WO2023176835A1 - キシロース誘導性プロモーター及びその使用 - Google Patents

キシロース誘導性プロモーター及びその使用 Download PDF

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WO2023176835A1
WO2023176835A1 PCT/JP2023/009855 JP2023009855W WO2023176835A1 WO 2023176835 A1 WO2023176835 A1 WO 2023176835A1 JP 2023009855 W JP2023009855 W JP 2023009855W WO 2023176835 A1 WO2023176835 A1 WO 2023176835A1
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WO
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xylose
seq
region
promoter
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PCT/JP2023/009855
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English (en)
French (fr)
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宏子 北本
拓未 田中
敦宏 三浦
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国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins

Definitions

  • the present invention relates to a xylose-inducible promoter and its use, and more specifically, to a xylose-inducible promoter containing a mutant base sequence, a vector, a nucleic acid molecule, and a microorganism containing the same, and a protein of interest using them. Concerning how to produce.
  • Microorganisms are used to produce proteins. Generally, a recombinant gene created by linking a gene encoding a target protein downstream of a promoter sequence that promotes gene expression is introduced into a microorganism and cultured to obtain the target protein.
  • Protein expression systems using microorganisms as hosts that have been put to practical use include systems using prokaryotic microorganisms and systems using eukaryotic microorganisms.In the former, E. coli, Brevibacillus, Corynebacterium, etc. , a variety of prokaryotic microorganisms have been used.
  • ascomycetes such as yeast and filamentous fungi
  • basidiomycetes such as Pseudozyma antarctica
  • Pseudozyma antarctica Pseudozyma antarctica
  • the xylose-inducible promoter (xylanase promoter) derived from P. antactica promotes proteins such as the biodegradable plastic degrading enzyme PaE. Used for production by Antactica.
  • An object of the present invention is to provide a xylose-inducible promoter that has improved ability to promote transcription of downstream genes by modifying the base sequence of the xylanase promoter.
  • the present invention was completed based on the discovery that increasing a specific sequence in the xylanase promoter derived from C. antactica improves the expression efficiency of downstream genes. That is, the present invention provides the xylose-inducible promoter shown below, a vector containing the same, a nucleic acid molecule, and a microorganism, and a method for producing a protein of interest using them.
  • a xylose-inducible promoter comprising a mutant base sequence of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, wherein the mutant base sequence is (i) Base sequence of the 1359th to 1413rd region of SEQ ID NO: 1, (ii) a continuous base sequence of at least 10 bases existing in the region 1204 to 1223 of SEQ ID NO: 1, and (iii) a base sequence of the region 964 to 1013 of SEQ ID NO: 1, and At least a nucleotide sequence containing a transcription-promoting nucleotide sequence selected from the group consisting of nucleotide sequences having 85% or more sequence identity with these and having a transcription-promoting effect is included in the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • the mutant base sequence additionally includes at least two base sequences containing the transcription-promoting base sequence, and the additionally included base sequence includes at least two transcription-promoting base sequences. , the xylose-inducible promoters according to [1] above, which are the same or different from each other.
  • the base sequence containing the transcription-promoting base sequence is inserted within 50 bases before and after any of the base sequences (i) to (iii) above, as described in [1] or [2] above. xylose-inducible promoter.
  • [4] The xylose-inducible promoter according to any one of [1] to [3] above, wherein the transcription-promoting base sequence is inserted within 50 bases before and after the base sequence (ii).
  • [5] The xylose-inducible promoter according to any one of [1] to [4] above, wherein the mutant base sequence has an additional mutation.
  • [6] A vector or nucleic acid molecule comprising the xylose-inducible promoter according to any one of [1] to [5] above.
  • [7] The vector or nucleic acid molecule according to [6] above, further comprising a base sequence encoding a protein of interest downstream of the xylose-inducible promoter.
  • a microorganism comprising the xylose-inducible promoter according to any one of [1] to [5] above, or the vector or nucleic acid molecule according to [6] or [7] above.
  • a method for producing a target protein comprising: a step of preparing a microorganism that includes a xylose-inducible promoter that includes a mutant nucleotide sequence of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, and that includes a nucleotide sequence that encodes a protein of interest downstream of the xylose-inducible promoter; the step of culturing the microorganism to express the target protein, wherein the mutant base sequence is (i) Base sequence of the 1359th to 1413rd region of SEQ ID NO: 1, (ii) a continuous base sequence of at least 10 bases existing in the region 1204 to 1223 of SEQ ID NO: 1, and (iii) a base sequence of the region 964 to 1013 of SEQ ID NO: 1, and At least a nucleotide sequence containing a transcription-promoting nucleotide sequence selected from the group consisting of nucleotide sequences having 85% or more sequence identity with these and having a
  • the present invention P.
  • a xylose-inducible promoter in which the portion contributing to promoter activity in the xylanase promoter derived from C. antactica is increased, the expression efficiency of downstream genes can be improved. Therefore, the microorganism in which the xylose-inducible promoter of the present invention functions can be used as one of the host strains useful for mass production of a target protein.
  • P. antactica P. antactica
  • P. antactica Pseudozyma fungus
  • yeast Pseudozyma fungus
  • Pxyn1 derived from P. antactica has the following sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • the xylose-inducible promoter of the present invention includes a mutant base sequence of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, and the mutant base sequence is (i) Base sequence of the region from 1359th to 1413th (-101st to -155th) of SEQ ID NO: 1, (ii) a continuous base sequence of at least 10 bases existing in the 1204th to 1223rd (-291st to -310th) region of SEQ ID NO: 1, and (iii) the base sequence of the region from 964th to 1013th (-501st to -550th) of SEQ ID NO: 1, and A base sequence containing a transcription-promoting base sequence selected from the group consisting of base sequences having a sequence identity of about 85% or more, about 90% or more, or about 95% or more and having a transcription-promoting effect.
  • transcription factors bind to regions (i) to (iii) of SEQ ID NO: 1, and by providing more of these regions than usual in the promoter sequence, It is thought that the binding of the transcription factor is promoted, leading to enhanced transcription and expression of downstream genes.
  • the base sequence containing the specific transcription-promoting base sequence in the region (ii) is not particularly limited as long as it has a transcription-promoting effect, but for example, (ii-1) 1214 to 1223 of SEQ ID NO: 1. (-291st to -300th), or (ii-2) 1204th to 1213th (-301st to -310th) (ii-3) 1214th to 1233rd (-281st to -300th), including at least one of them; (ii-4) 1204th to 1223rd (-291st to -310th), (ii-5) 1194th to 1213th (-301st to -320th), (ii-6) 1169th to 1223rd (-291st to -345th), (ii-7) 1201st to 1234th (-280 to -313th), (ii-8) 1201st to 1278th (-236th to -313rd) or (ii-9) 1169th to 1278th (-2
  • the mutant base sequence includes a total of two or more of the transcription-promoting base sequences.
  • the mutant base sequence may include at least two additional base sequences including the transcription-promoting base sequence, and thus may include a total of three or more transcription-promoting base sequences.
  • the additionally included base sequences containing the at least two transcription-promoting base sequences are the same or different from each other.
  • the base sequence containing the transcription-promoting base sequence is inserted within about 50 bases before and after any of the base sequences (i) to (iii) in the base sequence shown in SEQ ID NO: 1. It may be inserted immediately before or after any of the base sequences (i) to (iii) above.
  • the nucleotide sequence containing the transcription-promoting nucleotide sequence may be inserted within about 50 bases before and after the nucleotide sequence (ii) in the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1. may be inserted immediately before or after the base sequence.
  • the mutant base sequence may have an additional mutation.
  • the additional mutation may be any mutation as long as it does not impair the object of the present invention, but preferably includes a mutation that improves the transcription promoting activity of the xylose-inducible promoter.
  • the additional mutations are (a) to (e) of SEQ ID NO: 1: (a) 822nd to 827th (-687th to -692nd), (b) 905th to 963rd (-551st to -609th), (c) 1014th to 1060th (-454th to -500th), (d) 1064th to 1069th (-445th to -450th), and (e) 1297th to 1302nd (-212th to -217th)
  • the mutation may be a mutation in at least one region of SEQ ID NO: 1, and may result in suppression of the transcriptional repression effect compared to the base sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • the additional mutation is (a) 822nd to 827th (-687th to -692nd) of SEQ ID NO: 1; (b) 905th to 963rd (-551st to -609th), (c) 1014th to 1060th (-454th to -500th), (d) 1064th to 1069th (-445th to -450th), (d') 1061st to 1113th (-401st to -453rd), (e) 1297th to 1302nd (-212th to -217th), and (e') 1224th to 1303rd (-211th to -290th) It may be a deletion of all or a part of at least one region of (a) to (e'), and the total is within about 100 bases or about 80 bases.
  • the additional mutation is (a) positions 822 to 827 (positions -687 to -692) of SEQ ID NO: 1; (d) 1064th to 1069th (-445th to -450th), and (e) 1297th to 1302nd (-212th to -217th) It is also possible to replace all or part of at least one region of.
  • the nucleotide sequence after substitution is not particularly limited as long as the xylose-inducible promoter activity is improved, but for example, "5'-SYGGRG-3'"("S" is (C or G, "Y” represents C or T, "R” represents A or G) is preferred.
  • the present invention also relates to a vector or a nucleic acid molecule containing a xylose-inducible promoter containing the mutant base sequence.
  • the vector or nucleic acid molecule may further include a base sequence encoding a protein of interest downstream of the xylose-inducible promoter.
  • the present invention also relates to a microorganism containing a xylose-inducible promoter containing the mutant base sequence, or a vector or nucleic acid molecule containing the xylose-inducible promoter.
  • the microorganism is not particularly limited as long as the xylose-inducible promoter functions as a promoter, and may be, for example, a basidiomycete, preferably P. Antactica, P. Afidis, P. Rugrosa, P. Paraantactica, P. Graminicola, P. Tsukubaensis, P. Flocculossa, P. hupiensis, and P. hupiensis.
  • Pseudozyma chinensis It is a fungus of the genus Pseudozyma such as Pseudozyma chinensis. Please note that due to recent classification changes, P. Antactica is sometimes called Moesziomyces antarcticus.
  • the present invention also relates to a method for producing a protein of interest, the production method comprising: a step of preparing a microorganism that includes a xylose-inducible promoter containing the mutant base sequence and a base sequence that encodes a protein of interest downstream of the xylose-inducible promoter; The method includes a step of culturing the microorganism to express the target protein.
  • the target protein is not particularly limited, and may be, for example, a protein derived from the microorganism itself or a heterologous protein. Since the activity of the xylose-inducible promoter improves the expression efficiency of the protein of interest, the method of the present invention is useful for mass production of the protein of interest.
  • Test 1 of xylose-inducible promoter with mutations in internal sequence (1) Preparation of a screening promoter and reporter cassette-introduced strain having a deletion mutation in the internal sequence P.
  • the sequence of the wild-type xylanase promoter Pxyn1 obtained from the genomic DNA of Antactica GB-4(0) strain was subcloned into the pCR2.1TOPO TA vector.
  • inverse PCR was performed using various primer sets, and each amplified fragment was recircularized.
  • a nucleic acid fragment containing the screening promoter is cut out using a restriction enzyme and used as a reporter gene for Pxyn1.
  • Antactica PaE gene, its upstream and downstream sequences, and P. antactica as a selection marker for gene introduction.
  • a reporter cassette was prepared by combining the URA3 gene (uracil synthesis gene) of Antactica and the xylanase terminator. Specifically, the nucleic acid fragments were connected in the following order.
  • the reporter cassette introduced strain prepared in (1) above was transferred to YM liquid medium (containing 2% glucose, 0.5% peptone, 0.3% yeast extract, and 0.3% malt extract). ) was used to culture with shaking at 30°C for 24 hours to prepare a seed mother culture. 800 ⁇ L of 3xFMMX liquid medium (yeast extract 0.3%, sodium nitrate 0.2%, potassium dihydrogen phosphate 0.06%, magnesium sulfate) was dispensed into a 96-well 2 mL deep well plate. (containing 0.06% heptahydrate and 8% xylose) and cultured with shaking at 30° C. and 1500 rpm for 72 hours using a deep well plate mixer (manufactured by Taitec Corporation). Then, the culture solution was centrifuged to obtain bacterial cells and culture supernatant.
  • 3xFMMX liquid medium containing 0.06% heptahydrate and 8% xylose
  • the amount of PaE secreted into the culture supernatant was evaluated based on its biodegradable plastic degrading activity using a PaE activity measurement method using a microplate (see Non-Patent Document 1). Specifically, 10 ⁇ L of the culture supernatant appropriately diluted with sterile water was mixed with 7.5 ⁇ L of a polybutylene succinate adipate (PBSA) emulsion (EM-301, manufactured by Showa Denko K.K.) diluted to 3% w/v.
  • PBSA polybutylene succinate adipate
  • reaction solution 75 ⁇ L of HEPES buffer (50 mM, pH 7.3), and 57.5 ⁇ L of sterile water in a 96-well microplate (Proteosave (R) SS, manufactured by Sumitomo Bakelite Co., Ltd.) to prepare a reaction solution.
  • the mixture was shaken at 30° C. and 900 rpm for 15 minutes using a deep well plate mixer. Then, the OD660 (turbidity) of the reaction solution was measured before and after shaking.
  • the turbidity of the reaction solution decreases due to PaE in the culture supernatant, so if the decrease is small, it means that there is little PaE contained in the culture supernatant, which means that it has not been introduced into the cultured cell line. This means that the promoter activity of the reporter cassette contained in the protein is low.
  • the average decrease in turbidity due to the culture supernatant of a cell line into which a reporter cassette containing a wild-type promoter has been introduced is used as the reference value for promoter activity, and the relative promoter activity when this is set as 100% is determined for each promoter for screening. was calculated. The results are shown in Table 1.
  • inverse PCR is performed outward from the 5' end of region [3] or region [1], and the inverse PCR product is were mixed with the PCR product of region [3] or region [1] that was separately amplified by PCR, and ligated by a seamless cloning method using In-Fusion (R) HD Cloning Kit (manufactured by Takara Bio Inc.).
  • R In-Fusion
  • HD Cloning Kit manufactured by Takara Bio Inc.
  • mutant base sequences c to f were inserted to create mutant base sequences c to f.
  • the activity of the promoter composed of the prepared mutant base sequence was evaluated in the same manner as in items (1) and (2) above.
  • the types of mutant base sequences and relative promoter activities are shown in Tables 2 and 3.
  • a promoter composed of a mutant base sequence i.e., mutant base sequences a to c and e
  • the activity of a promoter composed of mutant base sequences that additionally include the base sequences of regions [2] and [5] i.e., mutant base sequences d and f
  • the base sequences of regions [1], [3], and [4] are important for the activity of the xylose-inducible promoter.
  • a screening promoter in which the inside of the 1243rd (-271st to -360th) region has been finely deleted specifically [3-1] 1224th to 1243rd (-271st to -290th) of SEQ ID NO: 1 , [3-2] 1214th to 1233rd (-281st to -300th), [3-3] 1204th to 1223rd (-291st to -310th), [3-4] 1194th to 1213th (-301st to -320th), [3-5] 1184th to 1203rd (-311th to -330th), [3-6] 1174th to 1193rd (-321st to -340th), [3-7] 1164th to 1183rd (-331st to -350th), or [3-8] 1154th to 1173rd (-341st to -360th), A promoter for screening in which the nucleotide sequence in the region was deleted was prepared using a DNA synthesis service. Then,
  • region [3] 2 The region from 1201st to 1234th (-280th to -313rd) of SEQ ID NO: 1, which includes the base sequence of region [3-3], is P. This is a region whose nucleotide sequence is conserved with the xylanase promoter of related species of Antactica, and the motif of this region is also reversed in the region 1245 to 1278 (-236 to -269) of SEQ ID NO: 1. It exists in the direction.
  • base sequences including these regions specifically, [M1] 1201st to 1234th (-280th to -313rd) of SEQ ID NO: 1, [M2] 1245th to 1278th (-236th to -269th), [M3] 1201st to 1278th (-236th to -313rd), or [M4] 1169th to 1278th (-236th to -345th)
  • [M1] 1201st to 1234th (-280th to -313rd) of SEQ ID NO: 1 [M2] 1245th to 1278th (-236th to -269th), [M3] 1201st to 1278th (-236th to -313rd), or [M4] 1169th to 1278th (-236th to -345th)
  • a mutant base sequence in which the base sequence of the region was inserted so as to be continuous to the 5' end of the corresponding region in SEQ ID NO: 1 was prepared in the same manner as in (5) above.
  • region [M2] when region [M2] was inserted, only the same level of clear zone was formed as in the cell line containing the wild-type xylanase promoter, but when region [M1], [M3], or [M4]
  • the transformant containing the promoter composed of the inserted mutant base sequence formed a larger clear zone than the cell line containing the wild-type xylanase promoter.
  • the base sequence of the 1201st to 1223rd (-291st to -313rd) regions of SEQ ID NO: 1 is common to regions [M1], [M3], and [M4], and region [3]. was suggested to be particularly important for xylanase promoter activity.
  • This base sequence includes the base sequence determined to be particularly important in (5) above.
  • a reporter cassette (PaE production cassette) using a promoter composed of the mutant base sequence h was introduced into P. It was randomly introduced onto the chromosome of PGB371 strain (Patent Document 2), which is a uracil-auxotrophic mutant of Antactica GB-4(0) strain, by a conventional method. Among the transformants obtained, 228 colonies that became uracil non-requiring were recovered. The recovered transformants, a strain containing a wild-type xylanase promoter (PGB371 strain), a non-PaE-producing strain, and an existing high-producing PaE strain (XG8 strain described in Non-Patent Document 2) were plated on a plate containing PBSA.
  • Transparent cells are transplanted onto agar medium (3xFMM-0.5% PBSA emulsion/8% xylose agar medium; see Patent Document 2 if necessary) and cultured, and PBSA is decomposed by the action of the produced PaE. The area (clear zone) was observed.
  • reporter cassette wt containing the wild-type xylanase promoter Pxyn1, reporter cassette h containing a promoter composed of the mutant base sequence h, or xylanase promoter was also used.
  • a reporter cassette cont containing the P. antactica URA3 gene that does not contain PaE was introduced by electroporation.
  • Colonies that have lost uracil auxotrophy are selected and placed on a plate agar medium containing PBSA (3xFMM-0.5% PBSA emulsion/8% xylose agar medium; as required). (see Patent Document 2) and cultured. Then, a transparent area (clear zone) produced when PBSA was decomposed by the action of the produced PaE was observed.
  • the parent strain (PGB433 strain) before transformation and the transformants introduced with the reporter cassette cont hardly formed a clear zone, whereas the transformants introduced with the reporter cassette wt or reporter cassette h
  • the body formed a clear clear zone.
  • the transformant into which reporter cassette h was introduced formed a very large clear zone. Therefore, P. It has been shown that a xylose-inducible promoter containing a mutant base sequence created by modifying the xylanase promoter of Antactica functions as a promoter even in different species of bacteria.
  • Each reporter cassette-introduced strain (8 wild-type strains without insertion, 4 strains with region [3] insertion type, and 8 strains with region [3 ⁇ ] insertion type) was grown on a plate agar medium containing PBSA (3xFMM-0.5% PBSA emulsion). - Transplanted onto a 2% xylose agar medium (see Patent Document 2 if necessary) and cultured for 1 day, a transparent area (clear zone) produced when PBSA was decomposed by the action of the produced PaE was observed.
  • screening promoters and the screening promoter prepared in item 1 (5) above specifically, [3-1] 1224th to 1243rd (-271st to -290th) of SEQ ID NO: 1, [3-2] 1214th to 1233rd (-281st to -300th), [3-3] 1204th to 1223rd (-291st to -310th), [3-4] 1194th to 1213rd (-301st to -320th), or [3-5] 1184th to 1203rd (-311th to -330th), Using a screening promoter with the region deleted, reporter cassettes containing each screening promoter were created in the same manner as described in item 1 (1) above, and a plurality of cell lines introduced with the promoters were created.
  • Each reporter cassette introduced strain (56 wild type strains without insertion, 15 strains with region [3-1] insertion type, 4 strains with region [3-2] insertion type, 4 strains with region [3-3] insertion type, 4 strains with region [3-1] insertion type, -4] 9 insertion type strains, region [3-5] insertion type 8 strains, region [3-9] insertion type 4 strains, and region [3-10] insertion type 7 strains) on a flat agar medium containing PBSA. (3x FMM-0.5% PBSA emulsion/2% xylose agar medium; refer to Patent Document 2 if necessary) and cultured for 3 days. Transparent cells are formed when PBSA is decomposed by the action of the produced PaE.
  • the area was observed. Analyze images of colonies and clear zones to measure colony size and clear zone size (relative area based on number of pixels), and calculate area ratio (y/x) by dividing clear zone size (y) by colony size (x). I asked for Further, the relative activity between the promoters was determined by taking the average value of the area ratio (y/x) as 100%. The results are shown in Table 7 below.
  • the 1204th to 1215th (-299th to -310th) nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, which is a nucleotide sequence contained in ], is particularly important for the activity of the xylanase promoter.
  • the expression efficiency of downstream genes could be improved by using a xylose-inducible promoter in which the portion contributing to promoter activity in the xylanase promoter derived from C. antactica was increased. Therefore, the microorganism in which the xylose-inducible promoter of the present invention functions can be used as one of the host strains useful for mass production of a target protein.

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Abstract

本発明は、Ｐ．アンタクティカ由来のキシロース誘導性プロモーター（キシラナーゼプロモーター）の塩基配列を改変することで、下流の遺伝子の転写を促進する能力が向上したキシロース誘導性プロモーターを提供することを目的としている。　本発明に従えば、Ｐ．アンタクティカ由来のキシラナーゼプロモーター中の特定の配列を増やしたキシロース誘導性プロモーターを使用することにより、下流の遺伝子の発現効率を向上することができる。

Description

キシロース誘導性プロモーター及びその使用
　本発明は、キシロース誘導性プロモーター及びその使用に関し、より具体的には、変異塩基配列を含むキシロース誘導性プロモーター、それを含むベクター、核酸分子、及び微生物、並びに、それらを使用して目的のタンパク質を生産する方法に関する。
　微生物はタンパク質を生産するために使用されている。一般的には、遺伝子の発現を促すプロモーター配列の下流に目的のタンパク質をコードする遺伝子を連結して作製した組換え遺伝子を、微生物に導入して培養することにより、当該目的のタンパク質を取得する。これまでに実用化されている微生物を宿主に用いたタンパク質発現系には、原核微生物を用いる系と、真核微生物を用いる系があり、前者においては、大腸菌、ブレビバチルス、及びコリネバクテリウムなど、多様な原核微生物が使用されている。一方、後者においては、酵母及び糸状菌などの子嚢菌やシュードザイマ・アンタクティカ（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）などの担子菌（特許文献１及び２並びに非特許文献１及び２）を目的のタンパク質の生産のために使用することは知られているものの、その種類は限られており、特にＰ．アンタクティカなどの担子菌のプロモーター配列を改変して、その遺伝子発現能力を向上させる研究は進んでいない。
国際公開第２０１４／１０９３６０号 特開２０１８－１５７８１４号公報
Sameshima-Yamashita Y, et al. (2019), Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 83:8, 1547-1556 Omae N, et al. (2021), PLoS ONE 16(3): e0247462. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0247462
　Ｐ．アンタクティカ由来のキシロース誘導性プロモーター（キシラナーゼプロモーター）は、生分解性プラスチック分解酵素ＰａＥなどのタンパク質を、Ｐ．アンタクティカによって生産するために使用されている。本発明は、当該キシラナーゼプロモーターの塩基配列を改変することで、下流の遺伝子の転写を促進する能力が向上したキシロース誘導性プロモーターを提供することを目的としている。
　本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、Ｐ．アンタクティカ由来のキシラナーゼプロモーター中の特定の配列を増やすと、下流の遺伝子の発現効率が向上することを見出し、本発明を完成させた。すなわち、本発明は、以下に示すキシロース誘導性プロモーター、それを含むベクター、核酸分子、及び微生物、並びに、それらを使用して目的のタンパク質を生産する方法を提供するものである。
〔１〕配列番号１に示される塩基配列の変異塩基配列を含む、キシロース誘導性プロモーターであって、前記変異塩基配列が、
（ｉ）配列番号１の１３５９～１４１３番目の領域の塩基配列、
（ｉｉ）配列番号１の１２０４～１２２３番目の領域に存在する少なくとも１０塩基の連続した塩基配列、及び
（ｉｉｉ）配列番号１の９６４～１０１３番目の領域の塩基配列、並びに、
それらと８５％以上の配列同一性を有し、かつ転写促進作用を有する塩基配列
からなる群から選択される転写促進性塩基配列を含む塩基配列を、配列番号１に示される塩基配列中に少なくとも１つ追加で含むものである、キシロース誘導性プロモーター。
〔２〕前記変異塩基配列が、前記転写促進性塩基配列を含む塩基配列を少なくとも２つ追加で含むものであり、追加で含まれている少なくとも２つの前記転写促進性塩基配列を含む塩基配列は、互いに同じであるか又は異なっている、前記〔１〕に記載のキシロース誘導性プロモーター。
〔３〕前記転写促進性塩基配列を含む塩基配列が、前記（ｉ）～（ｉｉｉ）のいずれかの塩基配列の前後５０塩基以内に挿入されている、前記〔１〕又は〔２〕に記載のキシロース誘導性プロモーター。
〔４〕前記転写促進性塩基配列が、前記（ｉｉ）の塩基配列の前後５０塩基以内に挿入されている、前記〔１〕～〔３〕のいずれか１項に記載のキシロース誘導性プロモーター。
〔５〕前記変異塩基配列が、追加の変異を有している、前記〔１〕～〔４〕のいずれか１項に記載のキシロース誘導性プロモーター。
〔６〕前記〔１〕～〔５〕のいずれか１項に記載のキシロース誘導性プロモーターを含む、ベクター又は核酸分子。
〔７〕前記キシロース誘導性プロモーターの下流に、目的のタンパク質をコードする塩基配列をさらに含む、前記〔６〕に記載のベクター又は核酸分子。
〔８〕前記〔１〕～〔５〕のいずれか１項に記載のキシロース誘導性プロモーター、又は、前記〔６〕若しくは〔７〕に記載のベクター又は核酸分子を含む、微生物。
〔９〕担子菌である、前記〔８〕に記載の微生物。
〔１０〕目的のタンパク質の生産方法であって、
　配列番号１に示される塩基配列の変異塩基配列を含むキシロース誘導性プロモーターを含み、かつ、前記キシロース誘導性プロモーターの下流に目的のタンパク質をコードする塩基配列を含む微生物を用意する工程と、
　前記微生物を培養して、目的のタンパク質を発現させる工程と
を含み、前記変異塩基配列が、
（ｉ）配列番号１の１３５９～１４１３番目の領域の塩基配列、
（ｉｉ）配列番号１の１２０４～１２２３番目の領域に存在する少なくとも１０塩基の連続した塩基配列、及び
（ｉｉｉ）配列番号１の９６４～１０１３番目の領域の塩基配列、並びに、
それらと８５％以上の配列同一性を有し、かつ転写促進作用を有する塩基配列
からなる群から選択される転写促進性塩基配列を含む塩基配列を、配列番号１に示される塩基配列中に少なくとも１つ追加で含むものである、生産方法。
　本発明に従えば、Ｐ．アンタクティカ由来のキシラナーゼプロモーター中のプロモーター活性に寄与する部分を増やしたキシロース誘導性プロモーターを使用することにより、下流の遺伝子の発現効率を向上することができる。したがって、本発明のキシロース誘導性プロモーターが機能する微生物を、目的のタンパク質の大量生産に有用な宿主株の１つとして用いることが可能となる。
　以下、本発明をさらに詳細に説明する。
　本明細書に記載の「シュードザイマ・アンタクティカ（Ｐ．アンタクティカ）」とは、イネやムギなどのイネ科植物の葉面に生息し得るシュードザイマ属菌（酵母）の一種であり、生分解性プラスチック分解酵素などを産生し得るものである。Ｐ．アンタクティカに由来するキシラナーゼプロモーターＰｘｙｎ１は、配列番号１で示される以下の配列を有している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000001
　本発明のキシロース誘導性プロモーターは、配列番号１に示される塩基配列の変異塩基配列を含んでおり、前記変異塩基配列は、
（ｉ）配列番号１の１３５９～１４１３番目（－１０１～－１５５番目）の領域の塩基配列、
（ｉｉ）配列番号１の１２０４～１２２３番目（－２９１～－３１０番目）の領域に存在する少なくとも１０塩基の連続した塩基配列、及び、
（ｉｉｉ）配列番号１の９６４～１０１３番目（－５０１～－５５０番目）の領域の塩基配列、並びに、
それらと約８５％以上、約９０％以上、又は約９５％以上の配列同一性を有し、かつ転写促進作用を有する塩基配列からなる群から選択される転写促進性塩基配列を含む塩基配列を、配列番号１に示される塩基配列中に少なくとも１つ追加で含んでいる（括弧内の数字は、アミノ酸配列をコードする部位へと続く３’末端側からの位置を表す）。特定の理論に拘束されるものではないが、配列番号１の（ｉ）～（ｉｉｉ）の領域には転写因子が結合すると考えられ、当該領域をプロモーター配列内に通常よりも多く設けることにより、当該転写因子の結合が促進され、下流の遺伝子の転写及び発現が亢進すると考えられる。
　前記（ｉｉ）の領域の具体的な転写促進性塩基配列を含む塩基配列は、転写促進作用を有している限り特に限定されないが、例えば、配列番号１の
（ｉｉ－１）１２１４～１２２３番目（－２９１～－３００番目）、又は、
（ｉｉ－２）１２０４～１２１３番目（－３０１～－３１０番目）
の領域の塩基配列などであってもよく、それらの少なくとも一方を含む
（ｉｉ－３）１２１４～１２３３番目（－２８１～－３００番目）、
（ｉｉ－４）１２０４～１２２３番目（－２９１～－３１０番目）、
（ｉｉ－５）１１９４～１２１３番目（－３０１～－３２０番目）、
（ｉｉ－６）１１６９～１２２３番目（－２９１～－３４５番目）、
（ｉｉ－７）１２０１～１２３４番目（－２８０～－３１３番目）、
（ｉｉ－８）１２０１～１２７８番目（－２３６～－３１３番目）、又は
（ｉｉ－９）１１６９～１２７８番目（－２３６～－３４５番目）
の領域の塩基配列などであってもよい。あるいは、前記（ｉｉ）の領域の具体的な転写促進性塩基配列を含む塩基配列は、
（ｉｉ－１０）１２０４～１２１５番目（－２９９～－３１０番目）
の領域の塩基配列などであってもよい。
　本明細書に記載の「少なくとも１つ追加で含む」とは、前記転写促進性塩基配列を含む塩基配列が、前記転写促進性塩基配列に対応する配列番号１中の塩基配列を損なわないように、配列番号１に示される塩基配列中に挿入されていることをいい、その結果、前記変異塩基配列は、前記転写促進性塩基配列を合計２つ以上含むことになる。ある態様では、前記変異塩基配列は、前記転写促進性塩基配列を含む塩基配列を少なくとも２つ追加で含んだ結果、当該転写促進性塩基配列を合計３つ以上含んでいてもよい。この場合、追加で含まれている少なくとも２つの前記転写促進性塩基配列を含む塩基配列は、互いに同じであるか又は異なっている。
　ある態様では、前記転写促進性塩基配列を含む塩基配列は、配列番号１に示される塩基配列中で前記（ｉ）～（ｉｉｉ）のいずれかの塩基配列の前後約５０塩基以内に挿入されていてもよく、前記（ｉ）～（ｉｉｉ）のいずれかの塩基配列の直前又は直後に挿入されていてもよい。好ましくは、前記転写促進性塩基配列を含む塩基配列は、配列番号１に示される塩基配列中で前記（ｉｉ）の塩基配列の前後約５０塩基以内に挿入されていてもよく、前記（ｉｉ）の塩基配列の直前又は直後に挿入されていてもよい。
　ある態様では、前記変異塩基配列は、追加の変異を有していてもよい。前記追加の変異は、本発明の目的を損なわない限り任意の変異であってもよいが、好ましくはキシロース誘導性プロモーターの転写促進活性を向上する変異を含む。例えば、前記追加の変異は、配列番号１の（ａ）～（ｅ）：
（ａ）８２２～８２７番目（－６８７～－６９２番目）、
（ｂ）９０５～９６３番目（－５５１～－６０９番目）、
（ｃ）１０１４～１０６０番目（－４５４～－５００番目）、
（ｄ）１０６４～１０６９番目（－４４５～－４５０番目）、及び
（ｅ）１２９７～１３０２番目（－２１２～－２１７番目）
の少なくとも１つの領域における変異であって、かつ配列番号１に示される塩基配列と比較して転写抑制作用の抑制をもたらすものであってもよい。より具体的には、前記追加の変異は、配列番号１の
（ａ）８２２～８２７番目（－６８７～－６９２番目）、
（ｂ）９０５～９６３番目（－５５１～－６０９番目）、
（ｃ）１０１４～１０６０番目（－４５４～－５００番目）、
（ｄ）１０６４～１０６９番目（－４４５～－４５０番目）、
（ｄ’）１０６１～１１１３番目（－４０１～－４５３番目）、
（ｅ）１２９７～１３０２番目（－２１２～－２１７番目）、及び
（ｅ’）１２２４～１３０３番目（－２１１～－２９０番目）
の少なくとも１つの領域のすべて又は一部の欠失であってもよく、前記（ａ）～（ｅ’）の少なくとも１つの領域のすべて又は一部を含む全体で約１００塩基以内又は約８０塩基以内の領域の欠失であってもよい。あるいは、前記追加の変異は、配列番号１の
（ａ）８２２～８２７番目（－６８７～－６９２番目）、
（ｄ）１０６４～１０６９番目（－４４５～－４５０番目）、及び
（ｅ）１２９７～１３０２番目（－２１２～－２１７番目）
の少なくとも１つの領域のすべて又は一部の置換であってもよい。置換後の塩基配列は、キシロース誘導性プロモーター活性が向上する限り特に制限されないが、例えば、転写抑制因子が結合し得る配列として知られている「５’－ＳＹＧＧＲＧ－３’」（「Ｓ」はＣ又はＧ、「Ｙ」はＣ又はＴ、「Ｒ」はＡ又はＧを表す。）の条件を満たさない配列が好ましい。
　別の態様では、本発明は、前記変異塩基配列を含むキシロース誘導性プロモーターを含む、ベクター又は核酸分子にも関している。前記ベクター又は核酸分子は、前記キシロース誘導性プロモーターの下流に、目的のタンパク質をコードする塩基配列をさらに含んでいてもよい。
　また別の態様では、本発明は、前記変異塩基配列を含むキシロース誘導性プロモーター、又は、当該キシロース誘導性プロモーターを含むベクター又は核酸分子を含む、微生物にも関している。前記微生物は、前記キシロース誘導性プロモーターがプロモーターとして機能する限り特に制限されないが、例えば、担子菌であってもよく、好ましくはＰ．アンタクティカ、Ｐ．アフィディス、Ｐ．ルグローサ、Ｐ．パラアンタクティカ、Ｐ．グラミニコラ、Ｐ．ツクバエンシス、Ｐ．フロキュロッサ、Ｐ．ヒューピエンシス、及びＰ．シャンシエンシスなどのシュードザイマ属の菌である。なお、最近の分類変更により、Ｐ．アンタクティカは、モエスジオマイセス・アンタクティクス（Ｍｏｅｓｚｉｏｍｙｃｅｓ ａｎｔａｒｃｔｉｃｕｓ）と呼ばれることもある。
　また別の態様では、本発明は、目的のタンパク質の生産方法にも関しており、当該生産方法は、
　前記変異塩基配列を含むキシロース誘導性プロモーターを含み、かつ、前記キシロース誘導性プロモーターの下流に目的のタンパク質をコードする塩基配列を含む微生物を用意する工程と、
　前記微生物を培養して、目的のタンパク質を発現させる工程と
を含んでいる。前記目的のタンパク質は、特に制限されず、例えば、前記微生物自体に由来するタンパク質であってもいいし、異種タンパク質であってもよい。前記キシロース誘導性プロモーターの活性により前記目的のタンパク質の発現効率が向上するため、本発明の方法は、当該目的のタンパク質の大量生産に有用である。
　以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明の範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
１．内部配列に変異を有するキシロース誘導性プロモーターの試験１
（１）内部配列に欠失変異を有するスクリーニング用プロモーター及びレポーターカセット導入株の作製
　Ｐ．アンタクティカＧＢ－４（０）株のゲノムＤＮＡから取得した野生型キシラナーゼプロモーターＰｘｙｎ１の配列をｐＣＲ２．１ＴＯＰＯ ＴＡベクターへサブクローニングした。このプロモーターの内部配列を部分的に削除するため、各種プライマーセットを用いたインバースＰＣＲを行い、増幅された各断片を再環化した。このようにして作製したＰｘｙｎ１内の内部配列を削除したスクリーニング用プロモーターを含むサブクローニングプラスミドから制限酵素で当該スクリーニング用プロモーターを含む核酸断片を切り出し、レポーター遺伝子としてＰ．アンタクティカのＰａＥ遺伝子、その上流配列及び下流配列、遺伝子導入の選抜マーカーとしてＰ．アンタクティカのＵＲＡ３遺伝子（ウラシル合成遺伝子）、並びに、キシラナーゼターミネーターを組み合わせて、レポーターカセットを作製した。具体的には、以下の順序で核酸断片を接続した。
＊レポーターカセットの構造
５’－［ＰａＥ遺伝子上流配列］－［ＵＲＡ３（マーカー）］－［スクリーニング用プロモーター］－［ＰａＥ］－［キシラナーゼターミネーター］－［ＰａＥ遺伝子下流配列］－３’
　このレポーターカセットを、ウラシル要求性相補を指標として、ＰａＥを産生しないＰ．アンタクティカのウラシル要求性変異株（ＰＧＢ０５０株；要すれば特許文献２を参照）の染色体上のＰａＥ遺伝子相当部位に、常法により１コピーだけ導入した。コントロールとして、スクリーニング用プロモーターに代えて野生型キシラナーゼプロモーターＰｘｙｎ１を含むレポーターカセットを導入した細胞株及びＰａＥ遺伝子を含まないレポーターカセットを導入したＰａＥ非産生株を作出した。
（２）プロモーター活性の評価
　上記（１）で作製したレポーターカセット導入株を、ＹＭ液体培地（グルコース２％、ペプトン０．５％、酵母エキス０．３％、及び麦芽エキス０．３％を含む）を用いて３０℃で２４時間振盪培養し、種母培養液を作製した。この種母培養液を、９６穴２ｍＬ容ディープウェルプレートに分注した８００μＬの３ｘＦＭＭＸ液体培地（酵母エキス０．３％、硝酸ナトリウム０．２％、リン酸二水素カリウム０．０６％、硫酸マグネシウム七水和物０．０６％、及びキシロース８％を含む）中に植菌し、ディープウェルプレートミキサー（タイテック株式会社製）を用いて３０℃、１５００ｒｐｍで７２時間振盪培養した。そして、培養液を遠心分離して、菌体及び培養上清を取得した。
　培養上清中に分泌されたＰａＥの量を、その生分解性プラスチック分解活性に基づき、マイクロプレートを用いたＰａＥ活性測定法（非特許文献１を参照）を用いて、評価した。具体的には、滅菌水で適宜希釈した培養上清１０μＬを、３％ｗ／ｖに希釈されたポリブチレンサクシネートアジペート（ＰＢＳＡ）のエマルジョン（ＥＭ－３０１、昭和電工株式会社製）７．５μＬ、ＨＥＰＥＳ緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．３）７５μＬ、及び滅菌水５７．５μＬと、９６穴マイクロプレート（プロテオセーブ(R)ＳＳ、住友ベークライト株式会社製）中で混合して反応液を調製し、ディープウェルプレートミキサーを用いて３０℃、９００ｒｐｍで１５分間振盪した。そして、当該反応液のＯＤ６６０（濁度）を振盪の前後で測定した。
　反応液の濁度は、培養上清中のＰａＥによって減少するので、減少の幅が小さければ、培養上清中に含まれているＰａＥが少ないこと、すなわち、培養された細胞株に導入されているレポーターカセットのプロモーター活性が低いことを意味している。野生型プロモーターを含むレポーターカセットを導入された細胞株の培養上清による濁度の減少幅の平均をプロモーター活性の基準値とし、これを１００％としたときの相対プロモーター活性を、各スクリーニング用プロモーターについて計算した。結果を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　キシラナーゼプロモーターＰｘｙｎ１（配列番号１）の５８４～６５８番目の塩基配列又は１１１４～１１６８番目の塩基配列を削除しても、プロモーター活性は野生型と変わらなかったが、
［１］１３５９～１４１３番目（－１０１～－１５５番目）、
［２］１３０４～１３５８番目（－１５６～－２１０番目）、
［３］１１６９～１２２３番目（－２９１～－３４５番目）、
［４］９６４～１０１３番目（－５０１～－５５０番目）、又は
［５］７２４～７８８番目（－７２６～－７９０番目）
の領域の塩基配列を削除すると、プロモーター活性は野生型よりも低くなった（括弧内の数字は、アミノ酸配列をコードする部位へと続く３’末端側からの位置を表す）。したがって、これらの領域は、キシラナーゼプロモーターＰｘｙｎ１において転写促進作用を担っており、これらの領域を野生型よりも増やすことでプロモーター活性を高められる可能性があると期待された。
（３）転写促進性の変異塩基配列を含むキシロース誘導性プロモーターの作製
　上記項目（２）で削除したときに最もプロモーター活性が低下した領域［３］と、プロモーター活性の低下率が４０％程度だった領域［１］について、これらの塩基配列を配列番号１中の対応する領域、すなわち領域［３］又は領域［１］の５’末端側にそれぞれ連なるように挿入して、変異塩基配列ａ及びｂを作製した。具体的には、野生型キシラナーゼプロモーターＰｘｙｎ１を含むｐＣＲ２．１ＴＯＰＯ ＴＡベクターを鋳型として用い、領域［３］又は領域［１］の５’末端部分から外側に向かってインバースＰＣＲを行い、当該インバースＰＣＲ産物を、別途ＰＣＲで増幅した領域［３］又は領域［１］のＰＣＲ産物とそれぞれ混合し、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ(R) ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社製）を用いたシームレスクローニング法で連結した。上記塩基配列の挿入の結果として、変異塩基配列ａ及びｂは、領域［３］又は領域［１］の塩基配列を２回繰り返した塩基配列を有していた。また、変異塩基配列ａの作製方法と同様の方法で、配列番号１中の領域［３］の５’末端側に連なるように、領域［１］、［２］、［４］、又は［５］の塩基配列を挿入し、変異塩基配列ｃ～ｆを作製した。作製した変異塩基配列から構成されるプロモーターの活性を、上記項目（１）及び（２）と同様にして評価した。変異塩基配列の種類及び相対プロモーター活性を表２及び３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　領域［１］、［３］、又は［４］の塩基配列を追加で含む変異塩基配列（すなわち変異塩基配列ａ～ｃ及びｅ）から構成されるプロモーターは、野生型のプロモーターと比較して、有意に高いプロモーター活性を有していた。一方、領域［２］及び［５］の塩基配列を追加で含む変異塩基配列（すなわち変異塩基配列ｄ及びｆ）から構成されるプロモーターの活性は、野生型のプロモーターの活性と比較して有意な差は見られなかった。したがって、領域［１］、［３］、及び［４］の塩基配列はキシロース誘導性プロモーターの活性に重要であることが示唆された。
（４）転写促進性の変異塩基配列を複数導入したキシロース誘導性プロモーターの作製
　野生型キシラナーゼプロモーターＰｘｙｎ１に挿入する断片（領域［３］の塩基配列の３回又は７回繰り返し配列）をＰＣＲではなくＤＮＡ合成サービスを利用して用意した以外は変異塩基配列ａの作製方法と同様にして、配列番号１中の領域［３］の５’末端側に連なるように領域［３］の塩基配列が３個又は７個挿入された変異塩基配列ｇ及びｈを作製した。変異塩基配列ａ、ｇ、又はｈから構成されるプロモーターの活性を、上記項目（１）及び（２）と同様にして評価した。変異塩基配列の種類及び相対プロモーター活性を表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　変異塩基配列ａ、ｇ、及びｈから構成されるプロモーターは、いずれも野生型のプロモーターと比較して、有意に高いプロモーター活性を有していた。領域［３］の塩基配列の挿入数を増やすと、それに応じてプロモーター活性を大幅に向上させることができた。
（５）領域［３］における重要配列の特定１
　配列番号１の領域［３］、すなわち配列番号１の１１６９～１２２３番目（－２９１～－３４５番目）の塩基配列のうち特に重要な配列を特定するため、この領域を含む配列番号１の１１４９～１２４３番目（－２７１～－３６０番目）の領域の内側を細かく欠失させたスクリーニング用プロモーター、具体的には、配列番号１の
［３－１］１２２４～１２４３番目（－２７１～－２９０番目）、
［３－２］１２１４～１２３３番目（－２８１～－３００番目）、
［３－３］１２０４～１２２３番目（－２９１～－３１０番目）、
［３－４］１１９４～１２１３番目（－３０１～－３２０番目）、
［３－５］１１８４～１２０３番目（－３１１～－３３０番目）、
［３－６］１１７４～１１９３番目（－３２１～－３４０番目）、
［３－７］１１６４～１１８３番目（－３３１～－３５０番目）、又は
［３－８］１１５４～１１７３番目（－３４１～－３６０番目）、
の領域の塩基配列を削除したスクリーニング用プロモーターを、ＤＮＡ合成サービスを利用して用意した。そして、常法により当該スクリーニング用プロモーターを組み込んだレポーターカセット（上記（１）参照）を作製し、レポーターカセット導入株を作製した。
　これらのレポーターカセット導入株、野生型キシラナーゼプロモーターＰｘｙｎ１を含むレポーターカセットを導入した細胞株、及び、ＰａＥ遺伝子を含まないレポーターカセットを導入したＰａＥ非産生株を、ＰＢＳＡを含む平板寒天培地（３ｘＦＭＭ－０．５％ＰＢＳＡエマルジョン・８％キシロース寒天培地；要すれば特許文献２を参照）にそれぞれ複数個移植して培養し、産生されたＰａＥの働きによってＰＢＳＡが分解されて生じる透明の領域（クリアゾーン）を観察した。
　その結果、領域［３－１］及び領域［３－５］～［３－８］を削除した場合には、野生型のキシラナーゼプロモーターを含む細胞株と同様のクリアゾーンが形成されたが、領域［３－２］～［３－４］を削除すると、クリアゾーンがほとんど形成されなかった。このことから、領域［３－２］のうち、領域［３－１］には含まれず領域［３－３］に含まれる塩基配列である配列番号１の１２１４～１２２３番目（－２９１～－３００番目）の塩基配列、及び、領域［３－４］のうち、領域［３－５］には含まれず領域［３－３］に含まれる塩基配列である配列番号１の１２０４～１２１３番目（－３０１～－３１０番目）の塩基配列は、キシラナーゼプロモーターの活性に特に重要であることが示唆された。
（６）領域［３］における重要配列の特定２
　領域［３－３］の塩基配列を含む配列番号１の１２０１～１２３４番目（－２８０～－３１３番目）の領域は、Ｐ．アンタクティカの近縁種のキシラナーゼプロモーターとの間で塩基配列が保存されている領域であり、この領域のモチーフは、配列番号１の１２４５～１２７８番目（－２３６～－２６９番目）の領域にも逆向きで存在している。そこで、これらの領域を含む塩基配列、具体的には、配列番号１の
［Ｍ１］１２０１～１２３４番目（－２８０～－３１３番目）、
［Ｍ２］１２４５～１２７８番目（－２３６～－２６９番目）、
［Ｍ３］１２０１～１２７８番目（－２３６～－３１３番目）、又は
［Ｍ４］１１６９～１２７８番目（－２３６～－３４５番目）
の領域の塩基配列を、配列番号１中の対応する領域の５’末端側に連なるように挿入した変異塩基配列を、上記（５）と同様にして作製した。これらの変異塩基配列から構成されるプロモーターの活性及び変異塩基配列ａ（領域［３］の塩基配列を追加で含む）から構成されるプロモーターの活性を、上記（５）と同様にして検討した。
　その結果、領域［Ｍ２］を挿入した場合には、野生型のキシラナーゼプロモーターを含む細胞株と同程度のクリアゾーンしか形成されなかったが、領域［Ｍ１］、［Ｍ３］、又は［Ｍ４］が挿入された変異塩基配列から構成されるプロモーターを含む形質転換体は、野生型のキシラナーゼプロモーターを含む細胞株よりも大きいクリアゾーンを形成した。このことから、領域［Ｍ１］、［Ｍ３］、及び［Ｍ４］、並びに領域［３］に共通している領域、すなわち配列番号１の１２０１～１２２３番目（－２９１～－３１３番目）の塩基配列が、キシラナーゼプロモーターの活性に特に重要であることが示唆された。この塩基配列は、上記（５）で特に重要と判断された塩基配列を包含している。
２．複数コピーの導入によるタンパク質発現の向上
　変異塩基配列ｈから構成されるプロモーターを用いたレポーターカセット（ＰａＥ生産カセット）を、Ｐ．アンタクティカＧＢ－４（０）株のウラシル要求性変異株であるＰＧＢ３７１株（特許文献２）の染色体上に、常法によってランダムに導入した。得られた形質転換体のうち、ウラシル非要求性となったコロニーを２２８個回収した。回収した形質転換体、並びに、野生型キシラナーゼプロモーターを含む菌株（ＰＧＢ３７１株）、ＰａＥ非生産株、及び、既存のＰａＥ高生産株（非特許文献２に記載のＸＧ８株）を、ＰＢＳＡを含む平板寒天培地（３ｘＦＭＭ－０．５％ＰＢＳＡエマルジョン・８％キシロース寒天培地；要すれば特許文献２を参照）上に移植して培養し、産生されたＰａＥの働きによってＰＢＳＡが分解されて生じる透明の領域（クリアゾーン）を観察した。
　その結果、野生株及びＰａＥ非生産株ではクリアゾーンは形成されなかったが、すべての形質転換体でクリアゾーンが形成され、そのうち特に１６株は、既存のＰａＥ高生産株よりも大きなクリアゾーンを形成した。コロニー及びクリアゾーンの画像を解析してコロニーサイズ及びクリアゾーンサイズ（直径）を測定し、それらの代表的な結果を以下の表５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
３．異種の菌におけるキシロース誘導性プロモーターの活性
　Ｐ．ツクバエンシスＪＣＭ１０３２４株から得られたウラシル要求性自然変異体ＰＧＢ４３３株に対し、野生型キシラナーゼプロモーターＰｘｙｎ１を含むレポーターカセットｗｔ、変異塩基配列ｈから構成されるプロモーターを含むレポーターカセットｈ、又は、キシラナーゼプロモーターもＰａＥも含まないレポーターカセットｃｏｎｔ（Ｐ．アンタクティカのＵＲＡ３遺伝子は含む）を、それぞれエレクトロポレーション法によって導入した。ウラシル要求性が無くなったコロニー（マーカーのＵＲＡ３遺伝子によりウラシル要求性が相補されたコロニー）を選抜し、ＰＢＳＡを含む平板寒天培地（３ｘＦＭＭ－０．５％ＰＢＳＡエマルジョン・８％キシロース寒天培地；要すれば特許文献２を参照）上に移植して培養した。そして、産生されたＰａＥの働きによってＰＢＳＡが分解されて生じる透明の領域（クリアゾーン）を観察した。
　その結果、形質転換する前の親株（ＰＧＢ４３３株）及びレポーターカセットｃｏｎｔを導入された形質転換体はほとんどクリアゾーンを形成しなかったのに対し、レポーターカセットｗｔ又はレポーターカセットｈを導入された形質転換体は明確なクリアゾーンを形成した。特にレポーターカセットｈを導入された形質転換体は、非常に大きなクリアゾーンを形成した。したがって、Ｐ．アンタクティカのキシラナーゼプロモーターを改変して作製した変異塩基配列を含むキシロース誘導性プロモーターは、異種の菌においてもプロモーターとして機能することが示された。
４．内部配列に変異を有するキシロース誘導性プロモーターの試験２
（１）プロモーター活性の確認
　上記項目１（５）では、配列番号１の１２０４～１２２３番目（－２９１～－３１０番目）の塩基配列（領域［３α］の塩基配列）を、特に重要な配列として特定した。この領域［３α］の塩基配列を、上記項目１（３）の変異塩基配列ａの作製方法と同様の方法で、配列番号１中の領域［３］の５’末端側（すなわち領域［３α］の５’末端側）に連なるように挿入し、変異塩基配列ｉを作製した。そして、上記項目１（１）に記載の方法と同様にして、変異塩基配列ａ又はｉから構成されるプロモーターを含むレポーターカセットを導入した細胞株をそれぞれ複数作製した。
　各レポーターカセット導入株（挿入なしの野生型８株、領域［３］挿入型４株、及び領域［３α］挿入型８株）を、ＰＢＳＡを含む平板寒天培地（３ｘＦＭＭ－０．５％ＰＢＳＡエマルジョン・２％キシロース寒天培地；要すれば特許文献２を参照）上に移植して１日培養し、産生されたＰａＥの働きによってＰＢＳＡが分解されて生じる透明の領域（クリアゾーン）を観察した。コロニー及びクリアゾーンの画像を解析してコロニーサイズ及びクリアゾーンサイズ（ピクセル数に基づく相対面積）を測定し、クリアゾーンサイズ（ｙ）をコロニーサイズ（ｘ）で除した面積比（ｙ／ｘ）を求めた。さらに、当該面積比（ｙ／ｘ）について、野生型の平均値を１００％としたときの値をプロモーター間の相対活性として求めた。結果を以下の表６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　変異塩基配列ａ又はｉから構成されるプロモーターは、いずれも野生型のプロモーターと比較して、有意に大きいクリアゾーンが観察された。これは、より多くのＰａＥが産生されてＰＢＳＡが分解された結果であるから、変異塩基配列ａ又はｉから構成されるプロモーターが、野生型よりも高いプロモーター活性を有していることを示すものである。
（２）領域［３］における重要配列の特定３
　配列番号１の領域［３α］の塩基配列のうち特に重要な配列を特定するため、この領域周辺を細かく欠失させたスクリーニング用プロモーター、具体的には、配列番号１の
［３－９］１２０４～１２０７番目（－３０７～－３１０番目）、又は
［３－１０］１２１６～１２２３番目（－２９１～－２９８番目）、
の領域の塩基配列を削除したスクリーニング用プロモーターを、ＤＮＡ合成サービスを利用して用意した。そして、これらのスクリーニング用プロモーターと、上記項目１（５）で用意したスクリーニング用プロモーター、具体的には、配列番号１の
［３－１］１２２４～１２４３番目（－２７１～－２９０番目）、
［３－２］１２１４～１２３３番目（－２８１～－３００番目）、
［３－３］１２０４～１２２３番目（－２９１～－３１０番目）、
［３－４］１１９４～１２１３番目（－３０１～－３２０番目）、又は
［３－５］１１８４～１２０３番目（－３１１～－３３０番目）、
の領域を削除したスクリーニング用プロモーターを用い、上記項目１（１）に記載の方法と同様にして、各スクリーニング用プロモーターを含むレポーターカセットを作製し、それらを導入した細胞株をそれぞれ複数作製した。
　各レポーターカセット導入株（挿入なしの野生型５６株、領域［３－１］挿入型１５株、領域［３－２］挿入型４株、領域［３－３］挿入型４株、領域［３－４］挿入型９株、領域［３－５］挿入型８株、領域［３－９］挿入型４株、及び領域［３－１０］挿入型７株）を、ＰＢＳＡを含む平板寒天培地（３ｘＦＭＭ－０．５％ＰＢＳＡエマルジョン・２％キシロース寒天培地；要すれば特許文献２を参照）上に移植して３日培養し、産生されたＰａＥの働きによってＰＢＳＡが分解されて生じる透明の領域（クリアゾーン）を観察した。コロニー及びクリアゾーンの画像を解析してコロニーサイズ及びクリアゾーンサイズ（ピクセル数に基づく相対面積）を測定し、クリアゾーンサイズ（ｙ）をコロニーサイズ（ｘ）で除した面積比（ｙ／ｘ）を求めた。さらに、当該面積比（ｙ／ｘ）の平均値を１００％としたときの値をプロモーター間の相対活性として求めた。結果を以下の表７に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　領域［３－１］、［３－５］、又は［３－１０］を削除した場合には、野生型のキシラナーゼプロモーターを含む細胞株と同様又はそれ以上のクリアゾーンが形成されたが、領域［３－２］～［３－４］又は［３－９］を削除すると、クリアゾーンがほとんど形成されなかった。このことから、配列番号１の１２０４～１２２３番目（－２９１～－３１０番目）の塩基配列（領域［３α］の塩基配列）のうち、領域［３－１０］には含まれず領域［３－９］に含まれる塩基配列である配列番号１の１２０４～１２１５番目（－２９９～－３１０番目）の塩基配列は、キシラナーゼプロモーターの活性に特に重要であることが示唆された。
　以上より、Ｐ．アンタクティカ由来のキシラナーゼプロモーター中のプロモーター活性に寄与する部分を増やしたキシロース誘導性プロモーターを使用することにより、下流の遺伝子の発現効率を向上できることが分かった。したがって、本発明のキシロース誘導性プロモーターが機能する微生物を、目的のタンパク質の大量生産に有用な宿主株の１つとして用いることが可能となる。

Claims (10)

  1. 　配列番号１に示される塩基配列の変異塩基配列を含む、キシロース誘導性プロモーターであって、前記変異塩基配列が、
    （ｉ）配列番号１の１３５９～１４１３番目の領域の塩基配列、
    （ｉｉ）配列番号１の１２０４～１２２３番目の領域に存在する少なくとも１０塩基の連続した塩基配列、及び
    （ｉｉｉ）配列番号１の９６４～１０１３番目の領域の塩基配列、並びに、
    それらと８５％以上の配列同一性を有し、かつ転写促進作用を有する塩基配列
    からなる群から選択される転写促進性塩基配列を含む塩基配列を、配列番号１に示される塩基配列中に少なくとも１つ追加で含むものである、キシロース誘導性プロモーター。
  2. 　前記変異塩基配列が、前記転写促進性塩基配列を含む塩基配列を少なくとも２つ追加で含むものであり、追加で含まれている少なくとも２つの前記転写促進性塩基配列を含む塩基配列は、互いに同じであるか又は異なっている、請求項１に記載のキシロース誘導性プロモーター。
  3. 　前記転写促進性塩基配列を含む塩基配列が、前記（ｉ）～（ｉｉｉ）のいずれかの塩基配列の前後５０塩基以内に挿入されている、請求項１に記載のキシロース誘導性プロモーター。
  4. 　前記転写促進性塩基配列が、前記（ｉｉ）の塩基配列の前後５０塩基以内に挿入されている、請求項１に記載のキシロース誘導性プロモーター。
  5. 　前記変異塩基配列が、追加の変異を有している、請求項１に記載のキシロース誘導性プロモーター。
  6. 　請求項１に記載のキシロース誘導性プロモーターを含む、ベクター又は核酸分子。
  7. 　前記キシロース誘導性プロモーターの下流に、目的のタンパク質をコードする塩基配列をさらに含む、請求項６に記載のベクター又は核酸分子。
  8. 　請求項１～５のいずれか１項に記載のキシロース誘導性プロモーター、又は、請求項６若しくは７に記載のベクター又は核酸分子を含む、微生物。
  9. 　担子菌である、請求項８に記載の微生物。
  10. 　目的のタンパク質の生産方法であって、
    　配列番号１に示される塩基配列の変異塩基配列を含むキシロース誘導性プロモーターを含み、かつ、前記キシロース誘導性プロモーターの下流に目的のタンパク質をコードする塩基配列を含む微生物を用意する工程と、
    　前記微生物を培養して、目的のタンパク質を発現させる工程と
    を含み、前記変異塩基配列が、
    （ｉ）配列番号１の１３５９～１４１３番目の領域の塩基配列、
    （ｉｉ）配列番号１の１２０４～１２２３番目の領域に存在する少なくとも１０塩基の連続した塩基配列、及び
    （ｉｉｉ）配列番号１の９６４～１０１３番目の領域の塩基配列、並びに、
    それらと８５％以上の配列同一性を有し、かつ転写促進作用を有する塩基配列
    からなる群から選択される転写促進性塩基配列を含む塩基配列を、配列番号１に示される塩基配列中に少なくとも１つ追加で含むものである、生産方法。
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