltenyi)]을 사용하여 자기적으로 분리하였다. 훼손되지 않은 T 세포를 Pan T 세포 분리 키트 II(제조원: 밀테나이)를 사용하여 분리하였다. T 세포를 제조업자의 프로토콜에 따라 새로이 분리된 PBMC와 함께 항온처리하는 것을 제외하고는, 초자기 비드를 PBMC의 모든 세포 소세트에 대해 지시된 항체의 패널로 피복시켰다. 이후에, 세포 및 비드 혼합물을 MACS 분리기(제조원; 밀테나이) 속의 강력하고 영구적인 자석 속에 두는 경우 자기장을 형성하는 매트릭스를 함유하는 컬럼에 적용시켰다. T 세포는 컬럼을 통과해 유동한 반면, 모든 다른 세포는 컬럼내에 보유되었다. T 세포 순도는 일반적으로 87 내지 93%이었다. 정제된 세포를 완전 RPMI(RPMI-1640, 10% 인간 AB 혈청, 2mM L-글루타민, 피루브산나트륨, 비-필수 아미노산, 페니실린/스트렙토마이신) 속에 약 2x106 세포/mL의 농도에서 현탁시키고 37℃에서 적절한 크기의 플라스크 속에서 밤새 항온처리하였다. 다음날 아침, 100μl의 세포 (200,000 세포)를 96-웰의, 검은, 폴리-D 라이신 플레이트로 이전시키고 37℃에서 3시간 동안 항온처리하였다. 당해 항온처리 시간 동안, 칼슘 유동 지시인자 염료를 제조업자의 지시(Molecular Devices FLIPR 칼슘 4 검정)에 따라 제조하였다. 또한, 실험적 처리물을 U-바닥 플레이트 속에서 제조하였다. 세포 처리물을 5x 농도에서 처리 플레이트 속에서 75μL의 용적으로 제조하였다. 모든 처리물(융합 단백질 및 교차-링커)를 3회 시험하였다. 100μL의 지시인자 염료를 세포에 플레이트를 판독하기 1시간 전에 가하였다. 지시인자 염료를 첨가한 후, 플레이트를 추가로 45분 동안 항온처리기 속에 다시 두었다. 이후에, 플레이트를 1200 rpm에서 5분 동안 실온에서 회전시킨 후 항온처리기에 추가로 15분 동안 다시 두었다. 당해 항온처리 기간의 말기에, 처리 플레이트 및 세포 플레이트를 FlexStation 3[제조원: 몰레큘러 디바이스(Molecular Devices)], 통합된 유체 이전기가 장착된 벤치톱(benchtop) 플레이트 판독기내로 로딩하였다. Flexstation은 세포 플레이트에 50μL의 처리물을 자동기계장치로 가한 후 칼슘 지시인자 염료로부터 수득되는 형광성을 750초의 기간에 걸쳐 매 7초마다 기록하였다. 이후에, 확보된 데이타를 분석을 위해 엑셀[공급원: 마이크로소프트 오피스(Microsoft Office)]에 보냈다.
상기 결과(도 7)는, 동일한 결합 도메인을 갖는 항체와는 대조적으로, 본 기재내용의 일본쇄 융합 단백질이 교차-결합인자(즉, 항-IgG 항체와 같은 2개 이상의 SMIP 분자에 결합하는 분자)의 부재하에서, T 세포내 풍부한 칼슘 유동을 유도함을 나타낸다. 유사한 결과가 BC3 결합 도메인을 발현하는 분자 포맷을 사용하고, 프라임된 T 세포를 사용하는 경우 수득되었다.
도 19는, BC3 결합 도메인을 갖는 일본쇄 융합 단백질에 의해 유발된 칼슘 유동의 수준에 있어서 상이한 힌지의 효과를 나타낸다. 당해 경우에, 융합 단백질 및 대조군을 20초에 가하고 교차-링커를 600초에 가하였다. 가장 짧은 힌지(링커 122, IgA2 힌지로부터 기원)를 갖는 융합 단백질은 가장 큰 칼슘 유동을 유발한 반면, 보다 긴 힌지(링커 115 및 116, 각각 IgE CH2 및 UBA로 부터 기원)를 갖는 융합 단백질은 보다 낮은 수준의 칼슘 유동을 유도하였다. 그러나, 모든 경우에서 BC3 결합 도메인을 갖는 일본쇄 융합 단백질은 항체보다 칼슘 유동에 있어 보다 큰 증가를 유발하였다. 따라서, 힌지는 요구되는 칼슘 유동을 조절하기 위해 조절될 수 있다.
실시예 6
항-마우스 TCR/CD3 분자의 시험관내 평가
마우스 비장세포의 분리
무균 조건하에서, 비장을 제거하고 지방 및 조직의 큰 조각을 제거하였다. 조직 배양 후드(hood) 속에서, 비장을 5mL의 멸균 1xPBS가 들어있는 작은 디쉬(dish)내에 위치시킨 후 2개의 단일-면의 반투명 유리 슬라이드 사이에서 분쇄하였다. 이 과정 동안에, 슬라이드는 페트리 디쉬 위에 일정한 각도로 유지시켜 세포 및 체액이 디쉬 내로 다시 들어가도록 하였다. 비장 캡슐이 모든 적색을 잃어버린 경우 당해 단계를 완료하였다. 페트리 디쉬 내의 세포 현탁액을 15 mL의 원뿔 튜브로 이전시키고 와동시켜 세포의 덩어리를 파괴하였다. 이후에, 튜브를 추가로 12 mL의 멸균 1xPBS로 충전하고, 상부에 두어 내용물이 5분 동안 고정되도록 하였다. 상층액을 제2의 15 mL의 원뿔 튜브로 이전시켜, 침전된 파편이 제1 튜브내에 흐트러지지 않도록 두었다. 이후에, 세포를 1500 rpm에서 5분 동안 실온에서 수거하였다. 상층액을 제거하고 세포 펠렛을 4 mL의 ACK 적혈구 세포 용해 완충액[제조원: 퀄리티 바이올로직스(Quality Biologics), 제품 번호 118-156-101] 속에 현탁시키고 실온에서 5분 동안 항온처리하였다. 이어서, 원뿔 튜브를 RPMI 완전 배지(10% FBS, 100 U/mL 페니실린, 100 ㎍/mL 스트렙토마이신, 및 2 mM L-글루타민을 함유하는 RPMI-1640)으로 충전시켰다. 세포 현탁액을 세포 염색기를 통해 여과하고 다른 15 mL의 원뿔 튜브로 이전시켰다. 세포를 완전 RPMI으로 3회 세척한 후 혈구계를 사용하여 계수하였다.
카복시플루오레세신 석신이미딜 에스테르( CFSE )를 사용한 마우스 비장세포의 표지화
마우스 비장세포의 밀도를 멸균 PBS 속에서 1x106/mL로 조절하였다. 세포를 50 mL의 원뿔 튜브 속에 튜브당 25 mL(25 x 106 세포) 이하로 분배하였다. 인간 PBMC 및 마우스 비장세포와 함께 사용하기 위한 조건을 최적화한 후, 세포를 CFSE로 CELLTRACETM CFSE 세포 증식 키트(제조원: 몰레큘러 프로브스, 제품번호:C34554)를 사용하여 표지시켰다. 조직 배양 등급 DMSO 중의 CFSE의 5　mM 용액을 18μL의　고 등급 DMSO(키트의 성분 B)를 50㎍의 동결건조된 CFSE(키트의 성분 A)를 함유하는 바이알에 가함으로써 사용 직전에 제조하였다. CFSE는 광 민감성이므로, 시약 제조 및 후속적인 세포 표지화 과정 동안 주의를 기울여 시약을 광으로부터 보호하였다. CFSE 용액을 PBMC 세포 현탁액에 50　nM CFSE의 최종 농도로 가하였다. 튜브의 캡을 세포 현탁액을 함유하는 튜브 위에 느슨하게 두어 가스 교환이 이루어지도록 하고, 튜브를 37℃, 5% CO2 항온처리기 속에서 15분 동안 두었다. 세포 표지 반응은, 혈청이 표지화 반응물을 퀀칭함에 따라, 튜브를 RPMI 완전 배지(10% FBS, 100 U/mL 페니실린, 100 ㎍/mL의 스트렙토마이신, 및 2 mM의 L-글루타민을 함유하는 RPMI-1640)로 충전시켜 퀀칭시켰다. 세포를 1500　rpm에서 7분 동안 실온에서 회전시켰다. 상층액을 각각의 튜브로부터 흡인하고 세포를 RPMI 완전 배지 속에 재현탁시켰다. 세포를 계수하고(도입량의 25% 이하의 손실은 일반적이다) RPMI 완전 배지 속에서 검정시 사용하기에 바람직한 밀도로 조절하였다.
ConA 모세포
비장세포를 앞서 기술한 바와 같이 BALB/c 마우스로부터 분리하고 완전 RPMI 배지(RPMI, 10%FBS, 2mM L-글루타민, 피루브산나트륨, 비-필수 아미노산, 펜/스트렙, 및 1%BME) 속에 2x106 세포/mL의 농도로 현탁시키고 1㎍/mL의 콘카나발린 A(제조원: 시그마)로 3일 동안 자극시켰다. 3일 후, 세포를 완전 RPMI으로 2회 세척하고 4일 동안 자극없이 새로운 플라스크 속에 재-플레이팅하였다. 4일의 휴지기 말기에, 세포를 수거하고 앞서 기술한 바와 같이 CFSE로 표지하였다.
이때, 제2 비장을 분리된 BALB/c 마우스 및 비장세포로부터 수거하였다. 이들 새로이 분리된 비장세포를 실험의 재자극 상 동안 보조 세포로 사용하였다. 보조 세포 집단을 제조하기 위해, T 세포(CD5+ 세포)를 새로운 비장 세포로부터 MACS 기술(공급원: 밀테나이)을 사용하여 분리하였다. 항-CD5 항체로 피복된 초자기 비드(제조원: 밀테나이, 제품 번호 130-049-301)를 새로이 분리한 비장세포와 함께 제조업자의 프로토콜에 따라 항온처리하였다. 이어서, 세포 및 비드 혼합물을 MACS 분리기(제조원: 밀테나이, 제품 번호 130-042-301) 내에 두는 경우 자기장을 형성하는 매트릭스, 강력한 영구 자석을 함유하는 컬럼(제조원: 밀테나이, 제품 번호: 130-042-401)에 적용시켰다. CD5+ 세포(T 세포)는 컬럼내에 보유되고 온전한 보조 세포가 유동통과되었다. 음성적으로 선택된 보조 세포를 미토마이신 C(앞서 기술한 바와 같음)로 처리하여 증식을 억제하였다.
CFSE-표지된 ConA 모세포 및 MMC 처리된 보조 세포 둘다를 완전 배지 속에 2x106/mL에서 재현탁시켰다. 0.5 mL의 각각의 세포 집단을 48-웰 조직 배양 플레이트에 나타낸 처리물과 함께 가하였다. 50μL의 상층액을 자극한 후 24시간째에 수거하고 세포 및 나머지 상층액을 재자극 후 4일째에 수거하였다. 세포를 CD5 (45-0051, 제조원: 이바이오사이언스) 및 CD25(25-0251, 제조원: 이바이오사이언스)에 대한 형광 태그된 항체로 염색하고, 유동 세포계산기(LSRII, 제조원: 벡톤 디킨슨)를 이동시키고 FlowJo 소프트웨어(공급원: 트리스타)로 분석하였다. 게이팅 전략은 다음과 같다: FSC:SSC 림프세포 게이트내에 속한 세포를 CD5 발현에 대해 분석한 후, CD5+ 게이트내에 속한 세포를 CFSE 희석 및 CD25 상향조절에 대해 분석하였다. CD5+, CFSElo 및 CD25hi에 있었던 세포를 활성화된 T 세포로 고려하였다. 상층액 시료를 사이토킨 및 케모킨의 존재에 대해 22 분석물, Linco-plex Luminex-계 검출 키트[제조원: 린코 리서치(Linco Research)]를 제조업자의 프로토콜에 따라 다음의 변형과 함께 분석하였다: 분석물 비드, 검출 항체, 및 스트렙타비딘-PE 스톡 용액을 검정에서 사용하기 전에 1:2로 희석하였다. 키트에 의해 검출된 22개 분석물은 다음과 같다: MIP-1a, GMCSF, MCP-1, KC, RANTES, IFNγ, IL-1B, IL-1a, G-CSF, IP-10, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, TNFα, IL-9, IL-13, IL-15, 및 IL-17.
H57 Null2 또는 2C11 Null2 SMIP를 제외한, H57-457 및 145-2C11 모노클로날 항체 둘다는 ConA-프라임된 T 세포의 사이토킨 방출을 유도하였다. ConA-프라임된 T 세포의 처리에 이은, 예시적인 사이토킨, IFNγ 및 IP-10의 방출 결과는 도 8A 및 8B에 나타낸다. 또한, H57-457 또는 145-2C11 모노클로날 항체를 제외한, H57 Null2(도 9에서 "H57 Mu Null"과 동일) 및 2C11 Null2 SMIP(도 9에서 "2C11 Mu null SMIP"와 동일) 둘다는 항원에 대한 T 세포 반응을 차단하였다(참조: 도 9). 다른 사이토킨의 방출을 측정한 경우 유사한 결과가 수득되었다.
실시예 7
예시적인 항-TCR SMIP의 시험관내 연구
20주령 암컷 BALB/c 마우스[하를란(Harlan)]을 6개 그룹으로 나누고 가쪽 꼬리 정맥(lateral tail vein)을 통해 7.3㎍, 37㎍, 75㎍, 또는 185㎍의 H57 Null2 SMIP, 5㎍(최대 허용가능한 투여량)의 H57 mAb, 250㎍의 IgG2a 동형 대조군(최대 SMIP 투여량의 몰 당량), 또는 200μL의 PBS를 주사하였다. 모든 주사 용적은 200μL이고 모든 주사된 물질은 0.5 EU/mg 이하의 내독성 수준을 가졌다. 그룹당 3마리의 무작위적으로 선택된 마우스를 24 시간째에 종결시키고 그룹당 나머지 3마리의 마우스를 주사 후 3일째인 실험 말기에 종결시켰다. 마우스를 체중 감소 및 증가된 임상 점수 형태의 약물 관련 독성의 임상 증상에 대해 모니터링하였다. 과학자가 평가하는 임상 점수는 각각의 그룹에게 투여된 치료에 대해 맹검이었다. 점수를 다음 요소를 기준으로 지정하였다: 0 = 정상; 1 = 약한 털세움; 2 = 중간의 털세움 및/또는 안구 염증 또는 자극; 3 = 구부린 자세/무기력; 4 = 빈사. 모든 마우스를 주사 후 2시간째에 및 이들의 말기 시점에 방혈하였다. 비장 및 서혜부 림프절을 말기 싯점에서 수거하였다. 혈청 시료를 14-플렉스 루미넥스(plex Luminex)-계 검출 키트[제조원: 밀리포어(Millipore), 밀리플렉스 시리즈]를 사용하여 제조업자의 프로토콜 및 다음 변형에 따라 사이토킨 및 케모킨의 존재에 대해 분석하였다: 분석물 비드, 검출 항체 및 스트렙타비딘-PE 스톡 용액을 검정시 사용 전에 1:2로 희석하였다. 또한, 혈청 시료를 순수하게(추천된 1:2 희석에 비교하여) 이동시켰다. 키트에 의해 검출된 14개 분석물은 다음과 같다: G-CSF, GM-CSF, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-13, IL-17, IP-10, KC, MCP1, IFNγ 및 TNFα. 비장 및 림프절로부터의 세포 현탁액을 SMIP로 피복된 이들 2개의 기관 속에서 T 세포의 비율을 측정하기 위해 CD5에 대한 항체(제조원: 이바이오사이언스, 제품 번호 45-0051) 및 마우스 IgG2a [제조원: 비디 바이오사이언시즈(BDBiosciences), 제품 번호 553390]로 염색하였다.
도 10a는, H57 Null2 SMIP의 정맥내 투여가 체중 감소를 유발하지 않았음을 나타낸다. 도 10b는, 이러한 치료가 임상 점수 어느 것에서도 증가를 유발하지 않았음을 나타낸다. 이들 결과는, 당해 Null2 SMIP가 바람직한 안정성 프로파일을 가짐을 입증한다.
도 11은, H57 Null2 SMIP의 정맥내 투여가 모 항체와는 대조적으로 정상 BALB/c 마우스에서 사이토킨 스톰을 유발하지 않았음을 나타낸다. 14개의 분석물 패널로부터 2개의 대표적인 사이토킨, IL-6 및 IL-4를 나타낸다.
도 12는, H57 Null2 SMIP 피복된 T 세포가 H57 Null2 SMIP 정맥내 투여 후 비장 속에서 검출되었음을 나타낸다.
실시예 8
융합 단백질은 생체내에서 급성 이식체 대 숙주 병을 억제한다.
대리 분자가 급성 이식체 대 숙주병(aGVHD) 마우스 모델에서 효과적인지를 측정하기 위해, 마우스를 예시적인 융합 단백질로 처리한 후 체중 감소, 공여체:숙주 림프세포 비, 및 사이토킨 및 케모킨 생성에 대해 모니터링하였다.
aGVHD를 암컷 C57BL/6xDBA2 F1 마우스[공급원: 타코닉(Taconic)]에서 공여체 암컷 C57BL/6 마우스(공급원: 타코닉)로부터의 비장세포를 이전시킴으로써 유도하였다. 공여체 마우스로부터의 비장을 수집하고 10% FBS를 함유하는 냉 RPMI 속에 침지시켰다. 수집된 비장을 멸균된, 성에가 낀 유리 슬라이드를 사용하여 해부하였다. 상층액을 수집하고, 회전시키고, 세포를 앞서 기술한 바와 같이 세척하였다. 이어서, 세척된 비장세포를 멸균 PBS 속에 65 x 106/200μl의 농도에서 재현탁시켰다. 주사 직전에, 비장세포 혼합물을 100μm의 세포 여과기(cell strainer)[제조원: 비디 팔콘(BD Falcon)]를 통과시켜 세포의 잔해 및 큰 덩어리를 제거하였다. 200μl의 공여체 비장세포 세포 현탁액을 F1 수용체 마우스의 가쪽 꼬리 통맥을 통해 정맥내(IV) 주사하였다. 가쪽 꼬리 정맥을 통한 IV 주사를 위해, 마우스를 열 램프에 약간 노출시키고 플라스틱 마우스 제지기(restrainer) 속에 가두었다. 주사는 27.5 게이지 침을 사용하여 투여하였다. 수용체 마우스는 공여체 세포 전달 후 14일까지 확고한 질병을 가졌으며, 이 시점에 실험을 종결하고 평가하였다. 질병 진행은, 이전된 동물의 비장내 숙주 세포의 공여체 세포-매개된 공격으로 인하여, 체중 손실 및 수반되는 손실과 함께 공여체 세포의 확장과 관련되었다. IFNγ와 같은 혈청 생마커는 또한 질병 진행과 상관관계가 있다.
효능 연구를 위해, 공여체 세포를 위에서 기술한 바와 같은 연구의 0일째(D0)에 F1내로 이전하였다. SMIP, IgG2a 대조군 및 PBS 처리물을 D0, D1, D3, D5, D7, D9, 및 D11에 투여하고 실험물을 D14에 수거하였다. 모든 처리 주사는 공여체 세포 이전 전에 안구뒤 부비동(retro-orbital sinus)을 통해 제공된 D0 주사를 제외하고는 정맥내 투여하였다. 100 μl 용적 또는 100μl의 PBS 중 100㎍의 H57 Null2 SMIP 또는 IgG2a를 주사당 제공한다. 생체내 연구에서 사용된 모든 단백질은 내독소 mg당 0.5 EU 미만이었다. 면역억제체 덱사메타손(DEX; 제조원: 시그마)으로 처리한 마우스에게 복강내 주사(IP)를 통해 10 mg/kg/일을 제공하였다.
실험 과정 동안, 마우스를 매일 칭량하는 시점에서 체중이 감소하기 시작할 때까지 이들을 격일로 칭량하였다. 수용체 마우스에 의한 초기 체중 감소의 비율은 도 13에 도시한다. H57 Null2 SMIP의 투여는 PBS 또는 IgG2a 대조군 처리를 제공받은 마우스와 대조적으로 aGVHD 질병 진행과 관련된 체중 감소를 방지하였다.
마우스를 혈청 생마커 분석을 위해 7일째에 방혈시켰다. 14일째, 말기 시점에, 비장 및 혈액 시료를 각각의 동물로부터 수거하였다. 각각의 비장의 체중 및 총 세포수를 측정하였다. 혈청 시료를 사이토킨 및 케모킨의 존재에 대해 custom 14-plex Luminex-계 검출 키트(제조원: 밀리포어, 밀리플렉스 시리즈)를 사용하여 제조업자의 프로토콜에 따라 사이토킨 및 케모킨의 존재에 대해 분석하였다. 키트에 의해 검출된 14개의 분석물은 G-CSF, GM-CSF, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-13, IL-17, IP-10, KC, MCP1, IFNγ 및 TNFα이었다. 사이토킨 및 케모킨 생산은 G-CSF (도 14a), KC (도 14b) 및 IFNγ(도 14c)을 포함하는 SMIP로 처리된 마우스에서 억제되었다. 이들 결과는, SMIP의 투여가 aGVHD와 관련된 사이토킨 및 케모킨, 특히 IFNγ 생산(이는 대표적으로 병이 있는 aGVHD 마우스에서 7일 째에 고도로 상승한다)과 관련된 사이토킨 및 케모킨 생산을 억제함을 나타내었다. 14일 째에, 비장세포를 앞서 기술한 바와 같이 분리하고 LSRII 유동 세포계산기(제조원: 비디 바이오사이언시즈)를 사용하는 분석을 위해 H-2b(공여체 세포) 및 H2-d(H2b+, H2-d+ 세포는 숙주 기원이었다)에 대한 항체로 염색하였다. H57 Null2 융합 단백질을 제공받은 마우스는 DEX를 제공받은 마우스 및 공여체 세포를 제공받지 않은 음성 대조군 마우스와 유사한 공여체 림프세포:숙주 림프세포 비를 가졌다(도 15). 이들 결과는, 본 기재내용의 융합 단백질이 공여체 림프세포의 확장을 억제함을 나타내며, 이는 PBS 및 IgG2a 대조군 처리를 제공받은 마우스에서 관찰된 aGVHD와 관련된 숙주 림프세포에서의 감소와 일치함을 나타낸다.
이들 생체내 연구는, 본 기재내용의 융합 단백질이 공여체 림프세포 확장, 염증성 사이토킨 및 케모킨 생산, 및 체중 감소에 의해 입증되는 바와 같이, aGVHD의 진행을 억제함을 나타낸다. 유사한 효능이 또한 만성 GVHD 마우스 모델을 사용한 예비 결과에서 발견되었다.
aGVHD의 실험 모델을 또한 완료하여 H57 half null, H57 null2, 및 2C11null2를 평가한다. H57 half null 및 H57 nul12는, 생마커 연구에서 일부 사이토킨의 조기 방출에도 불구하고, 시험한 매개변수에서 유사한 결과로 효과적임이 밝혀졌다. 2C11null2 융합 단백질 또한 효과적이었으며 aGVHD 모델에서 공여체 세포 확장을 방지하는 것으로 밝혀졌다.
실시예 9
IgG4 CH2 영역에서 N297A 및 추가의 단일 알라닌 치환을 갖는 융합 단백질은 동종항원에 대한 T 세포 반응을 차단한다.
인간 MLR 검정을 실시예 2에 기술된 바와 같이 다음 융합 단백질: OKT3 IgG4-WT-N297A (서열 번호: 232), OKT3 IgG4-ALGG-N297A (서열 번호: 234), OKT3 IgG4-FAGG-N297A (서열 번호: 236), OKT3 IgG4-FLAG-N297A (서열 번호: 238), OKT3 IgG4-FLGA-N297A (서열 번호: 240), OKT3 IgG4-AA-N297 (서열 번호: 91), OKT3 FL 및 OKT3 mAb를 사용하여 수행하였다.
도 20은, (a) N297에서 알라닌 치환 만 또는 (b) N297에서 알라닌 치환 및 F234, L235, G236 또는 F237 위치에서 추가의 알라닌 치환을 함유하는 OKT3 IgG4 융합 단백질이 공지된 OKT3 mAb 및 OKT3 ala-ala 항체보다 더 우수하게 동종항원에 대한 T 세포 반응을 차단하였음을 나타낸다.
실시예 10
힌지 영역의 선택에 의해 영향받을 수 있는 MLR 반응
인간 MLR 검정을 실시예 2에 기술된 바와 같이 BC3 IgG1-N297A(서열 번호: 80)로부터 기원하고 각종 길이의 힌지 및 서열: UBA로부터 기원한 링커 125(서열 번호: 329), IgE CH2로부터 유래한 링커 126(서열 번호: 330), IgD 힌지로부터 유래한 링커 127(서열 번호: 331), IgA2 힌지로부터 유래한 링커 128(서열 번호: 332), 및 IgG1 힌지로부터 유래한 링커 129(서열 번호: 333)를 함유하는 융합 단백질을 사용하여 수행하였다. 상기 나타낸 링커를 함유하는 BC3 IgG2-N297A SMIP의 아미노산 서열은 각각 서열 번호: 325, 323, 319, 315, 및 311로 서술되어 있다. 이들 BC3 IgG2-N297A SMIP를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 각각 서열 번호: 324, 322, 318, 314, 및 310으로 서술되어 있다.
도 21은 동종항원에 대한 T 세포 반응을 차단하는데 있어서, BC3 IgG1-N297A 융합 단백질의 능력에 대한 상이한 힌지의 효과를 나타낸다. 보다 짧은 힌지를 가진 융합 단백질은 T 세포 반응을 차단하는데 있어 보다 효과적이었던 것으로 여겨진다. 그러나, 모든 경우에, BC3 결합 도메인을 가진 일본쇄 융합 단백질은 HuIg1 BC3(BC3 mAb의 가변 영역 및 인간 IgG1 불변 영역을 함유하는 항체 분자)보다 동종 항원에 대한 T 세포 반응을 차단하는데 있어 보다 더 효과적이었다.
실시예 11
인간화된 Cris7 융합 단백질의 시험관내 분석
실시예 2에 기술된 바와 같이 수행한 인간 MLR 검정을 각종의 인간화된 Cris7 융합 단백질: 인간화된 Cris7 (VH3-VL1) IgG1-N297A(서열 번호: 290), 인간화된 Cris7(VH3-VL2) IgG1-N297A(서열 번호: 295), 인간화된 Cris7(VH3-VL1) IgG2-AA-N297A(서열 번호: 292), 인간화된 Cris7(VH3-VL2) IgG2-AA-N297A(서열 번호: 297), 인간화된 Cris7(VH3-VL1) IgG4-AA-N297A(서열 번호: 293), 인간화된 Cris7(VH3-VL2) IgG4-AA-N297A(서열 번호: 298), 키메라 Cris7 IgG1-N297A(서열 번호: 265), 인간화된 Cris7(VH3-VL1) HM1(서열 번호: 294), 인간화된 Cris7 (VH3-VL2) HM1(서열 번호: 299), 및 키메라 Cris7 HM1(서열 번호: 269)를 사용하여 수행하였다.
도 22는, 인간화된 Cris7 IgG1-N297A, IgG2-AA-N297A 및 IgG4-AA-N297A 융합 단백질 및 키메라 Cris7 IgG1-N297A 융합 단백질이 공지된 Cris7 mAb보다 동종항원에 대한 T 세포 반응을 더 잘 차단하였음을 나타낸다.
도 23은 또한, 인간화된 Cris7 IgG1-N297A, IgG2-AA-N297A 및 IgG4-AA-N297A 융합 단백질 및 키메라 Cris7 IgG1-N297A 융합 단백질이 공지된 Cris7 mAb보다 더 잘 동종 항원에 대한 T 세포 반응을 차단하였음을 나타낸다. 또한, 인간화된 및 키메라 Cris7 HM1 융합 단백질은 또한 Cris7 mAb보다 동종항원에 대한 T 세포 반응을 더 잘 차단하였다.
인간화된 Cris7 (VH3-VL1) IgG1-N297A 및 인간화된 Cris7 (VH3-VL2) IgG1-N297A 융합 단백질에 의해 재-자극된 PHA-프라임된 T 세포의 유사분열촉진성 및 사이토킨 방출을 실시예 1에 기술된 방법을 사용하여 분석하였다. 다음 사이토킨을 시험하였다: IL-1b, IL-10, IL-17, IFNγ TNFα IL6, MCP-1, IP-10, IL-2 및 IL4.
도 24는, 인간화된 Cris7 (VH3-VL1) IgG1-N297A 및 인간화된 Cris7 (VH3-VL2) IgG1-N297A 융합 단백질이 PHA-프라이머 T 세포를 활성화시키지 않았음을 나타낸다. 유사한 데이타가 인간화된 Cris7 (VH3-VL1) IgG2-AA-N297A, 인간화된 Cris7 (VH3-VL2) IgG2-AA-N297A, 인간화된 Cris7 (VH3-VL1) IgG4-AA-N297A, 및 인간화된 Cris7 (VH3-VL2) IgG4-AA-N297A 융합 단백질을 사용하여 생성되었다.
사이토킨 방출 결과는, (1) 인간화된 Cris7 IgG1-N297A, 인간화된 Cris7-IgG2-AA-N297A, 인간화된 Cris7-IgG4-AA-N297A 및 키메라 Cris7 IgG1-N297A 융합 단백질이 대조군 비-T 세포 결합 SMIP 단백질과 상이하지 않았고, (2) 모 Cris7 mAb가 IL-17(모 Cris7 mAb는 인간화된 Cris7 융합 단백질보다 더 IL-17 방출을 유도하였다)을 제외하고, 인간화된 Cris7 IgG1-N297A, 인간화된 Cris7-IgG2-AA-N297A, 및 인간화된 Cris7-IgG4-AA-N297A 융합 단백질과 비교가능하였으며, (3) Nuvion FL은 세포를 활성화시켜 IL-10, IFNγ IL-17, TNFα 및 IL-6를 생산하였고, (4) 시험한 모든 분자(대조군 비-T 세포 결합 SMIP 포함)는 PHA 재-자극과 같이 높은 수준에서 MCP-1의 분비를 유발하였음을 나타낸다. IFNγ 및 IL-17 방출의 결과는 각각 도 25A 및 25B에 나타낸다.
시험관내 시노몰구스 PBMC에서 원시 유사분열촉진성에 있어서 사이토킨 수준을 다음과 같이 평가하였다: 시노몰구스 원숭이로부터 비-인간 영장류 PBMC를, PBS 1X(CMF) 속에서 림프세포 분리 배지 중 90%를 사용하고 15ml의 원뿔 튜브 속에서 밀도 구배를 제조하는 것을 제외하고는, 실시예 1에 기술된 바와 같이 분리하였다. 세포를 RPMI 완전 배지(10% 인간 AB 혈청, 100 U/mL 페니실린, 100㎍/mL의 스트렙토마이신, 및 2 mM의 L-글루타민을 함유하는 RPMI-1640) 속에 4x106 세포/ml의 농도 및 100μl/웰에서 96 웰 평편 바닥 플레이트에 분취량으로, 나타낸 처리와 함께 재현탁시켰다. 세포를 37℃에서 항온처리하였다. 각각의 웰로부터의 상층액을 1일, 2일 및 3일째에 시료 채취하고, 비 인간 영장류 사이토킨의 존재에 대해 custom 9-plex Luminex-계 검출 키트(제조원: 밀로포어)를 사용하여 제조업자의 프로토콜에 따라 분석하였다. 키트에 의해 검출된 9개의 분석물은 IL-1β IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-17, MCP1, IFNγ 및 TNFα이었다.
결과(도 26A 내지 H)는, 인간화된 Cris7(VH3-VL1) IgG4-AA-N297A 및 인간화된 Cris7(VH3-VL2) IgG4-AA-N297A 융합 단백질이 Cris7 mAb와 비교하여 IFNγ IL-17, IL-4, TNFα, IL-6 및 IL-10의 방출을 거의 유도하지 않은 반면, IL-1B 및 IL-2의 수준을 인간화된 Cris7 IgG4-AA-N297A 융합 단백질을 사용한 처리 및 Cris7 mAb를 사용한 처리 후 비교가능하였음을 나타낸다.
실시예 12
H57 결합 도메인을 함유하는 예시적인 융합 단백질의 생마커 연구
10주령의 암컷 C57BL/6 x DBA2 F1 마우스를 짝을 지어 칭량하고 그룹당 8마리 동물의 5개 그룹으로 나누었다. 동물에게 안구뒤 부비동을 통해 정맥내 주사(200μL의 몰 당량의 300㎍의 H57 Null2 SMIP)에 의해 IgG2a 동형 대조군, H57 Null2 SMIP(서열 번호: 96), H57 ㅍNull SMIP (서열 번호: 304), H57 HM2 SMIP (서열 번호: 306), 또는 5㎍의 H57 mAb를 주사하였다. 각각의 그룹으로부터 4마리 마우스를 24시간째에 안락사시키고 나머지 4마리의 마우스는 주사 후 3일째인 실험 말기에 안락사시켰다. 마우스를 앞서 기술한 바와 같이 약물-관련 독성의 임상 증상에 대해 모니터링하였다. 모든 마우스를 주사 후 2시간째 및 이들의 말기 싯점에 방혈하였다. 혈청 시료를 사이토킨 및 케모킨의 존재에 대해 custom 14-plex Luminex-계 검출 키트(제조원: 앞서 기술한 바와 같은 밀리포어)를 사용하여 분석하였다. 혈청 분석을 위한 혈액 수집 외에, 혈액의 분취량을 전혈 미세용기 튜브(EDTA 함유)내로 전혈 세포의 말초 혈액 염색을 위해 수집하였다. 요약하면, 5μL의 전혈을 96-웰 U-바닥 플레이트내 웰에 가하였다. 5μL의 랫트 항-10㎍/ml의 마우스 CD16/CD32 Fc Block[제조원: 비디 파밍겐(BD Pharmingen)]을 가하고 플레이트를 실온에서 15분 동안 플레이트 진탕기상에서 중간 속도로 항온처리하였다. CD5(PE-Cy5), CD19(FITC, 제조원: 이바이오사이언스) 및 CD45(PE, 제조원: 이바이오사이언스)에 대해 10μL의 항체 칵테일(또는 적절한 단일 균주 대조군)을 1:4000의 최종 희석을 위해 가하였다. 플레이트를 추가로 20분 동안 실온에서, 광 보호하에 플레이트 진탕기를 중간 속도로 설정하여 항온처리하였다. 180μL의 1X BD Pharm Lyse 완충액을 가하고 웰을 완전히 혼합하고 실온에서 30분 동안 두었다. 이어서, 50μL의 각각의 시료를 BD LSRII 고 배출 시료기(High Throughput Sampler)(HTS)에서 분석하였다. 게이팅 전략은 다음과 같다: FSC:SSC 림프세포 게이트내에 속한 세포를 CD45 발현에 대해 분석한 후에, CD45+ 게이트내에 속한 세포를 CD5 및 CD19 발현에 대해 분석하였다. 각각의 세포 유형의 ml당 세포를 수집된 50μL의 시료 및 40의 희석 인자를 기초로 하여 역 계산하였다.
도 27은, H57 Null2, half null 및 HM2 SMIP 단백질이 체중 감소를 유발하지 않은 반면, H57 mAb의 정맥내 투여가 체중 감소를 유발하였음을 나타낸다. 모든 마우스는 0일과 3일 사이에 명백한 호흡곤란징후 없이 정상으로 보여졌다.
도 28은, H57 Null2, H57 half Null, H57 HM2, 또는 H57 mAb의 정맥내 투여가 IgG2a 동형 대조군과 비교하여 순환하는 CD5+ T-세포(세포/ml)에서 일시적인 감소를 초래함을 나타낸다. 순환하는 CD5+ T-세포의 수준(세포/ml)은 주사 후 72시간째에 그룹들 사이에서 상당한 차이가 없었다(도 29).
도 30a 내지 38c는, (1) H57 Null2 및 H57 HM2가 IgG2a와 비교하여 사이토킨 생산에 있어 증가를 유발하지 않았으며, (2) H57 half null 처리가 주사 후 2시간째에 IL-2, IL-10, IP-10, TNFα 및 IL-17의 수준을 증가시켰지만, IL-5는 주사 후 24 시간째에 정상 수준으로 회복되었음을 나타낸다.
실시예 13
H57 결합 도메인을 함유하는 예시적인 융합 단백질의 약력학적 연구
암컷 BALB/c 마우스에게 0시간째에 200㎍의 H57 Null2(서열 번호: 96), H57-HM2(서열 번호: 306) 또는 H57 half null SMIP 단백질(서열 번호: 304)을 함유하는 200 μL의 PBS를 정맥내(IV) 주사하였다. 그룹당 3마리의 마우스에게 H57-HM2 SMIP 단백질에 대해 각각의 싯점에서 주사하였다. 혈청 시료를 15분 및 2, 6, 8, 24, 30, 48, 72, 168, 및 336시간 째에 수득하고, H57 Null2 및 H57 half null의 경우, 추가의 싯점은 96 및 504 시간째에 취하였으나, 8 및 30 시간째 시료는 제외하였다. 안락사시킨 마우스를 팔신경얼기(brachial plexus) 또는 심장 펀처(cardiac puncture)를 통해 주사한 후 나타낸 싯점에서 방혈하고 혈청을 하기 기술한 바와 같이 수집하였다.
BC3 IgG4-AA-N297A 및 BC3 IgG2-AA-N297A의 혈청 농도를 포획 시약으로서 염소 항-인간 IgG Fc 특이적인 항체, 및 인간 IgG4 또는 IgG2에 대한 항체의 HRP 접합체를 사용하는 샌드위치 ELISA로 측정하여 결합된 BC3 IgG4-AA-N297A 또는 BC3-IgG2-AA-N297A SMIP를 각각 검출하였다. OKT3IgG4-AA-N297A 및 BC3-HM1에 대한 혈청 농도를 CD3+ 저켓(Jurkat) 세포주를 사용하여 FACS-계 결합 검정에서 측정하였다. 저켓 세포를 96 웰 평편 바닥 플레이트 속에서 OKT3 IgG4-AA-N297A 또는 BC3-HM1을 주사한 마우스로부터의 혈청 시료와 함께 항온처리하였다. 각각의 혈청 시료를 1개의 희석에서 3회 시험하였다. 시료에 사용된 희석은 상이한 싯점에 대해 변하였지만, OKT3 IgG4-AA-N297A의 경우 1:20 내지 1:15,000 및 BC3-HM1의 경우 1:20 내지 1:1000이었다 . (OKT3 IgG2-AA-N297A 또는 BC3-HM1을 주사한 마우스로부터의 혼주된 시료(pooled sample)를 예비 검정에서 시험하여, 각각의 시료에 대한 적절한 희석을 알았다.) 세포를 1시간 동안 희석된 혈청 시료 또는 표준물(하기 참조)의 존재하에 항온처리하고 검출 시약을 첨가하기 전에 세척하였다. 저켓 세포에 대한 OKT3 Ig4-AA-N297A의 결합을 PE-접합된 염소 항-인간 IgG Fcγ 단편-특이적인 항체를 사용하여 검출한 반면, 저켓 세포에 대한 BC3-HM1의 결합은 PE-접합된 항-His 항체를 사용하여 검출하였다. H57 Null2, H57-HM2, 및 H57 half null에 대한 혈청 농도를 FACS-계 결합 검정에서 EL4 세포, 마우스 T 세포주를 사용하여 측정하였다. EL4 세포를 항-마우스 CD16/CD32로 차단한 후, 96-웰 평편 바닥 플레이트 속에서 H57-null2를 주사한 마우스로부터의 혈청 시료와 함께 항온처리하였다. 각각의 혈청 시료를 하나의 희석에서 3회 시험하였다. 시료에 대해 사용된 희석은 상이한 싯점에 대해 변하였으나, 1:500 내지 1:10,000의 범위였다. (H57-null2를 주사한 마우스로부터의 혼주된 시료를 예비 검정에서 시험함으로써, 각각의 시료에 대한 적절한 희석을 알았다.) 표준 곡선은 FACS 완충제내로 스파이킹(spiking)되고 3회 이동시킨 각종의 공지된 농도의 H57 Null2로 이루어졌다. 전개 작업이, 1:50 보다 큰 희석에서의 혈청이 표준 곡선에 영향을 미치지 않았고, 보다 큰 희석(최소 1:500)의 혈청이 PK 시료에 요구되었으므로 혈청을 표준 곡선에 가하지 않았다.
EL4 세포를 희석된 혈청 시료 또는 표준물의 존재하에 1시간 동안 항온처리하고 검출 시약을 첨가하기 전에 세척하였다. EL4 세포에 대한 H57Null2 및 H57 half null의 결합을 PE-접합된 당나귀 항-마우스 IgG (H+L) 항체를 사용하여 검출한 반면, EL4 세포에 대한 H57-HM2의 결합은 PE-접합된 항-His 항체를 사용하여 검출하였다. 시료를 유동 세포분석기로 분석하였다. 평균 형광성 강도(MFI)를 Softmax Pro 소프트웨어로 가져와서 혈청 농도를 계산하고 표준 곡선의 정밀도 및 정확도를 측정하였다.
혈청 시료를 사이토킨 및 케모킨의 존재에 대해 custom 14-plex Luminex-계 검출 키트(제조원: 밀리포어)를 사용하여 앞서 기술한 바와 같이 분석하였다. 각각의 단백질에 대한 약력학적 소인 매개변수(pharmacokinetic disposition parameter)를 WinNonlinTM 전문가용 소프트웨어(v5.0.1)를 사용하고 예비컴파일된 모델 201을 정맥내 대량투여 및 드믄 시료 추출을 위해 적용하는 비-구획성 분석(non-compartmental analysis)으로 평가하였다. PK 결과를 도 40에 제공하고 계산된 반감기는 하기 표 2에 제공하는 한편, 사이토킨 결과는 도 40 내지 49에 제공한다.
PK 결과
시험 화합물 혈청 반감기(시간)
H57 Null2 (서열 번호: 96) 83.5
H57 half null (서열 번호: 304) 40.7
H57-HM2 (서열 번호: 306) 6.6
BC3-HM1 (서열 번호: 84) 3.2
BC3 IgG2-AA-N297A (서열 번호: 82) 87.5
BC3IgG4-AA-N297A (서열 번호: 83) 99.7
OKT3 IgG2-AA-N297A (서열 번호: 90) 42.4
PK 연구의 결과는, CH2CH3 테일을 함유하는 SMIP 단백질이 CH3만을 함유하는 테일의 반감기보다 더 긴 반감기를 가짐을 나타낸다.도 39 내지 48은, H57-HM2 SMIP 단백질이 일반적으로 측정한 모든 싯점에서 대부분의 사이토킨(IFN-γ, IL-2, IL-5, IL-6, 또는 IL-17)의 수준의 상승을 유발하지 않았음을 나타낸다. 이는 부분적으로 당해 분자의 보다 짧은 반감기에 기인할 수 있다. 또한, 관측된 약간 증가된 수준의 사이토킨은 일반적으로 주기적이며 H57 half null SMIP 융합 단백질을 사용하여 측정한 수준보다 항상 더 적다.
실시예 14
H57 결합 도메인을 함유하는 예시적인 융합 단백질의 시험관내 연구
MLR 및 ConA 모세포 재자극 검정을 실시예 6에서의 방법에 따라 수행하였다.
결과는, H57 mAb를 제외한, H57 Null2, H57 half null 및 H57-HM2 융합 단백질(각각 서열 번호: 96, 304 및 306)이 항원에 대한 원시 T 세포 반응을 차단하였음을 나타낸다(도 50과 51). 또한, H57 Null2, H57 half null 및 H57-HM2 융합 단백질 및 IgG2a는 ConA-프라임된 T 세포의 활성화를 유도하지 않았으며, H57 mAb는 ConA-프라임된 T 세포의 활성화를 약간 유도하였고, 2C11 mAb는 ConA-프라임된 T 세포의 활성화를 유도하였다(도 52). H57 Null2 및 H57-HM2 융합 단백질은 ConA 모세포 재자극 검정에서 사이토킨 방출을 유도하지 않은 반면, H57 half null 융합 단백질은 H57 Null2 및 H57-HM2 융합 단백질과 비교하여 시험한 일부 사이토킨(예를 들면, GM-CSF, IFN-γ IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-17, IP-10 및 TNF-α)의 보다 높은 수준을 초래하였다(데이타는 나타내지 않음).
위에서 기술한 각종 양태를 결합하여 추가의 양태를 제공할 수 있다. 본 명세서에 언급되고/되거나 출원 서지사항에 나열된 미국 특허, 미국 특허공개공보, 미국 특허출원, 외국 특허, 외국 특허출원 및 비-특허 공보 모두는, 이들의 전문이 본원에 참조로 포함된다.
이들 및 다른 변화가 상기한 상세한 설명의 측면에서 양태들로 이루어질 수 있다. 일반적으로, 다음의 특허청구범위에서, 사용된 용어는 명세서 및 특허청구범위에 기재된 구체적인 양태로 특허청구범위를 한정하는 것으로 해석되어서는 안되지만, 이러한 특허청구범위가 포함하는 균등물의 전체 범위와 함께 모든 가능한 양태들을 포함하는 것으로 해석될 수 있다. 따라서, 본원의 특허청구범위는 본 기재내용에 의해 한정되지 않는다.
<110> Aptevo Research and Development LLC <120> TCR COMPLEX IMMUNOTHERAPEUTICS <130> IPA110249-US-D1 <150> US61/104,608 <151> 2008-10-10 <150> US61/148,341 <151> 2009-01-29 <160> 434 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 0 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OKT3 VH nucleotide sequence <210> 2 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OKT3 VH amino acid sequence <400> 2 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr 20 25 30 Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 3 <211> 318 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OKT3 VL nucleotide sequence <400> 3 caaattgttc tcacccagtc tccagcaatc atgtctgcat ctccagggga gaaggtcacc 60 atgacctgca gtgccagctc aagtgtaagt tacatgaact ggtaccagca gaagtcaggc 120 acctccccca aaagatggat ttatgacaca tccaaactgg cttctggagt ccctgctcac 180 ttcaggggca gtgggtctgg gacctcttac tctctcacaa tcagcggcat ggaggctgaa 240 gatgctgcca cttattactg ccagcagtgg agtagtaacc cattcacgtt cggctcgggg 300 acaaagttgg aaataaac 318 <210> 4 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OKT3 VL amino acid sequence <400> 4 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala His Phe Arg Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Gly Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr 85 90 95 Phe Gly Ser Gly Thr Lys 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Arg Trp Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr 85 90 95 Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 9 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified human 2H7 Leader (for BC3, OKT3, 2C11 and H57) <400> 9 Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser 1 5 10 15 Val Ile Met Ser Arg Gly 20 <210> 10 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified huIgG1-SCCP hinge ; Linker 87 <220> <221> SITE <222> (1)..(2) <223> junction amino acids <400> 10 Arg Thr Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 1 5 10 15 Pro <210> 11 <211> 217 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> G1 N297A CH2-CH3 (N297ST - A297ST) <400> 11 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 20 25 30 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 35 40 45 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 50 55 60 Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 65 70 75 80 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 85 90 95 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 100 105 110 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu 115 120 125 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 130 135 140 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 145 150 155 160 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 165 170 175 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 180 185 190 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 195 200 205 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 210 215 <210> 12 <211> 216 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG1 AA N297A CH2CH3 (Ala substitutions at 234, 235, 237 and 297; 236 deleted) <400> 12 Ala Pro Glu Ala Ala Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 1 5 10 15 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 20 25 30 Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 35 40 45 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 50 55 60 Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 65 70 75 80 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 85 90 95 Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 100 105 110 Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr 115 120 125 Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 130 135 140 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 145 150 155 160 Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 165 170 175 Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 180 185 190 Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 195 200 205 Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 210 215 <210> 13 <211> 216 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> G2 AA N297A CH2CH3 (Ala substitution at 234, 236 and 297) <400> 13 Ala Pro Glu Ala Ala Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 1 5 10 15 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 20 25 30 Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val 35 40 45 Asp Gly Met Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 50 55 60 Phe Ala Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln 65 70 75 80 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly 85 90 95 Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro 100 105 110 Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr 115 120 125 Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 130 135 140 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 145 150 155 160 Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser 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Sequence <220> <223> Linker 20 <400> 119 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Cys Pro 1 5 10 <210> 120 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 21 <400> 120 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 <210> 121 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 22 <400> 121 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Asn Ser 1 5 10 <210> 122 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 23 <400> 122 Gly Cys Pro Pro Cys Pro Gly Gly Gly Gly Ser Asn Ser 1 5 10 <210> 123 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 24 <400> 123 Gly Gly Gly Gly Ser Cys Pro Pro Cys Pro Gly Asn Ser 1 5 10 <210> 124 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 25 <400> 124 Gly Cys Pro Pro Cys Pro Gly Gly Gly Gly Ser Asn Ser 1 5 10 <210> 125 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 26 <400> 125 Gly Gly Gly Ala Ser Cys Pro Pro Cys Pro Gly Asn Ser 1 5 10 <210> 126 <211> 13 <212> 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<220> <223> Linker 46 <400> 145 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 146 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 48 <400> 146 Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Ser 1 5 10 15 <210> 147 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 49 <400> 147 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Cys Ser 1 5 10 15 <210> 148 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 51 <400> 148 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Ser 1 5 10 15 <210> 149 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 52 <400> 149 Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro 1 5 10 15 <210> 150 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 53 <400> 150 Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Ser 1 5 10 15 <210> 151 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 54 <400> 151 Glu Pro Lys Ser Ser Asp 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Linker 67 <400> 164 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr Cys Cys Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 15 <210> 165 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 68 <400> 165 Glu Pro Lys Ser Cys Pro Pro Pro Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 15 <210> 166 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 69 <400> 166 Pro Pro Pro Pro Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 15 <210> 167 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 70 <400> 167 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Trp Trp Cys Pro 1 5 10 15 <210> 168 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 71 <400> 168 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Trp Trp His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 15 <210> 169 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 72 <400> 169 Glu Pro Lys Cys Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 15 <210> 170 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 73 <400> 170 Glu Pro Lys Ser Asp Cys Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 15 <210> 171 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 74 <400> 171 Glu Pro Lys Ser Asp Cys Trp Trp His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 15 <210> 172 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 75 <400> 172 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Phe Phe His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 15 <210> 173 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 76 <400> 173 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Trp Trp Trp Thr Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 15 <210> 174 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 77 <400> 174 Glu Pro Lys Ser Cys Trp Trp Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 15 <210> 175 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 78 <400> 175 Glu Pro Trp Trp Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 15 <210> 176 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 79 <400> 176 Ser Gln Pro Glu Ile Val Pro Ile Ser Cys Pro Pro Cys Pro Asn Ser 1 5 10 15 <210> 177 <211> 17 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189 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 95 <400> 189 Leu Ser Val Lys Ala Asp Phe Leu Thr Pro Ser Ile Ser Pro Pro Cys 1 5 10 15 Pro Asn Ser <210> 190 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 96 <400> 190 Ser Val Leu Ala Asn Phe Ser Gln Pro Glu Ile Ser Cys Pro Pro Cys 1 5 10 15 Pro Asn Ser <210> 191 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 97 <400> 191 Gly Gln Arg His Asn Asn Ser Ser Leu Asn Thr Arg Thr Gln Lys Ala 1 5 10 15 Arg His Ser Pro 20 <210> 192 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 98 <400> 192 Leu Ser Val Leu Ala Asn Phe Ser Gln Pro Glu Ile Ser Cys Pro Pro 1 5 10 15 Cys Pro Asn Ser 20 <210> 193 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 99 <400> 193 Leu Lys Ile Gln Glu Arg Val Ser Lys Pro Lys Ile Ser Cys Pro Pro 1 5 10 15 Cys Pro Asn Ser 20 <210> 194 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 100 <400> 194 Arg Glu Gln Leu Ala Glu Val Thr 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aagtgtaagt tacatgcact ggtaccagca gaagtcaggc 540 acctccccca aaagatggat ttatgacaca tccaaactgg cttctggcgt ccctgctcgc 600 ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttac tctctcacaa tcagcagcat ggaggctgaa 660 gatgctgcca cttattactg ccagcagtgg agtagtaatc cactcacgtt cggtgctggg 720 accaagctgg agctgaaacg ctcgagcgag tctccaaagg cacaggcctc ctccgtgccc 780 actgcacaac cccaagcaga gggcagcctc gccaaggcaa ccacagcccc agccaccacc 840 cgtaacacat gcccaccgtg cccagcacct gaactcctgg gtggaccgtc agtcttcctc 900 ttccccccaa aacccaagga caccctcatg atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg 960 gtggtggacg tgagccacga agaccctgag gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg 1020 gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg gaggagcagt acgccagcac gtaccgtgtg 1080 gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac tggctgaatg gcaaggagta caagtgcaag 1140 gtctccaaca aagccctccc agcccccatc gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag 1200 ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc ccatcccggg atgagctgac caagaaccag 1260 gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc tatccaagcg acatcgccgt ggagtgggag 1320 agcaatgggc agccggagaa caactacaag 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gtgccagctc aagtgtaagt tacatgcact ggtaccagca gaagtcaggc 540 acctccccca aaagatggat ttatgacaca tccaaactgg cttctggcgt ccctgctcgc 600 ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttac tctctcacaa tcagcagcat ggaggctgaa 660 gatgctgcca cttattactg ccagcagtgg agtagtaatc cactcacgtt cggtgctggg 720 accaagctgg agctgaaacg ctcgagccag gagaaagaag ctatagagag gttgaaggcc 780 gcaggcgccc cagagagcct ggtcatccag gcctatttcg cgagtgagaa gaatgagaac 840 ttggctgcca acttcctcct gagtcagaac tttgatgacg agtgcccacc gtgcccatcc 900 ggagcacctg aactcctggg tggaccgtca gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac 960 accctcatga tctcccggac ccctgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa 1020 gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca 1080 aagccgcggg aggagcagta cgccagcacg taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg 1140 caccaggact ggctgaatgg caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca 1200 gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac 1260 accctgcccc catcccggga tgagctgacc aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc 1320 aaaggcttct atccaagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac 1380 aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag 1440 ctcaccgtgg acaagagccg gtggcagcag gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat 1500 gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag agcctctccc tgtctccggg taaatga 1557 <210> 325 <211> 518 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BC3 G1 N297A with a UBA hinge and RSS junction amino acids <400> 325 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Ala Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr 20 25 30 Thr Met Gln Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Tyr Ile Gly Tyr Ser Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Thr Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Lys Val Tyr Tyr Asp Tyr Asp Val Tyr Ser Met Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125 Gly Gly 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junction amino acids <400> 326 caggtccagc tgcagcagtc tgcagctgaa ctggcaagac ctggggcctc agtgaagatg 60 tcctgcaagg cttctggcta cacctttact aggtacacga tgcagtgggt aaaacagagg 120 cctggacagg gtctggaatg gattggatac attaatccta gtagtggata tattgggtac 180 agtcagaagt tcaaggacaa gaccacattg actgcagaca aatcctccag cacagcctac 240 atgcaactga gcagtctgac atctgaggac tctgcggtct attactgtgc aagatcgaag 300 gtctactatg attacgacgt ttattctatg gactactggg gtcaaggaac ctcggtcacc 360 gtctcaagcg gtggcggagg gtctgggggt ggcggatccg gaggtggtgg ctctgcacaa 420 caaattattc tcacccagtc tccagcaatc atgtctgcat ctccagggga gaaggtcacc 480 atgacctgca gtgccagctc aagtgtaagt tacatgcact ggtaccagca gaagtcaggc 540 acctccccca aaagatggat ttatgacaca tccaaactgg cttctggcgt ccctgctcgc 600 ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttac tctctcacaa tcagcagcat ggaggctgaa 660 gatgctgcca cttattactg ccagcagtgg agtagtaatc cactcacgtt cggtgctggg 720 accaagctgg agctgaaacg ctcgagcgag ctgactgata cactccaagc ggagacagac 780 caactagaag atgagaagtc tgctttgcag accgagattg ccaacctgct 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Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 350 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 350 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Gly Gly Ser <210> 351 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 351 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 20 <210> 352 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 352 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 20 25 <210> 353 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 353 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 1 5 10 15 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 20 25 <210> 354 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 354 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 20 25 30 Gly Gly Gly Ser 35 <210> 355 <211> 45 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 355 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 20 25 30 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 35 40 45 <210> 356 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 356 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 357 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 357 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser 20 <210> 358 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 358 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 20 25 <210> 359 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human IgG1 upper hinge region <400> 359 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr 1 5 10 <210> 360 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human IgG2 upper hinge region <400> 360 Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu 1 5 <210> 361 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human IgG3 upper hinge region <400> 361 Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr 1 5 10 <210> 362 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human IgG3 upper hinge region <400> 362 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro 1 5 10 <210> 363 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human IgG4 upper hinge region <400> 363 Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro 1 5 <210> 364 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human IgG1 core hinge <400> 364 Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 <210> 365 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human IgG3 core hinge <400> 365 Cys Pro Arg Cys Pro 1 5 <210> 366 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human IgG4 core hinge <400> 366 Cys Pro Ser Cys Pro 1 5 <210> 367 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG4 upper and core hinge <400> 367 Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro Arg Cys 1 5 10 15 Pro <210> 368 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG4 upper and core hinge <400> 368 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro 1 5 10 15 <210> 369 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human IgD upper hinge region <400> 369 Glu Ser Pro Lys Ala Gln Ala Ser Ser Val Pro Thr Ala Gln Pro Gln 1 5 10 15 Ala Glu Gly Ser Leu Ala Lys Ala Thr Thr Ala Pro Ala Thr Thr Arg 20 25 30 Asn Thr <210> 370 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human IgD upper hinge region <400> 370 Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Lys Glu Lys Glu Lys Glu Glu Gln 1 5 10 15 Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro 20 <210> 371 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human IgA1 upper hinge <400> 371 Val Pro Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ser Pro Ser Thr Pro Pro Thr Pro 1 5 10 15 Ser Pro Ser <210> 372 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human IgA2 upper hinge <400> 372 Val Pro Pro Pro Pro Pro 1 5 <210> 373 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human IgECH2 upper hinge-like sequence <400> 373 Val Cys Ser Arg Asp Phe Thr Pro Pro Thr Val Lys Ile Leu Gln Ser 1 5 10 15 Ser Ser Asp Gly Gly Gly His Phe Pro Pro Thr Ile Gln Leu Leu Cys 20 25 30 Leu Val Ser Gly Tyr Thr Pro Gly Thr Ile Asn Ile Thr Trp Leu Glu 35 40 45 Asp Gly Gln Val Met Asp Val Asp Leu Ser Thr Ala Ser Thr Thr Gln 50 55 60 Glu Gly Glu Leu Ala Ser Thr Gln Ser Glu Leu Thr Leu Ser Gln Lys 65 70 75 80 His Trp Leu Ser Asp Arg Thr Tyr Thr Cys Gln Val Thr Tyr Gln Gly 85 90 95 His Thr Phe Glu Asp Ser Thr Lys Lys Cys Ala 100 105 <210> 374 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human IgM CH2 upper hinge-like sequence <400> 374 Val Ile Ala Glu Leu Pro Pro Lys Val Ser Val Phe Val Pro Pro Arg 1 5 10 15 Asp Gly Phe Phe Gly Asn Pro Arg Lys Ser Lys Leu Ile Cys Gln Ala 20 25 30 Thr Gly Phe Ser Pro Arg Gln Ile Gln Val Ser Trp Leu Arg Glu Gly 35 40 45 Lys Gln Val Gly Ser Gly Val Thr Thr Asp Gln Val Gln Ala Glu Ala 50 55 60 Lys Glu Ser Gly Pro Thr Thr Tyr Lys Val Thr Ser Thr Leu Thr Ile 65 70 75 80 Lys Glu Ser Asp Trp Leu Gly Gln Ser Met Phe Thr Cys Arg Val Asp 85 90 95 His Arg Gly Leu Thr Phe Gln Gln Asn Ala Ser Ser Met Cys Val Pro 100 105 110 <210> 375 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> huamn IgG4 AA CH2 with alanine substitutions at F234 and N297 <400> 375 Ala Pro Glu Ala Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 20 25 30 Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr 35 40 45 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 50 55 60 Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 65 70 75 80 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 85 90 95 Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 100 105 110 <210> 376 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human IgG4 AA CH2 with alanine substitutions at L235 and N297 <400> 376 Ala Pro Glu Phe Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 20 25 30 Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr 35 40 45 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 50 55 60 Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 65 70 75 80 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 85 90 95 Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 100 105 110 <210> 377 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human IgG4 AA CH2 with alanine substitutions at G236 and N297 <400> 377 Ala Pro Glu Phe Leu Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 20 25 30 Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr 35 40 45 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 50 55 60 Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 65 70 75 80 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 85 90 95 Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 100 105 110 <210> 378 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human IgG4 AA CH2 with alanine substitutions at G237 and N297 <400> 378 Ala Pro Glu Phe Leu Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 20 25 30 Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr 35 40 45 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 50 55 60 Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 65 70 75 80 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 85 90 95 Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 100 105 110 <210> 379 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 134 <400> 379 Glu Pro Met Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 15 <210> 380 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 135 <400> 380 Glu Pro Met Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 15 <210> 381 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 136 <400> 381 Glu Pro Met Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Cys Pro 1 5 10 15 <210> 382 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 137 <400> 382 Glu Pro Met Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Ser Pro 1 5 10 15 <210> 383 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 138 <400> 383 Glu Pro Met Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Cys Pro 1 5 10 15 <210> 384 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 139 <400> 384 Glu Pro Met Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Ser Pro 1 5 10 15 <210> 385 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 140 <400> 385 Glu Pro Met Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Pro 1 5 10 15 <210> 386 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 141 <400> 386 Glu Pro Met Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Ser 1 5 10 15 <210> 387 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 142 <400> 387 Glu Pro Met Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Ser 1 5 10 15 <210> 388 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 143 <400> 388 Glu Pro Met Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Cys Ser 1 5 10 15 <210> 389 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 144 <400> 389 Glu Pro Met Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Ser Ser 1 5 10 15 <210> 390 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 145 <400> 390 Glu Pro Met Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Cys Ser 1 5 10 15 <210> 391 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 146 <400> 391 Glu Pro Met Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Ser Pro 1 5 10 15 <210> 392 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 147 <400> 392 Glu Pro Met Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Ser 1 5 10 15 <210> 393 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 148 <400> 393 Glu Pro Thr Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 15 <210> 394 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 149 <400> 394 Glu Pro Thr Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 15 <210> 395 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 150 <400> 395 Glu Pro Thr Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Cys Pro 1 5 10 15 <210> 396 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 151 <400> 396 Glu Pro Thr Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Ser Pro 1 5 10 15 <210> 397 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 152 <400> 397 Glu Pro Thr Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Cys Pro 1 5 10 15 <210> 398 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 153 <400> 398 Glu Pro Thr Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Ser Pro 1 5 10 15 <210> 399 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 154 <400> 399 Glu Pro Thr Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Pro 1 5 10 15 <210> 400 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 155 <400> 400 Glu Pro Thr Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Ser 1 5 10 15 <210> 401 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 156 <400> 401 Glu Pro Thr Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Ser 1 5 10 15 <210> 402 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 157 <400> 402 Glu Pro Thr Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Cys Ser 1 5 10 15 <210> 403 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 158 <400> 403 Glu Pro Thr Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Ser Ser 1 5 10 15 <210> 404 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 159 <400> 404 Glu Pro Thr Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Cys Ser 1 5 10 15 <210> 405 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 160 <400> 405 Glu Pro Thr Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Ser Ser 1 5 10 15 <210> 406 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 161 <400> 406 Glu Pro Thr Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Ser 1 5 10 15 <210> 407 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 162 <400> 407 Glu Pro Ala Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 15 <210> 408 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 163 <400> 408 Glu Pro Ala Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 15 <210> 409 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 164 <400> 409 Glu Pro Ala Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Cys Pro 1 5 10 15 <210> 410 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 165 <400> 410 Glu Pro Ala Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Ser Pro 1 5 10 15 <210> 411 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 166 <400> 411 Glu Pro Ala Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Cys Pro 1 5 10 15 <210> 412 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 167 <400> 412 Glu Pro Ala Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Ser Pro 1 5 10 15 <210> 413 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 168 <400> 413 Glu Pro Ala Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Pro 1 5 10 15 <210> 414 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 169 <400> 414 Glu Pro Ala Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Ser 1 5 10 15 <210> 415 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 170 <400> 415 Glu Pro Ala Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Ser 1 5 10 15 <210> 416 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 171 <400> 416 Glu Pro Ala Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Cys Ser 1 5 10 15 <210> 417 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 172 <400> 417 Glu Pro Ala Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Ser Ser 1 5 10 15 <210> 418 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 173 <400> 418 Glu Pro Ala Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Cys Ser 1 5 10 15 <210> 419 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 174 <400> 419 Glu Pro Ala Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Ser Ser 1 5 10 15 <210> 420 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 175 <400> 420 Glu Pro Ala Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Ser 1 5 10 15 <210> 421 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 176 <400> 421 Glu Pro Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 <210> 422 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 177 <400> 422 Glu Pro Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 <210> 423 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 178 <400> 423 Glu Pro Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Cys Pro 1 5 10 <210> 424 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 179 <400> 424 Glu Pro Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Ser Pro 1 5 10 <210> 425 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 180 <400> 425 Glu Pro Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Cys Pro 1 5 10 <210> 426 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 181 <400> 426 Glu Pro Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Ser Pro 1 5 10 <210> 427 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 182 <400> 427 Glu Pro Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Pro 1 5 10 <210> 428 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 183 <400> 428 Glu Pro Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Ser 1 5 10 <210> 429 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 184 <400> 429 Glu Pro Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Ser 1 5 10 <210> 430 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 185 <400> 430 Glu Pro Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Cys Ser 1 5 10 <210> 431 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 186 <400> 431 Glu Pro Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Ser Ser 1 5 10 <210> 432 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 187 <400> 432 Glu Pro Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Cys Ser 1 5 10 <210> 433 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 188 <400> 433 Glu Pro Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Ser Ser 1 5 10 <210> 434 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker 189 <400> 434 Glu Pro Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser Ser 1 5 10

Claims (1)

  1. 아미노-말단으로부터 카복시-말단까지:
    (a) TCR 복합체 또는 이의 성분에 특이적으로 결합하는 결합 도메인,
    (b) 링커 폴리펩타이드,
    (c) 임의로, 다음 (i) 내지 (iii) 을 포함하는 면역글로불린 CH2 영역 폴리펩타이드: (i) 297번 위치의 아스파라긴에서 아미노산 치환, 및 234 내지 238번 위치에서 하나 이상의 치환 또는 결실;
    (ii) 234 내지 238번 위치에서 하나 이상의 치환 또는 결실, 및 253, 310, 318, 320, 322, 또는 331번 위치에서 적어도 하나의 치환; 또는
    (iii) 297번 위치의 아스파라긴에서 아미노산 치환, 234 내지 238번 위치에서 하나 이상의 치환 또는 결실, 및 253, 310, 318, 320, 322, 또는 331번 위치에서 적어도 하나의 치환; 및
    (d) 면역글로불린 CH3 영역 폴리펩타이드를 포함하며, 여기서, 융합 단백질은 최소한의 검출가능한 사이토킨 방출을 유도하지 않거나 또는 유도하고, 면역글로불린 CH2 영역내 아미노산 잔기는 EU 번호매김 시스템(EU numbering system)에 의해 번호매겨진, 일본쇄 융합 단백질.
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