JP6413117B2 - 高効率な異種タンパク質の製造方法 - Google Patents
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Description
当該新規タンパク質は、キシロース存在下で、培養液中に高濃度で分泌・生産されるため、その分泌シグナル配列を用いることによって、異種タンパク質の培養液中への分泌量を制御することができる。
さらに、キシロース存在下で培養することによって、他のPsudozyma属酵母も、P. antarcticaと同様に、培養液中に、先に見つけた新規蛋白質と同じ分子量約33kDaのタンパク質を分泌することを確認した。
(2)配列番号:1又は配列番号:7に示される塩基配列と少なくとも80%の相同性を有する塩基配列を含み、プロモーター活性を有する核酸分子。
(3)配列番号:1又は配列番号:7に示される塩基配列からなる核酸分子。
(4)上記(1)〜(3)のいずれか1項記載の核酸分子又はプロモーター活性を有するその断片を含む発現ベクター。
(5)配列番号:2又は配列番号:8に示される塩基配列、或いは、配列番号:2又は配列番号:8に示される塩基配列と少なくとも70%の相同性を有し、ターミネーター活性を有する塩基配列をさらに含む、上記(4)記載の発現ベクター。
(6)前記核酸分子に機能可能に連結した異種タンパク質をコードする塩基配列をさらに含む、上記(4)又は(5)記載の発現ベクター。
(7)異種タンパク質が、Pseudozyma属酵母由来の生分解性プラスチック分解酵素PaE、又は、糸状菌NITE P-573由来の生分解性プラスチック分解酵素PCLEである、上記(6)記載の発現ベクター。
(8)異種タンパク質をコードする塩基配列の上流に隣接して、配列番号:3又は配列番号:9に示される塩基配列、或いは、配列番号:3又は配列番号:9に示される塩基配列と少なくとも90%の相同性を有し、分泌シグナルとしての機能を有する塩基配列をさらに含む、上記(6)又は(7)記載の発現ベクター。
(9)上記(6)〜(8)のいずれか1項記載の発現ベクターで形質転換した宿主細胞。
(10)Pseudozyma属酵母、Ustilago属酵である、上記(9)記載の宿主細胞。
(11)Pseudozyma antarcticaである、上記(9)記載の宿主細胞。
(12)上記(9)〜(11)のいずれか1項記載の宿主細胞を、前記異種タンパク質の発現を可能にする条件下で培養する工程、及び、培養液から異種タンパク質を回収する工程を含む、異種タンパク質の製造方法。
(13)キシロースを含む培地中で宿主細胞を培養する、上記(12)記載の製造方法
(14)配列番号:4に示される塩基配列によりコードされるタンパク質。
(15)上記(14)に記載のタンパク質を含む、生分解性プラスチック分解製剤。
また、本発明の培養上清のタンパク質の構成は、主成分が目的の異種タンパク質であるため、組換え体である細胞をメンブレンフィルター等で除去することにより、そのまま酵素液として使用することができる。
本発明はさらに、配列番号:1に示される塩基配列と少なくとも80%の相同性を有する塩基配列を含み、プロモーター活性を有する核酸分子に関する。上記塩基配列は、好ましくは、配列番号:1に示される塩基配列と少なくとも81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%の相同性を有する。あるいは、塩基配列が本願発明に規定するタンパク質の製造方法においてプロモーター活性を有する限り、塩基の1もしくは数個が欠失、置換もしくは付加されていてもよい。さらに好ましくは、本発明の核酸分子は、配列番号:1に示される塩基配列からなる。
本発明はさらに、配列番号:7に示される塩基配列と少なくとも80%の相同性を有する塩基配列を含み、プロモーター活性を有する核酸分子に関する。上記塩基配列は、好ましくは、配列番号:7に示される塩基配列と少なくとも81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%の相同性を有する。あるいは、塩基配列が本願発明に規定するタンパク質の製造方法においてプロモーター活性を有する限り、塩基の1もしくは数個が欠失、置換もしくは付加されていてもよい。さらに好ましくは、本発明の核酸分子は、配列番号:7に示される塩基配列からなる。
本発明の発現ベクターにおいては、例えば上記のように、PANT_8c00118遺伝子のプロモーター、異種タンパク質cDNA塩基配列、ターミネーター(例えば、PANT_8c00118遺伝子ターミネーター)遺伝子塩基配列を配し、更にマーカー遺伝子塩基配列(例えば、アミノ酸や塩基合成遺伝子、抗生物質体制遺伝子)を配した発現カセットを構築することができる。
培養条件は、前記ベクターおよび宿主細胞の種類に応じて培地の組成、培養温度を決定することができ、25〜40℃、好ましくは30℃で培養することができる。
本願発明の方法においては、キシロースを含む培地中で宿主細胞を培養することによって、異種タンパク質を高発現させることが可能となる。キシロースは、培地中に2〜12質量%、好ましくは4〜8質量%の量で添加することができる。ジャー等の培養装置を用いて生産する時には通気条件を0.5〜3vvm(LPM/L)、好ましくは1〜2vvmにし、溶存酸素濃度を飽和度の20〜50%に保ちながら培養を行う。
また、酵素生産効率が低い培養初期の24時間までに、キシロースの代わりに安価な炭素源、例えばスクロースでは培地中に2〜4質量%、あるいは同等の菌体量を得るのに十分なグリセロール、糖蜜などを用いて高密度に菌体を増殖させた後、終濃度10〜20質量%のキシロースを連続的に流加して酵素生産を誘導してやることで、より高濃度の異種タンパク質が安価で生産させることが可能となる。
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれにより限定されるものではない。
本発明者らがPseudozyma antarcticaが産出する生分解性プラスチック分解酵素の産出条件を検討していた際、基準株Pseudozyma antarctica JCM10317を様々な炭素源を用いて培養した結果、キシロース存在下でのみ、強く発現が誘導され、培地中に大量に分泌される分子量約33kDaの未知のタンパク質があることを見出した。そこで本発明者らが所有している複数のP. antarctica株が、キシロース存在下で、基準株と同様に、分子量約33kDaの未知タンパク質を大量に分泌するかどうかを確認した。
YM培地で、30℃で24時間培養したもの前培養液として用いた。本培養では改変FMMを用い、褐変やフルフラールなどの培養阻害物質の生成を避けるため、炭素源(8%キシロース)とその他の培地成分を別々に滅菌した後、滅菌条件下で混合して作成した。それぞれの組成を以下に示す。
YM培地(Yeast extract Malt extract Medium)
Yeast extract 0.3%
Malt extract 0.3%
Bacto peptone 0.5%
Glucose 1.0%
改変FMM(Fungal minimum medium)
NaNO3 0.2%
KH2PO4 0.06%
MgSO4・7H2O 0.06%
Yeast extract 0.3%
Xylose 8.0%
また、本未知タンパク質は培養液中に非常に高濃度に分泌される分泌性蛋白質であることから、培養液中から精製された本タンパク質のN末端アミノ配列をもとに、開始コドンから蛋白質のN末端アミノ酸配列をコードする遺伝子配列の直前の102bp中に強力な分泌シグナルが存在することが推測された。
取得したPANT_8c00118遺伝子のプロモーター領域とターミネーター領域の末端に制限酵素サイトを付加し、図4に示すプラスミドpPAX1-neoを構築した。
このプラスミドは、市販のプラスミドpUXV1(ATCCより入手可能)をベースとし、Pgapの代わりにP. antarctica T34株のPANT_8c00118遺伝子プロモーター(配列番号:1)とターミネーター(配列番号:2)領域の間を複数の制限酵素サイトで連結した発現カセットと置き換え、ハイグロマイシン耐性遺伝子の代わりにT34株由来のhomocitrate synthaseプロモーターとその下流に大腸菌由来のネオマイシン耐性遺伝子を連結した遺伝子断片と置き換えたものである。
このプラスミドにP. antarctica JCM10317由来の生分解性プラスチック分解酵素PaEをコードするcDNA遺伝子のPaCLE1を組み込んだものが図5である。構築したプラスミドpPAX1-neo-PaCLE1は、以下の方法に従い、P. antarctica T34株に導入した。
培養液を4℃、3000xgで5分間遠心分離を行い、菌体を回収した。回収した菌体を20mlの氷冷0.5M sorbitolに懸濁し、再度4℃、3000×gで5分間遠心分離を行い、菌体を洗浄・回収した。その後、回収した菌体を10mlの氷冷1M sorbitolに懸濁し、4℃、3000×gで5分間遠心分離を行い、菌体を回収した。回収した菌体を1mlの氷冷1M sorbitolに懸濁した。
以上の操作は、氷上で行った。
ギャップ0.2cmのエレクトロポレーションキュベット(BIO-RAD)に菌体懸濁液50μlとプラスミドDNA 50μl(約5〜10μg)を加えて氷上で5分間インキュベートした。E. coli pulser(BIO−RAD)にキュベットをセットし、1.5kV、25kF、400Ωの条件でエレクトロポレーションを行った。その後、直ちに氷冷YMS(YM + 1M sorbitol)を加え、ピペッティングにより混合し、15mlのポリウレタン製チューブに移し、30℃で2時間、静置でインキュベートした。抗生物質G418を含むYMSプレート(YMS + 0.05% G418、2% agar)に塗布し、30℃でコロニーが形成するまでインキュベートを行い、得られた形質転換体のコロニーは新たな抗生物質G418を含むYMS プレートに植え継いだ。
このような形質転換体を選抜した。
なお、酵素活性測定は、以下のように行った。20mM Tris HCl buffer(pH6.8)に吸光度(OD660)がおよそ0.65となるようPBSAエマルジョンを懸濁した水溶液1.9mlを内径10mmの試験管に入れ、培養上清を100μl加え、30℃で180rpm、15分間振とう処理し、吸光度の減少量を測定した。酵素活性の単位は一分間当たりに吸光度を1.0減少させる酵素量を1Uと定義した。
作製したプラスミドpPAX1-neoのキシロースによる発現誘導がP. antarcticaで良好に働くことを確認できたので、次にP. antarctica近縁種で形質転換体を作製し、キシロースによる遺伝子発現誘導性を確認した。
Pseudozyma属酵母であるP. tsukubaensis JCM10324株、P. aphidis JCM10318株、P. rugulosa JCM10323株に対し、上記と同様の手法でpPAX1-neo-PaCLE1を組み込んだところ、いずれの株でもPBSAエマルジョンを含むFMMプレート上で、菌の周辺ではエマルジョンが溶解され、ハロを形成するようになった形質転換体が得られ(図8参照、P. rugulosa JCM10323株の形質転換体)、1% yeast extractに6% キシロースを含む液体培地での培養により、培養ろ液中にPBSAエマルジョン分解活性が強く誘導されることを確認した(図9参照、P. tsukubaensis JCM10324株とP. aphidis JCM10318株の形質転換体)。これらの結果から、形質転換体はキシロースにより生分解性プラスチック分解酵素PaEが誘導生産されることを確認した。
この結果は、P. antarcticaのPANT_8c00118配列中のプロモーターが、Pseudozyma属酵母全般で活性を発現可能であることを示している。また、既にUstilagoもPseudozymaもUstilaginales目(クロホ菌目)に含まれ、rDNAのD1/D2配列を用いた類似性比較の結果から、両方の属が近縁であることが既に示されていることから、これらの遺伝子操作に使用できる可能性を示している。
続いて、作製した異種タンパク質発現系が、異種タンパク質の大量生産に有効であることを実証するため、5LスケールのJar fermenterを用いて、PaEの生産試験を行った。
pPAX1-neo-PaCLE1はU. maydisの自己複製遺伝子UARSを有するため、制限酵素処理によりそのまま直鎖状にしても染色体に組み込まれた形質転換体が得られにくい。そこで、制限酵素SspI処理によってUARSを削除して直鎖状にした後、P. antarctica GB-4(0)株に組み込んだ形質転換体GB4(0)-PaE14株を作製した。
Jar fermenter用培地組成
Xylose 2%
NaNO3 0.2%
MgSO4・7H2O 0.04%
KH2PO4 0.04%
Yeast extract 0.2%
(NH4)2SO4 0.2%
酵素生産誘導用の流加培地組成
Xylose 20%
YNB w/o AA & AS 0.085%
Yeast extract 0.2%
この原因には、培地中のキシロース以外の栄養源の不足が考えられた。また、培養初期のタンパク質生産速度は低く、菌体がある程度増殖してきた培養24時間以後から、急激にタンパク質生産速度が上昇していたことから、培養開始から24時間まではスクロースなどの安価な炭素源を利用して菌体増殖のみを行い、24時間以降からキシロースを流加することによって、タンパク質生産速度を高く維持した状態での高密度流加培養を行うことにした。高密度培養用の培地組成および流加培地組成をそれぞれ以下に示す。なお、その他の培養条件は、上記と同様に行った。
Jar fermenterでの高密度培養用培地組成
Sucrose 3%
NaNO3 0.2%
MgSO4・7H2O 0.1%
KH2PO4 0.1%
Yeast extract 0.5%
(NH4)2SO4 1.0%
高密度培養用の流加培地組成
Xylose 50%
YNB w/o AA & AS 0.085%
Yeast extract 0.2%
培養開始から24時間で乾燥菌体重量が22.6g/Lまで増殖し、その後のキシロースの流加によって培養開始から104時間まで、高いタンパク質生産速度を維持し、最終的に144時間で208.0U/mL(約3g/L)という非常に高濃度のPaEが得られた(図10B参照)。この値は、親株での生産量と比較すると約10倍という高い生産量であった。
次に本発明者らは、開発した発現ベクターが異種タンパク質生産に有用であることを確かめるため、糸状菌B47-9株由来の生分解性プラスチックPCLEの生産を試みた。
開発した発現ベクターのUARSを制限酵素SspI処理によって削除し、PCLEをコードするcDNA遺伝子配列(GenBank Accession No. AB823703)を組み込んだpPAXn-PCLEが図11である。pPAXn-PCLEを制限酵素EcoRI処理によって直鎖状にした後、P. antarctica T34株に組み込んだ形質転換体、T34-PCLE1株を作製した。前述のPBSAエマルジョンを含むFMMプレートに親株T34株とT34-PCLE1株を接種したところ、T34-PCLE1株はPCLEの生産により、図12に示すようにエマルジョンが分解され、ハロの形成が確認された。
次に本発明者らは、P. antarctica GB-4(0)株においても、キシロースで生産が強力に誘導されるタンパク質の遺伝子の取得を試みた。
まず、P. antarctica T34株のPANT_8c00118遺伝子プロモーター、構造遺伝子、ターミネーター配列(図3、配列番号:5)を参考に、以下に示す8種類のPrimerを作成した。
XynF1:5’-GAAGGCTGAAGCTTTGGCTCTGACAT-3’
XynF2:5’-CATGCTTGAAGCTCCAAGAAGATATAA-3’
XynF3:5’-CACTCGCAGCTGCCTTCGTGGGTGCAG-3’
XynF4:5’-GAAGGCAGTCTGCTCGGCCGCTCCCGA-3’
XynR1:5’-TGTGGTGTTTGTTTGGCGTTTTTGCTT-3’
XynR2:5’-ATCCCACGCGTACACCTTGCCCTTGTA-3’
XynR3:5’-CCCACGCAGTTGGACTGGGCCAGGCAG-3’
XynR4:5’-CGAGCGCGATTTTCTCCGAGTCTAAA-3’
Claims (11)
- 配列番号:1又は配列番号:7に示される塩基配列を含み、キシロースによって誘導されるプロモーター活性を有する、核酸分子。
- 配列番号:1又は配列番号:7に示される塩基配列と少なくとも90%の相同性を有する塩基配列を含み、キシロースによって誘導されるプロモーター活性を有する、核酸分子。
- 配列番号:1又は配列番号:7に示される塩基配列からなる核酸分子。
- 請求項1〜3のいずれか1項記載の核酸分子又はキシロースによって誘導されるプロモーター活性を有するその断片を含む発現ベクター。
- 配列番号:2又は配列番号:8に示される塩基配列、或いは、配列番号:2又は配列番号:8に示される塩基配列と少なくとも90%の相同性を有し、ターミネーター活性を有する塩基配列をさらに含む、請求項4記載の発現ベクター。
- 前記核酸分子に機能可能に連結した異種タンパク質をコードする塩基配列をさらに含む、請求項4又は5記載の発現ベクター。
- 異種タンパク質が、Pseudozyma属酵母由来の生分解性プラスチック分解酵素PaE、又は、糸状菌NITE P-573由来の生分解性プラスチック分解酵素PCLEである、請求項6記載の発現ベクター。
- 異種タンパク質をコードする塩基配列の上流に隣接して、配列番号:3又は配列番号:9に示される塩基配列、或いは、配列番号:3又は配列番号:9に示される塩基配列と少なくとも90%の相同性を有し、分泌シグナルとしての機能を有する塩基配列をさらに含む、請求項6又は7記載の発現ベクター。
- 請求項6〜8のいずれか1項記載の発現ベクターで形質転換した、Pseudozyma属酵母又はUstilago属菌の宿主細胞。
- Pseudozyma antarcticaである、請求項9記載の宿主細胞。
- 請求項9又は10記載の宿主細胞を、キシロースを含む培地中で培養する工程、及び、培養液から異種タンパク質を回収する工程を含む、異種タンパク質の製造方法。
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