CN105671109B - 用糖基工程酵母制备具有动物细胞糖基化修饰流感血凝素糖蛋白的方法 - Google Patents

用糖基工程酵母制备具有动物细胞糖基化修饰流感血凝素糖蛋白的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN105671109B
CN105671109B CN201410668305.XA CN201410668305A CN105671109B CN 105671109 B CN105671109 B CN 105671109B CN 201410668305 A CN201410668305 A CN 201410668305A CN 105671109 B CN105671109 B CN 105671109B
Authority
CN
China
Prior art keywords
yeast
transferase
external source
influenza hemagglutinin
glycoprotein
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201410668305.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN105671109A (zh
Inventor
刘波
吴军
巩新
唱韶红
王莎
马清钧
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institute of Bioengineering Chinese Academy of Military Medical Sciences
Original Assignee
Institute of Bioengineering Chinese Academy of Military Medical Sciences
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institute of Bioengineering Chinese Academy of Military Medical Sciences filed Critical Institute of Bioengineering Chinese Academy of Military Medical Sciences
Priority to CN201410668305.XA priority Critical patent/CN105671109B/zh
Priority to PCT/CN2015/088745 priority patent/WO2016078466A1/zh
Publication of CN105671109A publication Critical patent/CN105671109A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN105671109B publication Critical patent/CN105671109B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C07K14/08—RNA viruses
    • C07K14/11—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/145—Fungal isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/16—Yeasts; Culture media therefor
    • C12N1/165—Yeast isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
    • C12R2001/78—Hansenula
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
    • C12R2001/84—Pichia

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了用糖基工程酵母制备具有动物细胞糖基化修饰流感血凝素糖蛋白的方法。本发明提供的方法，包括如下步骤：使流感病毒的血凝素HA基因在酵母突变体中表达，得到重组酵母；将所述重组酵母培养，制备得到具有哺乳动物糖型结构且无岩藻糖的流感病毒血凝素糖蛋白。本发明的实验证明，本发明方法制备的流感血凝素糖蛋白颗粒制备的疫苗可以诱导产生更高的抗流感病毒中和抗体，且避免了真菌型糖基化修饰可能引起过敏等问题。

Description

用糖基工程酵母制备具有动物细胞糖基化修饰流感血凝素糖 蛋白的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及用糖基工程酵母制备具有动物细胞糖基化修饰流感血凝素糖蛋白的方法。
背景技术
流感血凝素是流感病毒表面的主要蛋白之一，以三聚体形式存在，是流感病毒表面参与宿主细胞吸附和入侵的重要成分，其诱发的中和性抗体可以阻断病毒在宿主细胞表面的吸附和入侵，因此是流感疫苗的主要成分。流感血凝素变异、重配快，各种新型流感频发，新疫情爆发后，疫苗的快速研发和生产是疫情控制的关键。
现有的流感疫苗主要通过流感病毒减毒株或重配株的鸡胚培养获得的病毒，经病毒纯化、灭活制备的灭活疫苗，或进一步经病毒裂解或纯化，制备的裂解疫苗和亚单位疫苗。亚单位疫苗由于其具有较高的纯度，因此具有更好的安全性和更少的副反应。鸡胚流感疫苗生产技术存在的主要问题是，病毒生产受限于合格鸡胚的供应，病毒毒株的重配、减毒和鸡胚或细胞适应需要大量时间，且存在不确定性。制备的疫苗纯度低，易引起过敏等副反应。且有些亚型的病毒经灭活剂甲醛等的灭活后，抗原性可能发生改变，导致疫苗部分无效。近年来哺乳动物细胞替代鸡胚培养流感病毒的技术取得发展，但该技术只解决了鸡胚供应受限的问题，上述其它问题依然存在。
通过基因工程技术，重组表达和制备纯化的流感血凝素可望为这些问题的解决提供新途径。流感病毒表面的血凝素是由三个HA形成的三聚体，这种三聚体结构是其与受体结合必须的。流感血凝素上存在多个潜在的N-糖基化位点，不同表达系统和制备方法获得的重组HA在结构、糖基化等方面存在明显不同。在哺乳动物细胞和鸡胚中扩增的流感病毒表面的流感血凝素具有动物细胞的甘露糖型、杂合型和复杂型糖基的各种N-糖基化修饰。
酵母具有工程菌株构建快，工艺开发和产业化生产方便等优点，因此进行了多种用酵母表达流感HA疫苗的尝试。如Athmaram，TN等(Virology Journal 2011,8:524；VirusGenes 201245：440-451；J Ind Microbiol Biotechnol 2013,40:245-255)用毕赤酵母成功分泌表达并纯化获得了2009新型H1N1流感的HA0，Murugan,S等(Journal ofVirological Methods 2013,187:20-25)用毕赤酵母表达H5N1禽流感血凝素，从细胞裂解物中经变性、镍柱亲和层析、复性制备获得HA0，Tsai SM(Journal of VirologicalMethods 2011,175:175-181)，用乳酸克鲁维酵母表达禽流感H5N2的全长HA和NA。但是酵母作为一种真菌，具有对蛋白进行过度甘露糖基化修饰的特性，且缺乏形成类似于动物细胞的甘露糖型、杂合型和复杂型糖基的能力，众所周知，这种真菌型糖基化修饰可能引起过敏等问题。
昆虫细胞、植物细胞、动物细胞和鸡胚制备的流感血凝素的N-糖基中常常在与肽链连接的第一个核心N乙酰葡糖胺上存在岩藻糖修饰，植物细胞和有些昆虫细胞的岩藻糖修饰为α1，3岩藻糖修饰(An,Y.et al.J.Proteome Res.2013,12,3707-3720)，这种岩藻糖修饰在人体中可能引起过敏等问题。虽然，哺乳动物细胞和鸡胚制备的流感血凝素的N-糖基中的岩藻糖修饰一般为人体中存在的α1，6岩藻糖修饰，但是核心糖基上的岩藻糖修饰可能影响修饰位点附近活性基团的暴露。如人IgG抗体Fc上N-糖基的核心岩藻糖修饰可使其与受体FcIIIR的结合力明显下降，从而使抗体介导的细胞毒活性下降10倍左右(Theabsence of fucose but not the presence of galactose or bisecting N-acetylglucosamine of human IgG1 complex-type oligosaccharides shows thecritical role of enhancing antibody-dependent cellular cytotoxicity.Shinkawa,T.,Nakamura,K.,Yamane,N.,Shoji-Hosaka,E.,Kanda,Y.,Sakurada,M.,Uchida,K.,Anazawa,H.,Satoh,M.,Yamasaki,M.,Hanai,N.and Shitara,K.(2003)J Biol Chem,278,3466-73)。
酵母表达制备流感血凝素的另一个重要问题是，制备的血凝素血凝活性较低，且免疫小鼠后难以诱导较高的血凝抑制活性。如Athmaram，TN等(Virology Journal 2011,8:524；Virus Genes 201245：440-451；J Ind Microbiol Biotechnol 2013,40:245-255)用毕赤酵母成功分泌表达并纯化获得了2009新型H1N1流感的HA0以10μg/只和50μg/只的剂量两次免疫小鼠后血凝抑制活性仅为1:32，仍未能达到共认具有保护作用的1:40血凝抑制活性。而Murugan,S等(Journal of Virological Methods 2013,187:20-25)用毕赤酵母表达H5N1禽流感血凝素，从细胞裂解物中经变性、镍柱亲和层析、复性制备获得HA0，分子量略小于66KD，1mg/ml HA0的鸡红细胞血凝活性为1：32。Tsai SM(Journal of VirologicalMethods 2011,175:175-181)，用乳酸克鲁维酵母表达禽流感H5N2的全长HA和NA，培养上清表达的HA经浓缩后具有1:32的血凝活性，也未能达到共认具有保护作用的1:40血凝抑制活性。Murugan,S和Tsai SM等的工作均未报道其制备的HA可以诱导动物产生血凝抑制活性。
流感病毒血凝素HA蛋白的命名来源于病毒颗粒通过HA蛋白与特异性含唾液酸的受体结合，凝集血红细胞。其合成是首先经转录、翻译后在细胞内质网合成含有562～566个氨基酸的HA蛋白前体(HA0)，即血凝素前体；流感病毒RNA编码的血凝素(HA)成熟蛋白约含550个氨基酸残基，包括重链(HA1)和轻链(HA2)两部分，两者中间的碱性氨基酸位点在成熟病毒颗粒向细胞外芽生释放时，受细胞特异蛋白酶水解切开，成为通过二硫键相连的HA1和HA2。而未经蛋白酶切割前的流感血凝素又被称为流感血凝素前体(HA0)。这种特异性切割是流感病毒与宿主细胞膜融合必须的，但与流感血凝素与受体的结合无关，特异蛋白酶切割前后的流感血凝素都具有相同的抗原性和受体结合活性，HA0分子水解为HA1和HA2，是病毒感染性的先决条件。流感血凝素或HA均包括流感血凝素前体(HA0)和特异蛋白酶切割后形成的二硫键相连的HA1和HA2。
流感血凝素HA单体的分子量约为60KD左右，流感病毒表面的HA以三聚体(HA-trimer)形式组成刺突，这种三聚体结构是其与唾液酸受体结合必需的。一些动物如鸡、豚鼠等的红细胞表面具有能与流感病毒HA三聚体结合的唾液酸化糖基。病毒表面的多个HA刺突与不同红细胞表面的多个唾液酸化糖基结合，红细胞表面的多个唾液酸化糖基又与多个病毒表面的HA刺突结合，可形成病毒与红细胞的互相交联，形成血凝现象。由于流感病毒感染宿主细胞时的黏附过程也是通过流感病毒HA三聚体与宿主细胞表面的唾液酸化糖基结合实现的。因此血凝活性是检验HA受体结合活性的重要方法，血凝抑制实验是研究抗体是否具有阻断流感病毒HA三聚体与受体结合的中和活性的重要方法。不同表达系统和制备方法获得的重组HA在结构、糖基化、诱导中和抗体的能力等方面存在明显不同。Athmaram，TN等(Virology Journal 2011,8:524；Virus Genes 201245：440-451；J Ind MicrobiolBiotechnol 2013,40:245-255)用酵母成功分泌表达并纯化获得了2009新型H1N1流感的HA0，但制备的HA0用FPLC纯化时主要以单体和少量三聚体形式存在，以10μg/只和50μg/只的剂量两次免疫小鼠后血凝抑制活性仅为1:32，未能达到共认具有保护作用的1:40血凝抑制活性。未见酵母制备流感血凝素糖蛋白多聚物纳米颗粒的报道。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种制备具有哺乳动物糖型结构且无岩藻糖的流感病毒血凝素糖蛋白的方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：使流感病毒的血凝素HA基因在酵母突变体中表达，得到重组酵母；将所述重组酵母培养，制备得到具有哺乳动物糖型结构且无岩藻糖的流感病毒血凝素糖蛋白；
所述哺乳动物糖型结构的糖链为GalaGlcNAcbMancGlcNAC2，其中a：0-2个；b：0-2个；c：3-5个；
所述酵母突变体按照如下方法制备：阻断目的酵母中的甘露糖基化修饰途径，且在所述目的酵母中重构哺乳动物细胞糖基化修饰途径，得到酵母突变体。
上述方法中，
所述阻断目的酵母原有的甘露糖基化修饰途径为失活所述目的酵母中的磷酸甘露糖转移酶、磷酸甘露糖合成酶和β甘露糖转移酶中至少一种；
所述目的酵母为灭活α-1，6-甘露糖转移酶基因的酵母；
所述重构哺乳动物细胞糖基化修饰途径为表达外源甘露糖苷酶I、外源N-乙酰葡萄糖胺转移酶I、外源甘露糖苷酶II、外源N-乙酰葡萄糖胺转移酶II、外源半乳糖异构酶GalE和/或外源半乳糖转移酶GalT。
上述方法中，
所述酵母突变体的制备方法为如下1)-5)中任一种：
1)失活所述目的酵母中的磷酸甘露糖转移酶、磷酸甘露糖合成酶和β甘露糖转移酶中至少一种，且表达外源甘露糖苷酶I、外源N-乙酰葡萄糖胺转移酶I、外源甘露糖苷酶II、外源N-乙酰葡萄糖胺转移酶II、外源半乳糖异构酶GalE和外源半乳糖转移酶GalT；
具体为1)-a和1)-b：
1)-a：失活所述目的酵母中的磷酸甘露糖转移酶、磷酸甘露糖合成酶和β甘露糖转移酶中，且表达外源甘露糖苷酶I、外源N-乙酰葡萄糖胺转移酶I、外源甘露糖苷酶II、外源N-乙酰葡萄糖胺转移酶II、外源半乳糖异构酶GalE和外源半乳糖转移酶GalT；得到GJK08；
1)-b：失活所述目的酵母中的磷酸甘露糖转移酶，且表达外源甘露糖苷酶I、外源N-乙酰葡萄糖胺转移酶I、外源甘露糖苷酶II、外源N-乙酰葡萄糖胺转移酶II、外源半乳糖异构酶GalE和外源半乳糖转移酶GalT；得到GJK14；
2)失活所述目的酵母中的磷酸甘露糖转移酶、磷酸甘露糖合成酶和β甘露糖转移酶中至少一种，且表达外源甘露糖苷酶I、外源N-乙酰葡萄糖胺转移酶I、外源甘露糖苷酶II和外源N-乙酰葡萄糖胺转移酶II；
具体为失活所述目的酵母中的磷酸甘露糖转移酶、磷酸甘露糖合成酶和β甘露糖转移酶，且表达外源甘露糖苷酶I、外源N-乙酰葡萄糖胺转移酶I、外源甘露糖苷酶II和外源N-乙酰葡萄糖胺转移酶II；得到GJK07；
3)失活所述目的酵母中的磷酸甘露糖转移酶、磷酸甘露糖合成酶和β甘露糖转移酶中至少一种，且表达外源甘露糖苷酶I和外源N-乙酰葡萄糖胺转移酶I；
具体为失活所述目的酵母中的磷酸甘露糖转移酶、磷酸甘露糖合成酶和β甘露糖转移酶，且表达外源甘露糖苷酶I和外源N-乙酰葡萄糖胺转移酶I；得到GJK06；
4)失活所述目的酵母中的磷酸甘露糖转移酶、磷酸甘露糖合成酶和β甘露糖转移酶中至少一种，且表达外源甘露糖苷酶I；
具体为失活所述目的酵母中的磷酸甘露糖转移酶、磷酸甘露糖合成酶和β甘露糖转移酶，且表达外源甘露糖苷酶I，得到GJK05；
5)失活所述目的酵母中的磷酸甘露糖转移酶、磷酸甘露糖合成酶和β甘露糖转移酶中至少一种；
具体为失活所述目的酵母中的磷酸甘露糖转移酶、磷酸甘露糖合成酶和β甘露糖转移酶；得到GJK04。
所述磷酸甘露糖转移酶、磷酸甘露糖合成酶、β甘露糖转移酶具体分别为PNO1，MNN4B，ARM2。
上述方法中，
所述失活所述目的酵母基因组DNA中的磷酸甘露糖转移酶基因和/或磷酸甘露糖合成酶基因和/或β甘露糖转移酶基因均采用同源重组的方式进行；
所述外源甘露糖苷酶I来源于绿色木霉，且C端融合内质网保留信号HDEL；
所述外源N-乙酰葡萄糖胺转移酶I可以是来源于哺乳动物等的N-乙酰葡萄糖胺转移酶I，如人N-乙酰葡萄糖胺转移酶I(GenBank NO NM 002406)、白色念珠菌N-乙酰葡萄糖胺转移酶I(GenBank NO NW_139513.1)、盘基网柄菌N-乙酰葡萄糖胺转移酶I(GenBank NONC_007088.5)等等，可以在N-端或C-端融合内质网或内侧高尔基体定位信号，如ScGLS、ScMNS1、PpSEC12、ScMNN9等等；本发明实施例来源于人，且含有mnn9定位信号；
所述甘露糖苷酶II和所述N-乙酰葡萄糖胺转移酶II均含有mnn2定位信号；
所述外源甘露糖苷酶II可以是来源于丝状真菌、植物、昆虫、爪哇、哺乳动物等的甘露糖苷酶II，如果蝇甘露糖苷酶II(GenBank NO X77652)、线虫甘露糖苷酶II(GenBankNO NM 0735941)、人甘露糖苷酶II(GenBank NO U31520)等等；表达的甘露糖苷酶II可以在N-端或C-端融合内质网或内侧高尔基体定位信号，如ScGLS、ScMNS1、PpSEC12、ScMNN9等等，本发明的实施例来源于线虫，含有mnn2定位信号；
外源N-乙酰葡萄糖胺转移酶II，可以是来源于哺乳动物等的N-乙酰葡萄糖胺转移酶II，如人N-乙酰葡萄糖胺转移酶II(GenBank NO Q10469)、鼠N-乙酰葡萄糖胺转移酶II(GenBank NO Q09326)等等；表达的N-乙酰葡萄糖胺转移酶II可以在N-端或C-端融合内质网或内侧高尔基体定位信号，如ScGLS、ScMNS1、PpSEC12、ScMNN9等等，本发明的实施例来源于人，含有mnn2定位信号；
所述半乳糖异构酶GalE和所述半乳糖转移酶GalT均来源于人，且共有一个kre2定位信号。
半乳糖转移酶GalT可以是来源于哺乳动物等的半乳糖转移酶，如人β-1,4-半乳糖转移酶(GenBank NO gi:13929461)、鼠β-1,4-半乳糖转移酶GenBank NO NC_000081.6)等等。表达的半乳糖转移酶可以在N-端或C-端融合内质网或内侧高尔基体定位信号，如ScKRE2、ScGLS、ScMNS1、PpSEC12、ScMNN9等等，本发明实施例GalT来源于人，且共有一个kre2定位信号；
上述方法中，所述磷酸甘露糖转移酶基因通过序列表中序列1所示的DNA分子替换目的酵母菌基因组上的相应的同源序列进行同源重组；
所述磷酸甘露糖合成酶基因通过序列表中序列2所示的DNA分子替换目的酵母菌基因组上的相应的同源序列进行同源重组；
所述β甘露糖转移酶基因通过序列表中序列3所示的DNA分子替换目的酵母菌基因组上的相应的同源序列进行同源重组；
所述表达外源甘露糖苷酶I通过序列表中序列4所示的核苷酸导入所述目的酵母中；
所述外源N-乙酰葡萄糖胺转移酶I通过序列表中序列5所示的核苷酸导入所述目的酵母中；
所述表达甘露糖苷酶II和所述N-乙酰葡萄糖胺转移酶II通过序列表中序列6所示的核苷酸导入所述目的酵母中；
所述表达半乳糖异构酶GalE和所述半乳糖转移酶GalT通过序列表中序列7所示的核苷酸导入所述目的酵母中。
序列表中序列1自5’末端第7-1006位核苷酸为敲除甘露糖转移酶(PNO1)基因片段的上游同源臂；序列表中序列1自5’末端第1015-2017位核苷酸为敲除甘露糖转移酶(PNO1)基因片段的下游同源臂。
其中序列表中序列2自5’末端第7-1052位核苷酸为敲除甘露糖合成酶(MNN4B)基因片段的上游同源臂；序列表中序列2自5’末端第1061-1984位核苷酸为敲除甘露糖合成酶(MNN4B)基因片段的下游同源臂。
其中序列表中序列3自5’末端第7-652位核苷酸为敲除β甘露糖转移酶(ARM2)基因片段的上游同源臂；序列表中序列3自5’末端第661-1257位核苷酸为敲除β甘露糖转移酶(ARM2)基因片段的下游同源臂。
所述流感病毒的血凝素HA基因包含N端上游信号肽编码基因和C-端穿膜区编码基因；
所述流感病毒的血凝素HA基因通过重组表达载体转化酵母突变体；
所述重组表达载体具体是将含有N端上游信号肽编码基因和C-端穿膜区编码基因的流感病毒的血凝素HA基因插入表达载体得到的载体。
上述方法中，
所述流感病毒的血凝素HA为H1、H3、H5或H7血清型流感病毒的HA；
所述H1、H3、H5或H7血清型流感病毒的HA分别具体为H1N1、H3N2、H5N1或H7N9流感病毒的HA；
所述目的酵母为灭活α-1,6-甘露糖转移酶基因的酵母，所述酵母具体为毕赤酵母、汉逊酵母或乳酸克鲁维酵母。具体为GJK01 CGMCC No.1853，该酵母菌中α1，6甘露糖转移酶(OCH1)失活。
上述方法中，
所述具有哺乳动物甘露糖型结构且无岩藻糖的流感病毒血凝素糖蛋白为流感病毒血凝素糖蛋白聚合物纳米颗粒，其分子量大于670KD。
所述哺乳动物甘露糖型结构的糖链具体为Man5GlcNAc2、GlcNAcMan5GlcNAc2、GlcNAc2Man3GlcNAc2或Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2。
上述方法中，
在所述培养的步骤后，还包括如下步骤：将培养后的产物进行细胞破碎，加入去污剂，获得含流感病毒血凝素糖蛋白的溶液；将所述溶液进行纯化，制备得到具有血凝活性的具有哺乳动物糖型结构且无岩藻糖流感病毒血凝素糖蛋白；
所述细胞破碎的方法具体为物理方法、生物方法或化学方法；
所述物理方法具体为玻璃珠振荡法、高压匀浆法或球磨法；
所述生物方法具体为酶裂解法；
所述化学方法具体为碱裂解法；
所述去污剂具体为非离子型去污剂或弱离子型去污剂；
所述非离子型去污剂尤其具体为曲拉通、吐温或乙基苯基聚乙二醇；
所述弱离子型去污剂具体为脱氧胆酸盐或3-[(3-胆酰胺基丙基)二甲基铵基]-1-丙磺酸盐；
所述将所述溶液进行纯化的方法包括阳离子交换层析和/或阴离子交换层析和/或凝胶排阻层析；
所述阳离子交换层析的填料具体为Sepharose FF SP。
由上述方法制备得到的糖蛋白也是本发明保护的范围。
本发明的另一个目的是提供重组菌。
本发明提供的重组菌，为上述的酵母突变体。
上述重组菌在制备流感病毒血凝素糖蛋白中的应用也是本发明保护的范围；
所述流感病毒血凝素糖蛋白具体为具有哺乳动物甘露糖型结构且无岩藻糖的流感病毒血凝素糖蛋白聚合物纳米颗粒，
所述哺乳动物甘露糖型结构的糖链为GalaGlcNAcbMancGlcNAC2，其中a：0-2个；b：0-2个；c：3-5个；
所述流感病毒血凝素糖蛋白聚合物纳米颗粒分子量大于670KD。
所述纯化制备流感血凝素糖蛋白的方法，对分泌表达的流感血凝素糖蛋白，可以用各种方法分离如离心、盐析、沉淀、超滤和液相层析等技术及这些技术的组合。其中液相层析可以用凝胶排阻、亲和、离子交换、疏水和反相等层析技术。对细胞内或细胞膜上表达的流感血凝素糖蛋白，可以先进行细胞破碎，细胞破碎的方法可以是物理的方法，如玻璃珠震荡、高压匀浆、球磨等，也可以是生物或化学的方法，如裂解酶法等。对细胞膜上表达的流感血凝素糖蛋白，还可以先采用去污剂从膜上溶解HA，非离子型去污剂可以较好地保持HA的结构，所用去污剂可以是曲拉通、吐温、乙基苯基聚乙二醇等，这种流感血凝素经纯化和去除或降低去污剂浓度后，可以获得流感血凝素糖蛋白聚合物其特征为，分子量大于670KD，聚合物至少包含9个以上流感血凝素蛋白HA0单体。用这种流感血凝素HA0糖蛋白聚合物制备的疫苗可以诱导产生更高效价的中和抗体。
本发明的实验证明，本发明具有动物细胞N-糖型结构且无岩藻糖化的流感血凝素糖蛋白，其与普通酵母制备的高甘露糖基化流感血凝素相比，用这种具有动物细胞N-糖型结构，且无岩藻糖化的流感血凝素糖蛋白制备的疫苗可以诱导产生更高的抗流感病毒中和抗体，且避免了真菌型糖基化修饰可能引起过敏等问题。用这种流感血凝素制备的流感疫苗具有工程菌株构建周期短、生长快、易于大规模生产、安全性高等特点，使其不仅可用于制备季节性流感疫苗，而且非常适合在突发新型流感等应急条件下，进行疫苗高效研发和大规模生产。
除非另外说明，本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人通常理解的相同的意思。示例性的方法和材料描述如下，虽然与本文描述的类似或等同的方法和材料也可以用于实施本发明，这对本领域技术人员来说是显而易见的。本文提及的所有出版物和其它参考文献都以引用的方式引入其全文.在不一致的情况下，以本说明书，包括定义，为准。材料，方法和实施例仅是举例说明而不是进行限制。
附图说明
图1为PCR鉴定GJK02
图2为PCR鉴定GJK03
图3为PCR鉴定GJK04
图4为GJK08表达全长H7N9流感血凝素糖蛋白的阳离子色谱柱纯化
图5为GJK08表达全长H7N9流感血凝素糖蛋白的阴离子交换层析纯化
图6为GJK08表达全长H7N9流感血凝素糖蛋白纯化前后的还原SDS-PAGE
图7为GJK08表达全长H7N9流感血凝素糖蛋白凝胶排阻色谱层析
图8为GJK08表达全长H7N9流感血凝素糖蛋白的结构分析
图9为GJK08表达全长H7N9流感血凝素糖蛋白胰蛋白酶切割分析
图10为GJK08表达全长H7N9流感血凝素糖蛋白血凝实验
图11为GJK08表达全长H7N9流感血凝素糖蛋白分子排阻凝胶色谱
图12为GJK08表达全长H7N9流感血凝素糖蛋白电子显微镜照相
图13为GJK08表达H7N9流感血凝素糖蛋白多聚体颗粒的N-糖基结构分析
图14为GJK08表达H7N9流感血凝素糖蛋白多聚体颗粒抗原性
图15为GJK08表达H1N1流感血凝素糖蛋白多聚体颗粒分子量
图16为GJK08表达H1N1流感血凝素糖蛋白多聚体颗粒血凝活性
图17为GJK08表达H1N1流感血凝素糖蛋白多聚体颗粒抗原性
图18为GJK08表达去除C端穿膜区H7N9流感血凝素糖蛋白纯化结果
图19为GJK08表达H3N2流感血凝素糖蛋白分子量
图20为GJK08表达H3N2流感血凝素糖蛋白血凝活性
图21为GJK08表达H3N2流感血凝素糖蛋白抗原性
图22为GJK08表达H5N1流感血凝素糖蛋白血凝活性
图23为GJK08表达H5N1流感血凝素糖蛋白电子显微镜照相
图24为GJK08表达H5N1流感血凝素糖蛋白分子量
图25为GJK08表达H5N1流感血凝素糖蛋白抗原性
图26为GJK07表达H7N9流感血凝素糖蛋白N-糖基结构分析
图27为GJK07表达H7N9流感血凝素糖蛋白分子排阻凝胶色谱
图28为GJK07表达H7N9流感血凝素糖蛋白抗原性
图29为GJK05表达H7N9流感血凝素糖蛋白N-糖基结构分析
图30为GJK05表达H7N9流感血凝素糖蛋白分子排阻凝胶色谱
图31为GJK05表达H7N9流感血凝素糖蛋白抗原性
图32为GJK04表达H7N9流感血凝素糖蛋白N-糖基结构分析
图33为GJK04表达H7N9流感血凝素糖蛋白分子排阻凝胶色谱
图34为GJK04表达H7N9流感血凝素糖蛋白抗原性
图35为GJK12表达H7N9流感血凝素糖蛋白分子排阻凝胶色谱
图36为GJK12表达H7N9流感血凝素糖蛋白血凝抑制实验
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
为方便叙述，除特殊说明外，本发明流感血凝素或HA均包括流感血凝素前体(HA0)和特异蛋白酶切割后形成的二硫键相连的HA1和HA2。
pPICZα载体购自Invitrogen公司。
毕赤酵母X33、GS115购自Invitrogen公司。
TPCK处理胰蛋白酶(TPCK-Trypsin)购自Sigma公司。
H7N9流感重配疫苗株(NIBRG-268)在文献“杨娟，郑亚明，冯录召，余宏杰.人用H7N9禽流感疫苗研发进展，中华预防医学杂志，2014,48(2)”中公开过，公众可从中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所获得。
Pyrobest DNA聚合酶购自宝生物工程(大连)有限公司。
pKLAC1购自NEB。
毕赤酵母GJK01 CGMCC No.1853(记载发明专利ZL200610164912.8中，公开号为CN101195809，为失活了α-1,6-甘露糖转移酶的酵母。
实验中所使用的Pyrobest酶、LA Taq酶、dNTPs、限制性内切酶、T4连接酶等购自大连宝生物工程有限公司，pfu酶、试剂盒、DH5α感受态细胞购自北京全式金有限公司，引物合成、测序等由上海生工生物工程技术服务有限公司提供。
实施例1、经糖基修饰途径改造的酵母菌的构建
(一)、磷酸甘露糖转移酶基因、磷酸合成酶基因以及β甘露糖转移酶基因敲除的糖基工程酵母菌株构建
一、磷酸甘露糖转移酶基因灭活的酵母菌株构建
磷酸甘露糖转移酶基因灭活的酵母菌株GJK02为将序列1所示的DNA分子导入毕赤酵母GJK01中，与GJK01基因组中的同源序列发生同源重组，敲除酵母基因组中的磷酸甘露糖转移酶基因，得到的酵母；
1.构建磷酸甘露糖转移酶基因灭活载体
用于敲除甘露糖转移酶(PNO1)基因的敲除质粒pYES2-pno1为将序列表中序列1所示的敲除甘露糖转移酶(PNO1)基因片段插入载体pYES2的KpnI和XbaI酶切位点间得到的载体。其中序列表中序列1自5’末端第7-1006位核苷酸为敲除甘露糖转移酶(PNO1)基因片段的上游同源臂；序列表中序列1自5’末端第1015-2017位核苷酸为敲除甘露糖转移酶(PNO1)基因片段的下游同源臂。
具体如下：
用玻璃珠制备法(A.亚当斯等，《酵母遗传学方法实验指南》，科学出版社，2000)提取毕赤酵母X33的基因组DNA，以该基因组DNA为模板扩增甘露糖转移酶(PNO1)基因两侧的同源臂，PNO1两侧的同源臂分别约为1kb，中间缺失约1.4kb的编码基因。
扩增PNO1上游侧翼区同源臂(PNO15′同源臂)所用的引物为PNO-5-5和PNO-5-3，引物序列分别为：5′-AGTGGTACCGCAGTTTAATCATAGCCCACTGC-3′(划线部分为KpnI识别位点)和5′-ATTCCAATACCAAGAAAGTAAAGTgcggccgcAAGTGGAACTGGCGCACCGGT-3′(划线部分为NotI识别位点)；扩增PNO1下游侧翼区同源臂(PNO13′同源臂)所用的引物为PNO-3-5和PNO-3-3，引物序列分别为：5′-ACCGGTGCGCCAGTTCCACTTgcggccgcACTTTACTTTCTTGGTATTGGAAT-3′(划线部分为NotI识别位点)和5′-TGTTCTAGATCCGAGATTTTGCGCTATGGAGC-3′(划线部分为XbaI识别位点)。
两个同源臂的PCR扩增条件如下：94℃变性5min后，按照94℃变性30sec、55℃复性30sec、72℃延伸1min30sec进行30次循环，最后72℃延伸10min；目的片段大小在1kb左右。将PCR产物用PCR产物回收纯化试剂盒纯化回收(购自鼎国生物技术有限公司，北京)。利用重叠延伸PCR的方法融合PNO15′同源臂和3′同源臂(参见J.萨姆布鲁克等，《分子克隆实验指南》第二版，科学出版社，1995)，以PNO15′同源臂和3′同源臂PCR产物为模板，以PNO-5-5/PNO-3-3为引物，PCR扩增条件如下：94℃变性5min后，按照94℃变性1min、55℃复性1min、72℃延伸3min30sec进行30次循环，最后72℃延伸10min；目的片段大小在2kb左右。PCR产物用PCR产物回收纯化试剂盒纯化回收。
KpnI/XbaI双酶切(本试验所用的限制性内切酶均购自宝生物工程有限公司，大连)PCR产物，酶切后产物插入同样双酶切处理的载体pYES2(购自Invitrogen Corp.USA)中，T4连接酶16℃连接过夜，转化大肠杆菌DH5α，在含氨苄青霉素(100μg/ml)的LB平板上筛选阳性克隆。用KpnI/XbaI双酶切鉴定阳性克隆的质粒，得到4200bp左右和2000bp左右片段的重组载体命名为pYES2-pno1，即为用于敲除甘露糖转移酶(PNO1)基因的敲除质粒。
2、敲除质粒对毕赤酵母的转化
采用电转化法将敲除质粒pYES2-pno1转化入毕赤酵母GJK01(记载发明专利ZL200610164912.8中，公开号为CN101195809)中，电转化的方法为本领域所共知的(如A.亚当斯等，《酵母遗传学方法实验指南》，科学出版社，2000)。电转化前，先将敲除质粒用5’同源臂上BamHI酶切位点线性化，然后电转入制备好的感受态细胞中，涂布于含有精氨酸和组氨酸的MD培养基(YNB 1.34％，生物素4×10-5％，葡萄糖2％，琼脂1.5％，精氨酸100mg/ml,组氨酸100mg/ml)上。待培养基上长出克隆后，随机挑取几个克隆提取基因组，通过PCR的方法鉴定敲除质粒是否正确整合到了染色体上的目标位点，PCR反应所用的两对引物分别是：PNO1基因5’同源臂外的引物序列PNO-5-5OUT:GCAGTTTAATCATAGCCCACTGCTA和载体上的引物序列inner01:AGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCA。PCR反应所用的酶为rTaq(购自宝生物工程有限公司)，PCR扩增条件如下：94℃变性5min后，按照94℃变性30sec、55℃复性30sec、72℃延伸3min进行30次循环，最后72延伸10min。通过凝胶电泳分析PCR产物条带的大小，引物所扩增的条带在2.3kb左右为阳性克隆。
3.PCR鉴定阳性工程菌株
将其中一个阳性克隆接种于YPD培养基(1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖)中，25℃摇床培养12小时后，将菌液涂布于腺嘌呤缺陷的5-FOA培养基(YNB1.34％，生物素4×10-5％，葡萄糖2％，琼脂1.5％，精氨酸100mg/ml,组氨酸100mg/ml，尿嘧啶100mg/ml，5-FOA 0.1％)(其中，YNB，为无氨基酸酵母氮源，购自北京欣经科生物技术有限公司，5-FOA为5-氟尿嘧啶，购自Sigma-aldrich P.O.BOX14508,St.Loui s,MO 63178 USA)，置于25℃培养。
待5-FOA培养基上长出克隆后，提取这些克隆的基因组，进行PCR鉴定：以基因组为模板，鉴定引物为染色体上PNO1基因同源臂外的序列PNO-5-5OUT和PNO-3-3OUT，引物序列分别为：PNO-5-5OUT:5’-GCAGTTTAATCATAGCCCACTGCTA-3’和PNO-3-3OUT:5’-TTGGCGCGAGATCATCAGGAATTTCA-3’。同时将以野生型GS115菌株(购自Invitrogen公司)的基因组为模板的PCR反应体系设为对照。PCR反应所用的酶为LA Taq(购自宝生物工程有限公司)，PCR扩增条件如下：94℃变性5min后，按照94℃变性30sec、55℃复性30sec、72℃延伸3min进行30次循环，最后72延伸10min。
将产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图1A所示，1为野生型，2为PON1缺陷型；以野生型GS115菌株基因组为模板的PCR产物大小在2.6kb左右，以待鉴定的克隆基因组为模板的PCR产物大小在2.1kb左右，证明其为PON1缺陷型工程菌。
以阳性克隆基因组DNA为模板，用PNO1-ORF01：5'-GGGAAAGAAAACCTTCAATTT-3'和PNO1-ORF02：5'-TACAAGCCAGTTTCGCAATAA-3'进行PCR扩增。
结果如图1B，1为PON1缺陷型，2为野生型；以野生型GS115菌株基因组为模板的PCR产物大小在456bp左右，PON1缺陷型工程菌无扩增条带，也证明了PNO1基因的丢失，磷酸甘露糖转移酶敲除的菌株构建正确，命名为GJK02，为磷酸甘露糖转移酶敲除的重组毕赤酵母菌。
二、磷酸甘露糖合成酶基因灭活的酵母菌株构建
磷酸甘露糖转移酶和磷酸甘露糖合成酶基因灭活的酵母菌株GJK03为将序列1所示的DNA分子和序列表中序列2所示的DNA分子导入毕赤酵母GJK01中，与GJK01基因组中的同源序列发生同源重组，敲除酵母基因组中的磷酸甘露糖转移酶基因和磷酸甘露糖合成酶基因，得到的酵母；
1.构建磷酸甘露糖合成酶基因灭活载体
用于敲除磷酸甘露糖合成酶(MNN4B)基因的敲除质粒pYES2-MNN4B为将序列表中序列2所示的敲除甘露糖合成酶(MNN4B)基因片段插入载体pYES2的StuI和SPE1酶切位点间得到的载体。其中序列表中序列2自5’末端第7-1052位核苷酸为敲除甘露糖合成酶(MNN4B)基因片段的上游同源臂；序列表中序列2自5’末端第1061-1984位核苷酸为敲除甘露糖合成酶(MNN4B)基因片段的下游同源臂。具体如下：
利用同上述一的方法，用玻璃珠制备法提取毕赤酵母X33的基因组DNA，以该基因组DNA为模板扩增敲除甘露糖合成酶(MNN4B)基因片段，MNN4B两侧的同源臂分别约为1kb，中间缺失约1kb的编码基因。
扩增MNN4B上游侧翼区同源臂(ARM25′同源臂)所用的引物为MNN4B-5-5和MNN4B-5-3，引物序列分别为：5′-AGTAGGCCTTTCAACGAGTGACCAATGTAGA-3′(划线部分为StuI识别位点)和5′-TATCTCCATAGTTTCTAAGCAGGGCGGCCGCAATATGTGCGGTGTAGGGAGAAA-3′(划线部分为NotI识别位点)；
扩增MNN4下游侧翼区同源臂(MNN43′同源臂)所用的引物为MNN4-3-5和MNN4-3-3，引物序列分别为：5′-TTTCTCCCTACACCGCACATATTGCGGCCGCCCTGCTTAGAAACTATGGAGATA-3′(划线部分为NotI识别位点)和5′-TGTACTAGTTGAAGACGTCCCCTTTGAACA-3′(划线部分为SpeI识别位点)。
两个同源臂的PCR扩增条件、回收方法、以及酶切方法都同实施例1，最终构建获得pYES2-MNN4B敲除载体。
2.敲除质粒对毕赤酵母的转化
敲除质粒采用电转化法将敲除质粒转化入上述一构建的毕赤酵母工程菌株GJK02中，电转化的方法、鉴定方法同实施例1。
PCR反应所用的两对引物分别是：MNN4基因5’同源臂外的引物序列MNN4-5-5OUT:TAGTCCAAGTACGAAACGACACTA和载体上的引物序列inner01:AGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCA，引物所扩增的条带在2kb左右为阳性克隆。
3.PCR鉴定阳性工程菌株
将其中一个阳性克隆接种于5-FOA培养基上长出克隆后，提取这些克隆的基因组，进行PCR鉴定：以基因组为模板，鉴定引物为染色体上PNO1基因同源臂外的序列MNN4-5-5OUT和MNN4-3-3OUT，引物序列分别为：MNN4-5-5OUT:TAGTCCAAGTACGAAACGACACTA和MNN4-3-3OUT:ACGACGGTGAGTTCAAACAGTTTG。同时将以野生型GS115菌株(购自Invitrogen公司)的基因组为模板的PCR反应体系设为对照。PCR反应条件上述一。
将产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图2A所示，1为野生型，2为MNN4缺陷型；以野生型GS115菌株基因组为模板的PCR产物大小在3.0kb左右，以待鉴定的克隆基因组为模板的PCR产物大小在2.0kb左右，证明其为MNN4缺陷型工程菌。
引物序列：MNN4-ORF01:5'-AAAACTATCCAATGAGGGTCTC-3'和MNN4-ORF02:5'-TCTTCAATGTCTTTAACGGTGT-3'。
以阳性克隆基因组DNA为模板，利用引物MNN4-ORF01和MNN4-ORF02进行PCR扩增。结果如图2B所示，1为野生型，2为MNN4缺陷型；以野生型GS115菌株基因组为模板的PCR产物大小在912bp左右，MNN4缺陷型工程菌无扩增条带，也证明了磷酸甘露糖合成酶敲除的，命名为GJK03，为磷酸甘露糖转移酶和磷酸甘露糖合成酶敲除的重组毕赤酵母菌。
三、β甘露糖转移酶基因灭活的酵母菌株构建
磷酸甘露糖转移酶、磷酸甘露糖合成酶和β甘露糖转移酶基因灭活的酵母菌株GJK04为将序列1所示的DNA分子、序列表中序列2所示的DNA分子和序列3所示的DNA分子导入毕赤酵母GJK01中，与GJK01基因组中的同源序列发生同源重组，敲除酵母基因组中的磷酸甘露糖转移酶基因、磷酸甘露糖合成酶基因和β甘露糖转移酶基因，得到的酵母；
1.构建β甘露糖转移酶基因灭活载体
用于敲除β甘露糖转移酶(ARM2)基因的敲除质粒pYES2-ARM2为将序列表中序列3所示的敲除β甘露糖转移酶(ARM2)基因片段插入载体pYES2的KpnI和XbaI酶切位点间得到的载体。其中序列表中序列3自5’末端第7-652位核苷酸为敲除β甘露糖转移酶(ARM2)基因片段的上游同源臂；序列表中序列3自5’末端第661-1257位核苷酸为敲除β甘露糖转移酶(ARM2)基因片段的下游同源臂。具体如下：
利用同上述一的方法，用玻璃珠制备法提取毕赤酵母X33的基因组DNA，以该基因组DNA为模板扩增β甘露糖转移酶(ARM2)基因两侧的同源臂，ARM2两侧的同源臂分别约为0.6kb，中间缺失约0.6kb的编码基因。
扩增ARM2上游侧翼区同源臂(ARM25′同源臂)所用的引物为ARM2-5-5和MNN4-5-3，引物序列分别为：5′-ActTGGTACCACACGACTCAACTTCCTGCTGCTC-3′(划线部分为KpnI识别位点)和5′-actGCGGCCGCCACGAAACTTCTTACCTTTGACAA-3′(划线部分为NotI识别位点)；扩增ARM2下游侧翼区同源臂(ARM23′同源臂)所用的引物为ARM2-3-5和ARM2-3-3，引物序列分别为：5′-TTGTCAAAGGTAAGAAGTTTCGTGGCGGCCGCTATCTTGACATTGTCATTCAGTGA-3′(划线部分为NotI识别位点)和5′-caaTCTAGAGCCTCCTTCTTTTCCGCCT-3′(划线部分为XbaI识别位点)。
2.敲除质粒对毕赤酵母的转化
敲除质粒采用电转化法将敲除质粒转化入上述一构建的毕赤酵母工程菌株GJK03中，电转化的方法、鉴定方法同上述一。
PCR反应所用的两对引物分别是：ARM2基因5’同源臂外的引物序列ARM2-5-5OUT:TTTTCCTCAAGCCTTCAAAGACAG)和载体上的引物序列inner01:AGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCA，引物所扩增的条带在0.8kb左右为阳性克隆。
3.PCR鉴定阳性工程菌株
将其中一个阳性克隆接种于5-FOA培养基上长出克隆后，提取这些克隆的基因组，进行PCR鉴定：以基因组为模板，鉴定引物为染色体上ARM2基因同源臂外的序列ARM2-5-5OUT和ARM2-5-3OUT，引物序列分别为：ARM2-5-5OUT:和ARM2-5-3OUT:AGCTGCGCACGTCAAGACTGTC。PCR反应条件上述一。
将产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图3A所示，1、2为ARM缺陷型，3为野生型；以野生型GS115菌株基因组为模板的PCR产物大小在1.8kb左右，以待鉴定的克隆基因组为模板的PCR产物大小在1.2kb左右，证明其为ARM2缺陷型工程菌。
以阳性克隆基因组DNA为模板，用引物Arm-ORF01和Arm-ORF02进行PCR扩增，结果如图3B所示，1为野生型，2为ARM2缺陷型；结果以野生型GS115菌株基因组为模板的PCR产物大小在400bp左右，ARM2缺陷型工程菌无扩增条带，也证明了β甘露糖转移酶(ARM2)敲除的，命名为GJK04，为磷酸甘露糖转移酶、磷酸甘露糖合成酶和β甘露糖转移酶(ARM2)基因敲除的重组毕赤酵母菌。
引物序列：Arm-ORF01:5'-AAGACTATGAGATGCCCAGGTA-3'和Arm-ORF02:5'-GAGGTGGACAAGAGTTCAACAA-3'。
(二)、具有哺乳动物Man5GlcNAc2且无岩藻糖糖基化结构的糖基工程酵母菌株构建
具有哺乳动物Man5GlcNAc2且无岩藻糖糖基化结构的糖基工程酵母菌株GJK05为C端融合HDEL序列的MDSI(序列4)插入宿主菌GJK04的基因组中，得到的工程菌。
1.外源甘露糖苷酶I(MDSI)表达载体的构建
表达外源甘露糖苷酶I重组载体pPIC9-TrmdsI为将序列表中序列4所示的DNA分子插入pPIC9载体的XhoI和EcoRI酶切位点间得到的重组载体。
其中序列4自5’末端第13-1536位核苷酸为优化后的甘露糖苷酶I编码基因，自5’末端第1537-1548位核苷酸为内质网保留信号——HDEL编码基因。
1)甘露糖苷酶I(MDSI)基因
外源甘露糖苷酶I可以是来源于丝状真菌、植物、昆虫、爪哇、哺乳动物等的甘露糖苷酶I，本实施例选取绿色木霉的甘露糖苷酶I(GenBank NO AF212153)，并在甘露糖苷酶I的C-端融合了内质网保留信号——HDEL。
根据Genbank(GenBank NO AF212153)公布的绿色木霉的甘露糖苷酶I序列，根据酵母偏爱密码子和基因高表达原则优化编码基因，并在C端融合HDEL序列，得到基因片段。
2).设计并合成如下引物：
TrmdsI-5:5’-TCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTTATCCAAAGCCGGGCGCCAC-3’
下划线所示序列为XhoI酶切识别位点。
TrmdsI-3:5’-AGGGAATTCTTACAACTCGTCGTGAGCAAGGTGGCCGCCCCGTCGTGATG-3’
下划线所示序列为EcoRI酶切识别位点。
3)、以上述1)得到的基因片段为模板，以TrmdsI-5和TrmdsI-3为引物，进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，命名为TrmdsI，该产物的序列为序列4。
4).XhoI和EcoRI双酶切上述3)获得的PCR产物，得到基因片段；XhoI和EcoRI双酶切pPIC9载体得到载体大片段；将基因片段与载体大片段连接，得到重组质粒，将其命名为pPIC9-TrmdsI。将pPIC9-TrmdsI测序，结果正确。
2.表达外源甘露糖苷酶I的重组酵母的构建
将约10μg pPIC9-TrmdsI质粒，用SalI线性化，用1/10体积的3M醋酸钠和3倍体积的无水酒精沉淀线性化的质粒。用体积百分含量为70％的乙醇水溶液洗两次以除去其中的盐，晾干，加入约30μL水重悬沉淀，获得用于转化的pPIC9-TrmdsI线性化质粒。
以下步骤中制备酵母电转化感受态细胞的方法参照Invitrogen公司的相关手册和“Molecular Cloning，A laboratory Manual(Fourth Edition)”,2012 Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New YorK。选用的宿主菌是上述(一)构建的GJK04工程菌。
具体如下：
将毕赤酵母GJK04在YPD平板(酵母提取物10g/L，胰蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，琼脂15g/L)上用划线法分离单克隆，28℃温箱培养2天。接种一个单克隆至一个装有10mL YPD液体培养基(酵母提取物10g/L，胰蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L)的50mL三角瓶中，28℃过夜培养至OD600约为2，得到菌液。再将0.1-0.5mL菌液接种到含有500mLYPD液体培养基的3.5L摇瓶中，培养过夜至OD600至1.3-1.5之间。将菌液转移至无菌的离心瓶中，4℃，1500g离心10分钟。用500mL预冷的无菌水重悬菌体，4℃，1500g离心10分钟收获细胞，用250mL预冷的无菌水再洗一次。用20mL预冷的无菌1M山梨醇重悬菌体，4℃，1500g离心10分钟收获细胞，用预冷的1M山梨醇重悬菌体至终体积为1.5mL，得到菌悬液。
取80μL菌悬液与10μL用于转化的pPIC9-TrmdsI线性化质粒，在微量离心管中混匀，得到混合物，将其置冰上5min，将混合物转移到一个冰冷的0.2cm电转杯中，电穿孔细胞(Bio-Rad Gene Pulser，2000V，25μF，200Ω)，再立即向电转杯中加入1mL冰冷的1M山梨醇，并小心地将混合物(转化细胞)转移至15mL培养管中。
将培养管放在28℃温箱孵育1h，不要摇动。然后加入1mL YPD液体培养基后在28℃，250rpm的摇床中孵育3h。取200μL转化细胞涂布到含MD平板上(1.34g/100ml的YNB，4×10-5g/100ml Biotin，2g/100ml的葡萄糖)。28℃温箱培养2-5天，至形成单克隆，命名为GJK04-Tr，即GJK05。
用玻璃珠制备法提取GJK05的基因组DNA，以基因组DNA为模板，以TrmdsI-5和TrmdsI-3为引物，进行PCR扩增，得到PCR扩增产物约1.5kb，证明MDSI已插入到基因组中，即为阳性工程菌。
(三)、具有哺乳动物GlcNAcMan5GlcNAc2且无岩藻糖糖基化结构的糖基工程酵母菌株构建
具有哺乳动物GlcNAcMan5GlcNAc2且无岩藻糖糖基化结构的糖基工程酵母菌株GJK06为将序列5所示的含mnn9定位信号的N-乙酰葡萄糖胺转移酶I(GnTI)的DNA片段插入宿主菌GJK05基因组中，得到的工程菌。
其中序列5自5’末端第7-120位核苷酸为mnn9定位信号，自5’末端第121-1344位核苷酸为N-乙酰葡萄糖胺转移酶I编码基因。
1.含mnn9定位信号的N-乙酰葡萄糖胺转移酶I(GnTI)表达载体的构建
1)调取人gnt1基因
用人gnt1基因上游引物(mnn9-GnTI-01：tcagtcagcgctctcgatggcgaccccg(和下游引物GnTI-02：GCGAATTCTTAGTGCTAATTCCAGCTAGGATCATAG(下划线为EcoRI酶切位点)，用PCR的方法从人肝胎cDNA文库(购自Clontech Laboratories Inc.1290Terra BellaAve.Mountain View，CA94043,USA)获得人gnt1基因全长片段，PCR反应条件：94℃预变性5分钟，94℃变性30秒，52℃退火30秒，72℃延伸1分钟30秒，循环30次；最后72℃延伸10分钟。PCR扩增产物用0.8％的琼脂糖凝胶电泳分离，用DNA回收试剂盒进行回收。
2)含定位信号mnn9的GnTI DNA片段
S.cere MNN9高尔基体定位信号：ScMNN9-03：tatAATattATGTCACTTTCTCTTGTATCGTACCGCCTAAGAAAGAACCCGTGGGTTAACATTTTTCTACCTGTTTTGGCCATATTTCTAATATATATAATTTTTTTCCAGAGAGATCAATCTtcagtcagcgctctcgatggcgaccccg
以含有S.cere MNN9高尔基体定位信号编码序列的上游引物ScMNN9-03(tatAATattATGTCACTTTCTCTTGTATCGTACCGCCTAAGAAAGAACCCGTGGGTTAACATTTTTCTACCTGTTTTGGCCATATTTCTAATATATATAATTTTTTTCCAGAGAGATCAATCTtcagtcagcgctctcgatggcgaccccg，下划线为SspI酶切位点)和GnTI催化结构域编码区下游引物GnTI-02，通过PCR反应将回收纯化的1.2kb GnTI片段和S.cere MNN9高尔基体定位信号编码序列相连接，使用Pyrobest DNA聚合酶扩增mnn9-gnt1基因片段(序列5)。
PCR反应条件：94℃变性2分钟，52℃退火30秒、72℃延伸5分钟，之后94℃变性30秒，52℃退火30秒，72℃延伸1分钟30秒，循环30次；最后72℃延伸10分钟。
PCR扩增产物经0.8％的琼脂糖凝胶电泳(8V/cm，15分钟)分离，紫外灯下用洁净的刀片切下1.3kb的目的条带，用DNA回收试剂盒进行回收，方法同上。
3)PGE-URA3-GAP1-mnn9-GnTI表达载体的构建
SspI和EcoRI双酶切上述2)获得的mnn9-gnt1基因片段PCR产物，得到基因片段；SspI和EcoRI双酶切PGE-URA3-GAP1(杨晓鹏,刘波,宋淼,巩新,唱韶红,薛奎晶,吴军.Man5GlcNAc2哺乳动物甘露糖型糖蛋白的毕赤酵母表达系统构建.生物工程学报.2011；27:108-17.)载体得到载体大片段；将基因片段与载体大片段连接，得到重组质粒，将其命名为PGE-URA3-GAP1-mnn9-GnTI。测序，结果正确。
PGE-URA3-GAP1-mnn9-GnTI为将序列表中序列5所示的DNA分子插入PGE-URA3-GAP1载体得到的重组载体。
2.表达外源甘露糖苷酶I的重组酵母的构建
将约10μg PGE-URA3-GAP1-mnn9-GnTI质粒，用NheI线性化，获得用于转化的PGE-URA3-GAP1-mnn9-GnTI线性化质粒，制备酵母电转化感受态细胞的方法上述(二)。
选用的宿主菌是上述二构建的的GJK05工程菌。转化后在MD平板上形成的单克隆，命名为GJK06。
用玻璃珠制备法提取GJK06的基因组DNA，以基因组DNA为模板，以mnn9-GnTI-01和GnTI-02为引物，进行PCR扩增，得到PCR扩增产物约1.2kb，证明GnTI已插入到基因组中，即为阳性工程菌。
(四)、具有哺乳动物GlcNAc2Man3GlcNAc2且无岩藻糖糖基化结构的糖基工程酵母菌株构建
具有哺乳动物GlcNAc2Man3GlcNAc2且无岩藻糖糖基化结构的糖基工程酵母菌株GJK07为将序列6所示的GnTII-MDSII串联DNA分子插入宿主菌GJK06的基因组中，得到的工程菌GJK07。
其中序列6自5’末端第498-947位核苷酸为甘露糖苷酶II编码基因的mnn2定位信号，自5’末端第954-4289位核苷酸为甘露糖苷酶II编码基因、自5’末端第6534-6085位核苷酸为N-乙酰葡萄糖胺转移酶II编码基因的mnn2定位信号，自5’末端第6078-5014位核苷酸为N-乙酰葡萄糖胺转移酶II。
1.含mnn2定位信号的甘露糖苷酶II(MDSII)表达载体的构建
1)全基因合成方式合成含mnn2定位信号的MDSII基因
根据序列利用全基因合成方式合成含mnn2的MDSII基因，由南京金瑞斯公司合成并克隆至pUC57克隆载体中，获得pUC57-MDSII。
设计MDSII基因上游引物(mnn2-MDSII-01：CACCatgctgcttaccaaaaggttttcaaagctgttc(和下游引物MDSII-02：GCTATTTAAATctattaaaatgatacaagaatactggaaatatc(下划线为SwaI酶切位点)，用PCR的方法从pUC57-MDSII获得人MDSII基因全长片段PCR产物，PCR反应条件：94℃预变性5分钟，94℃变性30秒，52℃退火30秒，72℃延伸4分钟30秒，循环30次；最后72℃延伸10分钟。PCR扩增产物(序列6)用0.8％的琼脂糖凝胶电泳分离，用DNA回收试剂盒进行回收。
2)PGE-URA3-GAP1-mnn2-MDSII表达载体的构建
先用SwaI酶切上述PCR产物，再用T4PNK酶(大连宝生物有限公司)磷酸化该基因片段；SspI和EcoRI双酶切PGE-URA3-GAP1载体得到载体大片段；将基因片段与载体大片段连接，得到重组质粒，将其命名为PGE-URA3-GAP1-mnn2-MDSII。
2.含mnn2定位信号的N-乙酰葡萄糖胺转移酶II(GnTII)表达载体的构建
1)全基因合成方式合成GnTII基因
根据序列利用全基因合成方式合成含mnn2的GnTII基因，由南京金瑞斯公司合成并克隆至pUC57克隆载体中，获得pUC57-GnTII。设计GnTII基因上游引物(mnn2-GnTII-01：CACCatgctgcttaccaaaaggttttcaaagctgttc(和下游引物GnTII-02：GCTatttaaatTTAtcactgcagtcttctataacttttac(下划线为SwaI酶切位点)，用PCR的方法从pUC57-GnTII获得含mnn2定位信号的N-乙酰葡萄糖胺转移酶II(GnTII)DNA分子，PCR反应条件：94℃预变性5分钟，94℃变性30秒，52℃退火30秒，72℃延伸2分钟30秒，循环30次；最后72℃延伸10分钟。PCR扩增产物用0.8％的琼脂糖凝胶电泳分离，用DNA回收试剂盒进行回收。
2)PGE-URA3-GAP1-mnn2-GnTII表达载体的构建
酶切及构建方法与PGE-URA3-GAP1-mnn2-MDSII构建方法一致，得到重组质粒，将其命名为PGE-URA3-GAP1-mnn2-GnTII。
3、PGE-URA3-GAP1-mnn2-GnTII-MDSII串联载体的构建
将PGE-URA3-GAP1-mnn2-GnTII利用NotI酶切，再利用Klenow大片段进行补平，获得GnTII的表达盒片段；将PGE-URA3-GAP1-mnn2-MDSII利用SmaI酶切，再利用碱性磷酸酶CIAP去磷酸化处理，获得处理后的质粒PGE-URA3-GAP1-mnn2-MDSII；将质粒和片段进行连接，构建方法同上述(一)，最终获得GnTII-MDSII串联载体——PGE-URA3-GAP1-mnn2-GnTII-MDSII。
PGE-URA3-GAP1-mnn2-GnTII-MDSII为将序列表中序列6所示的GnTII-MDSII串联DNA分子插入表达载体PGE-URA3-GAP1载体中，得到的重组载体。
4、表达外源甘露糖苷酶II和N-乙酰葡萄糖胺转移酶II的重组酵母的构建
将约10μg PGE-URA3-GAP1-mnn2-GnTII-MDSII质粒，用MscI线性化，获得用于转化的PGE-URA3-GAP1-mnn2-GnTII-MDSII线性化质粒，制备酵母电转化感受态细胞的方法同(二)。
选用的宿主菌是(三)构建的GJK06工程菌。转化后在MD平板上形成的单克隆，命名为GJK07。
用玻璃珠制备法提取GJK06的基因组DNA，以基因组DNA为模板，分别以mnn2-MDSII-01和MDSII-02，mnn2-GnTII-01和GnTII-02为引物，进行PCR扩增，得到PCR扩增产物分别为3.8kb和1.6kb，证明MDSII和GnTII已插入到基因组中，即为阳性工程菌。
(五)、具有哺乳动物Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2且无岩藻糖糖基化结构的糖基工程酵母菌构建
具有哺乳动物Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2且无岩藻糖糖基化结构的糖基工程酵母菌株GJK08为将序列7所示的kre2-GalE-GalT基因片段插入宿主菌GJK07基因组中，得到的工程菌GJK08。
其中序列7自5’末端第12-304位核苷酸为kre2定位信号，自5’末端第315-1328位核苷酸为半乳糖异构酶GalE编码基因、自5’末端第1335-2405位核苷酸为半乳糖转移酶GalT编码基因。
1.含kre2定位信号的半乳糖转移酶(GalE+T)表达载体的构建
1)调取人GalE、GalT基因
用人GalE基因上游引物GalE5’和下游引物GalE3’，用人GalT基因上游引物GalT5’和下游引物GalT3’，用PCR的方法分别从人肝胎cDNA文库(购自Clontech LaboratoriesInc.1290Terra Bella Ave.Mountain View，CA94043,USA)获得人GalE、GalT基因全长片段，PCR反应条件：94℃预变性5分钟，94℃变性30秒，52℃退火30秒，72℃延伸1分钟30秒，循环30次；最后72℃延伸10分钟。PCR扩增产物分别用0.8％的琼脂糖凝胶电泳分离，用DNA回收试剂盒分别进行回收。
GalE5’:5’ATGAGAGTTCTGGTTACCGGTGGTA3’
GalE3’:5’AGGGTACCATCGGGATATCCCTGTGGATGGC3’(KpnI)
GalT5’:5’ATGGTACCGGTGGTGGCCGCGACCTGAGCCGCCTGC3’(KpnI)GalT3’:5’GCatttaaatttaGCTCGGTGTCCCGATGTCCACTGTGAT3’(SwaI)
2)含定位信号kre2的GalE-GalT DNA片段
Kre25’:5’ATGGATCCAAACGGCCCTCTTTCTCAGTAAGAG3’(下划线BamHI位点)Kre2
3’+GalE5’:5’CGCTACCACCGGtAACCAGaACTctCattcctgcaggaccacctccGATCGGGGCAtctgccttttcagc 3’
用PCR的方法从人酿酒酵母基因组DNA中调取kre2定位信号片段。PCR条件同上。
以含有S.cerekre2高尔基体定位信号编码序列的上游引物Kre2和GalE+GalT催化结构域编码区下游引物GalT3’，通过PCR反应将回收纯化的GalE、GalT片段和S.cerekre2高尔基体定位信号编码序列相连接，使用Pyrobest DNA聚合酶扩增kre2-GalE-GalT基因片段。
PCR反应条件：94℃变性2分钟，52℃退火30秒、72℃延伸5分钟，之后94℃变性30秒，52℃退火30秒，72℃延伸4分钟30秒，循环30次；最后72℃延伸10分钟。
PCR扩增产物经0.8％的琼脂糖凝胶电泳(8V/cm，15分钟)分离，紫外灯下用洁净的刀片切下1.3kb的目的条带，用DNA回收试剂盒进行回收，方法同上。
3.PGE-URA3-GAP1-kre2-GalE-GalT载体的构建
先用SwaI酶切上述kre2-GalE-GalT的DNA分子，再用T4PNK酶(大连宝生物有限公司)磷酸化该基因片段；SspI和EcoRI双酶切PGE-URA3-GAP1载体得到载体大片段；将基因片段与载体大片段连接，得到重组质粒，将其命名为PGE-URA3-GAP1-kre2-GalE-GalT。
测序，重组载体为将序列表中序列7所示的kre2-GalE-GalT的DNA分子插入PGE-URA3-GAP1载体的SspI和EcoRI酶切位点得到的载体。
4.表达外源UDP-Gal和乳糖转移酶的重组酵母的构建
将约10μg PGE-URA3-GAP1-kre2-GalE-GalT质粒，用NheI线性化，获得用于转化的PGE-URA3-GAP1-kre2-GalE-GalT线性化质粒，制备酵母电转化感受态细胞的方法同(二)。
选用的宿主菌是(四)构建的GJK07工程菌。转化后在MD平板上形成的单克隆，命名为GJK08。
用玻璃珠制备法提取GJK08的基因组DNA，以基因组DNA为模板，分别以GalE5’和GalE3’，GalT5’和GalT3’为引物，进行PCR扩增，得到PCR扩增产物分别为1.0kb和1.0kb，证明GalE和GalT已插入到基因组中，即为阳性工程菌。
实施例2、制备具有Gal2GlcNAc2Man3GlcNAC2的糖基结构修饰的流感病毒血凝素糖蛋白或其多聚物纳米颗粒
一、工程酵母制备的H7N9流感血凝素糖蛋白多聚物纳米颗粒
(一)、重组表达载体的构建
1.根据Genbank(KC853766)(A/Hongzhou/1/2013(H7N9)的流感HA全长氨基酸序列，根据酵母偏爱密码子和基因高表达原则优化编码基因。
2.设计并合成如下引物：
HA7-3：5’-ATCGCGGCCGCTTAAATACAGATAGTACATCTCAT-3’下划线所示序列为NotI酶切识别位点。
HA7-5：5’-ATCTTCGAAACGATGAACACCCAAATACTGGTTTTC-3’下划线所示序列为NspV酶切识别位点。
3.以优化编码基因为模板，以HA7-3和HA7-5为引物，进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，该产物的核苷酸序列为序列8所示，序列8中自5’末端起第8位至第12位为Kozak序列，第13至第66位为信号肽序列，第67位至第1695位为A/Hongzhou/1/2013(H7N9)的HA基因，第1585至第1668位为C端穿膜区序列。
4.NspV和NotI双酶切上述PCR产物，得到基因片段；NspV和NotI双酶切pPICZα载体得到载体大片段；将基因片段与载体大片段连接，得到重组质粒，将其命名为pPICZα-HA7。
将pPICZα-HA7测序，该重组载体为将序列表中序列8所示的含有流感血凝素HA的DNA分子插入pPICZα载体NspV和NotI酶切位点得到的重组载体。
(二)、重组酵母的构建和筛选
将约10μg pPICZα-HA7质粒，用BglII线性化，用1/10体积的3M醋酸钠水溶液和3倍体积的无水酒精沉淀线性化的质粒。用体积百分含量为70％的乙醇水溶液洗两次以除去其中的盐，晾干，加入约30μL水重悬沉淀，获得用于转化的pPICZα-HA7线性化质粒。
以下步骤中制备酵母电转化感受态细胞的方法参照Invitrogen公司的相关手册和“Molecular Cloning，A laboratory Manual(Fourth Edition)”,2012 Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New YorK。
将实施例1的(五)构建的毕赤酵母工程菌株GJK08在YPD平板(酵母提取物10g/L，胰蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，琼脂15g/L)上用划线法分离单克隆，28℃温箱培养2天。接种一个单克隆至一个装有10mL YPD液体培养基(酵母提取物10g/L，胰蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L)的50mL三角瓶中，28℃过夜培养至OD600约为2，得到菌液。再将0.1-0.5mL菌液接种到含有500mLYPD液体培养基的3.5L摇瓶中，培养过夜至OD600至1.3-1.5之间。将菌液转移至无菌的离心瓶中，4℃，1500g离心10分钟。用500mL预冷的无菌水重悬菌体，4℃，1500g离心10分钟收获细胞，用250mL预冷的无菌水再洗一次。用20mL预冷的无菌1M山梨醇重悬菌体，4℃，1500g离心10分钟收获细胞，用预冷的1M山梨醇重悬菌体至终体积为1.5mL，得到菌悬液。
取80μL菌悬液与10μL用于转化的pPICZα-HA7线性化质粒，在微量离心管中混匀，得到混合物，将其置冰上5min，将混合物转移到一个冰冷的0.2cm电转杯中，电穿孔细胞(Bio-Rad Gene Pulser，2000V，25μF，200Ω)，再立即向电转杯中加入1mL冰冷的1M山梨醇，并小心地将混合物(转化细胞)转移至15mL培养管中。
将培养管放在28℃温箱孵育1h，不要摇动。然后加入1mL YPD液体培养基后在28℃，250rpm的摇床中孵育3h。取200μL转化细胞涂布到含100μg/mL Zeocin的YPD平板上。28℃温箱培养2-5天，至形成单克隆。
随机挑取单克隆接种到2ml YPD液体培养基中，28℃培养48h，按体积比5％的接种量接种到BMGY培养基(酵母提取物10g/L，胰蛋白胨20g/L，pH6.0，100mmol/L磷酸缓冲液，1.34g/100ml的YNB，4×10-5g/100ml Biotin，1g/100ml的甘油)中，24h后加入体积百分含量为0.5％的甲醇诱导表达，每12h补加1次，诱导60h后离心收集菌体。每1ml菌液离心收获的菌体用100μl PBS重悬，加入1/4体积的酸洗玻璃珠(直径425-600μm或0.5mm)，每个样品以最大速度涡旋震荡1分钟，重复六次，每两次涡旋震荡中间冰浴两分钟以防蛋白降解。用低温微量离心机4℃，3500g离心1分钟，沉淀玻璃珠和未破损的细胞，得到上清即为破菌液。取破菌液先用PBS按照1：20体积比稀释后，再用PBS按照1：2体积比系列稀释后，用1％鸡红细胞进行血凝活性分析(方法见“郭元吉等《流行性感冒病毒及其实验技术》，北京，中国三峡出版社，1997)。挑取具有血凝活性的破菌液对应的克隆(重组毕赤酵母单克隆)，为阳性克隆，命名为GJK08/pPICZα-HA7。
用玻璃珠制备法提取GJK08/pPICZα-HA7的基因组DNA，以基因组DNA为模板，分别以HA7-5和HA7-3为引物，进行PCR扩增，得到PCR扩增产物分别为1.7kb，证明A/Hongzhou/1/2013(H7N9)的HA基因已插入到基因组中，即为HA7阳性工程菌。
(三)、工程酵母发酵
种子培养：将步骤二得到的具有血凝活性的重组毕赤酵母GJK08/pPICZα-HA7单克隆接种到新鲜MD平板(1.34g/100ml YNB，4×10-5g/100ml Biotin，1g/100ml葡萄糖，1.5g/100ml琼脂粉)上，培养，并挑取其上的单克隆菌落接种于YPD液体培养基中，24℃,250rpm培养约48h。再转接于YPD液体摇瓶培养基300mL中，接种量为1％，25℃,250rpm培养，至菌密度OD600大于10，得到种子液。
发酵培养：配制发酵培养基2.1L(H3PO4 3.5mL/L，K2SO4 2.4g/L，KOH 0.65g/L，CaSO4(无水)0.14g/L，MgSO4·7H2O 1.95g/L，甘油40.0g/L，PTM11.2mL/L，0.02g/100ml的生物素0.5mL/L，余量为水。其中PTM1的组成为：CuSO4·5H2O 6.0g/L，MnSO4·H2O 3.0g/L，FeSO4·7H2O 65g/L，ZnSO4·7H2O 20g/L，CoCl2·6H2O 0.5g/L，NaMoO4·2H2O 0.2g/L，KI0.1g/L，浓H2SO4 5mL/L。)，加入到5L发酵罐，121℃，30min高压灭菌。待发酵罐降至室温，用氨水调节pH 6.0。
以10％的接种量将种子液接入发酵罐，氨水控制pH 6.0，温度为28℃，调节搅拌转速和通气量维持在溶氧10％以上。当甘油耗尽时，溶氧回升，开始流加补料生长培养基(50g/100ml的甘油水溶液(含12mL/L PTM1，2mL/L 500×生物素(购自北京欣经科生物技术有限公司))，40ml/h，流加6-8h,停止补料。开始甲醇诱导，温度维持在24℃，用氨水溶液将pH调为6.4。起始阶段，无水甲醇以2.4mL/h开始流加，每小时增加2.4mL100％甲醇，5h后增至12mL/h，此时为诱导0小时，之后每12h取样。诱导48h后结束发酵，发酵液于4℃，7000rpm/min离心20min。用水重悬为40g/100ml的悬液，高压匀浆仪破菌(1200bar，破菌3次),得匀浆液，该匀浆液用于流感血凝素糖蛋白多聚物纳米颗粒的纯化。
(四)、流感血凝素糖蛋白多聚物纳米颗粒的纯化、鉴定
1、纯化
1)500ml步骤(三)得到的匀浆液中加50g PEG2000，搅拌溶解0.5h,7000rpm离心20min，收集沉淀，弃上清；沉淀加500ml体积的溶液(该溶液中含10mM Tris-HCl，体积百分含量2％TritonX-100(非离子型去污剂)，5g/100ml的甘油，余量为水)重悬，搅拌溶解2h。8000rpm离心20min，收集上清，用磷酸盐调节pH为6.0，用水稀释至电导低于2.5ms/cm，得上样液。
2)阳离子色谱柱(色谱介质为Sepharose FF SP(购自GE)，床层为检测波长为280nm，室温)先用A液平衡(A液：含有1g/100ml的Tween20、5g/100ml甘油，余量为20mM pH6.0的PB)后，将步骤(一)的上样液以50ml/min流速上样，用A液同样流速冲洗至A280小于0.2，换用B液(B液：含有1g/100ml的Tween20、5g/100ml甘油，余量为20mM pH6.86的PB)平衡，用15％C液(A液中添加终浓度为150mM NaCl)、100％C液洗脱(A液中添加终浓度为1M NaCl)洗脱，得到15％C液、100％C液的洗脱峰，结果如图4(左图为色谱图，右图为蛋白电泳结果；)，15％C液得到目的蛋白66KD(其中的15％C1为主峰和15％C2为峰尾)。
3)收集含有HA0组份的15％C液的洗脱液进行阴离子交换层析(色谱介质为Source30S(购自GE)，床层为检测波长为280nm，室温)。具体步骤如下：将15％C液的洗脱样品用A液(A液:1g/100mlTween20、5g/100ml的甘油，余量为20mMpH8.1的Tris-HCl)进行10倍稀释，以10ml/min的速度上样结束后，用B液平衡(B液:1g/100mlTween20、5g/100ml的甘油，余量为20mM pH7.5的Tris-HCl)，再分别用10％C液(A液中添加终浓度为100mM NaCl)、100％C液洗脱(A液中添加终浓度为1M NaCl)，最后用0.5M NaOH水溶液进行洗脱，得到各洗脱组分，结果如图5所示。
将纯化前的样品(步骤2得到的15％C液的洗脱液)、没有被Q柱(Source 30Q)吸附而穿出的样品、10％C液洗脱收集液以及利用100％C液进行洗脱的收集液，利用0.5M NaOH水溶液进行洗脱的收集液进行还原SDS-PAGE分析，结果如图6。图6中，柱前代表纯化前的样品(步骤2得到的15％C液的洗脱液)，Q穿代表没有被Q柱(Source30Q)吸附而穿出的样品，10％C即10％C为液洗脱收集液，100％C代表全部的C液(100％C液)进行洗脱的收集液，NaOH代表利用0.5M NaOH水溶液进行洗脱的收集液，M代表蛋白marker。箭头所示为HA条带。图6表明，该步骤的纯化获得了纯度提高的HA样品(目的蛋白的大小为66KD)，去除了部分杂蛋白，HA0组分所在的样品为10％C液的洗脱液。
4)收集步骤310％C液洗脱组分4ml，进行凝胶排阻色谱层析(色谱介质为Superdex200(购自GE),床层为检测波长为280nm，室温)，将步骤310％C液洗脱组分4ml上样后，用洗脱液(洗脱液：含有0.1M NaCl的pH 7.0的20mM PB)进行洗脱，流速1ml/min，结果如图7所示。
图7(左图为色谱图，右图为蛋白电泳结果)，箭头表示的第一个洗脱主峰为纯化的H7N9流感血凝素糖蛋白，测定其蛋白浓度为0.35mg/ml。
2、H7N9流感血凝素糖蛋白的结构分析
用N-糖苷酶F(PNGF)(购自NEB)处理，分析糖基切除前后的分子量变化，以分析步骤4制备的纯化的H7N9流感血凝素糖蛋白，具体步骤如下：取20ul步骤4纯化的H7N9流感血凝素糖蛋白(浓度为350ug/ml)，按N-糖苷酶F(PNGF)的酶切方法对其进行处理，同时设不加酶对照组和不加样品对照组。将各样品进行还原SDS-PAGE检测，结果如图8所示。
图8中，PNGF代表N-糖苷酶F，HA+PNGF代表步骤4制备的纯化的H7N9流感血凝素糖蛋白中加入了N-糖苷酶F，HA代表步骤4制备的纯化的H7N9流感血凝素糖蛋白，M代表蛋白marker。箭头所示为HA条带。图8表明，未用PNGF处理的纯化的H7N9流感血凝素糖蛋白的HA0分子量约为64KD，PNGF处理后，分子量下降为约60KD，与未糖基化的HA0成熟蛋白的理论分子量(60172Da)一致。说明制备的纯化的H7N9流感血凝素糖蛋白是糖蛋白。
3、验证为HA糖蛋白
1)胰蛋白酶切割的HA制备
为了制备被蛋白酶特异切割成HA1和HA2的HA，取浓度为350ug/ml的上述4制备的纯化的H7N9流感血凝素糖蛋白1ml，加TPCK处理的胰蛋白酶16μg，冰浴处理1小时，作为实验组。同时另取同样的纯化的H7N9流感血凝素糖蛋白1ml，100℃水浴处理5分钟进行变性，冰浴冷却，加TPCK处理的胰蛋白酶16μg，同样冰浴处理1小时，作为对照组。
蛋白酶特异切割不仅可用于制备切割H7N9流感血凝素糖蛋白多聚物纳米颗粒，而且也是分析HA0的高级结构是否正确的重要方法，具有流感病毒三聚体高级结构的HA0只有HA1与HA2间的碱性氨基酸位点裸露，才可以被胰蛋白酶特异性地切割为分子量约40KD的HA1和分子量约25KD的HA2。而不具有正确高级结构的HA0则可以被胰蛋白酶切成大小不等的各种片段。
将纯化的H7N9流感血凝素糖蛋白实验组和对照组进行还原SDS-PAGE，检测结果如图9所示。图9中，HA代表纯化的H7N9流感血凝素糖蛋白，HA+胰酶为实验组，HA变性+胰酶为对照组。箭头代表HA条带。图9表明，HA0被胰蛋白酶切割后，非还原SDS-PAGE电泳分析其分子量为64KD与未切割HA0相似，而还原电泳分析发现，HA0已被特异性切割成了分子量为40kD和24kD的两个片段，与HA1和HA2的分子量一致。说明本发明获得纯化的H7N9流感血凝素糖蛋白的HA0被胰蛋白酶特异性切割成了由二硫键连接的HA1和HA2亚基构成的HA。而该HA0经加热破坏高级结构后，再用胰酶切割，非还原电泳和还原电泳分析均未发现特异性条带，说明HA0已被胰蛋白酶切成了大小不等的各种片段。因此，本发明纯化的H7N9流感血凝素糖蛋白具有流感病毒血凝素相同的高级结构，证明其为流感血凝素糖蛋白。
2)、血凝实验
取上述4制备的纯化的H7N9流感血凝素糖蛋白，先用PBS按照体积比1：10稀释，然后再用PBS按照体积比1：2系列稀释，以生理盐水为对照，用1％鸡红细胞进行血凝活性分析，具体方法见“郭元吉等《流行性感冒病毒及其实验技术》，北京，中国三峡出版社，1997”。
血凝活性检测结果如图10所示。图10中，第二排为生理水对照，第一排为1；20开始2倍系列稀释的纯化的H7N9流感血凝素糖蛋白。图10表明，纯化的H7N9流感血凝素糖蛋白具有明显的血凝活性，鸡血血凝效价达到1：8000。因此本发明的纯化的H7N9流感血凝素糖蛋白具有唾液酸受体结合活性。
4、H7N9流感血凝素糖蛋白的分子大小
为了分析制备的纯化的H7N9流感血凝素糖蛋白的分子大小，对其进行SEC(分子排阻凝胶色谱)分析，仪器为Agilent1290高效液相色谱仪(Agilent Technologies Co)，紫外检测器，检测波长214nm，TSKG4000SWXL 色谱柱和TSK Guardcolumn SWXL保护柱(购自Tosoh Bioscience LLC)分析，以含有100mM NaCl的20mM PB为流动相，流速0.5ml/min。用SEC分子量标准(购自苏州赛分科技有限公司)分析标定。
结果如图11所示，图11的上图为分子量标准蛋白的色谱图，各分子量的保留时间分别为：670KD,20.593min；150KD,22.478min；44KD,24.074min；17.6KD,25.363min；1.35KD,26.966min)；下图为纯化的H7N9流感血凝素糖蛋白的色谱图。图11表明H7N9流感血凝素糖蛋白的色谱图，其纯度达到了99.69％。图11表明，纯化的H7N9流感血凝素糖蛋白在该条件分析下，保留时间为16.971min,说明其分子量明显大于670KD，由于HA0单体的分子量为66KD，其三聚体的分子量约为180KD，说明纯化的H7N9流感血凝素糖蛋白为含9个以上HA0单体形成的多聚体，而上述胰蛋白酶切割实验和血凝实验均表明纯化的H7N9流感血凝素糖蛋白具有流感血凝素的三聚体高级结构，因此，该纯化的H7N9流感血凝素糖蛋白为三个以上HA0三聚体形成的多聚体。
将制备的纯化的H7N9流感血凝素糖蛋白负染后用50,000倍电子显微镜照相，结果如图12所示，标尺为20纳米。图12表明，H7N9流感血凝素糖蛋白多聚物纳米颗粒为至少3个以上血凝素三聚体(此处的血凝素三聚体是指三个HA0单体聚合形成的三聚体)尾部在内聚合，头部向外突出，形成的多聚体颗粒，直径约20-50纳米。
将工程化酵母制备获得的H7N9流感血凝素糖蛋白命名为GJK08-H7N9HA，为H7N9流感血凝素糖蛋白多聚体颗粒。
5.H7N9流感血凝素糖蛋白多聚体颗粒GJK08-H7N9HA的N-糖基结构分析
N-糖基分析是通过基于DNA测序仪的荧光糖电泳(DNA sequencer assistedfluorophore－assisted carbohydrate electrophoresis，DSA－FACE)的方法来实现(刘波,宋淼,巩新,唱韶红,王凌雪,杨依丽,汪丽娜,马清钧,吴军.一种利用DSA-FACE分析寡糖链的方法.生物技术通讯.2008；19:885-8.)。
首先将纯化后的蛋白经PNGase F(New England Biolabs)酶切以便获得糖链，具体方法如下：GJK08-H7N9HA在0.5g/100ml SDS和1ml/100mlβ-巯基乙醇变性缓冲液中100℃变性5min，然后在如下溶液中37℃反应16hr：50mmol/L磷酸钠(pH7.5)，1ml/100ml NP-40，5-10μl(500,000units/ml)N-糖苷酶F(PNGaseF，New England BioLabs,NEB,Ipswich,MA)。反应结束后，酶切体系中添加4倍体积-20℃预冷的丙酮沉淀糖链，13000g离心10min，弃上清，沉淀经由700uL-20℃预冷的60％甲醇两次萃提。然后将所提糖链低压冻干，利用APTS(8-aminopyrene-1,3,6-trisulfonate，8-氨基-1,3,6-三磺酸芘，购自Biotium公司)标记还原末端。最终待测样品中含1μL样品，8μL去离子甲酰胺和1μL ROX修饰内标混合物，其中ROX内标混合物是指由罗丹明修饰的6-、30-寡核苷酸(由5′-TAC-3′重复序列组成，由Invitrogen公司PAGE纯化得到)。上样，利用标准的36cm毛细管及POP-6胶(ABI)分离，并利用GeneScan 3.7软件进行数据分析。
结果如图13(M5-9分别为Man5GlcNAc2、Man6GlcNAc2、Man7GlcNAc2、Man8GlcNAc2、Man9GlcNAc2)所示，表明GJK08表达的糖蛋白GJK08-H7N9HA的糖链为Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2结构(其中Man:甘露糖；GlcNAc：N-乙酰葡萄糖胺)。从而证明了工程酵母表达的GJK08-H7N9HA的糖基结构已经成为哺乳动物的甘露糖型结构，而酵母不具有这种糖基结构。
(五)、流感血凝素糖蛋白多聚物纳米颗粒的抗原性
采用同样的技术方法，将pPICZα-HA7导入商业化酵母菌柱GS115(Invitrogen公司)，得到重组工程菌，按照上述四的方法发酵纯化，得到表达H7N9流感血凝素糖蛋白，命名为GS115-H7N9HA。
将GS115-H7N9HA和上述(四)制备的H7N9流感血凝素糖蛋白多聚物纳米颗粒GJK08-H7N9HA，用pH7.4的PBS稀释至15μg/50μl，添加等体积的1.2mg/ml Al(OH)3佐剂(购自GE公司，商品名为Rehydragel@LV)，分别制成流感疫苗，设为对照组和实验组。
每组5只小鼠，每组每只小鼠后腿肌肉注射相应组的注射液100μl。第一次免疫三个星期后采血得血清进行血凝抑制实验，血凝抑制实验的标准血凝素为WHO(世界卫生组织)推荐的英国国立生物标准与参考品研究所NIBSC(National Institute forBiological Standards and Control,a centre of the Medical and Healthcareproducts Regulatory Agency(MHRA),United Kingdom of Great Britain and NorthernIreland，)提供的H7N9流感重配疫苗株(NIBRG-268)的鸡胚培养病毒经1：2000甲醛灭活后制备。H7N9流感重配疫苗株(NIBRG-268)的鸡胚培养病毒经1：2000甲醛灭活后制备的病毒制备标准血凝素、稀释和血凝抑制实验方法见“郭元吉等《流行性感冒病毒及其实验技术》，北京，中国三峡出版社，1997”。
各组小鼠血清中中和抗体的血凝抑制活性结果如图14所示，图14中，纵坐标为血凝抑制效价(HI)，横坐标为分组。图14表明，GS115-H7N9HA的血清几乎没有产生血凝抑制，GJK08-H7N9HA小鼠血清血凝抑制效价均大于1：40，平均血凝抑制效价为1：450。一般认为流感疫苗诱导的血凝抑制效价大于1：40即可为机体提供有效的免疫保护。
因此，用重组酵母制备的H7N9流感血凝素糖蛋白多聚物纳米颗粒可以用于制备流感疫苗。
二、工程酵母制备的H1N1流感血凝素糖蛋白多聚物纳米颗粒
(一)、重组表达载体的构建
重组表达载体pPICZα-HA1为将序列9所示的HA1插入pPICZα载体的NspV和NotI双酶切位点间得到的载体，方法同上述一的(一)。其中，HA1来源于H1N1流感病毒(Influenza A virus(A/California/04/2009(H1N1)))的H1N1流感血凝素糖蛋白编码基因。
序列9中自5’末端起第8至第12位为Kozak序列，第13至第63位为信号肽序列，第64位至第1713位为HA基因，第1588至第1677位为C端穿膜区序列。
(二)、重组酵母的构建和筛选
GJK08/pPICZα-HA1为将重组表达载体pPICZα-HA1转化工程菌GJK08，获得具有血凝活性的破菌液对应的克隆，具体方法同一的(二)。
(三)、工程酵母发酵
同一的(三)，收集匀浆液。
(四)、流感血凝素糖蛋白多聚物纳米颗粒的纯化、鉴定
1、纯化：同一的(四)的1，得到66KD的纯化H1N1流感血凝素糖蛋白；
2、H1N1流感血凝素糖蛋白的结构分析：同一的(四)的2，说明制备的纯化的H1N1流感血凝素糖蛋白是糖蛋白。
3、验证为HA糖蛋白
1)胰蛋白酶切割的HA制备：同一的(四)的3的1)，证明其为流感血凝素糖蛋白。
2)血凝实验：同一的(四)的3的2)，
对H1N1流感血凝素糖蛋白进行鸡红细胞血凝活性分析，结果如图16所示，第二排从左至右为从1：20开始2倍系列稀释的(H1N1)HA，第一排为生理盐水对照，发现H1N1流感血凝素糖蛋白具有良好的血凝活性(图16)。
4、H1N1流感血凝素糖蛋白的分子大小
同一的(四)的4，结果H1N1流感血凝素糖蛋白为三个以上HA0三聚体形成的多聚体，分子量为大于670kD；
将制备的纯化的H1N1流感血凝素糖蛋白负染后用50,000倍电子显微镜照相，结果H1N1流感血凝素糖蛋白多聚物纳米颗粒为至少3个以上血凝素三聚体(此处的血凝素三聚体是指三个HA0单体聚合形成的三聚体)尾部在内聚合，头部向外突出，形成的多聚体颗粒，直径约20-50纳米，将其记为(H1N1)HA；
还原SDS-PAGE分析((H1N1)HA分子量约为66KD(图15，此处的分子量约为66KD的条带是H1N1流感血凝素糖蛋白多聚物纳米颗粒的HA0组分)。
5、H1N1流感血凝素糖蛋白多聚体颗粒GJK08-H1N1HA的N-糖基结构分析
同一的(四)的5，用N-糖苷酶F(PNGF)处理H1N1流感病毒血凝素糖蛋白聚合物(H1N1)HA，发现用PNGF切除糖基后血凝素糖蛋白(H1N1流感血凝素糖蛋白多聚物纳米颗粒的HA0组分)的分子量下降为61kD。
(五)、流感血凝素糖蛋白多聚物纳米颗粒的抗原性
用实施例2的一的(五)相同的方法制备H1N1流感血凝素糖蛋白多聚物纳米颗粒(H1N1)HA流感疫苗、免疫小鼠，并在加强免疫后一个星期采血得血清进行血凝抑制实验，结果如图17所示，图17中，纵坐标为血凝抑制效价(HI)，横坐标为分组，GJK08-HA1为实验组，发现实验组小鼠血清的平均血凝抑制效价达到1:320。
因此，工程酵母制备的H1N1流感血凝素糖蛋白多聚物纳米颗粒(H1N1)HA可以用于制备流感疫苗。
三、工程酵母制备的去除C端穿膜区H7N9流感血凝素糖蛋白
(一)、重组表达载体的构建
重组表达载体pPICZα-HA7-C为将序列8自5’末端第8-1584所示的去除C端穿膜区的HA7插入pPICZα载体的NspV和NotI双酶切位点间得到的载体，方法同上述一的(一)。其中，HA7来源于Genbank(KC853766)(A/Hongzhou/1/2013(H7N9)的H7N9流感血凝素糖蛋白编码基因。
序列8中自5’末端起第8至第12位为Kozak序列，第13至第63位为信号肽序列，第64位至第1584位为HA基因，已去除C端穿膜区序列。
设计并合成如下引物：
HA7-C-3：5’-atcGCGGCCGCttaaacgtctttgtatccagaagac-3’下划线所示序列为NotI酶切识别位点。
HA7-5：5’-ATCTTCGAAACGATGAACACCCAAATACTGGTTTTC-3’下划线所示序列为NspV酶切识别位点。
(二)、重组酵母的构建和筛选
GJK08/pPICZα-HA7-C为将重组表达载体pPICZα-HA7-C转化工程菌GJK08，获得具有阳性表达的克隆，具体方法同一的(二)。
(三)、工程酵母发酵
同一的(三)，收集发酵上清液。
(四)、流感血凝素糖蛋白的纯化、鉴定
1、纯化：同一的(四)的1，得到58KD的纯化H7N9流感血凝素糖蛋白)；
2、H7N9流感血凝素糖蛋白的结构分析：同一的(四)的2，说明制备的纯化的H7N9流感血凝素是糖蛋白。(图18a，第一泳道是marker，第二泳道是HA，第三泳道是PNGF酶切结果
3、血凝实验
方法同前。
血凝活性检测结果如图18b所示。图中，第一排为生理水对照，第二排为1；20开始2倍系列稀释的纯化的H7N9流感血凝素颗粒型糖蛋白，第三排为1；20开始2倍系列稀释的本实施例纯化的H7N9流感血凝素糖蛋白。表明，本实施例可以纯化得到H7N9流感血凝素糖蛋白，但血凝活性非常低，这是因为本实施例纯化的H7N9流感血凝素糖蛋白因缺少C端穿膜区而不能形成三聚体结构，因此没有唾液酸受体结合活性。
四、工程酵母制备的H3N2流感血凝素糖蛋白多聚物纳米颗粒
(一)、重组表达载体的构建
重组表达载体pPICZα-HA3为将序列10所示的HA3插入pPICZα载体的NspV和NotI双酶切位点间得到的载体，方法同上述一的(一)。
其中，HA3来源于H3N2流感病毒(Genbank(A/reassortant/NYMC X-223A(Texas/50/2012x PuertoRico/8/1934)(H3N2))的H3N2流感血凝素糖蛋白编码基因。
序列10中自5’末端起第8位至第12位为Kozak序列、第13至第60位为信号肽序列，第61位至第1713位为HA基因，第1600至第1674位为C端穿膜区序列。
(二)、重组酵母的构建和筛选
GJK08/pPICZα-HA3为将重组表达载体pPICZα-HA3转化工程菌GJK08，获得具有血凝活性的破菌液对应的克隆，具体方法同一的(二)。
(三)、工程酵母发酵
同一的(三)，收集匀浆液。
(四)、流感血凝素糖蛋白多聚物纳米颗粒的纯化、鉴定
1、纯化：同一的(四)的1，得到66KD的纯化H3N2流感血凝素糖蛋白；
2、H3N2流感血凝素糖蛋白的结构分析：同一的(四)的2，说明制备的纯化的H3N2流感血凝素糖蛋白是糖蛋白。
3、验证为HA糖蛋白
1)胰蛋白酶切割的HA制备：同一的(四)的3的1)，证明其为流感血凝素糖蛋白。
2)血凝实验：同一的(四)的3的2)，
对H3N2流感血凝素糖蛋白进行鸡红细胞血凝活性分析，结果如图20所示，第二排从左至右为从1：20开始2倍系列稀释的(H3N2)HA，第一排为生理盐水对照，发现H3N2流感血凝素糖蛋白具有良好的血凝活性。
4、H3N2流感血凝素糖蛋白的分子大小
同一的(四)的4，结果H3N3流感血凝素糖蛋白为三个以上HA0三聚体形成的多聚体，分子量为大于670kD；
将制备的纯化的H3N2流感血凝素糖蛋白负染后用50,000倍电子显微镜照相，结果H3N2流感血凝素糖蛋白多聚物纳米颗粒为至少3个以上血凝素三聚体(此处的血凝素三聚体是指三个HA0单体聚合形成的三聚体)尾部在内聚合，头部向外突出，形成的多聚体颗粒，直径约20-50纳米，将其记为(H3N2)HA。
还原SDS-PAGE分析((H3N2)HA分子量约为66KD，为H3N2流感血凝素糖蛋白多聚物纳米颗粒的HA0组分(图19)。
5、H3N2流感血凝素糖蛋白多聚体颗粒GJK08-H3N2HA的N-糖基结构分析
同一的(四)的5，用N-糖苷酶F(PNGF)处理H3N2流感病毒血凝素糖蛋白聚合物(H3N2)HA，发现用PNGF切除糖基后血凝素糖蛋白(H3N2流感血凝素糖蛋白多聚物纳米颗粒的HA0组分)的分子量下降为61kD。
(五)、流感血凝素糖蛋白多聚物纳米颗粒的抗原性
用实施例2的一的(五)相同的方法制备H3N2流感血凝素糖蛋白多聚物纳米颗粒(H3N2)HA流感疫苗、免疫小鼠，并在加强免疫后一个星期采血得血清进行血凝抑制实验，结果如图21所示，图21中，纵坐标为血凝抑制效价(HI)，横坐标为分组，HA3为实验组，发现实验组小鼠血清的平均血凝抑制效价达到1:320。
因此，工程酵母制备的H3N2流感血凝素糖蛋白多聚物纳米颗粒(H3N2)HA可以用于制备流感疫苗。
五、工程酵母制备的H5N1流感血凝素糖蛋白多聚物纳米颗粒
(一)、重组表达载体的构建
重组表达载体pPICZα-HA5为将序列11所示的HA5插入pPICZα载体的NspV和NotI双酶切位点间得到的载体，方法同上述一的(一)。
其中，HA5来源于H5N1流感病毒(Genbank(EU263353.1)(A/duck/Guangxi/27/2003(H5N1)))的H5N1流感血凝素糖蛋白编码基因。
序列11中自5’末端起第8至第12位为Kozak序列，第13至第60位为信号肽序列，第61至第1719位为HA基因，第1609至第1685位为C端穿膜区序列。
(二)、重组酵母的构建和筛选
GJK08/pPICZα-HA5为将重组表达载体pPICZα-HA5转化工程菌GJK08，获得具有血凝活性的破菌液对应的克隆，具体方法同一的(二)。
(三)、工程酵母发酵
同一的(三)，收集匀浆液。
(四)、流感血凝素糖蛋白多聚物纳米颗粒的纯化、鉴定
1、纯化：同一的(四)的1，得到约60KD的纯化H5N1流感血凝素糖蛋白；
2、H5N1流感血凝素糖蛋白的结构分析：同一的(四)的2，说明制备的纯化的H5N1流感血凝素糖蛋白是糖蛋白。
3、验证为HA糖蛋白
1)胰蛋白酶切割的HA制备：同一的(四)的3的1)，证明其为流感血凝素糖蛋白。
2)血凝实验：同一的(四)的3的2)，
对H5N1流感血凝素糖蛋白进行鸡红细胞血凝活性分析，结果如图22所示，第二排从左至右为从1：20开始2倍系列稀释的(H5N1)HA，第一排为生理盐水对照，发现H5N1流感血凝素糖蛋白具有良好的血凝活性。
4、H5N1流感血凝素糖蛋白的分子大小
同一的(四)的4，结果H5N1流感血凝素糖蛋白为三个以上HA0三聚体形成的多聚体，分子量大于670kD；
将制备的纯化的H5N1流感血凝素糖蛋白负染后用50,000倍电子显微镜照相，结果如图23，H5N1流感血凝素糖蛋白多聚物纳米颗粒为至少3个以上血凝素三聚体(此处的血凝素三聚体是指三个HA0单体聚合形成的三聚体)尾部在内聚合，头部向外突出，形成的多聚体颗粒，直径约20-50纳米，将其记为(H5N1)HA。
还原SDS-PAGE分析((H5N1)HA分子量约为66KD(图24，此处的分子量约为66KD的条带是H5N1流感血凝素糖蛋白多聚物纳米颗粒的HA0组分。
5、H5N1流感血凝素糖蛋白多聚体颗粒GJK08-H5N1HA的N-糖基结构分析
同一的(四)的5，用N-糖苷酶F(PNGF)处理H5N1流感病毒血凝素糖蛋白聚合物(H5N1)HA，发现用PNGF切除糖基后血凝素糖蛋白(H5N1流感血凝素糖蛋白多聚物纳米颗粒的HA0组分)的分子量下降为61kD。
(五)、流感血凝素糖蛋白多聚物纳米颗粒的抗原性
用实施例2的一的(五)相同的方法制备H5N1流感血凝素糖蛋白多聚物纳米颗粒(H5N1)HA流感疫苗、免疫小鼠，并在加强免疫后一个星期采血得血清进行血凝抑制实验，结果如图25所示，图25中，纵坐标为血凝抑制效价(HI)，横坐标为分组，GJK08-HA5为实验组，发现实验组小鼠血清的平均血凝抑制效价达到1：300。
因此，工程酵母制备的H5N1流感血凝素糖蛋白多聚物纳米颗粒(H5N1)HA可以用于制备流感疫苗。
实施例3、制备具有GlcNAC2Man3GlcNAC2的糖基结构修饰的H7N9流感病毒血凝素糖蛋白多聚物纳米颗粒
一、工程酵母制备的H7N9流感血凝素糖蛋白多聚物纳米颗粒
(一)、重组表达载体的构建：与实施例2的一相同；
(二)、重组酵母的构建和筛选：
将重组载体pPICZα-HA7用实施例2的(二)的方法导入实施例1的(四)构建的毕赤酵母工程菌株GJK07，得到重组菌GJK07//pPICZα-HA7。
筛选和鉴定方法同实施例2的(二)。
(三)、工程酵母发酵
重组菌GJK07/pPICZα-HA7按照实施例2的(三)的方法发酵，得到匀浆液。
(四)、流感血凝素糖蛋白多聚物纳米颗粒的纯化、鉴定
上述三得到的匀浆液按照实施例2的(四)的方法纯化，得到流感血凝素糖蛋白多聚物纳米颗粒GJK07-H7N9HA。
将流感血凝素糖蛋白多聚物纳米颗粒进行N-糖基结构分析，方法同上。
结果如图26所示，表明GJK07表达的糖蛋白HA的糖链主要为GlcNAc2Man3GlcNAc2结构(其中Man:甘露糖；GlcNAc：N-乙酰葡萄糖胺，简写为GlcNAc2M3)。表明了工程酵母表达的HA的糖基结构已经成为哺乳动物的甘露糖型结构，而酵母不具有这种糖基结构。
为了分析制备的纯化的H7N9流感血凝素糖蛋白的分子大小，对其进行SEC(分子排阻凝胶色谱)分析，
结果如图27所示，图为纯化的H7N9流感血凝素糖蛋白的色谱图，纯化的H7N9流感血凝素糖蛋白在该条件分析下，保留时间约为16min,与标准蛋白相比，说明其分子量明显大于670KD，由于HA0单体的分子量为66KD，其三聚体的分子量约为180KD，说明纯化的H7N9流感血凝素糖蛋白为含9个以上，HA0单体形成的多聚体，而上述胰蛋白酶切割实验和血凝实验均表明纯化的H7N9流感血凝素糖蛋白具有流感血凝素的三聚体高级结构，因此，该纯化的H7N9流感血凝素糖蛋白为三个以上HA0三聚体形成的多聚体。
(五)、流感血凝素糖蛋白多聚物纳米颗粒的抗原性
将GS115-H7N9HA和本实施例制备的H7N9流感血凝素糖蛋白多聚物纳米颗粒GJK07-H7N9HA作为对照组和实验组，每组5只小鼠，每组每只小鼠后腿肌肉注射相应组的注射液100μl。第一次免疫三个星期后采血得血清进行血凝抑制实验。
各组小鼠血清中中和抗体的血凝抑制活性结果如图28所示，图中，纵坐标为血凝抑制效价(HI)，横坐标为分组。表明，对照组GS115-H7N9HA小鼠的血清没有产生血凝抑制，实验组GJK07-H7N9HA小鼠血清血凝抑制效价均大于1：40，平均血凝抑制效价为1：400。一般认为流感疫苗诱导的血凝抑制效价大于1：40即可为机体提供有效的免疫保护。因此，用重组酵母制备的H7N9流感血凝素糖蛋白多聚物纳米颗粒可以用于制备流感疫苗。
实施例4、制备具有Man5GlcNAC2的糖基结构修饰的H7N9流感病毒血凝素糖蛋白多聚物纳米颗粒
一、工程酵母制备的H7N9流感血凝素糖蛋白多聚物纳米颗粒
(一)、重组表达载体的构建：与实施例2的一相同；
(二)、重组酵母的构建和筛选：
将重组载体pPICZα-HA7用实施例2的(二)的方法导入实施例1的(二)构建的毕赤酵母工程菌株GJK05，得到重组菌GJK05//pPICZα-HA7。
筛选和鉴定方法同实施例2的(二)。
(三)、工程酵母发酵
重组菌GJK05//pPICZα-HA7按照实施例2的(三)的方法发酵，得到匀浆液。
(四)、流感血凝素糖蛋白多聚物纳米颗粒的纯化、鉴定
上述三得到的匀浆液按照实施例2的(四)的方法纯化，得到流感血凝素糖蛋白多聚物纳米颗粒GJK05-H7N9HA。
将流感血凝素糖蛋白多聚物纳米颗粒进行N-糖基结构分析，方法同上。
结果如图29所示，表明GJK05表达的糖蛋白HA的糖链主要为Man5GlcNAc2结构(其中Man:甘露糖；GlcNAc：N-乙酰葡萄糖胺)。表明了工程酵母表达的HA的糖基结构已经成为哺乳动物的甘露糖型结构，而酵母不具有这种糖基结构。
为了分析制备的纯化的H7N9流感血凝素糖蛋白的分子大小，对其进行SEC(分子排阻凝胶色谱)分析，
结果如图30所示，图为纯化的H7N9流感血凝素糖蛋白的色谱图，纯化的H7N9流感血凝素糖蛋白在该条件分析下，保留时间约为16min,与标准蛋白相比，说明其分子量明显大于670KD，由于HA0单体的分子量为66KD，其三聚体的分子量约为180KD，说明纯化的H7N9流感血凝素糖蛋白为含9个以上，HA0单体形成的多聚体，而上述胰蛋白酶切割实验和血凝实验均表明纯化的H7N9流感血凝素糖蛋白具有流感血凝素的三聚体高级结构，因此，该纯化的H7N9流感血凝素糖蛋白为三个以上HA0三聚体形成的多聚体。
(五)、流感血凝素糖蛋白多聚物纳米颗粒的抗原性
将GS115-H7N9HA和本实施例制备的H7N9流感血凝素糖蛋白多聚物纳米颗粒GJK05-H7N9HA作为对照组和实验组，每组5只小鼠，每组每只小鼠后腿肌肉注射相应组的注射液100μl。第一次免疫三个星期后采血得血清进行血凝抑制实验。
各组小鼠血清中中和抗体的血凝抑制活性结果如图31所示，图中，纵坐标为血凝抑制效价(HI)，横坐标为分组。图表明，对照组小鼠的血清没有产生血凝抑制，实验组小鼠血清血凝抑制效价均大于1：40，平均血凝抑制效价为1：320。一般认为流感疫苗诱导的血凝抑制效价大于1：40即可为机体提供有效的免疫保护。因此，用重组酵母制备的H7N9流感血凝素糖蛋白多聚物纳米颗粒可以用于制备流感疫苗。
实施例5、制备具有Man8-9GlcNAC2的糖基结构修饰的H7N9流感病毒血凝素糖蛋白多聚物纳米颗粒
一、工程酵母制备的H7N9流感血凝素糖蛋白多聚物纳米颗粒
(一)、重组表达载体的构建：与实施例2的一相同；
(二)、重组酵母的构建和筛选：
将重组载体pPICZα-HA7用实施例2的(二)的方法导入实施例1的(一)构建的毕赤酵母工程菌株GJK04，得到重组菌GJK04//pPICZα-HA7。
筛选和鉴定方法同实施例2的(二)。
(三)、工程酵母发酵
重组菌GJK04//pPICZα-HA7按照实施例2的(三)的方法发酵，得到匀浆液。
(四)、流感血凝素糖蛋白多聚物纳米颗粒的纯化、鉴定
上述三得到的匀浆液按照实施例2的(四)的方法纯化，得到流感血凝素糖蛋白多聚物纳米颗粒GJK04-H7N9HA。
将流感血凝素糖蛋白多聚物纳米颗粒进行N-糖基结构分析，方法同上。
N-糖基结构分析结果如图32所示，表明GJK04表达的糖蛋白HA的糖链主要为Man8- 9GlcNAc2结构(其中Man:甘露糖；GlcNAc：N-乙酰葡萄糖胺)。表明了工程酵母表达的HA的糖基结构已经不是酵母通常所具有的高甘露糖型糖基结构。
为了分析制备的纯化的H7N9流感血凝素糖蛋白的分子大小，对其进行SEC(分子排阻凝胶色谱)分析，
结果如图33所示，图为纯化的H7N9流感血凝素糖蛋白的色谱图，纯化的H7N9流感血凝素糖蛋白在该条件分析下，保留时间约为16min,与标准蛋白相比，说明其分子量明显大于670KD，由于HA0单体的分子量为66KD，其三聚体的分子量约为180KD，说明纯化的H7N9流感血凝素糖蛋白为含9个以上，HA0单体形成的多聚体，而上述胰蛋白酶切割实验和血凝实验均表明纯化的H7N9流感血凝素糖蛋白具有流感血凝素的三聚体高级结构，因此，该纯化的H7N9流感血凝素糖蛋白为三个以上HA0三聚体形成的多聚体。
(五)、流感血凝素糖蛋白多聚物纳米颗粒的抗原性
将GS115-H7N9HA和本实施例制备的H7N9流感血凝素糖蛋白多聚物纳米颗粒GJK04-H7N9HA作为对照组和实验组，每组5只小鼠，每组每只小鼠后腿肌肉注射相应组的注射液100μl。第一次免疫三个星期后采血得血清进行血凝抑制实验。
各组小鼠血清中中和抗体的血凝抑制活性结果如图34所示。图中，纵坐标为血凝抑制效价(HI)，横坐标为分组，。图表明，对照组GS115-H7N9HA小鼠的血清没有产生血凝抑制，实验组GJK04-H7N9HA小鼠血清血凝抑制效价均大于1：40，平均血凝抑制效价为1：280。一般认为流感疫苗诱导的血凝抑制效价大于1：40即可为机体提供有效的免疫保护。因此，用重组酵母制备的H7N9流感血凝素糖蛋白多聚物纳米颗粒可以用于制备流感疫苗。
与普通酵母表达的高甘露糖基化流感血凝素相比，具有动物细胞Man5GlcNAC2-且无岩藻糖的N-糖基结构修饰的流感血凝素糖蛋白在小鼠中诱导更高的中和抗体。
实施例6、制备具有GlcNAC2Man3GlcNAC2的糖基结构修饰的H7N9流感病毒血凝素糖蛋白多聚物纳米颗粒
一、工程酵母制备的H7N9流感血凝素糖蛋白多聚物纳米颗粒
(一)、重组表达载体的构建：与实施例2的一相同；
(二)、重组酵母GJK14的构建：即具有哺乳动物GlcNAc2Man3GlcNAc2且无岩藻糖糖基化结构的糖基工程酵母菌株构建，与实施例1的(四)构建略有不同。该重组菌GJK014的构建过程是：1)磷酸甘露糖转移酶基因PNO1灭活的酵母菌株为将序列1所示的DNA分子导入毕赤酵母GJK01中，与GJK01基因组中的同源序列发生同源重组，敲除酵母基因组中的磷酸甘露糖转移酶基因得到的酵母GJK02；2)将C端融合HDEL序列的MDSI(序列4)插入宿主菌GJK02的基因组中，得到的工程菌GJK12，其具有哺乳动物Man5GlcNAc2且无岩藻糖糖基化结构；3)将序列5所示的含mnn9定位信号的N-乙酰葡萄糖胺转移酶I(GnTI)的DNA片段插入宿主菌GJK12基因组中，得到的工程菌GJK13，其具有哺乳动物GlcNAcMan5GlcNAc2且无岩藻糖糖基化结构；4)进一步将序列6所示的GnTII-MDSII串联DNA分子插入宿主菌GJK13的基因组中，得到的工程菌GJK14，其具有哺乳动物GlcNAc2Man3GlcNAc2且无岩藻糖糖基化结构。
所有构建方法、步骤同实施例1。
将重组载体pPICZα-HA7用实施例2的(二)的方法导入本实施例构建的毕赤酵母工程菌株GJK14，即得到重组菌GJK14//pPICZα-HA7。
筛选和鉴定方法同实施例2的(二)。
(三)、工程酵母发酵
重组菌GJK14/pPICZα-HA7按照实施例2的(三)的方法发酵，得到匀浆液。
(四)、流感血凝素糖蛋白多聚物纳米颗粒的纯化、鉴定
上述三得到的匀浆液按照实施例2的(四)的方法纯化，得到流感血凝素糖蛋白多聚物纳米颗粒GJK14-H7N9HA。
将流感血凝素糖蛋白多聚物纳米颗粒进行N-糖基结构分析，方法同上,结果表明GJK14表达的糖蛋白HA的糖链主要为GlcNAc2Man3GlcNAc2结构，但同时存在Man5GlcNAc2结构，表明了工程酵母表达的HA的糖基结构基本已经成为哺乳动物的甘露糖型结构。
为了分析制备的纯化的H7N9流感血凝素糖蛋白的分子大小，对其进行SEC(分子排阻凝胶色谱)分析，结果如图35所示，图为纯化的H7N9流感血凝素糖蛋白的色谱图，纯化的H7N9流感血凝素糖蛋白在该条件分析下，保留时间约为16.9min,与标准蛋白相比，说明其分子量明显大于670KD，由于HA0单体的分子量为66KD，其三聚体的分子量约为180KD，说明纯化的H7N9流感血凝素糖蛋白为含9个以上，HA0单体形成的多聚体，同时胰蛋白酶切割实验和血凝实验均表明纯化的H7N9流感血凝素糖蛋白具有流感血凝素的三聚体高级结构，因此，该纯化的H7N9流感血凝素糖蛋白为三个以上HA0三聚体形成的多聚体。
(五)、流感血凝素糖蛋白多聚物纳米颗粒的抗原性
将GS115-H7N9HA和本实施例制备的H7N9流感血凝素糖蛋白多聚物纳米颗粒GJK14-H7N9HA作为对照组和实验组，每组5只小鼠，每组每只小鼠后腿肌肉注射相应组的注射液100μl。第一次免疫三个星期后采血得血清进行血凝抑制实验。
各组小鼠血清中中和抗体的血凝抑制活性结果如图36所示，图中，纵坐标为血凝抑制效价(HI)，横坐标为分组。表明，对照组GS115-H7N9HA小鼠的血清没有产生血凝抑制，实验组GJK14-H7N9HA小鼠血清血凝抑制效价均大于1：40，平均血凝抑制效价为1：320。一般认为流感疫苗诱导的血凝抑制效价大于1：40即可为机体提供有效的免疫保护。因此，用重组酵母GJK14制备的H7N9流感血凝素糖蛋白多聚物纳米颗粒可以用于制备流感疫苗。

Claims (6)

1.一种制备具有哺乳动物糖型结构且无岩藻糖的流感病毒血凝素糖蛋白的方法，包括如下步骤：使流感病毒的血凝素HA基因在酵母突变体中表达，得到重组酵母；将所述重组酵母培养，制备得到具有哺乳动物糖型结构且无岩藻糖的流感病毒血凝素糖蛋白；
所述哺乳动物糖型结构的糖链为Man5GlcNAc2、GlcNAcMan5GlcNAc2、GlcNAc2Man3GlcNAc2或Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2；
所述酵母突变体按照如下方法制备：阻断目的酵母中的甘露糖基化修饰途径，且在所述目的酵母中重构哺乳动物细胞糖基化修饰途径，得到酵母突变体；
所述流感病毒的血凝素HA基因包含N端上游信号肽编码基因和C-端穿膜区编码基因；
所述流感病毒的血凝素HA基因通过重组表达载体转化酵母突变体；
所述重组表达载体是将含有N端上游信号肽编码基因和C-端穿膜区编码基因的流感病毒的血凝素HA基因插入表达载体得到的载体；
所述具有哺乳动物糖型结构且无岩藻糖的流感病毒血凝素糖蛋白为流感病毒血凝素糖蛋白聚合物纳米颗粒，其分子量大于670KD。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述阻断目的酵母原有的甘露糖基化修饰途径为失活所述目的酵母中的磷酸甘露糖转移酶、磷酸甘露糖合成酶和β甘露糖转移酶中至少一种；
所述目的酵母为灭活α-1,6-甘露糖转移酶基因的酵母；
所述重构哺乳动物细胞糖基化修饰途径为表达外源甘露糖苷酶I、外源N-乙酰葡萄糖胺转移酶I、外源甘露糖苷酶II、外源N-乙酰葡萄糖胺转移酶II、外源半乳糖异构酶GalE和/或外源半乳糖转移酶GalT。
3.根据权利要求1或2方法，其特征在于：所述酵母突变体的制备方法为如下1）-4）中任一种：
1）失活所述目的酵母中的磷酸甘露糖转移酶、磷酸甘露糖合成酶和β甘露糖转移酶，且表达外源甘露糖苷酶I、外源N-乙酰葡萄糖胺转移酶I、外源甘露糖苷酶II、外源N-乙酰葡萄糖胺转移酶II、外源半乳糖异构酶GalE和外源半乳糖转移酶GalT，得到具有哺乳动物Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2且无岩藻糖糖基化结构的糖基工程酵母菌株；
2）失活所述目的酵母中的磷酸甘露糖转移酶、磷酸甘露糖合成酶和β甘露糖转移酶，且表达外源甘露糖苷酶I、外源N-乙酰葡萄糖胺转移酶I、外源甘露糖苷酶II和外源N-乙酰葡萄糖胺转移酶II，得到具有哺乳动物GlcNAc2Man3GlcNAc2且无岩藻糖糖基化结构的糖基工程酵母菌株；
3）失活所述目的酵母中的磷酸甘露糖转移酶、磷酸甘露糖合成酶和β甘露糖转移酶，且表达外源甘露糖苷酶I和外源N-乙酰葡萄糖胺转移酶I，得到具有哺乳动物GlcNAcMan5GlcNAc2且无岩藻糖糖基化结构的糖基工程酵母菌株；
4）失活所述目的酵母中的磷酸甘露糖转移酶、磷酸甘露糖合成酶和β甘露糖转移酶，且表达外源甘露糖苷酶I，得到具有哺乳动物Man5GlcNAc2且无岩藻糖糖基化结构的糖基工程酵母菌株。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：
所述失活所述目的酵母基因组DNA中的磷酸甘露糖转移酶基因和/或磷酸甘露糖合成酶基因和/或β甘露糖转移酶基因采用同源重组的方式进行；
所述外源甘露糖苷酶I来源于绿色木霉，且C端融合内质网保留信号HDEL；
所述外源N-乙酰葡萄糖胺转移酶I来源于人，且含有mnn9定位信号；
所述甘露糖苷酶II来源于线虫，所述N-乙酰葡萄糖胺转移酶II来源于人，且均含有mnn2定位信号；
所述半乳糖异构酶GalE和所述半乳糖转移酶GalT均来源于人，且共有一个kre2定位信号。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：
所述流感病毒的血凝素HA为H1、H3、H5 或H7血清型流感病毒的HA；
所述H1、H3、H5 或H7血清型流感病毒的HA分别为H1N1、H3N2、H5N1或H7N9流感病毒的HA；
所述酵母为毕赤酵母、汉逊酵母或乳酸克鲁维酵母。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：
在所述培养的步骤后，还包括如下步骤：将培养后的产物进行细胞破碎，加入去污剂，获得含流感病毒血凝素糖蛋白的溶液；将所述溶液进行纯化，制备得到具有血凝活性的具有哺乳动物糖型结构且无岩藻糖流感病毒血凝素糖蛋白；
所述细胞破碎的方法为物理方法、生物方法或化学方法；
所述物理方法为玻璃珠振荡法、高压匀浆法或球磨法；
所述生物方法为酶裂解法；
所述化学方法为碱裂解法；
所述去污剂为非离子型去污剂或弱离子型去污剂；
所述非离子型去污剂为曲拉通、吐温或乙基苯基聚乙二醇；
所述弱离子型去污剂为脱氧胆酸盐或3-[(3-胆酰胺基丙基)二甲基铵基]-1-丙磺酸盐；
所述将所述溶液进行纯化的方法包括阳离子交换层析和/或阴离子交换层析和/或凝胶排阻层析；
所述阳离子交换层析的填料为Sepharose FF SP。
CN201410668305.XA 2014-11-20 2014-11-20 用糖基工程酵母制备具有动物细胞糖基化修饰流感血凝素糖蛋白的方法 Active CN105671109B (zh)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410668305.XA CN105671109B (zh) 2014-11-20 2014-11-20 用糖基工程酵母制备具有动物细胞糖基化修饰流感血凝素糖蛋白的方法
PCT/CN2015/088745 WO2016078466A1 (zh) 2014-11-20 2015-09-01 用糖基工程酵母制备具有动物细胞糖基化修饰流感血凝素糖蛋白的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410668305.XA CN105671109B (zh) 2014-11-20 2014-11-20 用糖基工程酵母制备具有动物细胞糖基化修饰流感血凝素糖蛋白的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105671109A CN105671109A (zh) 2016-06-15
CN105671109B true CN105671109B (zh) 2019-08-23

Family

ID=56013256

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201410668305.XA Active CN105671109B (zh) 2014-11-20 2014-11-20 用糖基工程酵母制备具有动物细胞糖基化修饰流感血凝素糖蛋白的方法

Country Status (2)

Country Link
CN (1) CN105671109B (zh)
WO (1) WO2016078466A1 (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106868025B (zh) * 2017-03-13 2020-01-21 中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所 用酵母制备三聚体埃博拉病毒糖蛋白突变体的方法
CN113549560B (zh) * 2020-04-24 2024-02-13 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 一种用于糖蛋白制备的工程化酵母构建方法及其菌株
CN113754739B (zh) * 2020-06-03 2024-07-05 上海君实生物医药科技股份有限公司 一种冠状病毒s蛋白rbd糖蛋白的制备方法及其应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101195809A (zh) * 2006-12-07 2008-06-11 中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所 α-1,6-甘露糖转移酶缺失的毕赤酵母菌株及其构建方法
CN102112150A (zh) * 2008-05-30 2011-06-29 格利科菲公司 用于生产具有末端α-1,3-连接的半乳糖的蛋白质的酵母菌株

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SG176251A1 (en) * 2009-06-02 2011-12-29 Regeneron Pharma Fucosylation-deficient cells

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101195809A (zh) * 2006-12-07 2008-06-11 中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所 α-1,6-甘露糖转移酶缺失的毕赤酵母菌株及其构建方法
CN102112150A (zh) * 2008-05-30 2011-06-29 格利科菲公司 用于生产具有末端α-1,3-连接的半乳糖的蛋白质的酵母菌株

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
N-糖基工程研究进展;吴军等;《生物产业技术》;20090731(第4期);第2.2节、第2.3节、第2.4节及图2 *
Produciton of Human Compatible High Mannose-type (Man5GlcNAc2)Sugar Chains in Saccharomyces cerevisiae;Yasunori Chiba等;《The Journal of Biological Chemistry》;19981009;第273卷(第41期);第26298-26304页 *

Also Published As

Publication number Publication date
WO2016078466A1 (zh) 2016-05-26
CN105671109A (zh) 2016-06-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2021244255A1 (zh) 一种冠状病毒s蛋白rbd糖蛋白的制备方法及其应用
CN102822343B (zh) 微藻中异源多肽的生产，微藻胞外体、组合物及其制备方法和用途
Ravin et al. Plant-produced recombinant influenza vaccine based on virus-like HBc particles carrying an extracellular domain of M2 protein
TWI232238B (en) Novel yeast mutant strains and method for preparing glycoprotein with mammalian-typed sugar chains
JP6017439B2 (ja) Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ活性を有する融合酵素
CN104195166B (zh) 植物通过表达非哺乳动物糖基转移酶而表现出哺乳动物类型的糖基化作用
Kainz et al. N-glycan modification in Aspergillus species
CN101679991A (zh) 用于产生同质糖蛋白的遗传改良酵母
CN105671109B (zh) 用糖基工程酵母制备具有动物细胞糖基化修饰流感血凝素糖蛋白的方法
US20050260627A1 (en) Mannosidases and methods for using same
US20200399649A1 (en) Organisms and methods for producing glycomolecules with low sulfation
WO2021213489A1 (zh) 一种用于糖蛋白制备的工程化酵母构建方法及其菌株
CN108265065A (zh) 一种重组黄花蒿1类变应原蛋白及其应用
CN113797326B (zh) 一种预防冠状病毒引起疾病的疫苗
CN105233302B (zh) 一种流感血凝素糖蛋白多聚物纳米颗粒的制备方法
US20210189002A1 (en) Recombinant organisms and methods for producing glycomolecules with high glycan occupancy
CN113817040A (zh) 一种细粒棘球蚴重组蛋白及其制备方法
CN104877979B (zh) 一种元基因组来源的β‑甘露聚糖酶、其编码基因及其表达
WO2019213069A1 (en) Recombinant organisms and methods for producing glycomolecules with low sulfation
CN109337882A (zh) 一种α-1,2-岩藻糖基转移酶及制备人乳寡糖中的应用
WO2019089077A1 (en) Expression of modified glycoproteins and glycopeptides
EA031404B1 (ru) Вакцина для профилактики и лечения ротавирусной инфекции, содержащая гибридный белок в качестве активного агента (варианты)
Valdés et al. Expression in Pichia pastoris and immunological evaluation of a truncated Dengue envelope protein
KR102171224B1 (ko) 이눌린 과당전이효소 활성이 도입된 효모 및 이를 이용한 디프럭토스 언하이드리드 iii 및 프럭토올리고당의 생산방법
CN110938612A (zh) 利用生物酶制备薯蓣皂苷元的方法及其所用生物材料

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant