CN107922920A

CN107922920A - 补充牛磺酸的细胞培养基和使用方法

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Publication number: CN107922920A
Application number: CN201680041992.XA
Authority: CN
Inventors: A·S·约翰逊; M·E·卡塞; S·奥绍迪; S·劳伦斯
Original assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2015-08-04
Filing date: 2016-08-03
Publication date: 2018-04-17
Anticipated expiration: 2036-08-03
Also published as: JP2018521664A; WO2017024062A1; US20180223249A1; MX2018001531A; EA201890137A1; TWI797060B; JP2022162157A; AR105602A1; JP7198868B2; JP2021112215A; CN114854668A; TW201718849A; IL256525B2; KR20180032581A; CA2989178A1; TW202330904A; HK1250740A1; US10927342B2; CA3236082A1; US20240018467A1

Abstract

本说明书描述了包含改良的真核细胞培养基的组合物，其可用于产生感兴趣的蛋白。牛磺酸可加入无血清的培养基或化学成分确定的培养基中以增加感兴趣蛋白的产量。还包括使用培养基组合物来重组表达高水平蛋白的方法。

Description

补充牛磺酸的细胞培养基和使用方法

领域

本发明涉及培养细胞和用于产生重组蛋白的培养基和方法。本发明特别地涉及用于培养重组真核细胞用于产生蛋白生物治疗剂的添加牛磺酸的培养基和其方法。

背景

有机酸牛磺酸，通常称为β-氨基酸，在大多数的组织有高浓度的分布且为氨基酸半胱氨酸的衍生物(Huxtable,RJ.,1992,Physiol Rev,72：101-163)。

牛磺酸存在许多人类和其他哺乳动物种类的组织中，例如脑、视网膜、心肌、骨骼和平滑肌、血小板和嗜中性粒细胞。牛磺酸已知用来帮助渗透压调节、膜稳定和抗发炎，以及经由防护超氧化产生的增加的电子传递链活性来调节线粒体蛋白合成(Jong等人，2010,Journal of Biomedical Science 17(Suppl 1)：S25；Jong等人，2012,Amino Acids42：2223-2232sw)。在初代神经元培养中，牛磺酸，由于其抑制谷氨酸-引发的毒性，经定性为细胞保护剂。已开发出各种包含牛磺酸用于胚胎培养的培养基。

包含氨基酸进料的细胞培养技术用于从培养细胞产生重组蛋白已有悠久历史。氨基酸为生物合成前体、能量来源、渗透物质等等，且其在生产培养中的用途与连续细胞生长和生产力系强烈相关。

然而，有助于生产力和高产率蛋白表达的生理事件不计其数，且竞争代谢活性和运送机制使得培养策略的设计变成一种挑战。氨基酸补充的类型和添加的时机也可能对培养中所产生的蛋白的质量具有影响(Altamirano,et al.,2006,Electron.J.Biotechnol.9：61-67)。副产物的累积通常成为生产细胞培养的问题，且被视为细胞培养中营养物不均衡的后果，最后抑制细胞生长(Fan,Y.等人BiotechnolBioeng.2015Mar；112(3)：521-35)。在细胞培养中已建议亚牛磺酸或其类似物或前体，以便达到降低包含重组产生的多肽的组合物颜色浓度的期望结果(WO2014145098A1,2014年9月18日公开)。促进未成熟的视网膜色素上皮细胞成熟化为成熟的视网膜色素上皮细胞的包含牛磺酸的细胞培养基已有描述(WO2013184809A1,published 12 December 2013)。然而，在补充牛磺酸的培养中优化重组蛋白生产力在现有技术中尚未辨识出。增加重组表达蛋白的生产力同时将可能的有毒细胞代谢副产物例如氨减至最小的细胞培养方法为极其期望的。生产力的任何恒定增益可能等同商业规模的生物治疗产品的明显较高的供应。

因此，现有技术对于培养哺乳动物细胞的培养基和方法存在需求，其中该培养基允许健康和强健的细胞生长和维持，和高滴度产生生物医药物质。

发明概述

本发明人已惊人地发现，培养基中包含牛磺酸增加了细胞单位生产力并使这些细胞有较少的氨副产物。各种包含牛磺酸的培养策略使得蛋白产生滴度增加。此外，加入牛磺酸对于培养效能或所产生的抗体质量并无负面影响。

本发明提供用于以高产率产生治疗蛋白的方法，其包括于含有牛磺酸的培养基中培养重组细胞，其中该细胞包含编码该治疗蛋白的稳定整合的核酸。

本发明涉及细胞培养基，其为无血清的并包含约0.1mM至约10mM牛磺酸。本发明涉及细胞培养基，其为无血清的并包含约0.1mM至约1mM牛磺酸，约0.2至约1mM牛磺酸，约0.3至约1mM牛磺酸，约0.4至约1mM牛磺酸，或约0.5至约1mM牛磺酸。本发明涉及细胞培养基，其为无血清的并包含约1mM至约10mM牛磺酸。本发明涉及细胞培养基，其为无血清的并包含约1mM至约5mM牛磺酸，约1mM至约6mM牛磺酸，约1mM至约7mM牛磺酸，约1mM至约8mM牛磺酸，或约1mM至约9mM牛磺酸。

在某些实施方案中，培养基进一步包含由下列组成的群中选择的另外的氨基酸：精氨酸、组氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。

在某些实施方案中，培养基含有≤16g/L水解产物。在某些实施方案中，培养基并无任何水解产物。

在一个实施方案中，培养基含有化学成分确定的基础培养基，例如常规配制物或市售基础培养基。在一个实施方案中，完全培养基为化学成分确定的、无血清和无水解产物。

在某些实施方案中，整个过程(包含基础培养基和进料)含有总计至少115mM的氨基酸或氨基酸盐的混合物。在一个实施方案中，氨基酸的混合物包含由下列组成的群中选择的氨基酸：精氨酸、组氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸，其量由表1中选择。

在某些实施方案中，培养基含有一种或多种脂肪酸。在一个具体的实施方案中，培养基含有脂肪酸(或脂肪酸衍生物)和α生育醇的混合物。脂肪酸或脂肪酸衍生物选自：亚麻油酸、次亚麻油酸、硫辛酸、油酸、棕榈酸、硬脂酸、花生酸、花生四烯酸、月桂酸、山嵛酸、癸酸、十二酸、己酸、掬焦油酸(lignoceric acid)、肉豆蔻酸和辛酸。

在某些实施方案中，培养基含有核苷的混合物。在一个实施方案中，培养基含有腺苷、鸟苷、胞苷、尿苷、胸苷和次黄嘌呤。

在某些实施方案中，培养基含有盐类的混合物。盐类包括二价阳离子，例如钙和镁。在一个实施方案中，培养基含有氯化钙和硫酸镁。其他的盐类可包括磷酸盐。

在一个实施方案中，培养基(1)含有0.1±0.015mM、1±0.015mM、3±0.05mM、5±0.10mM、7±0.15mM或10±0.2mM牛磺酸，(2)含有≤16g/L的水解产物，(3)为无血清的，(4)任选另外含有氨基酸的混合物，(5)含有脂肪酸的混合物，(6)含有核苷的混合物，包括腺苷、鸟苷、胞苷、尿苷、胸苷和次黄嘌呤，和(7)含有钙、镁的盐类和磷酸盐。

本发明提供以高产率产生感兴趣蛋白的方法，其包括于含有至少约0.1mM至约10mM牛磺酸的细胞培养基中培养重组细胞系，其中该细胞系包含编码该蛋白的稳定整合的核酸。在其他的实施方案中，培养基的实施方案为任何前述本发明的方面。

在另外的方面，本发明提供培养真核细胞用于增加重蛋白产量的方法，其包括下列步骤：(a)在生长阶段期间于成分确定的细胞培养基中增殖或维持细胞，(b)以约0.1mM至约10mM L-牛磺酸补充此基础细胞培养基并于生产阶段期间表达感兴趣的重组蛋白，和(c)通过添加牛磺酸来增加感兴趣蛋白的滴度。在某些实施方案中，此牛磺酸补充在生产阶段期间至少提供一次，或两次、三次、四次或五次，或在生产阶段期间每天提供。在其他的实施方案中，此方法进一步包括在生产阶段期间以约0.1mM至约10mM L-牛磺酸补充培养基。在某些实施方案中，相较于缺乏牛磺酸补充物或含有低于0.1mM牛磺酸补充物或在另外相同的条件下的真核细胞，此方法提供增加产量的重组蛋白。

在另外的方面，本发明提供在细胞培养基(例如任何前述方面所述的培养基的实施方案)中培养细胞的方法。在一个实施方案中，此方法使用在(1)含有至少0.1mM±0.015mM浓度的牛磺酸，(2)含有≤16g/L水解产物或无水解产物，(3)为无血清的，(4)和任选选自表1的氨基酸的混合物的氨基酸的培养基中增殖或维持细胞的步骤。

在一个实施方案中，此任选的氨基酸补充物混合物由表1的氨基酸组成的群中选择：

表1

在某些实施方案中，细胞为哺乳动物细胞、鸟类细胞、昆虫细胞、酵母细胞或细菌细胞。在一个实施方案中，细胞为可用于产生重组蛋白的哺乳动物细胞，例如CHO细胞或衍生物CHO-K1。在某些实施方案中，细胞表达感兴趣蛋白，例如生物治疗蛋白。此生物治疗蛋白可为抗原结合蛋白，其可含有Fc结构域。在某些实施方案中，感兴趣蛋白为Fc-融合蛋白，例如ScFv分子或捕捉阱分子(trap molecule)。捕捉阱分子包括(但不限于)VEGF阱和IL-1阱蛋白。在某些实施方案中，感兴趣蛋白为抗体，例如人类单克隆抗体、人源化单克隆抗体、双特异性抗体或抗体片段。

如果通过于各种形式的无血清培养基中包括牛磺酸而对蛋白产生产生正面效应，则根据此方法所培养的细胞使得平均的蛋白滴度增加。在一个实施方案中，当相较于未补充牛磺酸的培养基的蛋白滴度时，生长于根据此方法的补充牛磺酸培养中的细胞产生具有大于比较对照培养(即未补充牛磺酸的培养)至少8％的蛋白滴度。在一个实施方案中，生长于补充牛磺酸培养中的细胞，当与未补充牛磺酸的培养基中的蛋白滴度相比较时，产生大于比较物对照培养的滴度至少9％，至少10％，至少11％，至少12％，至少13％，至少14％，至少15％，至少16％，至少17％，至少18％，至少19％，至少20％，至少21％，至少22％，至少23％，至少24％，至少25％，至少26％，至少27％，至少28％，或至少29％的蛋白滴度。

同样的，在无血清培养基中单独包括牛磺酸可让培养细胞得到比不包含牛磺酸更低的氨副产物。在无血清和无水解产物的补充牛磺酸的培养基的实施方案中，细胞培养能得到比不含有补充物(即低于0.1mM牛磺酸或无牛磺酸补充物)的类似细胞培养中降低至少4％，至高降低32％的氨副产物量(mM NH₃)。

在另外的实施方案中，此方法包括于细胞培养基中加入一个或多个使用点(point-of-use)添加物的步骤。在某些实施方案中，此使用点添加物为任何一种或多种的NaHCO₃、谷氨酰胺、胰岛素、葡萄糖、CuSO₄、ZnSO₄、FeCl₃、NiSO₄、Na₄EDTA和柠檬酸钠。在一个实施方案中，此方法使用将各下列使用点化学物加到细胞培养基的步骤：NaHCO₃、谷氨酰胺、胰岛素、葡萄糖、CuSO₄、ZnSO₄、FeCl₃、NiSO₄、Na₄EDTA和柠檬酸钠。在某些实施方案中，使用点添加物可在一开始时包括在培养基中。

在具体实施方案中，此方面提供于无血清培养基中培养细胞的方法，培养基基本上由(1)浓度至少0.1mM的牛磺酸；(2)含有≤16g/L的水解产物，(3)为无血清的，和(4)任选另外含有至少约20mM，或至少约25mM，或至少约30mM，或至少约40mM，或至少约50mM，或至少约60mM，或至少约70mM由下列组成的群中选择的总氨基酸的混合物所组成：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。

在另外的方面，本发明通过使用下列步骤提供产生感兴趣蛋白的方法：(1)于细胞中导入编码感兴趣蛋白的核酸序列；(2)选择表达感兴趣蛋白的一个或多个细胞；(3)于任何前述方面所述的无血清细胞培养基的实施方案中或根据文中所述的方法的实施方案中培养此选择的细胞；和(4)于细胞中表达感兴趣蛋白，其中感兴趣蛋白被分泌至培养基。在某些实施方案中，用于产生蛋白的细胞为能产生生物治疗剂的哺乳动物细胞，例如CHO、293和BHK细胞，或其任何衍生物。在一个实施方案中，细胞为CHO细胞，例如CHO-K1细胞。

在某些实施方案中，感兴趣蛋白为抗原结合蛋白。在某些实施方案中，感兴趣蛋白为具有Fc结构域的蛋白。在某些情况下，两种感兴趣蛋白可能重叠，例如受体-Fc-融合蛋白的情况，例如抗体和ScFv蛋白。因此，在某些实施方案中，感兴趣蛋白为抗体，例如人类抗体或人源化抗体，抗体片段，例如Fab或F(ab’)₂，双特异性抗体，捕捉阱分子，例如VEGF-阱或IL-1-阱，ScFv分子、可溶性TCR-Fc融合蛋白等等。

在一个实施方案中，感兴趣蛋白能以平均14、15、16或17天滴度产生，其比类似细胞于含有低于0.1mM或未补充牛磺酸的无血清细胞培养基所产生的平均14、15、16或17天滴度高至少8％。在一个实施方案中，感兴趣蛋白能以平均6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17天滴度产生，其比类似细胞于含有低于0.1mM或未补充牛磺酸的无血清细胞培养基所产生的平均6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17天滴度高至少9％，至少10％，至少11％，至少12％，至少13％，至少14％，至少15％，至少16％，至少17％，至少18％，至少19％，至少20％，至少21％，至少22％，至少23％，至少24％，至少25％，至少26％，至少27％，至少28％，或至少29％。

在另外的实施方案中，感兴趣蛋白通过以下步骤产生：(1)于CHO细胞中导入一编码感兴趣蛋白(例如抗体或其他抗原结合蛋白)的核酸序列；(2)选择一稳定表达感兴趣蛋白的细胞；(3)于包含约0.1mM至约10mM牛磺酸的无血清细胞培养基中培养此选择的细胞。

附图简述

图1显示每天从产生Ab3的细胞培养中的生产培养所回收的样品蛋白滴度(产率)，其中提供与无牛磺酸补充相比(以虚线所连接的x)的牛磺酸-补充(以实线所连接的实心正方形)。补充牛磺酸培养对蛋白产率的益处可在早期如生产培养的第6天看出。

发明详述

应理解本发明不限于特定的方法和所述的实验条件，因为方法和条件可能改变。还应理解，文中所用的术语仅作为描述特定实施方案的目的，且不希望受限制，因为本发明的范围是以申请专利范围来定义。

除非内文中另有清楚指出，否则如本说明书和所附的权利要求书中所用，单数形式“一个”和“一种”包括多数形式的参照物。因此，例如，“一种方法”的提及包括一种或多种方法，和/或文中所述的类型的步骤，和/或在阅读本公开内容后，其对于本领域技术人员将变得某些。

除非另有定义或另有说明，否则文中所用的所有的技术和科学术语具有与本发明所属的领域中的一般技术人员通常理解的意义。虽然任何类似或等同文中所述的方法和物质可用于实践本发明，但具体的物质和方法为本文所述。文中所提及的所有出版物以全文引用的方式并入本文中。

本发明人已惊人地发现，相对于含有非常少量或无牛磺酸的细胞培养基，细胞培养基中添加牛磺酸增加了细胞培养中重组细胞的蛋白产生。

在描述本细胞培养和方法之前，应理解本发明不限于特定的方法和所述的实验条件，因为方法和条件可能改变。还应理解，文中所用的术语仅作为描述特定实施方案的目的，且不希望受到限制。

文中所用的段落标题仅作为组织目的且不应视为限制所述的主题。除非另有指出，否则文中所述的方法和技术一般根据现有技术中已知的常规方法和如整个说明书中所引述和讨论的各种通用和更具体参考文献中所述来进行。参见，例如Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual,3^rd ed.,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,Cold Spring Harbor,N.Y.(2001)和Ausubel等人，Current Protocols inMolecular Biology,Greene Publishing Associates(1992),Harlow and LaneAntibodies：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,N.Y.(1990)，和Julio E.Celis,Cell Biology：A Laboratory Handbook,2^nd ed.,Academic Press,New York,N.Y.(1998)，和Dieffenbach和Dveksler,PCR Primer：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1995)。整个公开内容中提及的所有出版物以全文引用的方式并入本文中。

定义

“牛磺酸”也称为2-氨基乙磺酸(IUPAC命名法；CAS登录号107-35-7)。“牛磺酸”和“L-牛磺酸”可交换使用是指相同的有机化合物。牛磺酸为含有氨基基团的有机酸，然而并不视为现有技术中熟知的氨基酸，而氨基酸含有氨基基团和羧基基团二者。当亚牛磺酸(一种半胱氨酸的衍生物)通过氧化转变成牛磺酸时，则发生牛磺酸的生合成。

术语“补充”和类似术语是指加入成分、组分、分子等，其可用于培养基供细胞培养以维持和/或促进细胞的生长和/或分化，延长或强化培养或细胞整体的属性，或补其不足。就此目的，补充牛磺酸包括加入特定浓度的牛磺酸溶液于培养基中。

如文中所用“肽”、“多肽”和“蛋白”全部可交换使用并是指包括两个或多个氨基酸残基彼此通过肽键相连接的分子。肽、多肽和蛋白也可包括修饰，例如糖基化、脂质连接、硫化、谷氨酸残基的γ-羧基化、烷化、羟化和ADP-核糖基化。肽、多肽和蛋白可具有科学或商业利益，包括蛋白药物。尤其是，肽、多肽和蛋白包含抗体和嵌合或融合蛋白。肽、多肽和蛋白可通过重组的动物细胞系使用细胞培养法来产生。

如文中所用，术语“异源性聚核苷酸序列”是指编码感兴趣蛋白的核酸聚合物，例如经产生为生物医药物质的嵌合蛋白(如捕捉阱分子)、抗体或抗体部分(例如VH、VL、CDR3)。异源性聚核苷酸序列可通过基因工程技术来产生(例如，如编码羟核蛋白的序列，或密码子优化序列，无内含子序列等)并导入细胞中，其中其可驻留作为游离基因(episome)或可整合至细胞的基因组中。异源性聚核苷酸序列可为导入生产细胞基因组内的异位位置的天然生成序列。此异源性聚核苷酸序列可为来自其他生物体的天然生成序列，例如编码人类异种同源物的序列。

“抗体”是指通过二硫键相连接的四条多肽链(二条重(H)链和二条轻(L)链)所组成的免疫球蛋白分子。各重链具有重链可变区(HCVR或V_H)和重链恒定区。重链恒定区含有三个结构域，CH1、CH2和CH3。各轻链具有轻链可变区和轻链恒定区。轻链恒定区由一个结构域(CL)所组成。VH和VL区可进一步细分为高变区，称为互补决定区(CDR)，其间散布着较保守性区域，称为框架区(FR)。各VH和VL由三个CDR和四个FR所组成，以下列顺序由氨基端排列至羧基端：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。术语“抗体”包括提到的糖基化和非糖基化免疫球蛋白的任何同型或亚类。术语“抗体”包括通过重组方法制备、表达、创制或分离的抗体分子，例如由转染表达此抗体的宿主细胞所分离的抗体。术语抗体还包括双特异性抗体，其包括可与一个以上的不同表位结合的异四聚化免疫球蛋白。双特异性抗体一般性描述于美国专利申请公开号2010/0331527，其以引用的方式并入本申请文中。

术语抗体的“抗原结合部分”(或“抗体片段”)是指一种或多种保留与抗原特异性结合的能力的抗体片段。涵盖在术语抗体的“抗原结合部分”内的结合片段的实例包括(i)Fab片段，一种由VL、VH、CL和CH1结构域所组成的单价片段；(ii)F(ab’)2片段，一种包括两个Fab片段通过二硫桥在铰链区相连接的二价片段；(iii)Fd片段，由VH和CH1区所组成；(iv)Fv片段，由抗体单臂的VL和VH结构域所组成，(v)dAb片段(Ward et al.(1989)Nature241：544-546)，其由VH结构域所组成，(vi)分离的CDR，和(vii)scFv，其由Fv片段的两个区VL和VH，通过合成的接头相连接形成单一蛋白链所组成，其中VL和VH结构域对形成单价分子。其他单链抗体的形式，例如双抗体亦涵盖在术语“抗体”中(参见，例如Holliger et al.(1993)PNAS USA 90：6444-6448；Poljak et al.(1994)Structure 2：1121-1123)。

更进一步，抗体或其抗原结合部分可为较大免疫黏附分子的一部分，其通过抗体或抗体部分与一种或多种其他蛋白或多肽共价或非共价结合所形成。免疫黏附分子的实例包括使用链霉亲和素核心区来产生四聚化scFv分子(Kipriyanov et al.(1995)HumanAntibodies and Hybridomas 6：93-101)和使用半胱氨酸残基、标记蛋白和C-端聚组氨酸标签来产生二价和生物素化的scFv分子(Kipriyanov et al.(1994)Mol.Immunol.31：1047-1058)。抗体部分，例如Fab和F(ab’)2片段可从完整的抗体使用熟知的技术，例如通过完整抗体的木瓜酶(papain)或胃蛋白酶(pepsin)消化来制备。此外，抗体、抗体部分和免疫黏附分子可使用现有技术熟知的标准重组DNA技术来获得(参见Sambrook et al.,1989)。

术语“人类抗体”意欲包括具有衍生自人类生殖系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。本发明的人类抗体也可包括并非由人类生殖系免疫球蛋白序列所编码的氨基酸残基(例如通过随机或定点突变于体外导入突变或通过体内的体细胞突变)，例如在CDR和特别是CDR3中。然而，如文中所用，术语“人类抗体”不包括其中衍生自另外的哺乳动物物种例如小鼠的生殖系的CDR序列已嫁接至人类框架序列上的抗体。

如文中所用，术语“重组的人类抗体”意欲包括所有通过重组方法制备、表达、产生或分离的人类抗体，例如使用转染至宿主细胞的重组表达载体所表达的抗体、分离自重组物的抗体、组合的人类抗体库、分离自人类免疫球蛋白基因的转基因动物(例如小鼠)的抗体(参见，例如Taylor et al.(1992)Nucl.Acids Res.20：6287-6295)，或通过任何其他涉及剪接人类免疫球蛋白基因序列至其他DNA序列的方法所制备、表达、产生或分离的抗体。重组的人类抗体具有衍生自人类生殖系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区。然而，在特定的实施方案中，重组的人类抗体于体外进行突变(或当使用人类Ig序列的转基因动物时为体内体细胞突变)且因此该重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列，当衍生自人类生殖系VH和VL序列或与其相关时，可能为并非于体内天然存在人类抗体生殖系储库的序列。

“Fc融合蛋白”包括部分或全部两个或多个蛋白，其中的一个为免疫球蛋白分子的Fc部分，其并非在自然界中一起发现的。包括特定异源性多肽与不同部分的抗体衍生多肽(包括Fc结构域)融合的融合蛋白的制备已有描述，例如Ashkenazi et al.,Proc.Natl.Acad.ScL USA 88：10535,1991；Byrn et al.,Nature 344：677,1990；和Hollenbaugh et al.,"Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins",inCurrent Protocols in Immunology,Suppl.4,pages10.19.1-10.19.11,1992。“受体Fc-融合蛋白”包括一个或多个与Fc部分结合的受体胞外区，其在某些实施方案中包括铰链区接着免疫球蛋白的CH2和CH3区。在某些实施方案中，此Fc-融合蛋白含有两个或多个与一个或多个配体结合的不同受体链。例如，此Fc-融合蛋白为捕捉阱(trap)，例如IL-1阱(例如列洛西普(rilonacept)，其含有与IL-1R1胞外区融合的IL-1RAcP配体-结合区，而该IL-1R1胞外区与hIgG1的Fc结构域融合；参见美国专利第6,927,004号)，或VEGF捕捉阱(例如阿柏西普(aflibercept)，其含有与VEGF受体Flk1的Ig3区融合的VEGF受体Flt1的Ig结构域2，而该VEGF受体Flk1的Ig结构域3与hIgG1的Fc结构域融合；参见美国专利第7,087,411和7,279,159号)。

细胞培养

术语“细胞培养基”和“培养基”是指用于生长哺乳动物细胞的营养物溶液，其通常提供必需营养物来促进细胞生长，例如碳水化合物能量来源、必需氨基酸(例如苯丙氨酸、缬氨酸、苏氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸和组氨酸)和非必需氨基酸(例如丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸和酪氨酸)、微量元素、能量来源、脂质、维生素等。细胞培养基可含有提取物，例如血清或蛋白胨(水解产物)，其供应支持细胞生长的原料。培养基可含有酵母-衍生的或大豆提取物，而非动物-衍生的提取物。化学成分确定的培养基是指其中所有的化学组分为已知的(即具有已知的化学物结构)的细胞培养基。化学成分确定的培养基完全不含动物-衍生的组分，例如血清或动物-衍生的蛋白胨。在一个实施方案中，培养基为化学成分确定的培养基。

此溶液也可含有促进生长和/或最小存活率以上的组分，包括激素和生长因子。此溶液优选地被配制至适合细胞存活和增殖的pH和盐浓度。

“细胞系”是指经由细胞的连续传代或次代培养衍生自特定品系的一种或多种细胞。术语“细胞”可与“细胞群体”交换使用。

术语“细胞”包括适用于表达重组核酸序列的任何细胞。细胞包括真核细胞，例如非人类动物细胞、哺乳动物细胞、人类细胞、鸟类细胞、昆虫细胞、酵母细胞或细胞融合物，例如杂交瘤或四重杂交瘤。在特定的实施方案中，细胞为人类、猴、人猿、仓鼠、大鼠或小鼠细胞。在特定的实施方案中，细胞为选自下列细胞的细胞：CHO(例如CHO K1、DXB-11CHO、Veggie-CHO)、COS(例如COS-7)、视网膜细胞、Vero、CV1、肾(例如HEK293、293EBNA、MSR 293、MDCK、HaK、BHK21)、HeLa、HepG2、WI 38、MRC 5、Colo25、HB 8065、HL-60，淋巴细胞，例如Jurkat(T淋巴细胞)或Daudi(B淋巴细胞)、A431(表皮)、CV-1、U937、3T3、L细胞、C127细胞、SP2/0、NS-0、MMT细胞、干细胞、肿瘤细胞和衍生自前述细胞的细胞系。在某些实施方案中，细胞包括一个或多个病毒基因，例如表达病毒基因的视网膜细胞(例如细胞)。在某些实施方案中，细胞为为CHO细胞。在其他的实施方案中，细胞为CHO K1细胞。

本发明一方面涉及接种培养，其中细胞群体在蛋白生产前扩增并于生产培养中收获。根据如文中所述的本发明，牛磺酸可以作为接种培养配制物加到基础培养基中。

本发明另一方面涉及生产培养，蛋白在其中生产并收获。在生产阶段之前，通常有生长阶段(也称为接种训练或接种培养)，其中用于细胞培养的所有组分在培养程序开始时供应至培养容器中，然后扩增细胞群体直到准备好生产规模。就此而言，根据起始细胞系，将培养容器以适合的接种密度接种细胞，进行起初的细胞生长阶段。在某些方面，根据如文中所述的本发明，牛磺酸可以作为接种培养配制物加到基础培养基以进一步增加或促进在后续生产阶段中细胞的生产力。

本发明一方面涉及生产培养，其中细胞培养条件经修改以增加重组原核细胞的生长，同时增加细胞的一种或多种感兴趣重组蛋白的生产和维持细胞生存力，特别地通过加入牛磺酸至生产细胞培养基和/或接种培养中。在生产培养容器或生物反应器中，基础培养基和细胞系在接种培养或生长阶段之后供应至培养容器中。在某些实施方案中，在生产培养后收获细胞上清液或细胞裂解物。在其他的实施方案中，感兴趣多肽或蛋白从细胞培养基或细胞裂解物中回收，或无论情况如何，依照感兴趣蛋白的位置，使用本领域熟知的技术回收。

培养容器包括(但不限于)多孔盘、T-烧瓶、震荡烧瓶、搅拌容器、旋转烧瓶中空纤维、气升式生物反应器等等。适合的细胞培养容器为生物反应器。生物反应器是指经产生或改造以操作或控制环境条件的任何培养容器。这样的培养容器已为现有技术所熟知。

生物反应器程序和系统已被开发以使气体交换优化，以供应足够的氧气来维持细胞生长和生产力，并移除CO₂。维持气体交换功效是确保成功扩大细胞培养和蛋白生产的重要准则。这样的系统已为现有技术人员所熟知。

在多肽生产阶段中，“进料式批次细胞培养”或“进料式批次培养”是指其中动物细胞和培养基在开始时供应至培养容器，和在培养期间以持续或以离散扩增将另外的培养营养物缓慢注入至培养中，无论在培养终止前有或无定期的细胞和/或产物收获。进料式批次培养包括“半连续进料式批次培养”，其中定期地移除整个培养(其可包括细胞和培养基)并以新鲜的培养基置换。进料式批次培养不同于简单的“批次培养”，而所有细胞培养的组分(包括动物细胞和所有的培养营养物)在批式培养的培养程序开始时供应至培养容器中。只要是在进行期间并未从培养容器移除上清液，进料式批次培养可进一步与灌注培养区分，而在灌注培养中，细胞局限在培养中，通过例如过滤，和培养基系持续或间接地导入和从培养容器中移除。然而，要考虑在进料式批次培养期间就检测目的移出样品。此进料式批次程序系持续直到测定出达到最大工作容积和/或蛋白生产量。

“连续细胞培养”一词当用于文中涉及用于连续培养细胞的技术，通常在特别的生长阶段。例如，如果需要恒定供应细胞，或需要产生特定的感兴趣多肽或蛋白，则细胞培养可能需要维持在特别的生长阶段。因此，必须持续监测条件并据此调整以便将细胞维持在特定的时期。

培养基

本发明提供包含约0.1mM至10mM牛磺酸的细胞培养基，其为无血清的。“无血清的”适用于不含有动物血清，例如胎牛血清的细胞培养基。无血清培养基可能含有≤16g/L的水解产物，例如大豆水解产物。本发明还提供化学成分确定的培养基，其不仅为无血清的，同时还为无水解产物。“无水解产物”适用于不含有外源性蛋白水解产物，例如动物或植物蛋白水解产物，例如蛋白胨、胰胨等等的细胞培养基。“基础培养基”为起初的培养基(存在接种和/或在第0天的细胞培养生产中)，细胞在其中增殖并含有所有必需的营养物，其包括氨基酸的基底混合物。各种用于基础培养基的配方(即配制物)可以市售量来产生或购买。同样的，“基础进料培养基”含有在生产培养期间正常消耗的补充营养物混合物并以进料策略来利用(用于所谓的“进料式批次”培养)。各式各样的基础培养基可从市面上购得。“进料”包括定期的添加或以规律的间隔添加至培养基，例如根据计划，包括持续进料培养系统，如恒化器中(chemostat)(参见C.Altamirano et al.,Biotechnol Prog.2001Nov-Dec；17(6)：1032-41)，或根据进料式批次程序(Y.M.Huang et al.,Biotechnol Prog.2010Sep-Oct；26(5)：1400-10)。例如，培养可为每天、每隔一天、每三天进料一次，或可在监控下当特定培养基组分的浓度落在期望的范围以外时进料。

从细胞培养基中消除血清和降低或消除水解产物，同时降低每批次间的变异性和增加下游处理步骤，不幸地减低了细胞生长、生存力和蛋白表达。因此，化学成分确定的无血清和低至无水产物的培养基需要另外的成分以增加细胞生长和蛋白产量。

因此，本发明的细胞培养基包括基础培养基，其含有存活细胞培养所有必需的营养物。根据如文中所述的本发明，牛磺酸可以作为接种培养配制物加到基础培养基中。此外，牛磺酸可以作为生产培养配制物加到基础培养基中，其然后依照所培养的细胞的需求或期望的细胞培养参数，可在有或无另外的成分(例如聚胺)或增加浓度的组分如氨基酸、盐类、糖类、维生素、激素、生长因子、缓冲剂、抗生素、脂质、微量元素等等下定期进料(如于所谓的“进料式批次”培养中)。

本发明提供补充牛磺酸的细胞培养基在蛋白生产培养期间氨基酸可能耗尽，其中不提供另外的氨基酸补充，或此补充牛磺酸的细胞培养基可能为“非耗尽的”，其中氨基酸补充提供用于耗尽的氨基酸(如下述)。本发明人已观察到，在生产阶段期间补充有牛磺酸的培养物在各种如前面所述的培养条件下增加了重组蛋白产量。

本发明提供补充牛磺酸的培养基，其含有至少约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10mM浓度(以每升毫摩尔表示)的牛磺酸。

在一个实施方案中，培养基另外含有100μM±15μM鸟氨酸，或300μM±45μM鸟氨酸，或600μM±90μM鸟氨酸，或甚至900μM±135μM鸟氨酸。在另外的实施方案中，培养基含有至少约5mg/L±1mg/L鸟氨酸·HCl，或至少约10mg/L±2mg/L鸟氨酸·HCl,15mg/L±2.25mg/L鸟氨酸·HCl，或至少约50mg/L±7.5mg/L鸟氨酸·HCl，或至少约100mg/L±15mg/L鸟氨酸·HCl，或至少约150mg/L±22.5mg/L鸟氨酸·HCl。

腐胺(putrescine)可任选加到补充的培养基中。在某些细胞培养基配制物中以包括非常低浓度的腐胺作为组分；参见例如WO2005/028626，其描述了0.02-0.08mg/L腐胺；美国专利第5,426,699号(0.08mg/L)；美国专利第RE30,985号(0.16mg/L)；美国专利第5,811,299号(0.27mg/L)；美国专利第5,122,469号(0.5635mg/L)；美国专利第5,063,157号(1mg/L)；WO 2008/154014(～100μM-～1000μM)；美国专利申请案第2007/0212770号(0.5-30mg/L多胺；2mg/L腐胺；2mg/L腐胺+2mg/L鸟氨酸；2mg/L腐胺+10mg/L鸟氨酸)。

在某些实施方案中，培养基进一步补充鸟氨酸和腐胺的组合物，其中腐胺可为至少约150至720μM的浓度。在某些实施方案中，培养基进一步补充至少约170至230μM浓度的腐胺。在一个实施方案中，培养基除了≥90μM±15μM鸟氨酸之外，含有200μM±30μM腐胺。在一个实施方案中，培养基除了≤15mg/L±2.25mg/L鸟氨酸之外，含有≤30mg/L±4.5mg/L腐胺·2HCl。在另外的实施方案中，培养基除了≥15mg/L±2.25mg/L鸟氨酸·HCl之外，含有≥30mg/L±4.5mg/L腐胺·2HCl(参见2014年9月14日公开的国际公开案第WO2014/144198A1号，其以全文引用的方式并入本文中)。

在其他的实施方案中，鸟氨酸以范围从0.09±0.014mM至0.9±0.14mM，例如0.09±0.014mM，0.3±0.05mM，0.6±0.09mM，或0.9±0.14mM鸟氨酸的浓度存在培养基中。在某些实施方案中，培养基还含有至少0.20±0.03mM腐胺。在某些实施方案中，此另外的腐胺浓度范围为从0.20±0.03mM至0.714±0.11mM，例如0.20±0.03mM，0.35±0.06，或0.714±0.11mM腐胺。

各种其他的补充物可加到培养基中且在本领域技术人员的技术范围内以决定另外适合的条件。在某些实施方案中，培养基补充了由下列组成的群中选择的氨基酸的混合物：天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、甘氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸和色氨酸，以便于为非耗尽的或当需要补充的营养物时。

在一个实施方案中，培养基进一步补充约170μM至175μM核苷。在一个实施方案中，培养基含有至少40μM，至少45μM，至少50μM，至少55μM，至少60μM，至少65μM，至少70μM，至少75μM，至少80μM，至少85μM，至少90μM，至少95μM，至少100μM，或至少105μM累积浓度的嘌呤衍生物。在一个实施方案中，培养基含有约100μM至110μM的嘌呤衍生物。嘌呤衍生物包括次黄嘌呤和核苷腺苷和鸟苷。在一个实施方案中，培养基含有至少30μM，至少35μM，至少40μM，至少45μM，至少50μM，至少55μM，至少60μM，或至少65μM累积浓度的嘧啶衍生物。在一个实施方案中，培养基含有约65μM至75μM的嘧啶衍生物。嘧啶衍生物包括核苷胸苷、尿苷和胞苷。在一个具体的实施方案中，培养基含有腺苷、鸟苷、胞苷、尿苷、胸苷和次黄嘌呤。

除了包括任何上述添加物之外，在一个实施方案中，培养基进一步补充微摩尔量的脂肪酸(或脂肪酸衍生物)和生育醇。在一个实施方案中，此脂肪酸包括任何一或多项的亚麻油酸、次亚麻油酸、硫辛酸、油酸、棕榈酸、硬脂酸、花生酸、花生四烯酸、月桂酸、山嵛酸、癸酸、十二酸、己酸、掬焦油酸、肉豆蔻酸和辛酸。在一个实施方案中，培养基含有生育醇、亚麻油酸和硫辛酸。

在一个实施方案中，培养基也可进一步补充维生素的混合物，其包括至少约700μM或至少约2mM累积浓度的其他的营养物和必需营养物。在一个实施方案中，维生素的混合物含有一种或多种的D-生物素、氯化胆碱、叶酸、肌醇、烟碱酰胺、吡哆醇HCl、D-泛酸(hemiCa)、核黄素、硫胺素HCl、维生素B12等等。在一个实施方案中，维生素的混合物包括所有的D-生物素、氯化胆碱、叶酸、肌醇、烟碱酰胺、吡哆醇HCl、D-泛酸(hemiCa)、核黄素、硫胺素HCl和维生素B12。

本发明培养基的各种实施方案包括任何的上述实施方案的组合，包括化学成分确定的、无水解产物、无血清培养基，其系含指定量的牛磺酸，加上(尤其是)(a)氨基酸；(b)任选核苷；(c)二价阳离子的盐类；(d)脂肪酸和生育醇；和(e)维生素。在某些实施方案中，所有小量的水解产物可加到补充牛磺酸的培养基中。

申请人设想，在本发明的实践中，一种或多种的各式基础培养基或其组合可使用牛磺酸。基础培养基一般已为现有技术所知并包括(尤其是)Eagle’s MEME(最小必需培养基)(Eagle,Science,1955,112(3168)：501-504)、Ham’s F12(Ham,Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA,1965,53：288-293)、F-12K培养基、杜氏(Dulbecco,s)培养基、杜氏修改伊格尔培养基(Dulbecco,s Modified Eagle Medium)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,1952August；38(8)：747-752)、DMEM/Ham’s F12 1：1、Trowell,s T8、A2培养基Holmes andWolf,Biophys.Biochem.Cytol.,1961,10：389-401)、Waymouth培养基(Davidson andWaymouth,Biochem.J.,1945,39(2)：188-199)、Williams E培养基(William,s et al.,Exp.Cell Res.,1971,69：105et seq.)、RPMI 1640(Moore et al.,J.Amer.Med.Assoc.,1967,199：519-524)、MCDB 104/110培养基(Bettger et al.,Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA,1981,78(9)：5588-5592)、Ventrex HL-1培养基、白蛋白-球蛋白培养基(Orr et al.,Appl.Microbiol.,1973,25(1)：49-54)、RPMI-1640培养基、RPMI-1641培养基、Iscove,s修改杜氏培养基、McCoy,s 5A培养基、Leibovitz’s L-15培养基，以及无血清培养基，例如EX-CELL^TM 300 Series(JRH Biosciences,Lenexa,Kansas)、鱼精蛋白(protamine)-锌-胰岛素培养基(Weiss et al.,1974,US 4,072,565)、生物素-叶酸培养基(Cartaya,1978,USRe30,985)、运铁蛋白-脂肪酸培养基(Baker,1982,US4,560,655)、运体蛋白-EGF培养基(Hasegawa,1982,US 4,615,977；Chessebeuf,1984,US 4,786,599)和其他培养基置换(参见Inlow,US 6,048,728；Drapeau,US 7,294,484；Mather,US 5,122,469；Furukawa,US 5,976,833；Chen,US 6,180,401；Chen,US 5,856,179；Etcheverry,US 5,705,364；Etcheverry,US 7,666,416；Ryll,US 6,528,286；Singh,US 6,924,124；Luan,US 7,429,491；等等)。

在一个具体的实施方案中，培养基为化学成分确定的且除了牛磺酸之外含有：如文所定义的氨基酸的混合物、CaCl₂ 2H₂O；HEPES缓冲剂、KCl；MgSO₄；NaCl；Na₂HPO₄或其他磷酸盐；丙酮酸；D-生物素；氯化胆碱；叶酸；肌醇；烟碱酰胺；吡哆醇HCl；D-泛酸；核黄素；硫胺素HCl；维生素B12；ρ-氨基苯甲酸；乙醇胺HCl；泊洛沙姆188；DL-a-生育醇磷酸盐；亚麻油酸；Na₂SeO₃；硫辛酸；和葡萄糖；以及任选腺苷；鸟苷；胞苷；尿苷；胸苷和次黄嘌呤2Na。

在一个实施方案中，本发明培养基的开始的渗透压为200-500、250-400、275-350或约300mOsm。在细胞于本发明培养基中的生长阶段期间，和特别是在任何根据进料批次法进料后，培养的渗透压可增加至高约350、400、450、500或至高约550mOsm。

在某些实施方案中，其中成分确定的培养基的渗透压低于约300，此渗透压以添加一种或多种指定过量的盐类而达到约300。在一个实施方案中，通过加入一种或多种选自下列的渗透物，将渗透压增加至期望的程度：氯化钠、氯化钾、镁盐、钙盐、氨基酸盐、脂肪酸盐、碳酸氢钠、碳酸钠、碳酸钾、盐的螯合剂、糖(例如半乳糖、葡萄糖、蔗糖、果糖、岩藻糖等)，和其组合。在一个实施方案中，除了已存在成分确定培养基中的组分的浓度以外，又再加入渗透物(例如除了指定的糖组分之外，又再加入糖)。

上述培养基的各个实施方案，以及含有至少约0.1mM牛磺酸的任何其他无血清培养基称为补充牛磺酸的培养基。相反地，不含有牛磺酸的培养基，或含有低于0.1mM牛磺酸的培养基在下文称为非补充牛磺酸培养基或无补充物。

进料式批次培养

细胞培养的进料策略以确保细胞在多细胞生物体或组织外最佳生长和增殖为目标。适合哺乳动物细胞的培养条件已为现有技术所知。参见，例如Animal cell culture：APractical Approach,D.Rickwood,ed.,Oxford University Press,New York(1992)。哺乳动物细胞可在悬浮液中培养或同时黏附固体底物。可利用流化床生物反应器、中空纤维生物反反应器、旋转瓶、震荡烧瓶或搅拌统生物反应器(在有或无微载体下，和以批次、进料批次、连续、半连续、或灌注模式操作)用于哺乳动物细胞培养。细胞培养基或浓缩进料培养基可连续或在培养期间相隔一段时间加到培养中。例如，培养可每天、每隔一天、每三天进料一次，或可在监控下当特定培养基组分的浓度落在期望的范围以外时进料。

除了包括牛磺酸之外，在一个实施方案中，培养基可进一步补充至少20mM累积浓度的氨基酸。在一个实施方案中，包括在开始细胞培养基的最初的氨基酸浓度并不包括此补充的氨基酸累积(总)浓度。在一细胞培养基的实施方案中，或在培养细胞的方法或产生感兴趣蛋白的方法中，培养基可补充大于约20mM，大于约25mM，大于约30mM，大于约40mM，大于约50mM，或大于约60mM，大于约70mM，大于约100mM，大于约200mM，大于约300mM，大于约400mM，或大于约500mM的量。亦参见文中的表1。在一个实施方案中加至培养基中的氨基酸量为约30mM±10mM或更多。

补充进料方案可由本领域技术人员优化以于生产阶段期间支持细胞生长，将细胞压力最小化，或提供“非-耗尽培养基(non-depleted medium)”。

“非-耗尽培养基”包括经测定具有营养物，特别是产生感兴趣的重组蛋白所需的氨基酸的细胞培养基。氨基酸进料通常补充细胞培养中产生重组蛋白的构建单元所需的氨基酸。然而，依照培养中细胞所产生的特定蛋白的需求，某些氨基酸消耗可能比其他氨基酸更快。在非耗尽培养基中，已决定进料方案因此必需氨基酸在其消耗时再补充。因此，可通过下步骤来测定耗尽和随后的最佳消耗率(pg/细胞-天)：于细胞培养基中培养表达感兴趣蛋白的真核细胞；在时间点测量培养基中各氨基酸浓度以建立消耗量；鉴定出氨基酸浓度落在消耗量以下的消耗时间点；计算各氨基酸的消耗率；并决定最佳消耗率为就在耗尽时间点之前的时间点的消耗率。然后按需要以适当浓度的特定氨基酸补充细胞培养以维持最佳消耗率，以便用作非耗尽的培养基。

应理解，本发明提供于耗尽以及非耗尽培养中增加蛋白滴度的补充牛磺酸的细胞培养基。

本发明提供于上述的补充牛磺酸的细胞培养基中包括表达感兴趣蛋白的细胞系的细胞培养。常规用于产生蛋白生物治疗剂的细胞系的实例包括(尤其是)初代细胞、BSC细胞、HeLa细胞、HepG2细胞、LLC-MK细胞、CV-1细胞、COS细胞、VERO细胞、MDBK细胞、MDCK细胞、CRFK细胞、RAF细胞、RK细胞、TCMK-1细胞、LLCPK细胞、PK15细胞、LLC-RK细胞、MDOK细胞、BHK细胞、BHK-21细胞、CHO细胞、CHO-K1细胞、NS-1细胞、MRC-5细胞、WI-38细胞、3T3细胞、293细胞、Per.C6细胞和鸡胚胎细胞。在一个实施方案中，细胞系为CHO细胞系或一种或多种经优化用于大规模蛋白产生的数种特定CHO细胞变体，例如CHO-K1。

在一个实施方案中，补充牛磺酸的细胞培养含有胰岛素，其可加入培养基中作为使用点成分，或可包括在培养基配制物中。在一个实施方案中，细胞包含能产生生物治疗蛋白的细胞。

在一个实施方案中，培养基在培养期间根据进料批次法间隔一段时间补充。进料批次培养一般已为现有技术所知并应用于优化蛋白产量(参见Y.M.Huang et al.,Biotechnol Prog.2010Sep-Oct；26(5)：1400-10)。

其中未提供培养基交换的细胞生长阶段或接种培养(即最初细胞培养)通常后续是不同的第二培养，称为多肽生产阶段。在生产阶段期间，通常使用进料批次法。

本发明提供在生产细胞培养开始时(第0天)包括约0.1mM至约10mM牛磺酸的细胞培养基。或者，包括约0.1mM至约10mM牛磺酸的细胞培养基可在生产细胞培养的第1天，第2天，第3天，第4天，第5天，第6天，第7天，第8天，第9天和/或第10天补充。在多个日子加到生产培养的细胞培养基包括总量为约0.1mM至约10mM的牛磺酸。包括总量约0.1mM至约10mM的牛磺酸的细胞培养基可以以任何顺序方式加入。

牛磺酸也可在接种扩增期补充到基础培养基中。

在生产培养期间，间隔一段时间以每天、每2-3天的频率可进行补充进料以包括另外的营养物，例如维生素、氨基酸和其他上述的营养物。在整个2周或更长培养的生产培养期间，可进行补充进料(加入含有营养物的补充培养基)至少2次，或至少8次。在另外的实施方案中，可在培养期间每天进行补充进料。也可预想替代的培养进料方案。

也可进行另外的氨基酸补充以提供非耗尽培养基，其中根据现有技术中已知的和文中所述的方法来测定耗尽的氨基酸。当应用此方案时，依照测定的氨基酸消耗，间隔一段时间补充或加入额外的氨基酸，优选地在生产培养期间以每天或每2-3天的频率。在一个实施方案中，维持非耗尽细胞培养基的额外的氨基酸的混合物在或约第1天，在或约第2天，在或约第3天，在或约第4天，在或约第5天，在或约第6天，在或约第7天，在或约第8天，在或约第9天，在或约第10天，在或约第11天，在或约第12天，在或约第13天，在或约第14天，加到培养中，进行2周或更长的培养。也可预想替代的培养进料方案。

动物细胞，例如CHO细胞，可以小规培养来培养，例如于具有约25mL培养基的125ml容器中，具有约50至100mL培养基的250ml容器中，具有约100至200mL培养基的500mL容器中。或者，此培养也可为大规模的，例如具有约300至1000mL培养基的1000mL容器，具有约500mL至3000mL培养基的3000mL容器，具有约2000mL至8000mL培养基的8000mL容器，具有约4000mL至15000mL培养基的15000mL容器。用于产生的培养可含有10,000L的培养基或更多。大规模细胞培养，例如临床产生蛋白治疗剂，通常在细胞产生期望的蛋白同时，维持数天或甚至数周。在此期间，此培养可补充含有例如营养物和氨基酸组分的浓缩的进料培养基，其在培养期间消耗。浓缩的进料培养基可以任何细胞培养基配制物为基础。此一浓缩的进料培养基可含有大部分的细胞培养基的组分，例如约5X、6X、7X、8X、9X、10X、12X、14X、16X、20X、30X、50X、100X、200X、400X、600X、800X或甚至约1000X其正常可使用量。浓缩的进料培养基通常用于进料批次培养法中。

在某些实施方案中，含有牛磺酸的细胞培养在细胞生长或蛋白生产期间进一步补充“使用点添加物”，也称为添加物、使用点成分或使用点化学物。使用点添加物包括任何一种或多种生长因子或其他蛋白、缓冲剂、能量来源、盐、氨基酸、金属和螯合剂。其他的蛋白包含运铁蛋白和白蛋白。生长因子，包括细胞激素和趋化激素，一般已为现有技术所知且已知刺激细胞生长，或在某些情况下为细胞分化。生长因子通常为蛋白(例如胰岛素)、小分子肽或类固醇激素，例如雌激素、DHEA、睾丸酮等等。在某些情况下，生长激素可为促进细胞增殖或蛋白生产的非天然化学物，例如四氢叶酸(THF)、胺甲喋呤(methotrexate)等等。蛋白和肽生长因子的非限定实例包括血管生成素、骨塑型蛋白(BMP)、脑衍生神经营养因子(BDNF)、表皮生长因子(EGF)、红血球生成素(EPO)、纤维母细胞生长因子(FGF)、胶质细胞系衍生的神经营养因子(GDNF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、生长分化因子-9(GDF9)、肝细胞生长因(HGF)、肝癌衍生的生长因子(HDGF)、胰岛素、类胰岛素生长因子(IGF)、促移行因子、肌骨素(myostatin)(GDF-8)、神经生长因子(NGF)和其他神经营养蛋白、血小板衍生的生长因子(PDGF)、促血小板生成素(TPO)、转形生长因子α(TGF-α)、转形生长因子β(TGF-β)、肿瘤凋亡因子-α(TNF-α)、血管内皮生长因子(VEGF)、wnt讯号传递路径促效剂、胎盘生长因子(PlGF)、胎牛促体素(FBS)、介白素-1(IL-1)、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7等等。在一个实施方案中，细胞培养基补充使用点添加物生长因子胰岛素。在一个实施方案中，培养基中胰岛素的浓度，即添加后细胞培养基中胰岛素的量为约0.1μM至10μM。

缓冲剂一般已为现有技术所知。本发明不限于任何特定的缓冲剂，和任何现有技术的一般技术人员可就用于生产特定蛋白的特定细胞系选择适合的缓冲剂。在一个实施方案中，使用点添加物缓冲剂为NaHCO₃。在另外的实施方案中，此缓冲剂为HEPES。在其他的实施方案中，此使用点添加缓冲剂包括NaHCO₃和HEPES二者。

于细胞培养中用作为使用点添加的能量来源亦为现有技术所熟知。不受限制，在一个实施方案中，使用点添加的能量来源为葡萄糖。如果给予特定细胞系和生产蛋白的特定和指定的需求，在一个实施方案中此葡萄糖在培养基中可以约1至20mM的浓度加入。在某些情况下，可以20g/L的高量或更高量加入。

螯合剂同样地已为细胞培养和蛋白产生技术所熟知。虽然施行本发明可应用其他螯合剂，但EDTA四钠二水合物和柠檬酸盐为两种用于现有技术的常见的螯合剂。在一个实施方案中，使用点添加螯合剂为EDTA四钠二水合物。在一个实施方案中，使用点添加螯合剂为柠檬酸盐，例如Na₃C₆H₅O₇。

在一个实施方案中，细胞培养基可另外补充一种或多种使用点添加物氨基酸作为能量来源，例如谷氨酰胺。在一个实施方案中，细胞培养基系补充最终浓度约1mM至13mM的使用点添加物谷氨酰胺。

其他的使用点添加物包括一种或多种各种金属盐类，例如铁盐、镍盐、锌盐和铜盐。在一个实施方案中，细胞培养基补充任何一种或多种的硫酸铜、硫酸锌、氯化铁和硫酸镍。

在某些实施方案中，由补充牛磺酸培养基的细胞培养所产生的蛋白滴度比未补充牛磺酸的细胞培养所产生的蛋白滴度大至少4％，至少5％，至少6％，至少7％，至少8％，至少9％，至少10％，至少11％，至少12％，至少13％，至少14％，至少15％，至少16％，至少17％，至少18％，至少19％，至少20％，至少21％，至少22％，至少23％，至少24％，至少25％，至少26％，至少27％，至少28％或至少29％。在某些实施方案中，由补充牛磺酸培养基的细胞培养所产生的蛋白滴度比未补充牛磺酸的类似或相同细胞培养所产生的蛋白滴度大至少2％，至少3％，至少4％，或至少5％。

在某些实施方案中，相较于未补充牛磺酸的培养基的细胞培养，在补充牛磺酸的培养基中细胞培养的氨浓度降低大于4％，大于5％，大于6％，大于7％，大于8％，大于9％，大于10％，大于15％，或大于20％。

蛋白生产

除了补充牛磺酸的培养基和于补充牛磺酸的培养基中培养细胞的方法之外，本发明提供于补充牛磺酸的培养基的细胞培养中增加生产蛋白，例如治疗上有效的抗体或其他生物医药物质的方法。本发明提供以高产率产生治疗性蛋白的方法，其包括于含有牛磺酸的培养基中培养重组的细胞系，其中该细胞包含编码该治疗性蛋白的稳定整合的核酸。

在某些实施方案中，含有牛磺酸培养基中培养的哺乳动物细胞的蛋白滴度(产率)比未补充牛磺酸培养基中所培养的相同哺乳动物细胞的蛋白滴度大至少100mg/L，至少0.5g/L，至少1g/L，至少1.2g/L，至少1.4g/L，至少1.6g/L，至少1.8g/L，至少2g/L，至少2.5g/L。

在某些实施方案中，来自补充牛磺酸培养基的细胞培养的蛋白产率或滴度，其可用每升培养基的蛋白克数来表示，为至少100mg/L，至少1g/L，至少1.2g/L，至少1.4g/L，至少1.6g/L，至少1.8g/L，至少2g/L，至少2.5g/L，至少3g/L，至少3.5g/L，至少4g/L，至少4.5g/L，至少5g/L，至少5.5g/L，至少6g/L，至少6.5g/L，至少7g/L，至少7.5g/L，至少8g/L，至少8.5g/L，至少9g/L，至少9.5g/L，至少10g/L，至少15g/L，或至少20g/L。

在某些实施方案中，由补充牛磺酸培养基的细胞所产生的蛋白滴度比未补充牛磺酸培养基所培养的类似或相同细胞的蛋白滴度(产率)大至少2％，至少3％，至少4％，至少5％，至少6％，至少7％，至少8％，至少9％，至少10％，至少11％，至少12％，至少13％，至少14％，至少15％，至少16％，至少17％，至少18％，至少19％，至少20％，至少21％，至少22％，至少23％，至少24％，至少25％，至少26％，至少27％，至少28％或至少29％。

在某些实施方案中，蛋白产物(感兴趣蛋白)为抗体、人类抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单克隆抗体、多特异性抗体、双特异性抗体、抗原结合的抗体片段、单链抗体、双抗体、三抗体或四抗体、Fab片段或F(ab’)2片段、IgD抗体、IgE抗体、IgM抗体、IgG抗体、IgG1抗体、IgG2抗体、IgG3抗体或IgG4抗体。在一个实施方案中，此抗体为IgG1抗体。在一个实施方案中，此抗体为1gG2抗体。在一个实施方案中，此抗体为IgG4抗体。在一个实施方案中，此抗体为嵌合的IgG2/IgG4抗体。在一个实施方案中，此抗体为嵌合的IgG2/IgG1抗体。在一个实施方案中，此抗体为嵌合的IgG2/IgG1/IgG4抗体。

在某些实施方案中，此抗体选自：抗程序性细胞死亡抗体(例如，如美国专利申请公开案第US2015/0203579A1号所述的抗-PD1抗体)、抗程序性细胞死亡配体-1(例如，如美国专利申请公开案第US2015/0203580A1号所述的抗-PD-L1抗体)、抗-D114抗体、抗-血管生成素-2抗体(例如，如美国专利第9,402,898号所述的抗-ANG2抗体)、类抗-血管生成素-3抗体(例如，如美国专利第9,018,356号所述的抗-AngPtl3抗体)、抗-血小板衍生生长因子受体抗体(例如，抗-PDGFR抗体美国专利第9,265,827号)、抗-Erb3抗体、抗-泌乳素受体抗体(例如，如美国专利第9,302,015号所述的抗-PRLR抗体)、抗-补体5抗体(例如，如美国专利申请公开案第US2015/0313194A 1号所述的抗-C5抗体)、抗-TNF抗体、抗-表皮生长因子受体抗体(例如，如美国专利第9,132,192号所述的抗-EGFR抗体或如美国专利申请公开案第US2015/0259423A1号所述的抗-EGFRvIII抗体)、抗-前蛋白转化酶枯草溶菌素-9抗体(例如，如美国专利第8,062,640号或美国专利申请公开案第US2014/0044730A1号所述的抗-PCSK9抗体)、抗-生长和分化因子-8抗体(例如，如美国专利第8,871,209号或第9,260,515号所述的抗-GDF8抗体，也称为抗-肌骨素抗体)、抗-升糖素受体(例如，如美国专利申请公开案第US2015/0337045A1号或第US2016/0075778A1号所述的抗-GCGR抗体)、抗-VEGF抗体、抗-IL1R抗体、介白素4受体抗体(例如，如美国专利申请公开案第US2014/0271681A1号或美国专利第8,735,095号或第8,945,559号所述的抗-IL4R抗体)、抗-介白素6受体抗体(例如，如抗体美国专利案号7,582,298、8,043,617或9,173,880所述的抗-IL6R)、抗-IL1抗体、抗-IL2抗体、抗-IL3抗体、抗-IL4抗体、抗-IL5抗体、抗-IL6抗体、抗-IL7抗体、抗-介白素33(例如，如美国专利申请公开案号US2014/0271658A1或US2014/0271642A1所述的抗-IL33抗体)、抗-呼吸道融合病毒抗体(例如，如美国专利申请公开案第US2014/0271653A1号所述的抗-RSV抗体)、抗-分化群3(例如，如美国专利申请公开案号US2014/0088295A1和US20150266966A1以及美国申请案第62/222,605号所述的抗-CD3抗体)、抗-分化群20(例如，如美国专利申请公开案号US2014/0088295A1和US20150266966A1以及美国专利第7,879,984号所述的抗-CD20抗体)、抗-CD19抗体、抗-CD28抗体、抗-分化群-48(例如，如美国专利第9,228,014号所述的抗-CD48抗体)、抗-Fel d1抗体(例如，描述于美国专利第9,079,948号)、抗-中东呼吸症候群病毒(例如，如美国专利申请公开案第US2015/0337029A1号所述的抗-MERS抗体)、抗-伊波拉病毒抗体(例如，描述于美国专利申请公开案第US2016/0215040号)、抗-Zika病毒抗体、抗-淋巴细胞活化基因3(例如，抗-LAG3抗体或抗-CD223抗体)和抗-活化素A抗体。在某些实施方案中，此双特异性抗体选自：抗-CD3 x抗-CD20双特异性抗体(如描述于美国专利申请公开案号US2014/0088295A1和US20150266966A1)、抗-CD3x抗-黏蛋白16双特异性抗体(例如，抗-CD3 x抗-Muc16双特异性抗体)和抗-CD3 x抗-前列腺-特异性膜抗原双特异性抗体(例如，抗-CD3 x anti-PSMA双特异性抗体)。在某些实施方案中，感兴趣蛋白选自：alirocumab、sarilumab、fasinumab、nesvacumab、dupilumab、trevogrumab、evinacumab和rinucumab。整个公开内容中所提及的所有出版品以全文引用的方式并入本文中。

在某些实施方案中，感兴趣蛋白为含有Fc部分和另外区域的重组蛋白(例如Fc-融合蛋白)。在某些实施方案中，Fc-融合蛋白为受体Fc-融合蛋白，其含有结合Fc部分的一个或多个受体的胞外区。在某些实施方案中，此Fc部分包括铰链区接着IgG的CH2和CH3区。在某些实施方案中，此受体Fc-融合蛋白含有两个或多个与单一配体或多配体结合的不同受体链。例如，此Fc-融合蛋白为捕捉阱(TRAP)蛋白，例如IL-1阱(例如列洛西普(rilonacept)，其含有与Il-1R1胞外区融合的IL-1RAcP配体-结合区，而该Il-1R1胞外区与hIgG1的Fc结构域融合；参见美国专利第6,927,004号，其以全文引用的方式并入本文中)，或VEGF捕捉阱(例如阿柏西普(aflibercept)，其含有与VEGF受体Flk1的Ig 3区融合的VEGF受体Flt1的Ig 2区，而该VEGF受体Flk1的Ig 3区与hIgG1的Fc结构域融合；参见美国专利第7,087,411和7,279,159号)。在其他的实施方案中，Fc-融合蛋白为ScFv-Fc-融合蛋白，其含有一个或多个抗原结合区，例如与Fc部分结合的抗体的可变重链片段和可变轻链片段。

就蛋白产生，本发明不限于任何特定类型的细胞。适合蛋白产生的细胞类型的实例包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、鸟类细胞、细菌细胞和酵母细胞。细胞可为干细胞或以重组基因表达的载体所转化的重组细胞，或以产生病毒产物的病毒转染的细胞。细胞可含有一编码感兴趣蛋白的重组的异源性聚核苷酸结构。此结构可为游离基因组(episome)或其可为天然整合至细胞基因组的组件。细胞也可在不具有于异源多肽结构上所编码的蛋白下，产生感兴趣蛋白。换言之，细胞可本质上编码感兴趣蛋白，例如B-细胞产生抗体。细胞也可为初级细胞例如鸡胚胎细胞，或初级细胞系。可用的细胞实例包括BSC细胞、LLC-MK细胞、CV-1细胞、COS细胞、VERO细胞、MDBK细胞、MDCK细胞、CRFK细胞、RAF细胞、RK细胞、TCMK-1细胞、LLCPK细胞、PK15细胞、LLC-RK细胞、MDOK细胞、BHK-21细胞、鸡胚胎细胞、NS-1细胞、MRC-5细胞、WI-38细胞、BHK细胞、293细胞、RK细胞、Per.C6细胞和CHO细胞。在各种实施方案中，细胞系为CHO细胞衍生物，例如CHO-K1、CHO DUX B-11、CHO DG-44、Veggie-CHO、GS-CHO、S-CHO或CHO lec突变株。

在一个实施方案中，细胞为异位表达蛋白的CHO细胞。在一个实施方案中，蛋白包含免疫球蛋白重链区，例如CH1、CH2或CH3区。在一个实施方案中，蛋白包含人类或啮齿类免疫球蛋白CH2和CH3区。在一个实施方案中，蛋白包含类或啮齿类免疫球蛋白CH1、CH2和CH3区。在一个实施方案中，蛋白包含铰链区和CH1、CH2和CH3区。在一个实施方案中，蛋白包含免疫球蛋白重链可变结构域。在一个实施方案中，蛋白包含免疫球蛋白轻链可变结构域。在一个实施方案中，蛋白包含免疫球蛋白重链可变结构域和免疫球蛋白轻链可变结构域。在一个实施方案中，蛋白为抗体，例如人类抗体、啮齿类抗体或嵌合的人类/啮齿类抗体(例如人类/小鼠、人类/大鼠或人类/仓鼠)。

生产阶段可以以任何的培养规模来进行，从震荡器烧瓶或摇动包袋，至1升生物反应器以及大规模工业生物反应器。同样地，接种扩增期可以以任何的培养规模来进行，从震荡器烧瓶或摇动包袋，至1升或大型生物反应器。大规模处理可以约100升至20,000升或更大的容量来进行。可使用一种或数种方法来控制蛋白生产，例如温度变换或化学诱发。生长阶段可发生在比生产阶段更高的温度。例如，生长阶段可发生在约35℃至38℃的第一温度，而生产阶段可发生在约29℃至37℃的第二温度，任选从约30℃至36℃或从约30℃至34℃。此外，蛋白生产的化学诱发物，例如咖啡因、丁酸盐、泰莫西芬(tamoxifen)、雌激素、四环霉素、多西环素、六亚甲基双乙酰胺(HMBA)可在温度变换的同时、之前或之后加入。如果诱发物在温度变换之后加入，则其可在温度变换后的1小时至5天加入，例如温度变换后的1至2天。生产细胞培养可如连续进料培养系统来运作，如于恒化器中(参见C.Altamirano etal.,2001上文)或根据进料批次法(Huang,2010上文)来运作。

本发明可经由细胞培养程序用于增加细胞产量。用于本发明的细胞系可经基因工程化以表达商业或科学上感兴趣的多肽。基因工程化细胞涉及以重组的聚合苷酸分子转染、转化或转换细胞，或另外改变(例如通过同源性重组和基因活化或重组细胞与非重组细胞融合)使得宿主细胞表达期望的重组多肽。用于基因工程化细胞或细胞系来表达感兴趣多肽的方法和载体已为本领域技术人员所熟知；例如分子生物学实验手册中所示的各种技术。Ausubel et al.,eds.(Wiley&Sons,New York,1988,and quarterly updates)；Sambrook et al.,Molecular Cloning：A Laboratory Manual(Cold Spring LaboratoryPress,1989)；Kaufman,R.J.,Large Scale Mammalian Cell Culture,1990,pp.15-69。适用于培养中生长的各种广泛细胞系可得自美国接种中心(Manassas,Va.)和市面工应商。常用于工业上的细胞系的实例包括VERO、BHK、HeLa、CVl(包括Cos)、MDCK、293、3T3、骨髓瘤细胞系(例如NSO、NSl)、PC12、WI38细胞和中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。CHO细胞系广泛地用于产生复杂的重组蛋白，例如细胞激素、凝结因子和抗体(Brasel et al.(1996),Blood 88：2004-2012；Kaufman et al.(1988),J.Biol Chem 263：6352-6362；McKinnon et al.(1991),J MoI Endocrinol6：231-239；Wood et al.(1990),J Immunol.145：3011-3016)。二氢叶酸还原酶(DHFR)-缺陷的突变细胞系(Urlaub et al.(1980),Proc Natl Acad SciUSA 77：4216-4220)、DXBl 1和DG-44和期望的CHO宿主细胞因为此缺陷的DHFR可选择和可增幅基因表达而让高量的重组蛋白表达在这些细胞中(Kaufman RJ.(1990),Meth Enzymol185：537-566)。此外，这些细胞容易操作为黏附或悬浮液培养并展现相当良好的基因稳定性。CHO细胞和由其所重组表达的蛋白已被广泛定性且管理当局已核准用于临床和商业产生。在某些实施方案中，此CHO细胞系为如描述于美国专利申请公开案号2010/0304436 A1、2009/0162901 A1和2009/0137416 A1，以及美国专利案号7,455,988 B2、7,435,553 B2和7,105,348 B2的细胞系。

本发明不限于文中所述的特定实施方案的范围，其希望作为本发明的个别方面或实施方案的说明。功能上等价的方法和组分在本发明的范围内。本发明的各种修改，除了文中所述的之外，由前述说明和伴随的附图对于本领域技术人员为某些的。修改为落在本发明的范围内。

实施例

实施例1：由于牛磺酸补充增加了抗体滴度

实施例1A-高通量震荡烧瓶培养：从衍生自CHO-K1的单克隆抗体(Ab1)产生细胞的接种培养接种250mL震荡烧瓶。让接种的细胞于35.5℃生长17天并于需要时给予葡萄糖和其他补充的营养物。细胞系生长于化学成分确定的(无水解产物和无血清)基础培养基中。

各培养烧瓶在第0天为无补充的(烧瓶1a)，或补充1mM牛磺酸(烧瓶1b)。

表2：平均17天抗体滴度(g/L)和相对于基线的近似滴度增加(％)

*％滴度增加的基线对照；将烧瓶1b与未补充的培养基中的滴度进行比较(烧瓶1a)。

^A未补充培养和补充培养之间的最终滴度的差异是统计学上显著的(p<0.05)。

从第17天收获的蛋白计算滴度值，且相较于基线为统计上显著的(p<0.05)。补充牛磺酸的培养在最终的蛋白滴度上展现整体优于未补充培养8％增加。

实施例1B-桌上型生物反应器：在一类似的实施例中，又在一较大规模的生产中，从衍生自CHO-K1的单克隆抗体(Ab2、Ab3或Ab4)产生细胞的接种培养接种2L生物反应器。让接种的细胞于35.5℃生长，40.4％的设定和22ccm的空气注入进行14天。Ab2和Ab3处理系具有7.0±0.15的pH设定点，而Ab4处理具有7.13±0.27的pH设定点。当需要时供应葡萄糖、消泡剂和基础进料至生物反应器中。培养物在无补充培养基(生物反应器2a、3a、4a)下生长或补充约1mM牛磺酸的培养基(Ab2和Ab3)或补充约3mM牛磺酸的培养基(Ab4)中生长，其在生产的第0天添加(分别为生物反应器2b、3b和4b)。

就Ab2-生产细胞，抗体产率(滴度)为6.4g/L，而以牛磺酸生长的细胞则产生8g/L蛋白。相较于生长在无牛磺酸补充物的细胞，24％增加为统计上显著的(p<0.05)。在14天后(分别为11％和20％)，相较于未补充牛磺酸的培养，Ab3-生产培养和Ab4-生产培养的所产生的最终滴度亦显著较高(p<0.05)。参见表3。

表3：平均14天抗体滴度(g/L)和相对于基线的近似滴度增加(％)

*未补充培养基是用于％滴度增加的基线对照，其中生物反应器2b、3b或4b的％滴度增加与未补充培养基(分别为生物反应器2a，3a或4a)中的效价进行比较。

就Ab3-生产细胞培养，对有关蛋白滴度的方案作图，且由于补充牛磺酸，从第6天开始在蛋白滴度上于培养的每日观察到有显著增加。

表4：在代表性时间点牛磺酸补充引起的抗体滴度(g/L)改善

*与同日收集的未补充培养基相比的大致增加(％)

^A与未补充培养相比，添加牛磺酸的滴度增加具有统计学显著性(p<0.05)。

早在第6天于生产培养中可看到滴度显著的增加(相较于无牛磺酸补充的相同培养，增加12％)。还参见图1。在此方案中在第9天看到最大的差异(显著的(p<0.05)，相较于3a)，生物反应器3b增加29％和在培养的最后一天(14)观察到显著的(p<0.05)滴度增加11％。

经由不同规模(实施例1A和1B)和不同细胞系(实施例1B)观察到补充牛磺酸的蛋白生产利益。

实施例2：高通量震荡烧瓶培养中各种牛磺酸浓度的恒定生产力

通过在生产第0天加到培养中的不同量的牛磺酸来试验蛋白滴度的恒定性。从衍生自CHO-K1的单克隆抗体(Ab1)产生细胞的接种培养接种250mL震荡烧瓶。让接种的细胞于35.5℃生长14天并于需要时给予葡萄糖和其他补充的营养物。细胞系生长于化学成分确定的(无水解产物和无血清)基础培养基中。

各培养系不含有牛磺酸(无补充)或含有0.1mM、0.3mM、0.5mM、0.7mM、1mM、3mM、5mM、7.5mM或10mM浓度的牛磺酸。

表5：补充有0.1至10mM牛磺酸的培养物的平均14天抗体效价(g/L)

*未补充培养基是％滴度增加的基线对照。

^#与未添加对照相比，最终滴度的差异具有统计学意义(P<0.1)。

^A与未补充对照相比，最终滴度的差异具有统计学意义(P<0.05)。

其显示，当牛磺酸补充在至少0.1mM至10mM的范围时，不同的牛磺酸-补充量一致地产生高滴度。补充牛磺酸条件的最终滴度与无补充条件在统计上为不同的。就0.1mM牛磺酸为p<0.1，而就0.3mM至10mM牛磺酸为p<0.05。

实施例3：以高通量震荡烧瓶培养试验各种牛磺酸给药方案

实施例3A：于接种扩增期期间添加牛磺酸：以高通量震荡烧瓶模型评估在扩增接种期期间将牛磺酸加到培养中的利益。在烧瓶6a中(表6)，将产生Ab1的CHO细胞溶于化学成分确定的(无水解产物和无血清)补充1mM牛磺酸的基础培养基。在整个扩增期中，基础培养基的牛磺酸浓度维持在1mM。在生产期间，培养基础培养基在第0天补充1mM牛磺酸。在17天的生产期间，如需要则供应葡萄糖和营养物基本养料。

在整个接种扩增期期间，烧瓶6b细胞生长于无牛磺酸的(无补充)化学成分确定(无水解产物和无血清)基础培养基中。在生产的第0天，培养基础培养基补充1mM牛磺酸。就17天的生产，如需要则供应葡萄糖和营养物基本养料。

表6：补充有1mM牛磺酸的培养物的平均17天抗体滴度

最终滴度(第17天)的差异并非统计上显著的(p>0.1)。

就两种条件(仅在生产时或接种和生产联合补充牛磺酸)最终(第17天)滴度值为类似的。所产生的滴度并非统计上显著的(p>0.1)。于接种扩增期中添加牛磺酸的利益与生产阶段中补充牛磺酸为相类似的。

实施例3B：生产阶段期间各种牛磺酸进料方案：为了测定不同标准进料方案对于补充牛磺酸的培养基的蛋白滴度是否有任何影响，则以类似的振荡烧瓶培养生长产生Ab1的CHO细胞，进行另外的实验。类似实施例2将细胞进行不同的培养条件，其中进料方案与之前相同，如需要则加入葡萄糖/营养物基本养料。

Ab1-生产培养系补充总计5mM牛磺酸。在不同的牛磺酸进料方案观察到类似的生产力(7.1g/L、6.8g/L和7.0g/L)。本实验中比较的滴度值并非统计上有差异的(p>0.1)(参见表7)。

表7：添加5mM的培养物的平均14天抗体滴度(g/L)

第14天间滴度值的差异并非统计上显著的(p>0.1)。

牛磺酸的进料方案并不具有任何的负面效应，亦不会改变其中补充牛磺酸对产物产率为有利的结果。因此，补充牛磺酸可在第0添加一次，或在后续的生产阶段天数中添加，或可在生产阶段期间以多个时间间隔添加。

实施例4：测量高通量震荡烧瓶培养中的氨副产物

在以类似实施例2的方法进行14-天的培养后，就补充牛磺酸的产生Ab1-CHO细胞的培养，测量氨副产物。让细胞经历类似上述的各种培养条件，其中如需要则添加葡萄糖/营养物基本养料。

表8：平均17天氨(mM)和减少(％)

*作为氨减少％的基线对照；补充牛磺酸的条件与无补充培养中的氨相比较。

^氨浓度的减少为统计上显著的(p<0.1)。

在产生Ab1的细胞中，培养基中补充的牛磺酸支持健康的持续培养，其中氨副产物已下降32％。补充牛磺酸的氨浓度的下降量为统计上显著的(p<0.1)。

本发明可以其他特定实施方案实施。

Claims

1.一种培养重组的真核细胞用于增加重组蛋白产量的方法，其包括下列步骤：(a)在生长阶段期间于成分确定的细胞培养基中增殖或维持细胞，(b)以约0.1mM至约10mM L-牛磺酸补充基础细胞培养基并于生产阶段期间表达感兴趣的重组蛋白，和(c)通过添加牛磺酸来增加感兴趣蛋白的滴度。

2.权利要求1的方法，其中(b)的牛磺酸补充在生产阶段期间提供至少一次。

3.权利要求1的方法，其中(b)的牛磺酸补充在生产阶段期间提供至少两次。

4.权利要求1的方法，其中(b)的牛磺酸补充在生产阶段期间提供至少三次。

5.权利要求1的方法，其中(b)的牛磺酸补充在生产阶段期间提供至少四次。

6.权利要求1的方法，其中(b)的牛磺酸补充在生产阶段期间提供至少五次。

7.权利要求1的方法，其中(b)的牛磺酸补充在生产阶段期间每天提供。

8.权利要求1至7中任一项的方法，进一步包括在生长阶段期间以约0.1mM至约10mM L-牛磺酸补充成分确定细胞培养基中的培养。

9.权利要求1至8中任一项的方法，其中所述真核细胞选自：哺乳动物细胞、鸟类细胞、昆虫细胞和酵母细胞。

10.权利要求9的方法，其中所述细胞选自：CHO(例如CHO K1、DXB-11CHO、Veggie-CHO)、COS(例如COS-7)、视网膜细胞、Vero、CV1、肾(例如HEK293、293EBNA、MSR 293、MDCK、HaK、BHK21)、HeLa、HepG2、WI38、MRC 5、Colo25、HB 8065、HL-60、淋巴细胞(例如Jurkat、Daudi)、A431(表皮)、CV-1、U937、3T3、L细胞、C127细胞、SP2/0、NS-0、MMT细胞、细胞、干细胞、肿瘤细胞和衍生自前述细胞的细胞系。

11.权利要求10的方法，其中所述细胞为CHO细胞。

12.权利要求1至11中任一项的方法，其中所述感兴趣蛋白为抗原结合蛋白。

13.权利要求1至12中任一项的方法，其中所述感兴趣蛋白包含Fc结构域。

14.权利要求12或13的方法，其中所述感兴趣蛋白选自：Fc-融合蛋白、受体-Fc-融合蛋白(TRAP)、抗体、抗体片段和ScFv-Fc融合蛋白。

15.权利要求14的方法，其中所述感兴趣蛋白选自：抗PD1抗体，抗PDL-1抗体，抗Dll4抗体，抗ANG2抗体，抗AngPtl3抗体，抗PDGFR抗体，抗Erb3抗体，抗PRLR抗体，抗TNF抗体，抗EGFR抗体，抗PCSK9抗体，抗GDF8抗体，抗GCGR抗体，抗VEGF抗体，抗IL1R抗体，抗IL4R抗体，抗IL6R抗体，抗IL1抗体，抗IL2抗体，抗IL3抗体，抗IL4抗体，抗IL5抗体，抗IL6抗体，抗IL7抗体，抗RSV抗体，抗NGF抗体，抗CD3抗体，抗CD20抗体，抗CD19抗体，抗CD28抗体，抗CD48抗体，抗CD3/抗CD20双特异性抗体，抗CD3/抗MUC16双特异性抗体和抗CD3/抗PSMA双特异性抗体。

16.权利要求14的方法，其中所述感兴趣蛋白选自alirocumab，sarilumab，fasinumab，nesvacumab，dupilumab，trevogrumab，evinacumab和rinucumab。

17.一种用于产生感兴趣的重组蛋白的方法，其包括下列步骤：(a)于一个或多个细胞中导入包含编码感兴趣蛋白的核苷酸序列的核酸；(b)选择表达所述感兴趣蛋白的细胞；(c)于包含约0.1mM至约10mM L-牛磺酸的细胞培养基中培养所述选择的细胞；和(d)于细胞中产生感兴趣蛋白，其中所述感兴趣蛋白被分泌至培养基中。

18.权利要求17的方法，其中通过添加牛磺酸于培养基中来增加所述感兴趣蛋白的滴度。

19.权利要求17或18的方法，其中步骤(c)的细胞能高产率产生所述感兴趣蛋白。

20.权利要求17至19中任一项的方法，其中相较于含有低于0.1mM L-牛磺酸的细胞培养基中表达所述感兴趣蛋白的细胞，所述细胞具有至少3％较高的蛋白产率。

21.权利要求17至20中任一项的方法，其中相较于含有低于0.1mM L-牛磺酸的细胞培养基中表达所述感兴趣蛋白的细胞，所述细胞具有至少8％较高的蛋白产率。

22.权利要求17至21中任一项的方法，其中所述细胞为CHO细胞、HEK293细胞或BHK细胞。

23.权利要求17至22中任一项的方法，其中所述感兴趣蛋白为抗原结合蛋白。

24.权利要求17至22中任一项的方法，其中所述感兴趣蛋白包含Fc结构域。

25.权利要求17至24任一项的方法，其中所述感兴趣蛋白选自：Fc-融合蛋白、受体-Fc-融合蛋白(TRAP)、抗体和抗体片段。

26.权利要求25的方法，其中所述感兴趣蛋白选自：抗PD1抗体，抗PDL-1抗体，抗Dll4抗体，抗ANG2抗体，抗AngPtl3抗体，抗PDGFR抗体，抗Erb3抗体，抗PRLR抗体，抗TNF抗体，抗EGFR抗体，抗PCSK9抗体，抗GDF8抗体，抗GCGR抗体，抗VEGF抗体，抗IL1R抗体，抗IL4R抗体，抗IL6R抗体，抗IL1抗体，抗IL2抗体，抗IL3抗体，抗IL4抗体，抗IL5抗体，抗IL6抗体，抗IL7抗体，抗RSV抗体，抗NGF抗体，抗CD3抗体，抗CD20抗体，抗CD19抗体，抗CD28抗体，抗CD48抗体，抗CD3/抗CD20双特异性抗体，抗CD3/抗MUC16双特异性抗体和抗CD3/抗PSMA双特异性抗体。

27.权利要求25的方法，其中所述感兴趣蛋白选自alirocumab，sarilumab，fasinumab，nesvacumab，dupilumab，trevogrumab，evinacumab和rinucumab。

28.一种于补充牛磺酸的培养基中产生感兴趣蛋白的方法，其包括下列步骤：

(a)于细胞中导入包含编码感兴趣蛋白的核酸；

(b)选择表达所述感兴趣蛋白的细胞；

(c)于细胞培养基中培养所选择的细胞；

(d)以约0.1mM至约10mM的量的牛磺酸补充所述细胞培养基；

(e)于(d)的牛磺酸补充条件下维持细胞培养至少6天以于细胞中表达相较于在未补充牛磺酸的培养中培养的细胞较高滴度的感兴趣蛋白；

(f)收获所述感兴趣蛋白。

29.权利要求28的方法，其中通过牛磺酸补充来增加所述感兴趣蛋白的滴度。

30.权利要求29的方法，其中所述收获的蛋白具有高于比较对照培养的滴度至少8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％或至少20％的蛋白滴度，其中比较对照培养基并未进行(d)的牛磺酸补充条件。

31.一种用于以高产率产生感兴趣的重组蛋白的方法，其包括于包含至少约0.1mM L-牛磺酸的细胞培养基中培养重组细胞系，其中所述细胞包含稳定整合的编码所述重组蛋白的核酸。

32.权利要求31的方法，其中相较于不包含L-牛磺酸的细胞培养基中所培养的细胞系，所述感兴趣重组蛋白的产率通过于培养基中包括牛磺酸来增加。

33.权利要求31或32的方法，其中所述感兴趣蛋白为抗原结合蛋白。

34.权利要求31至33中任一项的方法，其中所述感兴趣蛋白包含Fc结构域。

35.权利要求31至34中任一项的方法，其中所述感兴趣蛋白选自：Fc-融合蛋白、受体-Fc-融合蛋白(TRAP)、抗体和抗体片段。

36.权利要求35的方法，其中所述感兴趣蛋白选自：抗PD1抗体，抗PDL-1抗体，抗Dll4抗体，抗ANG2抗体，抗AngPtl3抗体，抗PDGFR抗体，抗Erb3抗体，抗PRLR抗体，抗TNF抗体，抗EGFR抗体，抗PCSK9抗体，抗GDF8抗体，抗GCGR抗体，抗VEGF抗体，抗IL1R抗体，抗IL4R抗体，抗IL6R抗体，抗IL1抗体，抗IL2抗体，抗IL3抗体，抗IL4抗体，抗IL5抗体，抗IL6抗体，抗IL7抗体，抗RSV抗体，抗NGF抗体，抗CD3抗体，抗CD20抗体，抗CD19抗体，抗CD28抗体，抗CD48抗体，抗CD3/抗CD20双特异性抗体，抗CD3/抗MUC16 双特异性抗体和抗CD3/抗PSMA双特异性抗体。

37.权利要求35的方法，其中所述感兴趣蛋白选自alirocumab，sarilumab，fasinumab，nesvacumab，dupilumab，trevogrumab，evinacumab和rinucumab。

38.权利要求31至37中任一项的方法，其中相较于含有低于0.1mM牛磺酸的细胞培养基中的类似产生方法，所述产生方法能增加蛋白产率至少0.1g/L，至少0.5g/L，至少1g/L，至少1.2g/L，至少1.4g/L，至少1.6g/L，至少1.8g/L，至少2g/L，至少2.2g/L，至少2.4g/L，或至少2.5g/L。

39.权利要求31至38中任一项的方法，其中相较于含有低于0.1mM牛磺酸的细胞培养基中的类似产生方法，所述产生方法能增加蛋白产率至少3％。

40.权利要求31至39中任一项的方法，其中相较于含有低于0.1mM牛磺酸的细胞培养基中的类似产生方法，所述产生方法能降低氨累积至少8％。

41.权利要求31至40中任一项的方法，进一步包括于细胞培养基中加入一种或多种使用点添加物的步骤。

42.一种用于高产率重组产生抗体的CHO细胞培养基，其包含约0.1mM至约10mM L-牛磺酸。

43.权利要求42的CHO细胞培养基，进一步包含鸟氨酸。

44.权利要求43的CHO细胞培养基，进一步包含腐胺。

45.权利要求42至44中任一项的CHO细胞培养基，进一步包含由下列组成的群中选择的氨基酸的混合物：精氨酸、组氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。

46.权利要求42至45中任一项的CHO细胞培养基，其中所述培养基为无血清的。

47.权利要求42至46中任一项的CHO细胞培养基，其中所述培养基为无水解产物的。

48.权利要求42至47中任一项的CHO细胞培养基，其中所述培养基为化学成分确定的。

49.权利要求42至48中任一项的CHO细胞培养基，其中所述培养基在第0天提供给生产批次培养。

50.权利要求42至49中任一项的CHO细胞培养基，其中进料在第0天，第1天，第2天，第3天，第4天，第5天，第6天，第7天，第8天，第9天和/或第10天提供给生产批次培养。

51.权利要求50的CHO细胞培养进料，其中在生产阶段期间提供给生产批次培养的培养基和进料含有总计约5mM至约10mM L-牛磺酸。

52.权利要求42至51中任一项的CHO细胞培养基，进一步包含一种或多种脂肪酸。

53.权利要求52的CHO细胞培养基，其中所述一种或多种脂肪酸由下列组成的群中选择：亚麻油酸、次亚麻油酸、硫辛酸、油酸、棕榈酸、硬脂酸、花生酸、花生四烯酸、月桂酸、山嵛酸、癸酸、十二酸、己酸、掬焦油酸、肉豆蔻酸和辛酸。

54.权利要求42至53中任一项的CHO细胞培养基，进一步包含由下列组成的群中选择的维生素和辅因子：生物素、D-泛酸钙、氯化胆碱、叶酸、I-肌醇、烟碱酰胺、吡哆醇HCl、核黄素、硫胺素.HCl和维生素B12。

55.权利要求42至54中任一项的CHO细胞培养基，进一步包含核苷的混合物。

56.权利要求55的CHO细胞培养基，其中所述核苷的混合物包含腺苷、鸟苷、胞苷、尿苷、胸苷和次黄嘌呤中的一种或多种。

57.权利要求42至56中任一项的CHO细胞培养基，进一步包含腺苷、鸟苷、胞苷、尿苷、胸苷和次黄嘌呤。

58.权利要求42至57中任一项的CHO细胞培养基，进一步包含一种或多种二价阳离子。

59.权利要求58的CHO细胞培养基，其中所述二价阳离子为镁、钙或二者。

60.权利要求59的CHO细胞培养基，包含Ca2+和Mg2+。

61.一种用于在CHO细胞培养中产生蛋白的进料批次培养基和/或进料，其包含约0.1mM至约10mM的量的牛磺酸。

62.权利要求61的进料批次培养基和/或进料，进一步包含鸟氨酸。

63.权利要求62的进料批次培养基和/或进料，进一步包含腐胺。

64.权利要求61至63中任一项的进料批次培养基和/或进料，进一步包含由下列组成的群中选择的氨基酸的混合物：精氨酸、组氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。

65.一种培养真核细胞用于产生感兴趣的重组蛋白的方法，其包括下列步骤：(a)提供根据权利要求42至64中任一项所述的细胞培养基，和(b)在所述细胞培养基中增殖或维持细胞，以形成细胞培养物，其中所述细胞表达感兴趣蛋白。

66.权利要求65的方法，其中所述真核细胞选自：哺乳动物细胞、鸟类细胞、昆虫细胞和酵母细胞。

67.权利要求65或66的方法，其中所述细胞为CHO细胞。

68.权利要求65至67中任一项的方法，其中所述感兴趣蛋白由细胞分泌至培养基中。

69.权利要求68的方法，其中所述感兴趣蛋白为抗原结合蛋白。

70.权利要求68或69的方法，其中所述感兴趣蛋白包含Fc结构域。

71.权利要求68至70中任一项的方法，其中所述感兴趣蛋白选自：Fc-融合蛋白、受体-Fc-融合蛋白(TRAP)、抗体和抗体片段。

72.权利要求71的方法，其中所述感兴趣蛋白选自：抗PD1抗体，抗PDL-1抗体，抗Dll4抗体，抗ANG2抗体，抗AngPtl3抗体，抗PDGFR抗体，抗Erb3抗体，抗PRLR抗体，抗TNF抗体，抗EGFR抗体，抗PCSK9抗体，抗GDF8抗体，抗GCGR抗体，抗VEGF抗体，抗IL1R抗体，抗IL4R抗体，抗IL6R抗体，抗IL1抗体，抗IL2抗体，抗IL3抗体，抗IL4抗体，抗IL5抗体，抗IL6抗体，抗IL7抗体，抗RSV 抗体，抗NGF抗体，抗CD3抗体，抗CD20抗体，抗CD19抗体，抗CD28抗体，抗CD48抗体，抗CD3/抗CD20双特异性抗体，抗CD3/抗MUC16双特异性抗体和抗CD3/抗PSMA双特异性抗体。

73.权利要求71的方法，其中所述感兴趣蛋白选自alirocumab，sarilumab，fasinumab，nesvacumab，dupilumab，trevogrumab，evinacumab和rinucumab。

74.权利要求65至73中任一项的方法，其中相较于含有低于0.1mM牛磺酸的培养基中的类似细胞培养，所述细胞培养能降低氨累积至少3％。

75.权利要求65至74中任一项的方法，其中相较于含有低于0.1mM牛磺酸的培养基中的类似细胞培养，所述细胞培养能降低氨累积至少8％。