WO2023190542A1 - 担子菌酵母及び担子菌酵母の炭素カタボライト抑制を低減する方法 - Google Patents
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Definitions
- the present invention relates to basidiomycete yeasts and methods for reducing carbon catabolite inhibition in basidiomycete yeasts.
- Microorganisms are used to produce proteins. Generally, a recombinant gene created by linking a gene encoding a target protein downstream of a promoter sequence that promotes gene expression is introduced into a microorganism and cultured to obtain the target protein.
- Protein expression systems using microorganisms as hosts that have been put to practical use include systems using prokaryotic microorganisms and systems using eukaryotic microorganisms.In the former, E. coli, Brevibacillus, Corynebacterium, etc. , a variety of prokaryotic microorganisms have been used.
- Patent Documents 1 and 2 and Non-Patent Document 1 Saccharomyces cerevisiae or Aspergillus or basidiomycete yeasts such as Pseudozyma antactica
- Patent Documents 1 and 2 and Non-Patent Document 1 can be used for the production of the target protein.
- Pseudozyma antactica Pseudozyma antactica
- CCR carbon catabolite suppression
- Non-Patent Document 3 describes that Hxk2, a type of hexokinase, controls CCR in Saccharomyces cerevisiae and glucokinase in Aspergillus aspergillus; Patent Document 3 also states that CreA It has also been described that CreB controls CCR of filamentous fungi such as Aspergillus oryzae. On the other hand, no literature describes an enzyme that controls CCR in basidiomycete yeast.
- the xylose-inducible promoter (xylanase promoter) derived from P. antactica promotes proteins such as the biodegradable plastic degrading enzyme PaE. Antactica is used for production, but promoter function is limited by CCR in a medium containing glucose, an inexpensive carbon source. Therefore, the present invention is directed to P.
- the purpose of this invention is to provide a mutant in which CCR is relaxed in basidiomycete yeast such as Antactica.
- the present inventors discovered that glucokinase of basidiomycete yeast controls CCR, and completed the present invention. That is, the present invention provides the following method for reducing carbon catabolite inhibition of basidiomycete yeast and basidiomycete yeast.
- Basidiomycete yeast containing a functional-reducing mutation in the glucokinase gene.
- the basidiomycete yeast according to [1] above which is a fungus of the genus Pseudozyma.
- the loss-of-function mutation includes disruption of the glucokinase gene.
- the basidiomycete yeast according to any one of [1] to [5] above, further comprising a xylose-inducible promoter and a nucleotide sequence downstream thereof that encodes a protein of interest.
- a method for reducing carbon catabolite inhibition of basidiomycete yeast comprising the step of suppressing glucokinase function of the basidiomycete yeast.
- the basidiomycete yeast is a fungus of the genus Pseudozyma.
- the suppressing step includes the step of introducing a functional-reducing mutation into the glucokinase gene.
- glucokinase gene is a gene containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 or a homolog thereof.
- the function-reducing mutation is a loss-of-function mutation.
- the loss-of-function mutation includes disruption of the glucokinase gene.
- CCR of the basidiomycete yeast can be alleviated by introducing a functional-reducing mutation into the glucokinase gene of the basidiomycete yeast. Therefore, it becomes possible to use inexpensive glucose as a carbon source, and it is possible to reduce the manufacturing cost of recombinant proteins.
- a photograph of colonies and clear zones formed on a polybutylene succinate adipate (PBSA)-containing plate agar medium is shown. Photographs of colonies and clear zones formed on a PBSA-containing plate agar medium are shown.
- PBSA polybutylene succinate adipate
- the basidiomycete yeast of the present invention contains a functional-reducing mutation in the glucokinase gene.
- Glucokinase as described herein is an enzyme that promotes the phosphorylation of glucose to glucose-6-phosphate.
- decreased function mutation refers to the expression of glucokinase as a protein, or by expressing a glucokinase mutant with reduced glucose phosphorylation promoting activity.
- the function-reducing mutation may be a loss-of-function mutation that substantially loses the function of glucokinase.
- the loss-of-function mutations are not particularly limited, but include, for example, mutations that result in loss of glucokinase protein expression (splicing abnormalities, frameshift mutations, deletion of part or the entire gene, or gene disruption, etc.). ), or it may be a mutation that is expressed as a protein but loses its function as glucokinase (such as a mutation accompanied by an amino acid substitution in the active site).
- the glucokinase gene can be appropriately selected depending on the type of basidiomycete yeast, but for example, the glucokinase gene can be selected depending on the type of basidiomycete yeast.
- the glucokinase gene (PaGLK1 gene) of Antactica has the following sequence shown in SEQ ID NO: 1. That is, in one embodiment, the glucokinase gene may be a gene containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 below (lowercase letters are introns) or a homolog thereof.
- basidiomycete yeast of the present invention is not particularly limited, but for example, P. Antactica, P. Afidis, P. Rugrosa, P. Paraantactica, P. Graminicola, P. Tsukubaensis, P. Flocculossa, P. hupiensis, and P. hupiensis. It may also be a bacterium of the genus Pseudozyma such as Pseudozyma chinensis. In addition, P.
- Antactica is a type of fungus of the genus Pseudozyma (yeast) that can live on the leaves of grasses such as rice and wheat, and can produce biodegradable plastic-degrading enzymes (PaE) and the like. Due to recent classification changes, P. Antactica is sometimes called Moesziomyces antarcticus.
- Promoters that are activated by the presence of specific sugars such as xylose-inducible promoters such as xylanase promoters and PaE promoters that are activated by xylose, and cellulase promoters that are activated by cellulose, can be used to express the protein of interest.
- the activity is suppressed by CCR in the presence of glucose.
- CCR is relaxed, so even if glucose is used as a carbon source for the cultured bacteria, a promoter such as the xylose-inducible promoter that is activated by the presence of a specific sugar can be used to efficiently produce the target protein.
- the basidiomycete yeast may further include a xylose-inducible promoter, and optionally may further include a base sequence encoding a protein of interest downstream of the xylose-inducible promoter.
- the target protein is not particularly limited, and may be, for example, PaE.
- the basidiomycete yeast of the present invention may further contain any mutation, as long as it does not impair the object of the present invention, or may be further subjected to another treatment to reduce CCR.
- the present invention also relates to a method for reducing the CCR of a basidiomycete yeast, which method includes the step of suppressing the glucokinase function of the basidiomycete yeast.
- the means for suppressing the glucokinase function is not particularly limited, but includes, for example, introducing a functional-reducing mutation (for example, a loss-of-function mutation) into the glucokinase gene of the basidiomycete yeast, or introducing a glucokinase gene of the basidiomycete yeast. (eg, RNAi), or addition of a glucokinase inhibitor (eg, an antibody or D-mannoheptulose) to the medium of the basidiomycete yeast.
- a glucokinase inhibitor eg, an antibody or D-mannoheptulose
- the method of reducing CCR of the present invention may further include any operation step, as long as the object of the present invention is not impaired, and may further include the step of reducing CCR by another means.
- the remaining points are as described above for the basidiomycete yeast of the present invention.
- the present invention also relates to a method for producing a protein of interest, the method comprising: (1-1) a step of preparing a basidiomycete yeast containing a functional-reducing mutation in the glucokinase gene and containing a xylose-inducible promoter and a base sequence encoding a target protein downstream thereof, or (1-2) preparing a basidiomycete yeast containing a xylose-inducible promoter and a base sequence encoding a target protein downstream thereof, and suppressing the glucokinase function of the basidiomycete yeast; (2) The step of culturing the basidiomycete yeast to express the target protein is included.
- the culturing step may include a step of culturing the basidiomycete yeast in the presence of glucose.
- the production method of the present invention may further include any operation step, as long as the object of the present invention is not impaired, and may further include a step of reducing CCR by another means.
- the remaining points are as described above regarding the basidiomycete yeast of the present invention and the method of reducing CCR of the present invention.
- PaE expression cassette 1 5'-[PaUra3 gene (marker)]-[xylanase promoter]-[PaE gene]-[xylanase terminator]-3'
- PaE expression cassette 2 5'-[PaUra3 gene upstream sequence]-[xylanase promoter]-[PaE gene]-[xylanase terminator]-[PaUra3 gene downstream sequence]-3'
- PaE expression cassette 1 was randomly introduced into 2DGr2 and 2DGr3 strains selected as CCR release strains by a conventional method using uracil auxotrophic complementation as an indicator. These were inoculated onto a PBSA-containing agar medium containing glucose, and one transformant each forming the largest clear zone was selected (2DGr2-3 strain and 2DGr3-2 strain).
- a control strain (dnU strain) having one copy of PaE expression cassette 2 and in which CCR was not released was prepared. Specifically, wild type P.
- strain, and the strain in which the PaE gene on the chromosome was replaced with the Nourseothricin resistance gene by homologous recombination was selected for Nourseothricin resistance.
- the URA3 gene on the chromosome was replaced with PaE expression cassette 2, one copy of the PaE expression cassette was integrated, and the strain became uracil auxotrophic using 5'-FOA (5'-fluoroorotic acid) resistance as an indicator.
- 5'-FOA 5'-fluoroorotic acid
- 817 strains of PGB were obtained.
- the Nourseothricin resistance gene on the chromosome was replaced with the PaUra3 gene, selection was performed by uracil auxotrophic complementation, and the resulting strain was designated as the dnU strain.
- the 2DGr2-3 strain, the 2DGr3-2 strain, and the dnU strain were each cultured for 48 hours in the following three types of liquid media containing different carbon sources.
- PaE activity was evaluated based on the biodegradable plastic decomposition activity using a PaE activity measurement method that was partially modified from the method described in Non-Patent Document 1. Specifically, 10 ⁇ L of the culture supernatant appropriately diluted with sterile water was mixed with 8 to 9 ⁇ L of a polybutylene succinate adipate (PBSA) emulsion (EM-301, manufactured by Showa Denko K.K.) diluted to 3% w/v.
- PBSA polybutylene succinate adipate
- EM-301 manufactured by Showa Denko K.K.
- the PaE activity (i.e., the amount of PaE produced) in the medium decreases in 4X4G medium, and in 1X7G medium compared to 8X medium. It decreased by more than 75%.
- the 2DGr2-3 strain and the 2DGr3-2 strain were able to produce PaE in the same way even when the carbon source was changed.
- the PaE activity (ie, the amount of PaE produced) in the medium was overall high. This indicates that by using the CCR release strain, genes inserted downstream of the xylanase promoter can be expressed with high efficiency even in a medium containing a high concentration of glucose.
- the deduced amino acid sequence of XP_014656502.1 shows higher identity (39%) with Saccharomyces cerevisiae glucokinase (Glk1) than Hxk2, so XP_014653676.1 was named PaHXK1 and XP_014656502.1 was named PaGLK1.
- XP_014656502.1 was named PaGLK1.
- the cells were further cultured for 24 hours, and the PaE activity in the culture supernatant was measured in the same manner as in Item 2 above.
- PaE activity was increased in the PaGlk1 gene-disrupted strain compared to the control strain (Table 3). This showed that PaGLK1 is involved in CCR.
- the PaUra3 gene was replaced with the mutant PaGlk1 gene of the 2DGr2 strain by a conventional method to produce a mutant PaGLK1-introduced strain.
- a PaGLK1-disrupted strain U was created by removing the PaUra3 gene from the PaGlk1 gene-disrupted strain using a conventional method.
- the PGB817 strain, the PaGLK1-disrupted strain U, and the mutant PaGLK1 introduced strain share a common genetic background in that they are uracil-requiring mutant strains that do not contain the PaUra3 gene and have one copy of the PaE expression cassette.
- the PGB817 strain which has the wild-type PaGlk1 gene, formed a clear zone in a glucose-free medium and did not form a clear zone in a glucose-containing medium, whereas the PaGLK1-disrupted-U strain and the mutant PaGLK1-introduced strain The strain formed clear zones in both media, with and without glucose. As described above, the CCR released by disruption of the PaGlk1 gene was not recovered by the introduction of the mutant PaGlk1 gene, indicating that the mutant PaGlk1 gene had lost its function.
- a normal PaGLK1 gene was introduced into the 2DGr2-3 strain and 2DGr3-2 strain by a conventional method to create a normal PaGLK1 reintroduction strain.
- the 2DGr2-3 strain, the 2DGr3-2 strain, and their normal PaGLK1 reintroduction strain were transplanted and cultured on a PBSA-containing plate agar medium containing 4% xylose and 4% glucose.
- the outer diameter of the transparent area (clear zone) generated by decomposition and the diameter of the colony were measured.
- a photograph of the medium after culture is shown in Figure 2.
- the 2DGr2-3 strain and the 2DGr3-2 strain (parent strain P) formed a clear clear zone, but these normal PaGLK1 reintroduced strains (+PaGLK1) hardly formed a clear zone. That is, the normal PaGLK1-reintroduced strain was unable to produce PaE in the presence of glucose, and its PBSA degrading activity was reduced. This indicates that the high PaE production ability of the 2DGr2-3 and 2DGr3-2 strains is due to the mutation in the PaGlk1 gene.
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Abstract
本発明は、Ｐ．アンタクティカなどの担子菌酵母において、炭素カタボライト抑制を低減させた変異体を提供することを目的としている。 本発明は、グルコキナーゼ遺伝子に機能低下型変異を含む、担子菌酵母に関している。また、本発明は、担子菌酵母の炭素カタボライト抑制を低減する方法であって、前記担子菌酵母のグルコキナーゼの機能を抑制する工程を含む方法にも関している。
Description
本発明は、担子菌酵母及び担子菌酵母の炭素カタボライト抑制を低減する方法に関する。
微生物はタンパク質を生産するために使用されている。一般的には、遺伝子の発現を促すプロモーター配列の下流に目的のタンパク質をコードする遺伝子を連結して作製した組換え遺伝子を、微生物に導入して培養することにより、当該目的のタンパク質を取得する。これまでに実用化されている微生物を宿主に用いたタンパク質発現系には、原核微生物を用いる系と、真核微生物を用いる系があり、前者においては、大腸菌、ブレビバチルス、及びコリネバクテリウムなど、多様な原核微生物が使用されている。一方、後者においては、出芽酵母又は麹菌、あるいはシュードザイマ・アンタクティカ（Ｐｓｅｕｄｏｚｙｍａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）などの担子菌酵母（特許文献１及び２並びに非特許文献１）を、目的のタンパク質の生産のために使用することが知られている。
また、微生物の培地中にグルコースなどの代謝されやすい炭素源があるときに、他の代謝されにくい炭素源（キシロースなど）の分解系の遺伝子発現を抑制する機構を炭素カタボライト抑制（ＣＣＲ）という。このＣＣＲに関して、グルコースの構造アナログである２－デオキシグルコース（２ＤＧ）は、グルコースによる抑制に対して抵抗性の変異の選択のために用いられている（非特許文献２）。そして、非特許文献３には、出芽酵母においてはヘキソキナーゼの１種であるＨxｋ２が、麹菌においてはグルコキナーゼが、それぞれＣＣＲを制御している旨が記載されており、特許文献３には、ＣｒｅＡ及びＣｒｅＢが麹菌などの糸状菌のＣＣＲを制御している旨が記載されている。他方、担子菌酵母のＣＣＲを制御する酵素については、いずれの文献にも記載されていない。
Sameshima-Yamashita Y, et al., Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry (2019), 83:8, 1547-1556
McCartney et al., Genetics (2014), 198: 635-646
田中瑞己, 生物工学 (2020), Vol. 98, No. 4, pp. 186-190
Ｐ．アンタクティカ由来のキシロース誘導性プロモーター（キシラナーゼプロモーター）は、生分解性プラスチック分解酵素ＰａＥなどのタンパク質を、Ｐ．アンタクティカによって生産するために使用されているが、安価な炭素源であるグルコースを含む培地ではＣＣＲによりプロモーター機能が制限されてしまう。そこで、本発明は、Ｐ．アンタクティカなどの担子菌酵母において、ＣＣＲが緩和された変異体を提供することを目的としている。
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、担子菌酵母のグルコキナーゼがＣＣＲを制御していることを見出し、本発明を完成させた。すなわち、本発明は、以下に示す担子菌酵母及び担子菌酵母の炭素カタボライト抑制を低減する方法を提供するものである。
〔１〕グルコキナーゼ遺伝子に機能低下型変異を含む、担子菌酵母。
〔２〕シュードザイマ属の菌である、前記〔１〕に記載の担子菌酵母。
〔３〕前記グルコキナーゼ遺伝子が、配列番号１で示される塩基配列を含む遺伝子又はそのホモログである、前記〔１〕又は〔２〕に記載の担子菌酵母。
〔４〕前記機能低下型変異が、機能喪失型変異である、前記〔１〕～〔３〕のいずれか１項に記載の担子菌酵母。
〔５〕前記機能喪失型変異が、前記グルコキナーゼ遺伝子の破壊を含む、前記〔４〕に記載の担子菌酵母。
〔６〕キシロース誘導性プロモーターと、その下流に続く目的のタンパク質をコードする塩基配列とをさらに含む、前記〔１〕～〔５〕のいずれか１項に記載の担子菌酵母。
〔７〕担子菌酵母の炭素カタボライト抑制を低減する方法であって、前記担子菌酵母のグルコキナーゼの機能を抑制する工程を含む、方法。
〔８〕前記担子菌酵母が、シュードザイマ属の菌である、前記〔７〕に記載の方法。
〔９〕前記抑制工程が、グルコキナーゼ遺伝子に機能低下型変異を導入する工程を含む、前記〔７〕又は〔８〕に記載の方法。
〔１０〕前記グルコキナーゼ遺伝子が、配列番号１で示される塩基配列を含む遺伝子又はそのホモログである、前記〔９〕に記載の方法。
〔１１〕前記機能低下型変異が、機能喪失型変異である、前記〔９〕又は〔１０〕に記載の方法。
〔１２〕前記機能喪失型変異が、前記グルコキナーゼ遺伝子の破壊を含む、前記〔１１〕に記載の方法。
〔１〕グルコキナーゼ遺伝子に機能低下型変異を含む、担子菌酵母。
〔２〕シュードザイマ属の菌である、前記〔１〕に記載の担子菌酵母。
〔３〕前記グルコキナーゼ遺伝子が、配列番号１で示される塩基配列を含む遺伝子又はそのホモログである、前記〔１〕又は〔２〕に記載の担子菌酵母。
〔４〕前記機能低下型変異が、機能喪失型変異である、前記〔１〕～〔３〕のいずれか１項に記載の担子菌酵母。
〔５〕前記機能喪失型変異が、前記グルコキナーゼ遺伝子の破壊を含む、前記〔４〕に記載の担子菌酵母。
〔６〕キシロース誘導性プロモーターと、その下流に続く目的のタンパク質をコードする塩基配列とをさらに含む、前記〔１〕～〔５〕のいずれか１項に記載の担子菌酵母。
〔７〕担子菌酵母の炭素カタボライト抑制を低減する方法であって、前記担子菌酵母のグルコキナーゼの機能を抑制する工程を含む、方法。
〔８〕前記担子菌酵母が、シュードザイマ属の菌である、前記〔７〕に記載の方法。
〔９〕前記抑制工程が、グルコキナーゼ遺伝子に機能低下型変異を導入する工程を含む、前記〔７〕又は〔８〕に記載の方法。
〔１０〕前記グルコキナーゼ遺伝子が、配列番号１で示される塩基配列を含む遺伝子又はそのホモログである、前記〔９〕に記載の方法。
〔１１〕前記機能低下型変異が、機能喪失型変異である、前記〔９〕又は〔１０〕に記載の方法。
〔１２〕前記機能喪失型変異が、前記グルコキナーゼ遺伝子の破壊を含む、前記〔１１〕に記載の方法。
本発明に従えば、担子菌酵母のグルコキナーゼ遺伝子に機能低下型変異を導入することにより、当該担子菌酵母のＣＣＲを緩和することができる。したがって、安価なグルコースを炭素源とすることが可能となり、組換えタンパク質の製造コストの低減を図ることができる。
以下、本発明をさらに詳細に説明する。
本発明の担子菌酵母は、グルコキナーゼ遺伝子に機能低下型変異を含んでいる。本明細書に記載の「グルコキナーゼ」とは、グルコースからグルコース－６－リン酸へのリン酸化を促進する酵素である。本明細書に記載の「機能低下型変異」とは、グルコキナーゼのタンパク質としての発現を低下させたり、グルコースのリン酸化促進活性が低下したグルコキナーゼ変異体を発現させたりすることにより、前記担子菌酵母においてグルコキナーゼとしての機能の低下を引き起こす変異のことをいう。ある態様では、前記機能低下型変異は、グルコキナーゼの機能を実質的に失う機能喪失型変異であってもよい。前記機能喪失型変異としては、特に限定されないが、例えば、グルコキナーゼのタンパク質の発現が失われるような変異（スプライシング異常、フレームシフト変異、又は遺伝子の一部若しくは全体の欠失、あるいは遺伝子破壊など）であってもいいし、タンパク質としては発現するがグルコキナーゼとしての機能が失われるような変異（活性部位でのアミノ酸置換を伴う変異など）であってもよい。
本発明の担子菌酵母は、グルコキナーゼ遺伝子に機能低下型変異を含んでいる。本明細書に記載の「グルコキナーゼ」とは、グルコースからグルコース－６－リン酸へのリン酸化を促進する酵素である。本明細書に記載の「機能低下型変異」とは、グルコキナーゼのタンパク質としての発現を低下させたり、グルコースのリン酸化促進活性が低下したグルコキナーゼ変異体を発現させたりすることにより、前記担子菌酵母においてグルコキナーゼとしての機能の低下を引き起こす変異のことをいう。ある態様では、前記機能低下型変異は、グルコキナーゼの機能を実質的に失う機能喪失型変異であってもよい。前記機能喪失型変異としては、特に限定されないが、例えば、グルコキナーゼのタンパク質の発現が失われるような変異（スプライシング異常、フレームシフト変異、又は遺伝子の一部若しくは全体の欠失、あるいは遺伝子破壊など）であってもいいし、タンパク質としては発現するがグルコキナーゼとしての機能が失われるような変異（活性部位でのアミノ酸置換を伴う変異など）であってもよい。
背景技術の項で上述したように、出芽酵母ではＨｘｋ２がＣＣＲを制御していること、及び、麹菌ではグルコキナーゼ、又はＣｒｅＡ及びＣｒｅＢがＣＣＲを制御していることが知られており（非特許文献３及び特許文献３を参照）、ＣＣＲを制御しているタンパク質は、微生物の種類によって異なっている。すなわち、グルコキナーゼのＣＣＲへの関与は、特定の微生物においてしか知られておらず、またグルコキナーゼ以外にもＣＣＲを制御するタンパク質は知られていたので、出芽酵母とも麹菌とも異なる担子菌酵母においてＣＣＲを制御しているタンパク質を特定することは困難であった。本発明では、意外なことに、担子菌酵母においてはグルコキナーゼがＣＣＲに関与していること、及び、グルコキナーゼの機能を低下させることがＣＣＲの緩和に十分であることが明らかになった。
グルコキナーゼ遺伝子は、担子菌酵母の種類に応じて適宜選択することができるが、例えば、担子菌酵母であるＰ．アンタクティカのグルコキナーゼ遺伝子（ＰａＧＬＫ１遺伝子）は、配列番号１で示される以下の配列を有している。すなわち、ある態様では、前記グルコキナーゼ遺伝子は、以下の配列番号１で示される塩基配列（小文字はイントロン）を含む遺伝子又はそのホモログであってもよい。
本発明の担子菌酵母の種類は、特に限定されないが、例えば、Ｐ．アンタクティカ、Ｐ．アフィディス、Ｐ．ルグローサ、Ｐ．パラアンタクティカ、Ｐ．グラミニコラ、Ｐ．ツクバエンシス、Ｐ．フロキュロッサ、Ｐ．ヒューピエンシス、及びＰ．シャンシエンシスなどのシュードザイマ属の菌であってもよい。なお、Ｐ．アンタクティカは、イネやムギなどのイネ科植物の葉面に生息し得るシュードザイマ属菌（酵母）の一種であり、生分解性プラスチック分解酵素（ＰａＥ）などを産生し得るものである。最近の分類変更により、Ｐ．アンタクティカは、モエスジオマイセス・アンタクティクス（Ｍｏｅｓｚｉｏｍｙｃｅｓ ａｎｔａｒｃｔｉｃｕｓ）と呼ばれることもある。
特定の糖の存在により活性化するプロモーター、例えば、キシロースで活性化するキシラナーゼプロモーター及びＰａＥプロモーターなどのキシロース誘導性プロモーターや、セルロースで活性化するセルラーゼプロモーターなどは、目的のタンパク質の発現のために利用されているが、グルコースの存在下ではＣＣＲにより活性が抑制される。本発明の担子菌酵母においては、ＣＣＲが緩和されているため、たとえ培養する菌の炭素源としてグルコースを使用していても、前記キシロース誘導性プロモーターなどの特定の糖の存在により活性化するプロモーターを利用して、効率的に目的のタンパク質を生産することができる。すなわち、ある態様では、前記担子菌酵母は、キシロース誘導性プロモーターをさらに含んでもよく、任意で、当該キシロース誘導性プロモーターの下流に目的のタンパク質をコードする塩基配列をさらに含んでもよい。前記目的のタンパク質は、特に限定されないが、例えば、ＰａＥであってもよい。
本発明の担子菌酵母は、本発明の目的を損なわない限り、任意の変異をさらに含んでもよく、ＣＣＲを低減するための別の処理をさらに受けたものであってもよい。
別の態様では、本発明は、担子菌酵母のＣＣＲを低減する方法にも関しており、当該方法は、前記担子菌酵母のグルコキナーゼの機能を抑制する工程を含んでいる。前記グルコキナーゼの機能を抑制する手段は、特に制限されないが、例えば、前記担子菌酵母のグルコキナーゼ遺伝子への機能低下型変異（例えば機能喪失型変異）の導入、前記担子菌酵母のグルコキナーゼ遺伝子の発現抑制（例えばＲＮＡｉなど）、又は、前記担子菌酵母の培地中へのグルコキナーゼ阻害剤（例えば抗体又はＤ－マンノヘプツロースなど）の添加などであってもよい。
本発明のＣＣＲを低減する方法は、本発明の目的を損なわない限り、任意の操作工程をさらに含んでもよく、別の手段によりＣＣＲを低減する工程をさらに含んでもよい。その余の点については、本発明の担子菌酵母について上述したとおりである。
また別の態様では、本発明は、目的のタンパク質の生産方法にも関しており、当該方法は、
（１－１）グルコキナーゼ遺伝子に機能低下型変異を含み、かつ、キシロース誘導性プロモーター及びその下流に目的のタンパク質をコードする塩基配列を含む担子菌酵母を用意する工程、又は、
（１－２）キシロース誘導性プロモーター及びその下流に目的のタンパク質をコードする塩基配列を含む担子菌酵母を用意し、前記担子菌酵母のグルコキナーゼの機能を抑制する工程と、
（２）前記担子菌酵母を培養して、目的のタンパク質を発現させる工程と
を含んでいる。前記工程（２）で用いる担子菌酵母においては、ＣＣＲが緩和されているため、培養時の炭素源としてグルコースを採用することができる。すなわち、ある態様では、前記培養工程は、前記担子菌酵母をグルコース存在下で培養する工程を含んでもよい。
（１－１）グルコキナーゼ遺伝子に機能低下型変異を含み、かつ、キシロース誘導性プロモーター及びその下流に目的のタンパク質をコードする塩基配列を含む担子菌酵母を用意する工程、又は、
（１－２）キシロース誘導性プロモーター及びその下流に目的のタンパク質をコードする塩基配列を含む担子菌酵母を用意し、前記担子菌酵母のグルコキナーゼの機能を抑制する工程と、
（２）前記担子菌酵母を培養して、目的のタンパク質を発現させる工程と
を含んでいる。前記工程（２）で用いる担子菌酵母においては、ＣＣＲが緩和されているため、培養時の炭素源としてグルコースを採用することができる。すなわち、ある態様では、前記培養工程は、前記担子菌酵母をグルコース存在下で培養する工程を含んでもよい。
本発明の生産方法は、本発明の目的を損なわない限り、任意の操作工程をさらに含んでもよく、別の手段によりＣＣＲを低減する工程をさらに含んでもよい。その余の点については、本発明の担子菌酵母及び本発明のＣＣＲを低減する方法について上述したとおりである。
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明の範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
１．炭素カタボライト抑制が解除された変異株の取得
炭素カタボライト抑制（ＣＣＲ）が解除される変異を見出すため、Ｐ．アンタクティカのウラシル要求性自然変異株（ＰＧＢ３７１株）に紫外線を照射し、グルコースの構造アナログである２－デオキシグルコース（２ＤＧ）を含むキシロース培地で生育可能な菌株を選抜した。２ＤＧは細胞内においてリン酸化されて２ＤＧ－６－リン酸を生じるが、これは炭素源として代謝されないだけでなく、ＣＣＲを引き起こすことで他の炭素源の代謝を阻害する。そのため、２ＤＧを含むキシロース培地では、炭素カタボライト抑制が解除された株のみが生育可能である。具体的には、０．１％の２ＤＧを添加したキシロース培地で生育可能なＰＧＢ３７１株の変異株を選抜し、ＣＣＲが緩和されているか否かを調べた。野生型Ｐ．アンタクティカでは、生分解性プラスチック分解酵素ＰａＥの遺伝子（ＰａＥプロモーターの制御下）の発現がＣＣＲを受けることから、グルコースを含むＰＢＳＡ含有平板寒天培地（３ｘＦＭＭ－０．５％ＰＢＳＡエマルジョン、１％グルコース、及び１％キシロース寒天培地）に２ＤＧ耐性株を植菌し、ＰＢＳＡの分解によって生じる透明の領域（クリアゾーン）の形成を比較した。なお、ＰＢＳＡ含有平板寒天培地については、要すれば特許文献２を参照されたい。
炭素カタボライト抑制（ＣＣＲ）が解除される変異を見出すため、Ｐ．アンタクティカのウラシル要求性自然変異株（ＰＧＢ３７１株）に紫外線を照射し、グルコースの構造アナログである２－デオキシグルコース（２ＤＧ）を含むキシロース培地で生育可能な菌株を選抜した。２ＤＧは細胞内においてリン酸化されて２ＤＧ－６－リン酸を生じるが、これは炭素源として代謝されないだけでなく、ＣＣＲを引き起こすことで他の炭素源の代謝を阻害する。そのため、２ＤＧを含むキシロース培地では、炭素カタボライト抑制が解除された株のみが生育可能である。具体的には、０．１％の２ＤＧを添加したキシロース培地で生育可能なＰＧＢ３７１株の変異株を選抜し、ＣＣＲが緩和されているか否かを調べた。野生型Ｐ．アンタクティカでは、生分解性プラスチック分解酵素ＰａＥの遺伝子（ＰａＥプロモーターの制御下）の発現がＣＣＲを受けることから、グルコースを含むＰＢＳＡ含有平板寒天培地（３ｘＦＭＭ－０．５％ＰＢＳＡエマルジョン、１％グルコース、及び１％キシロース寒天培地）に２ＤＧ耐性株を植菌し、ＰＢＳＡの分解によって生じる透明の領域（クリアゾーン）の形成を比較した。なお、ＰＢＳＡ含有平板寒天培地については、要すれば特許文献２を参照されたい。
大きなクリアゾーンを形成した７株を選抜し、グルコース及びキシロースを炭素源とした液体培地で培養し、炭素カタボライト抑制を受けるキシラナーゼの生産量をＳＤＳ－ＰＡＧＥにより比較した。その結果、グルコースが存在してもキシラナーゼの生産量が低下しない２ＤＧｒ２株及び２ＤＧｒ３株の２株をＣＣＲ解除株として選抜した。
２．ＣＣＲ解除株におけるキシラナーゼプロモーターの働き
ＣＣＲの影響を受けることが知られているキシラナーゼプロモーターが、ＣＣＲ解除株ではグルコース存在下でも機能するかどうか確認するため、Ｐ．アンタクティカのＰａＥ遺伝子をレポーター遺伝子とする試験系を構築した。具体的には、キシラナーゼプロモーター、ＰａＥ遺伝子（ＰａＣＬＥ１）、その上流配列及び下流配列、遺伝子導入の選抜マーカーとしてＰ．アンタクティカのＵｒａ３遺伝子（ウラシルなどのピリミジン合成経路の遺伝子ＰａＵＲＡ３）、その上流配列及び下流配列、並びに、キシラナーゼターミネーターを組み合わせて、次の二種類のＰａＥ発現カセットを作製した。
＊ＰａＥ発現カセット１の構造
５’－［ＰａＵｒａ３遺伝子（マーカー）］－［キシラナーゼプロモーター］－［ＰａＥ遺伝子］－［キシラナーゼターミネーター］－３’
＊ＰａＥ発現カセット２の構造
５’－［ＰａＵｒａ３遺伝子上流配列］－［キシラナーゼプロモーター］－［ＰａＥ遺伝子］－［キシラナーゼターミネーター］－［ＰａＵｒａ３遺伝子下流配列］－３’
ＣＣＲの影響を受けることが知られているキシラナーゼプロモーターが、ＣＣＲ解除株ではグルコース存在下でも機能するかどうか確認するため、Ｐ．アンタクティカのＰａＥ遺伝子をレポーター遺伝子とする試験系を構築した。具体的には、キシラナーゼプロモーター、ＰａＥ遺伝子（ＰａＣＬＥ１）、その上流配列及び下流配列、遺伝子導入の選抜マーカーとしてＰ．アンタクティカのＵｒａ３遺伝子（ウラシルなどのピリミジン合成経路の遺伝子ＰａＵＲＡ３）、その上流配列及び下流配列、並びに、キシラナーゼターミネーターを組み合わせて、次の二種類のＰａＥ発現カセットを作製した。
＊ＰａＥ発現カセット１の構造
５’－［ＰａＵｒａ３遺伝子（マーカー）］－［キシラナーゼプロモーター］－［ＰａＥ遺伝子］－［キシラナーゼターミネーター］－３’
＊ＰａＥ発現カセット２の構造
５’－［ＰａＵｒａ３遺伝子上流配列］－［キシラナーゼプロモーター］－［ＰａＥ遺伝子］－［キシラナーゼターミネーター］－［ＰａＵｒａ３遺伝子下流配列］－３’
ＰａＥ発現カセット１を、ＣＣＲ解除株として選抜した２ＤＧｒ２株及び２ＤＧｒ３株に、ウラシル要求性相補を指標として常法によりランダムに導入した。これらを、グルコースを含むＰＢＳＡ含有寒天培地に植菌し、最も大きなクリアゾーンを形成する形質転換体をそれぞれ１株ずつ選抜した（２ＤＧｒ２－３株及び２ＤＧｒ３－２株）。また、コントロール用に、ＰａＥ発現カセット２を１コピー有するＣＣＲが解除されていないコントロール株（ｄｎＵ株）を作製した。具体的には、野生型Ｐ．アンタクティカＧＢ－４（０）株のＰａＥ遺伝子上流配列、Ａｓｈｂｙａ ｇｏｓｓｙｐｉｉのＴＥＦ１プロモーターとターミネーターの間にＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｎｏｕｒｓｅｉのｎａｔ１を挿入したＮｏｕｒｓｅｏｔｈｒｉｃｉｎ耐性遺伝子、ＰａＥ遺伝子下流配列を組合せたＤＮＡカセットをＧＢ－４（０）株に導入し、相同組換えにより染色体上のＰａＥ遺伝子をＮｏｕｒｓｅｏｔｈｒｉｃｉｎ耐性遺伝子と置換した株を、Ｎｏｕｒｓｅｏｔｈｒｉｃｉｎ耐性によって選抜を行った。次に、染色体上のＵＲＡ３遺伝子をＰａＥ発現カセット２で置換して１コピーのＰａＥ発現カセットを組み込み、５’－ＦＯＡ（５’－フルオロオロチン酸）耐性を指標としてウラシル要求性となった株を選抜し、ＰＧＢ８１７株を得た。上記の手順で作製されたＰＧＢ８１７株を宿主として、染色体上のＮｏｕｒｓｅｏｔｈｒｉｃｉｎ耐性遺伝子をＰａＵｒａ３遺伝子と置換し、ウラシル要求性相補によって選抜を行い、得られた株をｄｎＵ株とした。そして、２ＤＧｒ２－３株、２ＤＧｒ３－２株、及びｄｎＵ株を、炭素源の異なる以下の３種類の液体培地でそれぞれ４８時間培養した。
（１）８質量％キシロース（８Ｘ）
（２）４質量％キシロース＋４質量％グルコース（４Ｘ４Ｇ）
（３）１質量％キシロース＋７質量％グルコース（１Ｘ７Ｇ）
（１）８質量％キシロース（８Ｘ）
（２）４質量％キシロース＋４質量％グルコース（４Ｘ４Ｇ）
（３）１質量％キシロース＋７質量％グルコース（１Ｘ７Ｇ）
（ＰａＥ活性の測定方法）
ＰａＥ活性は、その生分解性プラスチック分解活性に基づき、非特許文献１に記載の方法を一部改良したＰａＥ活性測定法によって評価した。具体的には、滅菌水で適宜希釈した培養上清１０μＬを、３％ｗ／ｖに希釈されたポリブチレンサクシネートアジペート（ＰＢＳＡ）のエマルジョン（ＥＭ－３０１、昭和電工株式会社製）８～９μＬ、ＨＥＰＥＳ緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．３）７５μＬ、及び滅菌水５６～５７μＬと、９６穴マイクロプレート（プロテオセーブ(R)ＳＳ、住友ベークライト株式会社製）中で混合してＯＤ６６０（濁度）が０．８となる１５０μＬの反応液を調製し、ディープウェルプレートミキサーを用いて３０℃、９００ｒｐｍで振盪した。そして、反応後のＯＤ６６０（濁度）を測定して単位時間当たりの濁度減少量を測定し、１分間に反応溶液のＯＤ６６０を１減少させる酵素活性を１Ｕ／ｍＬと定義し、ＰａＥ活性値を算出した。その結果を表１に示す。なお、括弧内は８質量％キシロースを含む液体培地で培養したときの培養上清の活性値を基準とした相対活性を示す。
ＰａＥ活性は、その生分解性プラスチック分解活性に基づき、非特許文献１に記載の方法を一部改良したＰａＥ活性測定法によって評価した。具体的には、滅菌水で適宜希釈した培養上清１０μＬを、３％ｗ／ｖに希釈されたポリブチレンサクシネートアジペート（ＰＢＳＡ）のエマルジョン（ＥＭ－３０１、昭和電工株式会社製）８～９μＬ、ＨＥＰＥＳ緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．３）７５μＬ、及び滅菌水５６～５７μＬと、９６穴マイクロプレート（プロテオセーブ(R)ＳＳ、住友ベークライト株式会社製）中で混合してＯＤ６６０（濁度）が０．８となる１５０μＬの反応液を調製し、ディープウェルプレートミキサーを用いて３０℃、９００ｒｐｍで振盪した。そして、反応後のＯＤ６６０（濁度）を測定して単位時間当たりの濁度減少量を測定し、１分間に反応溶液のＯＤ６６０を１減少させる酵素活性を１Ｕ／ｍＬと定義し、ＰａＥ活性値を算出した。その結果を表１に示す。なお、括弧内は８質量％キシロースを含む液体培地で培養したときの培養上清の活性値を基準とした相対活性を示す。
ＣＣＲが解除されていないコントロールのｄｎＵ株は、８Ｘ培地ではＰａＥを産生することができるものの、４Ｘ４Ｇ培地では培地中のＰａＥ活性（すなわちＰａＥの産生量）は低下し、１Ｘ７Ｇ培地では８Ｘ培地と比較して７５％以上低下した。これに対して、２ＤＧｒ２－３株及び２ＤＧｒ３－２株は、炭素源が変わっても同じようにＰａＥを産生することができた。しかも、２ＤＧｒ２－３株及び２ＤＧｒ３－２株には上記ＰａＥ発現カセットが複数コピー導入されているため、培地中のＰａＥ活性（すなわちＰａＥの産生量）が全体的に高かった。このことから、ＣＣＲ解除株を用いれば、グルコースを高濃度に含む培地においてもキシラナーゼプロモーターにより、その下流に挿入した遺伝子を高い効率で発現させることができることが示された。
３．ＣＣＲの解除に寄与する変異遺伝子の同定
（１）変異体の遺伝子のシーケンシング
出芽酵母では、ヘキソキナーゼの１種であるＨｘｋ２遺伝子の変異体で炭素カタボライト抑制が解除されることが知られている（非特許文献３）。そこで、Ｐ．アンタクティカＪＣＭ１０３１７株のゲノム上を探索すると、出芽酵母のＨｘｋ２のアミノ酸配列と相同性を示す配列が２つ存在していることが分かった。ＸＰ＿０１４６５３６７６．１の推定アミノ酸配列は、Ｈｘｋ２のアミノ酸配列に対して４４％の同一性を示し、ＸＰ＿０１４６５６５０２．１は３６％の同一性を示す。ＸＰ＿０１４６５６５０２．１の推定アミノ酸配列は、Ｈｘｋ２よりも出芽酵母のグルコキナーゼ（Ｇｌｋ１）とより高い同一性（３９％）を示すため、ＸＰ＿０１４６５３６７６．１をＰａＨＸＫ１、ＸＰ＿０１４６５６５０２．１をＰａＧＬＫ１と命名した。２ＤＧｒ２株と２ＤＧｒ３株におけるこれらの遺伝子配列を調べた結果、いずれもＰａＨｘｋ１遺伝子には変異が存在せず、ＰａＧｌｋ１遺伝子に変異が存在していることが分かった。具体的な変異は以下のとおりだった。
（１）変異体の遺伝子のシーケンシング
出芽酵母では、ヘキソキナーゼの１種であるＨｘｋ２遺伝子の変異体で炭素カタボライト抑制が解除されることが知られている（非特許文献３）。そこで、Ｐ．アンタクティカＪＣＭ１０３１７株のゲノム上を探索すると、出芽酵母のＨｘｋ２のアミノ酸配列と相同性を示す配列が２つ存在していることが分かった。ＸＰ＿０１４６５３６７６．１の推定アミノ酸配列は、Ｈｘｋ２のアミノ酸配列に対して４４％の同一性を示し、ＸＰ＿０１４６５６５０２．１は３６％の同一性を示す。ＸＰ＿０１４６５６５０２．１の推定アミノ酸配列は、Ｈｘｋ２よりも出芽酵母のグルコキナーゼ（Ｇｌｋ１）とより高い同一性（３９％）を示すため、ＸＰ＿０１４６５３６７６．１をＰａＨＸＫ１、ＸＰ＿０１４６５６５０２．１をＰａＧＬＫ１と命名した。２ＤＧｒ２株と２ＤＧｒ３株におけるこれらの遺伝子配列を調べた結果、いずれもＰａＨｘｋ１遺伝子には変異が存在せず、ＰａＧｌｋ１遺伝子に変異が存在していることが分かった。具体的な変異は以下のとおりだった。
（２）ＰａＧｌｋ１遺伝子の破壊
ＰａＧｌｋ１のＣＣＲへの関与を調べるため、ＰａＥ発現カセットが１コピー導入されているＰＧＢ８１７株のＰａＧｌｋ１遺伝子を常法によりＰａＵｒａ３遺伝子に置換することで、ＰａＧｌｋ１遺伝子破壊株を作製した。そして、コントロール株（ｄｎＵ株）又はＰａＧｌｋ１遺伝子破壊株を、８質量％のグルコースを含む培地で２４時間培養した後、培地量に対して１質量％のキシロース及び３質量％のグルコースを新たに添加してさらに２４時間培養し、その培養上清中のＰａＥ活性を上記項目２と同様にして測定した。その結果、ＰａＧｌｋ１遺伝子破壊株では、コントロール株と比較してＰａＥ活性が増加した（表３）。このことから、ＰａＧＬＫ１がＣＣＲに関与していることが示された。
ＰａＧｌｋ１のＣＣＲへの関与を調べるため、ＰａＥ発現カセットが１コピー導入されているＰＧＢ８１７株のＰａＧｌｋ１遺伝子を常法によりＰａＵｒａ３遺伝子に置換することで、ＰａＧｌｋ１遺伝子破壊株を作製した。そして、コントロール株（ｄｎＵ株）又はＰａＧｌｋ１遺伝子破壊株を、８質量％のグルコースを含む培地で２４時間培養した後、培地量に対して１質量％のキシロース及び３質量％のグルコースを新たに添加してさらに２４時間培養し、その培養上清中のＰａＥ活性を上記項目２と同様にして測定した。その結果、ＰａＧｌｋ１遺伝子破壊株では、コントロール株と比較してＰａＥ活性が増加した（表３）。このことから、ＰａＧＬＫ１がＣＣＲに関与していることが示された。
（３）変異ＰａＧｌｋ１遺伝子の導入
ＰａＧｌｋ１遺伝子破壊株において、ＰａＵｒａ３遺伝子を、常法により２ＤＧｒ２株の変異ＰａＧｌｋ１遺伝子と置換し、変異ＰａＧＬＫ１導入株を作製した。また、ＰａＧｌｋ１遺伝子破壊株のＰａＵｒａ３遺伝子を常法により除去することでＰａＧＬＫ１破壊―Ｕ株を作製した。ＰＧＢ８１７株、ＰａＧＬＫ１破壊―Ｕ株、及び変異ＰａＧＬＫ１導入株は、ＰａＵｒａ３遺伝子を含まないウラシル要求性変異株であって、ＰａＥ発現カセットを１コピー有しているという点で共通の遺伝的バックグラウンドを有している一方、野生型ＰａＧｌｋ１遺伝子を有しているか、ＰａＧｌｋ１遺伝子を有していないか、又は変異ＰａＧｌｋ１遺伝子を有しているという点でのみ相違している。これらの３種類の菌株を、２質量％キシロースを含む（グルコースを含まない）ＰＢＳＡ含有平板寒天培地（２Ｘ）又は１％キシロース及び１質量％グルコースを含むＰＢＳＡ含有平板寒天培地（１Ｘ１Ｇ）にそれぞれ移植して培養し、産生されたＰａＥの働きによってＰＢＳＡが分解されて生じる透明の領域（クリアゾーン）の外延の直径及びコロニーの直径をそれぞれ測定した。培養後の培地の写真を図１に示し、各直径の測定結果を表４に示す。
ＰａＧｌｋ１遺伝子破壊株において、ＰａＵｒａ３遺伝子を、常法により２ＤＧｒ２株の変異ＰａＧｌｋ１遺伝子と置換し、変異ＰａＧＬＫ１導入株を作製した。また、ＰａＧｌｋ１遺伝子破壊株のＰａＵｒａ３遺伝子を常法により除去することでＰａＧＬＫ１破壊―Ｕ株を作製した。ＰＧＢ８１７株、ＰａＧＬＫ１破壊―Ｕ株、及び変異ＰａＧＬＫ１導入株は、ＰａＵｒａ３遺伝子を含まないウラシル要求性変異株であって、ＰａＥ発現カセットを１コピー有しているという点で共通の遺伝的バックグラウンドを有している一方、野生型ＰａＧｌｋ１遺伝子を有しているか、ＰａＧｌｋ１遺伝子を有していないか、又は変異ＰａＧｌｋ１遺伝子を有しているという点でのみ相違している。これらの３種類の菌株を、２質量％キシロースを含む（グルコースを含まない）ＰＢＳＡ含有平板寒天培地（２Ｘ）又は１％キシロース及び１質量％グルコースを含むＰＢＳＡ含有平板寒天培地（１Ｘ１Ｇ）にそれぞれ移植して培養し、産生されたＰａＥの働きによってＰＢＳＡが分解されて生じる透明の領域（クリアゾーン）の外延の直径及びコロニーの直径をそれぞれ測定した。培養後の培地の写真を図１に示し、各直径の測定結果を表４に示す。
野生型ＰａＧｌｋ１遺伝子を有しているＰＧＢ８１７株は、グルコースを含まない培地ではクリアゾーンを形成し、グルコースを含む培地ではクリアゾーンを形成しなかったのに対し、ＰａＧＬＫ１破壊―Ｕ株及び変異ＰａＧＬＫ１導入株は、グルコースの有無にかかわらず、いずれの培地でもクリアゾーンを形成した。このように、ＰａＧｌｋ１遺伝子の破壊によって解除されたＣＣＲは変異ＰａＧｌｋ１遺伝子の導入によっては回復しなかったことから、変異ＰａＧｌｋ１遺伝子は機能を喪失していることが示された。
また、ＰＧＢ８１７株、ＰａＧＬＫ１破壊―Ｕ株、及び変異ＰａＧＬＫ１導入株を、８質量％のグルコースを含む培地で２４時間培養した後、遠心分離により培地を除き、各菌体を４質量％キシロースを含む液体培地（４Ｘ）又は１質量％キシロース及び３質量％グルコースを含む液体培地（１Ｘ３Ｇ）に移し替え、さらに２４時間培養した。そして、上記項目２と同様にして、各培養上清のＰａＥ活性を測定した。結果を表５に示す。なお、括弧内は４質量％キシロースの液体培地で培養したときの培養上清の活性値を基準とした相対活性を示す。
固体培養のときと同様に、液体培養においても、ＰａＧｌｋ１遺伝子の破壊によってＣＣＲが解除され、この状態は変異ＰａＧｌｋ１遺伝子の導入によっては回復しないことが確認された。
（４）正常ＰａＧｌｋ１遺伝子の導入
２ＤＧｒ２－３株及び２ＤＧｒ３－２株に対して、常法により正常なＰａＧｌｋ１遺伝子を導入して、正常ＰａＧＬＫ１再導入株を作製した。２ＤＧｒ２－３株及び２ＤＧｒ３－２株並びにこれらの正常ＰａＧＬＫ１再導入株を、４％キシロース及び４％グルコースを含むＰＢＳＡ含有平板寒天培地にそれぞれ移植して培養し、産生されたＰａＥの働きによってＰＢＳＡが分解されて生じる透明の領域（クリアゾーン）の外延の直径及びコロニーの直径をそれぞれ測定した。培養後の培地の写真を図２に示す。
２ＤＧｒ２－３株及び２ＤＧｒ３－２株に対して、常法により正常なＰａＧｌｋ１遺伝子を導入して、正常ＰａＧＬＫ１再導入株を作製した。２ＤＧｒ２－３株及び２ＤＧｒ３－２株並びにこれらの正常ＰａＧＬＫ１再導入株を、４％キシロース及び４％グルコースを含むＰＢＳＡ含有平板寒天培地にそれぞれ移植して培養し、産生されたＰａＥの働きによってＰＢＳＡが分解されて生じる透明の領域（クリアゾーン）の外延の直径及びコロニーの直径をそれぞれ測定した。培養後の培地の写真を図２に示す。
２ＤＧｒ２－３株及び２ＤＧｒ３－２株（親株Ｐ）は、明確なクリアゾーンを形成したが、これらの正常ＰａＧＬＫ１再導入株（＋ＰａＧＬＫ１）は、クリアゾーンをほとんど形成しなかった。すなわち、正常ＰａＧＬＫ１再導入株は、グルコース存在下ではＰａＥを産生することができず、ＰＢＳＡ分解活性が低下した。このことから、２ＤＧｒ２－３株及び２ＤＧｒ３－２株のＰａＥ高生産能は、ＰａＧｌｋ１遺伝子の変異に起因することが示された。
以上より、担子菌酵母のグルコキナーゼ遺伝子に機能低下型変異を導入することにより、当該担子菌酵母のＣＣＲを低減することができることが分かった。したがって、安価なグルコースを炭素源とすることが可能となり、組換えタンパク質の製造コストの低減を図ることができる。
Claims (12)
- グルコキナーゼ遺伝子に機能低下型変異を含む、担子菌酵母。
- シュードザイマ属の菌である、請求項１に記載の担子菌酵母。
- 前記グルコキナーゼ遺伝子が、配列番号１で示される塩基配列を含む遺伝子又はそのホモログである、請求項１又は２に記載の担子菌酵母。
- 前記機能低下型変異が、機能喪失型変異である、請求項１～３のいずれか１項に記載の担子菌酵母。
- 前記機能喪失型変異が、前記グルコキナーゼ遺伝子の破壊を含む、請求項４に記載の担子菌酵母。
- キシロース誘導性プロモーターと、その下流に続く目的のタンパク質をコードする塩基配列とをさらに含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の担子菌酵母。
- 担子菌酵母の炭素カタボライト抑制を低減する方法であって、前記担子菌酵母のグルコキナーゼの機能を抑制する工程を含む、方法。
- 前記担子菌酵母が、シュードザイマ属の菌である、請求項７に記載の方法。
- 前記抑制工程が、グルコキナーゼ遺伝子に機能低下型変異を導入する工程を含む、請求項７又は８に記載の方法。
- 前記グルコキナーゼ遺伝子が、配列番号１で示される塩基配列を含む遺伝子又はそのホモログである、請求項９に記載の方法。
- 前記機能低下型変異が、機能喪失型変異である、請求項９又は１０に記載の方法。
- 前記機能喪失型変異が、前記グルコキナーゼ遺伝子の破壊を含む、請求項１１に記載の方法。
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Non-Patent Citations (4)
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| GUZMÁN SILVIA, CARMONA ALONSO, ESCALANTE LAURA, IMRISKOVA IVETA, LÓPEZ RUTH, RODRÍGUEZ-SANOJA ROMINA, RUIZ BEATRIZ, SERVÍN-GONZÁLE: "Pleiotropic effect of the SCO2127 gene on the glucose uptake, glucose kinase activity and carbon catabolite repression in Streptomyces peucetius var. caesius", MICROBIOLOGY, SOCIETY FOR GENERAL MICROBIOLOGY, READING, vol. 151, no. 5, 1 May 2005 (2005-05-01), Reading , pages 1717 - 1723, XP093094422, ISSN: 1350-0872, DOI: 10.1099/mic.0.27557-0 * |
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| TANAKA, TAKUMI; MIURA, ATSUHIRO; TANAKA, MIZUKI; KITAMOTO, HIROKO: "4C08-02 Identification and functional analysis of the C2H2 transcription factor Mig1 from the basidiomycetous yeast Pseudozyma antarctica", PROCEEDINGS OF THE 2022 ANNUAL MEETING OF JAPAN SOCIETY FOR BIOSCIENCE, BIOTECHNOLOGY, AND AGROCHEMISTRY (JSBBA 2022); MARCH 15-18, 2022, 5 March 2022 (2022-03-05) - 18 March 2022 (2022-03-18), pages 1095, XP009549367 * |
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