JP5744856B2 - フコシル化欠損細胞 - Google Patents

Description

（分野）
本発明は、フコシル化経路における改変哺乳動物酵素であって、改変哺乳動物酵素を有する細胞がタンパク質をフコシル化する能力の低下を呈する、改変哺乳動物酵素、およびタンパク質をフコシル化する能力の低下を生じる遺伝的改変を含む細胞に関するものである。本発明は、野生型細胞系統と比較してフコシル化の低下を有する、抗体を含むタンパク質を発現する哺乳動物細胞系統（たとえばＣＨＯ系統）を含む。本発明は、タンパク質フコシル化の条件制御にも関する。

（背景）
タンパク質をフコシル化することができない細胞系統が当分野で公知である。タンパク質をフコシル化することができない、いくつかの機能喪失型変異体、おそらく最も顕著には、あるレクチンに対する耐性について選択されたあるチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞変異体が公知である。このような細胞系統は、変異原の存在下で特定のレクチン、たとえばレンズマメレクチンを結合できないことに関して、反復選択によって単離される。タンパク質、たとえば抗体をフコシル化することができないことが報告されている他の細胞系統が公知であり、たとえば特許文献１および特許文献２（α１，６−フコシルトランスフェラーゼ、すなわちＦＵＴ８変異体）を参照のこと。

米国特許第７，４２５，４６６号明細書 米国特許第７，２１４，７７５号明細書

タンパク質をフコシル化する能力の低下を有する細胞系統に対する、特にノックアウトの存在下でのフコシル化能力の低下を有する細胞に対する、およびタンパク質を条件付きでフコシル化する細胞に対する要求が当分野に残存している。

（概要）
１態様において、７９Ｓ、９０Ｋ、１３６Ｌ、２１１Ｒ、２８９Ｓ、およびその組合せからなる群より選択される改変を含む、単離された改変ＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシ−マンノース−３，５−エピメラーゼ−４−レダクターゼ（ＦＸ）タンパク質が提供される。１実施形態において、ＦＸタンパク質は２８９Ｓ改変を含む。１実施形態において、ＦＸタンパク質は、２８９Ｓ改変ならびに７９Ｓ、９０Ｋ、１３６Ｌ、２１１Ｒ、およびその組合せからなる群より選択される少なくとも１つの改変を含む。

１態様において、改変ＦＸタンパク質配列をコードする核酸が提供される。特定の実施形態において、核酸はｃＤＮＡである。１実施形態において、核酸を含む発現ベクターまたはターゲティングベクターが提供される。１実施形態において、ターゲティングベクターの核酸はイントロンを含む。１実施形態において、ターゲティングベクターの核酸は、改変ＦＸタンパク質をコードするｃＤＮＡを含む。特定の実施形態において、ターゲティングベクターは、ヒト、非ヒト霊長類、ハムスター、マウス、またはラットのゲノム中の遺伝子座にベクターをターゲティングするターゲティング配列を含む。

１態様において、ＦＸタンパク質をコードする核酸に対する改変を含むか、または改変を有するＦＸタンパク質を発現する細胞が提供され、細胞は野生型ＦＸタンパク質を発現しないか、または実質的に発現しない。特定の実施形態において、細胞は、改変を欠いた細胞と比較して、１０％以下の、５％以下の、２％以下の、または１％以下の野生型ＦＸタンパク質を呈する。

１実施形態において、改変ＦＸタンパク質または核酸を含む細胞はＦｃ含有糖タンパク質を発現し、前記細胞は改変を欠いた細胞と比較して、９０％以下の、９５％以下の、９６％以下の、９７％以下の、９８％以下の、または９９％以下の糖タンパク質をフコシル化する。

１態様において、ＦＸタンパク質をコードする核酸への改変を含むか、または改変を有するＦＸタンパク質を発現する細胞が提供され、細胞は第１の温度にて糖タンパク質をフコシル化する能力を欠いているかまたは実質的に欠いているが、第２の温度にて糖タンパク質をフコシル化する能力は欠いていないかまたは実質的に欠いていない。

１実施形態において、第１の温度は約３７℃である。１実施形態において、第２の温度は約３４℃である。

１実施形態において、第１の温度にて糖タンパク質をフコシル化する能力は、改変を欠いた細胞によって呈された糖タンパク質をフコシル化する能力の約１％から約１０％である。１実施形態において、第２の温度にて糖タンパク質をフコシル化する能力は、改変を欠いた細胞による糖タンパク質をフコシル化する能力と比較して、約７０％、８０％、９０％、またはそれ以上である。

特定の実施形態において、ＦＸタンパク質改変は、以下のアミノ酸置換：９０Ｋ、２８９Ｓ、２１１Ｒ、１３６Ｌ、７９Ｓ、およびその組合せからなる群より選択されるアミノ酸置換を含む。特定の実施形態において、置換は２８９Ｓである。

１実施形態において、ＦＸタンパク質は、非ヒト霊長類（たとえば、Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ）、ヒト、マウス（たとえば、Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）、ラット（たとえば、Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）、またはハムスター（たとえばチャイニーズハムスター、すなわち、Ｃｒｉｃｅｔｕｌｕｓ ｇｒｉｓｅｕｓ）由来である。特定の実施形態において、ＦＸタンパク質は、配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号５、または配列番号６のアミノ酸配列を含み、本明細書に記載するような１つ以上の改変（たとえばアミノ酸置換）を有する。

１実施形態において、核酸は、配列番号１の配列と少なくとも９０％または少なくとも９５％同一であるＦＸタンパク質をコードして、以下のアミノ酸の１つ以上を以下の位置の１つ以上：７９Ｓ、９０Ｋ、１３６Ｌ、２１１Ｒ、および２８９Ｓにさらに含む。

１実施形態において、核酸は、配列番号２のＦＸと少なくとも９５％同一であるＦＸをコードする。特定の実施形態において、ＦＸは、配列番号２のアミノ酸配列を有する。

１態様において、細胞が提供され、細胞は細胞が糖タンパク質をフコシル化する能力の低下を生じる改変を含み、改変は糖タンパク質をフコシル化する能力の低下を生じる、ＦＸ遺伝子の配列における変異または変更を含む。

１実施形態において、細胞はＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ（ＧＭＤ）、野生型ＧＤＰ−β−Ｌ−フコースピロホスホリラーゼ（ＧＦＰＰ）、野生型α−１，６−フコシルトランスフェラーゼ（ｆｕｃｏｌｙｓｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）（ＦＵＴ８）、およびその組合せからなる群より選択される野生型フコシル化経路酵素を発現する。

１態様において、タンパク質をフコシル化することが可能である哺乳動物細胞が提供され、細胞はＦＸ遺伝子中に改変を含み、改変は、変異または変更を欠く細胞との比較で、細胞がタンパク質をフコシル化する能力の少なくとも９０％の低下を生じる。

１実施形態において、低下は、改変を含有しない哺乳動物細胞との比較で、約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％である。

１実施形態において、本発明による改変細胞と改変を含まない細胞との比較が、同じかまたは実質的に同じ条件（たとえば培地、温度、細胞密度など）下で行われる。

１実施形態において、細胞は、ＣＯＳ、ＣＨＯ、２９３、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、Ｖｅｒｏ、アデノウイルス遺伝子（たとえばＡＤ５ Ｅ１）をトランスフェクトされた哺乳動物細胞、例えば、これに限定されるわけではないが、アデノウイルス遺伝子をトランスフェクトされた不死化ヒト網膜細胞、たとえばＰＥＲ．Ｃ６^ＴＭ細胞、およびＮＳＯ細胞から選択される。１実施形態において、細胞はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。特定の実施形態において、ＣＨＯ細胞はＣＨＯ Ｋ１細胞である。

１実施形態において、改変は以下のアミノ酸：７９Ｓ、９０Ｋ、１３６Ｌ、２１１Ｒ、２８９Ｓ、およびその組合せからなる群より選択される。特定の実施形態において、置換は２８９Ｓを含む。別の特定の実施形態において、置換は２８９Ｓならびに７９Ｓ、９０Ｋ、１３６Ｌ、および２１１Ｒの１つ以上を含む。

１実施形態において、細胞は、Ｎ７９Ｓ、Ｎ９０Ｋ、Ｐ１３６Ｌ、Ｇ２１１Ｒ、Ｌ２８９Ｓ、およびその組合せからなる群より選択される１つ以上のアミノ酸置換を有する配列番号１の配列を含むタンパク質をコードする、ＦＸ遺伝子を含む。特定の実施形態において、アミノ酸置換はＬ２８９ＳならびにＮ７９Ｓ、Ｎ９０Ｋ、Ｐ１３６Ｌ、およびＧ２１１Ｒの１つ以上を含む。

１実施形態において、細胞は、免疫グロブリンタンパク質をコードする少なくとも１つの核酸をさらに含む。特定の実施形態において、免疫グロブリンタンパク質は、ヒトタンパク質またはマウスタンパク質である。特定の実施形態において、免疫グロブリンタンパク質は、免疫グロブリン軽鎖を含む。特定の実施形態において、免疫グロブリンタンパク質は、免疫グロブリン重鎖を含む。１実施形態において、免疫グロブリン重鎖は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４アイソタイプである。１実施形態において、免疫グロブリン重鎖はＩｇＧ１アイソタイプ、たとえばヒトＩｇＧ１アイソタイプである。１実施形態において、重鎖および／または軽鎖の可変領域は、ヒトＣＤＲを、別の実施形態において、マウスＣＤＲを、別の実施形態において、マウスまたは非ヒト霊長類のヒト化ＣＤＲを含む。

１実施形態において、細胞は、免疫グロブリン重鎖のＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインをコードする核酸を含む。１実施形態において、免疫グロブリン重鎖は、アイソタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４である。

１実施形態において、タンパク質は抗原結合タンパク質である。特定の実施形態において、抗原結合タンパク質は抗体である。特定の実施形態において、抗体はＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、またはＩｇＭアイソタイプの重鎖を含む。１実施形態において、抗原結合タンパク質はＩｇＧ１アイソタイプの抗体である。

１実施形態において、タンパク質は抗体であり、細胞により作製された抗体タンパク質のわずか約５％、４％、３％、２％、１％、または０．５％がフコシル化される。１実施形態において、フコシル化されている作製された抗体タンパク質の量は、抗体タンパク質のＰＮＧアーゼＦによる一晩の脱グリコシルと、続いてのＨＰＬＣを介したオリゴサッカライド分析によって測定され、フコシル含有オリゴサッカライドは、グリカンピーク面積の積分によって定量化され、たとえばタンパク質フコシル化はグリカンピーク面積に基づいて計算される。特定の実施形態において、フコシル化グリカンは質量分析によって同定される。

１態様において、抗原結合タンパク質を作製する方法であって：（ａ）タンパク質をフコシル化することが可能である細胞であって、タンパク質をフコシル化する細胞の能力の少なくとも９０％の低下を生じるＦＸ遺伝子中の改変を含む細胞を提供することと；（ｂ）細胞中に抗原結合タンパク質をコードする核酸配列を導入することと；（ｃ）核酸配列を発現させて抗原結合タンパク質を産生するのに十分な条件下で細胞を維持することと；（ｄ）細胞によって発現された抗原結合タンパク質を収集することと；を含む方法が提供される。

１実施形態において、抗原結合タンパク質は抗体である。特定の実施形態において、抗体はヒト抗体、マウス抗体、キメラヒト／マウス抗体、および非ヒト霊長類抗体から選択される。

１実施形態において、細胞はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。

１実施形態において、タンパク質をフコシル化する細胞の能力の低下は、ＦＸ遺伝子中の改変を欠く細胞と比較して、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％である。

１実施形態において、改変は、以下の位置における以下のアミノ酸：７９Ｓ、９０Ｋ、１３６Ｌ、２１１Ｒ、および２８９Ｓからなる群より選択される。１実施形態において、改変は２８９Ｓならびに７９Ｓ、９０Ｋ、１３６Ｌ、および２１１Ｒの少なくとも１つを含む。

１実施形態において、フコシルトランスフェラーゼ遺伝子は、Ｎ７９Ｓ、Ｎ９０Ｋ、Ｐ１３６Ｌ、Ｇ２１１Ｒ、およびＬ２８９Ｓからなる群より選択されるアミノ酸置換を有する配列番号１の配列を含むタンパク質をコードする。１実施形態において、改変はＬ２８９ＳならびにＮ７９Ｓ、Ｎ９０Ｋ、Ｐ１３６Ｌ、およびＧ２１１Ｒの少なくとも１つを含む。

１実施形態において、抗体またはそのフラグメントはヒト抗体またはそのフラグメントである。特定の実施形態において、抗体はＩｇＧ１アイソタイプ、たとえばヒトＩｇＧ１である。

１実施形態において、収集された抗体は、改変を欠く野生型細胞中で作製された同じ抗体と比較してその約５％以下のフコシル化を、別の実施形態において、改変を欠く野生型細胞中で作製された同じ抗体と比較して４％、３％、２％、１％、または０．５％以下のフコシル化を有する。

１態様において、ＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ（ＧＭＤ）、野生型ＧＤＰ−β−Ｌ−フコースピロホスホリラーゼ（ＧＦＰＰ）、野生型α−１，６−フコシルトランスフェラーゼ（ｆｕｃｏｌｙｓｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）（ＦＵＴ８）、およびその組合せからなる群より選択される野生型フコシル化経路酵素を発現する細胞が提供され；細胞は改変ＦＸ遺伝子を含み、細胞は、ＦＸ遺伝子に対する改変を欠いた細胞と比較して、糖タンパク質をフコシル化する能力の低下を有する。

特定の実施形態において、糖タンパク質はＦｃを含む。１実施形態において、タンパク質は抗体である。１実施形態において、タンパク質はＩｇＧの配列を含む。特定の実施形態において、ＩｇＧの配列は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４配列、またはその組合せである。特定の実施形態において、タンパク質は抗体であり、抗体はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、および／またはＩｇＧ４配列を有するＦｃを含む。

１実施形態において、細胞はＣＨＯ、ＣＯＳ、ヒト網膜（たとえばＰＥＲ．Ｃ６^ＴＭ）、Ｖｅｒｏ、またはＨｅＬａ細胞から選択される。

１態様において、改変ＦＸ遺伝子を含む哺乳動物細胞中で糖タンパク質を発現することを含む、糖タンパク質を作製する方法が提供される。

１実施形態において、ＣＨＯ細胞が糖タンパク質を発現するのに十分な条件下にて培養培地中で糖タンパク質発現ＣＨＯ細胞を培養することと、ＣＨＯ細胞または培養培地から発現された糖タンパク質を収集することとを含む、糖タンパク質を作製する方法が提供される。１実施形態において、発現された糖タンパク質は、約５％以下がフコシル化されている。１実施形態において、約４％、３％、２％、１％、または０．５％以下がフコシル化されている。特定の実施形態において、フコシル化パーセントは、フコースのグリカンに対するモルパーセントである。特定の実施形態において、フコシル化パーセントは、フコースの糖タンパク質に対するモルパーセントである。特定の実施形態において、非フコシル化タンパク質のフコシル化タンパク質に対するモル比は、約０．９０から０．１０、約０．９１から０．０９、約０．９２から０．０８、約０．９３から０．０７、約０．９４から０．０６、約０．９５から０．０５、約０．９６から０．０４、約０．９７から０．０３、約０．９８から０．０２、または約０．９９から０．０１である。

１実施形態において、糖タンパク質は、位置２９７（ＥＵナンバリング）に以下のグリカン部分：Ｎ結合を通じて糖タンパク質に結合されたＧｌｃＮＡｃ（１）；ＧｌｃＮＡｃ（１）−ＧｌｃＮＡｃ（２）−マンノース（１）（ここでマンノース（１）は第１および第２の部分を有し、第１の部分はマンノース（２）−ＭａｎＧｌｃＮＡｃ（３）から本質的に成り；第２の部分はマンノース（３）−ＧｌｃＮＡｃ（４）から本質的に成る）を有する免疫グロブリンＣＨ２およびＣＨ３領域を含む。１実施形態において、炭水化物部分はさらに、ＧｌｃＮＡｃ（４）に結合されたＧａｌ（１）から本質的に成る。別の実施形態において、炭水化物部分はさらに、ＧｌｃＮＡｃ（４）に結合されたＧａｌ（１）およびＧｌｃＮＡｃ（３）に結合されたＧａｌ（２）から本質的に成る。

１実施形態において、フコシル化糖タンパク質は、本段落の直前の段落に記載された非フコシル化グリカン部分と同一であるグリカン部分を含むが、ＧｌｃＮＡｃ（１）にフコース部分も有する。

１態様において、遺伝的に改変された細胞であって、改変がＦＸ遺伝子に対してであり、改変が以下のアミノ酸：７９Ｓ、９０Ｋ、１３６Ｌ、２１１Ｒ、２８９Ｓの少なくとも１つを有するＦＸタンパク質をコードするＦＸｍＲＮＡを産生する細胞を生じ；細胞がＦＸ遺伝子改変を欠く細胞と比較して、糖タンパク質をフコシル化する能力の低下を呈する細胞が提供される。１実施形態において、ｍＲＮＡは、位置２８９にセリンを含むＦＸタンパク質をコードする。別の実施形態において、ｍＲＮＡは、７９Ｓ、９０Ｋ、１３６Ｌ、２１１Ｒの少なくとも１つをさらに含むＦＸタンパク質をコードする。

１態様において、遺伝的に改変された細胞であって、改変がＦＸ遺伝子に対してであり、改変されたＦＸ遺伝子が以下の：位置７９のセリン、位置９０のリジン、位置１３６のロイシン、位置２１１のアルギニン、および位置２８９のセリンの少なくとも１つを有するＦＸタンパク質をコードするように、改変がＦＸ遺伝子のコドンを変更する細胞が提供される。１実施形態において、ＦＸタンパク質は、位置２８９のセリンならびに位置９０のリジン、位置１３６のロイシン、および／または位置２１１のアルギニンの少なくとも１つを含む。

１実施形態において、細胞はＦｃ含有タンパク質をさらに発現する。１実施形態において、Ｆｃ含有タンパク質は抗体である。

１実施形態において、細胞はＦｃ含有タンパク質をグリコシル化するが、グリコシル化Ｆｃ含有タンパク質は実質的にフコシル化しない。特定の実施形態において、フコシル化は、ＦＸ遺伝子改変を欠く細胞と比較して、グリコシル化Ｆｃ含有タンパク質のフコシル化の約５％、４％、３％、２％、１％、または０．５％以下である。

１実施形態において、グリコシル化は２分岐トリマンノシル基を含む。１実施形態において、フコース対２分岐トリマンノシル基のモル比は、約１：２０、１：２５、１：３３、１：５０、１：１００、または１：２００以下である。１実施形態において、フコシル化Ｆｃ含有タンパク質中のフコース対２分岐トリマンノシル基のモル比は、約１：２０、１：２５、１：３３、１：５０、１：１００、または１：２００以下である。

１実施形態において、Ｆｃ含有タンパク質は抗体であり、グリコシル化はＦｃの位置２９７でのグリカン部分を含む。１実施形態において、フコース対グリカン部分のモル比は、約１：２０、１：２０、１：２５、１：３３、１：５０、１：１００、または２００以下である。１実施形態において、グリカン部分は２分岐トリマンノシル部分が続く２個のタンデムＧｌｃＮＡｃ残基を含み、トリマンノシル部分の２個の末端マンノシル部分はそれぞれ１個のＧｌｃＮＡｃ残基を有する。１実施形態において、グリカン中のフコース対ＧｌｃＮＡｃのモル比は、１：８０、１：１００、１：１３３、１：１５０、１：２００、１：４００、または１：８００以下である。

１態様において、糖タンパク質を異所的に発現する改変哺乳動物細胞が提供され、改変は改変ＦＸ核酸配列を含み、細胞はフコースサルベージ経路およびデノボフコース合成経路を含み、機能性ＦＵＴ８タンパク質および機能性ＧＭＤタンパク質を発現し、デノボフコース合成経路は、約３７℃においてはＦＸ核酸配列の改変のために糖タンパク質を実質的にフコシル化することができないが、約３４℃においては糖タンパク質を実質的にフコシル化することが可能である。

本明細書に記載する個別の態様および実施形態は、単独でまたはその他の任意の態様もしくは実施形態と組合せて、そうでないと明示的に示されない限り、またはこのような組合せが状況によって許可されない場合を除いて、用いられることが意図される。

図１は、サル（Ｍａｃａｃｃａ ｍｕｌａｔｔａ）、配列番号３；ヒト、配列番号４；マウス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）、配列番号５；ラット（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）、配列番号６；ＣＨＯ（Ｃｒｉｃｅｔｕｌｕｓ ｇｒｉｓｅｕｓ）、配列番号１；ならびにＬ２８９ＳおよびＮ９０Ｋ改変を有するＣＨＯ（細胞系統８０８８と呼ぶ）、配列番号２の、ＦＸタンパク質配列のＭａｃＶｅｃｔｏｒ^ＴＭアラインメント（上から下へ）を示す。 図２は、ＬＣＡによる染色前後の３０３３、６０６６、７０７７、および８０８８細胞のフローサイトメトリーヒストグラムを示す。 図３は、染色されていない４０４４−１細胞のフローサイトメトリーヒストグラム、ならびにＬＣＡによって染色した４０４４−１、６０６９、２０２０、および２１２１細胞のヒストグラムを示す。 図４は、染色されていない５０５５細胞のフローサイトメトリーヒストグラムならびにＬＣＡによって染色した５０５５、８０８８、および１０１０細胞のヒストグラムを示す。 図５は、ＬＣＡによる染色前後の３７℃および３４℃にて培養した４０４４−１および６０６６−１細胞のフローサイトメトリーヒストグラムを示す。 図６は、５ｍＭ Ｌ−フコースを含む培地および含まない培地で培養した３０３３、７０７７、８０８８、および１０１０細胞のフローサイトメトリーヒストグラム、ならびにＬ−フコースを含まない培地で培養した５０５５細胞のヒストグラムを示す。すべての細胞をＬＣＡで染色した。 図７は、ｐＲ４００９、ｐＲ４０１０、およびｐＲ４０１１によって安定的にトランスフェクトされた８０８８細胞、ならびに５０５５細胞のフローサイトメトリーヒストグラムを示す。 図８は、外部フコース供給源の非存在下で３７℃にて増殖させられた８０８８細胞中のＡｂ３．１のＨＰＬＣによるグリカン分離を示す（１．４７％フコシル化）。 図９は、図８のグリカンの質量分析結果を示す；グリカンの構造が各ピークの右側に表示されている。ＧｌｃＮＡｃ残基は正方形によって表され；マンノース残基は円によって表され；ガラクトース残基はひし形によって表されている。 図１０は、１０ｍＭフコースの存在下で３７℃にて増殖させられた８０８８細胞中のＡｂ３．１のＨＰＬＣによるグリカン分離を示す（９５．２２％フコシル化）。 図１１は、図１０のグリカンの質量分析結果を示す；グリカンの構造が各ピークの右側に表示されている。ＧｌｃＮＡｃ残基は正方形によって表され；マンノース残基は円によって表され；ガラクトース残基はひし形によって表され；フコース残基は三角形によって表されている。 図１２は、外部フコース供給源の非存在下で３７℃にて増殖させられた８０８８細胞中のＡｂ３．２のＨＰＬＣによるグリカン分離を示す（５．７３％フコシル化）。 図１３は、図１２のグリカンの質量分析結果を示す；グリカンの構造が各ピークの右側に表示されている。ＧｌｃＮＡｃ残基は正方形によって表され；マンノース残基は円によって表され；ガラクトース残基はひし形によって表されている。 図１４は、１０ｍＭフコースの存在下で３７℃にて増殖させられた８０８８細胞中のＡｂ３．２のＨＰＬＣによるグリカン分離を示す（９５．６３％フコシル化）。 図１５は、図１４のグリカンの質量分析結果を示す；グリカンの構造が各ピークの右側に表示されている。ＧｌｃＮＡｃ残基は正方形によって表され；マンノース残基は円によって表され；ガラクトース残基はひし形によって表され；フコース残基は三角形によって表されている。 図１６は、野生型および低フコシル化細胞系統に対する質量分析試験の結果をまとめる。ＧｌｃＮＡｃ残基は正方形によって表され；マンノース残基は円によって表され；ガラクトース残基はひし形によって表され；フコース残基は三角形によって表されている。

（説明）
本発明は記載された特定の方法および実験条件に限定されない。なぜならば、そのような方法および条件は変動し得るからである。本発明は認められた請求項によって包含されるため、本明細書で使用する専門用語は、特定の実施形態を説明する目的のためだけにあり、制限的であることが意図されない。

別途定義されない限り、使用されるすべての用語および語句は、反対のことが明瞭に示されない限り、または用語または語句が使用される状況から明瞭に明らかでない限り、用語および語句が当分野で獲得した意味を含む。記載するものと類似または同等であるいずれの方法および材料も本発明の実施または試験で使用することができるが、特定の方法および材料がここで記載される。言及されたすべての刊行物は、参照により本明細書に組み入れられている。

単数形（たとえば「ａ」または「ｔｈｅ」）への言及は、複数形への言及が除外されることを文脈が明瞭に示さない限り、複数形への言及を包含することが意図される。

「抗体」という用語は、ジスルフィド結合によって相互接続された４つのポリペプチド鎖、すなわち２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含む免疫グロブリン分子を含む。各重鎖は、重鎖可変（ＶＨ）領域および重鎖定常領域（ＣＨ）を含む。重鎖定常領域は、３つのドメインＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含む。各軽鎖は、軽鎖可変（ＶＬ）領域および軽鎖定常領域（ＣＬ）を含む。ＶＨおよびＶＬ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域、相補性決定領域が散在する、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存された領域にさらに細分することができる。各ＶＨおよびＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端へ以下の順序で配置された３つのＣＤＲおよび４つのＦＲを含む：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４（重鎖ＣＤＲはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３と省略され得る；軽鎖ＣＤＲはＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３と省略され得る）。「高親和性」抗体という用語は、その標的エピトープに関して約１０^−９Ｍ以下（たとえば約１×１０^−９Ｍ、１×１０^−１０Ｍ、１×１０^−１１Ｍ、または約１×１０^−１２Ｍ）のＫＤを有する抗体を指す。１実施形態において、ＫＤは表面プラズモン共鳴、たとえばＢＩＡＣＯＲＥ^ＴＭによって測定される；別の実施形態において、ＫＤはＥＬＩＳＡによって測定される。

「結合タンパク質」という語句は、結合パートナーを特異的に認識することが可能であるいずれのタンパク質も含む。特異的認識は概して、結合タンパク質がその結合パートナーに数マイクロモル以下の解離定数（ＫＤ）で結合することを必要とし、大半の例では、望ましい結合タンパク質はその結合パートナーをナノモル範囲で、たとえば各種の実施形態において、およそ百ナノモル未満で結合する。本明細書に記載する大半の結合タンパク質は、Ｆｃ含有タンパク質でもあり、すなわちこれらは、少なくとも免疫グロブリンＣＨ２およびＣＨ３領域の機能性部分を含むＦｃと融合した結合部分を含む。代表的な結合タンパク質は、抗体、多重特異性抗体（たとえば２重特異性抗体）、イムノアドヘシン、トラップ（たとえばＩＬ−１トラップなどのサイトカイントラップ；ＶＥＧＦトラップなど）である。抗体でない代表的な結合タンパク質は、結合部分（たとえば受容体またはその断片、リガンドまたはその断片、標準的な免疫グロブリン可変ドメインの改変体など）ならびにＣＨ２およびＣＨ３免疫グロブリンドメインを頻繁に含む免疫グロブリン部分（またはＦｃエフェクター機能を保持するその断片）を有する。それゆえ、本発明の組成物および方法は、Ｆｃ受容体を結合し、および／または補体を活性化して、これによりＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣを媒介することが可能である免疫グロブリン領域（たとえば機能性ＣＨ２およびＣＨ３領域）を有する結合タンパク質（たとえばイムノアドヘシンおよびトラップを含む）を作製するために使用することができる。

多重特異性抗体は、１つの標的ポリペプチドの異なるエピトープに対して特異的であり得、または１を超える標的ポリペプチドに対して特異的である抗原結合ドメインを含有し得る。２本の免疫グロブリンアームを含む２重特異性である多重特異性結合タンパク質を作製することができ、たとえば免疫グロブリンの第１のアームは第１のエピトープに特異的であり、免疫グロブリンの第２のアームは第２のエピトープに特異的である。他の多重特異性結合タンパク質は、第２のアームがタンパク質または非タンパク質結合パートナーである標的を特異的に結合する結合部分（リガンドもしくは受容体またはその結合断片）を有する多重特異性結合タンパク質を含む。

「２重特異性抗体」という語句は、２つ以上のエピトープを選択的に結合することが可能である抗体を含む。２重特異性抗体は概して、２つの同一でない重鎖を含み、各重鎖は異なるエピトープ（２つの異なる分子上（たとえば２つの異なる抗原上の異なるエピトープ）または同じ分子上（たとえば同じ抗原上の異なるエピトープ）のどちらか）に特異的に結合する。２重特異性抗体が２つの異なるエピトープ（第１のエピトープおよび第２のエピトープ）を選択的に結合することが可能である場合、第１のエピトープに対する第１の重鎖の親和性は概して、第２のエピトープに対する第１の重鎖の親和性より少なくとも１から２桁または３桁または４桁以上低く、逆もまた同様である。２重特異性抗体によって特異的に結合されたエピトープは、同じかまたは異なる標的上に（たとえば同じかまたは異なるタンパク質上に）あることができる。２重特異性抗体は、たとえば、同じ抗原の異なるエピトープを認識する重鎖を組合せることによって作製することができる。たとえば、同じ抗原の異なるエピトープを認識する重鎖可変配列をコードする核酸配列は、同じかまたは異なる重鎖定常領域をコードする核酸配列に融合させることができ、このような配列は免疫グロブリン軽鎖を発現する細胞中で発現させることができる。代表的な２重特異性抗体は、それぞれ３つの重鎖ＣＤＲと、続いての（Ｎ末端からＣ末端へ）ＣＨ１ドメイン、ヒンジ、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを有する２個の重鎖、ならびにエピトープ結合特異性を付与しないが、各重鎖と関連することができる、または各重鎖と関連することができて、重鎖エピトープ結合領域によって結合されたエピトープの１つ以上を結合することができる、または各重鎖と関連することができて、１つまたは両方の重鎖の１つまたは両方のエピトープへの結合を可能にする、いずれかの免疫グロブリン軽鎖を有する。

２重特異性結合タンパク質フォーマットの１例は、第１の免疫グロブリン（Ｉｇ）ＣＨ３ドメインおよび第２のＩｇ ＣＨ３ドメインを用い、第１のおよび第２のＩｇ ＣＨ３ドメインは少なくとも１つのアミノ酸が相互に異なり、少なくとも１つのアミノ酸の相違がアミノ酸相違を欠いた２重特異性抗体と比較して、２重特異性抗体のプロテインＡへの結合を低下させる。１実施形態において、第１のＩｇ ＣＨ３ドメインはプロテインＡを結合して、第２のＩｇ ＣＨ３ドメインは、４３５Ｒ改変（ＥＵナンバリングによる；ＩＭＧＴエクソンナンバリングにより９５Ｒ）などの、プロテインＡ結合を低下させるかまたは無くす変異を含有する。第２のＣＨ３は、４３６Ｆ改変（ＥＵナンバリングによる；ＩＭＧＴナンバリングにより９６Ｆ）をさらに含み得る。第２のＣＨ３内に見出され得るさらなる改変は、３５６Ｅ、３５８Ｍ、３８４Ｓ、３９２Ｎ、３９７Ｍ、および４２２１（ＥＵナンバリングによる；ＩＭＧＴナンバリングにより１６Ｅ、１８Ｍ、４４Ｓ、５２Ｎ、５７Ｍ、および８２Ｉ）を含む。本フォーマットでは、第１のＩｇ ＣＨ３ドメインは第１の結合部分（たとえば第１のエピトープを特異的に結合する第１のＩｇ可変ドメイン）に融合され、第２のＩｇ ＣＨ３ドメインは第２の結合部分（たとえば第２のエピトープを特異的に結合する第２のＩｇ可変ドメイン、第１のエピトープと第２のエピトープは異なる）に融合される。

「細胞」という用語は、組換え核酸配列を発現するのに好適ないずれの細胞も含む。細胞は、真核生物（単細胞または多細胞）、酵母細胞（たとえばＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓ．ｐｏｍｂｅ、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａなど）、植物細胞、昆虫細胞（たとえばＳＦ−９、ＳＦ−２１、バキュロウイルス感染昆虫細胞、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉなど）、非ヒト動物細胞、ヒト細胞、または細胞融合物、たとえばハイブリドーマもしくはクアドローマを含む。フコシル化の経路を天然に含んでいない細胞は、フコシル化経路を含有するように遺伝的に改変され得（たとえば米国特許出願公開番号２０１０／００２８９５１Ａ１を参照）、細胞は、本明細書に記載するような改変されているＦＸ遺伝子を用いるように改変することができる。

いくつかの実施形態において、細胞はヒト、サル、類人猿、ハムスター、ラット、またはマウスの細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は真核性であり、以下の細胞：ＣＨＯ（たとえばＣＨＯ Ｋ１、ＤＸＢ−１１ ＣＨＯ、Ｖｅｇｇｉｅ−ＣＨＯ）、ＣＯＳ（たとえばＣＯＳ−７）、シリアンハムスター、ラット骨髄腫（ｍｙｌｅｌｏｍａ）、マウス骨髄腫（たとえばＳＰ２／０、ＮＳ０）、網膜細胞、Ｖｅｒｏ、ＣＶ１、腎臓（たとえばＨＥＫ２９３、２９３ ＥＢＮＡ、ＭＳＲ ２９３、ＭＤＣＫ、ＨａＫ、ＢＨＫ、ＢＨＫ２１）、ＨｅＬａ、ＨｅｐＧ２、ＷＩ３８、ＭＲＣ ５、Ｃｏｌｏ２０５、ＨＢ ８０６５、ＨＬ−６０、Ｊｕｒｋａｔ、Ｄａｕｄｉ、Ａ４３１（表皮）、ＣＶ−１、Ｕ９３７、３Ｔ３、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、ＭＭＴ ０６０５６２、セルトリ細胞、ＢＲＬ ３Ａ細胞、ＨＴ１０８０細胞、ヒト骨髄腫細胞、腫瘍細胞、ヒトリンパ腫細胞（たとえばナマルバ細胞）および上述の細胞に由来する細胞系統から選択される。いくつかの実施形態において、細胞は１つ以上のウイルス遺伝子を含み、たとえば細胞はウイルス遺伝子を発現する網膜細胞（たとえばＰＥＲ．Ｃ６^ＴＭ細胞）である。

「Ｆｃ含有タンパク質」という語句は、抗体、２重特異性抗体、イムノアドヘシン、ならびに免疫グロブリンＣＨ２およびＣＨ３領域の少なくとも機能性部分を含む他の結合タンパク質を含む。「機能性部分」は、Ｆｃ受容体（たとえばＦｃγＲまたはＦｃＲＮ）を結合することができる、および／または補体の活性化に関与することができるＣＨ２およびＣＨ３領域を指す。ＣＨ２およびＣＨ３領域が欠失、置換、および／もしくは挿入または任意のＦｃ受容体に結合できないように、および補体を活性化できないようにもする他の改変を含有する場合、そのＣＨ２およびＣＨ３領域は機能性ではない。

Ｆｃ含有タンパク質は、免疫グロブリンドメイン中の改変を含むことができ、改変が結合タンパク質の１つ以上のエフェクター機能に影響を及ぼす場合を含む（たとえばＦｃγＲ結合、ＦｃＲＮ結合、そしてそれゆえ半減期および／またはＣＤＣ活性に影響を及ぼす改変）。このような改変は、これに限定されるわけではないが、免疫グロブリン定常領域のＥＵナンバリングに関して、以下の改変およびその組合せを含む：２３８、２３９、２４８、２４９、２５０、２５２、２５４、２５５、２５６、２５８、２６５、２６７、２６８、２６９、２７０、２７２、２７６、２７８、２８０、２８３、２８５、２８６、２８９、２９０、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、３０１、３０３、３０５、３０７、３０８、３０９、３１１、３１２、３１５、３１８、３２０、３２２、３２４、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３７、３３８、３３９、３４０、３４２、３４４、３５６、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３７３、３７５、３７６、３７８、３８０、３８２、３８３、３８４、３８６、３８８、３８９、３９８、４１４、４１６、４１９、４２８、４３０、４３３、４３４、４３５、４３７、４３８、および４３９。たとえば、制限としてではなく、結合タンパク質は、増強された血清半減期を呈し得、位置２５２、２５４、および２５６における改変；または４２８および／もしくは４３３および／もしくは４３４における改変；または２５０および／もしくは４２８における改変；または３０７もしくは３０８、および４３４における改変を有し得る。

「ＦＸ」という用語は、ＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシマンノース−３，５−エピメラーゼ−４−レダクターゼ活性を呈するタンパク質またはＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシマンノース−３，５−エピメラーゼ−４−レダクターゼ活性を有するタンパク質をコードする核酸配列を指す。本明細書に記載する大半の例は、野生型Ｃ．ｇｒｉｓｅｕｓ ＦＸまたは本発明に従って改変されているＣ．ｇｒｉｓｅｕｓ ＦＸを指す。しかし、「ＦＸ」はＣＨＯ細胞への言及に制限されない。図１に示すように、Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ、ヒト、Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ、Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ ＦＸ配列のアラインメントは、非常に高度の保存を明らかにし、すなわち各種生物からのＦＸ配列は非常に類似している。この高度の同一性に基づいて、これらの種の間に存在するわずかな配列の相違がＦＸ活性に実質的に影響を及ぼさないことが予想される。ＣＨＯ ＦＸ配列（配列番号１）とサル（配列番号３）、ヒト（配列番号４）、マウス（配列番号５）、およびラット（配列番号６）からの配列との間の相違は、以下の：５Ｈ、８Ｍ、２１Ｋ、３７Ｄ、５１Ｔ、５５Ｒ、５９Ｅ、６２Ｒ、９３Ｍ、１０６Ａ、１０７Ｃ、１３８Ｎ、１６１Ｙ、１６７Ｓ、１７７Ｙ、２０１Ｓ、２０２Ｓ、２０２Ｄ、２１２Ｎ、２２５Ｑ、２３５Ｓ、２６６Ｈ、２６６Ｎ、２６６Ｓ、２７３Ｔ、２７４Ｓ、２８０Ｆ、２８７Ｓ、２９１Ｔ、２９１Ｓ、２９７Ｃ、３１０Ｄ、３１４Ｅを含む。３２１アミノ酸野生型ＣＨＯ ＦＸ（配列番号１）に関して、サル、ヒト、マウス、およびラットＦＸ配列のいずれか１つは、３１の異なる置換から選択することによって再現させることができ、すなわちこれは、３１／３２１×１００＝野生型ＣＨＯ ＦＸ配列の９．６％である。それゆえ、本発明の改変ＦＸは、野生型ＣＨＯ ＦＸ（たとえば配列番号１）または野生型ＣＨＯ ＦＸと少なくとも９０．４％の同一性を有し、Ｎ７９Ｓ、Ｎ９０Ｋ、Ｇ２１１Ｒ、およびＬ２８９Ｓからなる群より選択される置換も有するＦＸを含む。配列番号１からの少ない派生のために、本発明の改変ＦＸは、配列番号１と少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であり、Ｎ７９Ｓ、Ｎ９０Ｋ、Ｐ１３６Ｌ、Ｇ２１１Ｒ、およびＬ２８９Ｓからなる群より選択される少なくとも１つの改変を有し、たとえばＬ２８９Ｓ改変を有する。当業者は、位置７９、９０、１３６、２１１、および２８９の少なくとも１つを含む小さな挿入の１つ以上または小さな欠失の１つ以上が、本発明の実施形態と関連する利点も提供する可能性が高いであろうことを予想する（たとえば改変遺伝子を有する細胞は、糖タンパク質のフコシル化の低下を呈する）。

特定の実施形態において、ＦＸは、２８９Ｓである第１の置換および１つ以上の第２の置換を含む。

「低フコシル化」または「フコシル化の低下」という語句は、正常または野生型細胞と比較して、改変細胞が糖タンパク質をフコシル化する能力の下降または低下を指す。糖タンパク質は内因性糖タンパク質であり得る。さらに通例、核酸改変は、異種糖タンパク質を発現させるために使用される細胞、たとえば結合タンパク質（たとえば抗体もしくは２重特異性抗体もしくはイムノアドヘシンまたは他のＦｃ含有糖タンパク質）を異所的に発現する細胞の中で行われる。たとえば本発明に従って改変されたＣＨＯまたはＰＥＲＣ．６^ＴＭ細胞系統であり、これは、ヒト抗体、たとえばヒトＩｇＧ１抗体も発現する。

一般に、糖タンパク質に関しての「低フコシル化」または「フコシル化の低下」への言及は、より少ないフコース残基が結合している単一の糖タンパク質分子を指さない。そうではなく、細胞から調製された糖タンパク質調製物が言及され、糖タンパク質調製物は個別の糖タンパク質分子の集団を含み、集団のメンバーは異なるグリコシル化特色を有する。限定ではなく例証の目的で、本発明に従って改変ＣＨＯ細胞中で発現されるＩｇＧ１抗体では、「低フコシル化」または「フコシル化の低下」は、Ｆｃの位置２９７において、グリカンのＮ結合ＧｌｃＮＡｃ残基にフコース残基を有する個別の糖タンパク質の、より少ない数を指す。このような「低フコシル化」または「フコシル化の低下」は、多種多様の仕方で（本明細書の別の箇所を参照）特徴付けることができるが、各場合において、本発明による改変を欠く細胞系統中で作製された同じ糖タンパク質の集団と比較して、フコース残基をその上に有する、集団の比較的低い（または低下した）数の糖タンパク質が言及される。

例証として、本発明によって作製された糖タンパク質が、野生型細胞によって作製された同じ糖タンパク質と比較して１％フコシル化されている場合、対応する野生型細胞中で観察されたフコシル化の量と比較して、Ｆｃ含有タンパク質の分子のわずか１％が本発明の細胞中でフコシル化されている（同じ条件下で野生型細胞においてＦｃ含有タンパク質の分子のすべてがフコシル化されているか否かにかかわらず、任意に１００％に設定した）。

本発明による「低フコシル化」または「フコシル化の低下」細胞において、糖タンパク質のフコシル化は、改変を含有しない細胞との比較で、約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％低下している。特定の実施形態において、低下は、改変を含有しない細胞との比較で、約９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、または９９．９％である。別の特定の実施形態において、低下は、改変を含有しない細胞との比較で、約９８．１％、９８．２％、９８．３％、９８．４％、９８．５％、９８．６％、９８．７％、９８．８％、または９８．９％である。別の特定の実施形態において、低下は、改変を含有しない細胞との比較で、約９７．１％、９７．２％、９７．３％、９７．４％、９７．５％、９７．６％、９７．７％、９７．８％、または９７．９％である。別の特定の実施形態において、低下は、改変を含有しない細胞との比較で、約９６．１％、９６．２％、９６．３％、９６．４％、９６．５％、９６．６％、９６．７％、９６．８％、または９６．９％である。別の特定の実施形態において、低下は、改変を含有しない細胞との比較で、約９５．１％、９５．２％、９５．３％、９５．４％、９５．５％、９５．６％、９５．７％、９５．８％、または９５．９％である。別の特定の実施形態において、低下は、改変を含有しない細胞との比較で、約９４．１％、９４．２％、９４．３％、９４．４％、９４．５％、９４．６％、９４．７％、９４．８％、または９４．９％である。

本発明による細胞中で作製された糖タンパク質調製物は、改変を含有しない細胞中で作製された同じ糖タンパク質のフコシル化の量の、わずか約５％、約４％、約３％、約２％、約１％、約０．５％、約０．４％、約０．３％、約０．２％、または約０．１％がフコシル化されている。

「低フコシル化」または「フコシル化の低下」細胞からの糖タンパク質調製物を特徴付けする別の仕方は、細胞によって作製された糖タンパク質調製物中のフコシル化糖タンパク質対非フコシル化糖タンパク質の比による。たとえば改変細胞によって作製された糖タンパク質調製物は、約１：１０から１：１５、１：１５から１：２０、１：２０から１：４０、１：４０から１：６０、１：６０から１：８０、１：８０から１：１００、または１：１００から１：１５０であるフコシル化糖タンパク質：非フコシル化糖タンパク質の比を有する。

「低フコシル化」または「フコシル化の低下」細胞からの糖タンパク質調製物を特徴付けする別の仕方は、（全体、すなわちフコシル化および非フコシル化糖タンパク質と比較した）非フコシル化糖タンパク質の相対重量パーセントによる。たとえば改変細胞によって作製された糖タンパク質調製物は、改変を欠く細胞からの同じ糖タンパク質調製物と比較して、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約９９．５％である非フコシル化糖タンパク質のパーセントを有する。

「低フコシル化」または「フコシル化の低下」細胞からの糖タンパク質調製物を特徴付けする別の仕方は、糖タンパク質調製物の、フコース対グリカンの相対量またはフコース対グリカン構成要素の相対量による。たとえばＦｃ含有タンパク質（たとえば抗体）の場合、グリコシル化は位置２９７にグリカンを含み、グリカンは２分岐トリマンノシル部分を含む。１実施形態において、フコース対グリカン部分のモル比は、約１：２０、１：２０、１：２５、１：３３、１：５０、１：１００、または１：２００以下である。１実施形態において、フコース対２分岐トリマンノシル部分の比は、約１：２０、１：２５、１：３３、１：５０、１：１００、または１：２００以下である。１実施形態において、フコシル化Ｆｃ含有タンパク質中のフコース対２分岐トリマンノシル部分のモル比は、約１：２０、１：２５、１：３３、１：５０、１：１００、または１：２００以下である。１実施形態において、グリカン部分は２分岐トリマンノシル部分が続く２個のタンデムＧｌｃＮＡｃ残基を含み、トリマンノシル部分の２個の分岐末端マンノシル部分はそれぞれ１個のＧｌｃＮＡｃ残基を有する。１実施形態において、グリカン中のフコース対ＧｌｃＮＡｃのモル比は、１：８０、１：１００、１：１３３、１：１５０、１：２００、１：４００、または１：８００以下である。

１実施形態において、フコシル化されている作製された抗体タンパク質の量は、抗体タンパク質のＰＮＧアーゼＦによる一晩の脱グリコシルと、続いてのＨＰＬＣを介したオリゴサッカライド分析によって測定され、フコシル含有オリゴサッカライドは、グリカンピーク面積の積分によって定量化され、たとえばタンパク質フコシル化はグリカンピーク面積に基づいて計算される。グリカンの同一性（および組成）は、任意の好適な方法（たとえば質量分析）によって決定（および／または定量化）することができる。

「野生型」という語句は、本発明に従って改変されていない細胞または活性、たとえば改変ＦＸ核酸配列または改変ＦＸタンパク質を含有していない細胞への言及を含む。「野生型」ＦＸ活性は、天然または非改変ＦＸ遺伝子またはタンパク質によって呈される活性（たとえば酵素活性）のいずれかのパラメータへの言及を含む。ＦＸタンパク質の「野生型」活性および改変ＦＸタンパク質の活性の比較では、「野生型」ＦＸタンパク質および改変ＦＸタンパク質は、実質的に同じ供給源（たとえば同じ細胞型、同じ生物）から実質的に同じ方式で単離され、実質的に同じ条件下で比較される。野生型細胞と改変細胞との間での「野生型」ＦＸ活性および改変ＦＸ活性の比較では、ＦＸ活性は好ましくは、実質的に同じかまたは実質的に類似の条件下で、同一のまたは実質的に同一の糖タンパク質を用いて測定される。

（概要）
改変ＦＸ核酸およびタンパク質配列が提供され、改変は、改変の欠如を有する細胞は支持することができるレベルでの外部フコース供給源の非存在下にて、タンパク質フコシル化を支持することができない細胞を生じる。細胞は、糖タンパク質フコシル化の基質、ＧＤＰ−Ｌ−フコースの合成のためのデノボ経路の酵素活性の破壊のために、１つの温度における（フコース供給源の非存在下での）糖タンパク質をフコシル化する能力の実質的低下を呈する。別の（高い）温度では、細胞の能力の低下は最小限であるかまたは実質的でない。

酵素ＧＤＰ−４−ケト−デオキシ−マンノース−３，５，−エピメラーゼ−４−レダクターゼ（ＦＸ）は、ＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシマンノースからＧＤＰ−Ｌ−フコースを形成するＧＤＰ−Ｌ−フコース合成のデノボ経路に関係する。得られたＧＤＰ−Ｌ−フコースは、細胞によって使用されて、フコシル化抗体を含むフコシル化タンパク質を作製することができる。ＧＤＰ−Ｌ−フコースシンセターゼはデノボ経路に関係するため、十分なＦＸ活性を欠く細胞中でのフコシル化の低下は、サルベージ経路によって救援することができる。サルベージ経路はフコースを必要とし、フコースはサルベージ経路を通じて働き、タンパク質フコシル化の基質であるＧＤＰ−Ｌ−フコースを形成する。

ＦＸにおけるある改変は、改変ＦＸ遺伝子を有する細胞がフコース供給源の非存在下でタンパク質フコシル化を持続できないことを生じ、これにより、野生型ＦＸ遺伝子を有する野生型細胞と比較して、改変酵素を有して、たとえば組換え抗体を発現する細胞が抗体をフコシル化する能力の実質的な低下を呈する。

本明細書に記載されたＦＸ遺伝子改変のためにタンパク質フコシル化を十分な速度またはレベルで持続できないことは、実質的に温度依存性である。特に、改変ＦＸ遺伝子を有する細胞は、約３７℃にて糖タンパク質フコシル化を実質的に持続できないことを呈し（たとえばヒトＩｇＧ１アイソタイプ抗体の７％のフコシル化）、このことは約３４℃にて実質的に軽減される（たとえば同じ抗体の７０％のフコシル化；表３を参照）。野生型ＦＸ遺伝子のみを有する細胞は対照的に、３４℃と比較して、３７℃にて糖タンパク質フコシル化を持続させる能力に大きな相違を呈さない。

（ＧＤＰ−フコースへのデノボおよびサルベージ経路）
ＧＤＰ−フコースは、糖タンパク質フコシル化経路における中心代謝産物である；ＧＤＰ−フコースは、糖タンパク質フコシル化でのフコース供与体である。Ｆｃを含む糖タンパク質をフコシル化することができる目的の公知のフコシルトランスフェラーゼはすべて、ＧＤＰ−フコースを使用する。それゆえ効率的な糖タンパク質フコシル化のために、ＧＤＰフコースの十分なプールを、糖タンパク質産生に一致する十分なレベルで発生させて、維持しなければならない。

ＧＤＰ−フコースへの２つの主要な経路：デノボ合成経路およびサルベージ経路がある。多くの哺乳動物細胞において、ＧＤＰ−フコースは、外部供給炭素供給源（たとえばグルコース）からデノボフコシル化経路によって作製することができる。フコシル化のデノボ経路において、グルコースはトランスポーターを通じて細胞に進入し、Ｄ−マンノース−１−ホスフェートに変換される。Ｄ−マンノース−１−ホスフェートは次に、Ｄ−マンノース−１−ホスフェートグアニリルトランスフェラーゼによってＧＤＰ−マンノースに変換される。ＧＤＰ−マンノースはＧＤＰマンノース４，６−デヒドラターゼ（ｄｈｙｄｒａｔａｓｅ）（ＧＭＤ）によって、ＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシ−マンノースに変換される。ＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシ−マンノースは、ＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシ−マンノース−３，５−エピメラーゼ−４−レダクターゼ（ＦＸ）によってＧＤＰフコースに変換される。ＧＤＰ−フコースは、ＧＭＤの強力なフィードバックインヒビターである。ＧＤＰ−フコースは、ＧＤＰ−フコーストランスポーターを通じてゴルジ装置に進入する。ゴルジに入ると、ＧＤＰ−フコースは、糖タンパク質をフコシル化するα１，６−フコシルトランスフェラーゼの基質である。

多くの哺乳動物細胞において、外部から供給されたフコースからＧＤＰ−フコースを発生させるサルベージ経路も存在する。サルベージ経路において、フコースは細胞中に輸送され、リン酸化されてフコース−１−ホスフェートを形成し、これをＧＤＰ−フコースに変換することができる。ＧＤＰ−フコースはゴルジ中に輸送され、α１，６−フコシルトランスフェラーゼの基質として利用可能である。細胞中へのフコース輸送は、おそらく、促進拡散およびリソソーム輸送によるものであり、サルベージ経路は哺乳動物細胞において普遍的であるように思われる（たとえばＢｅｃｋｅｒ ａｎｄ Ｌｏｗｅ（２００３）Ｆｕｃｏｓｅ：ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｍａｍｍａｌｓ，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ １３（７）：４１Ｒ−５３Ｒを参照）。

それゆえフコース供給源の非存在下では、細胞はデノボ合成経路によって発生したフコースを使用して、糖タンパク質をフコシル化する。フコースの存在下では、細胞は細胞中に輸送されたフコースを使用して、糖タンパク質をフコシル化する。したがってデノボ合成経路が遮断または損傷された場合、糖タンパク質フコシル化はなお行われることができるが、フコース供給源の存在下のみで行われる。

記載された組成物および方法は、ＦＸ核酸配列中に改変を有する遺伝的に改変された細胞を提供することによって、糖タンパク質をフコシル化する経路に条件遮断を提供する細胞系統を可能にする。デノボ経路およびサルベージ経路の両方を含有する細胞において、細胞は増強された多様性を提供する。フコース外部供給源の非存在下でのこのような細胞において、糖タンパク質のフコシル化は、１つの温度にて実質的に低下させることができるが、第２の温度においては実質的に低下させることはできない。代わりに、糖タンパク質フコシル化の本質的に野生型の速度またはレベルを、細胞が維持されている温度とは関係なく、フコースの外部供給源を提供することによってオンに切り換えることができる。

（ＦＸ改変）
改変ＦＸタンパク質配列をコードする単離核酸が提供される。単離核酸は、７９Ｓ、９０Ｋ、１３６Ｌ、２１１Ｒ、２８９Ｓ、およびその組合せからなる群より選択されるアミノ酸改変を含むＦＸタンパク質をコードする。１実施形態において、単離核酸は、位置２８９にセリンを含むＦＸタンパク質をコードし、別の実施形態では、７９Ｓ、９０Ｋ、１３６Ｌ、および／または２１１Ｒの少なくとも１つを含む。

改変ＦＸタンパク質をコードする核酸は、任意の好適な形で使用される。核酸の形の適合性は、その使用に依存する。たとえば好適な形は、細胞中の染色体外発現のための発現ベクターで使用することができるｃＤＮＡ、または細胞のゲノム中に（特異的位置に、またはランダムに）組み入れることができるｃＤＮＡを含む。好適な形は、本明細書に記載する置換をコードするように改変されたゲノム配列も含む。好適な形は、例えば、核酸をゲノム中の特異的位置にターゲティングしてたとえば天然ＦＸ遺伝子の一方または両方の対立遺伝子を置き換えるための、ターゲティング配列（たとえば１つ以上のターゲティングアーム）も含む。好適な形は、内因性ＦＸ核酸配列の本発明によるＦＸ核酸配列での置き換えのために、細胞中の特異的位置、たとえばＦＸ遺伝子座に核酸をターゲティングする、ターゲティングベクターを含む。内因性ＦＸ配列の改変は、細胞の一方または両方の対立遺伝子にて行うことができる。

（低フコシル化またはフコシル化の低下を有する細胞系統）
細胞系統を低フコシル化するための組成物および方法が提供される。組成物は、天然または野生型ＦＸ活性を欠いた細胞または実質的に欠いた細胞中に存在するときに、糖タンパク質、たとえばＦｃ含有糖タンパク質（たとえば抗体など）をフコシル化する能力の低下を細胞に付与する核酸およびタンパク質を含む。各種の実施形態において、このような細胞は、第１の温度（たとえば約３７℃）にて糖タンパク質をフコシル化する能力の実質的な低下を呈するが、第２の温度（たとえば約３４℃）にて糖タンパク質をフコシル化する能力を保持する細胞を含む。それゆえ、フコシル化阻害性である第１の温度にて増殖させることができる細胞が提供され、増殖条件はフコシル化許容性である第２の温度まで変化させることができる。

低フコシル化細胞系統は、本明細書に記載する組成物および方法と併せて、任意の好適な細胞を使用して作製することができる。たとえば、制限としてではなく、生物製剤の製造で普通に用いられる任意の細胞系統を使用することができる。このような細胞系統を低フコシル化細胞系統として有用にするためのある方法および組成物は、本明細書に記載されている；他の方法および組成物は、本記載に照らして当業者によって明白にまたは容易に明らかになる。ヒト細胞（たとえばＨｅＬａ、ＰＥＲＣ．６^ＴＭなど）、ＣＨＯ細胞、マウス細胞などは、本明細書に記載するように遺伝的に改変されて有用な細胞系統を発生することができる。ＣＨＯ細胞の場合、たとえば有用な低フコシル化細胞系統は、ＣＨＯ ＦＸ活性が機能的に１倍体であると思われる観察のために、ＦＸ遺伝子の単一の対立遺伝子を改変することによって作製することができる。他方では、ＦＸ遺伝子座に機能的２倍性を呈する他の細胞の場合、一方のＦＸ対立遺伝子を本明細書に記載するような改変ＦＸ核酸配列で置き換えること、および第２の（野生型）対立遺伝子をノックアウトすることによって、または両方のＦＸ対立遺伝子を本明細書に記載するような改変ＦＸ核酸配列で置き換えることによって操作することができる。

得られた細胞は、ＦＸ活性が、低フコシル化として、全体としてまたは実質的に特徴付けられる細胞を含む。すなわち細胞は、野生型ＦＸタンパク質または野生型ＦＸ遺伝子が完全に欠けている必要はない；しかし、細胞は適切な条件または条件のセット（たとえば選択された温度）の下で、全く正常なＦＸ活性を有する対応する細胞が同じ糖タンパク質をフコシル化することができるレベル付近のどこででも、糖タンパク質（たとえばＦｃ含有糖タンパク質）をフコシル化することができない、または実質的にできないはずである。

本発明による細胞と改変を含有しない細胞との比較が、同じかまたは実質的に同じ条件（たとえば培地、温度、細胞密度など）下で行われる。たとえば、各種の実施形態において、細胞は、野生型細胞が呈するフコシル化する能力の、１０％以下から１％以下のフコシル化する能力を呈する。本比較は、たとえば本明細書に記載する改変を有する細胞を調製することと、および前記細胞によって発現された糖タンパク質（たとえば細胞中の発現構築物からの抗体の発現）のフコシル化のレベルを、野生型細胞によって発現された同じ糖タンパク質のフコシル化のレベルと比較することによって行うことができる。比較のために、細胞は同じ温度にて同じ条件下で増殖させられる。糖タンパク質のフコシル化レベルは、糖タンパク質調製物中に存在するフコースの量を定量化するための、当分野で公知のいずれかの好適な分析方法を使用して確かめることができる。

どれだけの糖タンパク質がフコシル化されているかを決定する際に、フコースの量を、糖タンパク質の全量または上記タンパク質から得たグリカンの量のどちらかと比較する。

（フコシル化欠損細胞系統）
糖タンパク質を全くフコシル化することができないいくつかの哺乳動物細胞系統が単離された。フコシル化欠損細胞系統の開発は、フコシル化を欠いた抗体を作製することへの必要性によって大いに刺激された。フコシル化を欠いた抗体は、Ｆｃ受容体への変更された結合のために、抗体依存性細胞媒介細胞傷害（ＡＤＣＣ）をフコシル化抗体よりもはるかに良好に媒介することができる。したがってＡＤＣＣをより良好に媒介する抗体、特に腫瘍細胞を標的とする可変領域を含む抗体は高度に望ましい。糖タンパク質をフコシル化することができない細胞はそれゆえ、治療使用のための抗体の開発および製造で広く使用されている。

細胞が糖タンパク質をフコシル化できないことを生じる、２つのフコシル化経路のノックアウトが開発された。α１，６−フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ８）のノックアウトは、ＧＤＰ−フコースが糖タンパク質に移行できないことを生じる。ＧＤＰマンノース４，６−デヒドラターゼ（ＧＭＤ）のノックアウトは、デノボ経路においてＧＤＰ−マンノースからＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシ−マンノースを作製できないことを生じる。

ＧＤＰ−フコース形成の下流のフコシル化ノックアウト、たとえばα１，６−フコシルトランスフェラーゼノックアウトは、外部フコース供給源の存在下で糖タンパク質をフコシル化するために、サルベージ経路に頼ることができない。これは、遮断がデノボ経路とサルベージ経路が接する代謝産物であるＧＤＰ−フコースの形成の遠位にあるためである。したがってこのようなノックアウトを有する細胞にフコースを与えることは、糖タンパク質フコシル化を救援しない。それゆえα１，６−フコシルトランスフェラーゼノックアウトは、細胞が糖タンパク質をフコシル化する能力を選択的に操作するための単純な経路を供さない。

ＧＤＰ−フコース形成の上流のフコシル化ノックアウト、たとえばＧＭＤノックアウトは、糖タンパク質をフコシル化するために、サルベージ経路に理論的には頼ることができる。これは、ＧＤＰ−フコースの形成前に遮断が行われるためである。このような細胞にフコース与えることは、糖タンパク質フコシル化を理論的には救援する。しかし、ノックアウトを含有する細胞系統は多様性を欠いている。

本発明者らは、ＧＤＰ−フコースの形成前のデノボフコシル化経路の選択的破壊が、フコース供給源を提供することによって救援されるか、またはフコシル化を許容する条件下で細胞を維持することによって救援される欠損を有する細胞系統を発生させることを見出した。本発明者らは、ＧＤＰ−フコースの上流のデノボ経路に欠損を有するように細胞を改変し、細胞は第１の条件にてフコースの非存在下で増殖することができ、糖タンパク質をフコシル化する能力の実質的低下を呈するが、第２の条件にて、細胞は外部フコース供給源の非存在下でも糖タンパク質を有効にフコシル化することができる。このような特に多様性の細胞系統は、フコース（または好適なフコース前駆体）の外部供給源の利用可能性を制御すること、および／またはフコシル化許容条件もしくはフコシル化欠損条件下で細胞を増殖させることによって、細胞系統においてフコシル化を開始または中止する選択肢を与える。

本発明者らは、変異ＦＸ核酸配列を発生させることによって、ＧＤＰ−フコース合成のためのデノボ経路を選択的に破壊した。ＦＸタンパク質は、マンノースのＣ３ヒドロキシル基およびＣ５メチル基をエピマー化してＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシガラクトースを形成する、２機能性エピメラーゼレダクターゼである。２機能性酵素のＮＡＤＰＨ依存性レダクターゼ活性は次に、ケト部分を還元してＧＤＰ−フコースを形成する。ＦＸ遺伝子は高度に保存されており、このことはＦＸタンパク質の高度の同一性および類似性に反映されている。たとえばＢｅｃｋｅｒ ａｎｄ Ｌｏｗｅ（２００３）Ｆｕｃｏｓｅ：ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｍａｍｍａｌｓ，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，１３（７）：４１Ｒ−５３Ｒを参照。それゆえ、ＣＨＯ細胞中のＦＸ変異に関係して示されたデータは、多種多様の細胞中の対応するＦＸ改変に適用できる。

選択的ＦＸ破壊は増強した多様性を提供し、これは実施者が、培養物を第１の温度に維持することによって、フコシル化を促進しない（ｄｉｓｆａｖｏｒ）かまたは阻害することを可能にし；培養物を第２の温度に維持することによって、フコシル化を可能にする。各種の実施形態において、このことは、改変が（ＣＨＯ ＦＸタンパク質に対する）Ｌ２８９Ｓ、Ｎ７９Ｓ、Ｎ９０Ｋ、Ｐ１３６Ｌ、Ｇ２１１Ｒ、およびその組合せからなる群より選択される改変を含む改変ＦＸ遺伝子によって例証される。各種の実施形態において、ＦＸ改変は、Ｌ２８９Ｓ、Ｌ２８９Ｓ／Ｎ９０Ｋ、Ｌ２８９Ｓ／Ｇ２１１Ｒ、Ｌ２８９Ｓ／Ｐ１３６Ｌ、Ｌ２８９Ｓ／Ｎ７９Ｓ、およびその組合せからなる群より選択される改変から本質的に成る。

当業者に公知であるように、２倍体である細胞、たとえばＣＨＯ細胞は、特定の遺伝子座における２つの対立遺伝子の一方のみの活性を反映する表現型を提示し、これらの遺伝子座に関して、表現型の観点から機能的１倍体（または低２倍体）であると思われる。このような細胞において、本明細書に記載するような単一の対立遺伝子の改変さえ、表現型が優性表現型でない場合でも、改変対立遺伝子の活性を本質的に反映する表現型を生じ得る。たとえばＣＨＯ細胞において、単一の対立遺伝子の本明細書に記載するような改変は、推定するところ野生型ＦＸ対立遺伝子の非発現（または低発現）のために、本質的に本明細書に記載するようなＦＸ表現型を生じるであろう。

各種の実施形態において、ＦＸはＣＨＯ細胞由来ではないＦＸであり、改変は非ＣＨＯ ＦＸにおける上に挙げたＣＨＯ改変に対応する改変からなる群より選択される改変を含む。対応する改変は、たとえばＣｌｕｓｔａｌＷなどの汎用多重配列アラインメントアルゴリズムを、デフォルトパラメータ（たとえばヒト（アクセッション番号ＡＡＣ５０７８６）およびＣ．ｇｒｉｓｅｕｓ（アクセッション番号ＡＡＭ９１９２６）ＦＸでは、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ^ＴＭｖ．１０．０．２、ペアワイズ：低アラインメントスピードでのＧｏｎｎｅｔマトリクス、オープンギャップペナルティ＝１０．０、伸長ギャップペナルティ＝０．１；多重：Ｇｏｎｎｅｔシリーズ、オープンギャップペナルティ＝１０．０、伸長ギャップペナルティ＝０．２、遅延発散（ｄｅｌａｙ ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ）＝３０％、ギャップ分離距離（ｇａｐ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｄｉｓｔａｎｃｅ）＝４、エンドギャップ分離なし（ｎｏ ｅｎｄ ｇａｐ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ）、残基特異性ペナルティ、および親水性ペナルティ（親水性残基ＧＰＳＮＤＱＥＫＲ）を使用）で使用して、ＣＨＯ ＦＸタンパク質配列を目的の任意の他のＦＸ配列（アラインメント中にギャップを有するかまたは有さない）と整列させることによって同定する。

実際の問題として、ペアワイズ・アラインメント・デフォルト・パラメータを使用して、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ^ＴＭで配列番号１または配列番号１および３〜６に対して対象配列を整列させることは、ＣＨＯ Ｎ７９、Ｎ９０、Ｐ１３６、Ｇ２１１、およびＬ２８９位置と同等の位置に改変を作製するための対象配列中の対応する位置を同定するであろう。

（糖タンパク質）
組成物および方法を使用して、目的の任意の糖タンパク質の低フコシル化を達成するために細胞のフコシル化能力を改変することができる。本開示の大部分は抗体中のフコシル化の低下の利益に言及しているが、本発明の利点は抗体に限定されない。Ｆｃを有するいずれの結合タンパク質も、このような結合タンパク質は非常に多くの種類があるが、本発明の組成物および方法を使用して作製することができる。

本発明によって作製できる代表的な糖タンパク質は、グリコシル化され、野生型細胞において正常な条件でフコシル化される抗体（たとえばヒト、マウス、またはヒト化抗体）である。例は、限定するためではなく、例証のために挙げると、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、およびＩｇＧ４サブタイプのヒト抗体を含む。このような抗体の糖型は、位置２９７にグリカン部分を有する糖型を含む。位置２９７の代表的な糖型は、Ｎ結合ＧｌｃＮＡｃであって、ＧｌｃＮＡｃが続き、２分岐トリマンノシル部分が続き、（２分岐トリマンノシル部分の２つのマンノシル部分のそれぞれに）１つ以上のＧｌｃＮＡｃ残基が続き、場合により２分岐トリマンノシル部分の分岐に結合されたＧｌｃＮＡｃ残基の１つ以上におけるガラクトース残基が続く、Ｎ結合ＧｌｃＮＡｃを含む。グリカンのフコシル化は、通常、Ｎ結合の最初のＧｌｃＮＡｃ残基で起こり、ここで、（通常）単一のフコース残基がフコシルトランスフェラーゼを介して２９７−グリコール化抗体に結合される。各種の実施形態において、抗体のフコシル化のモル比またはパーセントまたは程度は、本フコース残基に関して、抗体の量（もしくはモル）および／またはグリカンもしくはグリカン置換基の量（もしくはモル）に関連して測定される（たとえば野生型細胞からかまたは本発明による改変ＦＸ核酸配列を含む細胞から得た抗体調製物中の、フコース：抗体の、または２９７結合グリカンの、フコース：ＧｌｃＮＡｃもしくはフコース：マンノースもしくはフコース：トリマンノシル部分もしくはフコース：ガラクトースに対する、相対モル）。

（低フコシル化ＣＨＯ系統）
低フコシル化ＣＨＯ系統は、無血清バイオリアクター培地中にて懸濁状態で増殖するのに適合したＣＨＯ Ｋ１細胞から構築された。ＣＨＯ系統（系統６０６６と呼ぶ）は、ＣＨＯ ＦＸ遺伝子中にＬ２８９Ｓ置換を含有していた。インターロイキン受容体を特異的に結合するヒトＩｇＧ１である組換え抗体（抗体１）および免疫細胞の細胞表面タンパク質を特異的に結合するヒトＩｇＧ１である組換え抗体（抗体２）が、実施例に記載するように上記細胞系統中、およびＦＸ改変を欠いた対応するＣＨＯ細胞系統（系統４０４４と呼ぶ）中で作製された。細胞は、振とう器で３日間またはバイオリアクターで１２日間増殖させられた（それぞれ３７℃）。

ＦＸ遺伝子改変を有して、抗体１を発現した細胞は、抗体１の約６．１４もしくは６．８６％（１２日間）または約７もしくは８％（３日間）だけをフコシル化したのに対して、ＦＸ改変の非存在下で、細胞は約８９．３％（３日間）または約８５．８％（１２日間）をフコシル化した（表１）。

ＦＸ遺伝子改変を有して、抗体２を発現した細胞は、抗体２を約３．６％だけフコシル化したのに対して、ＦＸ遺伝子改変の非存在下で、細胞は約９５％（３日間）または約７６．８％（１２日間）をフコシル化した（表１）。

別の低フコシル化ＣＨＯ系統は、ＣＨＯ ＦＸ遺伝子のＬ２８９ＳおよびＮ９０Ｋ改変を含有するＣＨＯ Ｋ１細胞から作製された（系統８０８８と呼ぶ）。これらの細胞中で発現された抗体１は、約０．９６％のみのフコシル化（３日間）または０．７１％のみのフコシル化（１２日間）（表２）を呈した。

別の低フコシル化ＣＨＯ系統は、Ｐ１３６Ｌ置換を含有する（Ｌ２８９Ｓ ＦＸ遺伝子改変を有する６０６６−１細胞からの）ＣＨＯ Ｋ１細胞から作製された（系統２１２１と呼ぶ）。これらの細胞は、３日間で０．８２％のみがフコシル化された抗体１を発現した（表２）。

２つのさらなる低フコシル化ＣＨＯ系統は、Ｎ７９Ｓ置換を含有する（Ｌ２８９Ｓ ＦＸ遺伝子改変を有する６０６６−１細胞からの）ＣＨＯ Ｋ１細胞から作製された（系統２０２０および６０６９と呼ぶ）。これらの細胞は、３日間で０．９４％のみがフコシル化されたか（２０２０）、または３日間で０．８６％のみがフコシル化された（６０６９）抗体１を発現した（表２）。

抗体１のフコシル化の温度依存性は、細胞系統４０４４−１（ＦＸ遺伝子改変なし）および細胞系統６０６６−１（Ｌ２８９Ｓ ＦＸ遺伝子改変）を使用して試験された。細胞系統６０６６−１は、３７℃にて７％のみのフコシル化を呈し、３４℃にて約７０％のフコシル化を呈した。細胞系統４０４４−１は、３７℃および３４℃にてほぼ同じフコシル化（９５から９６％）を呈した。

２つのさらなる低フコシル化細胞系統が、同じ成長因子受容体に対する２つの異なる抗体（Ａｂ３．１およびＡｂ３．２）を発現した細胞系統８０８８（Ｌ２８９ＳおよびＮ９０Ｋ）から作製された。フコースの存在下（サルベージ経路）または非存在下（デノボ経路）で３７℃にて３日間増殖させた後、グリカン組成およびグリカンのフコース含有量を決定した。フコースの非存在下で上記細胞系統は約１．８７％または５．７３％のみのフコシル化を生じたのに対して、外部フコース供給源の存在下では、フコシル化は少なくとも９５．２２％または９５．６３％に回復した。

（実施例）
（実施例１：ＣＨＯ細胞系統）
ＣＨＯ Ｋ１細胞から直接または間接的に単離された多種多様のＣＨＯ細胞系統が本明細書に記載される。

ＲＧＣ１０細胞。ＣＨＯ細胞系統３０３３は、参照により本明細書に組み入れられている米国特許第７，４３５，５５３号でＲＧＣ１０細胞について記載されたように、ＣＨＯ Ｋ１細胞から発生した。簡潔には、ＣＨＯ Ｋ１細胞にベクターｐＴＥ１５８およびｐｃＤＮＡ６／ＴＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が安定的にトランスフェクトされた。トランスフェクトされた細胞は、ｈＦｃγＲ１のドキシサイクリン誘導性発現についてスクリーニングされ、３０３３細胞系統を生じるために１つのクローンが選択された。３０３３細胞は、無血清培地３中の懸濁培養物中で増殖するように適合させられた。

５０５５細胞。５０５５細胞は、無血清バイオリアクター培地の培地２中にて懸濁状態で増殖するように適合させられたＣＨＯ Ｋ１細胞である。

４０４４細胞。４０４４細胞は、それぞれ参照により本明細書に組み入れられている、２００８年６月４日に出願された国際特許出願公開番号ＷＯ ２００８／１５１２１９ Ａ１、および２００８年６月４日に出願された米国特許出願公開番号２００９／０１２４００５Ａ１に記載されたＲＧＣ１６細胞に由来し、これは、増強された発現および安定性（ｅｎｈａｎｃｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ（ＥＥＳＹＲ））遺伝子座にｌｏｘ化（ｌｏｘｅｄ）カセットを含有する。４０４４のＥＥＳＹＲ遺伝子座はコード鎖上の５’から３’方向に、ｌｏｘＰ部位、ＳＶ４０後期プロモーター、ピューロマイシン耐性遺伝子、ＣＭＶプロモーター、ＩＲＥＳ、ｅＣＦＰ遺伝子、ｌｏｘ２２７２部位、ＣＭＶプロモーター、ＤｓＲｅｄ遺伝子、およびｌｏｘ５１１部位を有する。４０４４細胞は、安定的にトランスフェクトされたｐｃＤＮＡ６／ＴＲベクターをさらに含有する。

他の細胞。７０７７細胞系統は、外因性組換え核酸の使用なしに３０３３細胞に由来した。６０６６、８０８８、および１０１０細胞系統は、外因性組換え核酸の使用なしに４０４４細胞に由来した。

（実施例２：ＣＨＯ細胞中での組換え抗体の産生）
ベクター。本明細書に記載するベクターは、示された特色を有し、その特色の相対的配置が、コード鎖に関して示される（５’から３’方向に挙げる）。

ｐＲ４０００：ヒトＵｂＣプロモーター、Ａｂ２の重鎖をコードする遺伝子、ＳＶ４０後期プロモーター、およびハイグロマイシン耐性遺伝子。

ｐＲ４００１：ヒトＵｂＣプロモーター、Ａｂ２の軽鎖をコードする遺伝子、ＳＶ４０後期プロモーター、およびピューロマイシン耐性遺伝子。

ｐＲ４００２：ＬｏｘＰ部位、ヒトＣＭＶプロモーター、Ａｂ２の重鎖をコードする遺伝子、ＳＶ４０後期プロモーター、およびＬｏｘ２２７２部位。

ｐＲ４００３：Ｌｏｘ２２７２部位、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ＩＲＥＳ、ＥＧＦＰ遺伝子、ヒトＣＭＶプロモーター、Ａｂ２の軽鎖をコードする遺伝子、およびＬｏｘ５１１部位。

ｐＲ４００４：ＳＶ４０後期プロモーターおよびＣｒｅリコンビナーゼをコードする遺伝子（参照により本明細書に組み入れられている、ＷＯ ２００８／１５１２１９Ａ１を参照）。

ｐＲ４００５：ＬｏｘＰ部位、ヒトＣＭＶプロモーター、抗体１（Ａｂ１）の軽鎖をコードする遺伝子、ＳＶ４０後期プロモーター、およびＬｏｘ２２７２部位。

ｐＲ４００６：Ｌｏｘ２２７２部位、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ＩＲＥＳ、ＥＧＦＰ遺伝子、ヒトＣＭＶプロモーター、Ａｂ１の重鎖をコードする遺伝子、およびＬｏｘ５１１部位。

ｐＲ４００７：ＬｏｘＰ部位、ヒトＣＭＶプロモーター、Ａｂ１の軽鎖をコードする遺伝子、ＳＶ４０後期プロモーター、ハイグロマイシン耐性タンパク質のＮ末端をコードする遺伝子、およびＬｏｘ２２７２部位。

ｐＲ４００８：Ｌｏｘ２２７２部位、ハイグロマイシン耐性タンパク質のＣ末端をコードする遺伝子、ＩＲＥＳ、ＥＧＦＰ遺伝子、ヒトＣＭＶプロモーター、Ａｂ１の重鎖をコードする遺伝子、およびＬｏｘ５１１部位。

ｐＲ４００９：ＬｏｘＰ部位、ＳＶ４０後期プロモーター、ハイグロマイシン耐性遺伝子、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、ＥＧＦＰ遺伝子、ヒトＣＭＶプロモーター、およびＬｏｘ５１１部位。

ｐＲ４０１０：ＬｏｘＰ部位、ＳＶ４０後期プロモーター、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ＩＲＥＳ、ＥＧＦＰ遺伝子、ヒトＣＭＶプロモーター、野生型ＦＸ遺伝子、およびＬｏｘ５１１部位。

ｐＲ４０１０：ＬｏｘＰ部位、ＳＶ４０後期プロモーター、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ＩＲＥＳ、ＥＧＦＰ遺伝子、ヒトＣＭＶプロモーター、ならびに変異Ｌ２８９ＳおよびＮ９０Ｋを有する変異ＦＸ遺伝子。

ＣＨＯ細胞でのフコシル化のレベル（ｆｕｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｐｒｏｆｉｃｉｅｎｃｙ）は、細胞表面ＬＣＡ染色およびＣＨＯ細胞から産生された組換え抗体の分析によって試験された。１つの試験において、７０７７細胞は、参照により本明細書に組み入れられている米国特許第７，４３５，５５３号に記載された方法に従って、ヒトＢ細胞受容体に対するヒトＩｇＧ１抗体である抗体２（Ａｂ２）の発現のための宿主細胞として使用された。簡潔には、１×１０^７個の７０７７細胞に、リポフェクタミン^ＴＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用して、プラスミドｐＲ４０００（重鎖、ハイグロマイシン耐性）およびｐＲ４００１（軽鎖、ピューロマイシン耐性）がトランスフェクトされた。トランスフェクトされた培養物は、それぞれ４００マイクログラム／ｍＬハイグロマイシンおよび１０マイクログラム／ｍＬピューロマイシンによって、１０％ウシ胎仔血清を含有するＦ１２培地中で２週間にわたって選択された。選択を生存した細胞は、一緒にプールされ、無血清バイオリアクター培地の培地２中にて懸濁状態で増殖するように適合させられた。ｈＦｃγＲＩの発現は、ドキシサイクリンの培養培地への３日間にわたる添加によって誘導された。誘導された培養物は、１ミリグラム／ｍＬウサギＩｇＧと共に１８時間インキュベートされてから、ヤギポリクローナルＦＩＴＣ結合体化抗ヒトＦｃ抗体のＦ（ａｂ’）_２断片（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）によって染色された。細胞は１時間染色され、次にＰＢＳで２回洗浄されてから、ＭｏＦｌｏ^ＴＭセルソーター（Ｆｏｒｔ Ｃｏｌｌｉｎｓ，ＣＯ）でのフローサイトメトリーによって分析された。全細胞集団の上位５％中の平均ＦＩＴＣ蛍光強度を有する細胞がプールにソートされて、７０７７−１細胞と命名された。７０７７−１細胞を、培地２中で１０日間増殖させた。組換えＡｂ２を産生するために、７０７７−１細胞は、４×１０^５細胞／ｍＬで、振とう器フラスコ内の３７℃の培地２に播種された。３日後、馴化培地が収集され、その中のＡｂ２タンパク質はプロテインＡアフィニティクロマトグラフィーによって精製された。

４０４４および６０６６ＣＨＯ細胞は、ヒトサイトカイン受容体に対するヒトＩｇＧ１抗体であるＡｂ２およびＡｂ１の発現のための宿主細胞として使用された。簡潔には、Ａｂ２を発現させるために、２×１０^６個の４０４４細胞および２×１０^６個の６０６６細胞（ＥＥＳＹＲ遺伝子座にｌｏｘ化カセットをそれぞれ有する）それぞれに、ｐＲ４００２（ｌｏｘ化カセット中の重鎖）、ｐＲ４００３（ｌｏｘ化カセット中の軽鎖およびハイグロマイシン耐性）、およびｐＲ４００４（Ｃｒｅをコードする）がトランスフェクトされた。Ａｂ１を発現させるために、２×１０^６個の４０４４細胞および２×１０^６個の６０６６細胞それぞれに、ｐＲ４００５（ｌｏｘ化カセット中の軽鎖）、ｐＲ４００６（ｌｏｘ化カセット中の重鎖およびハイグロマイシン耐性）、およびｐＲ４００４（Ｃｒｅをコードする）がトランスフェクトされた。トランスフェクトされた４０４４細胞および６０６６細胞は、４００マイクログラム／ｍＬハイグロマイシンによって、１０％ＦＣＳを含有するＦ１２培地中で１０日間選択された。生存細胞は、７日間、無血清培地１中にて懸濁状態で増殖するように適合させられた。ＥＥＳＹＲ遺伝子座においてＣｒｅ媒介カセット交換を受けた細胞は、ＥＧＦＰを発現したが、ＤｓＲｅｄもＥＣＦＰも発現しなかった。ＥＧＦＰについて陽性であるが、ＤｓＲｅｄおよびＥＣＦＰについては陰性である細胞は、ＭｏＦｌｏ^ＴＭソーターを使用したセルソーティングによって収集された。Ａｂ２遺伝子およびＡｂ１遺伝子がトランスフェクトされた４０４４由来細胞はそれぞれ、４０４４−２細胞および４０４４−１細胞と呼ばれた。Ａｂ２遺伝子およびＡｂ１遺伝子がトランスフェクトされた６０６６由来細胞はそれぞれ、６０６６−２細胞および６０６６−１細胞と呼ばれた。４０４４−２細胞、６０６６−２細胞、４０４４−１細胞、および６０６６−１細胞を、培地２中で７日間培養して増殖させた。組換え抗体を産生するために、４つの細胞系統は、４×１０^５細胞／ｍＬで振とう器フラスコ内の３７℃の培地２に播種された。３日後、馴化培地が収集され、その中の組換え抗体はプロテインＡアフィニティクロマトグラフィーによって精製された。

８０８８および１０１０ ＣＨＯ細胞は、Ａｂ１の発現のための宿主細胞としても使用された。簡潔には、Ａｂ１を発現させるために、２×１０^６個の８０８８細胞および２×１０^６個の１０１０細胞それぞれに、ｐＲ４００７（ｌｏｘ化カセット中の軽鎖およびハイグロマイシン耐性遺伝子の第１の部分）、ｐＲ４００８（ｌｏｘ化カセット中の重鎖およびハイグロマイシン耐性遺伝子の第２の部分）、およびｐＲ４００４（Ｃｒｅをコードする）がトランスフェクトされた。４００マイクログラム／ｍＬハイグロマイシンによる選択を生存したトランスフェクトされた細胞は、無血清培地１中にて懸濁状態で増殖するように適合させられた。トランスフェクトされた８０８８および１０１０からＥＧＦＰを発現したが、ＤｓＲｅｄもＥＣＦＰも発現しなかった細胞は、ＭｏＦｌｏ^ＴＭでのセルソーティングによって単離され、８０８８−１および１０１０−１と呼ばれた。Ａｂ１タンパク質を産生するために、８０８８−１細胞および１０１０−１細胞は４×１０^５細胞／ｍＬで振とう器フラスコに播種された。３日後、培養培地が収集され、その中のＡｂ１はプロテインＡクロマトグラフィーによって精製された。

（実施例３：抗体フコシル化分析）
精製ヒトＩｇＧ１抗体タンパク質は最初に、ＰＮＧアーゼＦにより変性条件（０．５％ＳＤＳ、２ｍＭ ＴＣＥＰ、１％ＮＰ−４０によって遮断）下にて、１マイクログラム／０．１ｍＵのタンパク質／酵素比の５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０中で３７℃にて一晩脱グリコシル化された。放出されたグリカンは次に、アントラニル酸によって８０℃にて１時間、蛍光的に誘導体化された。試料は前洗浄（ｐｒｅ−ｃｌｅａｎ）されて、Ｗａｔｅｒｓ Ｏａｓｉｓ^ＴＭＨＬＢカートリッジによって余分なアントラニル酸試薬が除去された。オリゴサッカライド混合物は次に、逆相ＨＰＬＣによって、ｄｄＨ_２Ｏ中の０．５％ＴＦＡを移動相Ａとして、９０％アセトニトリル／１０％ｄｄＨ_２Ｏ中の０．０４５％ＴＦＡを移動相Ｂとして使用して分析された。グリカンはＴｈｅｒｍｏ Ｈｙｐｅｒｃａｒｂ^ＴＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）カラム（寸法１００×２．１、粒径３マイクロメートル）で、３０から４０％までのＢの勾配を４０分間適用することを通じて分解された。シグナルは、蛍光検出器を使用して励起波長２３０ｎｍおよび発光波長４２５ｎｍで検出された。質量分析によるＨＰＬＣ分離グリカンピークのさらなる分析は、これらが主に２つの群；非フコシル化２分岐グリカンおよびフコシル化２分岐グリカンに分離されたことを明らかにした。各群（フコシル化対非フコシル化）の中で、グリカンはさらにジガラクトシル（Ｇ２）型、モノガラクトシル（Ｇ１）型またはアガラクトシル（Ｇ０）型に分離された。異なるグリカン型に対応するピーク面積の積分によって、モノクローナル抗体での個別のグリカンそれぞれの集団の定量化が可能となる。

（実施例４：ＦＸ、ＧＭＤ、ＧＤＰ−フコーストランスポーター、およびＦＵＴ８遺伝子の主要転写物の配列決定）
ＦＸ、ＧＭＤ、ＧＤＰ−フコーストランスポーター、およびＦＵＴ８遺伝子によってコードされたタンパク質は、デノボフコシル化経路の構成要素である。ＣＨＯ細胞系統５０５５、４０４４−１、７０７７−１、６０６６−１、２１２１、２０２０、６０６９、１０１０、および８０８８細胞中のＦＸ遺伝子の主要な転写物の配列、ならびに４０４４−１、６０６６−１、１０１０、および８０８８細胞中のＧＭＤ遺伝子の主要な転写物の配列が決定された。ＦＵＴ８およびＧＤＰ−フコーストランスポーター遺伝子から発現された主要な転写物の配列も、４０４４−１および６０６６−１細胞中で決定された。

簡潔には、全ＲＮＡは、５×１０^６個のＣＨＯ細胞からＭｉｃｒｏ−Ｆａｓｔ Ｔｒａｃｋ２．０キット^ＴＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用して単離された。４つのフコシル化遺伝子のｃＤＮＡは全ＲＮＡから、プライマーとしてのオリゴ−ｄＴおよびＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ第１鎖合成システム^ＴＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して合成された。ＧＭＤ ｃＤＮＡは、プライマー５’−ｃｔａｃａａｔｃｔｔ ｇｇｔｇｃｃｃａｇａ ｇｃ−３’配列番号７および５’−ｔｃｃａｇｔｔｃａｇ ｔｔｔｃｔｇｃｔｇｃ ｇ−３’配列番号８を使用してＰＣＲ増幅された。ＦＸ ｃＤＮＡは、プライマー５’−ｔｔｃｃｃｔｇａｃａ ａｇａｃｃａｃｃｔａ ｔｃｃ−３’配列番号９および５’−ｔａｇｔｔｇｔｃｇｇ ｔｇａａｃｃａｇｇｃ ａｃ−３’配列番号１０を使用してＰＣＲ増幅された。ＧＤＰ−フコーストランスポーターｃＤＮＡは、プライマー５’−ｇａｔｇａｇｇａｃａ ｇｃａｇｇａａｃａａ ｇｃ−３’配列番号１１および５’−ａｇｃａｃｔｃｔｔｃ ｔｃａｃｃｃｔｃｔｔ ｔｇｇ−３’配列番号１２を使用してＰＣＲ増幅された。ＦＵＴ８ ｃＤＮＡは、プライマー５’−ａｇｃｃａａｇｇｇｔ ａａｇｔａａｇｇａｇ ｇａｃｇ−３’配列番号１３および５’−ｔｔｇｔａｇａｃａｇ ｃｃｔｃｃａｔｃｃｔ ｃｇ−３’配列番号１４を使用してＰＣＲ増幅された。ＰＣＲ反応で使用されたＤＮＡポリメラーゼは、Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑ^ＴＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびクローン化Ｐｆｕ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）の２０対１のミックスであった。ＰＣＲ生成物は、ゲル電気泳動の後に精製され、ｐＣＲ２．１ ＴＯＰＯ^ＴＭベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に製造者の説明書に従ってクローニングされた。クローン化ＤＮＡ生成物は、エレクトロコンピテントＤＨ１０Ｂ細胞に形質転換された。各形質転換から少なくとも３つの細菌コロニーが選ばれ、ＬＢおよび１００マイクログラム／ｍＬアンピシリンを含有する３つの液体培養物に接種した。これらの培養物中のプラスミドＤＮＡは、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット^ＴＭ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製された。クローン化ＰＣＲ生成物の配列は、ベクター上に位置するＭ１３プライマーならびにそれぞれの５’および３’ＰＣＲプライマーを使用して決定された。これらの配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ配列のＣ．ｇｒｉｓｅｕｓからのＦＸ（アクセッション番号ＡＦ５２５３６５）、ＧＭＤ（アクセッション番号ＡＦ５２５３６４）、ＧＤＰ−フコーストランスポーター（アクセッション番号ＡＢ２２２０３７）、およびＦＵＴ８（アクセッション番号ＢＤ３５９１３８）ｍＲＮＡについて比較された。

Ｇｅｎｂａｎｋ参照配列（ＡＦ５２５３６５）からのコドン変化を生じるコンセンサスＦＸ転写物配列中の変異は、７０７７−１、６０６６−１、２１２１、２０２０、６０６９、１０１０、および８０８８細胞で同定された（表１および２）。４０４４−１、６０６６−１、１０１０、および８０８８細胞からのＧＭＤ転写物の配列は、ＧｅｎＢａｎｋで報告されたＧＭＤ配列（アクセッション番号ＡＦ５２５３６４）と一致した。４０４４−１および６０６６−１細胞中のＧＤＰ−フコーストランスポーターおよびＦＵＴ８転写物の配列は、ＧｅｎＢａｎｋで報告されたそのそれぞれの配列（アクセッション番号ＡＢ２２２０３７およびＢＤ３５９１３８）に同様に一致した。

（実施例５：ＦＸ遺伝子中に単一のＬ２８９Ｓ変異を有するＣＨＯ細胞系統におけるフコシル化）
３０３３、４０４４、６０６６、および７０７７細胞における相対フコシル化レベルは最初に、レクチンレンズマメ凝集素（ＬＣＡ）で染色することによって試験された。簡潔には、２×１０^６個の４０４４および６０６６細胞はそれぞれ、５マイクログラム／ｍＬビオチン−ＬＣＡ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）と共に１時間インキュベートされた。ＰＢＳで２回洗浄した後、細胞はフィコエリトリン結合体化ストレプトアビジン（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）と共に３０分間インキュベートされた。細胞は次にＰＢＳで１回洗浄され、フローサイトメトリーによって分析された。３０３３細胞および７０７７細胞は、ＦＩＴＣ−ＬＣＡで１時間染色され、２回洗浄されて、フローサイトメトリー（図２）によって分析された。３０３３、４０４４、６０６６、および７０７７細胞はすべてＬＣＡによって染色された。６０６６および７０７７細胞におけるＬＣＡ染色強度は、３０３３および４０４４細胞におけるＬＣＡ染色強度よりも著しく弱く（図２）、６０６６および７０７７細胞では、３０３３および４０４４細胞よりも弱くタンパク質がフコシル化されることが示唆された。６０６６および７０７７細胞が低フコース含有量を有するｈＩｇＧ１抗体の発現のための宿主細胞として使用できるか否かを検査するために、４０４４および６０６６細胞にＡｂ２およびＡｂ１の発現プラスミドが安定的にトランスフェクトされ、７０７７細胞にＡｂ２の発現プラスミドが安定的にトランスフェクトされた（実施例２を参照）。組換えＡｂ２およびＡｂ１は、３日間の振とう器フラスコ中での培養、ならびに１２日間の流加バイオリアクター培養においてトランスフェクトされた細胞から産生された。Ａｂ２およびＡｂ１は馴化培地から精製され、そのフコシル化のレベルはＨＰＬＣによって決定された（表１）。表１に示すように、７０７７−１、６０６６−１、および６０６６−２は、振とう器およびバイオリアクター内で３７℃にて、３．６％から８％のフコシル化レベルを有する組換え抗体を産生した。

（実施例６：ＦＸ遺伝子中に２つのアミノ酸変化を有するＣＨＯ細胞系統におけるフコシル化）
８０８８および１０１０は、外因性組換え核酸の使用なしに６０６６細胞から単離された２つの細胞系統である。６０６９、２０２０、および２１２１は、外因性組換え核酸の使用なしに６０６６−１細胞から単離された３つの細胞系統である。ＦＸ遺伝子の主要な転写物の配列は、ＲＴ−ＰＣＲによって決定された（表２）。これらの５つの細胞系統は、６０６６および７０７７細胞中と同じＬ２８９Ｓ変異を有することが見出された。５つすべての細胞系統中のＦＸ転写物はまた、Ｌ２８９Ｓ変化に加えて１つのアミノ酸を変化させる変異を有している。これらの変異は、表２にまとめられている。８０８８、１０１０、６０６９、２０２０、および２１２１細胞は、ＬＣＡへの結合低下を呈し（図４）、これらの細胞でのタンパク質フコシル化の低下を示唆した。

８０８８および１０１０細胞におけるフコシル化レベルを検査するために、これらの２つの宿主細胞から安定的トランスフェクションによってＡｂ１が産生された。トランスフェクトされた培養物は、４００マイクログラム／ｍＬハイグロマイシンによって２週間にわたって選択された。ハイグロマイシンに耐性である細胞は、培地１にて懸濁培養物中で増殖するように適合させられた。組換えＡｂ１は、３日間の振とう器フラスコ中での培養、ならびに１２日間の流加バイオリアクター培養において産生された。Ａｂ１は馴化培地から精製され、Ａｂ１フコシル化のレベルはＨＰＬＣによって決定された（表２）。図２に示すように、トランスフェクトされた８０８８および１０１０細胞は、振とう器およびバイオリアクター内３４℃にて０．５３％から０．９６％のフコシル化レベルを有する組換えＡｂ１抗体を産生した。

６０６９、２０２０、２１２１細胞のフコシル化レベルも、振とう器フラスコ培養物中に産生されたＡｂ１タンパク質の精製後に検査された。表２は、これらの３つの細胞系統が０．８２％から０．９４％に及ぶフコシル化レベルを有するＡｂ１を産生したことを示す。

（実施例７：６０６６−１におけるフコシル化レベルは温度依存性である）
６０６６−１細胞におけるタンパク質フコシル化に対する培養温度の影響は、ＬＣＡ染色によって、およびこれらの細胞から産生されたＡｂ１タンパク質のフコシル化の分析によって検査された。図５は、３７℃および３４℃の両方において増殖させられた４０４４−１および６０６６−１細胞のＬＣＡ染色を示す。３４℃および３７℃にて増殖させられた４０４４−１細胞は、ＬＣＡによって同様に染色された。３４℃にて増殖させられた６０６６−１細胞は、３７℃にて増殖させられた６０６６−１細胞よりも著しく高いレベルでＬＣＡを結合した。表３は、振とう器フラスコ培養物中で３４℃および３７℃にて４０４４−１および６０６６−１細胞から産生されたＡｂ１タンパク質におけるフコシル化のレベルを示す。４０４４−１細胞は、３４℃および３７℃それぞれにおいて増殖させられたときに、９６％および９５％のフコシル化を有するＡＢ１を産生した。対照的に、６０６６−１細胞は、３４℃および３７℃それぞれにおいて約７０％および７％のフコシル化を有するＡｂ１を産生した。本結果は、６０６６−１細胞におけるフコシル化レベルが温度依存性であることを示している。

（実施例８：Ｌ−フコースが補充された培地中で培養されたＣＨＯ細胞のフコシル化）
哺乳動物細胞において、ＧＤＰ−フコースは、デノボ合成経路およびサルベージ経路によって産生されることができる（Ｂｅｃｋｅｒ ａｎｄ Ｌｏｗｅ（２００３）Ｆｕｃｏｓｅ：ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｍａｍｍａｌｓ，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，１３（７）：４１Ｒ−５３Ｒ）。Ｌ−フコースを欠く培養培地中で増殖した細胞において、ＧＤＰ−フコースはＧＭＤおよびＦＸタンパク質によってＧＤＰ−マンノースから産生される。Ｌ−フコースを有する培地において、ＧＤＰ−フコースをＬ−フコースから、Ｌ−フコースキナーゼおよびＧＤＰ−Ｌ−フコースピロホスホリラーゼによって発生させることができる。どちらかの経路から産生されたＧＤＰ−フコースは、ＧＤＰ−フコーストランスポーターを通じてゴルジ装置に輸送される。ゴルジにおいて、フコシルトランスフェラーゼタンパク質ＦＵＴ８は、ＧＤＰ−フコースを用いて糖タンパク質をフコシル化タンパク質に変換する。５ｍＭ Ｌ−フコースを有するかまたは有さない培養培地中で増殖させた６０６６−２、８０８８、および１０１０細胞のフコシル化レベルが検査された。６０６６−２細胞は、Ａｂ２抗体を発現して、ＦＸ遺伝子転写物中にＬ２８９Ｓ変異を有していた（実施例２および表１）。精製されたＡｂ２のＨＰＬＣ分析により、振とう器フラスコ内で増殖させられた６０６６−２細胞は、Ｌ−フコースが添加されていない培地２中で１．９％のフコシル化を有するＡＢ２を産生した。対照的に、振とう器フラスコ内で増殖させられた６０６６−２細胞は、５ｍＭ Ｌ−フコースが補充された培地２中で９３．５％のフコシル化を有するＡｂ２を産生した。本結果は、ＧＤＰ−フコース合成のサルベージ経路、ＧＤＰ−フコーストランスポーター、およびＦＵＴ８タンパク質が６０６６−２細胞中で機能性であることを示す。

５ｍＭ Ｌ−フコースを有するかまたは有さない培地２中で増殖させられた３０３３、５０５５、７０７７、８０８８、および８０８８細胞の相対フコシル化レベルは、ＬＣＡで染色することによって検査された（図６）。３０３３および５０５５細胞は、Ｌ−フコース補充を有するときも有さないときも、類似のレベルのＬＣＡを結合した。７０７７、８０８８、および８０８８細胞は、５ｍＭ Ｌ−フコースを有する培地中で増殖させられたときに、Ｌ−フコースを欠く培地中よりも著しく多くのＬＣＡを結合した。本結果は、７０７７、８０８８、および８０８８細胞が機能性ＧＤＰ−フコーストランスポーターおよび機能性ＦＵＴ８タンパク質を有したことを示唆する。

（実施例９：ＦＸ遺伝子がトランスフェクトされた８０８８におけるフコシル化）
８０８８細胞中で見られたフコシル化レベルの低下が変異体ＦＸ遺伝子（Ｌ２８９ＳおよびＮ９０Ｋ変異を有する）のためであったことを確認するために、野生型ＦＸ遺伝子および変異体ＦＸ遺伝子を、安定的トランスフェクションによって８０８８細胞中で発現させ、次にトランスフェクトされた細胞のフコシル化レベルを、ＬＣＡによる細胞の染色によって検査した。対照として、８０８８細胞にはベクターｐＲ４００９（ハイグロマイシン耐性遺伝子およびＥＧＦＰ遺伝子を有するｌｏｘ化カセット）が別々にトランスフェクトされた。ベクターｐＲ４０１０およびｐＲ４０１１は、それぞれ、ｐＲ４００９中のＣＭＶプロモーターとＬｏｘ５１１部位との間に位置する野生型ＦＸ遺伝子およびＬ２８９Ｓ Ｎ９０Ｋ ＦＸ遺伝子を含有している。ｐＲ４００４およびｐＲ４００９、ｐＲ４０１０、またはｐＲ４０１１のいずれかがトランスフェクトされた８０８８細胞は、４００マイクログラム／ｍＬハイグロマイシンによって１４日間にわたって選択された。ＥＥＳＹＲにおいてＣｒｅ媒介カセット交換を受けた細胞は、ＥＧＦＰを発現したが、ＥＹＦＰを発現しなかった。ＥＧＦＰ陽性であるが、ＥＹＦＰ陰性である細胞は、セルソーティングによって単離された。３４℃の組織培養物中での増殖の後、ソートされた細胞は、ビオチン−ＬＣＡおよびＰＥ−ストレプトアビジンによって順次染色された。ベクターｐＲ４００９およびｐＲ４０１１がトランスフェクトされた８０８８は、同じレベルのＬＣＡ染色を呈した。対照的に、ｐＲ４０１０がトランスフェクトされた８０８８細胞は、５０５５細胞に匹敵するレベルのＬＣＡ染色を呈した（図７）。要約すれば、Ｌ２８９Ｓ Ｎ９０Ｋ変異体ＦＸタンパク質ではなく、野生型ＦＸタンパク質は、ＬＣＡ染色によってアッセイされたように、８０８８細胞におけるフコシル化レベルを回復することができた。本結果は、８０８８細胞における低いフコシル化レベルは、これらの細胞中のＦＸタンパク質におけるＬ２８９Ｓ Ｎ９０Ｋ変異のためであったことを示す。

（実施例１０：グリカンのＨＰＬＣおよび質量分析：Ａｂ３．１および３．２）
ＦＸタンパク質置換Ｌ２８９ＳおよびＮ９０ＫをコードするＦＸ遺伝子改変を有するＣＨＯ系統である細胞系統８０８８は、同じ成長因子受容体を特異的に結合する異なる可変領域を有する２つのヒト抗体（抗体３．１および抗体３．２）の重（ヒトＩｇＧ１）鎖および軽（ヒトカッパ）鎖をコードするプラスミドが別々にトランスフェクトされた。各抗体を発現する細胞は培地２中、１０ｍＭフコースの存在下または非存在下で３日間、３７℃にて増殖させられ、各条件セットの下で抗体からグリカンが単離され、質量分析によって同定された。

フコースの非存在下でＡ３．１を発現する８０８８細胞は、ＨＰＬＣで３つの主要なグリカンピークを産生し（図８）、質量スペクトルでは、末端ガラクトシル化が異なった３つの異なる非フコシル化グリカン（図９）を、約１．４７％のフコシル化と共に表した。１０ｍＭフコースの存在下でＡ３．１を発現する８０８８細胞は、ＨＰＬＣで３つの主要なグリカンピークを産生して（図１０）、質量スペクトルでは、３つの異なるフコシル化グリカンおよび１つの非フコシル化グリカン（ｇｌｙｃａｌ）（図１１）を、約９５．２２％のフコシル化と共に表した。

フコースの非存在下でＡ３．２を発現する８０８８細胞は、ＨＰＬＣで３つの主要なグリカンピークを産生して（図１２）、質量スペクトルでは、末端ガラクトシル化が異なった３つの異なる非フコシル化グリカン（図１３）を、約５．３７％のフコシル化と共に表した。１０ｍＭフコースの存在下でＡ３．２を発現する８０８８細胞は、ＨＰＬＣで３つの主要なグリカンピークを産生して（図１４）、質量スペクトルでは、３つの異なるフコシル化グリカンおよび第４の微量の非フコシル化グリカン（図１５）を、約９５．６３％のフコシル化と共に表した。

抗体３．１または抗体３．２を発現するフコースを加えた８０８８細胞およびフコースを加えない８０８８細胞のグリカン分析の結果を、グリカンの種類に従ってグループ化して、図１６にまとめる。特定の条件下での抗体のパーセンテージを示す縦列は合計で１００となる。Ａｂ３．１では、１０ｍＭフコースの非存在下での全フコシル化は１．８７％であった；Ａｂ３．２では１０ｍＭフコースの非存在下での全フコシル化は５．７３％であった（図１６の表の下３行の対応する縦列を合計）。１０ｍＭフコースの存在下で、Ａｂ３．１の全フコシル化は９５．２２％であった；１０ｍＭフコースの存在下で、Ａｂ３．２の全フコシル化は９５．６３％であった（図１６の表の最後の３行の対応する縦列を合計）。これらのデータは、低フコシル化細胞系統がフコースの非存在下では約１．８７％または５．７３％以下をフコシル化すること、しかしフコシル化はフコースの存在下で少なくとも約９５．２２％または９５．６３％のフコシル化まで戻すことができることを確認する。

グリカン分析では、２つの抗体（抗体３．１および抗体３．２）試料のそれぞれの１００マイクログラム一定分量を、５０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）、２．０ｍＭトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、０．５％ＳＤＳを含有する変性緩衝液４５マイクロリットルに再懸濁させた。タンパク質を、８０℃にて７分間加熱することによって変性した。抗体上のＮ結合グリカンは、１０ｍＵのＰＮＧアーゼＦおよび１％ＮＰ４０によって３７℃にて一晩インキュベーションした後に放出された。放出されたグリカンは、２００マイクロリットルの誘導体化溶液（４％（ｗ／ｖ）酢酸ナトリウムおよび２％（ｗ／ｖ）ホウ酸を含有するメタノール中の３０ｍｇ／ｍＬアントラニル酸（ＡＡ）および２０ｍｇ／ｍＬシアノ水素化ホウ素ナトリウム）の添加、および８０℃にて１時間のインキュベーションによって蛍光標識された。ＡＡ誘導体化グリカンは、固相抽出カートリッジ（Ｏａｓｉｓ^ＴＭＨＬＢカートリッジ、Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐ．）を使用して過剰な試薬からさらに分離され、２００マイクロリットルの５％アセトニトリル中に溶離された。グリカンのＨＰＬＣ分離では、Ｔｈｅｒｍｏ Ｈｙｐｅｒｃａｒｂ^ＴＭカラム（３μｍ、１００×２．１ｍｍ）を０．１５ｍＬ／分の流速で使用した。移動相ＡはＨ_２Ｏ中０．０５％ＴＦＡであり、移動相Ｂは９０％アセトニトリルおよび１０％Ｈ_２Ｏ中の０．０４５％ＴＦＡであった。１０マイクロリットルの一定分量の蛍光誘導体化オリゴサッカライドは、９０マイクロリットルのＨ_２Ｏ中０．１％ＴＦＡと混合され、２５％移動相Ｂにおいて事前に平衡化されたカラムに注入された。試料注入後に、勾配を５分間で３０％Ｂまで上昇させ、３９分間での４３％Ｂへの新たな上昇が続き、オリゴサッカライドを分離した。ＡＡ標識グリカンは、蛍光検出器を使用して励起波長２３０ｎｍおよび発光波長４５０ｎｍで検出された。ＡＡ標識グリカンの質量分析は、Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ａｘｉｍａ^ＴＭＭＡＬＤＩ−ＴＯＦシステムを使用して行われた。１００マイクロリットルの誘導体化グリカンをスピードバキュームで乾燥させ、１０マイクロリットルの０．１％ＴＦＡ中に再懸濁した。濃縮されたグリカンを、Ｎｕｔｉｐ Ｈｙｐｅｒｃａｒｂ^ＴＭを使用してさらに脱塩し、６５％アセトニトリル中の３０マイクロリットルの０．１％ＴＦＡ中に溶離させて、スピードバキュームで乾燥させた。凍結乾燥したグリカンを、７０％アセトニトリル中の２マイクロリットルの１０ｍｇ／ｍＬ ＤＨＢ（２，５−ジヒドロキシ安息香酸）に再溶解させ、ＭＡＬＤＩプレート上にスポットした。スペクトルは線形ネガティブモードの下で、１５００ｍｕにおける後抽出（ｐｏｓｔ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ）、および３３７ｎｍの波長で動作する最大出力（６ｍＷ）の６０〜９０％で設定されたレーザ出力を用いて収集された。
（項目１） 糖タンパク質をフコシル化することが可能な細胞であって、該細胞は、改変を有する改変ＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシ−マンノース−３，５−エピメラーゼ−４−レダクターゼ（ＦＸ）遺伝子を含み、該遺伝子は、配列番号１と少なくとも９０％同一であり、位置２８９にセリンを含む、ＦＸタンパク質をコードし、該糖タンパク質の約１０％以下は、該細胞が外部フコース供給源の非存在下で約３７℃の温度にて増殖させられるときにフコシル化される、細胞。
（項目２） 上記ＦＸ遺伝子が改変をさらに含み、該遺伝子が、位置７９のセリン、位置９０のリジン、位置１３６のロイシン、位置２１１のアルギニン、およびその組合せからなる群より選択される特異的位置のアミノ酸を有するＦＸタンパク質をコードする、項目１に記載の細胞。
（項目３） 上記ＦＸタンパク質が配列番号１と少なくとも９５％同一であり、位置２８９にセリンを含む、項目１に記載の細胞。
（項目４） チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である、項目１に記載の細胞。（項目５） 上記ＦＸタンパク質がハムスターＦＸタンパク質、マウスＦＸタンパク質、ラットＦＸタンパク質、サルＦＸタンパク質、またはヒトＦＸタンパク質である、項目１に記載の細胞。
（項目６） 免疫グロブリンＣＨ２領域および免疫グロブリンＣＨ３領域を含む糖タンパク質を発現するものである、項目１に記載の細胞。
（項目７） 上記糖タンパク質が抗体である、項目６に記載の細胞。
（項目８） 項目６に記載の細胞であって、該細胞が外部フコース供給源の非存在下で約３７℃の温度にて増殖させられるときに、上記糖タンパク質の約６％以下がフコシル化される、細胞。
（項目９） 項目８に記載の細胞であって、該細胞が外部フコース供給源の非存在下で約３７℃の温度にて増殖させられるときに、上記糖タンパク質の約２％以下がフコシル化される、細胞。
（項目１０） 項目１に記載の細胞であって、該細胞が外部フコース供給源の非存在下で約３４℃の温度にて増殖させられるときに、該細胞が上記糖タンパク質の少なくとも７０％をフコシル化する、細胞。
（項目１１） 項目１に記載の細胞であって、該細胞が外部フコース供給源の非存在下で約３４℃の温度にて増殖させられるときに、該細胞が上記糖タンパク質の少なくとも９０％をフコシル化する、細胞。
（項目１２） 項目１に記載の細胞であって、該細胞が外部フコース供給源の存在下で約３７℃の温度にて増殖させられるときに、該細胞が上記糖タンパク質の少なくとも７０％をフコシル化する、細胞。
（項目１３） 項目１に記載の細胞であって、該細胞が外部フコース供給源の存在下で約３７℃の温度にて増殖させられるときに、該細胞が上記糖タンパク質の少なくとも９０％をフコシル化する、細胞。
（項目１４） ＦＸタンパク質をコードする単離ヌクレオチド配列であって、該ＦＸタンパク質が位置２８９にセリンを含む、単離ヌクレオチド配列。
（項目１５） 項目１４に記載の単離ヌクレオチド配列であって、該ヌクレオチド配列によってコードされた上記ＦＸタンパク質が位置７９のセリン、または位置９０のリジン、または位置１３６のロイシン、または位置２１１のアルギニン、またはその組合せをさらに含む、単離ヌクレオチド配列。
（項目１６） 配列番号１と少なくとも９５％同一であるＦＸタンパク質をコードする、項目１４に記載の単離ヌクレオチド配列。
（項目１７） 免疫グロブリン遺伝子をコードするヌクレオチド配列をさらに含む、項目１に記載の細胞。
（項目１８） フコシル化の低下を有する糖タンパク質を作製するための方法であって：
位置２８９にセリンを有するＦＸタンパク質をコードするＦＸ遺伝子を含む哺乳動物細胞であって、免疫グロブリンＣＨ２領域および免疫グロブリンＣＨ３領域を含む糖タンパク質を発現する、細胞を、約３７℃の温度にて、外部フコース供給源の非存在下で培養することと；
該糖タンパク質を該培養物から単離することと；
を含む、方法。
（項目１９） 上記ＦＸ遺伝子が位置７９のセリン、位置９０のリジン、位置１３６のロイシン、位置２１１のアルギニン、およびその組合せから選択される特異的位置のアミノ酸を有するＦＸタンパク質をコードする、項目１８に記載の方法。
（項目２０） 上記糖タンパク質が抗体である、項目１８に記載の方法。
（項目Ａ１）
糖タンパク質をフコシル化することが可能な細胞であって、該細胞は、改変を有する改変ＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシ−マンノース−３，５−エピメラーゼ−４−レダクターゼ（ＦＸ）遺伝子を含み、該遺伝子は、配列番号１と少なくとも９０％同一であり、位置２８９にセリンを含む、ＦＸタンパク質をコードし、該糖タンパク質の１０％以下は、該細胞が外部フコース供給源の非存在下で３７℃の温度にて増殖させられるときにフコシル化される、細胞。
（項目Ａ２）
前記ＦＸ遺伝子が改変をさらに含み、該遺伝子が、位置７９のセリン、位置９０のリジン、位置１３６のロイシン、位置２１１のアルギニン、およびその組合せからなる群より選択される特異的位置のアミノ酸を有するＦＸタンパク質をコードする、項目Ａ１に記載の細胞。
（項目Ａ３）
前記ＦＸタンパク質が配列番号１と少なくとも９５％同一であり、位置２８９にセリンを含む、項目Ａ１に記載の細胞。
（項目Ａ４）
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である、項目Ａ１に記載の細胞。
（項目Ａ５）
前記ＦＸタンパク質がハムスターＦＸタンパク質、マウスＦＸタンパク質、ラットＦＸタンパク質、サルＦＸタンパク質、またはヒトＦＸタンパク質である、項目Ａ１に記載の細胞。
（項目Ａ６）
免疫グロブリンＣＨ２領域および免疫グロブリンＣＨ３領域を含む糖タンパク質を発現するものである、項目Ａ１に記載の細胞。
（項目Ａ７）
前記糖タンパク質が抗体である、項目Ａ６に記載の細胞。
（項目Ａ８）
項目Ａ６に記載の細胞であって、該細胞が外部フコース供給源の非存在下で３７℃の温度にて増殖させられるときに、前記糖タンパク質の６％以下がフコシル化される、細胞。
（項目Ａ９）
項目Ａ８に記載の細胞であって、該細胞が外部フコース供給源の非存在下で３７℃の温度にて増殖させられるときに、前記糖タンパク質の２％以下がフコシル化される、細胞。
（項目Ａ１０）
項目Ａ１に記載の細胞であって、該細胞が外部フコース供給源の非存在下で３４℃の温度にて増殖させられるときに、該細胞が前記糖タンパク質の少なくとも７０％をフコシル化する、細胞。
（項目Ａ１１）
項目Ａ１に記載の細胞であって、該細胞が外部フコース供給源の非存在下で３４℃の温度にて増殖させられるときに、該細胞が前記糖タンパク質の少なくとも９０％をフコシル化する、細胞。
（項目Ａ１２）
項目Ａ１に記載の細胞であって、該細胞が外部フコース供給源の存在下で３７℃の温度にて増殖させられるときに、該細胞が前記糖タンパク質の少なくとも７０％をフコシル化する、細胞。
（項目Ａ１３）
項目Ａ１に記載の細胞であって、該細胞が外部フコース供給源の存在下で３７℃の温度にて増殖させられるときに、該細胞が前記糖タンパク質の少なくとも９０％をフコシル化する、細胞。
（項目Ａ１４）
ＦＸタンパク質をコードする単離ヌクレオチド配列であって、該ＦＸタンパク質が位置２８９にセリンを含み、配列番号１と少なくとも９０％同一である、単離ヌクレオチド配列。
（項目Ａ１５）
項目Ａ１４に記載の単離ヌクレオチド配列であって、該ヌクレオチド配列によってコードされた前記ＦＸタンパク質が位置７９のセリン、または位置９０のリジン、または位置１３６のロイシン、または位置２１１のアルギニン、またはその組合せをさらに含む、単離ヌクレオチド配列。
（項目Ａ１６）
配列番号１と少なくとも９５％同一であるＦＸタンパク質をコードする、項目Ａ１４に記載の単離ヌクレオチド配列。
（項目Ａ１７）
免疫グロブリン遺伝子をコードするヌクレオチド配列をさらに含む、項目Ａ１に記載の細胞。
（項目Ａ１８）
フコシル化の低下を有する糖タンパク質を作製するための方法であって：
位置２８９にセリンを有し、配列番号１と少なくとも９０％同一であるＦＸタンパク質をコードするＦＸ遺伝子を含む哺乳動物細胞であって、免疫グロブリンＣＨ２領域および免疫グロブリンＣＨ３領域を含む糖タンパク質を発現する、細胞を、３７℃の温度にて、外部フコース供給源の非存在下で培養することと；
該糖タンパク質を該培養物から単離することと；
を含む、方法。
（項目Ａ１９）
前記ＦＸ遺伝子が位置７９のセリン、位置９０のリジン、位置１３６のロイシン、位置２１１のアルギニン、およびその組合せから選択される特異的位置のアミノ酸を有するＦＸタンパク質をコードする、項目Ａ１８に記載の方法。
（項目Ａ２０）
前記糖タンパク質が抗体である、項目Ａ１８に記載の方法。

Claims (20)

1. 糖タンパク質をフコシル化することが可能な細胞であって、該細胞は、改変を有する改変ＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシ−マンノース−３，５−エピメラーゼ−４−レダクターゼ（ＦＸ）遺伝子を含み、該遺伝子は、配列番号１と少なくとも９０％同一であり、位置２８９にセリンを含む、ＦＸタンパク質をコードし、該糖タンパク質の１０％以下は、該細胞が外部フコース供給源の非存在下で３７℃の温度にて増殖させられるときにフコシル化される、細胞。
2. 前記ＦＸ遺伝子が改変をさらに含み、該遺伝子が、位置７９のセリン、位置９０のリジン、位置１３６のロイシン、位置２１１のアルギニン、およびその組合せからなる群より選択される特異的位置のアミノ酸を有するＦＸタンパク質をコードする、請求項１に記載の細胞。
3. 前記ＦＸタンパク質が配列番号１と少なくとも９５％同一であり、位置２８９にセリンを含む、請求項１に記載の細胞。
4. チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である、請求項１に記載の細胞。
5. 前記ＦＸタンパク質がハムスターＦＸタンパク質、マウスＦＸタンパク質、ラットＦＸタンパク質、サルＦＸタンパク質、またはヒトＦＸタンパク質である、請求項１に記載の細胞。
6. 免疫グロブリンＣＨ２領域および免疫グロブリンＣＨ３領域を含む糖タンパク質を発現するものである、請求項１に記載の細胞。
7. 前記糖タンパク質が抗体である、請求項６に記載の細胞。
8. 請求項６に記載の細胞であって、該細胞が外部フコース供給源の非存在下で３７℃の温度にて増殖させられるときに、前記糖タンパク質の６％以下がフコシル化される、細胞。
9. 請求項８に記載の細胞であって、該細胞が外部フコース供給源の非存在下で３７℃の温度にて増殖させられるときに、前記糖タンパク質の２％以下がフコシル化される、細胞。
10. 請求項１に記載の細胞であって、該細胞が外部フコース供給源の非存在下で３４℃の温度にて増殖させられるときに、該細胞が前記糖タンパク質の少なくとも７０％をフコシル化する、細胞。
11. 請求項１に記載の細胞であって、該細胞が外部フコース供給源の非存在下で３４℃の温度にて増殖させられるときに、該細胞が前記糖タンパク質の少なくとも９０％をフコシル化する、細胞。
12. 請求項１に記載の細胞であって、該細胞が外部フコース供給源の存在下で３７℃の温度にて増殖させられるときに、該細胞が前記糖タンパク質の少なくとも７０％をフコシル化する、細胞。
13. 請求項１に記載の細胞であって、該細胞が外部フコース供給源の存在下で３７℃の温度にて増殖させられるときに、該細胞が前記糖タンパク質の少なくとも９０％をフコシル化する、細胞。
14. ＦＸタンパク質をコードする単離ポリヌクレオチドであって、該ＦＸタンパク質が位置２８９にセリンを含み、配列番号１と少なくとも９０％同一である、単離ポリヌクレオチド。
15. 請求項１４に記載の単離ポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドによってコードされた前記ＦＸタンパク質が位置７９のセリン、または位置９０のリジン、または位置１３６のロイシン、または位置２１１のアルギニン、またはその組合せをさらに含む、単離ポリヌクレオチド。
16. 配列番号１と少なくとも９５％同一であるＦＸタンパク質をコードする、請求項１４に記載の単離ポリヌクレオチド。
17. 免疫グロブリン遺伝子をコードするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１に記載の細胞。
18. フコシル化の低下を有する糖タンパク質を作製するための方法であって：
    位置２８９にセリンを有し、配列番号１と少なくとも９０％同一であるＦＸタンパク質をコードするＦＸ遺伝子を含む哺乳動物細胞であって、免疫グロブリンＣＨ２領域および免疫グロブリンＣＨ３領域を含む糖タンパク質を発現する、細胞を、３７℃の温度にて、外部フコース供給源の非存在下で培養することと；
    該糖タンパク質を該培養物から単離することと；
    を含む、方法。
19. 前記ＦＸ遺伝子が位置７９のセリン、位置９０のリジン、位置１３６のロイシン、位置２１１のアルギニン、およびその組合せから選択される特異的位置のアミノ酸を有するＦＸタンパク質をコードする、請求項１８に記載の方法。
20. 前記糖タンパク質が抗体である、請求項１８に記載の方法。
    

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