CN108918892A

CN108918892A - 一种测定抗vegf抗体活性的方法及其应用

Info

Publication number: CN108918892A
Application number: CN201810864854.2A
Authority: CN
Inventors: 吴晓云; 杨少伟; 李胜峰; 俞金泉
Original assignee: Bio Thera Solutions Ltd
Current assignee: Bio Thera Solutions Ltd
Priority date: 2018-08-01
Filing date: 2018-08-01
Publication date: 2018-11-30
Anticipated expiration: 2038-08-01
Also published as: CN108918892B

Abstract

本发明公开了一种测定抗VEGF抗体活性的方法，用转染了VEGF受体、IL‑1R3、IL‑1R6以及报告基因的效应细胞作为检测材料，由anti‑CD3和anti‑CD28抗体激活Jurkat细胞，并加入VEGF配体，VEGF配体通过与效应细胞上的VEGFR的结合，使得细胞内的IL‑1R3和IL‑1R6相互作用，激活下游的NFAT信号通路，使得报告基因得以表达。当加入抗VEGF抗体后，抗VEGF抗体能够竞争性的与VEGF配体结合，阻断VEGF配体与其受体VEGFR的结合，造成下游的报告基因表达量的减少。该方法操作步骤更为简便，大大缩短了实验时间，检测灵敏度高和准确性好。

Description

一种测定抗VEGF抗体活性的方法及其应用

技术领域

本发明属于药物活性检测方法技术领域，具体涉及一种测定抗VEGF抗体活性的方法的建立及其应用。

背景技术

肿瘤是一种血管生成依赖性疾病，肿瘤的生长离不开血管及血液的供应。肿瘤血管靶向治疗(tumor vascular targeting therapy)逐步发展成为当今肿瘤领域研究的主攻方向之一。肿瘤组织产生血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)，与血管内皮细胞上的受体(vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR)结合后，能够通过胞内信号转导系统促进血管内皮细胞增殖、迁移、管腔形成以及微血管通透性，并诱导血管生成，维持肿瘤的继续生长。VEGF是目前发现的功能最重要的血管生长因子，与诸多生理及病理过程有关。已有研究表明，多种实体瘤中存在VEGF的过表达，这使得VEGF成为肿瘤治疗的靶点。

目前VEGF主要有5大类，分别为VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、以及PlGF。而VEGF的受体(VEGFR)分为三类，分别为位于造血干细胞的VEGFR1、位于血管内皮细胞的VEGFR2和位于淋巴内皮细胞的VEGFR3。VEGF-VEGFR信号通路的相关抗体或融合蛋白通过与VEGF的结合，进而阻止VEGF与其受体进行结合，进而阻止其功能的发挥。抗VEGF抗体主要有贝伐珠单抗(Bevacizumab，Avastin)、VEGF Trap(Aflibercept，Eylea)、雷莫芦单抗(Ramucirumab，Cyramza)及雷珠单抗(ranibizumab,Lucentis)等等。

其中，贝伐珠单抗是由美国基因泰克公司(Genentech)研发的一种重组人源化IgG1单克隆抗体，能够高亲和力地选择性结合VEGF，通过空间位阻阻断VEGF与其血管内皮细胞表面上的受体Flt-1(VEGFR-1)和KDR(VEGFR-2)结合，从而中和了VEGF的生物学活性，特异性抑制肿瘤血管生成，从而阻止肿瘤的生长和转移。作为世界首个抗VEGF的抗体药物，贝伐珠单抗已经被国际权威的NCCN推荐为多种转移性肿瘤的一线治疗药物，在全球转移性癌症患者中得到广泛应用。EYLEA(aflibercept)是一种由人VEGFR-1和2细胞外结构区部分融合至人IgG1的Fc部分组成的重组融合蛋白，其作用如同可溶性诱饵受体[decoyreceptor]与VEGF-A和PlGF结合，抑制其VEGF受体结合和激活。雷莫芦单抗是抗VEGFR2的人源单克隆抗体。雷珠单抗是靶向VEGF的Fab抗体片段。

生物学活性是上述治疗类抗体质量性能参数中一个关键指标，为了对此治疗性抗体进行有效的质量控制，首先要建立切实可行的测定其生物学活性的方法。传统的检测抗VEGF抗体的方法是利用VEGF能够刺激HUVEC细胞增殖，而抗VEGF单抗可通过结合VEGF来抑制HUVEC细胞增殖的原理进行检测。但由于HUVEC为原代贴壁细胞，生长周期慢，整个实验过程需要72小时，检测时间长、灵敏度低。

发明内容

基于此，有必要提供一种快速且灵敏度高的测定抗VEGF抗体活性的方法。

一种测定抗VEGF抗体活性的方法，包括如下步骤：

提供转染了VEGF受体、IL-1R3、IL-1R6以及报告基因的效应细胞；

用anti-CD3抗体和anti-CD28抗体激活所述效应细胞；

向激活后的所述效应细胞中加入VEGF配体，其中，所述VEGF配体能够与所述VEGF受体结合，促使所述效应细胞内的IL-1R3和IL-1R6相互作用并表达所述报告基因；及

加入待测抗VEGF抗体以阻断所述VEGF配体与所述VEGF受体结合，根据所述抗VEGF抗体的加入量与所述报告基因表达量的参数曲线确定所述待测抗VEGF抗体的活性。

在一个实施方式中，所述加入待测抗VEGF抗体以阻断所述VEGF配体与所述VEGF受体结合的操作之前，还包括：

向激活后的所述效应细胞中加入VEGF配体，并加入梯度已知浓度的抗VEGF抗体以阻断所述VEGF配体与所述VEGF抗体结合，获得各个浓度的所述抗VEGF抗体对应的报告基因表达量；及

建立所述抗VEGF抗体的加入量与所述报告基因表达量的参数曲线。

在一个实施方式中，所述转染了VEGF受体、IL-1R3、IL-1R6以及报告基因的效应细胞通过如下方法构建得到：

用含有报告基因的载体转染宿主细胞，获得含有报告基因的宿主细胞；及

向所述含有报告基因的宿主细胞中转染第一载体和第二载体，其中所述第一载体中含有VEGF受体以及IL-1R3基因，所述第二载体中含有VEGF受体以及IL-1R6基因，并加入抗性标记物筛选获得稳定表达VEGF受体、IL-1R3、IL-1R6以及报告基因的宿主细胞，得到所述效应细胞。

在一个实施方式中，所述宿主细胞为悬浮生长细胞。

在一个实施方式中，所述VEGF受体为VEGFR2。

在一个实施方式中，所述抗性标记物选自G481和zeo中的至少一种。

在一个实施方式中，所述报告基因具体为荧光素酶报告基因。

在一个实施方式中，所述VEGF配体选自VEGF-165和PIGF中的至少一种。

在一个实施方式中，所述抗VEGF抗体选自贝伐珠单抗、VEGF Trap、雷莫芦单抗及雷珠单抗中的至少一种。

在一个实施方式中，所述用anti-CD3抗体和anti-CD28抗体激活所述效应细胞的操作之前，还包括将所述效应细胞制备成细胞悬液，所述细胞悬液的的浓度为1×10⁴个/孔～1×10⁶个/孔。

上述测定抗VEGF抗体活性的方法，用转染了VEGF受体、IL-1R3、IL-1R6以及报告基因的效应细胞作为检测材料，再由anti-CD3抗体和anti-CD28抗体激活Jurkat细胞，然后加入VEGF配体，VEGF配体通过与效应细胞上的VEGF受体(VEGFR)的结合，使得细胞内的IL-1R3和IL-1R6相互作用，进而激活下游的NFAT信号通路，NFAT蛋白进入细胞核进而与NFAT-RE结合，使得报告基因得以表达。报告基因的表达量强弱与VEGF配体与VEGF受体的结合呈正相关。当加入抗VEGF抗体后，抗VEGF抗体能够竞争性的与VEGF配体结合，阻断VEGF配体与其受体VEGFR的结合，造成下游的报告基因表达量的减少。因此，抗VEGF抗体的加入量与报告基因表达量之间的关系可以拟合形成参数曲线。当检测未知活性的待测抗VEGF抗体时，先获得待测抗VEGF抗体对应地报告基因表达量，将该报告基因表达量带入该参数曲线中即可确定待测抗VEGF抗体的活性。该方法操作步骤更为简便，整个实验只需要6小时左右，大大缩短了实验时间，并且利用报告基因来检测，增强了检测方法的灵敏度和准确性。

附图说明

图1为测定抗VEGF抗体活性的方法的原理图；

图2为实施例1中不同克隆的效应细胞荧光素酶活性测定结果图；

图3为VEGFR-NFAT-Jurkat-1-2细胞在不同VEGF-165浓度下的荧光值曲线图；

图4是VEGFR-NFAT-Jurkat-1-2细胞在不同抗体浓度下的荧光值曲线图；

图5是VEGFR-NFAT-Jurkat-1-2细胞在不同细胞密度下的荧光值曲线图；

图6是实施例3中测定四种单抗药物活性结果比较图；

图7是实施例3转基因细胞法和增殖抑制法测定药物活性的结果比较图。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例及附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。

一种测定抗VEGF抗体活性的方法，包括如下步骤S110～S140。

S110、提供转染了VEGF受体、IL-1R3、IL-1R6以及报告基因的效应细胞。

具体地，用含有报告基因的载体转染宿主细胞，获得含有报告基因的宿主细胞，再向向含有报告基因的宿主细胞中转染第一载体和第二载体，其中所述第一载体中含有VEGF受体以及IL-1R3基因，第二载体中含有VEGF受体以及IL-1R6基因，并加入抗性标记物筛选获得稳定表达VEGF受体、IL-1R3、IL-1R6以及报告基因的宿主细胞，得到效应细胞。

具体地，宿主细胞为悬浮生长细胞。悬浮生长地细胞容易培养，生长周期短，利于实现快速检测。

具体地，宿主细胞可以为Jurkat细胞、CHO细胞或293细胞等。优选地，宿主细胞为Jurkat细胞。

具体地，VEGF受体可以为VEGFR1或者VEGFR2。VEGFR1的氨基酸序列如SEQNO.1所示，VEGFR2的氨基酸序列如SEQNO.2所示。

优选VEGF受体为VEGFR2。VEGF-VEGFR信号通路的抑制剂种类繁多，机理稍有差异，VEGFR2-NFAT-Jurkat系统比VEGFR1-NFAT-Jurkat系统更具有实用性，可用于如贝伐珠单抗、VEGF Trap、雷莫芦单抗及雷珠单抗的生物活性检测，而VEGFR1-NFAT-Jurkat适用于贝伐珠单抗及雷珠单抗的生物活性检测。

本实施方式中，报告基因具体为荧光素酶报告基因。荧光素酶能够在底物的作用下发出荧光信号，根据检测荧光信号的强弱实现定量化的检测。

本实施方式中，抗性标记物可选自G481和zeo中的至少一种。通过抗性筛选，获得稳定表达VEGF受体、IL-1R3、IL-1R6以及报告基因的效应细胞。

构建效应细胞后，将效应细胞制备成细胞悬液，便于下一步地检测。优选地，细胞悬液的的浓度为1×10⁴个/孔～1×10⁶个/孔。

S120、用anti-CD3抗体和anti-CD28抗体激活所述效应细胞；

具体地，采用anti-CD3抗体和anti-CD28抗体包被效应细胞过夜，以激活效应细胞。

S130、向激活后的效应细胞中加入VEGF配体，其中，VEGF配体能够与效应细胞上的VEGF结合，促使效应细胞内的IL-1R3和IL-1R6相互作用并表达报告基因。

具体地，VEGF配体可以选自VEGF-165和PIGF中的至少一种。当然，在其他实施方式中，VEGF配体还可以为VEGF115、VEGF121、VEGF145、VEGF189、VEGF206等。

本实施方式中，IL-1R3的氨基酸序列如SEQNO.3所示，IL-1R6的氨基酸序列如SEQNO.4所示。

S140、加入待测抗VEGF抗体以阻断VEGF配体与VEGF结合，并根据抗VEGF抗体的加入量与报告基因表达量的参数曲线确定待测抗VEGF抗体的活性。

具体地加入待测抗VEGF抗体以阻断所述VEGF配体与所述VEGF结合的操作之前，还包括：向激活后的效应细胞中加入VEGF配体，并加入梯度已知浓度的抗VEGF抗体以阻断VEGF配体与所述VEGF结合，获得各个浓度的抗VEGF抗体对应的报告基因表达量，建立抗VEGF抗体的加入量与报告基因表达量的参数曲线。当然，如果已经建立了抗VEGF抗体的加入量与报告基因表达量的参数曲线，则这一步骤可以省略。

具体地，报告基因表达量通过荧光信号的强弱来评估。

如图1所示，anti-CD3抗体和anti-CD28抗体激活效应细胞后，然后加入配体VEGF-165或PIGF，配体通过与VEGFR的结合，使得细胞内的IL-1R3和IL-1R6相互作用，进而激活下游的NFAT信号通路，NFAT蛋白进入细胞核进而与NFAT-RE结合，使得荧光素酶蛋白得以表达，加入荧光素酶底物，通过酶标仪对荧光信号进行记录。荧光信号的强弱与配体VEGF-165或PIGF与VEGFR的结合呈正相关。进一步地，当使用抗VEGF抗体，抗VEGF抗体与配体VEGF结合后，阻断VEGF与其受体VEGFR的结合，造成下游的荧光素酶蛋白表达量的减少，酶标仪检测的荧光信号减弱。

具体地，抗VEGF抗体选自贝伐珠单抗、VEGF Trap、雷莫芦单抗及雷珠单抗中的至少一种。

实施例1构建稳定表达VEGFR-luciferase的Jurkat细胞株

1.1实验材料

本检测系统所需的试验耗材如下：含有NFAT-luciferase报告基因的NFAT-Jurkat细胞由购买于Promega公司的Jurkat细胞，转入NFAT-luciferase报告基因后，经筛选稳定细胞株获得。pcDNA3.1[G418]和pcDNA3.1[zeo]质粒来源于通用生物系统(安徽)有限公司。VEGFR-IL1R序列合成于通用生物系统(安徽)有限公司。活性用重组人血管内皮生长因子-165(VEGF-165)购买于北京义翘神州科技有限公司。Bio-Glo荧光素酶试剂盒购买于Promega公司。

1.2质粒转染

分为两组：

第一组：采用NEONTM电穿孔转染系统(invitrogen)对NFAT-Jurkat细胞进行pcDNA3.1[VEGFR1-IL1R3/G418]和pcDNA3.1[VEGFR1-IL1R6/zeo]质粒的共转染。其中，VEGFR1的氨基酸序列如SEQNO.1所示，IL-1R3的氨基酸序列如SEQNO.3所示，IL-1R6的氨基酸序列如SEQNO.4所示。转染48小时后，在培养液中加入300μg/mL的G418和200μg/mL的zeo进行加压筛选。待细胞密度和活力恢复后，通过有限稀释法，按照0.5cell/孔的密度，铺96孔板筛选单克隆。在细胞生长期间，观察并标记那些孔是单克隆，当单克隆孔内VEGFR1-NFAT-Jurkat细胞汇合度达到30％以上时，将此孔内细胞转移至24孔板，逐步扩大培养。

第二组：采用NEONTM电穿孔转染系统(invitrogen)对NFAT-Jurkat细胞进行pcDNA3.1[VEGFR2-IL1R3/G418]和pcDNA3.1[VEGFR2-IL1R6/zeo]质粒的共转染。其中，VEGFR2的氨基酸序列如SEQNO.2所示，IL-1R3的氨基酸序列如SEQNO.3所示，IL-1R6的氨基酸序列如SEQNO.4所示。转染48小时后，在培养液中同时加入300μg/mL的G418和200μg/mL的zeo进行加压筛选。待细胞密度和活力恢复后，通过有限稀释法，按照0.5cell/孔的密度，铺96孔板筛选单克隆。在细胞生长期间，观察并标记那些孔是单克隆，当单克隆孔内VEGFR2-NFAT-Jurkat细胞汇合度达到30％以上时，将此孔内细胞转移至24孔板，逐步扩大培养。

1.3VEGFR-NFAT-Jurkat细胞株筛选

为了比较VEGFR1-NFAT-Jurkat细胞株和VEGFR2-NFAT-Jurkat细胞株对VEGF-165细胞因子的灵敏度，通过VEGF-165细胞因子刺激2种细胞，根据荧光信号的差异，选择VEGFR2-NFAT-Jurkat细胞株为工程株。

筛选：anti-CD3抗体和anti-CD28抗体包被96孔白板4℃过夜，每孔加入20000个不同株的VEGFR2-NFAT-Jurkat细胞，VEGF-165稀释至100ng/mL，1：2稀释11个浓度梯度，37℃，5％CO₂培养箱6小时，每孔加50μL荧光素酶底物，酶标仪检测荧光信号。

经过筛选，VEGFR2-NFAT-Jurkat-1-2细胞对VEGF-165的刺激有较好荧光素酶表达反应性(见图2)，选取VEGFR2-NFAT-Jurkat-1-2细胞为实验用细胞。因为VEGF-VEGFR信号通路的抑制剂种类繁多，机理稍有差异，VEGFR2-NFAT-Jurkat系统比VEGFR1-NFAT-Jurkat系统更具有实用性，VEGFR2-NFAT-Jurkat可用于如贝伐珠单抗、VEGF Trap、雷莫芦单抗及雷珠单抗的生物活性检测。

本系统采用悬浮T淋巴细胞系Jurkat细胞，Jurkat细胞是悬浮细胞，无需贴壁过夜培养，节省检测实验时间。另外T淋巴细胞系对IL-1R的胞内信号传导更灵敏。anti-CD3抗体和anti-CD28抗体与Jurkat细胞表面CD3和CD28结合，双激活胞内NFAT信号通路，进一步增强信号传导灵敏度。

具体的检测原理如下：首先由anti-CD3抗体和anti-CD28抗体激活Jurkat细胞，然后加入配体VEGF-165或PIGF，配体通过与VEGFR的结合，使得细胞内的IL-1R3和IL-1R6相互作用，进而激活下游的NFAT信号通路，NFAT蛋白进入细胞核进而与NFAT-RE结合，使得荧光素酶蛋白得以表达。加入荧光素酶底物，通过酶标仪对荧光信号进行记录，荧光信号的强弱与配体VEGF-165或PIGF与VEGFR的结合呈正相关，当使用抗VEGF抗体，抗体与配体VEGF结合后，阻断VEGF与其受体VEGFR的结合，造成下游的荧光素酶蛋白表达量的减少，酶标仪检测的荧光信号减弱(见图1)。

实施例2检测方法优化

2.1浓度优化

根据实施例1.3的VEGF-165激活实验结果，VEGF-165设置200ng/mL、100ng/mL、25ng/mL三个不同的浓度，分别进行VEGF单抗的抑制实验，根据测定的荧光值确定VEGF-165的使用浓度。

方法：anti-CD3抗体和anti-CD28抗体包被96孔白板4℃过夜，每孔加入100000个VEGFR2-NFAT-Jurkat-1-2细胞；贝伐珠单抗(购买于罗氏公司)初始浓度为125μg/mL，1：3梯度稀释10个浓度点，加入上述细胞板中；VEGF-165分别稀释至200ng/mL、100ng/mL、25ng/mL，分别转移到上述细胞板中；37℃，5％CO2培养箱6小时，每孔加50μL荧光素酶底物，酶标仪检测荧光信号。

结果显示，VEGF-165浓度选择100ng/mL，此时能够达到很好的荧光信号，也能节省VEGF-165的用量(见图3)。

2.2抗体量效范围优化

将贝伐珠单抗稀释到较高的浓度1mg/mL，1：3稀释，20个浓度点，根据测定的荧光值拟合的四参数曲线确定贝伐珠单抗的作用范围。

方法：anti-CD3抗体和anti-CD28抗体包被96孔白板4℃过夜，每孔加入100000个VEGFR2-NFAT-Jurkat-1-2细胞；VEGF-165稀释至100ng/mL，转移到上述细胞板中；贝伐珠单抗稀释至1mg/mL，1：3梯度稀释17个浓度点，将稀释后的抗体转移至细胞板中；37℃，5％CO₂培养箱6小时，每孔加50μL荧光素酶底物，酶标仪检测荧光信号。

根据IC50值及上下平台计算，确定贝伐珠单抗起始点终浓度为125μg/mL，1：4稀释，设十个浓度点，能够保证上下平台各有两个浓度点，线性部分至少三个点(见图4)。

2.3细胞密度优化

设置2×10⁵个/孔、1×10⁵个/孔、5×10⁴个/孔、1×10⁴个/孔四个不同的细胞密度，分别进行VEGF单抗的抑制实验，根据测定的荧光值拟合的四参数曲线确定最优细胞密度。

方法：anti-CD3抗体和anti-CD28抗体包被96孔白板4℃过夜，将VEGFR2-NFAT-Jurkat-1-2细胞分别按照2×10⁵个/孔、1×10⁵个/孔、5×10⁴个/孔、1×10⁴个/孔加入到96孔白板中。加入100ng/mL的VEGF-165，贝伐珠单抗初始浓度为125μg/mL，1：4稀释10个浓度梯度，转移至上述细胞板中。37℃，5％CO₂培养箱6小时，每孔加50μL荧光素酶底物，酶标仪检测荧光信号。

结果：根据上下平台计算得出的信噪比，VEGFR2-NFAT-Jurkat-1-2细胞密度1×10⁵个/孔至2×10⁵个/孔范围内时，信噪比相差不多，细胞密度对信噪比影响不大(见图5)。选择细胞密度1×10⁵个/孔进行后续实验。

实施例3检测方法的验证

3.1专属性验证

本方法是针对抗VEGF抗体的生物学活性方法，因此，对其专属性的验证采用了不同靶点的单抗药物：贝伐珠单抗(Bevacizumab，靶点为VEGF)、托珠单抗(Tocilizumab，靶点为IL-6R)、利妥昔单抗(Rituximab，靶点为CD20)、昔妥昔单抗(Cetuximab，靶点为EGFR)。在相同的实验条件下，利用我们的VEGFR2-NFAT-Jurkat-1-2报告基因测活体系，测定这四种单抗药物的活性。

方法：anti-CD3抗体和anti-CD28抗体包被96孔白板4℃过夜，将VEGFR2-NFAT-Jurkat-1-2细胞按照1×10⁵个/孔加入到96孔白板中；加入100ng/mL的VEGF-165；将4种单抗分别稀释至初始浓度125μg/mL，1：4稀释10个浓度梯度，分别转移至上述细胞板中；37℃，5％CO₂培养箱6小时，每孔加50μL荧光素酶底物，酶标仪检测荧光信号。

本方法对IL-6R、CD20、EGFR靶点的抗体药物均没有剂量效应曲线，说明本方法不适于除了VEGF靶点以外的其它药物，证明本方法专属性较好(见图6)。

3.2与传统方法的方法学比较

目前贝伐珠单抗的生物学活性测定方法主要是细胞增殖抑制的方法，该方法依据对VEGF有生长依赖性的人脐静脉内皮细胞系HUVEC，加入贝伐珠单抗和VEGF-165，贝伐珠单抗通过与VEGF-165的结合，阻断VEGF-165与细胞表面的VEGFR结合，孵育72小时后，通过测定细胞的数量来定量贝伐珠单抗的细胞增殖抑制作用。我们分别使用传统方法和VEGFR2-NFAT-Jurkat报告基因法测定同一批样品的相对效价，每个实验重复6次。

本申请的方法(转基因细胞法)：anti-CD3抗体和anti-CD28抗体包被96孔白板4℃过夜，将VEGFR2-NFAT-Jurkat-1-2细胞按照1×10⁵个/孔加入到96孔白板中；加入100ng/mL的VEGF-165；贝伐珠单抗初始浓度为125μg/mL,1：4稀释10个浓度梯度，转移至细胞板中；37℃，5％CO₂培养箱6小时，每孔加50μl荧光素酶底物，酶标仪检测荧光信号。

增殖抑制法：将HUVEC细胞按6×10⁴个/孔接种于96孔板中；加入100ng/mL的VEGF；贝伐珠单抗初始浓度为40μg/mL,1：4稀释10个浓度梯度，转移至细胞板中；37℃，5％CO₂培养箱72小时。将CCK8显色液以20μL/孔加入细胞板，继续培养3小时，检测450nm/650nm波长测其吸光度。

结果显示：转基因细胞法测定结果与传统方法增殖抑制法测定结果具有很好的一致性，且转基因细胞法的相对变异系数要低于传统方法(见图7)。

转基因细胞法，一方面细胞采用悬浮培养的方式，便于细胞的培养，冻存，以及实验操作等；另一方面减少了整个实验周期，节约时间，提高工作效率；此外，转基因细胞法同传统的增殖抑制法比较，在实验结果的变异系数方面更有优势。

实施例4测定未知活性浓度的贝伐珠单抗。

anti-CD3抗体和anti-CD28抗体包被96孔白板4℃过夜，将VEGFR2-NFAT-Jurkat-1-2细胞按照1×10⁵个/孔加入到96孔白板中；加入100ng/mL的VEGF-165；将未知活性浓度的贝伐珠单抗转移至上述细胞板中；37℃，5％CO₂培养箱6小时，每孔加50μL荧光素酶底物，酶标仪检测荧光信号。将荧光信号值带入图4的曲线中，荧光值平均为17000，根据图4曲线，测定浓度为450ng/ml。

以上所述实施例仅表达了本发明的一种或几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

序列表

<110> 百奥泰生物科技（广州）有限公司

<120> 一种测定抗VEGF抗体活性的方法及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 756

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Val Ser Tyr Trp Asp Thr Gly Val Leu Leu Cys Ala Leu Leu Ser

1 5 10 15

Cys Leu Leu Leu Thr Gly Ser Ser Ser Gly Ser Lys Leu Lys Asp Pro

20 25 30

Glu Leu Ser Leu Lys Gly Thr Gln His Ile Met Gln Ala Gly Gln Thr

35 40 45

Leu His Leu Gln Cys Arg Gly Glu Ala Ala His Lys Trp Ser Leu Pro

50 55 60

Glu Met Val Ser Lys Glu Ser Glu Arg Leu Ser Ile Thr Lys Ser Ala

65 70 75 80

Cys Gly Arg Asn Gly Lys Gln Phe Cys Ser Thr Leu Thr Leu Asn Thr

85 90 95

Ala Gln Ala Asn His Thr Gly Phe Tyr Ser Cys Lys Tyr Leu Ala Val

100 105 110

Pro Thr Ser Lys Lys Lys Glu Thr Glu Ser Ala Ile Tyr Ile Phe Ile

115 120 125

Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu

130 135 140

Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val

145 150 155 160

Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr

165 170 175

Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe

180 185 190

Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu

195 200 205

Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg

210 215 220

Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Gln Ile Ser Thr Pro Arg Pro Val

225 230 235 240

Lys Leu Leu Arg Gly His Thr Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Thr Thr

245 250 255

Pro Leu Asn Thr Arg Val Gln Met Thr Trp Ser Tyr Pro Asp Glu Lys

260 265 270

Asn Lys Arg Ala Ser Val Arg Arg Arg Ile Asp Gln Ser Asn Ser His

275 280 285

Ala Asn Ile Phe Tyr Ser Val Leu Thr Ile Asp Lys Met Gln Asn Lys

290 295 300

Asp Lys Gly Leu Tyr Thr Cys Arg Val Arg Ser Gly Pro Ser Phe Lys

305 310 315 320

Ser Val Asn Thr Ser Val His Ile Tyr Asp Lys Ala Phe Ile Thr Val

325 330 335

Lys His Arg Lys Gln Gln Val Leu Glu Thr Val Ala Gly Lys Arg Ser

340 345 350

Tyr Arg Leu Ser Met Lys Val Lys Ala Phe Pro Ser Pro Glu Val Val

355 360 365

Trp Leu Lys Asp Gly Leu Pro Ala Thr Glu Lys Ser Ala Arg Tyr Leu

370 375 380

Thr Arg Gly Tyr Ser Leu Ile Ile Lys Asp Val Thr Glu Glu Asp Ala

385 390 395 400

Gly Asn Tyr Thr Ile Leu Leu Ser Ile Lys Gln Ser Asn Val Phe Lys

405 410 415

Asn Leu Thr Ala Thr Leu Ile Val Asn Val Lys Pro Gln Ile Tyr Glu

420 425 430

Lys Ala Val Ser Ser Phe Pro Asp Pro Ala Leu Tyr Pro Leu Gly Ser

435 440 445

Arg Gln Ile Leu Thr Cys Thr Ala Tyr Gly Ile Pro Gln Pro Thr Ile

450 455 460

Lys Trp Phe Trp His Pro Cys Asn His Asn His Ser Glu Ala Arg Cys

465 470 475 480

Asp Phe Cys Ser Asn Asn Glu Glu Ser Phe Ile Leu Asp Ala Asp Ser

485 490 495

Asn Met Gly Asn Arg Ile Glu Ser Ile Thr Gln Arg Met Ala Ile Ile

500 505 510

Glu Gly Lys Asn Lys Met Ala Ser Thr Leu Val Val Ala Asp Ser Arg

515 520 525

Ile Ser Gly Ile Tyr Ile Cys Ile Ala Ser Asn Lys Val Gly Thr Val

530 535 540

Gly Arg Asn Ile Ser Phe Tyr Ile Thr Asp Val Pro Asn Gly Phe His

545 550 555 560

Val Asn Leu Glu Lys Met Pro Thr Glu Gly Glu Asp Leu Lys Leu Ser

565 570 575

Cys Thr Val Asn Lys Phe Leu Tyr Arg Asp Val Thr Trp Ile Leu Leu

580 585 590

Arg Thr Val Asn Asn Arg Thr Met His Tyr Ser Ile Ser Lys Gln Lys

595 600 605

Met Ala Ile Thr Lys Glu His Ser Ile Thr Leu Asn Leu Thr Ile Met

610 615 620

Asn Val Ser Leu Gln Asp Ser Gly Thr Tyr Ala Cys Arg Ala Arg Asn

625 630 635 640

Val Tyr Thr Gly Glu Glu Ile Leu Gln Lys Lys Glu Ile Thr Ile Arg

645 650 655

Asp Gln Glu Ala Pro Tyr Leu Leu Arg Asn Leu Ser Asp His Thr Val

660 665 670

Ala Ile Ser Ser Ser Thr Thr Leu Asp Cys His Ala Asn Gly Val Pro

675 680 685

Glu Pro Gln Ile Thr Trp Phe Lys Asn Asn His Lys Ile Gln Gln Glu

690 695 700

Pro Gly Ile Ile Leu Gly Pro Gly Ser Ser Thr Leu Phe Ile Glu Arg

705 710 715 720

Val Thr Glu Glu Asp Glu Gly Val Tyr His Cys Lys Ala Thr Asn Gln

725 730 735

Lys Gly Ser Val Glu Ser Ser Ala Tyr Leu Thr Val Gln Gly Thr Ser

740 745 750

Asp Lys Ser Asn

755

<210> 2

<211> 764

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Gln Ser Lys Val Leu Leu Ala Val Ala Leu Trp Leu Cys Val Glu

1 5 10 15

Thr Arg Ala Ala Ser Val Gly Leu Pro Ser Val Ser Leu Asp Leu Pro

20 25 30

Arg Leu Ser Ile Gln Lys Asp Ile Leu Thr Ile Lys Ala Asn Thr Thr

35 40 45

Leu Gln Ile Thr Cys Arg Gly Gln Arg Asp Leu Asp Trp Leu Trp Pro

50 55 60

Asn Asn Gln Ser Gly Ser Glu Gln Arg Val Glu Val Thr Glu Cys Ser

65 70 75 80

Asp Gly Leu Phe Cys Lys Thr Leu Thr Ile Pro Lys Val Ile Gly Asn

85 90 95

Asp Thr Gly Ala Tyr Lys Cys Phe Tyr Arg Glu Thr Asp Leu Ala Ser

100 105 110

Val Ile Tyr Val Tyr Val Gln Asp Tyr Arg Ser Pro Phe Ile Ala Ser

115 120 125

Val Ser Asp Gln His Gly Val Val Tyr Ile Thr Glu Asn Lys Asn Lys

130 135 140

Thr Val Val Ile Pro Cys Leu Gly Ser Ile Ser Asn Leu Asn Val Ser

145 150 155 160

Leu Cys Ala Arg Tyr Pro Glu Lys Arg Phe Val Pro Asp Gly Asn Arg

165 170 175

Ile Ser Trp Asp Ser Lys Lys Gly Phe Thr Ile Pro Ser Tyr Met Ile

180 185 190

Ser Tyr Ala Gly Met Val Phe Cys Glu Ala Lys Ile Asn Asp Glu Ser

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210 215 220

Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser Val Gly Glu

225 230 235 240

Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile

245 250 255

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260 265 270

Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met Lys Lys Phe

275 280 285

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290 295 300

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Phe Val Arg Val His Glu Lys Pro Phe Val Ala Phe Gly Ser Gly Met

325 330 335

Glu Ser Leu Val Glu Ala Thr Val Gly Glu Arg Val Arg Ile Pro Ala

340 345 350

Lys Tyr Leu Gly Tyr Pro Pro Pro Glu Ile Lys Trp Tyr Lys Asn Gly

355 360 365

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Ile Met Glu Val Ser Glu Arg Asp Thr Gly Asn Tyr Thr Val Ile Leu

385 390 395 400

Thr Asn Pro Ile Ser Lys Glu Lys Gln Ser His Val Val Ser Leu Val

405 410 415

Val Tyr Val Pro Pro Gln Ile Gly Glu Lys Ser Leu Ile Ser Pro Val

420 425 430

Asp Ser Tyr Gln Tyr Gly Thr Thr Gln Thr Leu Thr Cys Thr Val Tyr

435 440 445

Ala Ile Pro Pro Pro His His Ile His Trp Tyr Trp Gln Leu Glu Glu

450 455 460

Glu Cys Ala Asn Glu Pro Ser Gln Ala Val Ser Val Thr Asn Pro Tyr

465 470 475 480

Pro Cys Glu Glu Trp Arg Ser Val Glu Asp Phe Gln Gly Gly Asn Lys

485 490 495

Ile Glu Val Asn Lys Asn Gln Phe Ala Leu Ile Glu Gly Lys Asn Lys

500 505 510

Thr Val Ser Thr Leu Val Ile Gln Ala Ala Asn Val Ser Ala Leu Tyr

515 520 525

Lys Cys Glu Ala Val Asn Lys Val Gly Arg Gly Glu Arg Val Ile Ser

530 535 540

Phe His Val Thr Arg Gly Pro Glu Ile Thr Leu Gln Pro Asp Met Gln

545 550 555 560

Pro Thr Glu Gln Glu Ser Val Ser Leu Trp Cys Thr Ala Asp Arg Ser

565 570 575

Thr Phe Glu Asn Leu Thr Trp Tyr Lys Leu Gly Pro Gln Pro Leu Pro

580 585 590

Ile His Val Gly Glu Leu Pro Thr Pro Val Cys Lys Asn Leu Asp Thr

595 600 605

Leu Trp Lys Leu Asn Ala Thr Met Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asp Ile

610 615 620

Leu Ile Met Glu Leu Lys Asn Ala Ser Leu Gln Asp Gln Gly Asp Tyr

625 630 635 640

Val Cys Leu Ala Gln Asp Arg Lys Thr Lys Lys Arg His Cys Val Val

645 650 655

Arg Gln Leu Thr Val Leu Glu Arg Val Ala Pro Thr Ile Thr Gly Asn

660 665 670

Leu Glu Asn Gln Thr Thr Ser Ile Gly Glu Ser Ile Glu Val Ser Cys

675 680 685

Thr Ala Ser Gly Asn Pro Pro Pro Gln Ile Met Trp Phe Lys Asp Asn

690 695 700

Glu Thr Leu Val Glu Asp Ser Gly Ile Val Leu Lys Asp Gly Asn Arg

705 710 715 720

Asn Leu Thr Ile Arg Arg Val Arg Lys Glu Asp Glu Gly Leu Tyr Thr

725 730 735

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740 745 750

Ile Ile Glu Gly Ala Gln Glu Lys Thr Asn Leu Glu

755 760

<210> 3

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

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20 25 30

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100 105 110

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165 170 175

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180 185 190

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195 200 205

Pro Val Leu Ser Glu Ser

210

<210> 4

<211> 195

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Lys Arg Gly Val Val Leu Leu Tyr Ile Leu Leu Gly Thr Ile Gly Thr

1 5 10 15

Leu Val Ala Val Leu Ala Ala Ser Ala Leu Leu Tyr Arg His Trp Ile

20 25 30

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35 40 45

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50 55 60

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65 70 75 80

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85 90 95

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100 105 110

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115 120 125

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130 135 140

Asn Leu Ala Leu Asp Asp Gln Thr Leu Lys Leu Ile Leu Ile Lys Phe

145 150 155 160

Cys Tyr Phe Gln Glu Pro Glu Ser Leu Pro His Leu Val Lys Lys Ala

165 170 175

Leu Arg Val Leu Pro Thr Val Thr Trp Arg Gly Leu Lys Ser Val Pro

180 185 190

Pro Asn Ser

195

Claims

1.一种测定抗VEGF抗体活性的方法，其特征在于，包括如下步骤：

提供转染了VEGF受体、IL-1R3、IL-1R6以及报告基因的效应细胞；

用anti-CD3抗体和anti-CD28抗体激活所述效应细胞；

2.根据权利要求1所述的测定抗VEGF抗体活性的方法，其特征在于，所述加入待测抗VEGF抗体以阻断所述VEGF配体与所述VEGF受体结合的操作之前，还包括：

3.根据权利要求1所述的测定抗VEGF抗体活性的方法，其特征在于，所述转染了VEGF受体、IL-1R3、IL-1R6以及报告基因的效应细胞通过如下方法构建得到：

向所述含有报告基因的宿主细胞中转染第一载体和第二载体，其中所述第一载体中含有VEGF受体、IL-1R3基因以及抗性标记物，所述第二载体中含有VEGF受体、IL-1R6基因以及抗性标记物；

经所述抗性标记物筛选获得稳定表达VEGF受体、IL-1R3、IL-1R6以及报告基因的宿主细胞，得到所述效应细胞。

4.根据权利要求3所述的测定抗VEGF抗体活性的方法，其特征在于，所述宿主细胞为悬浮生长细胞。

5.根据权利要求1或3所述的测定抗VEGF抗体活性的方法，其特征在于，所述VEGF受体为VEGFR2。

6.根据权利要求3所述的测定抗VEGF抗体活性的方法，其特征在于，所述抗性标记物选自G481和zeo中的至少一种。

7.根据权利要求1所述的测定抗VEGF抗体活性的方法，其特征在于，所述报告基因具体为荧光素酶报告基因。

8.根据权利要求1所述的测定抗VEGF抗体活性的方法，其特征在于，所述VEGF配体选自VEGF-165和PIGF中的至少一种。

9.根据权利要求1所述的测定抗VEGF抗体活性的方法，其特征在于，所述抗VEGF抗体选自贝伐珠单抗、VEGF Trap、雷莫芦单抗及雷珠单抗中的至少一种。

10.根据权利要求1所述的测定抗VEGF抗体活性的方法，其特征在于，所述用anti-CD3抗体和anti-CD28抗体激活所述效应细胞的操作之前，还包括将所述效应细胞制备成细胞悬液，所述细胞悬液的浓度为1×10⁴个/孔～1×10⁶个/孔。