CN102985541B - 宿主、转化体及其制造方法、以及含o-糖苷型糖链的异源蛋白质的制造方法 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的在于提供可使用粟酒裂殖酵母作为宿主而获得具有将糖链结构控制为特定的结构的O-糖苷型糖链的异源蛋白质的转化体、该转化体的制造方法及用于获得该转化体的宿主、以及包含O-糖苷型糖链的异源蛋白质的制造方法。本发明提供的宿主是由具有omh1基因缺失或失活的染色体的粟酒裂殖酵母构成的宿主，用于通过基因工程方法使编码异源蛋白质的基因表达，再使糖链结合于所表达的异源蛋白质，从而生成具有特定的O-糖苷型糖链的异源蛋白质。本发明还提供使用该宿主的转化体及其制造方法、以及使用该转化体的包含O-糖苷型糖链的异源蛋白质的制造方法。

Description

宿主、转化体及其制造方法、以及含O-糖苷型糖链的异源蛋白质的制造方法
技术领域
本发明涉及宿主、转化体及其制造方法、以及含O-糖苷型糖链的异源蛋白质的制造方法。
背景技术
真核生物中的分泌性蛋白质等的糖基化是翻译后修饰中的重要过程之一，由与内质网、高尔基体相关的各种酶来管理。通过糖基化与蛋白质结合的糖链由甘露糖(Man)、半乳糖(Gal)、N-乙酰基葡糖胺等形成。与蛋白质结合的糖链有结合在天冬氨酸残基的酰胺基的氮原子上的N-糖苷型糖链和结合在丝氨酸残基或苏氨酸残基的羟基的氧原子上的O-糖苷型糖链这两种。该糖链被认为影响着蛋白质的稳定性的赋予以及与细胞的相互作用。因此，为了制造医药品，尝试着开发用于制造结合有N-糖苷型糖链的蛋白质的技术(例如参照专利文献1和2)。
对于N-糖苷型糖链已积累了各种认识，但对于O-糖苷型糖链的认识较少。通常，在机体内生成结合有具有各种结构的O-糖苷型糖链的蛋白质，特别是在医药品的制造中，将结合于蛋白质的糖链的结构控制为特定的结构是很重要的。于是，对于具有O-糖苷型糖链的蛋白质，也要求开发出以高生产性制造具有特定的糖链结构的蛋白质的技术。
作为以高生产性制造目标蛋白质的方法，广泛采用的是使用导入有编码目标异源蛋白质(宿主本身不产生的蛋白质)的基因的转化体的基因工程制造方法。认为在制造来源于真核生物的蛋白质时，宿主最好使用作为真核生物的微生物，从不含对人体造成不良影响的物质的角度来看，多使用酵母。其中，已知与Saccharomycescerevisiae(下称酿酒酵母)等出芽酵母相比，作为裂殖酵母的Schizosaccharomycespombe(下称粟酒裂殖酵母)的细胞周期和染色体结构、RNA剪接等与动物细胞更为相似，认为所生成的蛋白质的翻译后修饰也与动物细胞更为接近。
酿酒酵母中的O-糖苷型糖链的合成由甘露糖通过PMT基因家族所编码的O-甘露糖基转移酶与蛋白质的丝氨酸残基或苏氨酸残基的氧结合而引发(参照非专利文献1和2)。随后，KTR基因家族所编码的α1，2-甘露糖基转移酶和MNN1基因家族所编码的α1，3-甘露糖基转移酶参与糖链的延伸(参照非专利文献3)。
另一方面，对于粟酒裂殖酵母，参与O-糖苷型糖链的延伸的基因尚未确定。
对于使用粟酒裂殖酵母的异源蛋白质的制造，已开发出在粟酒裂殖酵母中起作用的启动子和分泌信号基因、多克隆载体等。但是，参与粟酒裂殖酵母中的O-糖苷型糖链的糖链修饰的基因尚不清楚，因此至今为止无法控制O-糖苷型糖链的结构。
由于以上原因，希望开发出用粟酒裂殖酵母制造具有特定的O-糖苷型糖链的异源蛋白质的方法。
专利文献1：日本专利特表2004-501642号公报
专利文献2：日本专利特表2005-514021号公报
非专利文献1：Strahl-BolsingerS，GentzschM和TannerW，BiochimBiophysActa，1426，297-307(1999).
非专利文献2：GirrbachV和StrahlS，JBiolChem，278，12554-12562(2003)
非专利文献3：LussierM，SdicuM和BusseyH，BiochimBiophysActa，1426，323-334(1999)
发明的揭示
于是，本发明的目的在于提供一种转化体及该转化体的制造方法，所述转化体可使用粟酒裂殖酵母作为宿主来获得具有将糖链结构控制为O-Man-Gal(异源蛋白质的氧原子上依次结合有甘露糖、半乳糖的糖链)双糖结构的O-糖苷型糖链的异源蛋白质。本发明的目的也在于提供用于获得该转化体的粟酒裂殖酵母宿主。
本发明的目的还在于提供使用所述转化体的包含O-糖苷型糖链的异源蛋白质的制造方法。
本发明的宿主是由omh1基因缺失或失活的粟酒裂殖酵母构成的宿主，用于通过基因工程方法使编码异源蛋白质的基因表达，再使糖链结合于所表达的异源蛋白质，从而生成具有呈O-Man-Gal双糖结构的O-糖苷型糖链的异源蛋白质。
本发明的转化体以omh1基因缺失或失活的粟酒裂殖酵母作为宿主，包含编码异源蛋白质的基因。
本发明的转化体较好是还包含编码在所述粟酒裂殖酵母中起作用的分泌信号的基因，该基因结合于编码所述异源蛋白质的基因的5’末端。
本发明的转化体中，较好是与所述异源蛋白质相对应的野生型蛋白质是具有O-糖苷型糖链的蛋白质。
本发明的转化体的制造方法的特征在于，以omh1基因缺失或失活的粟酒裂殖酵母作为宿主，将编码异源蛋白质的基因整合到所述宿主中。
本发明的转化体的制造方法中，较好是在编码所述异源蛋白质的基因的5’末端侧具有编码在粟酒裂殖酵母中起作用的分泌信号的基因。
本发明的转化体的制造方法中，较好是与所述异源蛋白质相对应的野生型蛋白质是具有O-糖苷型糖链的异源蛋白质。
本发明的包含O-糖苷型糖链的异源蛋白质的制造方法是制造具有O-糖苷型糖链的异源蛋白质的方法，其特征在于，对所述转化体进行培养，获取所生成的具有呈O-Man-Gal双糖结构的O-糖苷型糖链的异源蛋白质。
本发明的包含O-糖苷型糖链的异源蛋白质的制造方法中，较好是无论与所生成的具有O-糖苷型糖链的异源蛋白质相对应的野生型异源蛋白质是否具有糖链，也无论该野生型异源蛋白质的糖链结构如何，所生成的具有O-糖苷型糖链的异源蛋白质的糖链均具有O-Man-Gal双糖结构。
本发明的包含O-糖苷型糖链的异源蛋白质的制造方法中，较好是从培养转化体的培养液中获取具有O-糖苷型糖链的异源蛋白质。
本发明的粟酒裂殖酵母宿主可用作为用于生成具有呈O-Man-Gal双糖结构的O-糖苷型糖链的异源蛋白质的宿主。
利用本发明的以粟酒裂殖酵母作为宿主的转化体，可获得具有将糖链结构控制为O-Man-Gal双糖结构的O-糖苷型糖链的异源蛋白质。
利用本发明的转化体的制造方法，可制造转化体，该转化体可获得具有将糖链结构控制为O-Man-Gal双糖结构的O-糖苷型糖链的异源蛋白质。
利用本发明，可使用所述转化体来制造将糖链结构控制为O-Man-Gal双糖结构的包含O-糖苷型糖链的异源蛋白质。
附图的简单说明
图1是表示KTR家族和omh基因所编码的蛋白质的氨基酸序列的图。
图2是表示例2中细胞形态的观察结果的图。
图3是表示例3中的培养后的结果的图。
图4是表示例4中的酸性磷酸酶的分析结果的非变性PAGE照片。(泳道1)野生型粟酒裂殖酵母，(泳道2)omh1突变株，(泳道3)omh2突变株，(泳道4)omh3突变株，(泳道5)omh4突变株，(泳道6)omh5突变株，(泳道7)omh6突变株。
图5是表示例5～12中的壳多糖酶的分析结果的SDS-PAGE照片。(泳道1)酿酒酵母，(泳道2)野生型粟酒裂殖酵母，(泳道3)omh1突变株，(泳道4)omh2突变株，(泳道5)omh3突变株，(泳道6)omh4突变株，(泳道7)omh5突变株，(泳道8)omh6突变株。
图6是表示例13～19中通过正相HPLC分析糖链结构的结果的图。(a)野生型粟酒裂殖酵母，(b)omh1突变株，(c)omh2突变株，(d)omh3突变株，(e)omh4突变株，(f)omh5突变株，(g)omh6突变株。
图7是表示例20中的糖链结构的正相HPLC分析结果的图。(a)pREP41-GFP，(b)pREP41-omh1-GFP。
图8是表示例20中的细胞的观察结果的图。(a)装载有诺马斯基(Nomarski)光学系统的观察装置，(b)荧光显微镜(GFP观察)，(c)荧光显微镜(RFP观察)。
图9是表示例21和22中的壳多糖酶的分析结果的SDS-PAGE照片。(泳道1)粟酒裂殖酵母野生株，(泳道2)omh1突变株。
图10是表示例23和24中的糖链结构的正相HPLC分析结果的图。(a)粟酒裂殖酵母野生株，(b)omh1突变株。
图11是例25中的分离纯化后的双糖的糖链结构的反相HPLC分析结果。(a)和(e)标准糖链，(b)～(d)粟酒裂殖酵母野生株，(f)～(h)omh1突变株。
实施发明的最佳方式
本发明的宿主是由omh1基因缺失或失活的粟酒裂殖酵母构成的宿主，可用作为用于制造本发明的转化体的宿主。将编码异源蛋白质的基因(以下也称“异源蛋白质基因”)导入该宿主，从而制造本发明的转化体。本发明的转化体生成具有呈O-Man-Gal双糖结构的O-糖苷型糖链的异源蛋白质，本发明的蛋白质的制造方法中获取所生成的该具有O-糖苷型糖链的异源蛋白质。
本发明中，“异源蛋白质”是指作为宿主的粟酒裂殖酵母本身不产生(野生型的粟酒裂殖酵母不具有编码该蛋白质的基因)的蛋白质。从工业价值高的角度来看，异源蛋白质优选人或其它哺乳动物所产生的蛋白质。“与异源蛋白质相对应的野生型蛋白质”是指产生异源蛋白质的生物(粟酒裂殖酵母以外的生物)的细胞所产生的蛋白质。本发明的转化体所生成的异源蛋白质的糖链可以与该野生型蛋白质的糖链不同。本发明的转化体所生成的异源蛋白质是具有呈O-Man-Gal双糖结构的糖链的包含O-糖苷型糖链的异源蛋白质，是实质上不具有O-Man-Gal双糖结构以外的O-糖苷型糖链的异源蛋白质。
作为异源蛋白质基因，从容易稳定地获得O-糖苷型糖链的结构被控制为O-Man-Gal(氧原子上依次结合有甘露糖、半乳糖的糖链结构)的包含O-糖苷型糖链的异源蛋白质的角度来看，优选编码野生型的蛋白质具有O-糖苷型糖链的蛋白质(糖蛋白)的基因。作为这样的异源蛋白质，可例举例如粟酒裂殖酵母不产生的壳多糖酶、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)等。
利用本发明的转化体，即使是野生型不具有O-糖苷型糖链的异源蛋白质，也可通过在N末端融合分泌信号来将所表达的异源蛋白质输送至内质网或高尔基体，因此通过氨基酸序列以及该蛋白质的二级结构和三级结构，可获得具有O-糖苷型糖链的异源蛋白质。对于野生型中的N末端不具有分泌信号的蛋白质，也可以制成具有编码合适的分泌信号的DNA序列的嵌合序列。
(宿主)
用作宿主的粟酒裂殖酵母是属于裂殖酵母属的酵母，是被认为与其它酵母相比耐酸性特别优良，细胞周期和染色体结构、RNA剪接等与动物细胞更为相似，所生成的蛋白质的翻译后修饰也与动物细胞更为接近的微生物。作为本发明的宿主的粟酒裂殖酵母是具有omh1基因缺失或失活的染色体的突变型。该突变型粟酒裂殖酵母维持着上述特征，且向该宿主中导入异源蛋白质基因而得的转化体也维持着上述特征。
omh1基因(SPBC19C7.12c，登录号：060160)是粟酒裂殖酵母中编码作为合成O-糖苷型糖链的酶(蛋白质)的后述的omh1p的基因之一，是特别在该合成中起到重要作用的酶的基因。本说明书中，登录号表示蛋白质数据库Uniprot(URL：http://www.Uniprot.org/)的登录号。
O-糖苷型糖链的合成与Saccharomycescerevisiae(酿酒酵母)同样，由PMT基因家族所表达的O-甘露糖基转移酶引发。该基因在从酵母到多细胞生物的范围内高度保守，在粟酒裂殖酵母中也是通过PMT基因家族所编码的O-甘露糖基转移酶在蛋白质中的丝氨酸残基或苏氨酸残基上添加甘露糖。
在蛋白质上添加了第一个甘露糖后，在酿酒酵母中，如上所述，由KTR基因家族和MNN1基因家族编码的α1，2-甘露糖基转移酶和α1，3-甘露糖基转移酶与糖链的延伸有关。与之相对，参与粟酒裂殖酵母中的O-糖苷型糖链延伸的酶的基因至今尚未确定。
于是，本发明人考察了粟酒裂殖酵母的染色体中与参与酿酒酵母的O-糖苷型糖链的延伸反应的KTR基因(编码α1，2-甘露糖基转移酶的基因)家族的同源性高的基因(omh基因，O-糖苷α1，2-甘露糖基转移酶同源物(O-glycosideα1，2-mannosyltransferasehomologues))。结果发现了在粟酒裂殖酵母中参与O-糖苷型糖链延伸的酶的6个基因，即：SPBC19C7.12c(omh1基因)、SPBC16H5.09c(omh2基因，登录号：042944)、SPCC777.07(omh3基因，登录号：074546)、SPBC1773.08c(omh4基因，登录号：094565)、SPBC32H8.08c(omh5基因，登录号：Q96WW1)和SPAC959.04c(omh6基因，登录号：Q9P4X2)。此外，在粟酒裂殖酵母中未发现与所述MNN1基因的同源性高的基因。
图1所示为由酿酒酵母的KTR基因家族的Kre2基因、Ktr1基因、Ktr3基因编码的蛋白质与由omh1基因～omh6基因编码的各蛋白质的氨基酸序列的比较。
相对于酿酒酵母的KTR基因家族的Kre2基因、Ktr1基因、Ktr3基因亚家族，omh1基因～omh5基因的碱基序列的同源性为33～55％。另一方面，omh6基因与omh1基因～omh5基因相比同源性低。
Kre2基因所编码的α1，2-甘露糖基转移酶(下称Kre2p)具有与公知的各种糖基转移酶所具有的DXD基序相当的EPD(Glu247-Pro248-Asp249)位点(图1)。omh1基因～omh6基因所编码的α1，2-甘露糖基转移酶(以下分别称为omh1p～omh6p)也具有与之相当的位点，虽然249位的天冬氨酸残基也可能会变成丝氨酸残基、甘氨酸残基、谷氨酸残基，但247位的谷氨酸高度保守。因此认为omh1p～omh6p通过与Kre2p同样的机制参与糖链的延伸。即，Kre2p的247位的谷氨酸通过2价阳离子的配位与给体的糖核苷酸(GDP-甘露糖)的磷酸基相互作用，220位的酪氨酸残基(图1的○记号)在所述给体的糖核苷酸与受体末端的甘露糖之间的糖转移中起到重要的作用。认为omh1p～omh6p也与Kre2p同样地通过酪氨酸残基的帮助来进行糖转移。
在Kre2p与omh1p～omh6p之间，7个半胱氨酸残基(图1的●记号)的位置也是保守的。除此之外，在很多位点氨基酸序列都高度保守(图1的反转部分)。因此认为omh1p～omh6p具有与Kre2p同样的三维结构。
此外，Kre2p中与所述给体和受体结合而成为的活性位点的氨基酸序列(YNLCHFWSNFEI，图1的下划线部分)也在omh1p～omh6p中高度保守，因此认为omh1p～omh6p通过与Kre2p同样的机制进行糖链延伸。
这些omh基因中，omh1基因是编码在O-糖苷型糖链的延伸反应中起着重要作用的酶的基因。本发明的转化体中，通过使omh1基因缺失或失活，从而不表达omh1p，可将转化体所生成的异源蛋白质上结合的O-糖苷型糖链的结构控制为O-Man-Gal。
认为其原因在于，omh1基因所编码的omh1p(α1，2-甘露糖基转移酶)参与了使第二个甘露糖与结合在蛋白质上的第一个甘露糖结合的反应。即，认为通过使omh1基因缺失或失活，可使第二个甘露糖无法与第一个甘露糖结合，因此半乳糖通过半乳糖基转移酶与第一个甘露糖结合。
omh1基因～omh6基因均非粟酒裂殖酵母生长所必需的基因，并且即使使omh1基因失活或缺失，细胞的表型也无特别变化。因此，本发明的转化体虽然使omh1基因失活或缺失，但却可稳定地制造包含O-糖苷型糖链的异源蛋白质。
粟酒裂殖酵母中，使omh1基因缺失或失活的情况下，omh1基因的功能无法通过omh2基因～omh6基因的过表达来弥补。即使破坏omh2基因～omh5基因中的任一个，也能生成与野生型相同的包含O-糖苷型糖链的蛋白质，因此认为这些基因所编码的酶均与第三个甘露糖的添加有关或者在糖链的合成中承担剩余的功能。
作为使omh1基因缺失或失活的方法，可采用公知的方法。具体而言，可通过采用拉图尔法(NucreicAcidsRes(2006)34：e11和国际公开第2007/063919号文本等中记载)来使基因缺失。也可通过采用诱变剂的突变分离法(酵母分子遗传学实验法，1996年，学会出版中心)、采用PCR(聚合酶链式反应)的随机突变法(PCR方法及应用(PCRMethodsAppl.)，1992年，第2卷，p.28-33.)等向基因的一部分中引入突变，藉此使该基因失活。
(转化体)
本发明的转化体通过向上述本发明的omh1基因缺失或失活的宿主中导入异源蛋白质基因而获得。异源蛋白质基因除了具有编码目标异源蛋白质的部分以外，也可以具有编码分泌信号的部分。该编码分泌信号的部分是编码在产生异源蛋白质的生物(粟酒裂殖酵母以外)的细胞中起作用的分泌信号的部分，在该细胞内表达了在N末端具有分泌信号的蛋白质后，分泌信号部分在细胞内被去除，然后从细胞分泌出不具有分泌信号的异源蛋白质。异源蛋白质基因具有编码分泌信号的部分的情况下，该分泌信号必须在上述本发明的宿主中也能起作用。该分泌信号在上述本发明的宿主中不起作用的情况下，较好是使用在上述宿主中起作用的分泌信号来代替该不起作用的分泌信号。
作为在上述本发明的宿主中起作用的分泌信号，较好是粟酒裂殖酵母所具有的分泌信号。通过使编码该粟酒裂殖酵母所具有的分泌信号的基因结合于异源蛋白质基因的5’末端侧，从而表达在异源蛋白质的N末端侧结合有该分泌信号的蛋白质，接着在上述本发明的宿主内去除该分泌信号。作为在粟酒裂殖酵母中起作用的分泌信号基因，较好是国际公开第96/23890号文本中记载的分泌信号基因。特别好是使用编码该文献中记载的分泌信号P3的基因。
为了转化宿主，使用包含异源蛋白质基因的表达载体。异源蛋白质基因不包含在宿主内起作用的分泌信号基因的情况下，较好是包含在宿主内起作用的分泌信号基因。异源蛋白质基因包含在宿主内不起作用的分泌信号基因的情况下，较好是使用除去了该分泌信号基因的异源蛋白质基因，并使用在宿主内起作用的分泌信号基因来代替。载体还可以包含通常在宿主内起作用的启动子，还可以包含终止子、5’-非翻译区，3’-非翻译区中的任一种以上。启动予只要是能在作为宿主的粟酒裂殖酵母中起作用而表达异源蛋白质的启动子即可。
作为本发明的启动子，可例举例如日本专利特开平5-15380号公报、日本专利特开平7-163373号公报及日本专利特开平10-234375号公报中记载的来源于动物细胞病毒的启动子，优选CMV启动子、SV40启动子。除此之外，可使用日本专利特开平11-192094号公报、国际公开第2007/26617号文本等中记载的已知是能在粟酒裂殖酵母中起作用的启动子的各种启动子。
作为使用包含异源蛋白质基因的表达载体来转化粟酒裂殖酵母的方法，已知以上述公知例为代表的各种方法，可使用该公知的方法。作为上述例子以外的具体例子，可采用例如日本专利特开2000-262284号公报、日本专利特开2003-310269号公报、日本专利特开2005-198612号公报等中记载的载体及使用该载体的转化方法。异源蛋白质基因不仅能以表达载体的形式导入宿主的染色体外而获得转化体，也能以表达盒的形式导入宿主的染色体内。表达盒具有异源蛋白质基因以及上述启动子和分泌信号等，通常使用同源重组法整合到宿主的染色体中。作为通过使用表达盒将异源蛋白质基因整合到染色体中的方法来转化粟酒裂殖酵母的方法，较好是使用上述日本专利特开2000-262284号公报中记载的方法。如果将表达盒整合到染色体中，则容易抑制在转化体的培养过程中表达盒从细胞脱落而失去生成包含O-糖苷型糖链的异源蛋白质的能力这一现象。将表达盒整合到粟酒裂殖酵母的染色体中的情况下，从包含O-糖苷型糖链的异源蛋白质的生产性提高的角度来看，所整合的表达盒较好是2个以上。
将如上所述的载体导入粟酒裂殖酵母的细胞内来进行转化。转化而得的转化体可使用所述抗生素抗性基因或营养需求性标记物来选择。
使用包含抗生素抗性基因的载体的情况下，通过使用含有该抗生素的培养基，可选择出转化体。作为抗生素抗性基因，可例举例如新霉素抗性基因。作为营养需求性标记物，可例举例如乳清苷酸脱羧酶基因(ura4基因)或异丙基苹果酸脱氢酶基因(leu1基因)。
使用营养需求性标记物的情况下，例如可以将使ura4基因缺失或失活而制成的尿嘧啶需求性粟酒裂殖酵母作为宿主，利用包含ura4基因的所述载体进行转化后，选择尿嘧啶需求性消失了的宿主，藉此获得整合有载体的转化体。
作为选择方法，可例举例如以下所示的方法。通过可利用所述营养需求性标记物选择转化体的培养基进行筛选，可从所得的克隆中选择出多个克隆。接着，将这些克隆分别进行液体培养后，考察各培养液中的异源蛋白质的表达量，选择出异源蛋白质的表达量较多的转化体。此外，通过对这些选择出的转化体进行基于脉冲场凝胶电泳法的基因组分析，可考察出整合到染色体中的表达盒的数量。
[含O-糖苷型糖链的异源蛋白质的制造方法]
本发明的包含O-糖苷型糖链的异源蛋白质的制造方法是对本发明的转化体进行培养，获取由该转化体所生成的具有O-糖苷型糖链的异源蛋白质的方法。
作为培养液，可使用公知的酵母培养用培养基，只要是含有粟酒裂殖酵母可利用的碳源、氮源、无机盐类等而能高效地进行粟酒裂殖酵母的培养的培养基即可。
作为培养液，既可以使用天然培养基，也可以使用合成培养基。
作为碳源，可例举例如葡萄糖、果糖、蔗糖等糖及淀粉等碳水化合物。其中优选葡萄糖或蔗糖。
作为氮源，可例举例如氨、硫酸铵、氯化铵、乙酸铵等无机酸的铵盐及蛋白胨、肉精、酵母提取物。其中优选硫酸铵或酵母提取物。
作为无机盐类，可例举磷酸镁、硫酸镁、氯化钠。其中优选磷酸镁。
培养液中还可以含有蛋白脂质。
培养可通过振荡培养、搅拌培养等方法进行。
培养温度较好是16～37℃，更好是25～32℃。培养时间可适当决定。
培养既可以是分批培养，也可以是连续培养。
连续培养的方法可例举例如下述方法：从培养了一定时间的培养液中获取包含O-糖苷型糖链的异源蛋白质并同时回收培养上清，向该培养上清中再次添加培养液进行培养，反复进行上述操作来连续地进行培养。通过进行连续培养，包含O-糖苷型糖链的异源蛋白质的生产性进一步提高。
可采用公知的蛋白质纯化方法从培养液中获取包含o-糖苷型糖链的异源蛋白质。
如上所述，根据本发明，通过使用以具有omh1基因缺失或失活的染色体的粟酒裂殖酵母作为宿主的转化体，可获得O-糖苷型糖链被控制为O-Man-Gal的包含O-糖苷型糖链的异源蛋白质。
实施例
下面，示出实施例来对本发明进行详细说明。但是，本发明并不受到下述记载的限定。本实施例中的转化通过乙酸锂法或电穿孔法(Electroporation)进行。
[例1]克隆及omh基因的破坏
使用ura4作为选择标记物，进行omh1基因～omh6基因的破坏。
使用表1所示的正向引物和反向引物，从野生型粟酒裂殖酵母的基因组DNA中扩增分别包含omh1基因、omh2基因、omh3基因的一部分或全部的3条DNA片段(1.3kb、1.6kb、1.25kb)，进行亚克隆。载体使用pGEM-TEasy载体和pGEM-T载体普洛麦格(Promega)。
亚克隆后，通过使用KpnI和EcoRI的限制酶处理在载体的omh1基因内进行酶切，从而在该位置插入ura4+盒(1.6kb)，藉此得到破坏了omh1基因的载体。同样地，使用限制酶EcoRV和HindIII得到破坏了omh2基因的载体，使用限制酶EcoRI和XhoI得到破坏了omb3基因的载体。
接着，使用将分别具有被破坏的omh1基因的载体制成直线状而得的DNA片段，对尿嘧啶合成能力缺损的粟酒裂殖酵母ARC039株(单倍体)进行转化，通过尿嘧啶选择培养基进行选择，藉此得到具有被破坏的omh1基因的omh1突变株。具有被破坏的omh2基因的omh2突变株和具有被破坏的omh3基因的omh3突变株也通过同样的方法构建。通过DNA印迹法和PCR来确认获得了所要的omh1突变株、omh2突变株、omh3突变株。
使用loxP盒载体(pBSloxP-ura4-loxP，BiosciBiotechnolBiochem，68，545-550(2004)中记载)进行omh4基因～omh6基因的破坏。
采用分别具有XhoI和HindIII限制酶位点的正向引物和反向引物(表1)通过PCR来扩增omh4基因的上游侧的片段，采用分别具有EcoRI和BamHI限制酶位点的正向引物和反向引物(表1)通过PCR来扩增下游侧的片段。将这些扩增片段分别用合适的限制酶进行处理后，插入到pBSloxP-ura4-loxP载体，得到omh4基因的上游侧片段和下游侧片段分别位于loxP-ura4-loxP盒的两侧的omh4基因破坏用载体。此外，使用表1所示的正向引物和反向引物，通过同样的方法得到omh5基因破坏用载体和omh6基因破坏用载体。
使用将这些载体制成直线状而得的DNA片段，对尿嘧啶合成能力缺损的粟酒裂殖酵母ARC039株(单倍体)进行转化，通过尿嘧啶选择培养基进行选择，藉此分别得到omh4突变株、omh5突变株、omh6突变株。
[表1]
[例2]细胞形态的观察
将例1中得到的omh1突变株～omh6突变株用YES培养基(5ml)分别在30℃和37℃下培养过夜后，通过装载有诺马斯基光学系统的观察装置观察它们的细胞形态。
此外，作为比较对象，对于野生型粟酒裂殖酵母也进行了与各突变株同样的培养，并观察了细胞形态。结果示于图2(a)～(g)。图2中，(a)是野生型粟酒裂殖酵母的观察结果，(b)是omh1突变株的观察结果，(c)是omh2突变株的观察结果，(d)是omh3突变株的观察结果，(e)是omh4突变株的观察结果，(f)是omh5突变株的观察结果，(g)是omh6突变株的观察结果。
如图2所示，omh1突变株～omh6突变株的所有突变株均能生长，可知omh1基因～omh6基因均非生长所必需的基因。此外，对于omh1突变株～omh5突变株，即使omh1基因～omh5基因中的某一个被破坏，细胞的表型也与野生型粟酒裂殖酵母相同。omh1突变株的表型与野生型粟酒裂殖酵母相同，这表示omh1基因所编码的omh1p与野生型粟酒裂殖酵母的正常的细胞壁的结构和功能所必需的糖链结构的形成无关。
另一方面，omh6突变株表现出与野生型不同的表型。
[例3]温度依赖性和抗生素抗性(潮霉素B)
将例2的培养后的各培养液用水稀释至OD600达到0.5(相当于细胞数107个/ml)。再稀释10倍(图3中的10-1，最左侧的一列)后，将其中的7μl划线于YES培养基(琼脂培养基)，在30℃(图3(a))和37℃(图3(c))的条件下培养3天。此外，同样地用含有20μg/ml潮霉素B(0.005质量％)的YES培养基(5ml)在30℃下分别培养过夜(图3(b))。此外，很早就可见急剧的增殖的情况下，再以10倍的比例逐级稀释，在相同的条件下进行培养。图3(a)～(c)所示为各条件下自左侧起依次将OD600为0.5的样品以10倍的比例逐级稀释(10-1、10-2、10-3、10-4)而得的样品的培养结果。
如图3所示，可知omh1突变株、omh2突变株、omh4突变株和omh5突变株受温度和潮霉素B的影响小，以与野生型粟酒裂殖酵母没有多大差别的速度生长。
另一方面，对于omh3突变株和omh6突变株，在37℃下的培养及含有潮霉素B的培养基中的培养过程中生长速度降低。
[例4]酸性磷酸酶的分析
通过分析omh1突变株～omh6突变株对酸性磷酸酶的影响来考察omh1p～omh6p对N-糖苷型糖链的延伸的影响。
将ARC039株和omh1突变株～omh6突变株分别用YES培养基(5ml)在30℃下培养至OD600达到1.5后，通过离心分离得到1.5×108个细胞，再将该细胞重悬于5ml的MMP培养基(以MethodsEnzymol，194，795-823(1991)中记载的MM培养基为基础，含有14.6mM的乙酸钠来代替磷酸氢二钠和邻苯二甲酸氢钾的培养基)，于30℃温浴3小时，藉此诱导酸性磷酸酶的生成。
接着，离心分离回收所得细胞，用Tris-HCl缓冲液(62.5mM、pH6.8)洗涤后，悬浮于冰冷的200μl的溶菌液(62.5mMTris-HCl、pH6.8，1mMEDTA，2mM苯甲基磺酰氟，0.1mM二硫苏糖醇，10％(v/v)甘油)，得到悬浮液。
然后，使用研磨珠均质器(MiniBeadBeater-8，生物制品公司(バイオスペツク·プロダクツ社)制)，用直径0.5mm的玻璃珠对所述悬浮液进行5次搅拌(4℃、30秒钟)，得到细胞裂解物。将细胞裂解物在6％(w/v)聚丙烯酰胺凝胶(非变性)中电泳，进行活性染色(Yeast，18，903-904(2001)中记载的方法)。结果示于图4。泳道1是野生型粟酒裂殖酵母的电泳结果，泳道2是omh1突变株的电泳结果，泳道3是omh2突变株的电泳结果，泳道4是omh3突变株的电泳结果，泳道5是omh4突变株的电泳结果，泳道6是omh5突变株的电泳结果，泳道7是omh6突变株的电泳结果。
如图4所示，电泳中酸性磷酸酶的迁移率在omh1突变株～omh6突变株和野生型粟酒裂殖酵母之间没有变化，是同等的。由该结果可知，omh1p～omh6p不参与N-糖苷型糖链的延伸。
<异源表达的出芽酵母壳多糖酶(分泌蛋白质)的糖链结构分析(1)>
[例5]
使用具有酿酒酵母的壳多糖酶(Cts1)基因(在5’末端侧含有酿酒酵母的分泌信号基因)和粟酒裂殖酵母的nmt1启动子的载体pREP41-ScCTS1(参照文献：N.Tanaka等，BiochemBiophysResCommun(2005)330：813-820.)对omh1突变株进行转化(参照文献：T.Morita和K.Takegawa，Yeast(2004)21：613-617.和日本专利特开2005-198612号公报)。接着，用不含亮氨酸的MM培养基(5ml)培养至稳定期，转移至10ml的壳多糖酶表达培养基(以MM培养基为基础，含有0.1％(w/v)葡萄糖和2％(w/v)果糖来代替2％(w/v)葡萄糖)中，于30℃温浴3小时。然后，从培养基的上清中回收壳多糖酶，通过使用6％(w/v)聚丙烯酰胺凝胶的SDS(十二烷基硫酸钠(Sodiumdodecylsulfate))-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳(Poly-AcrylamideGelElectrophoresis))来分析O-糖苷型糖链的延伸。
如下所示进行从培养基中的壳多糖酶的回收。向培养基中添加壳多糖珠(chitinbeads)(20mg，西格玛公司(シグマ))后，于4℃搅拌12小时，离心而制成颗粒。将该颗粒用钠缓冲液(50mMTris-HCl、pH7.5，150mMNaCl)洗涤3次，在SDS样品缓冲液(50μl)中沸腾5分钟，藉此提取壳多糖酶。凝胶的染色用考马斯亮蓝R-250(CoomassieBrilliantBlueR-250)进行。
[例6～12]
对于野生型粟酒裂殖酵母(例6)和omh2突变株～omh6(例7～11)突变株，通过与例5同样的方法进行壳多糖酶的分析。此外，将酿酒酵母(例12)用YPD培养基(10ml)在30℃下培养，与例5同样地通过使用6％(w/v)聚丙烯酰胺凝胶的SDS-PAGE分离壳多糖酶。结果示于图5。泳道1是酿酒酵母的电泳结果，泳道2是野生型粟酒裂殖酵母的电泳结果，泳道3是omh1突变株的电泳结果，泳道4是omh2突变株的电泳结果，泳道5是omh3突变株的电泳结果，泳道6是omh4突变株的电泳结果，泳道7是omh5突变株的电泳结果，泳道8是omh6突变株的电泳结果。壳多糖酶的分子量用83kDa和175kDa的标记物来确定。
如图5所示，野生型粟酒裂殖酵母(例6，泳道2)和酿酒酵母(例12，泳道1)中的壳多糖酶具有大致同等的迁移率(相当于分子量约130kDa)。此外，omh2突变株～omh6突变株(例7～例11，泳道4～8)中的壳多糖酶的迁移率也未受影响，与酿酒酵母的壳多糖酶的迁移率大致同等。与之相对，omh1突变株(例5，泳道3)中，壳多糖酶的分子量约为100kDa，O-糖苷型糖链的延伸明显受阻。由该结果可以确认，omh1基因与O-糖苷型糖链的延伸显著相关。
接着，为了获得与O-糖苷型糖链的结构相关的更多的信息，将由野生型粟酒裂殖酵母和omh1突变株～omh6突变株得到的糖蛋白(包含O-糖苷型糖链的异源蛋白质)的糖链肼解，将其氨基吡啶(PA)化后通过HPLC(高效液相色谱法(Highperformanceliquidchromatography))进行分析。
[例13]
用YES培养基将omh1突变株在30℃下培养至稳定期，从中提取细胞表面的半乳甘露聚糖，得到冷冻干燥状态的半乳甘露聚糖(MethodsEnzymol，185，440-470(1990)中记载的方法)。接着，将2mg冷冻干燥状态的半乳甘露聚糖与0.2ml的无水肼一起于60℃加热6小时，使肼蒸发，通过阳离子交换树脂(Dowex50W-x2(H+))来除去钠离子。接着，将所得样品与氨基吡啶化剂(20μl)一起于90℃加热60分钟，添加还原剂(20μl)，于80℃加热35分钟，藉此在糖链的还原末端添加2-氨基吡啶。通过苯酚/氯仿(体积比为50/50)萃取除去过量的氨基吡啶化剂和还原剂。
接着，对所得样品进行正相HPLC分析(柱：AsahipakNH2P-50柱(4.6mm×50mm)，昭和电工株式会社(昭和電工社)制)。糖链的分子大小通过PA(氨基吡啶)标记的标准标记物、即PA化甘露糖、PA化麦芽糖、PA化异麦芽低聚糖(宝生物株式会社(タカラバイオ社)制)确定。
[例14～19]
对于野生型粟酒裂殖酵母(例14)和omh2突变株～omh6(例15～19)突变株，与例13同样地进行糖链的正相HPLC分析。此外，例14中，回收所检出的5个主峰，用刀豆α-甘露糖苷酶和咖啡豆α-半乳糖苷酶处理后，考察这些峰有何种变化，确认分别与这5个峰对应的糖链结构。
例13～19的正相HPLC分析的结果示于图6。图6中，(a)是野生型粟酒裂殖酵母的正相HPLC分析结果，(b)是omh1突变株的正相HPLC分析结果，(c)是omh2突变株的正相HPLC分析结果，(d)是omh3突变株的正相HPLC分析结果，(e)是omh4突变株的正相HPLC分析结果，(f)是omh5突变株的正相HPLC分析结果，(g)是omh6突变株的正相HPLC分析结果。
如图6(a)所示，在野生型粟酒裂殖酵母中确认有5个主峰(2G、2M、3G、3M、4i)。峰2G是Gal-Man-PA，峰2M是Man-Man-PA，峰3G是Gal-Man-Man-PA，峰3M是Man-Man-Man-PA。此外，峰4i是具有4个糖的糖链的混合物。
omh2突变株～omh6突变株(图6(c)～(g))中的糖链与野生型粟酒裂殖酵母中的糖链(图6(a))大致相同，无变化。
与之相对，omh1突变株中，具有3个以上的糖的糖链的量变得极少，几乎全都是峰2G(图6(b))。此外，将omh1突变株中得到的峰2G用刀豆α-甘露糖苷酶和咖啡豆α-半乳糖苷酶处理，结果在α-甘露糖苷酶处理中未被分解，而是被α-半乳糖苷酶分解，全都是Man-PA(相当于图6(a)的峰M1)。
由这些结果可知，omh1突变株中，第二个甘露糖通过α1，2键与第一个甘露糖结合的过程被抑制，这就表示omh1基因在O-糖苷型糖链的延伸中起到重要的作用。
[例20]
从野生型粟酒裂殖酵母的基因组DNA中通过PCR扩增omh1基因，引入限制酶BglII和NotI的酶切位点，用这些限制酶处理后插入到载体pREP41-GFP(由pREP41得到的载体pTN197，MolBiolCell，12，3955-3972(2001)中记载)的对应的位点来进行克隆，藉此得到载体pREP41-omh1-GFP，该载体包含表达在C末端结合有GFP(绿色荧光蛋白)的omh1p的基因。此外，通过Yeast，18，745-757(2001)中记载的方法得到载体pAU-Gms1-RFP，该载体包含表达结合有RFP(红色荧光蛋白)的Gms1p(由Gms1基因编码的UDP半乳糖转运蛋白)的基因。
用pREP41-GFP或pREP41-omh1-GFP转化omh1突变株，将所得转化体用不含亮氨酸的MM培养基在30℃下培养至稳定期。通过与例13同样的方法对其进行正相HPLC分析，结果示于图7(a)(pREP41-GFP)和(b)(pREP41-omh1-GFP)。
此外，用pREP41-omh1-GFP或pAU-Gms1-RFP转化omh1突变株，将所得转化体用不含尿嘧啶和亮氨酸的MM培养基在30℃下培养。然后观察所回收的细胞(OD600＝0.5)。其结果示于图8(a)～(c)。图8(a)是通过装载有诺马斯基光学系统的观察装置观察到的图，图8(b)是通过荧光显微镜观察pREP41-GFP而得的图，图8(c)是观察pAU-Gms1-RFP而得的图。
如图7(a)所示，在包含pREP41-GFP的omh1突变株中，确认到的峰与例13相同，几乎未合成具有3个以上的糖的糖链。另一方面，如图7(b)所示，在包含pREP41-omh1-GFP的omh1突变株中，确认到与例14的野生型粟酒裂殖酵母同样的5个主峰。这是因为通过由导入的载体表达omh1p，第一个甘露糖上能结合第二个甘露糖。
此外，如图8(a)～(c)所示，omh1p-GFP(结合有GFP的omh1p)集中存在于和Gms1p-RFP(结合有RFP的Gms1p)相同的位置。Gms1p是转运糖链合成所需的半乳糖的蛋白质，由该结果也可确认，omh1基因参与O-糖苷型糖链的合成。
<异源表达的出芽酵母壳多糖酶的糖链结构分析(2)>
[例21]
使用包含酿酒酵母的壳多糖酶(Cts1)基因以及编码粟酒裂殖酵母的转化酶启动子和信号肽的DNA序列的载体pFM1-1-SeCts1来转化粟酒裂殖酵母的野生株，用100ml不含亮氨酸的MM培养基(其中含有8％(w/v)葡萄糖来代替2％(w/v)葡萄糖)培养至稳定期，将其转移至100ml的壳多糖酶表达培养基(以MM培养基为基础，含有0.05％(w/v)葡萄糖和3％(v/v)甘油来代替2％(w/v)葡萄糖)中，于30℃振荡培养12小时。然后，从培养基的上清中回收壳多糖酶，通过使用6％(w/v)聚丙烯酰胺凝胶的SDS-PAGE来确认壳多糖酶的纯化度。如下所示进行从培养基中的壳多糖酶的回收。向培养基中添加壳多糖(400mg，和光纯药株式会社(和光純薬社)制)后，于4℃搅拌12小时，离心而制成颗粒。将该颗粒用钠缓冲液(50mMTris-HCl、pH7.5，150mMNaCl)洗涤3次，在SDS样品缓冲液(63mMTris盐酸(pH6.8)、10％(v/v)甘油、2％(w/v)SDS、0.002％(w/v)BPB，1ml)中沸腾5分钟，藉此提取壳多糖酶。凝胶的染色用考马斯亮蓝R-250(CoomassieBrilliantBlueR-250)进行。
[例22]
对于omh1突变株，通过与例21同样的方法进行壳多糖酶的分析。
例21和22的结果示于图9。泳道1所示为野生株粟酒裂殖酵母的结果，泳道2所示为omh1突变株的结果。
如图9所示，泳道1和泳道2中检出了单一条带，可确认从粟酒裂殖酵母野生株和omh1突变株回收的壳多糖酶均已纯化成单一蛋白质。此外，与例6(图5，泳道2)同样地在omh1突变株中观察到了分子量的减小。
接着，为了获得与O-糖苷型糖链的结构相关的更多的信息，将从粟酒裂殖酵母野生株和omh1突变株中纯化的壳多糖酶(包含O-糖苷型糖链的异源蛋白质)的糖链肼解而使其游离，将还原末端氨基吡啶(PA)化后通过HPLC进行分析。
[例23]
为了从例21中由壳多糖提取出的壳多糖酶中除去SDS而相对于MilliQ水(超纯水)进行了透析后，进行冷冻干燥。由粟酒裂殖酵母野生株得到1mg冷冻干燥粉末。
接着，使用HydraclubC-206(日本油脂磨坊株式会社(Jオイルミルズ社)制)对0.3mg的壳多糖酶冷冻干燥粉末进行肼解。接着，将所得的游离糖链样品与氨基吡啶化剂(20μl)一起于90℃加热60分钟，然后添加还原剂(20μl)，于80℃加热35分钟，藉此在糖链的还原末端添加2-氨基吡啶。通过苯酚/氯仿(体积比为50/50)萃取除去过量的氨基吡啶化剂和还原剂。
接着，对所得样品进行正相HPLC分析(柱：Amide-80柱(4.6mm×75mm)，东曹株式会社(東ソ一社)制)。糖链的分子大小通过PA标记的标准标记物、即PA化甘露糖、PA化麦芽糖、PA化异麦芽低聚糖(宝生物株式会社制)确定。
[例24]
为了从例22中由壳多糖提取出的壳多糖酶中除去SDS而相对于MilliQ水进行了透析后，进行冷冻干燥。由omh1突变株得到0.5mg冷冻干燥粉末。然后与例23同样地进行正相HPLC分析。
例23和24的正相HPLC分析的结果示于图10。图10中，(a)表示粟酒裂殖酵母野生株的结果，(b)表示omh1突变株的结果。
如图10(a)所示，粟酒裂殖酵母野生株中，主要确认到与双糖(图10的(Hex)2-PA)和四糖(图10的(Hex)4-PA)对应的峰。与之相对，如图10(b)所示，omh1突变株中，几乎仅确认到与双糖对应的峰。
[例25]
为了对粟酒裂殖酵母野生株(例23)和omh1突变株(例24)中确认到的双糖的峰的结构进行详细分析，将双糖的峰分离纯化，进行反相HPLC分析(柱：ODS-80Ts柱(4.6mm×150mm)，东曹株式会社制)。此外，对分离纯化后的双糖进行了α-半乳糖苷酶(西格玛公司制G8507，来源于咖啡豆)消化和α-甘露糖苷酶(西格玛公司制M7257，来源于刀豆)消化后，同样地进行反相HPLC分析。
反相HPLC分析的结果示于图11。图11(a)和(e)表示作为标准糖链的Man-PA和Man-Man-PA(Manα1-2Man-PA)的保留时间。此外，图11(b)～(d)表示粟酒裂殖酵母野生株的分析结果，图11(f)～(h)表示omh1突变株的分析结果，图11(b)和(f)是分离纯化后的分析结果，图11(c)和(g)是α-半乳糖苷酶消化后的分析结果，图11(d)和(f)是α-甘露糖苷酶消化后的分析结果。
如图11(b)和(f)所示，可确认S粟酒裂殖酵母野生株和omh1突变株的双糖主要由单一峰构成，并确认与Manα1-2Man-PA标准糖链的保留时间不同。此外，两株的双糖样品在α-甘露糖苷酶处理中未被分解(图11的(d)和(h))，而被α-半乳糖苷酶分解，全都是Man-PA(图11(c)和(g))。
如这些结果所示，粟酒裂殖酵母野生株中表达的壳多糖酶的双糖主要由O-Man-Gal构成，omh1突变株中表达的壳多糖酶的所有糖链均由O-Man-Gal构成，即使在表达异源蛋白质时，其糖链结构也由与细胞表面的半乳甘露聚糖同样的糖链结构构成。
产业上利用的可能性
本发明的转化体可制造对所结合的O-糖苷型糖链的结构进行了控制的异源蛋白质。因此，使用该转化体的包含O-糖苷型糖链的异源蛋白质的制造方法适合用于医疗领域等。
另外，在这里引用2008年10月1日提出申请的日本专利申请2008-256354号及2009年5月15日提出申请的日本专利申请2009-119280号的说明书、权利要求书、附图以及摘要的全部内容作为本发明的说明书的揭示。

Claims (6)

1.一种粟酒裂殖酵母转化体，其特征在于，以具有图1表示的SpOmh1p的蛋白质的氨基酸序列的omh1基因缺失或失活的粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)作为宿主，包含编码异源蛋白质的基因，与所述异源蛋白质相对应的野生型蛋白质是具有O-糖苷型糖链的蛋白质。
2.如权利要求1所述的粟酒裂殖酵母转化体，其特征在于，还包含编码在所述粟酒裂殖酵母中起作用的分泌信号的基因，该基因结合于编码所述异源蛋白质的基因的5’末端。
3.一种粟酒裂殖酵母转化体的制造方法，其特征在于，以具有图1表示的SpOmh1p的蛋白质的氨基酸序列的omh1基因缺失或失活的粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)作为宿主，将编码异源蛋白质的基因整合到所述宿主中，与所述异源蛋白质相对应的野生型蛋白质是具有O-糖苷型糖链的异源蛋白质。
4.如权利要求3所述的粟酒裂殖酵母转化体的制造方法，其特征在于，在编码所述异源蛋白质的基因的5’末端侧具有编码在粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)中起作用的分泌信号的基因。
5.一种包含O-糖苷型糖链的异源蛋白质的制造方法，其特征在于，对权利要求1或2所述的粟酒裂殖酵母转化体进行培养，获取所生成的具有呈O-Man-Gal双糖结构的O-糖苷型糖链的异源蛋白质。
6.如权利要求5所述的包含O-糖苷型糖链的异源蛋白质的制造方法，其特征在于，从培养粟酒裂殖酵母转化体的培养液中获取具有O-糖苷型糖链的异源蛋白质。
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