CN102586316A - 人源糖基化改造的汉逊酵母 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种人源糖基化改造的汉逊酵母。本发明提供了将重组质粒甲和乙导入汉逊酵母得到的重组菌。重组质粒甲包括：UGnT基因的表达盒、MMN9基因和GnTI基因的表达盒、MNN2基因和GnTII基因的表达盒；UGnT基因如序列1第548至1535位所示；MMN9基因如序列1第2438至2551位所示；GnTI基因如序列1第2558至3781位所示；MNN2基因如序列1第4685至4825位所示；GnTII基因如序列1第4832至5899位所示。重组质粒乙包括：MNN2基因和GnTII基因的表达盒、UGT基因的表达盒和UGalE基因的表达盒；UGalE基因如序列2第1164至2231位所示；UGT基因如序列2第3601至4659位所示。本发明提供的重组菌对制备人源糖基化蛋白具有重大价值。
Description
技术领域
本发明涉及人源糖基化改造的汉逊酵母。
背景技术
越来越多的医用疫苗、治疗性蛋白、多肽等可以通过基因重组技术生产，并在临床治疗中发挥着重要作用。其中糖蛋白类药物是基因工程药物发展的主体，其需求不断地迅速增长。糖蛋白中蛋白是生理功能的主要承担者，糖链则对蛋白的功能起到修饰作用。许多蛋白质功能的实现都与糖基化修饰密切相关。糖链可以改变蛋白质的构象，从而导致蛋白功能发生改变。糖基化对于蛋白质的折叠、运输、定位起着重要作用，并参与受体激活、信号转导等诸多重要的生物进程。
至今，哺乳动物细胞是唯一能生产类似于人的复杂型糖基修饰的糖蛋白药物表达系统，但该表达系统成本高，难以放大，严重制约了治疗性糖蛋白药物产业的发展。酵母作为最简单的真核生物，虽然具有培养成本低，可高密度发酵和易于大规模生产等优点，但它合成的糖蛋白糖基是高甘露糖型结构，这种糖基结构在体内存在易被清除、高免疫原性等问题，一般不能作为治疗药物。另外真核生物产生的天然糖蛋白广泛存在不均一性，即在一种给定的蛋白质的同一糖基化位点的聚糖结构有一定范围的变化，甚至这种不均一性程度在不同的位点、不同的蛋白和不同的细胞之间也有相当大的差异。为确保药品的药效、安全性和均一性，重组糖蛋白的糖基化形式也是很重要的。
糖蛋白上的糖链从连接方式上可分为两类：一类是与天冬氨酸(Asn)残基连接，即N-连接糖蛋白；另一类与丝氨酸或苏氨酸连接，称为O-连接糖蛋白。由于N-糖链位点保守、功能重要，糖基工程的研究目前主要集中在这N糖链上。N-糖基化修饰指包含N-乙酰葡萄糖胺残基的糖链与多肽中的天冬酰胺(Asn)残基的酰胺氮相连接，糖链的主要组分包括葡萄糖、甘露糖、半乳糖、岩藻糖、N-乙酰葡萄糖胺、N-乙酰半乳糖胺和唾液酸。糖基化修饰主要在内质网腔与翻译同时进行，并在高尔基体中继续反应成N-糖基化蛋白。真核细胞中各种N-糖基化加工都起始于内质网，几乎所有的生物在内质网形成的糖基化过程都是保守的。其糖链通常都会有一个五糖核心Man3GlcNAc2，具有相同的生物合成起源，即高甘露糖聚合前体Man5-9GlcNAc2。该前体并非直接在蛋白质上合成出来的，而是在脂质载体多萜醇(Dol)上合成寡糖链后转运到蛋白质受体上。进一步的糖基化发生在高尔基体，不同真核生物产生不同的糖链结构。
在哺乳动物细胞，甘露糖苷酶I(α1，2mannosidaseI，MnsI)切除多余的甘露糖残基形成Man5GlcNAc2；再有N-乙酰葡糖胺转移酶I(β-1，2-N-acetylglucosaminyltransferaseI，GlcNAcTI)在α-1，3-臂添加GlcNAc。由甘露糖苷酶II/III(mannosidaseII/III，MnsII/III)切除α-1，3-Man和α-1，6-Man分支，由N-乙酰葡糖胺转移酶II-VI(N-acetylglucosaminyl transferaseII-VI，GlcNAcTII-VI)继续添加GlcNAc形成二天线型或多天线型结构；最后由岩藻糖基转移酶(fucosyltransferase)、半乳糖基转移酶(galactosyltrnsferase，GalT)、唾液酸转移酶(sialytransferase，ST)添加岩藻糖、半乳糖、和唾液酸形成完整的复杂型N-聚糖。上述各酶依次定位于高尔基体膜上，糖蛋白在从高尔基体运送和向外分泌的过程中逐步被修饰(Helenius 2001)。
然而，在酵母中却发生了一系列由甘露糖转移酶(mannosyltransferase，MnT)催化的高甘露糖基化反应形成含有9-200个甘露糖残基的高甘露糖结构。常见的工程酵母中都存在不同程度的高甘露糖基化并且不同的酵母形成的糖链组成和结构也不尽相同。
虽然毕赤酵母酵母获得巨大成功，但在汉逊酵母的人源糖基化改造尚未见有成功的案例。多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)是当前国际上公认的理想外源基因表达系统(Gellissen 2000；Gellissen，Kunze et al.2005)。汉逊酵母最适生长温度高(37～43℃)，生长速率快，利于大规模发酵生产，易于培养，能够在廉价培养基中高密度培养。多形汉逊酵母能够按一定的基因剂量比分步整合多个基因，重组菌可按最佳的比例表达所需基因。而且具有遗传操作简单、外源基因拷贝数高、外源蛋白产量高等优点，是一个已得到广泛关注的外源基因表达系统。另外，与酿酒酵母相比，多形汉逊酵母在表达糖蛋白方面具有显著优势，其连接的糖链长度与酿酒酵母(20-100)和毕赤酵母(6-15)相比要短，成份构成相对简单(Cid，Gomis et al.2000；Kim，Kim et al.2006)；其次，酶解分析表明外链甘露糖的连接方式主要以α-1-2和α-1-6形式存在，除了前期形成的基本M3糖链形式外，几乎没有α-1-3连接的甘露糖末端产物出现(Oh，Park et al.2008；Song，Qian et al.2010)。
因此我们采用另一方法进行汉逊酵母的糖基化改造，避免了甘露糖苷酶的引入。我们在原始菌株中过表达反转酶基因(Rft1)的基础上，敲出汉逊酵母N-糖基化代谢途径相关基因ALG3、ALG11基因，而不必引入相应的甘露糖转移酶基因，直接获得获得五糖核心Man3GlcNAc2前体(Song，Qian et al.2010)。由此又筛选有效的N-乙酰葡糖胺转移酶(N-acetylglucosaminyl transferase，GlcNAcT)转入得到的ALG3和ALG11双缺陷菌株中得到菌株H.pGNT，此步得到菌株所表达的糖蛋白带有较为均一的GlcNAc2Man3GlcNAc2。在本申请中，我们又筛选了合适的半乳糖基转移酶(galactosyltrnsferase，GalT)，并按照汉逊酵母密码子优化了部分基因序列。然后，构建了1组巧妙的质粒组合，通过筛选标记转入H.pGNT菌株中，得到了1株基因工程菌株H.pGAL，这株酵母菌表达的糖蛋白带有Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2形式的糖链。
发明内容
本发明的目的是提供人源糖基化改造的汉逊酵母。
本发明提供了重组质粒甲，包括如下功能元件：UGnT基因的表达盒、MMN9基因和GnTI基因的表达盒、MNN2基因和GnTII基因的表达盒；所述UGnT基因如序列表的序列1自5’末端第548至1535位核苷酸所示；所述MMN9基因如序列表的序列1自5’末端第2438至2551位核苷酸所示；所述GnTI基因如序列表的序列1自5’末端第2558至3781位核苷酸所示；所述MNN2基因如序列表的序列1自5’末端第4685至4825位核苷酸所示；所述GnTII基因如序列表的序列1自5’末端第4832至5899位核苷酸所示。
所述UGnT基因的表达盒中，可由序列表的序列1自5’末端第7至541位核苷酸所示的GAP启动子启动所述UGnT基因的表达，可由序列表的序列1自5’末端第1559至1896位核苷酸所示的AOX1TT终止序列终止所述UGnT基因的表达。
所述MMN9基因和GnTI基因的表达盒中，可由序列表的序列1自5’末端第1903至2437位核苷酸所示的GAP启动子启动所述MMN9基因和所述GnTI基因的表达，可由序列表的序列1自5’末端第3806至4143位核苷酸所示的AOX1TT终止序列终止所述MMN9基因和所述GnTI基因的表达。
所述MNN2基因和GnTII基因的表达盒中，可由序列表的序列1自5’末端第4150至4684位核苷酸所示的GAP启动子启动所述MNN2基因和所述GnTII基因的表达，可由序列表的序列1自5’末端第5924至6261位核苷酸所示的AOX1TT终止序列终止所述MNN2基因和所述GnTII基因的表达。
所述重组质粒甲还可包括筛选基因的表达盒。所述筛选基因具体可为序列表的序列1自5’末端第6747至7562位核苷酸所示的G418基因。所述筛选基因的表达盒中，可由序列表的序列1自5’末端第6268至6678位核苷酸所示的TEF1p启动子启动所述筛选基因的表达，可由序列表的序列1自5’末端第7850至8167位核苷酸所示的CYC1TT终止序列终止所述筛选基因的表达。
所述重组质粒甲还包括PUC ori(复制起始子)。所述PUC ori具体可如序列表的序列1自5’末端第8178至8851位核苷酸所示。
所述重组质粒甲具体可如序列表的序列1所示。
本发明提供的重组菌(重组菌乙)为将所述重组质粒甲和重组质粒乙导入汉逊酵母得到的重组菌；所述重组质粒乙包括如下功能元件：MNN2基因和GnTII基因的表达盒、UGT基因的表达盒和UGalE基因的表达盒；所述UGalE基因如序列表的序列2自5’末端第1164至2231位核苷酸所示；所述UGT基因如序列表的序列2自5’末端第3601至4659位核苷酸所示；所述MNN2基因如序列表的序列2自5’末端第7975位核苷酸至8115位核苷酸所示；所述GnTII基因如序列表的序列2自5’末端第8122至9192位核苷酸所示。
所述UGalE基因的表达盒中，可由序列表的序列2自5’末端第623至1157位核苷酸所示的GAP启动子启动所述UGalE基因的表达，可由序列表的序列2自5’末端第2256至2593位核苷酸所示的AOX1TT终止序列终止所述UGalE基因的表达。
所述UGT基因的表达盒中，可由序列表的序列2自5’末端第2600至3600位核苷酸所示的PMA1启动子启动所述UGT基因的表达，可由序列表的序列2自5’末端第4684至5021位核苷酸所示的AOX1TT终止序列终止所述UGT基因的表达。
所述MNN2基因和GnTII基因的表达盒中，可由序列表的序列2自5’末端第7440至7974位核苷酸所示的GAP启动子启动所述MNN2基因和所述GnTII基因的表达，可由序列表的序列2自5’末端第9220至9554位核苷酸所示的AOX1TT终止序列终止所述MNN2基因和所述GnTII基因的表达。
所述重组质粒乙还包括至少一个筛选基因。所述筛选基因具体可为序列表的序列2自5’末端第5028至7433位核苷酸所示的LEU2基因。所述筛选基因具体还可为序列表的序列2自5’末端第10619至11434位核苷酸所示的G418基因。所述重组质粒乙也可同时具有上述两种筛选基因。
所述重组质粒乙上还可以具有根据所述酵母的基因组DNA设计的同源臂，以促进重组的发生。所述同源臂具体由上游同源臂和下游同源臂组成。所述上游同源臂具体可为序列表的序列2自5’末端第12至616位核苷酸为ALG3-HD片段。所述下游同源臂具体可为序列表的序列2自5’末端第9560至10133位核苷酸为ALG3-HU片段。
所述重组质粒乙还可包括PUC ori(复制起始子)。所述PUC ori具体可如序列表的序列2自5’末端第12050至12723位核苷酸所示。
所述重组质粒乙具体可如序列表的序列2所示。
所述汉逊酵母具体可为敲除ALG3基因(GENBANK ACCESSION NO.DQ193533)和ALG11基因(GENBANK ACCESSION NO.EF990145)的汉逊酵母，优选为汉逊酵母Hpalg3Δalg11ΔpRft1。所述ALG3基因和所述ALG11基因均参与N-糖基化代谢途径。
所述重组菌乙可用于制备人源糖基化蛋白。所述人源糖基化蛋白具体可为具有如下糖苷结构的糖蛋白Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2。
糖蛋白；所述糖蛋白的糖苷结构为Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2。所述糖蛋白具体可为rGOD蛋白(GENBANK ACCESSION NO.AAA32695)。
本发明还保护将所述重组质粒甲导入汉逊酵母得到的重组菌甲。所述汉逊酵母具体可为敲除ALG3基因(GENBANK ACCESSION NO.DQ193533)和ALG11基因(GENBANKACCESSION NO.EF990145)的汉逊酵母，优选为汉逊酵母Hpalg3Δalg11ΔpRft1。所述ALG3基因和所述ALG11基因均参与N-糖基化代谢途径。
所述重组菌甲可用于制备糖蛋白；所述糖蛋白的糖苷结构为GlcNAc2Man3GlcNAc2。所述糖蛋白具体可为rGOD蛋白(GENBANK ACCESSION NO.AAA32695。
本发明提供的工程菌(重组菌乙)表达的糖蛋白所带糖链结构为：Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2，该糖链类似于人类糖蛋白所带糖链结构，因此消除了在野生型酵母表达的蛋白由于高甘露糖链所引起的抗原性，可以直接用了生产表达药用糖蛋白。本发明提供的质粒以及工程菌对于制备人源糖基化蛋白具有重大价值。
附图说明
图1为重组质粒甲的结构示意图谱。
图2为重组质粒乙的结构示意图谱。
图3为工程菌株表达的糖蛋白的糖链质谱(MALDI-TOF MS)分析结果；A：对照菌表达的rGOD的糖链结构；B：重组菌pGNT-rGOD表达的rGOD的糖链结构；C：重组菌H.pGAL-rGOD表达的rGOD的糖链结构。
图4为人源糖基化改造菌株分泌表达的重组葡萄糖氧化酶糖蛋白(rGOD)的SDS-PAGE电泳图；泳道1：对照菌表达的rGOD；泳道2：H.pGAL菌表达的rGOD；泳道3：对照菌表达的rGOD被糖苷酶F酶切后的产物；泳道4：H.pGAL菌表达的rGOD被糖苷酶F酶切后的产物。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)AH109菌株：购自clontech公司。
人肝脏Marathon-Ready cDNA(Human Liver Marathon-Ready cDNA)：购自clontech公司，产品编号为：639307。
乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lacti)：购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，CGMCC编号为2.1494。
大鼠肝脏Marathon-ready cDNA(rat-liver Marathon-ready cDNA)：购自clontech公司，产品编号为：639413。
果蝇cDNA文库(Drosophila melanogaster)，又称Insect cDNA Library：购自安捷伦科技有限公司(中国)(Agilent Technologies)，产品编号为937602。
巴斯德毕赤酵母GS115：购自invitrogen公司。
栗酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)：购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，CGMCC编号为2.1630。
质粒pUG73：带有酿酒酵母LEU2筛选标记，购自Euroscarf(Frankfurt，Germany；http：//web.uni-frankfurt.de/fb15/mikro/euroscarf/data/pUG73.html)(见Güldener，U.，Heinisch，J.，G.J.，Voss，D.，and Hegemann，J.H.2002：A second set of loxP marker cassettes for Cre-mediated multiple gene knockoutsin budding yeast.Nucleic Acids Research 30，e23)，产品目录号为P30118，公众也可从中国科学院微生物研究所获得。
载体pHGAPGA：公众可以从中国科学院微生物研究所获得；参考文献：宋厚辉，汉逊酵母表达系统技术平台的建立和口蹄疫新型粘膜免疫疫苗的研究，中国科学院微生物所博士论文，2005。
汉逊酵母NCYC495(LEU1.1)：是一种亮氨酸营养缺陷型的多型汉逊酵母，公众可以从中国科学院微生物研究所获得；参考文献：leeson，M.，G.Ortori，et al.(1986).″Transformation of the methylotrophic yeast Hansenula polymorpha.″Journal of General Microbiology 132(12)：3459-3465.。
汉逊酵母Hpalg3Δalg11ΔpRft1：敲除了ALG3和ALG11的汉逊酵母，公众可以从中国科学院微生物研究所获得；参考文献：Song，H.，W.Qian，et al.(2010).″Identification and functional characterization of the HpALG11 and the HpRFT1genes involved in N-linked glycosylation in the methylotrophic yeast Hansenulapolymorpha.″Glycobiology 20(12)：1665-1674.。
质粒pHFMDZαL2-rGOD：能表达糖蛋白rGOD，公众可以从中国科学院微生物研究所获得；参考文献：Song，H.，W.Qian，et al.(2010).″Identification and functionalcharacterization of the HpALG11 and the HpRFT1 genes involved in N-linkedglycosylation in the methylotrophic yeast Hansenula polymorpha.″Glycobiology20(12)：1665-1674.。
SD培养基：0.17％无氨基酸酵母氮源(YNB W/O Amino acid，BD/Difco培养基，产品编号：291920)，0.5％硫酸铵，2％葡萄糖。
YNG培养基：0.17％无氨基酸酵母氮源(YNB W/O Amino acid，BD/Difco培养基，产品编号：291920)，0.5％硫酸铵，2％甘油。
实施例1、重组质粒甲和工程菌甲的构建
一、重组质粒甲的构建
重组质粒pGNT(又称重组质粒甲)的结构示意图见图1。重组质粒pGNT的核苷酸序列如序列表的序列1所示。序列1中，自5’末端第1至6位核苷酸为BglII酶切识别序列、第7至541位核苷酸为GAP启动子、第548至1535位核苷酸为UGnT基因、第1559至1896位核苷酸为AOX1TT终止序列、第1903至2437位核苷酸为GAP启动子、第2438至2551位核苷酸为MMN9基因、第2558至3781位核苷酸为GnTI基因、第3806至4143位核苷酸为AOX1TT终止序列、第4150至4684位核苷酸为GAP启动子、第4685至4825位核苷酸为MNN2基因、第4832至5899位核苷酸为GnTII基因、第5924至6261位核苷酸为AOX1TT终止序列、第6268至6678位核苷酸为TEF1p启动子、第6747至7562位核苷酸为G418抗性筛选基因、第7850至8167位核苷酸为CYC1TT终止序列、第8178至8851位核苷酸为PUC ori(复制起始子)。
重组质粒pGNT可采用任何现有方法制备。本专利中采用以下步骤制备：
1、重组质粒pHGAPG-MNN9的构建
(1)以酿酒酵母AH109菌株的基因组DNA为模板，采用MNN9-U和MNN9-D组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物(MNN9基因，约114bp)。
MNN9-U：5’-ATGTCACTTTCTCTTGTATCGT-3’；
MNN9-D：5’-GGGGAATTCAGATTGATCTCTCTGGAAA-3’(下划线标注EcoRI酶切位点)。
(2)以载体pHGAPGA为模板，采用GAP-U和GAP-MNN9组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物(GAP启动子)。
GAP-U：5’-TTTGCAAGCAGCAGATTACGC-3’(此引物序列在GAP启动子的外侧，与gap启动子之间有BglII酶切位点)；
GAP-MNN9：5’-GATACAAGAGAAAGTGACATGGTGTTTCTATATTAT-3’。
(3)同时以步骤(1)和步骤(2)的PCR产物为模板，采用引物GAP-U和MNN9-D组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物(GAP-MNN9融合基因)
(4)用限制性内切酶BglII和EcoRI双酶切步骤(3)的PCR扩增产物，回收酶切产物。
(5)用限制性内切酶BglII和EcoRI双酶切载体pHGAPGA，回收约3.1kb的载体骨架。
(6)将步骤(4)的酶切产物和步骤(5)的载体骨架连接，得到重组质粒pHGAPG-MNN9。
2、重组质粒pHGAPG-UGnT的构建
(1)以乳酸克鲁维酵母的基因组DNA为模板，采用UGnT-U和UGnT-D组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物(UGnT基因，约0.98kb)。
UGnT-U：5’-GGGCTGCAGATGAGTTTTGTATTGATT-3’(下划线标注PstI酶切位点)；
UGnT-D：5’-AAAGTCGACTCAGCGAGGCAGTGCAGT-3’(下划线标注SalI酶切位点)。
(2)用限制性内切酶PstI和SalI双酶切步骤(1)的PCR扩增产物，回收酶切产物。
(3)用限制性内切酶PstI和SalI双酶切载体pHGAPGA，回收约3.6kb的载体骨架。
(4)将步骤(2)的酶切产物和步骤(3)的载体骨架连接，得到重组质粒pHGAPG-UGnT。
3、重组质粒pHGAPG-GnTI的构建
(1)以人肝脏Marathon-Ready cDNA为模板，采用GnTI-U和GnTI-D组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物(GnTI基因，约1.2kb)。
GnTI-U：5’-GGTGAATTCTCAGTCAGCGCTCTCGAT-3’(下划线标注EcoRI酶切位点)；
GnTI-D：5’-GGTGTCGACCTAATTCCAGCTAGGATC-3’(下划线标注SalI酶切位点)。
(2)用限制性内切酶EcoRI和SalI双酶切步骤(1)的PCR扩增产物，回收酶切产物。
(3)用限制性内切酶EcoRI和SalI双酶切重组质粒pHGAPG-MNN9，回收约3.7kb的载体骨架。
(4)将步骤(2)的酶切产物和步骤(3)的载体骨架连接，得到重组质粒pHGAPG-GnTI。
4、载体pHGAPG-MNN2的构建
(1)以酿酒酵母AH109菌株的基因组DNA为模板，采用MNN2-U和MNN2-D组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物(MNN2基因，约141bp)。
MNN2-U：5’-CATGCTGCTTACCAAAAGGTT-3’；
MNN2-D：5’-GGGGAATTCATATCTGTCTAAGTACTCC-3’(下划线标注EcoRI酶切位点)。
(2)以载体pHGAPGA为模板，采用GAP-U和GAP-MNN2组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物(GAP启动子)。
GAP-MNN2：5’-AACCTTTTGGTAAGCAGCATGGTGTTTCTATATTAT-3’。
(3)同时以步骤(1)和步骤(2)的PCR产物为模板，采用引物GAP-U和MNN2-D组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物(GAP-MNN2融合基因)
(4)用限制性内切酶BglII和EcoRI双酶切步骤(3)的PCR扩增产物，回收酶切产物。
(5)用限制性内切酶BglII和EcoRI双酶切载体pHGAPGA，回收约3.1kb的载体骨架。
(6)将步骤(4)的酶切产物和步骤(5)的载体骨架连接，得到重组质粒pHGAPG-MNN2。
5、重组质粒pHGAPG-GnTII的构建
(1)以大鼠肝脏Marathon-ready cDNA为模板，采用GnTII-U和GnTII-D组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物(GnTII基因，约1.0kb)。
GNTII-U：5’-CCGGAATTCTCCCTAGTGTACCAGTTGAAC-3’(下划线标注EcoRI酶切位点)；
GNTII-D：5’-GGGGTCGACTCACTGCAGTCTTCTATAACT-3’(下划线标注SalI酶切位点)。
(2)用限制性内切酶EcoRI和SalI双酶切步骤(1)的PCR扩增产物，回收酶切产物。
(3)用限制性内切酶EcoRI和SalI双酶切重组质粒pHGAPG-MNN2，回收约3.7k的载体骨架。
(4)将步骤(2)的酶切产物和步骤(3)的载体骨架连接，得到重组质粒pHGAPG-GnTII。
6、重组质粒pGNT的构建
(1)用限制性内切酶BglII和BamHI双酶切重组质粒pHGAPG-GnTI，回收约2.2kb的片段(自上游至下游依次含有GAP启动子、MNN9基因、GnTI基因和AOX1TT终止序列)。
(2)用限制性内切酶BglII和BamHI双酶切重组质粒pHGAPG-GnTII，回收约2.0kb的片段(自上游至下游依次含有GAP启动子、MNN2基因、GnTII基因和AOX1TT终止序列)。
(3)用限制性内切酶BamHI酶切重组质粒pHGAPG-UGnT，回收约4.5kb的片段并进行脱磷酸化。
(4)将步骤(1)回收的片段与步骤(3)回收的片段连接，得到重组质粒pGNTI。
(5)用限制性内切酶BamHI酶切重组质粒pGNTI，回收约6.8kb的片段并进行脱磷酸化。
(6)将步骤(2)回收的片段与步骤(5)回收的片段连接，得到重组质粒pGNT。
二、工程菌甲的构建
1、用限制性内切酶BglII酶切重组质粒pGNT，回收约8.8kb的片段。
2、将步骤1的片段采用电穿孔法(电击参数为1.0kv，100Ω，50μF)转化汉逊酵母Hpalg3Δalg11ΔpRft1，得到重组酵母H.pGNT(又称工程菌甲)。
重组酵母H.pGNT进行三次PCR鉴定，第一次PCR鉴定采用GnTI-U和GnTI-D组成的引物对、第二次PCR鉴定采用GnTII-U和GnTII-D组成的引物对、第三次PCR鉴定采用UGnT-U和UGnT-D组成的引物对，三次PCR鉴定结果均为阳性。
实施例2、重组质粒乙和工程菌乙的构建
一、重组质粒乙的构建
重组质粒PGAL2(又称重组质粒乙)的结构示意图见图2。重组质粒PGAL2的核苷酸序列如序列表的序列2所示。序列2中，自5’末端第6至11位核苷酸为SnaBI酶切识别序列、第12至616位核苷酸为ALG3-HD片段(同源臂)、第623至1157位核苷酸为GAP启动子、第1164至2231位核苷酸为UGalE基因、第2256至2593位核苷酸为AOX1TT终止序列、第2600至3600位核苷酸为PMA1启动子、第3601至4659位核苷酸为UGT基因、第4684至5021位核苷酸为AOX1TT终止序列、第5028至7433位核苷酸为LEU2基因、第7440至7974位核苷酸为GAP启动子、第7975位核苷酸至8115位核苷酸为MNN2基因、第8122至9192位核苷酸为GalTI基因、第9220至9554位核苷酸为AOX1TT终止序列、第9560至10133位核苷酸为ALG3-HU片段(同源臂)、第10619至11434位核苷酸为G418抗性筛选基因、第12050至12723位核苷酸为PUC ori(复制起始子)。
重组质粒pGNT可采用任何现有方法制备。本专利中采用以下步骤制备：
1、重组质粒pHPMA1的构建
(1)以巴斯德毕赤酵母GS115的基因组DNA为模板，采用PMA1-U和PMA1-D组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物(PMA1启动子)。
PMA1-U：5’-GGGAGATCTATTCAAGCGAATGAGAATAATG-3’(下划线标注BglII酶切位点)；
PMA1-D：5’-TTGAATTCGCGGCCGCGAAGTTTTTAAAGGAAAGAGAT-3’(下划线标注EcoRI酶切位点)。
(2)用限制性内切酶BglII和EcoRI双酶切步骤(1)的PCR扩增产物，回收酶切产物。
(3)用限制性内切酶BglII和EcoRI双酶切载体pHGAPGA，回收约3.1kb的载体骨架。
(4)将步骤(2)的酶切产物和步骤(3)的载体骨架连接，得到重组质粒pHPMA1。
2、重组质粒pHPMA1-UGT的构建
(1)以果蝇cDNA文库为模板，采用UGT-U和UGT-D组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物(UGT基因，约1.0kb)。
UGT-U：5’-TTTGCGGCCGCATGAACGCCAATACGCTGAAG-3’(下划线标注NotI酶切位点)；
UGT-D：5’-TTTGTCGACCTAGACGCGCGGCAGCAGCT-3’(下划线标注SalI酶切位点)。
(2)用限制性内切酶NotI和SalI双酶切步骤(1)的PCR扩增产物，回收酶切产物。
(3)用限制性内切酶NotI和SalI双酶切重组质粒pHPMA1，回收约4.0kb的载体骨架。
(4)将步骤(2)的酶切产物和步骤(3)的载体骨架连接，得到重组质粒pHPMA1-UGT。
3、重组质粒pHGAPG-GalE的构建
(1)以栗酒裂殖酵母的cDNA为模板，采用UGalE-U和UGalE-D组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物(UGalE基因，约1.1kb)。
UGalE-U：5’-GGGGAATTCATGACTGGTGTTCATGAAG-3’(下划线标注EcoRI酶切位点)；
UGalE-D：5’-TTTGTCGACTTACTTATATGTCTTGGTAT-3’(下划线标注SalI酶切位点)。
(2)用限制性内切酶EcoRI和SalI双酶切步骤(1)的PCR扩增产物，回收酶切产物。
(3)用限制性内切酶EcoRI和SalI双酶切载体pHGAPGA，回收约3.6kb的载体骨架。
(4)将步骤(2)的酶切产物和步骤(3)的载体骨架连接，得到重组质粒pHGAPG-UGalE。
4、重组质粒pHGAPG-GalTI的构建
(1)以人肝脏Marathon-Ready cDNA为模板，采用GalTI-U和GalTI-D组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物(GalTI基因，约1.0kb)。
GalTI-U：5’-TTTGAATTCATGGGCCGCGACCTGAGCCG-3’(下划线标注EcoRI酶切位点)；
GalTI-D：5’-TTTGTCGACCTAGCTCGGTGTCCCGATGT-3’(下划线标注SalI酶切位点)。
(2)用限制性内切酶EcoRI和SalI双酶切步骤(1)的PCR扩增产物，回收酶切产物。
(3)用限制性内切酶EcoRI和SalI双酶切重组质粒pHGAPG-MNN2，回收约3.7kb的载体骨架。
(4)将步骤(2)的酶切产物和步骤(3)的载体骨架连接，得到重组质粒pHGAPG-GalTI。
5、重组质粒pGAL的构建
(1)以质粒pUG73为模板，采用LEU2-U和LEU2组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物(LEU2基因，约2.4kb)。
LEU2-U：5’-GGAAGATCTGTATGCTTCCGGCTCGTATG-3’(下划线标注BglII酶切位点)；
LEU2-D：5’-GCGGGATCCAAATGAAACAACCGCTGATG-3’(下划线标注BamHI酶切位点)。
(2)用限制性内切酶BamHI和BglII双酶切步骤(1)的PCR扩增产物，回收酶切产物。
(3)用限制性内切酶BglII单酶切重组质粒pHGAPG-GalTI，脱磷酸化后回收约4.8kb的载体骨架。
(4)将步骤(2)的酶切产物和步骤(3)的载体骨架连接，得到重组质粒pHGAPG-GalTI-LEU2。
(5)用限制性内切酶BglII和BamHI双酶切重组质粒pHGAPG-UGalE，回收约2.1kb的片段(自上游至下游依次含有GAP启动子、UGalE基因和AOX1TT终止序列)。
(6)用限制性内切酶BglII和BamHI双酶切重组质粒pHPMA1-UGT，回收约2.4kb的片段(自上游至下游依次含有PMA1启动子、UGT基因和AOX1TT终止序列)。
(7)用限制性内切酶BglII酶切重组质粒pHGAPG-GalTI-LEU2，回收约7.2kb的片段并进行脱磷酸化。
(8)将步骤(6)的片段和步骤(7)的片段连接，得到重组质粒pHGAPG-GalTI-LEU2-UGT。
(9)用限制性内切酶BglII酶切重组质粒pHGAPG-GalTI-LEU2-UGT，回收约9.6kb的片段并进行脱磷酸化。
(10)将步骤(9)的片段和步骤(5)的片段连接，得到重组质粒pGAL。
6、重组质粒pGAL2的构建
为了使重组质粒pGAL在汉逊酵母中能有效的整合，在载体加入整合同源臂，具体方法如下：
(1)根据汉逊酵母ALG3基因序列设计如下引物：
ALG3-A：5’-GGGAGATC 
TGGGCGATATCAAGTTTG-3’(下划线标注BglII酶切位点，斜体标注SnaBI酶切位点)；
ALG3-B：5’-TTTGGATCCAACAACTGTGCGCTGAAAAAGGTG-3’(下划线标注BamHI酶切位点)；
ALG3-C：5’-TTTAGATCTGCAGGCAGGCATTAACTGGGA-3’(下划线标注BglII酶切位点)；
ALG3-D：5’-TTTGGATCC 
TCCTGTTTGGGTTTGCCG-3’(下划线标注BamHI酶切位点，斜体标注SnaBI酶切位点)。
(2)以汉逊酵母NCYC495(LEU1.1)的基因组DNA为模板，采用ALG-A和ALG-B组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物(ALG3-HU片段)。
(3)以汉逊酵母NCYC495(LEU1.1)的基因组DNA为模板，采用ALG-C和ALG-D组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物(ALG3-HD片段)。
(4)用限制性内切酶BglII和BamHI酶切步骤(2)的PCR扩增产物，得到酶切产物。
(5)用限制性内切酶BamHI酶切重组质粒pGAL，回收约11.7kb的片段并进行脱磷酸化。
(6)将步骤(4)的酶切产物和步骤(5)的片段连接，得到重组质粒PGAL1。
(7)用限制性内切酶BglII和BamHI酶切步骤(3)的PCR扩增产物，得到酶切产物。
(8)用限制性内切酶BglII酶切重组质粒pGAL1，回收约12.1kb的片段并进行脱磷酸化。
(9)将步骤(7)的酶切产物和步骤(8)的片段连接，得到重组质粒PGAL2。
二、工程菌乙的构建
1、用限制性内切酶SnaBI酶切重组质粒PGAL2，回收约10kb的片段。
2、将步骤1的片段采用电穿孔法(电击参数为1.0kv，100Ω，50μF)转化工程菌甲，得到重组酵母H.pGAL(又称工程菌乙)。
重组酵母H.pGAL进行三次PCR鉴定，第一次PCR鉴定采用UGT-U和UGT-D组成的引物对、第二次PCR鉴定采用GalTI-U和GalTI-D组成的引物对、第三次PCR鉴定采用UGalE-U和UGalE-D组成的引物对，三次PCR鉴定结果均为阳性。
实施例3、工程菌表达的糖蛋白的纯化与鉴定
1、将质粒pHFMDZαL2-rGOD导入工程菌甲，得到重组菌H.pGNT-rGOD。
2、将质粒pHFMDZαL2-rGOD导入工程菌乙，得到重组菌H.pGAL-rGOD。
3、将质粒pHFMDZαL2-rGOD导入汉逊酵母Hpalg3Δalg11ΔpRft1，得到对照菌。
4、分别将步骤1得到的重组菌H.pGNT-rGOD、步骤2得到的重组菌H.pGAL-rGOD和步骤3得到的对照菌进行如下实验：
(1)rGOD蛋白的诱导表达
①接种工程菌单菌落到含有5mL SD培养基的试管中，30℃培养48h；然后转接到含有50mL YNG培养基的250mL三角瓶中，30℃培养32小时(30-35h均可)；
②转接100mL步骤①得到的培养物至含有450mL YPG培养基的5L三角瓶中，30℃培养30h(菌体OD600＞1.5)，然后加入作为诱导剂的甲醇(使甲醇的在培养体系中的体积百分含量为0.5％)；25℃培养84小时(72-90h均可)，每6小时(4-8h均可)检测甲醇浓度并补加甲醇，使甲醇的在培养体系中的体积百分含量为0.5％。
(2)将完成步骤(1)的培养体系离4℃心并收集上清液，使用赛多利斯(Sartorius)公司的Vivaflow50浓缩装置浓缩上清液至50-100mL之内(大约10倍)，高速离心去掉沉淀过0.22滤膜后保存待用，即为样品浓缩液。
(3)将步骤(2)得到的样品浓缩液使用GE公司的HisTrapTM FF Columns(产品目录号为：17-5319-01)纯化rGOD蛋白。
①平衡HisTrapTM FF Columns
安装好纯化柱后，首先用去离子水冲洗3-5个柱体积，然后用PBS缓冲液(pH＝7.4、0.01M)平衡5个柱体积。
②上样
将样品浓缩液用蠕动泵上柱，速率控制在1ml/min。
③洗脱杂蛋白
用含20mM咪唑的PBS缓冲液(pH＝7.4、0.01M)冲洗5个柱体积，速率控制在1ml/min。
④洗脱rGOD蛋白
用含300mM咪唑的PBS缓冲液(pH＝7.4、0.01M)洗脱柱子，流速控制在0.5mL/min，过柱后溶溶液，即为纯化后的rGOD蛋白。
5、将收集的rGOD蛋白用内切-β-N-乙酰葡萄糖胺的糖苷酶F(PNGase F；NewEngland Biolabs)酶切(从糖蛋白上切下糖链)，通过MALDI-TOF分析糖链结构，具体步骤如下：
①取纯化后的rGOX蛋白样品500μl，加入55μL 10×Denatuing Buffer(5％SDS，4M DTT)，沸水浴5min；自然冷却至室温。
②步骤①的样品400ul，加入50ul 10×Reaction Buffer(0.5M磷酸钠，pH＝7.5，25℃)和50ul 10％NP-40，混合均匀后加入5μL PNGase F，37℃水浴反应16h。
③将步骤②的产物中加入4倍体积的冷丙酮进行沉淀，-20℃放置20min，然后12,000r/min离心10min，收集沉淀，室温下晾干丙酮，然后再加入冷的60％甲醇，涡旋混匀，-20℃放置过夜。
④将步骤③的产物12,000r/min离心10min，收集上清液并再次12,000r/min离心10min，收集上清液并真空冷冻干燥，得到沉淀物。
⑤将步骤④得到的沉淀物溶于15ul纯水，然后通过MALDI-TOF分析糖链结构。
取样品和DHB基质(10mg 2，5-二羟基苯甲酸溶于1mL超纯水中)1∶1混合物0.8uL点于不锈钢靶板上，自然挥发结晶。送入基质辅助激光解析串联飞行时间质谱仪ABI4700中进行检测(型号：ABI 4700MALDI TOF-TOF)进行检测，激光源波长355nm，重复频率200Hz，加速电压20kv，选择阳离子反射模式，分子量扫描范围为899-2509m/z。MS数据用Data ExplorerTM Version 4.3软件(Applied Biosystems，Framingham，MA)来分析。
对照菌分泌得到的rGOD蛋白的糖链的质谱图，见图3A。其中图谱峰图指示了糖苷的分子量大小，分别为933.2559和1095.2960。这分别是Man3GlcNAc2和Man-4GlcNAc2的分子量大小。因此对照菌分泌得到的rGOD蛋白的糖链结构为Man3-4GlcNAc2。
重组菌pGNT-rGOD分泌得到的rGOD蛋白的糖链的质谱图见图3B，图谱峰图显示的糖苷分子量大小为1339.3994，此分子量的糖苷结构为GlcNAc2Man3GlcNAc2。
重组菌H.pGAL-rGOD分泌得到的rGOD蛋白的糖链的质谱图为图3C，图谱峰图显示的糖苷分子量大小为1663.5177，此分子量的糖苷结构为Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2。
重组菌H.pGAL-rGOD纯化后上清的电泳图见图4。
Claims (10)
1.重组质粒甲，包括如下功能元件：UGnT基因的表达盒、MMN9基因和GnTI基因的表达盒、MNN2基因和GnTII基因的表达盒；所述UGnT基因如序列表的序列1自5’末端第548至1535位核苷酸所示；所述MMN9基因如序列表的序列1自5’末端第2438至2551位核苷酸所示；所述GnTI基因如序列表的序列1自5’末端第2558至3781位核苷酸所示；所述MNN2基因如序列表的序列1自5’末端第4685至4825位核苷酸所示；所述GnTII基因如序列表的序列1自5’末端第4832至5899位核苷酸所示。
2.如权利要求1所述的重组质粒甲，其特征在于：
所述UGnT基因的表达盒中，由序列表的序列1自5’末端第7至541位核苷酸所示的GAP启动子启动所述UGnT基因的表达，由序列表的序列1自5’末端第1559至1896位核苷酸所示的AOX1TT终止序列终止所述UGnT基因的表达；
所述MMN9基因和GnTI基因的表达盒中，由序列表的序列1自5’末端第1903至2437位核苷酸所示的GAP启动子启动所述MMN9基因和所述GnTI基因的表达，由序列表的序列1自5’末端第3806至4143位核苷酸所示的AOX1TT终止序列终止所述MMN9基因和所述GnTI基因的表达；
所述MNN2基因和GnTII基因的表达盒中，由序列表的序列1自5’末端第4150至4684位核苷酸所示的GAP启动子启动所述MNN2基因和所述GnTII基因的表达，由序列表的序列1自5’末端第5924至6261位核苷酸所示的AOX1TT终止序列终止所述MNN2基因和所述GnTII基因的表达。
3.如权利要求2所述的重组质粒，其特征在于：所述重组质粒甲如序列表的序列1所示。
4.重组菌乙，是将权利要求1至3中任一所述重组质粒甲以及重组质粒乙导入汉逊酵母得到的重组菌；所述重组质粒乙包括如下功能元件：MNN2基因和GnTII基因的表达盒、UGT基因的表达盒和UGalE基因的表达盒；所述UGalE基因如序列表的序列2自5’末端第1164至2231位核苷酸所示；所述UGT基因如序列表的序列2自5’末端第3601至4659位核苷酸所示；所述MNN2基因如序列表的序列2自5’末端第7975位核苷酸至8115位核苷酸所示；所述GnTII基因如序列表的序列2自5’末端第8122至9192位核苷酸所示。
5.如权利要求4所述的重组菌乙，其特征在于：
所述UGalE基因的表达盒中，由序列表的序列2自5’末端第623至1157位核苷酸所示的GAP启动子启动所述UGalE基因的表达，由序列表的序列2自5’末端第2256至2593位核苷酸所示的AOX1TT终止序列终止所述UGalE基因的表达；
所述UGT基因的表达盒中，由序列表的序列2自5’末端第2600至3600位核苷酸所示的PMA1启动子启动所述UGT基因的表达，由序列表的序列2自5’末端第4684至5021位核苷酸所示的AOX1TT终止序列终止所述UGT基因的表达；
所述MNN2基因和GnTII基因的表达盒中，由序列表的序列2自5’末端第7440至7974位核苷酸所示的GAP启动子启动所述MNN2基因和所述GnTII基因的表达，由序列表的序列2自5’末端第9220至9554位核苷酸所示的AOX1TT终止序列终止所述MNN2基因和所述GnTII基因的表达。
6.如权利要求5所述的重组菌乙，其特征在于：所述重组质粒乙如序列表的序列2所示。
7.权利要求4或5或6所述重组菌乙在制备人源糖基化蛋白中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于：所述人源糖基化蛋白为具有如下糖苷结构的糖蛋白Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2。
9.重组菌甲，是将权利要求1至3中任一所述重组质粒甲导入汉逊酵母得到的重组菌。
10.权利要求9所述重组菌甲在制备糖蛋白中的应用；所述糖蛋白的糖苷结构为GlcNAc2Man3GlcNAc2。
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| HAOLEI SONG ET AL.: "Identification and functional characterization of the HpALG11 and the HpRFT1 genes involved in N-linked glycosylation in the methylotrophic yeast Hansenula polymorpha.", 《GLYCOBIOLOGY》 * |
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