JP6647653B2 - 変異型糸状菌及び当該変異型糸状菌を用いた物質生産方法 - Google Patents
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Description
本発明において、「α−1,3−グルカンを発現しない変異型の糸状菌」とは、糸状菌の変異株であって、α−1,3−グルカンを全く発現しないものだけでなく、α−1,3−グルカンを実質的に発現しないものも包含する。より具体的には、α−1,3−グルカンを実質的に発現しない変異株とは、ごくわずかにα−1,3−グルカンを発現するにとどまり、本発明の効果である菌体の凝集が有意に抑制されている変異株を示し、例えば、α−1,3−グルカンの発現量が野生株の30%以下、より好ましくは野生株の10%以下である株等が挙げられる。また、本発明における糸状菌変異株には、元々α−1,3−グルカンを発現しない糸状菌であって、GAG生合成クラスターの機能を欠損させた変異株も含まれる。
変異型糸状菌としては、これらのα−1,3−グルカン合成酵素遺伝子の1つ又は2つ以上を欠損しているものが挙げられ、3つ全てを欠損しているものが好ましい。
本発明は、
前述した糸状菌変異株を培養して、当該糸状菌に物質を生成させる工程、及び
得られた物質を回収する工程
を含む、物質生産方法。
を提供する。
本発明の方法は、α−1,3−グルカンを発現しない変異型の糸状菌を培養して、当該糸状菌に物質を生成させる工程を含む。当該工程で用いる培地としては、特に限定されず、糸状菌の培養に用いることができるものを広く使用することができる。例えば、CD最少培地、YPD培地、TSB培地、モルト培地、PDA培地等が挙げられる。上記培地には、炭素源として、グルコース、でんぷん、可溶性でんぷん等を添加してもよい。かかる炭素源の添加量としては特に限定されないが、例えば、0.5〜10%、より好ましくは1〜4%の範囲で適宜設定できる。培養温度は特に限定されず、20〜45℃、より好ましくは25〜37℃の範囲で適宜設定できる。培養時間も特に限定されないが、例えば、12〜72時間、より好ましくは24〜48時間の範囲で適宜設定できる。また、前述したように、本発明にかかる糸状菌変異株には、α−1,3−グルカン及び/又はGAGが一定の条件下でのみ発現されるように設計された、コンディショナルな遺伝子欠損を有するものも包含される。従って、本発明の方法には、上記コンディショナルな遺伝子欠損のされた変異株を、α−1,3−グルカン及びGAGが発現しない(又は発現が抑制される)条件下で培養する工程を含む方法も含まれる。
培養培地からの有用物質の回収方法としては、特に限定されず、自体公知の方法(遠心分離、再結晶、蒸留法、溶媒抽出法、クロマトグラフィー等)を適宜用いることができる。本発明の方法は、有用物質の回収方法である。従って、糸状菌自体等の研究のために、その菌体の構成成分を分析する目的で糸状菌変異体の構成成分を分解、検出する方法は、本発明の方法とは本質的に異なる。
材料と方法
菌株
本研究では、糸状菌 A. oryzae の野生株としてNS4株(遺伝子型;niaD−,sC−)の改変株を用いた。本研究で用いたNS4改変株は、高確率に目的部位へ遺伝子導入が可能なligDΔ::sCの変異およびアデニン栄養要求性をもつadeAΔ::ptrAの変異を導入した株(ligDΔ::sC,adeAΔ::ptrA)である。また、3種のα−1,3−グルカン合成酵素遺伝子欠損株(agsAΔagsBΔagsCΔ)をAG欠損株として使用した。その他、作製した遺伝子変異株とその遺伝子型は表1に示した通りである。
本研究では、A. oryzaeの選択最少培地としてCzapek−Dox(CD)培地を使用した。また、富栄養培地としてYPD培地を用いた。ここでCD培地について、niaD−の株を培養する際に窒素源として硝酸ナトリウムの代わりに70mMのグルタミン酸ナトリウムを添加したものを用いた (今後、これをCDE培地と呼ぶ)。また、adeA−の株を培養する際、終濃度0.01%となるようにアデニン硫酸塩を添加した(今後、これをCDEA培地と呼ぶ)。培地、培養液の組成は表2に示した通りである。培地を寒天平板培地として用いる場合、終濃度1.5%(w/v)となるように寒天を培地に加えた。
本研究では特に記載のない限り、A. oryzaeの培養は30℃で行った。寒天平板培養時にはプレートを静置し、液体培養時には120rpmでロータリー振盪培養を行った。
A. oryzae は、変異株の種類により、それぞれの栄養要求性を満たすCD培地の寒天平板培地に分生子を植菌し、分生子が十分に形成されるまで30℃で約7日間培養した。さらに、Malt培地に植え継ぎ、分生子が十分に形成されるまで30℃で約4日間培養した。プレート1枚あたり10mLの滅菌済み分生子懸濁溶液(150mM NaCl, 0.1% Tween20, 10mM Phosphate buffer(pH 7.2)) を寒天平板培地上に注ぎ、コンラージ棒で分生子を掻き取り懸濁した。この懸濁液中に混入する菌糸を取り除く目的で、滅菌済みセルストレイナー(穴径70μm)または、滅菌済みミラクロス(Calbiochem社)を用いてろ過し、分生子のみを50mL容または15mL容ファルコンチューブに回収し、分生子懸濁液とした。分生子の数はトーマの血球計算盤を用いて計測した。
A. oryzaeのuge3とsph3遺伝子は隣接しているため、両遺伝子を一度に破壊する破壊カセットを作製した。まず、uge3下流(5’側)領域(amplicon 1)およびsph3の下流(3’側)領域(amplicon 2)をA. oryzaeのゲノムDNAを鋳型にPCRで増幅した。また、AnadeA遺伝子(amplicon 3)をプラスミドTOPO−2.1−adeAからPCRで増幅した(1st round of PCR)。Amplicon 1にはプライマーSph3+Uge3−LUとSph3+Uge3−LL+Adeを、amplicon 2にはプライマーSph3+Uge3−RU+AdeとSph3+Uge3−RLを、amplicon 3にはプライマーSph3+Uge3−AUとSph3+Uge3−ALをそれぞれPCR増幅に用いた(表3)。プライマーSph3+Uge3−LL+AdeとSph3+Uge3−AU,Sph3+Uge3−RU+AdeとSph3+Uge3−ALの5’側には、fusion PCRによる連結のため、相補鎖との相同配列を含んでいる。PCR産物はゲル抽出を行い、プライマーSph3+Uge3−LUとSph3+Uge3−RLを用いてPCRを行い、これら3断片を連結させた(2nd round of PCR)。PCR産物のメインバンドをゲル抽出し、uge3,sph3遺伝子破壊カセットとした。
A. oryzae の形質転換はプロトプラスト・PEG法を用いて行った(非特許文献8)。宿主株には、野生株およびAG欠損株(agsAΔagsBΔagsCΔ)を用いた。宿主株の分生子2×108個を500mL容三角フラスコ中の200mLのYPD液体培地に接種し、30℃、20時間回転振盪培養した菌体を、滅菌したミラクロス (Calbiochem社) でろ過、集菌した。菌体を蒸留水で洗浄し、滅菌したスパーテルで菌体をプレスし脱水した。集めた菌体を50mL容ファルコンチューブに入れ、穴径0.20μmのフィルターDISMIC−25CS(ADVANTEC社)でろ過したプロトプラスト化溶液[10mg/mL Lysing Enzymes(Sigma社)、5mg/mL Cellulase Onozuka(Yakult Pharmaceutical Ind. Co., Ltd)、2.5mg/mL Yatalase(TaKaRa)、Lysing enzyme buffer(表4)]25mLを加えて懸濁した。30℃、83rpmで3時間振盪し、細胞壁を消化することでプロトプラストを調製した。反応後、滅菌したミラクロスで未消化の菌体をろ過し、ろ液を4℃、2,000×g、5分間遠心分離しプロトプラストを回収した。回収したプロトプラストを0.8M NaClで洗浄し、4℃、2,000×gで5分間遠心分離しプロトプラストを沈殿させ回収した。プロトプラストが2×108個/mLとなるようにSol.I(表4)を加え、懸濁した後、1/5量のSol.II(表4)を加え、よく混合した。240μLのプロトプラスト液を15mL容ファルコンチューブに分注し、DNA溶液を適量(1〜10μg程度)加えてよく混合し、氷中で25分間放置した。次に、1mLのSol.II (表4)を加え、よく混合した後、室温で20分間放置した。10mLのSol.Iを加え、よく混合した後、室温、2,000×gで5分間遠心し、上清を取り除き、300μL のSol.Iを加えた。プロトプラストを均一に懸濁し、0.8M NaClを含むCD選択培地(表2)に撒いた後、55℃に温めておいた同じ組成の軟寒天培地[0.6%(w/v)Agar]5mLを周りから注ぎ、プロトプラストを手早く均一に懸濁するように重層した。その後、30℃でコロニーを形成するまで培養した。
得られた形質転換候補株のゲノムDNAに対して、目的とする形質転換が行われたかを確認するため、簡易的に菌株の分生子からゲノムDNAを抽出し、設計したプライマーを用いたPCRにより形質転換株を選抜した。1.5mLエッペンドルフチューブに500 μLのYPD液体培地を取り、滅菌済みの爪楊枝にて形質転換候補株の分生子をつつき植菌し、30℃で菌体が生育するまで培養した。遠心後に培地を除去し、菌体と等量のガラスビーズ、150μLのNuclei Lysis Sol.(Promega)を加え、Micro SmashTM MS−100R(TOMY社)2分間4,500rpmで菌体を粉砕した。65℃で15分間放置し、100μLのProtein Prep. Sol.(Promega)を加えよく混合した。室温で5分間放置し、4℃、15,000rpmで5分間遠心後、上清を別の1.5mLチューブに移し、1/10量の3M酢酸ナトリウムと2.5倍量のエタノールを加え混合した。4℃、15,000rpmで20分間遠心後、1mLの70% エタノールで洗浄し、ペレットを50μLのRNase入りTEに溶解した。この溶液をゲノムDNA溶液とし、PCRのテンプレートとして用いるまで4℃で保存した。
目的の形質転換候補株を最小栄養寒天平板培地上で生育させ、回収した分生子懸濁液を予めオートクレーブ処理により滅菌した単核化フィルター(ISOPORE TM MEMBRANE FILTERS, 5.0 μm TMTP, Millipore)を通すことで単核分生子を回収した。単核化処理した分生子懸濁液は適宜希釈し、最小栄養寒天平板培地上で生育させた。得られた候補株を再度 PCR により確認し、目的とする形質転換株の純化を行った。
野生株、AG欠損株、AG−GAG欠損株を用いて、YPD培地による液体振盪培養を 24時間行った。温度は30℃、回転数は120rpm、培地スケールは50mL/200mL三角フラスコ(バッフル無し)とし、分生子を1×105個/mL接種した。
作製したcutL1高発現型AG−GAG欠損株について、cutL1高発現プラスミドの導入を確認するため、PBSA分解能試験を行った。試験には1%のPBSAを含む CDE(2%Maltose)培地を用いた。培地の中心に分生子を植菌し、30℃、4日間静置培養を行い、形成されるハローの観察を行った。コントロールとして、cutL1高発現型野生株とcutL1非高発現型AG−GAG欠損株を用いた。
培養上清100μL中のタンパク質をTCA沈殿により精製し、適宜希釈しSDS−PAGEに供した(バッファー組成は表5に示す通り)。スタンダードとして、BCA法により定量した0.4〜2μgの精製α−アミラーゼ(A. oryzae 由来、Sigma−Aldrich)または0.2〜1ngの精製CutL1を用いた。SDS−PAGEで検出されたゲルの画像をImageJに取り込み、目的のバンドをピクセル数値化した。スタンダードから検量線を作成し、内在性アミラーゼまたはCutL1分泌量の定量を行った。
cutL1高発現型の野生株、AG欠損株、AG−GAG欠損株を用いて、YPM培地(表2)による液体振盪培養を24時間行った。温度は30℃、回転数は100rpm、培地スケールは50mL/200mL三角フラスコとし、分生子を1×104個/mL 接種した。
A. oryzaeにおけるGAG生合成遺伝子クラスターの推定
A. fumigatusにおいてGAGの生合成を担うとされた5つの遺伝子クラスター配列を元にA. oryzaeにも同遺伝子クラスターが存在するか否かをデータベース(AspGD)で検索した。その結果、A. oryzaeにもクラスター遺伝子配列が存在しており、gtb3 (AOR_1_2580174), agd3(AOR_1_2582174), ega3(AOR_1_2584174), sph3(AOR_1_2586174), uge3(AOR_1_2588174) のORFがA. oryzaeにおけるGAG生合成遺伝子であることが示唆された(図1A)。
野生株およびAG欠損株を親株として、プロトプラスト・PEG法により、uge3,sph3遺伝子破壊カセットをゲノム中に導入した。形質転換体の選抜はadeA無添加のCDE寒天平板培地で行った。得られた形質転換体は、核純化を行い、プライマーSph3+Uge3−LUとSph3+Uge3−RLを用いてPCR増幅による確認を行った。
GAG単独欠損株は、野生株と比較して大きな菌糸塊を形成した。また、野生株とAG 欠損株では菌糸が凝集し、菌糸塊を形成しているのに対し、AG−GAG欠損株は菌糸の凝集が見られず、液体培地中で菌糸が完全に分散している様子が観察された。これまでに A. oryzaeにおいて、このように完全分散する培養性状を示す変異株は確認されていない。また、寒天平板培地上ではAG−GAG欠損株は野生株と同等の生育を示した。
AG−GAG欠損株を宿主株として、cutL1高発現用プラスミドpNGA−gla−cut(Takahashi et al., 2005)の形質転換を行った。cutL1高発現株の選抜には 0.8M NaClを含むCD培地を用い、硝酸独立栄養性を示す形質転換候補株を取得した。得られた形質転換体は核純化を行い、プライマーniaD−tail−FwとcutL1−RT−Fを用いてPCR増幅による確認を行った。
YPM培地で培養を行った結果、培養24時間目における乾燥菌体重は野生株、AG欠損株、AG−GAG欠損株の順に増加していた。特にAG−GAG欠損株の乾燥菌体重は野生株の約10倍となり有意に増加していた(図5A)。また、CutL1生産量についても野生株、AG欠損株、AG−GAG欠損株の順に増加しており、AG欠損株は野生株の約2.5倍、AG−GAG欠損株は野生株の約5倍でありそれぞれ有意に増加していた(図5B)。この結果から完全分散性を示すAG−GAG欠損株は高密度培養における物質高生産に好適な性質を持つことが示唆された。
コンゴレッド(CR)を0,10,20,40,80,120μg/mL含むCD寒天培地の中央に5x103/μLに調製したWT株、AGΔ株又はAG−GAGΔ株の分生子懸濁液を2μLスポットし(計1x104個/プレート)、3日間30℃でインキュベートした。3日後のコロニー直径を計測し、CR無添加の際のコロニー直径を基準として、CR含有培地の生育率を算出した(図88)。その結果、AG−GAGΔ株は全ての濃度において野生株、AGΔ株より生育率が低下した。このことから、AGだけでなくGAGもCR感受性に関与していることが示唆された。
麹菌の野生(WT)株、AGΔ株、AG−GAGΔ株及びGAGΔ株の細胞壁成分は、熱水アルカリ抽出法を用いて菌体の多糖成分を分画し、各画分の硫酸加水分解物に含まれる単糖成分を定量することにより解析した。まず、各株の分生子を終濃度1.0x105/mLとなるように200mLのYPD培地(2%peptone,1% yeast extract,2% glucose)に接種し、30℃,120rpm,24時間振盪培養した。培養後の培養液はミラクロスでろ過した。得られた菌体は水で洗浄した。菌体は凍結乾燥後、ミキサーミルで粉砕した。次に、各株の乾燥菌体粉末1gをYoshimiら(Yoshimi et al., PLoS ONE,2013)の方法に従って熱水可溶(HW)画分、アルカリ可溶・水可溶(AS1)画分、アルカリ可溶(AS2)画分およびアルカリ不溶(AI)画分に分画した(表6)。
また、各株のHW画分50μgを上述と同様の方法で硫酸加水分解および単糖成分の分析を行った。その結果、野生株およびAGΔ株ではガラクトサミンが生育菌体1g当たりそれぞれ0.25mgおよび0.60mg含まれていたのに対し、AG−GAGΔ株では全く検出されなかった(図90)。これまでの研究でAspergillus属糸状菌の細胞壁にはGAG以外にガラクトサミンを含む多糖は報告されていない。このことから、AG−GAGΔ株の細胞壁にはGAGが含まれていないことが明らかとなった。
トウモロコシごま葉枯病菌におけるGAG破壊株の造成と培養性状
トウモロコシごま葉枯病菌(Cochliobolus heterostrophus, anamorph: Bipolaris maydis)は、ゲノム中にガラクトサミノガラクタン生合成遺伝子クラスターと相同な遺伝子クラスターを持つ(配列情報、Figure 1A)。本クラスターには5つの遺伝子が含まれるが、これらのうちsph3とuge3に対応する領域をハイグロマイシン耐性遺伝子で置換するコンストラクトを作製した(図91A)。まず、トウモロコシごま葉枯病菌の野生株HITO7711株を完全培地(CM:1.5g Ca(NO3)2・4H2O,0.5g MgSO4・7H2O,0.5g KCl,0.4g KH2PO4,30mg K2HPO4,10g glucose,1.0g tryptone,and1.0g yeast extract per liter)で25℃において36時間震とう培養(120rpm)し、ミラクロスでろ過することによって菌体を回収した。次に、プロトプラスト化液(Lysing Enzyme 50mg/mL,Cellulase onozuka5mg/mL,Yatalase2.5mg/mL in 10mM Na Phosphate buffer pH6.0)で菌体を処理し、プロトプラストを作製した。作製したプロトプラストを用いて、Yoshimi et al.らの方法(Yoshimi et al.,2004,Mol.Gen.Genomics 271:228−236)に従ってプロトプラストPEG法により形質転換を行った。得られた1株の遺伝子破壊候補株からゲノムDNAを抽出し、PCRにより遺伝子破壊の確認を行った。その結果、遺伝子破壊が成功した際にのみ増幅する約3.5kbと5.5kbのバンドが認められたことから(図91B)、この株は設計どおりsph3とuge3に対応する領域が欠失しているGAG破壊株であることが確認された。
次に、得られたGAG破壊株を炭素源がマルトースのYPM培地(Peptone 2%,Yeast extract1%,Maltose2%)で震とう培養し(25℃,120rpm,72 hour)、培養性状を観察した。その結果、野生株が菌糸の塊を形成しながら生育するのに対し(図92A)、GAG破壊株の菌糸は分散する傾向を示した(図92B)。この特性はA.oryzaeのAG−GAG欠損株に類似していることから、C.heterostrophusにおいてもGAG欠損により高密度培養に適する培養特性となることが示唆された。
灰色カビ病菌におけるAG−GAG破壊株の造成と培養性状
灰色カビ病菌(Botryotinia fuckeliana, anamorph: Botrytis cinerea)は、ゲノム中にガラクトサミノガラクタン生合成遺伝子クラスターと相同な遺伝子クラスターを持つ(配列情報、図93A)。本クラスターには5つの遺伝子が含まれるが、これらのうちsph3とuge3に対応する領域をハイグロマイシン耐性遺伝子で置換するコンストラクトを作製した(図93A)。まず、灰色カビ病菌のAG破壊株を完全培地(CM:1.5g Ca(NO3)2・4H2O,0.5g MgSO4・7H2O,0.5g KCl,0.4g KH2PO4,30mg K2HPO4,10g glucose,1.0g tryptone,and1.0g yeast extract per liter)で25℃において36時間震とう培養(120rpm)し、ミラクロスでろ過することによって菌体を回収した。次に、前述のプロトプラスト化液で菌体を処理し、プロトプラストを作製した。作製したプロトプラストを用いて、同様にプロトプラストPEG法により形質転換を行った。得られた24株の遺伝子破壊候補株からゲノムDNAを抽出し、PCRにより遺伝子破壊の確認を行った。その結果、2株において遺伝子破壊が成功した際にのみ増幅する約3.5kbと5.5kbのバンドが認められたことから(図93B)、これらの株は設計どおりsph3とuge3に対応する領域が欠失しているGAG破壊株であることが確認された。
次に、得られたGAG破壊株を炭素源がマルトースのYPM培地(Peptone 2%,Yeast extract 1%,Maltose 2%)で震とう培養し(25℃,120rpm,72hour)、培養性状を観察した。後述するように、この培養条件でB. cinerera GAG破壊株の菌体表面のAG発現をα−1,3−glucanase−glucan binding domain−GFP融合体で検出すると(図112)、AGの発現は検出されず、実質A. oryzae AG−GAG破壊株と同等であることがわかった。そのためこの培養条件では、B.cinereraGAG破壊株はGAG単独欠損でありながら、野生株が菌糸の塊を形成しながら生育するのに対し(図94A)、B. cinereraGAG破壊株の菌糸は野生株より分散する傾向を示した(図94B)。この性質はA.oryzaeのAG−GAG破壊株と類似していることから、灰色カビ病菌では、GAG破壊のみでも高密度培養に好適となる可能性が考えられた。
菌体(Aspergillus oryzaeのWT又はAG−GAGΔ;Botrytis cinereaのWT又はGAGΔ;Cochliobolus heterostrophusのWT又はGAGΔ)をスライドガラス上にのせ、65℃で15分間インキュベートして、固定した。固定した菌体をAGBD−GFP溶液(100μg/mL in 50 mM potassium phosphate buffer)10 μLで浸し、3時間30℃でインキュベートした。AGBD−GFPとはα−1,3−グルカナーゼのα−1,3−グルカン結合部位とGFPをフュージョンした組換タンパク質であり、α−1,3−グルカンを特異的に染色することができる(Suyotha et al (2013) Biosci. Biotechnol. Biochem. 77: 639−647.)。3時間の反応の後、菌体を50 mM potassium phosphate bufferで3回洗浄し、蛍光顕微鏡で観察した。その結果、麹菌A. oryzae の菌体においては、α−1,3−グルカン由来の明確な蛍光が観察されたのに対し、AG−GAGΔ株では蛍光は観察されなかった(図112)。また、B. cinereaにおいても野生型株、GAGΔ株とも蛍光は観察されなかった(図112)。したがって、B. cinereaはα−1,3−グルカン合成酵素を有しているにもかかわらず、本培養条件ではα−1,3−グルカンを発現していないことが示唆された。
また、α−1,3−グルカン合成酵素を持たないC. heterostrophusにおいては当然ながら、α−1,3−グルカン由来の蛍光は観察されなかった(図113)。
Claims (7)
- GAG生合成クラスターの少なくとも一部を欠損し、かつα−1,3−グルカンを発現しない変異型の糸状菌。
- uge3、sph3、ega3、agd3及びgtb3からなる群より選択される少なくとも一つのGAG生合成遺伝子を欠損している、請求項1に記載の糸状菌。
- アスペルギルス属、ボトリティス属、又はコクリオボルス属に属する、請求項1又は2に記載の糸状菌。
- アスペルギルス オリゼ、アスペルギルス ソーヤ、アスペルギルス ニドランス、アスペルギルス ニガー、アスペルギルス フミガタス、ボトリティス シネレア、又はコクリオボルス コクリオボルス ヘテロストロフォスである、請求項3に記載の糸状菌。
- α−1,3−グルカン合成酵素AGSの少なくとも一つを欠損している、請求項1〜4のいずれか1項に記載の糸状菌。
- 請求項1〜5のいずれか1項に記載の糸状菌を培養して、当該糸状菌に物質を生成させる工程、及び
得られた物質を回収する工程
を含む、物質生産方法。 - 前記物質が糸状菌の細胞壁の構成成分又はその加水分解物以外の物質である、請求項6に記載の方法。
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