CN101679991A - 用于产生同质糖蛋白的遗传改良酵母 - Google Patents

用于产生同质糖蛋白的遗传改良酵母 Download PDF

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Abstract

本发明涉及用于产生具有优化的和同质聚糖结构的糖蛋白的遗传改良酵母。这些酵母包括：Och1基因的失活；通过同源重组将含有第一启动子，和含有α－1，2－甘露糖苷酶I的编码序列的开放阅读框的表达盒整合到营养缺陷标记中；以及整合含有与所述第一启动子不同的第二启动子和外源糖蛋白的编码序列的盒。这些酵母使得产生具有优化的和98％同质糖基化的EPO成为可能。

Description

用于产生同质糖蛋白的遗传改良酵母
本发明涉及用于产生具有优化和同质聚糖结构的糖蛋白的遗传改良酵母。这些酵母包括：Och1基因的失活；通过同源重组整合含有第一启动子，和含有α-1-2甘露糖苷酶I的编码序列的开放阅读框的表达盒到营养缺陷标记中；以及含有不同于第一启动子的第二启动子和外源糖蛋白的编码序列的盒的整合。这些酵母允许产生优化和同质的98％糖基化的EPO。
具有复合体型的聚糖的糖蛋白或糖肽类的产生，即与人类中的翻译后修饰加入的低聚糖相同的结构，已经是在制药业中被寻求了相当多年的目标。事实上，许多研究已经表明低聚糖对于优化治疗性糖蛋白的活性或一旦其被使用进一步改善其半衰期的重要性。
例如，人类促红细胞生成素(HuEPO)是在Asn-24，Asn-38和Asn-83上含有三个N-糖基化位点和在Ser-126位点上有粘蛋白型的O-糖基化位点的一个166个氨基酸的糖蛋白。EPO是一个研究N-糖基化显著相关的模型，因为其糖基化结构代表其40％的分子量。被认为是天然的EPO分子是尿的形式(uHuEPO)(Takeuchi等人，1988，Tusda1988，Rahbeck-nielsen 1997)。重组EPO(rHuEPO)目前是在CHO细胞中(Sasaki H等人，Takeuchi等人，1988)或在BHK细胞中(Nimtz等人，1993)产生的。在细胞系中表达的rHuEPO具有不同于在uHuEPO中发现的结构的N-聚糖结构。这些差别可以在体外有作用(Higuchi等人.，1992；Takeuchi等人，1990)，但是通过去糖基化形式的严重失活和通过与结构中存在的唾液酸的数目相关的活性增加，在体内似乎更敏感(Higuchi M等人，1992)。
为了产生具有优化的N-或O-糖基化的糖蛋白，提出了许多技术解决方案。可以提到的是通过不同的糖基转移酶加入糖，例如半乳糖、葡萄糖、果糖或甚至是唾液酸，或者通过抑制某种糖，例如用甘露糖苷酶抑制甘露糖在体外修饰聚糖结构。这一技术在WO 03/031464(Neose)中有描述。但是可以令人怀疑的是如何大规模使用这一技术，因为其涉及对存在于同一糖蛋白上的几个特定低聚糖的顺序修饰的许多步骤。在每一步骤中，应该实现反应的严格控制，并且应该保证同质聚糖结构的产生。现在当不得不在一个糖蛋白上修饰许多低聚糖的情况下，顺序的反应可以造成不合需要的和异质的修饰。因此，这一技术和生物药的制备不相容。另外，生产用纯化酶的工业规模使用似乎不代表可行的经济选择。
同样适用于化学耦合技术，例如在WO 2006/106348和WO2005/000862文件中描述的那些技术。这些化学耦合技术包括单调冗长的反应，保护/去保护步骤、多重检查。当不得不在特定的糖蛋白上修饰许多低聚糖的情况下，顺序反应也可以造成不合需要的和异质的修饰。
应用哺乳动物细胞系，例如在WO 01/77181(LFB)中描述的YB2/0或进一步在WO 03/055993(Kyowa)中经遗传修饰的CHO细胞系的其它技术已经证明抗体的Fc区域的轻度岩藻糖基化增加ADCC活性100倍。但是，这些技术特定地与抗体的产生相关。
最后，已经建议过通过用允许表达甘露糖苷酶和不同的糖基转移酶的质粒转化这些微生物而在酵母或丝状真菌中产生糖蛋白。这一方法在WO 02/00879(Glycofi)中有描述。但是直到现在，还没有证明这些微生物在生产临床批量用的高容量的发酵罐中是随时间稳定的。另外，也没有证明这种转化可以产生具有所需的和同质聚糖的糖蛋白。
为了产生具有N-聚糖结构的rHuEPO的目的(具有这种结构可以在体内获得最佳活性)，我们在遗传改良的酿酒酵母(S.cerevisiae)和栗酒裂殖酵母(S.pombe)中表达rHuEPO。这些酵母表现出具有同质的和被很好研究了特征的N-糖基化单位的rHuEPO的强表达。在第二阶段，根据其唾液酸化的水平，我们从遗传改良酵母开始并且引入了其它改良以便产生更复杂的N-聚糖单位。已知酵母系统具有快速产生大量蛋白的能力，但是此后描述的改良酵母也对产生的蛋白有以“人源化”(humanized)和同质的方式进行N-糖基化的能力。另外，发现这些酵母在大规模的生产条件下是稳定的。最后，在引起基因型回复的突变情况下，这些酵母被建立为可以被同一地恢复，这在生产临床用批量的范围内是必须的。
因此，这是说明在整个发明中使用的靶向整合方法(特定是位点的)的第一个例子，该方法允许控制被打乱的和被选择的基因组区域到一个核苷酸范围内，并且因此允许在自发的基因组回复的情况下恢复打乱。该方法应该与WO 02/00879中描述的方法是相反的，其方法为用一个序列库转化酵母菌株并且随后无需任何基因组鉴定而选择最佳克隆。
事实上，在WO 02/00879中整合是随机的并且克隆以所产生蛋白的N-聚糖结构的轮廓为基础被专一地选择，其包括，在突变、回复或任何其它遗传改良的情况下，单纯地和简单地丢失感兴趣的克隆。根据本发明所述技术的优点是通过给他/她提供控制、追踪遗传改良的保证，并且特别是重建严格具有同样容量的克隆的可能性，给使用者提供增加的安全性。
另外，我们首次提供了来自此后描述的Amélie菌株的“按要求的聚糖”技术。在这些条件下，结构的同质性比在糖基化像哺乳动物的CHO系统中更重要。事实上，获得的结果(见EPO光谱)报道了代表出现在蛋白上约98％的N-聚糖的Man5GlcNAc2型聚糖结构。因此为加强糖基化设计了该系统以便以非常大的比例获得所需的单位。
Amélie菌株是用于产生人们希望得到的人源化的、杂交的或复合聚糖的任何其它菌株的基础克隆。该菌株的优点是形成起始点，其被证明是稳定的和同质的产生98％的Man5GlcNAc2糖蛋白的系统，根据所需的最终结构，其可为其他修饰，例如引入GlcNAc转移酶、岩藻糖转移酶、半乳糖和/或唾液酸转移酶，根据需求快速的再加工。
发明内容
表达盒构建的实现是通过在ORF的5’位置整合一个启动子序列和在3’位置整合一个终止序列。另一方面，将这些盒整合到酵母的基因组中是以同源重组的整合的目的通过将与靶向位点同源的序列加到末端来控制。
对于每个菌株和每个ORF，以获得稳定和最佳表达允许同质糖基化糖蛋白的不同的酶为目的，已经确定启动子序列和整合序列。根据在图2中显示的常规模型(为构建ORF的表达盒用的装配PCR)，表达盒的构建用几个连续的PCR步骤完成。
通过整合亚细胞定位信号来部分修饰某个ORF序列，以此来表达(寻址)在间隔中活性为优化的蛋白(环境，当有供体，和底物等存在时)。
因此，在第一方面，本发明涉及可以产生有Man5GlcNAc2的结构的同质聚糖的糖蛋白的遗传改良酵母，所述酵母包括下列改良：
a)通过同源重组将编码一个抗生素(卡那霉素)抗性基因的异源序列通过插入使编码α-1，6-甘露糖转移酶的Och1基因失活(delta-Och1菌株)；
b)通过同源重组将表达盒整合到营养缺陷标记中，该表达盒包括选自分别具有序列SEQ ID：16-26的酿酒酵母或栗酒裂殖酵母的pGAP、pGAL1、PGK、TEF、adh1、nmt1、SV40、PMA1、CaMV、pet56，或ADH2启动子；含有内质网或高尔基体靶向序列的α-1-2-甘露糖苷酶I编码序列的开放阅读框，以及转录终止子；
c)通过同源重组整合表达盒到营养缺陷标记中，该表达盒包括选自分别具有序列SEQ ID：16-26的酿酒酵母或栗酒裂殖酵母的pGAP、pGAL1、PGK、TEF、adh1、nmt1、SV40、PMA1、CaMV、pet56，或ADH2启动子，所述c)中的启动子与b)中的启动子不同；含有需要产生的外源糖蛋白的编码序列的开放阅读框和转录终止子。
优选地，上述酵母已经整合了线虫(C.Elegans)的α-1-2甘露糖苷酶I，特别是含有SEQ ID：1的序列。发现这些酵母能够产生具有98％的Man5GlcNac2聚糖的糖蛋白：
Figure A20088000608600121
有利地，α-1-2甘露糖苷酶I是在pGAP启动子的控制下表达并且外源蛋白糖蛋白是在pGAL1启动子的控制下表达。
在下列描述中，对在技术领域中所用的缩写作出参考Man＝甘露糖，GlcNac＝N-乙酰-葡萄糖胺，Gal＝半乳糖，Fuc＝岩藻糖和NANA代表唾液酸或另外的N-乙酰神经氨酸。
在第二方面，本发明的酵母包括另外的改良以便产生具有75％，或甚至80％或进一步95％或98％以上的GlcNacMan5GlcNAc2结构的糖蛋白：
Figure A20088000608600131
为了这一目的，上面的菌株进一步包含通过同源重组将表达盒整合到营养缺陷标记中，该表达盒包括选自分别具有序列SEQ ID：16-26的酿酒酵母或栗酒裂殖酵母的pGAP、pGAL1、PGK、TEF、adh1、nmt1、SV40、PMA1、CaMV、pet56，或ADH2启动子，含有编码人类N-乙酰葡萄糖胺基转移酶I的编码序列的，含有内质网或高尔基体的靶向序列的开放阅读框和转录终止子。优选的，人类N-乙酰葡萄糖胺基转移酶I含有SEQ ID：2序列，无酶的胞质部分，该胞质部分被用于蛋白的高尔基体定位的Mnn9的胞质部分所代替。这一菌株被指定为“Arielle”。Arielle应该也包含GlcNAc UDP转运蛋白盒(在下面描述)以便合成这类聚糖。有利地是使用启动子pGAP。
Mnn9
Atgtcactttctcttgtatcgtaccgcctaagaaagaacccgtgggttaac：胞质部分(SEQ ID：13)。
上面的Amélie菌株可以进一步包括通过同源重组将表达盒整合到营养缺陷标记中，该表达盒包括选自分别具有序列SEQ ID：16-26的酿酒酵母或栗酒裂殖酵母的pGAP、pGAL1、PGK、TEF、adh1、nmt1、SV40、PMA1、CaMV、pet56，或ADH2启动子，含有人类UDP-GlcNAc转运蛋白的编码序列的开放阅读框和转录终止子。优选地人类UDP-GlcNAc转运蛋白含有SEQ ID：3序列。优选地，启动子是PGK。这个菌株在此后被指定为“Agathe”。
在第三方面，本发明的菌株包括其它改良以便产生具有75％，或甚至80％或进一步95％或98％以上的GlcNacMan3GlcNAc2结构的糖蛋白：
同样的，上述的Arielle酵母包括通过同源重组将表达盒整合到营养缺陷标记中，该表达盒包括选自分别具有序列SEQ ID：16-26的酿酒酵母或栗酒裂殖酵母的pGAP、pGAL1、PGK、TEF、adh1、nmt 1、SV40、PMA1、CaMV、pet56，或ADH2启动子，含有内质网或高尔基体靶向序列的甘露糖苷酶II编码序列的开放阅读框和转录终止子。优选地，甘露糖苷酶II是小鼠的，特别地是含有SEQ ID：4的序列。优选地启动子是TEF。这个菌株在此后被指定为
Figure A20088000608600142
在第四方面，本发明的酵母包括另外的改良以便产生具有75％，或甚至80％或进一步95％或98％以上的GlcNac2Man3GlcNAc2结构的糖蛋白：
Figure A20088000608600143
在这一情况下，上述的
Figure A20088000608600144
酵母包括通过同源重组将表达盒整合到营养缺陷标记中，该表达盒包括选自分别具有序列SEQ ID：16-26的酿酒酵母或栗酒裂殖酵母的pGAP、pGAL1、PGK、TEF、adh1、nmt 1、SV40、PMA1、CaMV、pet56、或ADH2启动子，含有N-乙酰葡萄糖胺基转移酶II的编码序列的，含有内质网或高尔基体的靶向序列的开放阅读框和转录终止子。优选地，N-乙酰葡萄糖胺基转移酶II是人类的，特别地是含有SEQ ID：5的序列。优选地启动子是PMA1，这个菌株在此后被指定为“Alice”。
在另一个具体实施方式中，本发明的Alice酵母包括另外的改良以便产生具有75％，或甚至80％或进一步95％或98％以上的Gal2GlcNac2Man3GlcNAc2结构的糖蛋白：
Figure A20088000608600151
在这一情况下，上述的Alice酵母包括通过同源重组将表达盒整合到营养缺陷标记中，该表达盒包括选自分别具有序列SEQ ID：16-26的酿酒酵母或栗酒裂殖酵母的pGAP、pGAL1、PGK、TEF、adh1、nmt 1、SV40、PMA1、CaMV、pet56、或ADH2启动子，优选地是CaMV启动子，含有半乳糖转移酶I的编码序列的，含有内质网或高尔基体靶向序列的开放阅读框和转录终止子。优选地，半乳糖转移酶I是人类的，特别地是含有SEQ ID：6的序列，其没有人类的靶向序列。这一菌株被指定为“Athena”。
有利地，前面提到的表达盒的整合是在选自(营养缺陷标记选自)URA3、ADE2、LYS2、LEU2、TRP1、CAN1、ADO1、HIS5、HIS3、ARG3、MET17、LEM3、Mnn1、Mnn9、gma12的整合标记中实现的。更有利地是将α-1-2甘露糖苷酶I的表达盒整合到URA3基因中，将N-乙酰葡萄糖胺基转移酶I的表达盒整合到ADE1或ADE2基因中，将UDP-GlcNAc转运蛋白的表达盒整合到LYS2基因中，将α-甘露糖苷酶II的表达盒整合到LEU2基因中，将N-乙酰葡萄糖胺转移酶II的表达盒整合到LEM3或TRP1基因中。将β-1，4-半乳糖转移酶I的表达盒整合到TRP1或MET17中。
另外，在构建体中优选使用内质网或高尔基体中的靶向序列，其是从含有SEQ ID：14的序列的Mnt1基因的定位序列和含有SEQ ID：15的终止子CYC1衍生来。
在另一个具体实施方式中，本发明上述的Alice和Athena酵母，包括另外的改良以便产生具有75％，或甚至80％或进一步95％或98％以上的选自以下结构的糖蛋白：
GlcNac2Man3GlcNAc2，
Gal2GlcNac2Man3GlcNAc2，或
GlcNac2Man3(Fuc)GlcNAc2，Ashley菌株
Gal2GlcNac2Man3(Fuc)GlcNAc2，Aurel菌株。
在这个情况下，上述的酵母包括通过同源重组将表达盒整合到营养缺陷标记中，该表达盒包括选自分别具有序列SEQ ID：16-26的酿酒酵母或栗酒裂殖酵母的pGAP、pGAL1、PGK、TEF、adh1、nmt 1、SV40、PMA1、CaMV、pet56、或ADH2启动子，或nmt1基因的启动子，含有α-1，6-岩藻糖转移酶FUT8的编码序列的，含有内质网或高尔基体中的靶向序列的开放阅读框和转录终止子，特别地是CYC1基因衍生来的终止子。这些菌株可以有利地含有与下述的GDP-岩藻糖转运蛋白相对应的盒。可以将这个盒整合到CAN1或HIS5中。
有利地，α-1，6-岩藻糖转移酶FUT8是人类的，特别地是含有SEQID：7的序列。
另外，这个菌株应该包括通过同源重组将表达盒整合到营养缺陷标记中，该表达盒包括SV40启动子，含有GDP-岩藻糖转运蛋白的编码序列的，特别地是含有SEQ ID：8的序列的开放阅读框。可以将这个盒整合到TRP1、ARG3或gma12中。
在另一个具体实施方式中，本发明的上述酵母GlcNac2Man3GlcNAc2(Athena)和Gal2GlcNac2Man3(Fuc)GlcNAc2(Aurel)，包括另外的改良以便产生具有75％，或甚至80％或进一步95％或98％以上的选自以下结构的糖蛋白：
NANA2Gal2GlcNac2Man3GlcNAc2Aeron菌株
NANA2Gal2GlcNac2Man3(Fuc)GlcNAc2Avrel菌株
在这个具体实施方式中，上述的酵母包括通过同源重组将表达盒整合到营养缺陷标记中，该表达盒包括上述启动子中的一个或含有SEQ ID：9序列的疱疹病毒胸苷激酶的启动子。
含有α-2，3-唾液酸转移酶的编码序列(ST3GAL4基因)的开放阅读框和转录终止子，特别是由含有SEQ ID：15序列的CYC1基因衍生来的终止子。优选地，唾液酸转移酶是人类的(NM_006278)，特别地是含有SEQ ID：10的序列。
在另一个具体实施方式中，本发明的上述酵母Gal2GlcNac2Man3GlcNAc2(Athena)和NANA2Gal2GlcNac2MAN3GLCNAc2(Aeron)包括另外的改良以便产生具有75％，或甚至80％或进一步95％或98％以上的选自下列结构的糖蛋白：
Gal2GlcNac3Man3GlcNAc2Azalée菌株
NANA2Gal2GlcNac3Man3GlcNAc2A菌株
Figure A20088000608600171
在这个具体实施方式中，上述的酵母包括通过同源重组将表达盒整合到营养缺陷标记中，该表达盒包括上述的一个启动子。
含有β-1，4-n-乙酰葡萄糖胺转移酶III的编码序列的开放阅读框和转录终止子，特别地是由含有SEQ ID：15序列的CYC1基因衍生来的终止子。优选地，GNTIII是鼠类的，特别地是含有SEQ ID：27的序列。
如上面表明，根据本发明的酵母整合入表达外源糖蛋白或糖肽的盒。糖蛋白可以选自治疗用的糖蛋白如细胞因子、白介素、生长激素、生长因子、酶和单克隆抗体、疫苗蛋白、可溶受体和所有类型的重组蛋白。这可以是编码EPO的序列，特别地是包含编码EPO的SEQ ID：11的盒，该序列带有SEQ ID：12，SEQ ID：12含有V5抗原决定簇和纯化用N-末端多HIS单位。
本发明还涉及药物组合物，该组合物含有具有同质聚糖结构的糖蛋白，该结构具有75％、90％、95％或进一步98％以上的以下结构：
Man5GlcNAc2，
GlcNacMan5GlcNAc2，
GlcNacMan3GlcNAc2，
GlcNac2Man3GlcNAc2，
Gal2GlcNac2Man3GlcNAc2，
NANA2Gal2GlcNac2Man3GlcNAc2，
GlcNac2Man3(Fuc)GlcNAc2，
Gal2GlcNac2Man3(Fuc)GlcNAc2，
NANA2Gal2GlcNac2Man3GlcNAc2，
Gal2GlcNac2Man3GlcNAc2，
NANA2Gal2GlcNac3Man3GlcNAc2。
本发明还涉及含有EPO作为活性成分的药物组合物，所述的EPO具有75％、90％、95％或进一步98％以上的结构：
NANA2Gal2GlcNac2Man3GlcNAc2或
NANA2Gal2GlcNac2Man3(Fuc)GlcNAc2。
本发明还涉及在发酵器中含有酵母培养基的基本培养基的培养物以及上述酵母。
在另一个方面，本发明涉及制备糖蛋白的方法，该糖蛋白具有同质聚糖结构，该结构具有75％、90％、95％或进一步98％以上的下列结构：
Man5GlcNAc2，
GlcNacMan5GlcNAc2，
GlcNacMan3GlcNAc2，
GlcNac2Man3GlcNAc2，
Gal2GlcNac2Man3GlcNAc2，
NANA2Gal2GlcNac2Man3GlcNAc2，
GlcNac2Man3(Fuc)GlcNAc2，
Gal2GlcNac2Man3(Fuc)GlcNAc2，
NANA2Gal2GlcNac2Man3(Fuc)GlcNAc2，
Gal2GlcNac3Man3GlcNAc2，
NANA2Gal2GlcNac3Man3GlcNAc2
该方法包括在发酵器中培养上述酵母，和从培养基中提取所述糖蛋白。该方法可以包括纯化步骤。
最后，本发明还涉及上述酵母在发酵器中制备糖蛋白的用途，该糖蛋白具有同质聚糖结构，该结构具有75％、90％、95％或进一步98％以上的下列结构：
Man5GlcNAc2，
GlcNacMan5GlcNAc2，
GlcNacMan3GlcNAc2，
GlcNac2Man3GlcNAc2，
Gal2GlcNac2Man3GlcNAc2，
NANA2Gal2GlcNac2Man3GlcNAc2，
GlcNac2Man3(Fuc)GlcNAc2，
Gal2GlcNac2Man3(Fuc)GlcNAc2，
NANA2Gal2GlcNac2Man3(Fuc)GlcNAc2，
Gal2GlcNac3Man3GlcNAc2，
NANA2Gal2GlcNac3Man3GlcNAc2。
实施例1：创建编码α-1，6-甘露糖转移酶的Och1基因的突变菌株 (delta-Och1菌株)
用PCR扩增卡那霉素的抗性基因并且在其两端加入基因Och1的同源侧翼区(图1)，该侧翼区是每个酿酒酵母或栗酒裂殖酵母菌株的特异区域。通过插入这个对抗生素卡那霉素有抗性的基因使得Och1基因无功能。将该基因整合到酵母的基因组中是通过电穿孔实现的然后通过同源重组整合该感兴趣的基因。
侧翼区有约40个碱基并且允许在酵母基因组的Och1基因的范围内整合卡那霉素。
在含有50μg/mL的卡那霉素的培养基中选择已经整合了卡那霉素抗性基因的菌株。然后我们通过PCR检查在Och1基因中卡那霉素抗性基因的整合。抽提在培养基中卡那霉素存在时有抗性的克隆的基因组DNA。选择寡核苷酸以便在一方面检查卡那霉素抗性基因的存在并且在另一方面检查确实将该基因整合到Och1基因中。也检测了野生菌株的基因组DNA；我们扩增了这些菌株的Och1基因。该基因有1,100bp。在已经整合了卡那霉素盒的菌株中，观察到的Och1基因的扩增更长(1,500bp)。
实施例2：活性的检测
2.1突变酵母菌株的Och1的甘露糖转移酶的活性
另一个证实水平：由于大多数时候的自发突变然后需要选择新克隆，所以对于每个整合到酵母菌株基因组中的基因，进行酶活性的系统检查，以便持续的跟踪可能的活性水平波动。
可以通过体外分析检测Och1酶的活性。在前研究表明通过Och1酶转移甘露糖的最好受体是Man8GlcNAc2。从酵母的微粒体部分(100μg的蛋白)或从总蛋白的裂解液(200μg)中，测定在Man8GlcNAc2结构上的α-1，6位置的甘露糖的转移活性。为此，与氨基吡啶基团结合的Man8GlcNAc2(M8GN2-AP)用作受体并且用[14C]-甘露糖标记的GDP-甘露糖作为放射性甘露糖的供体分子。将微粒体或蛋白和供体(放射性的GDP-甘露糖)，受体(Man8GlcN2-AP)和deoxymannojirimycin(甘露糖苷酶I的抑制剂)在控制了pH的缓冲培养基中孵育。在30℃孵育30分钟以后，在反应培养基中加入氯仿和甲醇以便获得3∶2∶1(v/v/v)比例的CHCl3/MeOH/H2O。与水相对应的上层相含有Man8GlcNAc2-AP、放射性的Man9GlcNAc2-AP和GDP-[14C]-甘露糖。一旦干燥，样品用100μL的H2O/1％乙酸吸收并且通过Sep-Pak C18(Waters)柱，预先调整以便从形成的放射性Man9GlcNAc2-AP中分离GDP-甘露糖(AP基团允许该化合物保留在C18柱上)。通过用H2O/1％乙酸(20mL)然后用20％甲醇/1％乙酸(4mL)洗脱，可以重新获得不同的组份并且用闪烁计数器计数。
2.2甘露糖苷酶的活性
通过在0.1M的PBS，pH 6.5+/-120μM DMJ(α-1，2-甘露糖苷酶I抑制剂)+/-12μM SW(甘露糖苷酶II的特异抑制剂)中和4mMp-硝基苯基-α-D-甘露吡喃糖苷和100-200μg的蛋白(来自总蛋白或亚细胞组份)在37℃孵育4小时测定甘露糖苷酶的活性。在405nm检测吸收。
2.3N-乙酰葡萄糖胺转移酶活性
在酵母的微粒体组份上检测GlcNAc转移酶的活性。在最终50μL在有50mM HEPES、10mM MnCl2、0.1％TritonX-100的培养基中将50μg的微粒体(BCA分析)和0.01μCi的供体(放射性UDP-GlcNAc)、0.5mM的受体(3-O-α-D-甘露-吡喃糖基-D-甘露吡喃糖苷)在30℃孵育25分钟。用400μL的10mM EDTA终止反应，然后样品通过DowexAG-1X2柱。然后用3M的甲酸从柱上洗脱放射性受体并且用闪烁计数器测量放射性。
实施例3：线虫的α-1-2甘露糖苷酶I的表达盒
构建表达盒的解释性图表：图2
3.1步骤1：获得ORF
α-甘露糖苷酶I：从具有质粒pDONR201的细菌克隆进行PCR(Open Biosystem)
程序：
94℃8分钟
35个循环：  94℃20秒
            65℃30秒
            72℃2分钟
            72℃10分钟
扩增1,644bp的片段
AAAGCAGGCatgggcctccgatcacacgaacaacttgtcgtgtgtgtcggagttatgtttcttctgactgtctgcatcacagcgttt
ttctttcttccgtcaggcggcgctgatctgtatttccgagaagaaaactccgttcacgttagagatgtgcttatcagagaggaaatt
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tctccaatctgactggaaatccagtttttgctcaaaaagctgataaaataagagatgttttaactgcaatggagaaaccagaagg
actttatccaatttatattactatggataatccaccaagatggggacaacatcttttctcaatgggtgcaatggctgacagttggtat
gaatatctgctcaaacaatggattgccactggtaaaaaagatgatcgcacgaaaagagaatacgaagaagcgatatttgcaat
ggaaaaacgaatgcttttcaaatcggaacagtcgaatctttggtatttcgcaaaaatgaacggaaatcgcatggaacattcatttg
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gagtgtagaggcaaaaacagaacgtcgtcaggattcatattatattcttcgtcctgaagtcgttgagacatggttctacttgtgga
gggctacaaaagacgagaaatatcgacaatgggcttgggatcatgttcaaaatttggaggagtattgtaagggcactgccgga
tactctggaatccgaaacgtctacgaatcgagcccggaacaagatgatgtgcagcagtcattcctcttcgctgagctcttcaaat
atctgtatttaattttcagtgaagataacattcttccacttgatcaatgggttttcaataccgaagctcatccattccgc
attcggcatcacgacgagttgatt(SEQ ID：1)
抽提并且用SBIOgene试剂盒从琼脂糖胶中纯化PCR扩增物并且将其引入载体TOPO2.1。用这个载体转化感受态细菌(TOP10，Invitrogen)。用PCR检查转化并且通过测序检查PCR扩增物插入载体(质粒pGLY02.001)。
3.2步骤2：表达盒的装配
两个菌株的甘露糖苷酶I表达盒的整合将定位在营养缺陷标记URA3中。该基因的失效导致对毒剂5-氟尿嘧啶的抗性。然后通过这个盒改良的酵母将对该药有抗性但是对尿嘧啶还是营养缺陷的。
酿酒酵母的表达盒
-从野生酿酒酵母的基因组DNA中扩增启动子pGAP
BS16(正向)和BS17’(反向)
-装配启动子pGAP(PCR产物)和ORF(pGLY02.001)
BS16(正向)和BS19’(反向)
-从质粒pYES2.1扩增终止子CYC1
BS40b(正向)和BS41(反向)
-装配ORF(质粒pGLY02.001)和终止子CYC1(PCR产物)
BS18(正向)和BS41(反向)
抽提并且用Qiagen试剂盒从琼脂糖胶中纯化PCR扩增物并且将其引入载体pTarget。用这个载体转化感受态细菌(JM109，Promega)。用PCR检查转化并且通过测序检查PCR扩增物插入载体(pGLY02.002)。
-用URA3的同源区(自引物)装配启动子-ORF(PCR产物)和ORF-终止子(pGLY02.002)
BS42(正向)
BS43(反向)
抽提并且用Qiagen试剂盒从琼脂糖胶中纯化PCR扩增物并且将其引入载体pTarget。用这个载体转化感受态细菌(JM109，Promega)。用PCR检查转化并且通过测序检查PCR扩增物插入载体(pGLY02.004)。
栗酒裂殖酵母的表达盒
-从野生栗酒裂殖酵母的基因组DNA中扩增启动子adh1
BS25和BS26’(反向)
-装配启动子adh1(PCR产物)和ORF(pGLY02.001)
BS25(正向)和BS20(反向)
抽提并且用Qiagen试剂盒从琼脂糖胶中纯化PCR扩增物并且将其引入载体TOPO2.1。用这个载体转化感受态细菌(TOP10，Invitrogen)。用PCR检查转化并且通过测序检查PCR扩增物插入载体(pGLY02.009)。
-用ORF-CYC1(PCR产物)装配产物启动子-ORF(pGLY02.009)
BS25(正向)and BS41(反向)
抽提并且用Qiagen试剂盒从琼脂糖胶中纯化PCR扩增物并且将其引入载体pTarget。用这个载体转化感受态细菌(JM109，Promega)。用PCR检查转化并且通过测序检查PCR扩增物插入载体(pGLY02.011)。
-用URA3同源的侧翼区扩增盒(pGLY02.011)
BS76(正向)和BS77(反向)
抽提并且用Qiagen试剂盒从琼脂糖胶中纯化PCR扩增物并且将其引入载体pTarget。用这个载体转化感受态细菌(JM109，Promega)。用PCR检查转化并且通过测序检查PCR扩增物插入载体。
3.3步骤3：酵母的转化
-酵母感受态的制备：
酿酒酵母Adèle：
过程：在OD＝0.1接种500ml的酵母并且在30℃孵育直到5.5＜OD＜6.5。
在4℃1500g离心细胞5分钟并且将它们重悬在500ml的冷无菌水中。
离心细胞并且将它们重悬在250ml的冷无菌水中。
离心细胞并且将它们重悬在20ml的1M的山梨醇中。离心细胞并且将它们重悬在1ml的1M的山梨醇中。形成80μL的部分并且将它们储存在-80℃。
栗酒裂殖酵母Edgar：
过程：在OD＝0.1接种200mL的酵母并且在30℃孵育直到OD＝1.5。
在20℃3,000rpm离心5分钟。在冷无菌水中洗细胞并离心，用1m的山梨醇洗第二次。通过加入DTT孵育15分钟以便达到最终25mM(为了增加电感受性)。再继续以形成在冷的1M山梨醇中的最终悬浮液(密度1-5.109细胞/mL：约5mL)。形成40μL的部分并且在-80℃储存约10管。
-通过电穿孔转化酵母：
对于每个表达盒，转化酵母使用的DNA或者来自用所选的限制性酶消化所述质粒，或者直接来自在完全装配后获得的纯化PCR产物。
酿酒酵母盒：用限制性酶BamHI和SmaI消化pGLY02.004。
用1μg的DNA转化感受态酵母：在冰上孵育5分钟。用V＝1,500V给予脉冲。立即加入1mL的冰冷无菌1M的山梨醇并用巴斯德移液管将细胞转移到Eppendorf管中然后让它们在30℃在Infors仪器中放松至少1小时。将酵母涂布在选择性培养基(含有10mM 5-氟尿嘧啶，5-FU的YPD)的碟子上。转化体在4-6天内出现。
栗酒裂殖酵母盒：用100ng的DNA(PCR产物)转化感受态酵母：在冰上孵育5分钟。将细胞和DNA转移到电穿孔槽中。在V＝1,500V给予脉冲并且立即加入0.9mL冷的1M山梨醇。尽快将细胞涂布在合适的培养基上(含有10mM 5-FU的YPD)。转化体在4-6天内出现。
实施例4：Amélie和Emma菌株+人类N-乙酰-葡萄糖胺转移酶I 的表达盒
4.1步骤1：获得ORF
从商业质粒Biovalley(人类ORF克隆V1.1)进行PCR
程序：
94℃5分钟
30个循环：94℃60秒
          56℃60秒
          72℃2分钟
          72℃5分钟
无酶的胞质部分的1,327bp片段的扩增。它将被蛋白的高尔基体定位用的Mnn9的胞质部分替代。
Mnn9胞质区：从野生酿酒酵母的基因组DNA进行PCR
95℃8分钟
30个循环：94℃20秒
        58℃30秒
        72℃1分钟
        72℃10分钟
扩增51bp的片段(Mnn9的胞质部分)。
Atgtcactttctcttgtatcgtaccgcctaagaaagaacccgtgggttaac(SEQ ID：13)
从这两个PCR扩增物中：
获得单一片段
Atgtcactttctcttgtatcgtaccgcctaagaaagaacccgtgggttaacgcagggcttgtgctgtggggcgctatcctcttt
gtggcctggaatgccctgctgctcctcttcttctggacgcgcccagcacctggcaggccaccctcagtcagcgctctcgatgg
cgaccccgccagcctcacccgggaagtgattcgcctggcccaagacgccgaggtggagctggagcggcagcgtgggctg
ctgcagcagatcggggatgccctgtcgagccagcgggggagggtgcccaccgcggcccctcccgcccagccgcgtgtgc
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tggacctgtcttacctgcagcgggaggcctatgaccgagatttcctcgcccgcgtctacggtgctccccagctgcaggtggag
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gccgccgtgtccacctggcgcccccactgacgtgggagggctatgatcctagctggaattagcacctgcctgtccttc
(SEQ ID：2)
装配PCR的扩增产物用QIAGEN试剂盒从琼脂糖胶中纯化并且引入TOPO2.1载体。用这个载体转化感受态细菌(TOP10，Invitrogen)。用PCR检查转化并且通过测序检查PCR扩增物插入到载体(pGLY03.001)。
4.2步骤2：表达盒的装配
酿酒酵母的表达盒
酿酒酵母的GlcNAc转移酶I的表达盒的整合将定位在营养缺陷标记ADE2中。该基因的失效导致酵母颜色变红的改变并且对腺嘌呤仍然是营养缺陷的。
-从酿酒酵母的基因组DNA中扩增启动子adh 1。
BS29(正向)和BS30(反向)
-装配启动子adh 1(PCR产物)和ORF(pGLY03.001)：
BS29(正向)和BS59
抽提并且用Qiagen试剂盒从琼脂糖胶中纯化PCR扩增物并且将其引入载体pTarget。用这个载体转化感受态细菌(JM109，Promega)。用PCR检查转化并且通过测序检查PCR扩增物插入载体(pGLY03.002)。
-用终止子CYC1(PCR产物)装配ORF(pGLY03.001)：
CA005(正向)
BS41(反向)
抽提并且用Qiagen试剂盒从琼脂糖胶中纯化PCR扩增物并且将其引入载体pTarget。用这个载体转化感受态细菌(JM109，Promega)。用PCR检查转化并且通过测序检查PCR扩增物插入载体(pGLY03.011)。
-用ADE2的同源延伸装配启动子-ORF(pGLY03.002)和ORF-终止子(PCR产物)：
BS67(正向)和BS68(反向)
抽提并且用Qiagen试剂盒从琼脂糖胶中纯化PCR扩增物并且将其引入载体pTarget。用这个载体转化感受态细菌(JM109，Promega)。用PCR检查转化并且通过测序检查PCR扩增物插入载体(pGLY03.010)。
栗酒裂殖酵母的表达盒
栗酒裂殖酵母的GlcNAc转移酶I的表达盒的整合将定位在营养缺陷标记ADE1中。该基因的失效导致酵母颜色变红的改变并且对于腺嘌呤还是营养缺陷的。
-从质粒pCDNA 3.1中扩增启动子hCMV
BS62(正向)和BS58(反向)
抽提并且用Qiagen试剂盒从琼脂糖胶中纯化PCR扩增物并且将其引入载体pTarget。用这个载体转化感受态细菌(JM109，Promega)。用PCR检查转化并且通过测序检查PCR扩增物插入载体(pGLY03.004)。
-用终止子CYC1(PCR产物)装配hCMV-ORF(pGLY03.004)
BS62(正向)和BS41(反向)
抽提并且用Qiagen试剂盒从琼脂糖胶中纯化PCR扩增物并且将其引入载体pTarget。用这个载体转化感受态细菌(JM109，Promega)。用PCR检查转化并且通过测序检查PCR扩增物插入载体(pGLY03.005)。
-用ADE1的同源延伸装配表达盒(pGLY03.005)：
BS69(正向)和BS70(反向)
抽提并且用Qiagen试剂盒从琼脂糖胶中纯化PCR扩增物并且将其引入载体pTarget。用这个载体转化感受态细菌(JM109，Promega)。用PCR检查转化并且通过测序检查PCR扩增物插入载体(pGLY03.007)。
4.3步骤3：酵母的转化
-感受态酵母的制备：
如上述制备Amélie和Emma菌株以便使它们有感受态。
-酿酒酵母和栗酒裂殖酵母的电穿孔
过程：
含有酿酒酵母和栗酒裂殖酵母的表达盒的20μg质粒用限制性酶EcoRI消化。通过电穿孔在酵母Amélie和Emma中引入线性化的盒。在含有必需氨基酸的YNB培养基上选择酵母。
实施例5：Agathe和Egée菌株+UDP-GlcNAc转运蛋白的表达盒
5.1步骤1：获得ORF
程序：
94℃3分钟
30个循环：  94℃20秒
            58℃30秒
            72℃2分钟
            72℃10分钟
扩增916bp的片段
atgttcgccaacctaaaatacgtttccctgggaattttggtctttcagactaccagtttggttctaacaatgcgttattccagaacct
ttaaaagaagaaggacctcgttatctatcttctacagcagtggttgttgctgaacttttgaagataatggcctgcattttattggtcta
caaagacagcaaatgtagtctaagagcactgaatcgagtactacatgatgaaattcttaataaacctatggaaacacttaaactt
gctattccatcagggatctatactcttcagaataatttactgtatgtggcactatcaaatctagatgcagctacttatcaggtcacgt
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atgcagataatattttaaaaggatttgcaacctctttatcgataatattatcaacattgatctcctatttttggcttcaagattttgtgcca
accagtgtctttttccttggagccatccttgtaa(SEQ ID：3)
抽提并且用Qiagen试剂盒从琼脂糖胶中纯化PCR扩增物并且将其引入载体TOPO2.1。用这个载体转化感受态细菌(TOP10，Invitrogen)。用PCR检查转化并且通过测序检查PCR扩增物插入载体(pGLY04.001)。
5.2步骤2：表达盒的装配：
酿酒酵母和栗酒裂殖酵母的盒：
酿酒酵母和栗酒裂殖酵母两者UDP-GlcNAc的转运蛋白表达盒的整合将定位在营养缺陷标记LYS2中。该基因的失效导致对毒剂α-氨基己二酸的抗性。因此通过该盒改良的酵母将变得对该药有抗性但是对赖氨酸还是营养缺陷的。
-从质粒pFL61扩增启动子PGK
BS95(正向)和BS96(反向)
-用终止子CYC1(PCR产物)装配ORF(pGLY04.001)
CA017(正向)和BS41(反向)
抽提并且用Qiagen试剂盒从琼脂糖胶中纯化PCR扩增物并且将其引入载体TOPO2.1。用这个载体转化感受态细菌(TOP10，Invitrogen)。用PCR检查转化并且通过测序检查PCR扩增物插入载体(pGLY04.002)。
-用ORF-终止子CYC1片段(pGLY04.002)装配启动子PGK(PCR产物)
BS95(正向)和BS41(反向)
-用酿酒酵母LYS2的同源延伸装配表达盒：
BS97(正向)和BS98(反向)
栗酒裂殖酵母
BS99(正向)
BS100(反向)
抽提并且用Qiagen试剂盒从琼脂糖胶中纯化PCR扩增物并且将其引入载体pTarget。用这个载体转化感受态细菌(JM109，Progema)。用PCR检查转化并且通过对酿酒酵母的盒的测序(pGLY04.006)和对栗酒裂殖酵母的盒的测序(pGLy04.005)检查PCR扩增物插入载体。
5.3步骤3：酵母的改良
-感受态酵母的制备：
如上述制备Agathe和Egée菌株以便使它们有感受态
-酵母的电穿孔：
含有酿酒酵母、栗酒裂殖酵母的表达盒的20μg质粒用限制性酶EcoRI消化。通过电穿孔将线性化的盒引入到酵母Agathe和Egée中。在含有必需氨基酸和α-氨基己二酸的YNB培养基上选择酵母。
实施例6：Arielle和Erika菌株+α-甘露糖苷酶II的表达盒
6.1步骤1：获得ORF
从小鼠肝的cDNA进行PCR
程序：
94℃3分钟
35个循环：  94℃20秒
            58℃30秒
            72℃4分钟
            72℃10分钟
3,453bp片段的扩增
atgaagttaagtcgccagttcaccgtgtttggcagcgcgatcttctgcgtcgtaatcttctcactctacctgatgctggacagg
ggtcacttggactaccctcggggcccgcgccaggagggctcctttccgcagggccagctttcaatattgcaagaaaagattga
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ggacggcccgcgggggtcaccaggcaacgccagccaaggctccatccacctccactcgccacagttggccctgcaggctg
accccagagactgtttgtttgcttcacagagtgggagtcagccccgggatgtgcagatgttggatgtttacgatctgattccttttg
ataatccagatggtggagtttggaagcaaggatttgacattaagtatgaagcggatgagtgggaccatgagcccctgcaagtg
tttgtggtgcctcactcccataatgacccaggttggttgaagactttcaatgactactttagagacaagactcagtatatttttaataa
catggtcctaaagctgaaagaagactcaagcaggaagtttatgtggtctgagatctcttaccttgcaaaatggtgggatattatag
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tcgggctgggccatagatccctttggtcattcacccacaatggcttatcttctaaagcgtgctggattttcacacatgctcatccag
agagtccattatgcaatcaaaaaacacttctctttgcataaaacgctggagtttttctggagacagaattgggatcttggatctgct
acagacattttgtgccatatgatgcccttctacagctacgacatccctcacacctgtgggcctgatcctaaaatatgctgccagttt
gattttaaacggcttcctggaggcagatatggttgtccctggggagttcccccagaagcaatatctcctggaaatgtccaaagc
agggctcagatgctattggatcagtaccggaaaaagtcaaaacttttccgcactaaagttctgctggctccactgggagacgac
tttcggttcagtgaatacacagagtgggatctgcagtgcaggaactacgagcaactgttcagttacatgaactcgcagcctcatc
tgaaagtgaagatccagtttggaaccttgtcagattatttcgacgcattggagaaagcggtggcagccgagaagaagagtagc
cagtctgtgttccctgccctgagtggagacttcttcacgtacgctgacagagacgaccattactggagtggctacttcacgtcca
gacctttctacaaacgaatggacagaataatggaatctcgtataagggctgctgaaattctttaccagttggccttgaaacaagct
cagaaatacaagataaataaatttctttcatcacctcattacacaacactgacagaagccagaaggaacttaggactatttcagc
atcatgatgccatcacaggaaccgcgaaagactgggtggttgtggactatggtaccagactctttcagtcattaaattctttggag
aagataattggagattctgcatttcttctcattttaaaggacaaaaagctgtaccagtcagatccttccaaagccttcttagagatg
gatacgaagcaaagttcacaagattctctgccccaaaaaattataatacaactgagcgcacaggagccaaggtaccttgtggtc
tacaatccctttgaacaagaacggcattcagtggtgtccatccgggtaaactccgccacagggaaagtgctgtctgattcggga
aaaccggtggaggttcaagtcagtgcagtttggaacgacatgaggacaatttcacaagcagcctatgaggtttcttttctagctc
atataccaccactgggactgaaagtgtttaagatcttagagtcacaaagttcaagctcacacttggctgattatgtcctatataata
atgatggactagcagaaaatggaatattccacgtgaagaacatggtggatgctggagatgccataacaatagagaatcccttc
ctggcgatttggtttgaccgatctgggctgatggagaaagtgagaaggaaagaagacagtagacagcatgaactgaaggtcc
agttcctgtggtacggaaccaccaacaaaagggacaagagcggtgcctacctcttcctgcctgacgggcagggccagccat
atgtttccctaagaccgccctttgtcagagtgacacgtggaaggatctactcagatgtgacctgtttcctcgaacacgttactcac
aaagtccgcctgtacaacattcagggaatagaaggtcagtccatggaagtttctaatattgtaaacatcaggaatgtgcataacc
gtgagattgtaatgagaatttcatctaaaataaacaaccaaaatagatattatactgacctaaatggatatcagattcagcctagaa
ggaccatgagcaaattgcctcttcaagccaacgtttacccgatgtgcacaatggcgtatatccaggatgctgagcaccggctca
cgctgctctctgctcagtctctaggtgcttccagcatggcttctggtcagattgaagtcttcatggatcgaaggctcatgcaggat
gataaccgtggccttgggcaaggcgtccatgacaataagattacagctaatttgtttcgaatcctcctcgagaagagaagcgct
gtgaacatggaagaagaaaagaagagccctgtcagctacccttccctcctcagccacatgacttcgtccttcctcaaccatccc
tttctccccatggtactaagtggccagctcccctcccctgcctttgagctgctgagtgaatttcctctgctgcagtcctctctacctt
gtgatatccatctggtcaacctgcggacaatacaatcaaagatgggcaaaggctattcggatgaggcagccttgatcctccaca
ggaaagggtttgattgccagttctccagcagaggcatcgggctaccctgttccactactcagggaaagatgtcagttctgaaac
ttttcaacaagtttgctgtggagagtctcgtcccttcctctctgtccttgatgcactcccctccagatgcccagaacatgagtgaag
tcagcctgagccccatggagatcagcacgttccgtatccgcttgcgttggacctga(SEQ ID：4)
该ORF的扩增是通过在小鼠肝cDNA上的巢式PCR(3,453bp)获得并且通过酚/氯仿方法纯化。将PCR产物引入到载体TOPO-XL中。通过PCR检查转化体并且通过测序检查PCR扩增物插入到载体(pGLY05.001)。
6.2步骤2：表达盒的装配
酿酒酵母和栗酒裂殖酵母的盒：
两个菌株甘露糖苷酶II的表达盒的整合将定位在营养缺陷标记LEU2中。该基因的失效导致对毒剂三氟亮氨酸的抗性。通过该盒改良的酵母将因此对该药变成有抗性但是对亮氨酸还是营养缺陷的。
-从酿酒酵母的基因组DNA中扩增启动子TEF
BS83(正向)和BS84(反向)
-用ORF(PCR产物)和终止子(PCR产物)装配启动子TEF(PCR产物)
对于酿酒酵母标记LEU2
BS111(正向)和BS112(反向)
对于栗酒裂殖酵母标记LEU2
BS113(正向)和BS114(反向)
抽提并且用Qiagen试剂盒从琼脂糖胶中纯化PCR扩增物并且将其引入载体pTarget。用这个载体转化感受态细菌(JM109，Progema)。用PCR检查转化并且通过测序检查PCR扩增物插入载体(对酿酒酵母的盒是pGLy05.008，对栗酒裂殖酵母的盒是pGly05.009)。
6.3步骤3：酵母的改良
-感受态酵母的制备：
如上述制备Arielle和Erika菌株以便使它们有感受态。
酵母的电穿孔
过程：含有酿酒酵母和栗酒裂殖酵母的表达盒的20μg质粒用限制性酶EcoRI消化。通过电穿孔将线性化的盒引入酵母Arielle和Erika中。在含有酿酒酵母和栗酒裂殖酵母的必需氨基酸和三氟亮氨酸(TFL)的YNB培养基上选择酵母。
实施例7：
Figure A20088000608600311
和Enrique菌株+N-乙酰-葡萄糖胺转移酶II表达 盒
6.1步骤1：获得ORF
从人类成纤维细胞的互补DNA进行PCR-使用Taq聚合酶IsisTM(Q-Biogene)
程序：
94℃3分钟
30个循环：94℃30秒
          58℃30秒
          68℃1.30分钟
1,344bp片段的扩增
atgaggttccgcatctacaaacggaaggtgctaatcctgacgctcgtggtggccgcctgcggcttcgtcctctggagcagca
atgggcgacaaaggaagaacgaggccctcgccccaccgttgctggacgccgaacccgcgcggggtgccggcggccgcg
gtggggaccacccctctgtggctgtgggcatccgcagggtctccaacgtgtcggcggcttccctggtcccggcggtccccca
gcccgaggcggacaacctgacgctgcggtaccggtccctggtgtaccagctgaactttgatcagaccctgaggaatgtagat
aaggctggcacctgggccccccgggagctggtgctggtggtccaggtgcataaccggcccgaatacctcagactgctgctg
gactcacttcgaaaagcccagggaattgacaacgtcctcgtcatctttagccatgacttctggtcgaccgagatcaatcagctga
tcgccggggtgaatttctgtccggttctgcaggtgttctttcctttcagcattcagttgtaccctaacgagtttccaggtagtgaccc
tagagattgtcccagagacctgccgaagaatgccgctttgaaattggggtgcatcaatgctgagtatcccgactccttcggcca
ttatagagaggccaaattctcccagaccaaacatcactggtggtggaagctgcattttgtgtgggaaagagtgaaaattcttcga
gattatgctggccttatacttttcctagaagaggatcactacttagccccagacttttaccatgtcttcaaaaagatgtggaaactg
aagcagcaagagtgccctgaatgtgatgttctctccctggggacctatagtgccagtcgcagtttctatggcatggctgacaag
gtagatgtgaaaacttggaaatccacagagcacaatatgggtctagccttgacccggaatgcctatcagaagctgatcgagtg
cacagacactttctgtacttatgatgattataactgggactggactcttcaatacttgactgtatcttgtcttccaaaattctggaaag
tgctggttcctcaaattcctaggatctttcatgctggagactgtggtatgcatcacaagaaaacctgtagaccatccactcagagt
gcccaaattgagtcactcttaaataataacaaacaatacatgtttccagaaactctaactatcagtgaaaagtttactgtggtagcc
atttccccacctagaaaaaatggagggtggggagatattagggaccatgaactctgtaaaagttatagaagactgcagtga
(SEQ ID：5)
用酚/氯仿方法纯化PCR扩增物并将其引入载体pTarget(Promega)中。用该载体转化感受态细菌(JM109，Promega)。用PCR检查转化并且通过测序检查PCR扩增物插入到载体(pGLY08.002)。
mmn9的胞质区：从野生酿酒酵母的基因组DNA进行PCR
94℃8分钟
30个循环：94℃20秒
          65℃30秒
          72℃1分钟
72℃10分钟
扩增51bp片段(mmn9的胞质部分)+GNTII的同源
Atgtcactttctcttgtatcgtaccgcctaagaaagaacccgtgggttaacaggttccgcatctac
用Taq Platinium装配Mnn9(PCR产物)和ORF(pGLY08.002)
CA005(正向)和CD005(反向)
程序：
95℃2分钟
30个循环：95℃45秒
          54℃45秒
          72℃2分钟
72℃10分钟
用酚/氯仿方法纯化PCR扩增物并将其引入载体pTarget(Promega)中。用该载体转化感受态细菌(JM109，Promega)。用PCR检查转化并且通过测序检查PCR扩增物插入到载体(pGLY08.007)。
7.2步骤2：装配酿酒酵母和栗酒裂殖酵母菌株的表达盒
GlcNAc-转移酶II的表达盒的整合将插入到酿酒酵母的Lem3标记和栗酒裂殖酵母的TRP1标记中。基因Lem3的失效导致对毒剂米替福新(miltefosine)的抗性。通过该盒改良的酵母将因此对该药变得有抗性。基因TRP1的失效导致对毒剂5-氟维生素L(5-fluoro-anthranilicacid)的抗性。通过该盒改良的酵母将因此对该药变得有抗性但是对于色氨酸还是营养缺陷的。
-启动子PMA1的扩增
CD001(正向)aagcttcctgaaacggag
CD008(反向)acgatacaagagaaagtgacatattgatattgtttgataattaaat
从酿酒酵母的基因组DNA进行PCR
程序：
95℃2分钟
30个循环：95℃45秒
          54℃45秒
          72℃2分钟
72℃5分钟
用Taq Expand(Roche)用Mnn9-同源ORF(pGLY08.007)装配启动子PMA1(PCR产物)
CD007 cgtttgtagatgcggaacctgttaacccacgggttcttt
CD001 aagcttcctgaaacggag
94℃2分钟
30个循环：94℃45秒
          55℃45秒
          68℃1.15分钟
68℃5分钟
用酚/氯仿方法纯化PCR扩增物并将其引入载体TOPO2.1(Invitrogen)中。用该载体转化感受态细菌(TOP10，Invitrogen)。用PCR检查转化并且通过测序检查PCR扩增物插入到载体(pGLY08.005)。
-用Taq聚合酶PhusionTM(Ozyme)用终止子CYC1(PCR产物)装配Mnn9-ORF(pGLY08.007)
程序
98℃2分钟
3个循环： 98℃10秒
          52℃30秒
          72℃40秒
加入引物然后
30个循环  98℃10秒
          61℃30秒
          72℃40秒
72℃5分钟
用酚/氯仿方法纯化PCR扩增物并将其引入载体pTarget(Promega)中。用该载体转化感受态细菌(JM109，Promega)。用PCR检查转化并且通过测序检查PCR扩增物插入到载体(pGLY08.04)。
-用Taq聚合酶PhusionTM(Ozyme)用带有酿酒酵母标记Lem3同源末端的Mnn9-ORF终止子CYC1(PCR产物)装配启动子PMA1-Mnn9(pGLY08.009)
CB053：Atggtaaatttcgatttgggccaagttggtgaagtattccaagcttcctgaaacggag(正向)
CB070：Ttctaccgccgaagagccaaaacgttaataatatcaatggcagcttgcaaattaaagc(反向)
程序
98℃2分钟
3个循环： 98℃10秒
          52℃30秒
          72℃4分钟
加入引物然后
30个循环  98℃10秒
          61℃30秒
          72℃1分钟
72℃5分钟
用酚/氯仿方法纯化PCR扩增物并将其引入载体pTarget(Promega)中。用该载体转化感受态细菌(JM109，Promega)。用PCR检查转化并且通过测序检查PCR扩增物插入到载体(pGLY08)。
-从pGLY08.012装配栗酒裂殖酵母标记TRP1的同源末端
CD009(正向)taaagttgattccgctggtgaaatcatacatggaaaagtttaagcttcctgaaacggag
CD010(反向)atgtgaaatttccttggccacggacaagtccacttttcgtttggcagcttgcaaattaaagc
7.3步骤3：酵母的改良
-感受态酵母的制备
如上述制备
Figure A20088000608600351
和Enrique菌株以便使它们有感受态。
-酵母的电穿孔
过程：含有酿酒酵母和栗酒裂殖酵母的表达盒的20μg质粒用限制性酶EcoRI消化。通过电穿孔将线性化的盒引入酵母
Figure A20088000608600352
和Enrique中。然后将酵母涂布在含有需要的选择性药物的琼脂糖YPD培养基上。
实施例8：Alice和Elga菌株+半乳糖转移酶I的表达盒
8.1步骤1：无需人类定位序列获得ORF
从人类淋巴母细胞的cDNA进行PCR
CD025(正向)CD026(反向)
94℃2分钟
30个循环：94℃45秒
          58℃45秒
          72℃1.15分钟
72℃5分钟
1,047bp片段的扩增
ccccaactggtcggagtctccacaccgctgcagggcggctcgaacagtgccgccgccatcgggcagtcctccggggagc
tccggaccggaggggcccggccgccgcctcctctaggcgcctcctcccagccgcgcccgggtggcgactccagcccagt
cgtggattctggccctggccccgctagcaacttgacctcggtcccagtgccccacaccaccgcactgtcgctgcccgcctgc
cctgaggagtccccgctgcttgtgggccccatgctgattgagtttaacatgcctgtggacctggagctcgtggcaaagcagaa
cccaaatgtgaagatgggcggccgctatgcccccagggactgcgtctctcctcacaaggtggccatcatcattccattccgca
accggcaggagcacctcaagtactggctatattatttgcacccagtcctgcagcgccagcagctggactatggcatctatgttat
caaccaggcgggagacactatattcaatcgtgctaagctcctcaatgttggctttcaagaagccttgaaggactatgactacacc
tgctttgtgtttagtgacgtggacctcattccaatgaatgaccataatgcgtacaggtgtttttcacagccacggcacatttccgttg
caatggataagtttggattcagcctaccttatgttcagtattttggaggtgtctctgctctaagtaaacaacagtttctaaccatcaat
ggatttcctaataattattggggctggggaggagaagatgatgacatttttaacagattagtttttagaggcatgtctatatctcgcc
caaatgctgtggtcgggaggtgtcgcatgatccgccactcaagagacaagaaaaatgaacccaatcctcagaggtttgaccg
aattgcacacacaaaggagacaatgctctctgatggtttgaactcactcacctaccaggtgctggatgtacagagatacccattg
tatacccaaatcacagtggacatcgggacaccgagctag(SEQ ID：6)。
用酚/氯仿方法纯化PCR扩增物并将其引入载体pTarget(Promega)中。用该载体转化感受态细菌(JM109，Promega)。用PCR检查转化并且通过测序检查PCR扩增物插入到载体(pGLY11.003)。
Mnt1定位：从酿酒酵母的gDNA进行PCR
94℃3分钟
30个循环：  94℃20秒
            58℃30秒
            72℃45秒
72℃10分钟
246bp片段的扩增-SEQ ID：14
atggccctctttctcagtaagagactgttgagatttaccgtcattgcaggtgcggttattgttctcctcctaacattgaattccaac
agtagaactcagcaatatattccgagttccatctccgctgcatttgattttacctcaggatctatatcccctgaacaacaagtcatct
ctgaggaaaatgatgctaaaaaattagagcaaagtgctctgaattcagaggcaagcgaagactccgaagcc
用酚/氯仿方法纯化PCR扩增物并将其引入载体pTarget(Promega)中。用该载体转化感受态细菌(JM109，Promega)。用PCR检查转化并且通过测序检查PCR扩增物插入到载体。
8.2步骤2：装配酿酒酵母和栗酒裂殖酵母菌株的表达盒
半乳糖转移酶I的表达盒的整合将定位在酿酒酵母Alice的标记TRP1中。该基因的失效导致对毒剂氟代维生素L的抗性。通过该盒改良的酵母将因此对该药变得有抗性。半乳糖转移酶I的表达盒的整合将定位在酿酒酵母Ashley的标记Met17中。
-从质粒pMDC扩增启动子CaMV
CD035(正向)
CD037(反向)
程序
94℃2分钟
30个循环：  94℃45秒
            65℃45秒
            72℃2分钟30秒
72℃5分钟
抽提并且用Qiagen试剂盒从琼脂糖胶中纯化PCR扩增物并且将其引入载体pTarget。感受态细菌(JM109，Progema)用这个载体转化。用PCR检查转化并且通过测序检查PCR扩增物插入载体(pGLY11.001)。
-用Mnt1定位序列(PCR产物)装配启动子CaMV(pGLY11.001)
CD035(正向)和CD028(反向)
程序：
94℃2分钟
30个循环：  94℃45秒
            59℃45秒
            72℃1分钟15秒
72℃3分钟
抽提并且用Qiagen试剂盒从琼脂糖胶中纯化PCR扩增物并且将其引入载体pTarget。用这个载体转化感受态细菌(JM109，Progema)。用PCR检查转化并且通过测序检查PCR扩增物插入载体(pGLY11.002)。
-用ORF(PCR产物)装配启动子CaMV-Mnt1定位(pGLY011.002)
CD035(正向)
CD029(反向)
程序：
94℃2分钟
30个循环：  94℃45秒
            56℃45秒
            72℃2分钟30秒
72℃3分钟
用酚/氯仿方法纯化PCR扩增物并将其引入载体pTarget(Promega)中。用该载体转化感受态细菌(JM109，Promega)。用PCR检查转化并且通过测序检查PCR扩增物插入到载体(pGLY011.004)。
-用Taq Expand(Roche)用终止子CYC1(PCR产物)装配启动子CaMV-定位Mnt1-ORF(pGLY011.004)
CD035(正向)BS41(反向)
程序：
95℃3分钟
30个循环：  95℃30秒
            57℃30秒
            68℃2分钟30秒
68℃10分钟
用酚/氯仿方法纯化PCR扩增物并将其引入载体pTarget(Promega)中。用该载体转化感受态细菌(JM109，Promega)。用PCR检查转化并且通过测序检查PCR扩增物插入到载体(pGLY011.005)。
-用Taq Expand(Roche)装配酿酒酵母的整合盒
CD063(正向)agatgccagaaacaaagcttgttgcaggtggtgctgctcatgcctgcaggtcaacatggt
CD064(反向)gtgtcgacgatcttagaagagtccaaaggtttgactggatgcagcttgcaaattaaagcc
程序：
95℃3分钟
30个循环：  95℃30秒
            57℃30秒
            68℃2分钟30秒
68℃10分钟
用酚/氯仿方法纯化PCR扩增物并将其引入载体TOPO 2.1(Invitrogen)中。用该载体转化感受态细菌(TOP 10Invitrogen)。用PCR检查转化并且通过测序检查PCR扩增物插入到载体(pGLY011.008)。
对于栗酒裂殖酵母，整合到序列PET6中
使用Taq Expand(Roche)
CD038(正向)和CD039(反向)
将PCR产物引入到载体TOPO-XL。用该载体转化感受态细菌(TOP10 Invitrogen)。用PCR检查转化并且通过测序检查PCR扩增物插入到载体(对于栗酒裂殖酵母是pGLY11.006并且对于酿酒酵母是pGLY11.007)。
8.3步骤3：酵母的改良
-感受态酵母的制备
如上述制备Alice和Elga菌株以便使它们有感受态。
-酵母的电穿孔
过程：含有酿酒酵母和栗酒裂殖酵母的表达盒的20μg质粒用限制性酶KpnI和XhoI消化。通过电穿孔将线性化的盒引入酵母Alice和Elga中。然后将酵母涂布在含有需要选择的琼脂糖YPD培养基上。
实施例9： 和Enrique菌株+岩藻糖基化(α1，6-岩藻糖转移 酶FUT8和GDP-岩藻糖转运蛋白)表达盒
9.1FUT8的表达盒
9.1.1步骤1：获得ORF
从人类胰腺和肺的cDNA进行PCR
程序：
94℃3分钟
35个循环：  94℃20秒
            58℃30秒
            72℃2分钟
72℃10分钟
1,801bp片段的扩增
caggactccagggaagtgagttgaaaatctgaaaatgcggccatggactggttcctggcgttggattatgctcattctttttgcc
tgggggaccttgctgttttatataggtggtcacttggtacgagataatgaccatcctgatcactctagccgagaactgtccaagat
tctggcaaagcttgaacgcttaaaacagcagaatgaagacttgaggcgaatggccgaatctctccggataccagaaggccct
attgatcaggggccagctataggaagagtacgcgttttagaagagcagcttgttaaggccaaagaacagattgaaaattacaa
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ttcctacagagtgaattgaagaaattaaagaacttagaaggaaatgaactccaaagacatgcagatgaatttcttttggatttagg
acatcatgaaaggtctataatgacggatctatactacctcagtcagacagatggagcaggtgattggcgggaaaaagaggcc
aaagatctgacagaactggttcagcggagaataacatatcttcagaatcccaaggactgcagcaaagccaaaaagctggtgt
gtaatatcaacaaaggctgtggctatggctgtcagctccatcatgtggtctactgcttcatgattgcatatggcacccagcgaac
actcatcttggaatctcagaattggcgctatgctactggtggatgggagactgtatttaggcctgtaagtgagacatgcacagac
agatctggcatctccactggacactggtcaggtgaagtgaaggacaaaaatgttcaagtggtcgagcttcccattgtagacagt
cttcatccccgtcctccatatttacccttggctgtaccagaagacctcgcagatcgacttgtacgagtgcatggtgaccctgcagt
gtggtgggtgtctcagtttgtcaaatacttgatccgcccacagccttggctagaaaaagaaatagaagaagccaccaagaagc
ttggcttcaaacatccagttattggagtccatgtcagacgcacagacaaagtgggaacagaagctgccttccatcccattgaag
agtacatggtgcatgttgaagaacattttcagcttcttgcacgcagaatgcaagtggacaaaaaaagagtgtatttggccacaga
tgacccttctttattaaaggaggcaaaaacaaagtaccccaattatgaatttattagtgataactctatttcctggtcagctggactg
cacaatcgatacacagaaaattcacttcgtggagtgatcctggatatacattttctctctcaggcagacttcctagtgtgtactttttc
atcccaggtctgtcgagttgcttatgaaattatgcaaacactacatcctgatgcctctgcaaacttccattctttagatgacatctact
attttgggggccagaatgcccacaatcaaattgccatttatgctcaccaaccccgaactgcagatgaaattcccatggaacctg
gagatatcattggtgtggctggaaatcattgggatggctattctaaaggtgtcaacaggaaattgggaaggacgggcctatatc
cctcctacaaagttcgagagaagatagaaacggtcaagtaccccacatatcctgaggctgagaaataaagctcagatggaag
agataaacgaccaaactcagttcga(SEQ ID：7)
抽提并且用QBIOgene试剂盒从琼脂糖胶中纯化PCR扩增物(自人类肺和胰腺cDNA的1,801bp)并且将其引入载体TOPO2.1。用这个载体转化感受态细菌(TOP10，Invitrogen)。用PCR检查转化并且通过测序检查PCR扩增物插入载体。
9.1.2步骤2：装配酿酒酵母的表达盒
-从栗酒裂殖酵母的基因组DNA扩增启动子mnt1
BS86(正向)和BS84(反向)
-用ORF(pGLY06.001)装配启动子mnt1(PCR产物)
BS86(正向)和BS88(反向)
抽提并且用Qiagen试剂盒从琼脂糖胶中纯化PCR扩增物并且将其引入载体pTarget。用这个载体转化感受态细菌(JM109，Progema)。用PCR检查转化并且通过测序检查PCR扩增物插入载体(pGLY06.003)。
用终止子CYC1(PCR产物)装配ORF(pGLY06.001)
CA011(正向)和BS41(反向)
抽提并且用Qiagen试剂盒从琼脂糖胶中纯化PCR扩增物并且将其引入载体pTarget。用这个载体转化感受态细菌(JM109，Progema)。用PCR检查转化并且通过测序检查PCR扩增物插入载体(pGLY06.002)。
-用ORF-终止子CYC1(PCR产物)装配nmt1-ORF(pGLY06.003)
BS86(正向)和BS41(反向)
-将整合用末端装配到酵母的营养缺陷标记中：
9.1.2.1酿酒酵母
FUT8表达盒的整合定位在酿酒酵母菌株的标记CAN1中。基因CAN1的失效导致对刀豆氨酸(canavanine)的营养缺陷。
BS147(正向)和BS148(反向)
抽提并且用Qiagen试剂盒从琼脂糖胶中纯化PCR扩增物并且将其引入载体pTarget。用这个载体转化感受态细菌(JM109，Progema)。用PCR检查转化并且通过测序检查PCR扩增物插入载体(pGLY06.005)。
9.1.2.2栗酒裂殖酵母
岩藻糖转移酶8的表达盒和对抗生素腐草霉素(phleomycin)有抗性的盒以串联的形式(in tandem)产生。将该双盒插入到简单的营养缺陷标记HIS5中。在该位点插入该盒将导致对腐草霉素的抗性以及对组氨酸的营养缺陷。
将以前获得的FUT8的表达盒与含有SV40启动子、抗腐草霉素的ORF以及终止子TEF的腐草霉素表达盒装配在一起。将这些串联的盒插入到标记HIS5中。
9.1.3步骤3：酵母的改良
-感受态酵母的制备
如上述制备
Figure A20088000608600411
和Enrique菌株以便使它们有感受态。
-酵母的电穿孔
过程：含有酿酒酵母和栗酒裂殖酵母的表达盒的20μg质粒用限制性酶EcoRI消化。通过电穿孔将线性化的盒引入酵母
Figure A20088000608600412
和Enrique中。将酵母以有限稀释涂布在琼脂糖YPD培养基上，被删除的标记对于药物不给予抗性。一旦释放了克隆，在基本培养基上建立复制子以便选择没有必需氨基酸就不能生长的克隆。
9.2GDP-岩藻糖转运蛋白的表达盒
9.2.1获得ORF
从人类肺的cDNA进行PCR
程序：
94℃3分钟
35个循环：  94℃20秒
            58℃30秒
            72℃2分钟
72℃10分钟
1,136bp片段的扩增
tgacccagctcctctgctaccatgaatagggcccctctgaagcggtccaggatcctgcacatggcgctgaccggggcctca
gacccctctgcagaggcagaggccaacggggagaagccctttctgctgcgggcattgcagatcgcgctggtggtctccctct
actgggtcacctccatctccatggtgttccttaataagtacctgctggacagcccctccctgcggctggacacccccatcttcgt
caccttctaccagtgcctggtgaccacgctgctgtgcaaaggcctcagcgctctggccgcctgctgccctggtgccgtggact
tccccagcttgcgcctggacctcagggtggcccgcagcgtcctgcccctgtcggtggtcttcatcggcatgatcaccttcaata
acctctgcctcaagtacgtcggtgtggccttctacaatgtgggccgctcactcaccaccgtcttcaacgtgctgctctcctacctg
ctgctcaagcagaccacctccttctatgccctgctcacctgcggtatcatcatcgggggcttctggcttggtgtggaccaggag
ggggcagaaggcaccctgtcgtggctgggcaccgtcttcggcgtgctggctagcctctgtgtctcgctcaacgccatctacac
cacgaaggtgctcccggcggtggacggcagcatctggcgcctgactttctacaacaacgtcaacgcctgcatcctcttcctgc
ccctgctcctgctgctcggggagcttcaggccctgcgtgactttgcccagctgggcagtgcccacttctgggggatgatgacg
ctgggcggcctgtttggctttgccatcggctacgtgacaggactgcagatcaagttcaccagtccgctgacccacaatgtgtcg
ggcacggccaaggcctgtgcccagacagtgctggccgtgctctactacgaggagaccaagagcttcctctggtggacgagc
aacatgatggtgctgggcggctcctccgcctacacctgggtcaggggctgggagatgaagaagactccggaggagcccag
ccccaaagacagcgagaagagcgccatgggggtgtgagcaccacaggcaccctggat(SEQ ID：8)
抽提并且用QIAGEN试剂盒从琼脂糖胶中纯化PCR扩增物并且将其引入载体TOPO2.1。用这个载体转化感受态细菌(TOP10，Invitrogen)。用PCR检查转化并且通过测序检查PCR扩增物插入载体(pGLY07.001)。
9.2.2步骤2：装配酿酒酵母和栗酒裂殖酵母的表达盒
-从pTarget扩增启动子SV40：
BS109(正向)和BS110(反向)
-用终止子CYCl(PCR产物)装配ORF(pGLY07.001)
CA013(正向)和BS41(反向)
抽提并且用Qiagen试剂盒从琼脂糖胶中纯化PCR扩增物并且将其引入载体pTarget。用这个载体转化感受态细菌(JM109，Promega)。用PCR检查转化并且通过测序检查PCR扩增物插入载体(pGLY07.002)。
9.2.2.1酿酒酵母
GDP-岩藻糖转运蛋白的表达盒的整合将定位在酿酒酵母菌株的营养缺陷标记TRP1中。基因TRP1的失效导致对毒剂5-氟维生素L的抗性。通过该盒改良的酵母将因此变得对该药有抗性但是对色氨酸仍是营养缺陷的。
-装配启动子SV40盒(PCR产物)、ORF(PCR产物)和终止子CYC1(PCR产物)
BS136(正向)和BS137(反向)
抽提并且用Qiagen试剂盒从琼脂糖胶中纯化PCR扩增物并且将其引入载体pTarget。用这个载体转化感受态细菌(JM109，Promega)。用PCR检查转化并且通过测序检查PCR扩增物插入载体(pGLY07.003)。
9.2.2.2栗酒裂殖酵母
GDP-岩藻糖转运蛋白的表达盒和对抗生素潮霉素(hygromycin)有抗性的盒以串联的形式产生。将该双盒插入到编码参与栗酒裂殖酵母的N-聚糖成熟的GMA12蛋白的基因中。在该位点插入该盒将导致对潮霉素的抗性但是也导致基因gma12的删除。
将以前获得的GDP-岩藻糖转运蛋白表达盒与含有SV40启动子、抗潮霉素的ORF以及终止子TEF的抗潮霉素表达盒装配在一起。将这些串联的盒插入到标记gma12中。
9.2.3步骤3：酵母的改良
-感受态酵母的制备：
如上述制备Apolline和Epiphanie菌株以便使它们有感受态。
-酵母的电穿孔
过程：含有酿酒酵母和栗酒裂殖酵母的表达盒的20μg质粒用限制性酶EcoRI消化。通过电穿孔将线性化的盒引入酵母Apolline和Epiphanie中。将酿酒酵母涂布在含有5-氟维生素L的YPD培养基上。将栗酒裂殖酵母以有限稀释涂布在琼脂糖YPD培养基上，被删除的标记对于药物不给予抗性。一旦释放了克隆，在基本培养基上建立复制子以便选择没有必需氨基酸就不能生长的克隆。
实施例10：Athena和Etienne菌株+N-乙酰葡萄糖胺转移酶III 的表达盒
10.1获得ORF
从鼠科大脑的互补DNA进行PCR
CB007(正向)Atgaagatgagacgctacaa
CB036(反向)ctagccctccactgtatc
程序：
94℃2分钟
30个循环：  94℃45秒
            56℃45秒
            72℃2分钟
72℃5分钟
无酶的胞质部分的bp片段的扩增：将其由用作蛋白的高尔基体定位的Mnt1的胞质部分代替。
10.2酿酒酵母和栗酒裂殖酵母菌株的表达盒的装配
10.2.1为酿酒酵母的装配
启动子nmt1的扩增
CB013：tatagtcgctttgttaaatcatatggccctctttctcagtaa
CB014：agcgaagactccgaagcccacttctttaagaccttatcc
终止子CYC1的扩增
用末端CAN1扩增表达盒
CB030(正向)：cagaaaatccgttccaagag
CB031(反向)：tgccacggtatttcaaagct
10.2.2为栗酒裂殖酵母的装配
GNTIII的表达盒与抗潮霉素的盒以串联的形式。插入GMA12。
10.3酵母的转化
实施例11：在酿酒酵母和栗酒裂殖酵母中参与高甘露糖基化(hypermannosylation)的基因的删除
11.1步骤1：在酵母Amélie、Arielle、
Figure A20088000608600441
Alice、Abel、Ashley、Athena、Azalée和Aurel中Mnn1基因的删除：
11.1.1构建和插入含有抗潮霉素基因的盒到Mnn1基因中
11.1.1.1构建表达盒
用Mnn15’末端扩增启动子CaMV
CB39：TTTATATTAAACCAAAGGTCTTTGAGATCGTGTACCATACTGCCTGCAGGTCAACATG
CB40：TTCTCGACAGACGTCGCGGTGAGTTCAGGCTTTTTACCCATCCGGGGATCCTCTAGAGTC
与启动子CaMV和Mnn1 3’末端有同源性的潮霉素-终止子TEF的扩增
CB41：TTCATTTGGAGAGGACCTCGACTCTAGAGGATCCCCGGATGGGTAAAAAGCCTGAACTC
CB42：GGTGTTATCTTTATTAGCATGTGACCAAACAGTGTTGACATCGACACTGGATGGCGGCGT
ATGGGTAAAAAGCCTGAACTCACCGCGACGTCTGTCGAGAAGTTTCTGATC
GAAAAGTTCGACAGCGTCTCCGACCTGATGCAGCTCTCGGAGGGCGAAGAA
TCTCGTGCTTTCAGCTTCGATGTAGGAGGGCGTGGATATGTCCTGCGGGTAAA
TAGCTGCGCCGATGGTTTCTACAAAGATCGTTATGTTTATCGGCACTTTGCATC
GGCCGCGCTCCCGATTCCGGAAGTGCTTGACATTGGGGAATTCAGCGAGAGC
CTGACCTATTGCATCTCCCGCCGTGCACAGGGTGTCACGTTGCAAGACCTGC
CTGAAACCGAACTGCCCGCTGTTCTGCAGCCGGTCGCGGAGGCCATGGATGC
GATCGCTGCGGCCGATCTTAGCCAGACGAGCGGGTTCGGCCCATTCGGACCG
CAAGGGGCGTGATTTCATATGCGCGATTGCTGATCCCCATGTGTATCACTGGC
AAACTGTGATGGACGACACCGTCAGTGCGTCCGTCGCGCAGGCTCTCGATGA
GCTGATGCTTTGGGCCGAGGACTGCCCCGAAGTCCGGCACCTCGTGCACGC
GGATTTCGGCTCCAACAATGTCCTGACGGACAATGGCCGCATAACAGCGGT
CATTGACTGGAGCGAGGCGATGTTCGGGGATTCCCAATACGAGGTCGCCAA
CATCTTCTTCTGGAGGCCGTGGTTGGCTTGTATGGAGCAGCAGACGCGCTAC
TTCGAGCGGAGGCATCCGGAGCTTGCAGGATCGCCGCGGCTCCGGGCGTAT
ATGCTCCGCATTGGTCTTGACCAACTCTATCAGAGCTTGGTTGACGGCAATT
TCGATGATGCAGCTTGGGCGCAGGGTCGATGCGACGCAATCGTCCGATCCG
GAGCCGGGACTGTCGGGCGTACACAAATCGCCCGCAGAAGCGCGGCCGTCT
GGACCGATGGCTGTGTAGAAGTACTCGCCGATAGTGGAAACCGACGCCCCA
GCACTCGTCCGAGGGCAAAGGAATAATCAGTACTGACAATAAAAAGATTCT
TGTTTTCAAGAACTTGTCATTTGTATAGTTTTTTTATATTGTAGTTGTTCTATT
TTAATCAAATGTTAGCGTGATTTATATTTTTTTTAGATGCGAAGTTAAGTGC
GCAGAAAGTAATATCATGCGTCAATCGTATGTGAATGCTGGTCGCTATACTG
CTGTCGATTCGATACTAACGCCGCCATCCAGTGTCGa
装配在酿酒酵母中的删除Mnn1基因用的插入盒
CB39：TTTATATTAAACCAAAGGTCTTTGAGATCGTGTACCATACTGCCTGCAGGTCAACATG
CB42：GGTGTTATCTTTATTAGCATGTGACCAAACAGTGTTGACATCGACACTGGATGGCGGCGT
11.1.1.2酵母的转化
-制备感受态酵母：
如上述制备菌株以便使它们有感受态
-酿酒酵母的电穿孔
过程：含有酿酒酵母的表达盒的20μg质粒用限制性酶消化。通过电穿孔将线性化的盒引入酵母中。在含有潮霉素的YPD培养基上选择酵母。
11.1.2删除在酵母Amélie、Arielle、
Figure A20088000608600451
Alice、Abel、Ashley、Athena、Azalée和Aurel中的Mnn9基因。
11.1.2.1构建用于整合到含有抗腐草霉素基因的Mnn9基因的盒。
用Mnn9 5’末端扩增启动子SV40
CB46：AAAGATCTTAACGTCGTCGACCATGTGCTTAAGCACGACGCAGGCAGAAGTATGCAAA
CB47：AAATCTCGTGATGGCAGGTTGGGCGTCGCTTGGTCGGCCATAGCTTTTTGCAAAAGCCTAG
与启动子SV40有同源性的腐草霉素-终止子TEF的扩增
CB48：GCTGTGGAATGTGTGTCAGTTAGGGTGTGGAAAGTCCCCAATGGCCGACCAAGCGACGCCC
CB49：GGTGTTATCTTTATTAGCATGTGACCAAACAGTGTTGACATCGACACTGGATGGCGGCGT
atggccgaccaagcgacgcccaacctgccatcacgagatttcgattccac
ggccgccttctatgaaaggttgggcttcggaatcgttttccgggacgccg
gctggatgatcctccagcgcggggatctcaagctggagttcttcgcccac
cccgggctcgatcccctcgcgagttggttcagctgctgcctgaggctgga
cgacctcgcggagttctaccggcagtgcaaatccgtcggcatccaggaaa
ccagcagcggctatccgcgcatccatgcccccgaactgcaggagtgggga
ggcacgatggccgctttggtcgacccggacgggacgctcctgcgcctgat
acagaacgaattgcttgcaggcatctcatgatcagtactgacaataaaaa
gattcttgttttcaagaacttgtcatttgtatagtttttttatattgtag
ttgttctattttaatcaaatgttagcgtgatttatattttttttcgcctc
gacatcatctgcccagatgcgaagttaagtgcgcagaaagtaatatcatg
cgtcaatcgtatgtgaatgctggtcgctatactgctgtcgattcgatact
aacgccgccatccagtgtcgaaaacgagctctcgagaacccttaat
11.1.2.2酵母的转化
-感受态酵母的制备：
如上述制备酵母以便使它们有感受态。
-酿酒酵母的电穿孔
过程：
含有酿酒酵母的表达盒的20μg质粒用限制性酶消化。通过电穿孔将线性化的盒引入酵母中。在含有腐草霉素的YPD培养基上选择酵母。
11.2步骤2：删除在栗酒裂殖酵母、Emma、Erika、Enrique、Elga、Etienne中的GMA12基因
11.2.1构建含有抗潮霉素基因的整合盒
ext-gma12/prom-CaMV/hph/Tef-term/ext-gma12
CB51：CAAAGATCTTAACGTCGTCGACCATGTGCTTAAGCACGACTGCCTGCAGGTCAACATG
CB52：ATATGATCCTTTTCTTGAGCAGACATCCAATCGGATCCTTTCGACACTGGATGGCGGCGT
11.2.2酵母的转化
-感受态酵母的制备：
如上述制备菌株以便使它们有感受态。
-酿酒酵母的电穿孔
过程：含有栗酒裂殖酵母的表达盒的20μg质粒用限制性酶消化。通过电穿孔将线性化的盒引入。在含有潮霉素的YPD培养基上选择酵母。
实施例12：菌株+酿酒酵母和栗酒裂殖酵母的N-聚糖唾液酸化用 的表达盒
为了获得在酿酒酵母和栗酒裂殖酵母中产生蛋白的N-聚糖的有效唾液酸化目的，首先不得不将唾液酸的生物合成途径引入到同样的酵母中。为完成这个，我们将脑膜炎奈瑟菌的CMP-唾液酸的生物合成途径，在胞质溶液中定位的酶引入酵母的基因组中。
用于唾液酸化作用的串联盒(从Athena、Aurel和Azalée菌株中)的制备
12.1盒S1
构建由启动子PET56、唾液酸合成酶的ORF、终止子CYC1然后是启动子PET565、CMP-唾液酸合成酶的ORF和终止子CYC1组成的串联的盒。
-获得ORF：
唾液酸合成酶(1,050bp)
Atgcaaaacaacaacgaatttaaaattggtaatcgttcagtaggttacaaccacgaaccattgattatctgtgaaatcggcatca
atcatgaaggctctttaaaaacagcttttgaaatggttgatgctgcctataatgcaggcgctgaagttgttaaacatcaaacacac
atcgttgaagacgaaatgtctgatgaggccaaacaagtcattccaggcaatgcagatgtctctatttatgaaattatggaacgttg
cgccctgaatgaagaagatgagattaaattaaaagaatacgtagagagtaagggtatgatttttatcagtactcctttctctcgtgc
agctgctttacgattacaacgtatggatattccagcatataaaatcggctctggcgaatgtaataactacccattaattaaactggt
ggcctcttttggtaagcctattattctctctaccggcatgaattctattgaaagcatcaaaaagtcggtagaaattattcgagaagc
aggggtaccttatgctttgcttcactgtaccaacatctacccaaccccttacgaagatgttcgattgggtggtatgaacgatttatct
gaagcctttccagacgcaatcattggcctgtctgaccataccttagataactatgcttgcttaggagcagtagctttaggcggttc
gattttagagcgtcactttactgaccgcatggatcgcccaggtccggatattgtatgctctatgaatccggatacttttaaagagct
caagcaaggcgctcatgctttaaaattggcacgcggcggcaaaaaagacacgattatcgcgggagaaaagccaactaaaga
tttcgcctttgcatctgtcgtagcagataaagacattaaaaaaggagaactgttgtccggagataacctatgggttaaacgccca
ggcaatggagacttcagcgtcaacgaatatgaaacattatttggtaaggtcgctgcttgcaatattcgcaaaggtgctcaaatca
aaaaaactgatattgaataa
CMP-唾液酸合成酶(687bp)：
atggaaaaacaaaatattgcggttatacttgcgcgccaaaactccaaaggattgccattaaaaaatctccggaaaatgaatggc
atatcattacttggtcatacaattaatgctgctatatcatcaaagtgttttgaccgcataattgtttcgactgatggcgggttaattgc
agaagaagctaaaaatttcggtgtcgaagtcgtcctacgccctgcagagctggcctccgatacagccagctctatttcaggtgt
aatacatgctttagaaacaattggcagtaattccggcacagtaaccctattacaaccaaccagtccattacgcacaggggctcat
attcgtgaagctttttctctatttgatgagaaaataaaaggatccgttgtctctgcatgcccaatggagcatcatccactaaaaacc
ctgcttcaaatcaataatggcgaatatgcccccatgcgccatctaagcgatttggagcagcctcgccaacaattacctcaggca
tttaggcctaatggtgcaatttacattaatgatactgcttcactaattgcaaataattgtttttttatcgctccaaccaaactttatattat
gtctcatcaagactctatcgatattgatactgagcttgatttacaacaggcagaaaacattcttaatcacaaggaaagctaa
-表达盒：
启动子PET56
CTTTGCCTTCGTTTATCTTGCCTGCTCATTTTTTAGTATATTCTTCGAAGAAATC
ACATTACTTTATATAATGTATAATTCATTATGTGATAATGCCAATCGCTAAGAAA
AAAAAAGAGTCATCCGCTAGGTGGAAAAAAAAAAATGAAAATCATTACCGA
GGCATAAAAAAATATAGAGTGTACTAGAGGAGGCCAAGAGTAATAGAAAAAG
AAAATTGCGGGAAAGGACTGTGTT
12.2盒S2
CMP-唾液酸转运蛋白的表达盒和对抗生素潮霉素有抗性的盒以串联的形式产生。将该双盒插入到mnn1基因中。将该盒插入到该位点将导致对潮霉素的抗性但是也导致mnn1基因的删除。
-获得ORF
来源于鼠科的CMP-唾液酸转运蛋白(1,011bp)
atggctccggcgagagaaaatgtcagtttattcttcaagctgtactgcttggcggtgatgactctggtggctgccgcttacaccg
tagctttaagatacacaaggacaacagctgaagaactctacttctcaaccactgccgtgtgtatcacagaagtgataaagttact
gataagtgttggcctgttagctaaggaaactggcagtttgggtagatttaaagcctcattaagtgaaaatgtcttggggagcccc
aaggaactggcgaagttgagtgtgccatcactagtgtatgctgtgcagaacaacatggccttcctggctctcagtaatctggatg
cagcagtgtaccaggtgacctatcaactgaagatcccctgcactgctttatgtactgttttaatgttaaatcgaacactcagcaaat
tacagtggatttccgtcttcatgctgtgtggtggggtcacactcgtacagtggaaaccagcccaagcttcaaaagtcgtggtagc
gcagaatccattgttaggctttggtgctatagctattgctgtattgtgctctggatttgcaggagtttattttgaaaaagtcttaaaga
gttccgacacttccctttgggtgagaaacattcagatgtatctgtcagggatcgttgtgacgttagctggtacctacttgtcagatg
gagctgaaattcaagaaaaaggattcttctatggctacacgtattatgtctggtttgttatcttccttgctagtgtgggaggcctcta
cacgtcagtggtggtgaagtatacagacaacatcatgaaaggcttctctgctgccgcagccattgttctttctaccattgcttcagt
cctactgtttggattacagataacactttcatttgcactgggagctcttcttgtgtgtgtttccatatatctctatgggttacccagaca
agatactacatccattcaacaagaagcaacttcaaaagagagaatcattggtgtgtga
-构建表达盒：
将CMP-唾液酸转运蛋白的表达盒(启动子CaMV、ORF、终止子CYC1)与含有启动子CaMV、抗潮霉素的ORF、以及终止子TEF的潮霉素抗性表达盒装配在一起。将这些串联的盒插入到标记mnn1中。
12.3盒S3：
唾液酸转移酶ST3GAL4的表达盒和对抗生素腐草霉素有抗性的盒以串联的形式产生。将该双盒插入到基因mnn9中。将该盒插入到该位点将导致对潮霉素的抗性但是也导致mnn9基因的删除。
-获得ORF
人类唾液酸转移酶ST3GAL4(990bp)
atggtcagcaagtcccgctggaagctcctggccatgttggctctggtcctggtcgtcatggtgtggtattccatctcccgggaa
gacagtttttattttcccatcccagagaagaaggagccgtgcctccagggtgaggcagagagcaaggcctctaagctctttgg
caactactcccgggatcagcccatcttcctgcggcttgaggattatttctgggtcaagacgccatctgcttacgagctgccctat
gggaccaaggggagtgaggatctgctcctccgggtgctagccatcaccagctcctccatccccaagaacatccagagcctca
ggtgccgccgctgtgtggtcgtggggaacgggcaccggctgcggaacagctcactgggagatgccatcaacaagtacgat
gtggtcatcagattgaacaatgccccagtggctggctatgagggtgacgtgggctccaagaccaccatgcgtctcttctaccct
gaatctgcccacttcgaccccaaagtagaaaacaacccagacacactcctcgtcctggtagctttcaaggcaatggacttccac
tggattgagaccatcctgagtgataagaagcgggtgcgaaagggtttctggaaacagcctcccctcatctgggatgtcaatcct
aaacagattcggattctcaaccccttcttcatggagattgcagctgacaaactgctgagcctgccaatgcaacagccacggaa
gattaagcagaagcccaccacgggcctgttggccatcacgctggccctccacctctgtgacttggtgcacattgccggctttgg
ctacccagacgcctacaacaagaagcagaccattcactactatgagcagatcacgctcaagtccatggcggggtcaggccat
aat gtctcccaagaggccctggccattaagcggatgctggagatgggagctatcaagaacctcacgtccttctga
鼠科动物唾液酸转移酶ST3GAL4(1,002bp)
atgaccagcaaatctcactggaagctcctggccctggctctggtccttgttgttgtcatggtgtggtattccatctcccgagaaga
taggtacattgagttcttttattttcccatctcagagaagaaagagccatgcttccagggtgaggcagagagacaggcctctaag
atttttggcaaccgttctagggaacagcccatctttctgcagcttaaggattatttttgggtaaagacgccatccacctatgagctg
ccctttgggactaaaggaagtgaagaccttcttctccgggtgctggccatcactagctattctatacctgagagcataaagagcc
tcgagtgtcgtcgctgtgttgtggtgggaaatgggcaccggttgcggaacagctcgctgggcggtgtcatcaacaagtacga
cgtggtcatcagattgaacaatgctcctgtggctggctacgagggagatgtgggctccaagaccaccatacgtctcttctatcct
gagtcggcccactttgaccctaaaatagaaaacaacccagacacgctcttggtcctggtagctttcaaggcgatggacttccac
tggattgagaccatcttgagtgataagaagcgggtgcgaaaaggcttctggaaacagcctcccctcatctgggatgtcaaccc
caaacaggtccggattctaaaccccttctttatggagattgcagcagacaagctcctgagcctgcccatacaacagcctcgaaa
gatcaagcagaagccaaccacgggtctgctagccatcaccttggctctacacctctgcgacttagtgcacattgctggctttgg
ctatccagatgcctccaacaagaagcagaccatccactactatgaacagatcacacttaagtctatggcgggatcaggccata
atgtctcccaagaggctatcgccatcaagcggatgctagagatgggagctgtcaagaacctcacatacttctga
将CMP-唾液酸转运蛋白的表达盒(启动子CaMV、ORF、终止子CYC1)与含有启动子CaMV、抗潮霉素的ORF以及终止子TEF的抗潮霉素的表达盒装配在一起。将这些串联的盒插入到标记mnn1中。
实施例13：同质的糖基化EPO的产生
13.1人类促红细胞生成素(EPO)的核苷酸序列的扩增
用适当的引物从人类的肾互补DNA中获得人类EPO核苷酸序列的扩增物。
13.2克隆酿酒酵母的表达载体中的EPO序列：
将截去了其终止密码的人类huEPO的核苷酸序列(585个碱基对)整合到酿酒酵母的表达载体中。在引入序列和质粒pSC的序列(抗原决定簇V5和多组氨酸标签)之间的阅读框的连续性通过对获得的质粒(pSC-EPO)测序而证实。发现蛋白EPO的表达是在酿酒酵母菌株通过半乳糖诱导的启动子pGAL1的控制之下。具有质粒的酵母的选择是通过对尿嘧啶的原养型回复实现的(在质粒中存在URA3序列)。
在表达质粒中获得的序列
  1 ATGGGGGTGC ACGAATGTCC TGCCTGGCTG TGGCTTCTCC TGTCCCTGCT
 51 GTCGCTCCCT CTGGGCCTCC CAGTCCTGGG CGCCCCACCA CGCCTCATCT
101 GTGACAGCCG AGTCCTGGAG AGGTACCTCT TGGAGGCCAA GGAGGCCGAG
151 AATATCACGA CGGGCTGTGC TGAACACTGC AGCTTGAATG AGAATATCAC
201 TGTCCCAGAC ACCAAAGTTA ATTTCTATGC CTGGAAGAGG ATGGAGGTCG
251 GGCAGCAGGC CGTAGAAGTC TGGCAGGGCC TGGCCCTGCT GTCGGAAGCT
301 GTCCTGCGGG GCCAGGCCCT GTTGGTCAAC TCTTCCCAGC CGTGGGAGCC
351 CCTGCAGCTG CATGTGGATA AAGCCGTCAG TGGCCTTCGC AGCCTCACCA
401 CTCTGCTTCG GGCTCTGGGA GCCCAGAAGG AAGCCATCTC CCCTCCAGAT
451 GCAGCCTCAG CTGCTCCGCT CCGAACAATC ACTGCTGACA CTTTCCGCAA
501 ACTCTTCCGA GTCTACTCCA ATTTCCTCCG GGGAAAGCTG AAGCTGTACA
551 CAGGGGAGGC CTGCAGGACA GGCGACAGAA AGGGCGAGCT TCGAGGTCAC
601 CCATTCGAAG GTAAGCCTAT CCCTAACCCT CTCCTCGGTC TCGATTCTAC
651 GCGTACCGGT CATCATCACC ATCACCATTG A(SEQ ID：11)
在表达质粒中经过测序的EPO的蛋白序列(SEQ ID：12)
MGVHECPAWLWLLLSLLSLPLGLPVLGAPPRLICDSRVLERYLLEAKEAENITTG
CAEHCSLNENITVPDTKVNFYAWKRMEVGQQAVEVWQGLALLSEAVLRGQAL
LVNSSQPWEPQLHVDKAVSGLRSLTTLLRALGAQKEAISPPDAASAAPLRTITAD
TFRKLFRVYSNFLRGKLKLYTGEACRTGDRKGELRGHPFEGKPIPNPLLGLDSTR
TGHHHHHH*
抗原决定簇V5  多组氨酸
13.3RNA的抽提：
将酵母在16000g离心5分钟。除去上清并且将沉淀重悬在500μL的TES缓冲液(10mM TrisHCl pH7.510mM EDTA，0.5％SDS)中。加入200μL酚和200μL氯仿，然后以每5分钟震荡30秒在65℃孵育20分钟并且在-80℃孵育1小时。以13,200rpm离心20分钟，然后回收水相并且加入335μL酚和67μL氯仿。震荡并且以11,000rpm离心5分钟。回收水相并且加入300μL氯仿。震荡并且以13,200rpm离心2分钟。回收水相并且加入pH 5.2的30μL 3M醋酸钠和600μL的无水乙醇。在-20℃孵育1小时。以13,200rpm离心15分钟。除去上清同时小心沉淀。令其干燥，将其吸收在100μL EDPC水中，然后将其置于有violet Nucleospin(Nucleospin RNAII)过滤器的管中。以11,000g离心1分钟。除去过滤器并且加入350μL 70％乙醇。加载NucleospinRNAII柱。以8000g离心30秒。将柱置于新的管中，加入350μL的膜脱盐缓冲液。以11,000g离心1分钟。将95μL DNA酶(DNase)溶液置于柱的中心，然后在室温孵育15分钟。加入200μL RA2溶液(使DNA酶失活)并且以8,000g离心30秒。将600μL RA3溶液加入柱的中心。以8,000g离心30秒。将柱置于新的管中，加入250μL RA3溶液。以11,000g离心2分钟以驱动该柱。将柱置于1.5mL管中并且加入50μL DEPC水。以11,000g离心1分钟。将样品储存在-80℃。
13.4逆转录：用于RT-PCR的Super Script III第一链合成系统(SuperScript III First-Strand Synthesis System)
5μg RNA                  最多8μL
随机六聚体    50ng/μL    1μL
dNTP混合物    10mM        1μL
DEPC水                    qsp 10μL
在65℃孵育5分钟
加入10μL转录混合物：     RT缓冲液    10X        2μL
                          MgCl2       25mM       4μL
                          DTT         0.1M       2μL
                          RNase Out   40U/μL    1μL
                          SuperScript 200U/μL   1μL
孵育      25℃10分钟
          50℃50分钟
        85℃5分钟
在冰中恢复并且加入1μL RNaseH。留在37℃孵育20分钟，然后在-20℃储存cDNA。
13.5蛋白的抽提：
在4℃以1,500g离心5分钟之后，在500μL的无菌水中吸收细胞沉淀，然后在4℃以最高速度离心30秒。将沉淀吸收在500μL磷酸钠50mM裂解缓冲液，pH 7.4，5％甘油，1mM PMSF中，在4℃以1,500g离心10分钟。然后将沉淀吸收在需要获得50-100OD的裂解缓冲液体积中。然后将样品用玻璃珠震荡4×30秒并且进行以最大速度离心10分钟以便从蛋白上清中分离珠子和细胞碎片。进行对上清的BCA分析。
13.6EPO的纯化：
首先将总蛋白用10mM Tris HCl缓冲液，pH 6.0透析。在用10mMTris-HCl pH 6.0平衡阳离子交换SP葡聚糖凝胶(Sephadex)C50柱之后，将所有经过透析的蛋白加载在柱上。在用10mM Tris HCl缓冲液pH 6.0洗柱之后，用10mM Tris HCl缓冲液pH 6.0、250mM NaCl将蛋白洗脱下来。在280nm检测每个组份的吸收以及通过Bradford分析检测洗脱蛋白的量。然后在12％丙烯酰胺胶上用SDS-PAGE电泳分析蛋白。
13.7EPO蛋白的检测-Western印记法(Western Blot)
将总蛋白转移到硝酸纤维素膜上以便进行通过抗-EPO抗体(R&DSystems)的检测。转移之后，将膜用封闭溶液(TBS，1％封闭溶液(Roche))饱和1小时。然后将膜与抗-EPO抗体溶液接触(1∶500稀释)1小时。在用0.1％Tween 20-TBS漂洗三次后，将膜与第二抗-小鼠-HRP抗体接触以便进行通过化学发光(chemiluminescence)(Roche检测溶液)的检测。
141.结果：
14.1：在Och1基因中整合了卡那霉素盒的克隆的验证
为了抑制Och1活性，在其整合之后将引入的盒完全测序以便在酵母的基因组中定位受影响的基因组区域。然后完成了酶活性的缺失，加强了前面的结果，然后用质谱测定聚糖的结构。
在1％琼脂糖-TBE胶上对从酿酒酵母克隆基因组DNA完成的PCR反应的分析显示具有卡那霉素盒的特异寡核苷酸对的2kb扩增片段。该酿酒酵母克隆在培养基中具有对卡那霉素的抗性。该片段的大小符合卡那霉素盒的理论大小。第二片段是通过卡那霉素盒内部的一个寡核苷酸和与Och1基因杂交的盒外部的一个寡核苷酸的方法扩增的。预期片段的理论大小是1.5kb，其符合获得片段的大小。因此我们可以定论克隆1、2、3和4确实已经整合了卡那霉素盒并且将后者整合到Och1基因中(见图3)。
在对培养基中存在的卡那霉素有抗性的栗酒裂殖酵母菌株上进行同样类型的PCR。因此，将每个菌株的两个突变克隆分离并且检测α-1，6-甘露糖转移酶酶活性的缺失。
检测在突变酵母菌株上的甘露糖转移酶Och1的活性
在通过酿酒酵母和栗酒裂殖酵母中的同源重组获得的突变Δoch1中验证Och1活性的缺失：
在通过PCR验证野生酿酒酵母和栗酒裂殖酵母的卡那霉素表达盒的插入之后，检测该插入的阳性克隆的甘露糖转移酶Och1活性的缺失。检测在酿酒酵母和栗酒裂殖酵母的微粒体上Och1的活性。图4显示Och1活性的检测在a-良酒酵母的野生菌株和所选克隆的微粒体组份，b-栗酒裂殖酵母的野生菌株和所选克隆的微粒体组份。根据图4，我们可以观察到在酿酒酵母(a)和栗酒裂殖酵母(b)的所选克隆中Och1酶活性的缺失。
通过N-聚糖的分析验证菌株：
还原和烷基化并且用胰蛋白酶消化来自两种改良菌株的总蛋白。通过SepPak C18除去自由多糖。回收的肽和糖肽经PNGase处理。在通过质谱在Maldi-Tof模式中分析聚糖之前，在SepPak C18上纯化然后甲基化聚糖。图5显示在菌株Adèle和Edgar的N-聚糖上进行的质谱。
酵母的命名：
酿酒酵母Δoch1＝Adèle
栗酒裂殖酵母Δoch1＝Edgar
两种菌株具有从Man7至Man10的寡甘露糖苷形式的N-聚糖，与在酿酒酵母的野生菌株中的相比，较短形式表明缺失了野生的聚甘露糖基化形式。
Edgar菌株(Δoch1)的主要结构是Man9和Man8，是在哺乳动物中新合成的蛋白运输到内质网中常见的结构。这提示由于高尔基体的甘露糖转移酶作用的不可能引起糖基化的阻断，转移酶只将甘露糖移植到聚糖上，在聚糖上酶Och1已经移植了一个连接在α1，6位置的甘露糖。
14.2在URA3基因中整合了甘露糖苷酶I盒的克隆的验证
对在基因URA3中甘露糖苷酶I表达盒的插入是阳性的Adèle和Edgar酵母检测其甘露糖苷酶I的生化活性。图6显示酿酒酵母和栗酒裂殖酵母在微粒体中的甘露糖苷酶活性的分析。实验进行三次重复。在野生的酿酒酵母和栗酒裂殖酵母菌株中，我们可以观察到不被DMJ抑制的甘露糖苷酶活性。相反，所选菌株具有在DMJ处理过程中测定的甘露糖苷酶活性的显著抑制。另外，因为检定的甘露糖苷酶I活性在酵母的微粒体中存在，我们可以推断该酶在顺面高尔基体/内质网的分泌途径中表达，显示细胞系统很好地识别整合在蛋白C-末端的HDEL滞留信号。
酵母的命名：
酿酒酵母Adèle+甘露糖苷酶I＝Amélie
栗酒裂殖酵母Edgar+甘露糖苷酶I＝Emma
14.3在改良酵母中整合了N-乙酰葡萄糖胺转移酶(GlcNAc转移酶I)盒的克隆的验证：
图7显示野生和改良酵母在微粒体中GlcNAc转移酶I的活性。
在Amélie-GlcNacTI和Emma-GlcNacTI酵母的微粒体或组份中，我们观察到与在对照酵母(野生的和/或Δoch1-MdseI酵母)中观察到的标记相比，通过放射性GlcNAc基团转移的受体标记的增加。该转移涉及通过GlcNAcTI的表达在改良酵母中的N-乙酰葡萄糖胺转移酶活性的存在。
改良酵母的命名：
酿酒酵母Amélie+GlcNAcTI＝Agathe
栗酒裂殖酵母Emma+GlcNAcTI＝Egée
14.4在改良酵母中整合了UDP-GlcNAc转运蛋白盒的克隆的验证
在亲代或改良酵母培养物上通过RT-PCR分析UDP-GlcNAc转运蛋白的表达。在总的被抽提RNA的逆转录步骤之后，通过使用UDP-GlcNAc转运蛋白的特异引物的PCR(巢式PCR)分析cDNA。因此，在通过UDP-GlcNAc转运蛋白的表达盒改良的酵母中观察到该转运蛋白的mRNA的表达(图8)。
改良酵母的命名：
酿酒酵母Agathe+UDP-GlcNAc转运蛋白＝Arielle
栗酒裂殖酵母Egée+UDP-GlcNAc转运蛋白＝Erika
14.5在改良酵母中整合了甘露糖苷酶II盒的克隆的验证：
a-通过PCR扩增验证
通过PCR检测酿酒酵母和栗酒裂殖酵母的所选克隆以便检查在酵母基因组中的甘露糖苷酶II表达盒的存在。
b-甘露糖苷酶II的表达
在亲代或改良酵母的培养物上通过RT-PCR分析甘露糖苷酶II的表达。在经抽提的RNA的逆转录步骤之后，通过使用特异的甘露糖苷酶II的引物用PCR分析cDNA(巢式PCR)。因此在通过甘露糖苷酶II表达盒改良的酵母中观察到该蛋白的mRNA的表达。
c-甘露糖苷酶II活性的检测
对于甘露糖苷酶II表达盒的插入是阳性的Adéle和Edgar酵母，检测其甘露糖苷酶II的生化活性。
根据图9，我们可以观察到在亲代酿酒酵母和栗酒裂殖酵母菌株中对苦马豆碱的抑制作用不敏感的甘露糖苷酶活性。相反，所选菌株具有当用苦马豆碱处理时测定的甘露糖苷酶活性的显著抑制。另外，因为在高尔基体酵母组份中检测到测定的甘露糖苷酶II活性，我们可以推断在高尔基体系统分泌途径中适当地表达了该酶。
改良酵母的命名：
Figure A20088000608600551
栗酒裂殖酵母Erika+甘露糖苷酶II＝Enrique
14.6在改良酵母中整合了N-乙酰葡萄糖胺转移酶II盒的克隆的验证：
a-通过PCR扩增验证
通过PCR检测酿酒酵母和栗酒裂殖酵母的所选克隆以便检查在酵母基因组中GlcNAc转移酶II表达盒的存在(结果未显示)。
b-GlcNAc转移酶II的表达：
在亲代或改良酵母培养物上通过RT-PCR分析GlcNAc转移酶II的表达。在经抽提的RNA的逆转录步骤之后，通过GlcNAc转移酶II的特异引物用PCR分析cDNA(巢式PCR)。因此在通过GlcNAc转移酶II表达盒改良的酵母中观察到经转录的mRNA的表达(结果未显示)。
改良酵母的命名：
Figure A20088000608600561
栗酒裂殖酵母Enrique+GlcNAc转移酶II＝Elga
14.7整合了半乳糖转移酶I盒的克隆的验证
a-通过PCR扩增验证
通过PCR检测酿酒酵母和栗酒裂殖酵母的所选克隆以便检查在酵母基因组中GalTI表达盒的存在(结果未显示)。
b-半乳糖转移酶I的表达：
在亲代或改良酵母的培养物上通过RT-PCR分析GalTI的表达。在经抽提的RNA的逆转录步骤之后，通过使用GalTI的特异引物用PCR分析cDNA(巢式PCR)。因此在通过GalTI表达盒改良的酵母中观察到经转录的mRNA的表达(结果未显示)。
c-GalTI的活性
在抽提改良酵母的总蛋白之后，将2μg蛋白放置在硝酸纤维素膜上。然后将膜用偶联了生物素的鸡冠珊瑚树凝集素(erythrina cristagallilectin)孵育，该凝集素可以特异地识别糖蛋白的聚糖上存在的Gal-β-1，4-GlcNAc单位的半乳糖。将膜与偶联了辣根过氧化物酶(HRP)的链霉亲和素(streptavidin)接触以便进行通过化学发光(Roche检测溶液)的检测。
14.8整合了GDP-岩藻糖转运蛋白盒的克隆的验证：
a-通过PCR扩增验证
通过PCR检测酿酒酵母和栗酒裂殖酵母的所选克隆以便检查在酵母基因组中的GDP-岩藻糖表达盒的存在。
b-GDP-岩藻糖转运蛋白的表达：
在亲代改良酵母的培养物上通过RT-PCR分析GDP-岩藻糖转运蛋白的表达。在经抽提的RNA的逆转录步骤之后，通过使用GDP-岩藻糖转运蛋白的特异引物用PCR分析cDNA(巢式PCR)。因此在通过GDP-岩藻糖转运蛋白表达盒改良的酵母中观察到经转录的mRNA的表达(图10)。
改良酵母的命名：
栗酒裂殖酵母Enrique+GDP-岩藻糖转运蛋白＝Epiphanie
14.9整合了岩藻糖转移酶8(FUT8)的克隆的验证
a-通过PCR扩增验证
通过PCR检测酿酒酵母和栗酒裂殖酵母的所选克隆以便检查在酵母基因组中的FUT8表达盒的存在。
b-FUT8的表达：
在亲代或改良酵母的培养物上通过RT-PCR分析FUT8的表达。在经抽提的RNA的逆转录步骤之后，通过使用FUT8的特异引物用PCR分析cDNA(巢式PCR)。因此在通过FUT8表达盒改良的酵母中观察到经转录的mRNA的表达(结果未显示)。
改良酵母的命名：
酿酒酵母Apolline+FUT8＝Ashley
栗酒裂殖酵母Epiphanie+FUT8＝Esther
14.10在Amélie菌株中EPO表达的特殊例子
Amélie菌株具有专一产生N-聚糖Man5GlcNAc2(图11)的能力，该结构是在哺乳动物中遇到的，被认为是一种简单类型的聚糖；并且作为用于加工带有半乳糖、岩藻糖或唾液酸的更复杂聚糖的基础。在上面描述了该菌株中的每个基因组改良的出现。这些步骤的每一个进入了包括选择最佳产生克隆和机会百分比最大化的验证“包”以便获得可利用的克隆。使用的方法允许对遗传改良过程的完全控制：需要整合的序列是完全已知的，如同未来整合的目标基因组区。关于可能的断裂效应，后者的位点更需要广泛的研究，这就是为什么由于其断裂之后获得的表现型缺失效应而需要最后选择整个目标。
进行追踪产生克隆的基因组稳定性的整个过程：在每次产生之后，定期将克隆移出到其原始选择用的严苛培养基上，并且再开始验证过程。克隆所有的表达盒以便在某个菌株的基因组重排的情况下，可以进行有机体的遗传改进。整合盒的过程不是标准化的并且如同使用者安排好的，可以设想产生“根据需要的”菌株以便获得特异的糖基化。
Amélie菌株是应该用作加工任何其它为了产生人源化杂交或复合聚糖的菌株的基础克隆。
在改良酵母中用作表达EPO的质粒含有启动子Gall。该启动子是酿酒酵母中已知最强的启动子之一并且现在被用于产生重组蛋白。该启动子通过半乳糖被诱导并且通过葡萄糖被抑制。事实上，在甘油中的酿酒酵母培养物中，加入半乳糖允许以约1,000倍诱导GAL基因。如果在没有半乳糖时在该培养物中加入葡萄糖，GAL基因将不再被诱导，只达到单独用半乳糖获得的1％的水平(Johnston，M.(1987)Microbiol.Rev.)。在5’通过加入抗原决定簇V5以及多组氨酸标签修改我们质粒中的人类EPO的整合序列以便帮助检测和纯化产生的蛋白。
首先用于产生人类EPO的酵母在不含尿嘧啶的YNB培养基、2％葡萄糖中培养直到达到OD＞12。在24-48小时培养之后，将2％半乳糖加入到培养物中以便诱导产生我们感兴趣的蛋白。在诱导0、6、24和48小时之后取出样品。
在改良酵母中EPO mRNA的表达：
对总的经抽提的RNA的RT-PCR分析表明在被半乳糖诱导后(图12带1和3)转化的酵母克隆中的EPO信使RNA的表达与在无半乳糖诱导(图12带2和4)的改良酵母中观察到的不同。因此半乳糖的存在导致EPO基因转录的诱导。对扩增片段的测序证实了恰当的mRNA的产生。
在改良酵母中表达的EPO蛋白的纯化：
通过半乳糖诱导rhuEPO蛋白表达后获得的总蛋白然后置于平衡至pH 6的葡聚糖凝胶C50树脂上。在柱的出口检测280nm的吸收(图13)。在12％丙烯酰胺胶上通过SDS-PAGE电泳分析从柱中洗脱的蛋白。
在SDS-PAGE胶的迁移之后，或通过考马斯蓝染色(图14)或通过western印记完成对蛋白的分析。在这种情况下将蛋白转移到硝酸纤维素膜上以便进行通过抗-EPO抗体的检测(R&D Systems)。
图15显示约35kDa蛋白的存在。该蛋白是考马斯蓝染色中的大多数蛋白并且在western印记分析中通过抗-EPO抗体被显示(在柱出口的第29管)。
因此所有这些结果显示了通过遗传改良酵母产生EPO蛋白。
序列表
<110>Glycode
<120>产生同质糖蛋白的遗传改良酵母
<130>D25151
<140>PCT/EP2008/050888
<141>2008-01-25
<150>FR 0753050
<151>2007-02-02
<160>27
<170>专利版本3.3
<210>1
<211>1644
<212>DNA
<213>秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)
<220>
<223>alpha-1-2甘露糖苷酶I
<400>1
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<210>2
<211>1387
<212>DNA
<213>人类(Homo sapiens)
<220>
<223>含有用于高尔基体定位的Mnn9的胞质结构域的N-乙酰-葡萄糖胺转移酶
<400>2
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gtccttc                                                             1387
<210>3
<211>916
<212>DNA
<213>人类
<220>
<223>UDP-GlcNAc转运蛋白
<400>3
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<210>4
<211>3453
<212>DNA
<213>小鼠(Mus musculus)
<220>
<223>甘露糖苷酶II
<400>4
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gaatctcgta taagggctgc tgaaattctt taccagttgg ccttgaaaca agctcagaaa  1620
tacaagataa ataaatttct ttcatcacct cattacacaa cactgacaga agccagaagg  1680
aacttaggac tatttcagca tcatgatgcc atcacaggaa ccgcgaaaga ctgggtggtt  1740
gtggactatg gtaccagact ctttcagtca ttaaattctt tggagaagat aattggagat  1800
tctgcatttc ttctcatttt aaaggacaaa aagctgtacc agtcagatcc ttccaaagcc  1860
ttcttagaga tggatacgaa gcaaagttca caagattctc tgccccaaaa aattataata  1920
caactgagcg cacaggagcc aaggtacctt gtggtctaca atccctttga acaagaacgg  1980
cattcagtgg tgtccatccg ggtaaactcc gccacaggga aagtgctgtc tgattcggga  2040
aaaccggtgg aggttcaagt cagtgcagtt tggaacgaca tgaggacaat ttcacaagca  2100
gcctatgagg tttcttttct agctcatata ccaccactgg gactgaaagt gtttaagatc  2160
ttagagtcac aaagttcaag ctcacacttg gctgattatg tcctatataa taatgatgga  2220
ctagcagaaa atggaatatt ccacgtgaag aacatggtgg atgctggaga tgccataaca  2280
atagagaatc ccttcctggc gatttggttt gaccgatctg ggctgatgga gaaagtgaga  2340
aggaaagaag acagtagaca gcatgaactg aaggtccagt tcctgtggta cggaaccacc  2400
aacaaaaggg acaagagcgg tgcctacctc ttcctgcctg acgggcaggg ccagccatat  2460
gtttccctaa gaccgccctt tgtcagagtg acacgtggaa ggatctactc agatgtgacc  2520
tgtttcctcg aacacgttac tcacaaagtc cgcctgtaca acattcaggg aatagaaggt  2580
cagtccatgg aagtttctaa tattgtaaac atcaggaatg tgcataaccg tgagattgta  2640
atgagaattt catctaaaat aaacaaccaa aatagatatt atactgacct aaatggatat  2700
cagattcagc ctagaaggac catgagcaaa ttgcctcttc aagccaacgt ttacccgatg  2760
tgcacaatgg cgtatatcca ggatgctgag caccggctca cgctgctctc tgctcagtct  2820
ctaggtgctt ccagcatggc ttctggtcag attgaagtct tcatggatcg aaggctcatg  2880
caggatgata accgtggcct tgggcaaggc gtccatgaca ataagattac agctaatttg  2940
tttcgaatcc tcctcgagaa gagaagcgct gtgaacatgg aagaagaaaa gaagagccct  3000
gtcagctacc cttccctcct cagccacatg acttcgtcct tcctcaacca tccctttctc  3060
cccatggtac taagtggcca gctcccctcc cctgcctttg agctgctgag tgaatttcct  3120
ctgctgcagt cctctctacc ttgtgatatc catctggtca acctgcggac aatacaatca  3180
aagatgggca aaggctattc ggatgaggca gccttgatcc tccacaggaa agggtttgat  3240
tgccagttct ccagcagagg catcgggcta ccctgttcca ctactcaggg aaagatgtca  3300
gttctgaaac ttttcaacaa gtttgctgtg gagagtctcg tcccttcctc tctgtccttg  3360
atgcactccc ctccagatgc ccagaacatg agtgaagtca gcctgagccc catggagatc  3420
agcacgttcc gtatccgctt gcgttggacc tga                               3453
<210>5
<211>1344
<212>DNA
<213>人类
<220>
<223>N-乙酰-葡萄糖胺转移酶II
<400>5
atgaggttcc gcatctacaa acggaaggtg ctaatcctga cgctcgtggt ggccgcctgc     60
ggcttcgtcc tctggagcag caatgggcga caaaggaaga acgaggccct cgccccaccg    120
ttgctggacg ccgaacccgc gcggggtgcc ggcggccgcg gtggggacca cccctctgtg    180
gctgtgggca tccgcagggt ctccaacgtg tcggcggctt ccctggtccc ggcggtcccc    240
cagcccgagg cggacaacct gacgctgcgg taccggtccc tggtgtacca gctgaacttt    300
gatcagaccc tgaggaatgt agataaggct ggcacctggg ccccccggga gctggtgctg    360
gtggtccagg tgcataaccg gcccgaatac ctcagactgc tgctggactc acttcgaaaa    420
gcccagggaa ttgacaacgt cctcgtcatc tttagccatg acttctggtc gaccgagatc    480
aatcagctga tcgccggggt gaatttctgt ccggttctgc aggtgttctt tcctttcagc    540
attcagttgt accctaacga gtttccaggt agtgacccta gagattgtcc cagagacctg    600
ccgaagaatg ccgctttgaa attggggtgc atcaatgctg agtatcccga ctccttcggc    660
cattatagag aggccaaatt ctcccagacc aaacatcact ggtggtggaa gctgcatttt    720
gtgtgggaaa gagtgaaaat tcttcgagat tatgctggcc ttatactttt cctagaagag    780
gatcactact tagccccaga cttttaccat gtcttcaaaa agatgtggaa actgaagcag    840
caagagtgcc ctgaatgtga tgttctctcc ctggggacct atagtgccag tcgcagtttc    900
tatggcatgg ctgacaaggt agatgtgaaa acttggaaat ccacagagca caatatgggt    960
ctagccttga cccggaatgc ctatcagaag ctgatcgagt gcacagacac tttctgtact   1020
tatgatgatt ataactggga ctggactctt caatacttga ctgtatcttg tcttccaaaa   1080
ttctggaaag tgctggttcc tcaaattcct aggatctttc atgctggaga ctgtggtatg   1140
catcacaaga aaacctgtag accatccact cagagtgccc aaattgagtc actcttaaat   1200
aataacaaac aatacatgtt tccagaaact ctaactatca gtgaaaagtt tactgtggta   1260
gccatttccc cacctagaaa aaatggaggg tggggagata ttagggacca tgaactctgt   1320
aaaagttata gaagactgca gtga                                          1344
<210>6
<211>1047
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>缺少人类靶向序列的半乳糖转移酶I
<400>6
ccccaactgg tcggagtctc cacaccgctg cagggcggct cgaacagtgc cgccgccatc     60
gggcagtcct ccggggagct ccggaccgga ggggcccggc cgccgcctcc tctaggcgcc    120
tcctcccagc cgcgcccggg tggcgactcc agcccagtcg tggattctgg ccctggcccc    180
gctagcaact tgacctcggt cccagtgccc cacaccaccg cactgtcgct gcccgcctgc    240
cctgaggagt ccccgctgct tgtgggcccc atgctgattg agtttaacat gcctgtggac    300
ctggagctcg tggcaaagca gaacccaaat gtgaagatgg gcggccgcta tgcccccagg    360
gactgcgtct ctcctcacaa ggtggccatc atcattccat tccgcaaccg gcaggagcac    420
ctcaagtact ggctatatta tttgcaccca gtcctgcagc gccagcagct ggactatggc    480
atctatgtta tcaaccaggc gggagacact atattcaatc gtgctaagct cctcaatgtt    540
ggctttcaag aagccttgaa ggactatgac tacacctgct ttgtgtttag tgacgtggac    600
ctcattccaa tgaatgacca taatgcgtac aggtgttttt cacagccacg gcacatttcc    660
gttgcaatgg ataagtttgg attcagccta ccttatgttc agtattttgg aggtgtctct    720
gctctaagta aacaacagtt tctaaccatc aatggatttc ctaataatta ttggggctgg    780
ggaggagaag atgatgacat ttttaacaga ttagttttta gaggcatgtc tatatctcgc    840
ccaaatgctg tggtcgggag gtgtcgcatg atccgccact caagagacaa gaaaaatgaa    900
cccaatcctc agaggtttga ccgaattgca cacacaaagg agacaatgct ctctgatggt    960
ttgaactcac tcacctacca ggtgctggat gtacagagat acccattgta tacccaaatc   1020
acagtggaca tcgggacacc gagctag                                       1047
<210>7
<211>1801
<212>DNA
<213>人类
<220>
<223>alpha-1，6-岩藻糖转移酶FUT8
<400>7
caggactcca gggaagtgag ttgaaaatct gaaaatgcgg ccatggactg gttcctggcg     60
ttggattatg ctcattcttt ttgcctgggg gaccttgctg ttttatatag gtggtcactt    120
ggtacgagat aatgaccatc ctgatcactc tagccgagaa ctgtccaaga ttctggcaaa    180
gcttgaacgc ttaaaacagc agaatgaaga cttgaggcga atggccgaat ctctccggat    240
accagaaggc cctattgatc aggggccagc tataggaaga gtacgcgttt tagaagagca    300
gcttgttaag gccaaagaac agattgaaaa ttacaagaaa cagaccagaa atggtctggg    360
gaaggatcat gaaatcctga ggaggaggat tgaaaatgga gctaaagagc tctggttttt    420
cctacagagt gaattgaaga aattaaagaa cttagaagga aatgaactcc aaagacatgc    480
agatgaattt cttttggatt taggacatca tgaaaggtct ataatgacgg atctatacta    540
cctcagtcag acagatggag caggtgattg gcgggaaaaa gaggccaaag atctgacaga    600
actggttcag cggagaataa catatcttca gaatcccaag gactgcagca aagccaaaaa    660
gctggtgtgt aatatcaaca aaggctgtgg ctatggctgt cagctccatc atgtggtcta    720
ctgcttcatg attgcatatg gcacccagcg aacactcatc ttggaatctc agaattggcg    780
ctatgctact ggtggatggg agactgtatt taggcctgta agtgagacat gcacagacag    840
atctggcatc tccactggac actggtcagg tgaagtgaag gacaaaaatg ttcaagtggt    900
cgagcttccc attgtagaca gtcttcatcc ccgtcctcca tatttaccct tggctgtacc    960
agaagacctc gcagatcgac ttgtacgagt gcatggtgac cctgcagtgt ggtgggtgtc   1020
tcagtttgtc aaatacttga tccgcccaca gccttggcta gaaaaagaaa tagaagaagc   1080
caccaagaag cttggcttca aacatccagt tattggagtc catgtcagac gcacagacaa   1140
agtgggaaca gaagctgcct tccatcccat tgaagagtac atggtgcatg ttgaagaaca   1200
ttttcagctt cttgcacgca gaatgcaagt ggacaaaaaa agagtgtatt tggccacaga   1260
tgacccttct ttattaaagg aggcaaaaac aaagtacccc aattatgaat ttattagtga   1320
taactctatt tcctggtcag ctggactgca caatcgatac acagaaaattcacttcgtgg    1380
agtgatcctg gatatacatt ttctctctca ggcagacttc ctagtgtgta ctttttcatc   1440
ccaggtctgt cgagttgctt atgaaattat gcaaacacta catcctgatg cctctgcaaa   1500
cttccattct ttagatgaca tctactattt tgggggccag aatgcccaca atcaaattgc   1560
catttatgct caccaacccc gaactgcaga tgaaattccc atggaacctg gagatatcat   1620
tggtgtggct ggaaatcatt gggatggcta ttctaaaggt gtcaacagga aattgggaag   1680
gacgggccta tatccctcct acaaagttcg agagaagata gaaacggtca agtaccccac   1740
atatcctgag gctgagaaat aaagctcaga tggaagagat aaacgaccaa actcagttcg   1800
a                                                                   1801
<210>8
<211>1136
<212>DNA
<213>人类
<220>
<223>GDP-岩藻糖转运蛋白
<400>8
tgacccagct cctctgctac catgaatagg gcccctctga agcggtccag gatcctgcac     60
atggcgctga ccggggcctc agacccctct gcagaggcag aggccaacgg ggagaagccc    120
tttctgctgc gggcattgca gatcgcgctg gtggtctccc tctactgggt cacctccatc    180
tccatggtgt tccttaataa gtacctgctg gacagcccct ccctgcggct ggacaccccc    240
atcttcgtca ccttctacca gtgcctggtg accacgctgc tgtgcaaagg cctcagcgct    300
ctggccgcct gctgccctgg tgccgtggac ttccccagct tgcgcctgga cctcagggtg    360
gcccgcagcg tcctgcccct gtcggtggtc ttcatcggca tgatcacctt caataacctc    420
tgcctcaagt acgtcggtgt ggccttctac aatgtgggcc gctcactcac caccgtcttc    480
aacgtgctgc tctcctacct gctgctcaag cagaccacct ccttctatgc cctgctcacc    540
tgcggtatca tcatcggggg cttctggctt ggtgtggacc aggagggggc agaaggcacc    600
ctgtcgtggc tgggcaccgt cttcggcgtg ctggctagcc tctgtgtctc gctcaacgcc    660
atctacacca cgaaggtgct cccggcggtg gacggcagca tctggcgcct gactttctac    720
aacaacgtca acgcctgcat cctcttcctg cccctgctcc tgctgctcgg ggagcttcag    780
gccctgcgtg actttgccca gctgggcagt gcccacttct gggggatgat gacgctgggc    840
ggcctgtttg gctttgccat cggctacgtg acaggactgc agatcaagtt caccagtccg    900
ctgacccaca atgtgtcggg cacggccaag gcctgtgccc agacagtgct ggccgtgctc    960
tactacgagg agaccaagag cttcctctgg tggacgagca acatgatggt gctgggcggc   1020
tcctccgcct acacctgggt caggggctgg gagatgaaga agactccgga ggagcccagc   1080
cccaaagaca gcgagaagag cgccatgggg gtgtgagcac cacaggcacc ctggat       1136
<210>9
<211>268
<212>DNA
<213>疱疹单纯病毒(herpes simplex virus)
<220>
<223>胸苷激酶启动子
<400>9
gcagtgtggt tttgcaagag gaagcaaaaa gcctctccac ccaggcctgg aatgtttcca     60
cccaatgtcg agcagtgtgg ttttgcaaga ggaagcaaaa agcctctcca cccaggcctg    120
gaatgtttcc acccaatgtc gagcaaaccc cgcccagcgt cttgtcattg gcgaattcga    180
acacgcagat gcagtcgggg cggcgcggtc ccaggtccac ttcgcatatt aaggtgacgc    240
gtgtggcctc gaacaccgag cgaccctg                                       268
<210>10
<211>990
<212>DNA
<213>人类
<220>
<223>唾液酸转移酶(NM_006278)
<400>10
atggtcagca agtcccgctg gaagctcctg gccatgttgg ctctggtcct ggtcgtcatg     60
gtgtggtatt ccatctcccg ggaagacagt ttttattttc ccatcccaga gaagaaggag    120
ccgtgcctcc agggtgaggc agagagcaag gcctctaagc tctttggcaa ctactcccgg    180
gatcagccca tcttcctgcg gcttgaggat tatttctggg tcaagacgcc atctgcttac    240
gagctgccct atgggaccaa ggggagtgag gatctgctcc tccgggtgct agccatcacc    300
agctcctcca tccccaagaa catccagagc ctcaggtgcc gccgctgtgt ggtcgtgggg    360
aacgggcacc ggctgcggaa cagctcactg ggagatgcca tcaacaagta cgatgtggtc    420
atcagattga acaatgcccc agtggctggc tatgagggtg acgtgggctc caagaccacc    480
atgcgtctct tctaccctga atctgcccac ttcgacccca aagtagaaaa caacccagac    540
acactcctcg tcctggtagc tttcaaggca atggacttcc actggattga gaccatcctg    600
agtgataaga agcgggtgcg aaagggtttc tggaaacagc ctcccctcat ctgggatgtc    660
aatcctaaac agattcggat tctcaacccc ttcttcatgg agattgcagc tgacaaactg    720
ctgagcctgc caatgcaaca gccacggaag attaagcaga agcccaccac gggcctgttg    780
gccatcacgc tggccctcca cctctgtgac ttggtgcaca ttgccggctt tggctaccca    840
gacgcctaca acaagaagca gaccattcac tactatgagc agatcacgct caagtccatg    900
gcggggtcag gccataatgt ctcccaagag gccctggcca ttaagcggat gctggagatg    960
ggagctatca agaacctcac gtccttctga                                     990
<210>11
<211>681
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>EPO改良序列
<400>11
atgggggtgc acgaatgtcc tgcctggctg tggcttctcc tgtccctgct gtcgctccct     60
ctgggcctcc cagtcctggg cgccccacca cgcctcatct gtgacagccg agtcctggag    120
aggtacctct tggaggccaa ggaggccgag aatatcacga cgggctgtgc tgaacactgc    180
agcttgaatg agaatatcac tgtcccagac accaaagtta atttctatgc ctggaagagg  240
atggaggtcg ggcagcaggc cgtagaagtc tggcagggcc tggccctgct gtcggaagct  300
gtcctgcggg gccaggccct gttggtcaac tcttcccagc cgtgggagcc cctgcagctg  360
catgtggata aagccgtcag tggccttcgc agcctcacca ctctgcttcg ggctctggga  420
gcccagaagg aagccatctc ccctccagat gcagcctcag ctgctccgct ccgaacaatc  480
actgctgaca ctttccgcaa actcttccga gtctactcca atttcctccg gggaaagctg  540
aagctgtaca caggggaggc ctgcaggaca ggcgacagaa agggcgagct tcgaggtcac  600
ccattcgaag gtaagcctat ccctaaccct ctcctcggtc tcgattctac gcgtaccggt  660
catcatcacc atcaccattg a                                            681
<210>12
<211>225
<212>蛋白质
<213>人造序列
<220>
<223>在表达质粒中测序了的EPO
<400>12
Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu
1               5                   10                  15
Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu
            20                  25                  30
Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu
        35                  40                  45
Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu
    50                  55                  60
Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg
65                  70                  75                  80
Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu
                85                  90                  95
Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser
            100                 105                 110
Gln Pro Trp Glu Pro Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly Leu
        115                 120                 125
Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu Ala
    130                 135                 140
Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile Thr
145                 150                 155                 160
Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg
                165                 170                 175
Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp Arg
            180                 185                 190
Lys Gly Glu Leu Arg Gly His Pro Phe Glu Gly Lys Pro Ile Pro Asn
        195                 200                 205
Pro Leu Leu Gly Leu Asp Ser Thr Arg Thr Gly His His His His His
    210                 215                 220
His
225
<210>13
<211>51
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>Mmn9胞质域
<400>13
atgtcacttt ctcttgtatc gtaccgccta agaaagaacc cgtgggttaa c              51
<210>14
<211>246
<212>DNA
<213>酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<400>14
atggccctct ttctcagtaa gagactgttg agatttaccg tcattgcagg tgcggttatt     60
gttctcctcc taacattgaa ttccaacagt agaactcagc aatatattcc gagttccatc    120
tccgctgcat ttgattttac ctcaggatct atatcccctg aacaacaagt catctctgag    180
gaaaatgatg ctaaaaaatt agagcaaagt gctctgaatt cagaggcaag cgaagactcc    240
gaagcc                                                               246
<210>15
<211>274
<212>DNA
<213>人造序列
<220>
<223>仅CYC1终止子
<400>15
gaattggtcg atcaggtatt catgtaatta gttatgtcac gcttacattc acgccctccc     60
cccacatccg ctctaaccga aaaggaagga gttagacaac ctgaagtcta ggtccctatt    120
tattttttta tagttatgtt agtattaaga acgttattta tatttcaaat ttttcttttt    180
tttctgtaca gacgcgtgta cgcatgtaac attatactga aaaccttgct tgagaaggtt    240
ttgggacgct cgaaggcttt aatttgcaag ctgc                                274
<210>16
<211>679
<212>DNA
<213>酿酒酵母
<220>
<223>pGAP启动子
<400>16
tcgagtttat cattatcaat actcgccatt tcaaagaata cgtaaataat taatagtagt     60
gattttccta actttattta gtcaaaaaat tagcctttta attctgctgt aacccgtaca    120
tgccaaaata gggggcgggt tacacagaat atataacact gatggtgctt gggtgaacag    180
gtttattcct ggcatccact aaatataatg gagcccgctt tttaagctgg catccagaaa    240
aaaaaagaat cccagcacca aaatattgtt ttcttcacca accatcagtt cataggtcca    300
ttctcttagc gcaactacag agaacagggc acaaacaggc aaaaaacggg cacaacctca    360
atggagtgat gcaacctgcc tggagtaaat gatgacacaa ggcaattgac ccacgcatgt    420
atctatctca ttttcttaca ccttctatta ccttctgctc tctctgattt ggaaaaagct    480
gaaaaaaaag gttgaaacca gttccctgaa attattcccc tacttgacta ataagtatat    540
aaagacggta ggtattgatt gtaattctgt aaatctattt cttaaacttc ttaaattcta    600
cttttatagt tagtcttttt tttagtttta aaacaccaag aacttagttt cgaataaaca    660
cacataaata aacaaaatg                                                 679
<210>17
<211>451
<212>DNA
<213>酿酒酵母
<220>
<223>pGAL1启动子
<400>17
acggattaga agccgccgag cgggtgacag ccctccgaag gaagactctc ctccgtgcgt     60
cctcgtcttc accggtcgcg ttcctgaaac gcagatgtgc ctcgcgccgc actgctccga    120
acaataaaga ttctacaata ctagctttta tggttatgaa gaggaaaaat tggcagtaac    180
ctggccccac aaaccttcaa atgaacgaat caaattaaca accataggat gataatgcga    240
ttagtttttt agccttattt ctggggtaat taatcagcga agcgatgatt tttgatctat    300
taacagatat ataaatgcaa aaactgcata accactttaa ctaatacttt caacattttc    360
ggtttgtatt acttcttatt caaatgtaat aaaagtatca acaaaaaatt gttaatatac    420
ctctatactt taacgtcaag gagaaaaaac c                                   451
<210>18
<211>603
<212>DNA
<213>酿酒酵母
<220>
<223>PGK启动子
<400>18
cccaagctta cctgctgcgc attgttttat atttgttgta aaaagtagat aattacttcc     60
ttgatgatct gtaaaaaaga gaaaaagaaa gcatctaaga acttgaaaaa ctacgaatta    120
gaaaagacca aatatgtatt tcttgcattg accaatttat gcaagtttat atatatgtaa    180
atgtaagttt cacgaggttc tactaaacta aaccaccccc ttggttagaa gaaaagagtg    240
tgtgagaaca ggctgttgtt gtcacacgat tcggacaatt ctgtttgaaa gagagagagt    300
aacagtacga tcgaacgaac tttgctctgg agatcacagt gggcatcata gcatgtggta    360
ctaaaccctt tcccgccatt ccagaacctt cgattgcttg ttacaaaacc tgtgagccgt    420
cgctaggacc ttgttgtgtg acgaaattgg aagctgcaat caataggaag acaggaagtc    480
gagcgtgtct gggttttttc agttttgttc tttttgcaaa caaatcacga gcgacggtaa    540
tttctttctc gataagaggc cacgtgcttt atgagggtaa catcaattca agatctgaat    600
tcc                                                                  603
<210>19
<211>409
<212>DNA
<213>酿酒酵母
<220>
<223>TEF启动子
<400>19
cccacacacc atagcttcaa aatgtttcta ctcctttttt actcttccag attttctcgg     60
actccgcgca tcgccgtacc acttcaaaac acccaagcac agcatactaa attttccctc    120
tttcttcctc tagggtgtcg ttaattaccc gtactaaagg tttggaaaag aaaaaagaga    180
ccgcctcgtt tctttttctt cgtcgaaaaa ggcaataaaa atttttatca cgtttctttt    240
tcttgaaatt ttttttttta gtttttttct ctttcagtga cctccattga tatttaagtt    300
aataaacggt cttcaatttc tcaagtttca gtttcatttt tcttgttcta ttacaacttt    360
ttttacttct tgttcattag aaagaaagca tagcaatcta atctaaggg                409
<210>20
<211>936
<212>DNA
<213>酿酒酵母
<220>
<223>PMA1启动子
<400>20
aagcttcctg aaacggagaa acataaacag gcattgctgg gatcacccat acatcactct     60
gttttgcctg accttttccg gtaatttgaa aacaaacccg gtctcgaagc ggagatccgg    120
cgataattac cgcagaaata aacccataca cgagacgtag aaccagccgc acatggccgg    180
agaaactcct gcgagaattt cgtaaactcg cgcgcattgc atctgtattt cctaatgcgg    240
cacttccagg cctcgagacc tctgacatgc ttttgacagg aatagacatt ttcagaatgt    300
tatccatatg cctttcgggt ttttttcctt ccttttccat catgaaaaat ctctcgagac    360
cgtttatcca ttgctttttt gttgtctttt tccctcgttc acagaaagtc tgaagaagct    420
atagtagaac tatgagcttt ttttgtttct gttttccttt tttttttttt tacctctgtg    480
gaaattgtta ctctcacact ctttagttcg tttgtttgtt ttgtttattc caattatgac    540
cggtgacgaa acgtggtcga tggtgggtac cgcttatgct cccctccatt agtttcgatt    600
atataaaaag gccaaatatt gtattatttt caaatgtcct atcattatcg tctaacatct    660
aatttctctt aaattttttc tctttctttc ctataacacc aatagtgaaa atcttttttt    720
cttctatatc tacaaaaact ttttttttct atcaacctcg ttgataaatt ttttctttaa    780
caatcgttaa taattaatta attggaaaat aaccattttt tctctctttt atacacacat    840
tcaaaagaaa gaaaaaaaat ataccccagc tagttaaaga aaatcattga aaagaataag    900
aagataagaa agatttaatt atcaaacaat atcaat                              936
<210>21
<211>504
<212>DNA
<213>花椰菜花叶病毒(Cauliflower mosaic virus)
<400>21
caacagaact cgccgtgaag actggcgaac agttcataca gagtctttta cgactcaatg     60
acaagaagaa aatcttcgtc aacatggtgg agcacgacac tctggtctac tccaaaaatg    120
tcaaagatac agtctcagaa gaccaaaggg ctattgagac ttttcaacaa aggataattt    180
cgggaaacct cctcggattc cattgcccag ctatctgtca cttcatcgaa aggacagtag    240
aaaaggaagg tggctcctac aaatgccatc attgcgataa aggaaaggct atcattcaag    300
atctgcctct gccgacagtg gtcccaaaga tggaccccca cccacgagga gcatcgtgga    360
aaaagaagac gttccaacca cgtcttcaaa gcaagtggat tgatgtgaca tctccactga    420
cgtaagggat gacgcacaat cccactatcc ttcgcaagac ccttcctcta tataaggaag    480
ttcatttcat ttggagagga cacg                                           504
<210>22
<211>623
<212>DNA
<213>酿酒酵母
<220>
<223>Pho5启动子
<400>22
gatccgaaag ttgtattcaa caagaatgcg caaatatgtc aacgtatttg gaagtcatct     60
tatgtgcgct gctttaatgt tttctcatgt aagcggacgt cgtctataaa cttcaaacga    120
aggtaaaagg ttcatagcgc tttttctttg tctgcacaaa gaaatatata ttaaattagc    180
acgttttcgc atagaacgca actgcacaat gccaaaaaaa gtaaaagtga ttaaaagagt    240
taattgaata ggcaatctct aaatgaatcg atacaacctt ggcactcaca cgtgggacta    300
gcacagacta aatttatgat tctggtccct gttttcgaag agatcgcaca tgccaaatta    360
tcaaattggt caccttactt ggcaaggcat atacccattt gggataaggg taaacatctt    420
tgaattgtcg aaatgaaacg tatataagcg ctgatgtttt gctaagtcga ggttagtatg    480
gcttcatctc tcatgagaat aagaacaaca acaaatagag caagcaaatt cgagattacc    540
aatgtttaaa tctgttgttt attcaatttt agccgcttct ttggccaatg caggtaccat    600
tcccttaggc aaactagccg atg                                            623
<210>23
<211>1501
<212>DNA
<213>酿酒酵母
<220>
<223>肌动蛋白-结合蛋白启动子
<400>23
gaattcggaa gactcagact tcccaacagg cagaaaattc agaagtcata aaggaccttt     60
acgagtacct ctgtaacgta cgtgtacata aaagctacga ggatgattct gggttgtggt    120
tcgacatctc gcagggcacc cactcagggg gatcttccga tgattattcg ataatggact    180
ataaactcgg atttgtcaag ggccaggcca agtcacagaa gtcatatatg cgcccgttct    240
taaacagcga tccaccgagg aactatactc gctacagtcg aaactaccgg aatacctctt    300
cgaaacgttg agtttccccc tctcgtcgct aaaccaattc tataacaaaa tcgctaaaag    360
cctgaataag aaaagagaga aaaaagatga aaccgagtaa gctgctacat aatgtctata    420
tatctacaca taaaattccg attattcctt tgcatacctg atttgcccct cagaatccac    480
aaccagactt ttcaagaagg tcttttttgc ccctttatcc ttcatggttt tcaaattttg    540
tacaacgact tgcccttgtg aagctcgata ccgttcgagg tcttttccac tttctctgcc    600
ttcttgatca caggcttctc cactttcttt gcaggagttg ccactgctgg tgctggtgct    660
gcttctgctg ctgcttctgc tgctgcttct gcttctgctt cttgttgccc ttgtacaacg    720
ctttctggta cttctcgtcc tcgctgatgc aagacgtgtg attcttgtaa ctcacgccat    780
cttcaaacgt cttggagcaa tctatgcatg tatagtacgc gttaggacat ctataataat    840
gcttttcggt attcttcttg ggcacagtat cattgcacac ctcacagttg aacgtaacca    900
tcctgtaata acaaatattt cttgactgag accgtttgct gttgtataca gaatactctt    960
agagctcatc gcaagttaaa aattttcaat tttttttcac tttttcccgt caaggcaaaa   1020
agcaaccaaa agagaatgaa cctttatttt tgatttattt attatgagat gctgctagtc   1080
cactcatctg catcaatgta gtagtcacaa agctaatatt tagacgttac tttgatatct   1140
ctgtccatga gagcacttat tttaggaagt taaatgagac agtcaatagt tcacaatatc   1200
ccgtcagcaa tggagggaaa aggcattcct tttccatagg attttaatcg ttttcaagca   1260
tcatacgccc tcgaggaact cttgttttcg ctttactatg caaccattga tgtatttctg   1320
tataaatgtg cgtcacgtgg ccttgtgtct cttatttcca cttgtttttt cacaatgcgg   1380
aaaacctcga ttaaagtaga aaaaaaggat ataataggag tataccatat tggatagttc   1440
aatctataaa caaacaatcg cataaccgca cgtatataca cgcacacacc tatcaatcac   1500
a                                                                   1501
<210>24
<211>384
<212>DNA
<213>酿酒酵母
<220>
<223>推定的CYC1启动子
<400>24
cccgggagca agatcaagat gttttcaccg atctttccgg tctctttggc cggggtttac     60
ggacgatgac cgaagaccaa gcgccagctc atttggcgag cgttggttgg tggatcaagc    120
ccacgcgtag gcaatcctcg agcagatccg ccaggcgtgt atatagcgtg gatggccagg    180
caactttagt gctgacacat acaggcatat atatatgtgt gcgacgacac atgatcatat    240
ggcatgcatg tgctctgtat gtatataaaa ctcttgtttt cttcttttct ctaaatattc    300
tttccttata cattaggtcc tttgtagcat aaattactat acttctatag acacgcaaac    360
acaaatacac acactaaatt aata                                           384
<210>25
<211>444
<212>DNA
<213>栗酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)
<220>
<223>CYC1启动子
<400>25
atcataccaa gaccaaccac acatgctgaa gatgcattgc atgccacgaa atcattgcat     60
atcagccaat tccagttttc caacgattac tgcactctaa cgatatctat tttccttatt    120
ttcagacacg gtatacaacc ttaattatgt ttaatacggc tgctcgtcat caccaaatcc    180
tgtttttact ttaacgaagg ttatcgcacg caaaaaaggt aaacattgga ttggctcgcc    240
atgtcattcc gcggagagct catgaaccaa tgaaataagg gcgaaaaaat aaatttaaag    300
gtcgacttcc accgcatccc aacttactct caacgtacat cttctcacta acttcgcggt    360
gaatttgtgg tttttaaatc ttcttctcta caaatactaa actcttaagc ctatttcctt    420
tccttagcaa tttattaatt caaa                                           444
<210>26
<211>159
<212>DNA
<213>酿酒酵母
<220>
<223>ADH2启动子
<400>26
cctatcacat ataaatagag tgccagtagc gacttttttc acactcgaga tactcttact     60
actgctctct tgttgttttt atcacttctt gtttcttctt ggtaaataga atatcaagct    120
acaaaaagca tacaatcaac tatcaactat taactatat                           159
<210>27
<211>1617
<212>DNA
<213>小鼠
<220>
<223>beta-1，4 N-乙酰葡萄糖胺转移酶III
<400>27
atgaagatga gacgctacaa gctctttctc atgttctgta tggctggcct gtgcctcata     60
tccttcctgc acttctttaa gaccttatcc tatgtcacct tcccgagaga actggcctcc    120
ctcagcccta acctcgtatc cagcttcttc tggaacaatg cccctgtcac tccccaggcc    180
agtccggagc cgggtggccc cgacctattg cggacacccc tctactccca ctctcccctg    240
ctccagccac tgtccccgag caaggccaca gaggaactgc accgggtgga cttcgtgttg    300
ccggaggaca ccacggagta ttttgtgcgc accaaagctg gtggtgtgtg cttcaaacca    360
ggtaccagga tgctggagaa accttcgcca gggcggacag aggagaagcc cgaagtgtct    420
gagggctcct cagcccgggg acctgctcgg aggcccatga ggcacgtgtt gagtacgcgg    480
gagcgcctgg gcagccgggg cactaggcgc aagtgggttg agtgtgtgtg cctgccaggc    540
tggcacgggc ccagttgcgg ggtgcccacg gtggtgcagt attccaacct gcccaccaag    600
gaacgcctgg tacccaggga ggtaccgagg cgggttatca acgccatcaa catcaaccac    660
gagttcgacc tgctggatgt gcgtttccat gagctgggag atgttgtgga cgccttcgtg    720
gtctgtgaat ctaatttcac cgcctacggg gagcctcggc cgctcaagtt ccgagagatg    780
ctgaccaatg gcaccttcga gtacatccgc cacaaggtgc tctatgtctt cctggaccat    840
ttcccacctg gtggccgtca ggacggctgg attgcggatg actacctgcg caccttcctc    900
acccaggatg gcgtctcccg cctgcgcaac ctgcggcccg atgacgtctt tatcatcgac    960
gatgcggacg agatccctgc gcgtgatggt gtgctgttcc tcaaactcta cgatggctgg   1020
acagagccct tcgccttcca catgcggaag tccctgtatg gtttcttctg gaagcagccg   1080
ggcacactgg aggtggtgtc aggctgcacc atggacatgc tgcaggccgt gtatgggctg   1140
gatggcatcc gcctgcgccg ccgccagtac tacaccatgc ccaacttccg gcagtatgag   1200
aaccgcaccg gccacatcct agtgcagtgg tctctcggca gccccctgca cttcgcgggc   1260
tggcattgct cctggtgctt cacacccgag ggcatctact ttaaactcgt gtcagcccag   1320
aatggcgact tcccccgctg gggtgactat gaggacaaga gggacctcaa ttacatccgc   1380
agcttgatcc gcactggggg atggttcgac ggaacgcagc aggagtaccc tcctgcggac   1440
cccagtgagc acatgtatgc tcctaaatac ctgctcaaga actatgacca gttccgctac   1500
ttgctggaaa atccctaccg ggagcccaag agcactgaag agggtgggcg ccggaaccag   1560
ggctcagatg gaaggccatc tgctgtcagg ggcaagttgg atacagtgga gggctag      1617

Claims (29)

1、遗传改良的酵母，能够产生具有含Man5GlcNac2结构的同质聚糖的糖蛋白，所述酵母包括下列改良：
a)通过编码抗生素抗性基因的异源序列的同源重组通过插入将编码α1，6-甘露糖转移酶的Och1基因失活(delta-Och1菌株)，
b)通过同源重组将表达盒整合到营养缺陷标记中，该表达盒包括选自分别具有序列SEQ ID：16-26的酿酒酵母或栗酒裂殖酵母的pGAP、pGAL1、PGK、TEF、adh1、nmt 1、SV40、PMA1、CaMV、pet56或ADH2启动子，含有内质网或高尔基体靶向序列的α-1-2甘露糖苷酶I编码序列的开放阅读框和转录终止子，
c)通过同源重组将表达盒整合到营养缺陷标记中，该表达盒包括选自分别具有序列SEQ ID：16-26的酿酒酵母或栗酒裂殖酵母的pGAP、pGAL1、PGK、TEF、adh1、nmt 1、SV40、PMA1、CaMV、pet56或ADH2启动子，所述c)中的启动子与b)中的启动子不同，含有需要产生的外源糖蛋白编码序列的开放阅读框和转录终止子。
2、根据权利要求1的酵母，其特征在于α-1-2甘露糖苷酶I是线虫的α-1-2甘露糖苷酶I，特别是含有SEQ ID：1的序列。
3、根据权利要求1或2的酵母，能够产生具有75％以上GlcNacMan5GlcNac2结构的糖蛋白，进一步包括通过同源重组将表达盒整合到营养缺陷标记中，该表达盒包括选自分别具有序列SEQID：16-26的酿酒酵母或栗酒裂殖酵母的pGAP、pGAL1、PGK、TEF、adh1、nmt 1、SV40、PMA1、CaMV、pet56或ADH2启动子，含有内质网或高尔基体靶向序列的N-乙酰-葡萄糖胺转移酶I编码序列的开放阅读框或者转录终止子。
4、根据权利要求3的酵母，其特征在于人类N-乙酰-葡萄糖胺转移酶I包含没有酶的胞质部分的SEQ ID：2序列，酶的胞质部分被用于蛋白高尔基体定位的mmn9的胞质部分(SEQ ID：13)所替代。
5、根据权利要求4的酵母，其特征在于其进一步包括通过同源重组将表达盒整合到营养缺陷标记中，该表达盒包括选自分别具有序列SEQ ID：16-26的酿酒酵母或栗酒裂殖酵母的pGAP、pGAL1、PGK、TEF、adh1、nmt 1、SV40、PMA1、CaMV、pet56或ADH2启动子，含有人类UDP-GlcNAc转运蛋白编码序列的开放阅读框和转录终止子。
6、根据权利要求5的酵母，其特点在于人类UDP-GlcNAc转运蛋白包含SEQ ID：3序列。
7、根据权利要求4至6中的任一项的酵母，能够产生具有75％以上GlcNacMan3GlcNac2结构的糖蛋白，进一步包括通过同源重组将表达盒整合到营养缺陷标记中，该表达盒包括选自分别具有序列SEQID：16-26的酿酒酵母或栗酒裂殖酵母的pGAP、pGAL1、PGK、TEF、adh1、nmt 1、SV40、PMA1、CaMV、pet56或ADH2启动子，含有内质网或高尔基体靶向序列的甘露糖苷酶II编码序列的开放阅读框和转录终止子。
8、根据权利要求7的酵母，其特点在于甘露糖苷酶II是鼠科的甘露糖苷酶II并且包含SEQ ID：4序列。
9、根据权利要求7至8中的任一项的酵母，能够产生具有75％以上GlcNac4Man3GlcNac2结构的糖蛋白，进一步包括通过同源重组将表达盒整合到营养缺陷标记中，该表达盒包括选自分别具有序列SEQID：16-26的酿酒酵母或栗酒裂殖酵母的pGAP、pGAL1、PGK、TEF、adh1、nmt 1、SV40、PMA1、CaMV、pet56或ADH2启动子，含有N-乙酰葡萄糖胺转移酶II编码序列的，含有内质网或高尔基体靶向序列的开放阅读框和转录终止子。
10、根据权利要求9的酵母，其特征在于N-乙酰葡萄糖胺转移酶II是人类的并且包括SEQ ID：5序列。
11、根据权利要求9至10的任一项的酵母，能够产生具有75％以上Gal4GlcNac4Man3GlcNac2结构的糖蛋白，进一步包括通过同源重组将表达盒整合到营养缺陷标记中，该表达盒包括选自分别具有序列SEQ ID：16-26的酿酒酵母或栗酒裂殖酵母的pGAP、pGAL1、PGK、TEF、adh1、nmt 1、SV40、PMA1、CaMV、pet56或ADH2启动子，含有半乳糖转移酶I编码序列的，含有内质网或高尔基体靶向序列的开放阅读框和转录终止子。
12、根据权利要求11的酵母，其特征在于半乳糖转移酶I是人类的，并且包含没有人类靶向序列的SEQ ID：6序列。
13、根据权利要求1至10的任一项的酵母，其特征在于整合标记选自URA3、ADE2、LYS2、LEU2、TRP1、CAN1、ADO1、HIS5、HIS3、ARG3、MET17、LEM3、Mnn1、Mnn9、gma12。
14、根据权利要求13的酵母，其特征在于α-1-2-甘露糖苷酶I的表达盒被整合到URA3基因中，N-乙酰葡萄糖胺转移酶I的表达盒被整合到ADE1或ADE2基因中，UDP-GlcNAc转运蛋白的表达盒被整合到LYS2基因中，α-甘露糖苷酶II的表达盒被整合到LEU2基因中，N-乙酰葡萄糖胺转移酶II的表达盒被整合到CYH1或TRP1基因中。
15、根据权利要求1至14的任一项的酵母，其特征在于内质网或高尔基体的靶向序列是从Mnt1基因的定位序列衍生的并且包括SEQID：14序列。
16、根据权利要求1至15任一项的酵母，其特征在于终止子是从CYC1基因衍生的并且包括SEQ ID：15序列。
17、根据权利要求3至10任一项的酵母，能够产生具有75％以上的选自
Man5GlcNac2，
GlcNacMan5GlcNac2，
GlcNacMan3GlcNac2，
GlcNac2Man3GlcNac2，
Gal2GlcNac2Man3GlcNac2，
GlcNac2Man3(Fuc)GlcNac2，
Gal2GlcNac2Man3(Fuc)GlcNac2
结构的糖蛋白，进一步包括通过同源重组将表达盒整合到营养缺陷标记中，该表达盒包括选自分别具有序列SEQ ID：16-26的酿酒酵母或栗酒裂殖酵母的pGAP、pGAL1、PGK、TEF、adh1、nmt 1、SV40、PMA1、CaMV、pet56或ADH2启动子，或Mnt1基因的启动子，含有α-1，6-岩藻糖转移酶FUT8编码序列的、含有内质网或高尔基体靶向序列的开放阅读框和从包含SEQ ID：15序列的基因CYC1衍生的转录终止子。
18、根据权利要求17的酵母，其特征在于α-1，6-岩藻糖转移酶FUT8是人类的并且包括SEQ ID：7序列。
19、根据权利要求17或18的任一项的酵母进一步包括通过同源重组将表达盒整合到营养缺陷标记中，该表达盒包括选自分别具有序列SEQ ID：16-26的酿酒酵母或栗酒裂殖酵母的pGAP、pGAL1、PGK、TEF、adh1、nmt 1、SV40、PMA1、CaMV、pet56或ADH2启动子，或SV40启动子，含有GDP-岩藻糖转运蛋白编码序列的，特别是含有SEQ ID：8序列的开放阅读框。
20、根据在先权利要求的任一项的酵母，其特征在于α-1-2甘露糖苷酶I是在启动子pGAP的控制下表达的并且外源蛋白糖蛋白是在启动子pGAL1的控制下表达的。
21、根据权利要求11至20的任一项的酵母，能够产生具有75％以上的选自NANA4Gal4GlcNac4Man3GlcNAc2和NANA4Gal4GlcNac4(Fuc)Man3GlcNAc2结构的糖蛋白，其特征在于其进一步包括通过同源重组将表达盒整合到营养缺陷标记中，该表达盒包括选自分别具有序列SEQ ID：16-26的酿酒酵母或栗酒裂殖酵母的pGAP、pGAL1、PGK、TEF、adh1、nmt1、SV40、PMA1、CaMV、pet56或ADH2启动子，或含有SEQ ID：9序列的疱疹病毒胸苷激酶的启动子，含有α-2，3唾液酸转移酶编码序列的开放阅读框和从含有SEQID：15序列的CYC1基因衍生的终止子。
22、根据权利要求21的酵母，其特征在于唾液酸转移酶是人类ST4GAL4，特别是含有SEQ ID：10的序列。
23、根据权利要求1至22的任一项的酵母，其特征在于糖蛋白选自治疗用糖蛋白如细胞因子、白介素、生长激素、生长因子、酶和单克隆抗体、疫苗蛋白、可溶受体和任何类型的重组蛋白。
24、根据权利要求23的酵母，其特征在于糖蛋白是EPO，特别是具有SEQ ID：12的EPO，SEQ ID：12含有抗原决定簇V5和纯化用N-末端多-HIS单位。
25、一种含有糖蛋白的药物组合物，该糖蛋白具有同质聚糖结构，该结构包括具有90％、95％或进一步98％以上，例如90％、95％或进一步98％以上的选自
GlcNacMan5GlcNAc2，
GlcNacMan3GlcNAc2，
GlcNac4Man3GlcNAc2，
Gal4GlcNac4Man3GlcNAc2，
GlcNac(Fuc)Man5GlcNAc2，
GlcNac(Fuc)Man3GlcNAc2，
GlcNac4(Fuc)Man3GlcNAc2，
Gal4GlcNac4(Fuc)Man3GlcNAc2，
NANA4Gal4GlcNac4Man3GlcNAc2或
NANA4Gal4GlcNac4Man3GlcNAc2或
NANA4Gal4GlcNac4Man3GlcNAc2或
NANA4Gal4GlcNac4(Fuc)Man3GlcNAc2
的结构。
26、一种药物组合物，其包括作为活性成分的EPO，所述EPO具有90％以上的
NANA4Gal4GlcNac4Man3GlcNAc2或
NANA4Gal4GlcNac4Man3GlcNAc2或
NANA4Gal4GlcNac4Man3GlcNAc2或
NANA4Gal4GlcNac4(Fuc)Man3GlcNAc2
的结构。
27、一种在发酵器中的培养物，其含有酵母培养基的基础培养基和根据权利要求1至24任一项的酵母。
28、一种制备糖蛋白的方法，所述糖蛋白具有同质聚糖结构，该结构具有75％以上的选自：
Man5GlcNAc2，
GlcNacMan5GlcNAc2，
GlcNacMan3GlcNAc2，
GlcNac2Man3GlcNAc2，
Gal2GlcNac2Man3GlcNAc2，
NANA2Gal2GlcNac2Man3GlcNAc2，
GlcNac2Man3(Fuc)GlcNAc2，
Gal2GlcNac2Man3(Fuc)GlcNAc2，
NANA2Gal2GlcNac2Man3(Fuc)GlcNAc2，
的结构，该方法包括在发酵器中培养根据权利要求1至24任一项的酵母，和从培养基中抽提所述的糖蛋白。
29、根据权利要求1至24任一项的酵母在发酵器中制备糖蛋白的用途，该糖蛋白具有同质聚糖结构，该结构具有75％以上的选自：
Man5GlcNAc2，
GlcNacMan5GlcNAc2，
GlcNacMan3GlcNAc2，
GlcNac2Man3GlcNAc2，
Gal2GlcNac2Man3GlcNAc2，
NANA2Gal2GlcNac2Man3GlcNAc2，
GlcNac2Man3(Fuc)GlcNAc2，
Gal2GlcNac2Man3(Fuc)GlcNAc2，
NANA2Gal2GlcNac2Man3(Fuc)GlcNAc2
的结构。
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