KR20130142900A

KR20130142900A - ＨｐＧＡＳ1 유전자 파쇄 효모 균주 및 이를 이용한 재조합 단백질의 생산 방법

Info

Publication number: KR20130142900A
Application number: KR1020130045467A
Authority: KR
Inventors: 권오석; 황동현; 오두병
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2012-06-19
Filing date: 2013-04-24
Publication date: 2013-12-30
Also published as: KR101498012B1

Abstract

본 발명은 신규 유전자를 파손시켜 단백질 분비능을 향상시킨 변이 균주를 외래 재조합 단백질 생산에 이용하기 위한 방법에 관한 것으로, 더욱 구체적으로는 한세눌라 폴리모르파 유전체 염기서열을 탐색하여 베타-1,3-글루카노실트랜스글라이코실레이즈 활성을 가지는 Gas1 단백질을 암호화하는 HpGAS 유전자 후보군을 확보하였으며, 그 중 신규한 유전자(HpGAS1)를 확인하고 해당 유전자를 결실시켜 그 기능을 검증한 결과 세포 형태 변화, 세포벽 합성 저해제 감수성 증대, 및 총 단백질 분비량이 증대되며, 재조합 단백질 분비량이 현격히 증대됨을 확인하였으므로, 외래 재조합 단백질의 분비생산, 정제 및 수확을 위한 자원으로서 유용하게 이용될 수 있다.

Description

ＨｐＧＡＳ1 유전자 파쇄 효모 균주 및 이를 이용한 재조합 단백질의 생산 방법{HpGAS1 gene deleted yeasts and methods of producing recombinant proteins using them}

본 발명은 신규 유전자를 파손시켜 단백질 분비능을 향상시킨 변이 균주 및 상기 변이 균주를 이용한 외래 재조합 단백질 생산 방법에 관한 것이다.

단백질 의약품 개발은 1970년대에 유전자 재조합 기술이 보편화됨에 따라 시작되었다. 특히, 생산량이 한정된 호르몬, 항체, 백신 및 생체기능성 단백질과 같은 유용 단백질을 미생물 숙주세포에서 대량 생산하여 의약품으로 개발하는 재조합 단백질 의약품 생산기술은 미생물을 세포공장(Cell factory)으로 활용하는 대표적인 미생물 이용기술로 부상하고 있으며, 인류의 보건 복지가 향상됨에 따라 난치성 질환의 치료를 위한 고순도의 단백질성 의약품에 대한 수요가 기하급수적으로 증가되고 있어, 저렴한 비용으로 대량생산이 가능한 미생물 발현시스템을 이용한 재조합 의약품 생산기술 개발은 미래 의약산업의 성장에 크게 기여할 것으로 예측되고 있다. 초기 단백질 의약품은 인체 조직 또는 혈액에서 분리하는 경우가 있었으나, HIV와 간염바이러스를 비롯한 바이러스 감염 문제, 잠재적인 암 유발 인자의 잔류 가능성 등과 같은 심각한 문제들 때문에 현재 이들은 재조합 의약품으로 바뀌고 있으며, 고비용 기술인 동물세포에서 생산하는 경우에도 여전히 바이러스와 광우병의 원인이 되는 프라이온 등의 오염 가능성 문제가 남기 때문에 안전하다고 여겨지는 GRAS(generally recognized as safe) 미생물을 이용한 경제성 높은 재조합 단백질의 대량생산 기술개발의 중요성이 부각되고 있다. 미생물 활용 재조합 의약용 단백질 개발 분야의 경우 생산기술의 근간이 되는 신규 고발현 시스템 개발, 유전체 정보 기반의 고기능 숙주세포 재설계, 고성능 생산 균주의 대량 배양에 관한 분자생물공정 기술 개발 등이 국제시장 개방과 함께 국가 경쟁력 강화를 위한 중요한 분야로 대두되고 있다.

재조합 단백질 생산 기술은 비교적 최근에 발달한 유전자 재조합 기술을 통하여 고등생물 유래의 유전자를 다양한 미생물로부터 대량 발현 생산하여 자연적으로 생산량이 한정된 고부가가치 의료용 단백질을 비교적 저렴한 비용으로 생산하는 기술로서 앞으로 난치성 질환의 증가와 국민 의료 수준의 제고에 따라 고 순도의 단백질성 의약품의 수요가 급증할 것으로 예상되고 있다. 따라서 인체에 무해한 다양한 미생물을 이용하여 신 기능성 재조합 단백질을 비교적 저렴한 비용으로 대량 생산할 수 있는 기술개발 연구가 필요한 실정이다. 효모를 숙주세포로 이용한 재조합 단백질생산 연구는 주로 전통효모 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)를 이용하였으나 효율적인 외래단백질 발현을 위한 강력한 프로모터의 부재 또는 장시간 발효시에 야기되는 플라스미드의 불안정성 등의 이유로 재조합 단백질의 생산효율이 떨어지며, 고농도 배양시 fed-batch 발효(fermentation)가 필요하고, 발현된 이종 단백질들이 하이퍼글라이코실레이션(hyperglycosylation) 된다는 점에서 비적절한 숙주로 간주되고 있다(Romanos, et al., Yeast, 8, 423, 1992). 이와 같은 단점을 보완하는 외래단백질 발현 시스템이 메탄올 자화 효모인 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)에서 개발되었으며(Sudbery et al., Yeast, 10, 1707, 1994 ; Cregg et al., Bio/Technol. 5, 479, 1987), 최근에는 또다른 메탄올 자화 효모인 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha)를 이용한 이종 단백질 발현 시스템의 개발 연구가 활발히 진행되고 있다(Oh et al., Biotechnol. J. 3, 1, 2008; Gellissen et al., Bio/Technol. 9, 291, 1991; Janowicz et al., Yeast 7, 431, 1991). 새로운 대체숙주효모 중의 하나인 메탄올 자화 효모 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha)는 값싼 원료물질인 메탄올을 탄소원으로 이용하여 비교적 쉽게 고농도 배양이 가능하며, 메탄올 대사에 관련된 몇 가지 유전자 유래의 강력한 프로모터가 존재한다. 또한, 외래 유전자를 숙주세포의 염색체 DNA에 다중도입(multicopy integration)할 수 있어 고농도 배양 중에도 안정하게 유지되는 장점이 있다.

이에, 본 발명자들은 외래 재조합 단백질의 생산에 유리한 기존의 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha) 균주의 단백질 분비 생산을 더욱 증가시키기 위하여 세포벽 구성 및 투과성 결정에 중요한 신규한 베타-1,3-글루카노실트랜스글라이코실레이즈(beta-1,3-glucanosyltransglycosylase) 활성을 가지는 HpGAS1 유전자를 확보하였으며, 상기 유전자 결손시 외래 재조합 단백질 분비능이 증가함을 확인하였으므로, 이를 통해 본 발명의 HpGAS1 유전자가 단일 결손된 한세눌라 폴리모르파 변이 균주가 의약용 재조합 단백질의 분비 생산을 위한 자원으로서 유용하게 이용될 수 있음을 밝힘으로써, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 서열번호 1로 기재되는 HpGAS1 유전자가 결손된 단백질 분비능이 향상된 기탁번호 KCTC12220BP의 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha) 변이 균주를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 단백질 분비능이 향상된 효모 균주의 제조 방법을 제공하는 것이다.

아울러, 본 발명의 또 다른 목적은 외래 재조합 단백질 생산 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1로 기재되는 HpGAS1 유전자가 결손된 단백질 분비능이 향상된 기탁번호 KCTC12220BP의 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha) 변이 균주를 제공한다.

또한, 본 발명은 단백질 분비능이 향상된 효모 균주의 제조 방법을 제공한다.

아울러, 본 발명은 외래 재조합 단백질 생산 방법을 제공한다.

본 발명의 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha)의 베타-1,3-글루카노실트랜스글라이코실레이즈(beta-1,3-glucanosyltransglycosylase)를 코딩하는 신규한 유전자 HpGAS1을 단일 결손시킨 한세눌라 폴리모르파 균주는 세포의 형태가 변화했으며, 세포벽 합성 저해제에 대한 감수성이 증대되었고, 총 단백질 분비량이 증대됨을 확인하였으며, 특히, 재조합 단백질의 분비량 및 활성이 현격히 향상됨을 확인하였으므로, 외래 재조합 단백질의 분비생산, 정제 및 수확에 유리하여 재조합 단백질의 생산을 위한 자원으로서 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 서열번호 1로 기재되는 HpGAS1 유전자의 서열을 NCBI의 BLAST를 이용하여 상동성을 검색한 결과이다.
도 2는 서열번호 2로 기재되는 HpGAS2 유전자의 서열을 NCBI의 BLAST를 이용하여 상동성을 검색한 결과이다.
도 3은 ScGas1 도메인을 통해 HpGas1 도메인을 비교 분석한 도이다:
*: Potential N-glycosylation 위치;
△: GPI 부착 위치(GPI attachment sites);
▲: Strictly conserved residues in the catalytic domain;
1-22: Signal sequence;
23-332: β-(1,3)-glucan transferase domain (GluTD);
370-462: 8 Cys-region;
485-525: Ser-rich region; 및
537-559: 소수성 부위(Hydrophobic region).
도 4는 HpURA3 유전자 파쇄 카세트의 제작 과정을 나타내는 도이다.
도 5는 HpGAS1 유전자 파쇄 카세트의 제작 과정을 나타내는 도이다.
도 6은 HpGAS2 유전자 파쇄 카세트의 제작 과정을 나타내는 도이다.
도 7은 HpGAS1, HpGAS2 및 ScGAS1 유전자를 클로닝한 한세눌라 폴리모르파용 벡터와 사카로마이세스 세레비지애용 벡터이다:
1: 한세눌라 폴리모르파용 벡터(pDLGUK):
2: 사카로마이세스 세레비지애용 벡터(YEp352ScGAPDHpt).
도 8은 HpGAS1 및 HpGAS2 단일 결손 변이주의 세포 형태적 특징을 보여주는 사진이다:
A: 2% 포도당 최소 배지에서 48 시간 동안 배양한 후 2000 배율의 공초점현미경으로 확인한 사진;
B: 2% 포도당 복합 배지에서 48 시간 동안 배양한 후 2000 배율의 공초점현미경으로 확인한 사진;
C: 2% 포도당 복합 배지에서 48 시간 동안 배양한 후 1000 배율의 광학현미경으로 확인한 사진;
1: 한세눌라 폴리모르파 야생형 균주(H. polymorpha DL1);
2: HpGAS1 유전자가 결손된 한세눌라 폴리모르파 균주(H. polymorpha DL1 ΔHpGAS1); 및
3: HpGAS2 유전자가 결손된 한세눌라 폴리모르파 균주(H. polymorpha DL1 ΔHpGAS2).
도 9는 HpGAS1 및 HpGAS2 단일 결손 변이 균주, 및 유전자 회복 균주의 생리적 특징을 확인한 사진이다:
A: 2% 포도당 복합 배지(37℃);
B: 2% 포도당 복합 배지(42℃);
C: Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) - 2% 포도당 복합 배지;
D: Congo Red (CR) - 2% 포도당 복합 배지;
E: Calcofluor White (CFW) - 2% 포도당 복합 배지;
1: 한세눌라 폴리모르파 DL1 야생형 균주(H. polymorpha DL1);
2: HpGAS1 유전자가 결손된 한세눌라 폴리모르파 균주(H. polymorpha DL1 ΔHpGAS1);
3: HpGAS2 유전자가 결손된 한세눌라 폴리모르파 균주(H. polymorpha DL1 ΔHpGAS2);
4: HpGAS1 발현벡터(pDLGUK-HpGAS1)로 형질전환된 HpGAS1 유전자가 결손된 한세눌라 폴리모르파 균주(H. polymorpha DL1 ΔHpGAS1 ΔURA3/pDLGUK-HpGAS1);
5: HpGAS2 발현벡터(pDLGUK-HpGAS2)로 형질전환된 HpGAS1 유전자가 결손된 한세눌라 폴리모르파 균주(H. polymorpha DL1 ΔHpGAS1 ΔURA3/pDLGUK-HpGAS2);
6: ScGAS1 발현벡터(pDLGUK-ScGAS1)로 형질전환된 HpGAS1 유전자가 결손된 한세눌라 폴리모르파 균주(H. polymorpha DL1 ΔHpGAS1 ΔURA3/pDLGUK-ScGAS1); 및
7: 대조군인 공벡터(pDLGUK)로 형질전환된 HpGAS1 유전자가 결손된 한세눌라 폴리모르파 균주(H. polymorpha DL1 ΔHpGAS1 ΔURA3/pDLGUK).
도 10은 HpGAS1 및 HpGAS2 단일 결손 변이 균주에서의 총 단백질 분비량을 비교한 그래프이다:
A: 한세눌라 폴리모르파 DL1 야생형 균주(H. polymorpha DL1);
B: HpGAS1을 결손시킨 DL1 균주(H. polymorpha DL1 ΔHpGAS1); 및
C: HpGAS2를 결손시킨 DL1 균주(H. polymorpha DL1 ΔHpGAS2).
도 11은 HpGAS1 및 HpGAS2 단일 결손 변이 균주에서 Glucose oxidase (GOD) 분비량을 비교한 사진이다:
M: 단백질 크기 표지
1: 야생형 GOD 생산균주[H. polymorpha/pDLMOX-GOD(H)];
2: HpGAS1을 결손시킨 GOD 생산균주[H. polymorpha ΔHpGAS1/pDLMOX-GOD(H)]; 및
3: HpGAS2를 결손시킨 GOD 생산균주[H. polymorpha ΔHpGAS2/pDLMOX-GOD(H)].
도 12는 HpGAS1 및 HpGAS2 단일 결손 변이주에서 분비된 Glucose oxidase (GOD) 활성을 비교한 그래프이다:
1: 야생형 GOD 생산균주 [H. polymorpha/pDLMOX-GOD(H)];
2: HpGAS1을 결손시킨 GOD 생산균주[H. polymorpha ΔHpGAS1/pDLMOX-GOD(H)]; 및
3: HpGAS2를 결손시킨 GOD 생산균주[H. polymorpha ΔHpGAS2/pDLMOX-GOD(H)].
도 13은 HpGAS1 및 HpGAS2 단일 결손 변이 균주에서 Human serum albumin (HSA) 분비량을 비교한 사진이다:
M: 단백질 크기 표지
1: 야생형 HSA 생산균주(H. polymorpha G3T8);
2: HpGAS1을 결손시킨 HSA 생산균주(H. polymorpha G3T8 ΔHpGAS1); 및
3: HpGAS2를 결손시킨 HSA 생산균주(H. polymorpha G3T8 ΔHpGAS2).
도 14는 HpGAS1 유전자 파쇄된 균주의 HpURA3을 결손시키는 과정을 나타내는 도이다.
도 15는 ScGAS1 유전자가 결손된 사카로마이세스 세레비지애균주(S. cerevisiae BY4741 ΔScGAS1)에서 HpGAS1 및 HpGAS2 유전자 발현벡터를 형질전환한 균주의 생리적 특징을 확인한 사진이다:
A: 2% 포도당 복합배지;
B: Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) - 2% 갈락토오즈 및 1% 라피노오즈 복합 배지;
C: Congo Red (CR) - 2% 갈락토오즈 및 1% 라피노오즈 최소 배지;
1: 사카로마이세스 세레비지애 야생형균주(S. cerevisiae BY4741);
2: ScGAS1 유전자가 결손된 사카로마이세스 세레비지애 균주(S. cerevisiae BY4741 ΔScGAS1);
3: HpGAS1 발현 벡터 (YEp352ScGAPDHpt-HpGAS1) 로 형질전환된 ScGAS1 유전자가 결손된 사카로마이세스 세레비지애 균주(S. cerevisiae BY4741 ΔScGAS1/YEp352ScGAPDHpt-HpGAS1);
4: HpGAS2 발현벡터(YEp352ScGAPDHpt-HpGAS2)로 형질전환된 ScGAS1 유전자가 결손된 사카로마이세스 세레비지애 균주(S. cerevisiae BY4741 ΔScGAS1/YEp352ScGAPDHpt-HpGAS2); 및
5: 대조군인 공벡터(YEp352ScGAPDHpt)로 형질전환된 ScGAS1 유전자가 결손된 사카로마이세스 세레비지애 균주(S. cerevisiae BY4741 ΔScGAS1/YEp352ScGAPDHpt).

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 서열번호 1로 기재되는 HpGAS1 유전자가 결손된 단백질 분비능이 향상된 기탁번호 KCTC12220BP의 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha) 변이 균주를 제공한다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 한세눌라 폴리모르파 DL1 유전체 정보 데이터베이스에서 다른 효모의 Gas1 단백질과 아미노산 서열이 유사한 단백질을 번역하는 HpGAS 유전자 후보들을 확보하였다. 그 결과 2 종의 한세눌라 폴리모파 유전자들(HpGAS1, HpGAS2)이 타 효모의 Gas1 단백질과 아미노산 서열 상동성이 높은 단백질을 번역하는 것으로 분석되었다 (도 1과 2 참조). 그 중 사카로마이세스 세레비지애의 ScGas1 단백질의 아미노산 서열과 더 높은 상동성을 갖는 단백질을 번역하는 신규한 서열의 HpGAS1 유전자 번역하는 단백질의 아미노산 서열에 여러 Gas1 단백질에 보존적인 아미노산 서열 및 활성 도메인이 존재함을 확인하였다(도 3 참조). HpGAS1 및 HpGAS2 유전자가 파쇄된 균주를 선별하기 위하여 우선, URA3 파쇄 카세트로 한세눌라 폴리모르파의 URA3 유전자를 파쇄한 뒤, HpGAS1 및 HpGAS2 유전자 파쇄 카세트를 이용한 상동재조합을 통해 한세눌라 폴리모르파 균주의 HpGAS1 및 HpGAS2 유전자를 각각 파쇄하였다. HpGAS1 및 HpGAS2 유전자가 파쇄된 한세눌라 폴리모르파 돌연변이 균주들의 특성을 비교 분석한 결과 HpGAS1 파쇄 균주만이 GAS1 유전자 파쇄 균주의 특성을 보였다. HpGAS1 유전자가 파쇄된 한세눌라 폴리모르파 균주에서 총 단백질 분비량이 증가함을 확인하였으며(도 10 참조), 외래 재조합 단백질인glucose oxidase (GOD) (Kim et al., Glycobiology. 14, 243, 2004)및 human serum albumin (HSA) (Kang et al., Biotechnol Bioeng. 76, 175, 2001)를 분비생산하는 균주의 HpGAS1 유전자를 파쇄한 결과 해당 재조합 단백질의 분비량이 현격하게 증가함을 확인할 수 있었다(도 11, 도 12 및 도 13 참조). 아울러, 상기 HpGAS1 유전자 발현 벡터를 형질전환하여 HpGAS1 결손 돌연변이를 회복시킨 경우, 유전자 파쇄시 관찰된 감수성 배지에서의 생장 저하가 복원되는 것을 알 수 있었다(도 9 및 도 15 참조). 따라서, HpGAS1 유전자를 파쇄한 한세눌라 폴리모르파 균주의 단백질 분비능의 향상은 HpGAS1 유전자의 단일 결실에 의한 것임을 재차 확인할 수 있었다.

본 발명은

1) URA3 유전자 파쇄 카세트를 상동재조합을 통해 효모 균주에 도입하는 단계; 및

2) 상기 균주에 HpGAS1 유전자 파쇄 카세트를 상동재조합을 통해 도입하는 단계를 포함하는 단백질 분비능이 향상된 효모 균주의 제조 방법을 제공한다.

상기 URA3 유전자 파쇄 카세트는 HpURA3 유전자의 N 말단 절편, HpURA3 유전자의 C 말단 절편 및 Zeocin 저항성 유전자 (Zeo^R) 카세트를 이용하여 제작한 파쇄카세트인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 HpGAS1 유전자 파쇄 카세트는 서열번호 1로 기재되는 염기서열로 구성되는 HpGAS1 유전자의 N 말단 절편, HpGAS1 유전자의 C 말단 절편 및 lacZ-HpURA3-lacZ 카세트의 N-말단 절편, lacZ-HpURA3-lacZ 카세트의 C-말단 절편 를 이용하여 제작한 파쇄 카세트인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 유전자 파쇄를 구별할 수 있도록 URA3 유전자를 파쇄하기 위하여, HpURA3 유전자의 N 말단 절편, HpURA3 유전자의 C 말단 절편 및 Zeocin 저항성 유전자 (Zeo^R) 카세트를 이용하여 URA3 파쇄 카세트를 제작하여 한세눌라 폴리모르파 균주에 형질전환한 후 상동재조합 방법으로 염색체상의 해당 유전자를 파쇄하였다(도 4 참조). URA3 유전자가 파쇄된 균주에 HpGAS1 유전자의 N 말단 절편, HpGAS1 유전자의 C 말단 절편 및 lacZ-HpURA3-lacZ 카세트의 N-말단 절편, lacZ-HpURA3-lacZ 카세트의 C-말단 절편을 이용하여 제작한 파쇄카세트를 형질전환하여 HpGAS1 유전자가 파쇄된 균주를 제작하였으며(도 5 참조), HpGAS1 유전자가 파쇄된 균주의 단백질 분비능이 향상됨을 확인하였다. 이를 통해, 기존의 한세눌라 폴리모르파 야생형 균주 및 특정 재조합 단백질을 분비하는 야생형의 재조합 한세눌라 폴리모르파 균주의 HpGAS1 유전자를 파쇄함으로써 단백질 분비가 월등히 증가한 한세눌라 폴리모르파 균주를 제작할 수 있었다.

본 발명은

1) HpGAS1 유전자가 파쇄된 상기 변이 균주에 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터를 도입시켜 재조합 효모 균주를 제조하는 단계; 및

2) 상기 재조합 효모 균주를 배양하는 단계를 포함하는 외래 재조합 단백질 생산 방법을 제공한다.

상기 재조합 효모 균주는 사카로마이세스(Saccharomyces), 클루베로마이세스(Kluyveromyces), 피키아(Pichia), 한세눌라(Hansenula) 또는 캔디다(Candida)속으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하며, 한세눌라 폴리모르파 균주인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 외래 재조합 생산 방법은 생물반응기(bioreactor)를 이용하여 상기 변이주를 대량 배양하는 단계를 추가로 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 glucose oxidase(GOD) 또는 인간 혈청 알부민(HSA)을 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터가 도입되어 외래 재조합 단백질을 생산하는 GOD 생산균주 및 HSA 생산균주의 HpGAS1 또는 HpGAS2 유전자를 파쇄시킨 뒤 배양한 결과, 특히 HpGAS1 유전자 파쇄의 경우 상기 외래 재조합 단백질의 분비능이 월등히 증가하였으며, 생산된 단백질의 활성 또한 증가함을 확인하였다(도 11, 도 12 및 도 13). 따라서, 본 발명의 HpGAS1 유전자를 단일 파쇄시킨 한세눌라 폴리모르파 균주를 외래 재조합 단백질의 생산을 위한 자원으로서 유용하게 이용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의하여 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> HpGAS1 및 HpGAS2 유전자 발굴 및 분석

본 발명자들은 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha)의 유전체 정보 해독 및 검색을 통하여 HpGAS1 유전자를 발굴하였다.

구체적으로, 미국 국립생물정보센터(NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)에서 다른 효모의 Gas1 단백질의 아미노산 서열정보(PpGas1, ZbGas1, ScGas1 단백질)를 확보한 뒤, 본 발명자들이 구축한 한세눌라 폴리모르파 DL1 유전체 정보 데이터베이스에서 tblastn 프로그램을 통해 Gas1 단백질과 유사한 아미노산 서열을 갖는 단백질을 번역하는 5가지의 HpGAS 유전자 후보를 확보하였다. 그 중 상동성이 높은 두 유전자를 다른 효모 Gas1 단백질과 아미노산 서열의 상동성을 비교 및 선별하여 HpGAS1 유전자(서열번호 1) 및 HpGAS2 유전자(서열번호 2)라고 명명하였다(표 1). 그 후, 상기 HpGAS1 및 HpGAS2 유전자의 염기 서열을 BLAST로 확인한 결과, 신규한 유전자임을 알 수 있었다(도 1 및 2). 또한, 상기 HpGAS1 유전자의 아미노산 서열을 웹에서 이용 가능한 소프트웨어(ClustalW-XXL , http://www.ch.embnet.org/software/ClustalW-XXL.html)을 이용하여 이미 도메인 구조가 알려진 ScGas1의 아미노산 서열과 상동성을 분석하여 HpGas1 단백질에도 보존적인 아미노산 서열 및 활성 도메인이 존재함을 확인하였다(도 3).

< 실시예 2> HpGAS1 및 HpGAS2 단일 유전자 파쇄 균주 제작

<2-1> URA3 파쇄 균주 제작

본 발명자들은 한세눌라 폴리모르파 균주의 URA3 유전자를 파쇄하여 영양요구주로 만들기 위하여 URA3 파쇄 카세트로 URA3 유전자 절편 사이에 Zeocin 저항성 유전자(Zeo^R) 를 클로닝하였다.

구체적으로, 한세눌라 폴리모르파 DL1 균주로부터 분리한 염색체 DNA를 주형으로 하여 프라이머 HpURA3_N_Forward(서열번호 3) 및 HpURA3_N_Reverse_ZRF (서열번호 4)를 이용하여 HpURA3의 N-말단 절편(499 bp)을 얻었으며, HpURA3_C_Forward_ZRR (서열번호 5) 및 HpURA3_C_Reverse(서열번호 6)를 이용하여 HpURA3의 C-말단 절편(441 bp)을 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 통해 얻었다. 또한, pPICZalphaA 벡터를 주형으로 하여 Zeo resistance_Forward (서열번호 7) 및 Zeo resistance_Reverse (서열번호 8)를 이용하여 Zeocin 저항성 유전자 (Zeo^R) 카세트(1192 bp)를 중합효소 연쇄 반응을 통해 얻었다. Fusion PCR 방법을 통해 상기 제작한 HpURA3의 N-말단 절편, Zeocin 저항성 유전자 (Zeo^R) 카세트 및 HpURA3의 C-말단 절편을 이용하여 URA3 파쇄 카세트를 제작하였다. URA3 파쇄 카세트를 야생형 한세눌라 폴리모르파 균주(H. polymorpha DL1), Glucose oxidase (GOD) 생산 재조합 균주[H. polymorpha/pDLMOX-GOD(H)] 및 Human serum albumin (HSA)생산 재조합 균주(H. polymorpha G3T8)에 각각 상동재조합을 통해 도입하여 Zeocin 배지에서 생존가능한 URA3 유전자가 파쇄된 돌연변이 균주를 얻었다(도 4).

<2-2> HpGAS1 파쇄 균주 제작

본 발명자들은 HpGAS1 유전자가 결손된 파쇄 균주를 제작하기 위하여 GAS1 파쇄 카세트를 제작하여 URA3 유전자가 파쇄된 실시예 <2-1>의 돌연변이 균주에 도입하였다.

구체적으로, 한세눌라 폴리모르파 DL1 균주로부터 분리한 염색체 DNA를 주형으로 하여 HpGAS1_N_Forward (서열번호 9) 및 HpGAS1_N_Reverse_LUF(서열번호 10)를 이용하여 HpGAS1의 N-말단 절편(537 bp)을 얻었으며, HpGAS1_C_Forward_LUR(서열번호 11) 및 HpGAS1_C_Reverse (서열번호 12)를 이용하여 HpGAS1의 C-말단절편(524 bp)을 중합효소 연쇄반응(PCR)을 통해 얻었다. pLacUR3를 주형 (Kim et al., J Biol Chem. 281, 6261, 2006)으로 프라이머 쌍 HplacZ_URA3_N_Forward (서열번호 24)와 HplacZ_URA3_N_Reverse (서열번호 25)를 이용하여 lacZ-HpURA3-lacZ 카세트의 N-말단 절편을, HplacZ_URA3_C_Forward (서열번호 26)와 HplacZ_URA3_C_Reverse (서열번호 27)를 이용하여 lacZ-HpURA3-lacZ 카세트의 C-말단 절편을 중합효소 연쇄반응을 통해 얻었다. HpGAS1의 N-말단절편, lacZ-HpURA3-lacZ 카세트의 N-말단 절편을 fusion PCR을 통해 GAS1 파쇄 카세트_N-말단 절편을 얻고, lacZ-HpURA3-lacZ 카세트의 C-말단 절편, HpGAS1의 C-말단절편을 fusion PCR을 통해 GAS1 파쇄 카세트_C-말단 절편을 얻었다(도 5). 제작한 GAS1 파쇄 카세트_N-말단 절편과 GAS1 파쇄 카세트_C-말단 절편을 상기 실시예 <2-1>에서 제작한 URA3 유전자가 파쇄된 균주 각각에 상동재조합을 통해 도입하여 SC-URA 최소 배지에서 생존할 수 있는 HpGAS1 유전자가 파쇄된 돌연변이주를 얻었다.

<2-3> HpGAS2 파쇄 균주 제작

본 발명자들은 HpGAS2 유전자가 결손된 파쇄 균주를 제작하기 위하여 GAS2 파쇄 카세트를 제작하여 실시예 <2-1>의 URA3 유전자가 파쇄된 돌연변이주에 도입하였다.

구체적으로, 한세눌라 폴리모르파 DL1 균주로부터 분리한 염색체 DNA를 주형으로 하여 HpGAS2_N_Forward (서열번호 13) 및 HpGAS2_N_Reverse_LUF(서열번호 14)를 이용하여 HpGAS2의 N-말단 절편(537 bp)을 얻었으며, HpGAS2_C_Forward_LUR (서열번호 15) 및 HpGAS2_C_Reverse (서열번호 16)를 이용하여 HpGAS2의 C-말단절편(524 bp)을 중합효소 연쇄반응(PCR)을 통해 얻었다. pLacUR3를 주형으로 프라이머 쌍 HplacZ_URA3_N_Forward (서열번호 24)와 HplacZ_URA3_N_Reverse (서열번호 25)를 이용하여 lacZ-HpURA3-lacZ 카세트의 N-말단 절편을, HplacZ_URA3_C_Forward (서열번호 26)와 HplacZ_URA3_C_Reverse (서열번호 27)를 이용하여 lacZ-HpURA3-lacZ 카세트의 C-말단 절편을 중합효소 연쇄반응을 통해 얻었다. HpGAS2의 N-말단절편, lacZ-HpURA3-lacZ 카세트의 N-말단 절편을 fusion PCR을 통해 GAS2 파쇄 카세트_N-말단 절편을 얻고, lacZ-HpURA3-lacZ 카세트의 C-말단 절편, HpGAS2의 C-말단절편을 fusion PCR을 통해 GAS2 파쇄 카세트_C-말단 절편을 얻었다(도 6). 제작한 GAS2 파쇄 카세트_N-말단 절편과 GAS2 파쇄 카세트_C-말단 절편을 상기 실시예 <2-1>에서 제작한 URA3 유전자가 파쇄된 균주 각각에 상동재조합을 통해 도입하여 SC-URA 최소 배지에서 생존할 수 있는 HpGAS2 유전자가 파쇄된 돌연변이주를 얻었다.

<실험예 1> 유전자 파쇄 변이주의 특성 확인

<1-1> HpGAS1 또는 HpGAS2 파쇄 균주의 형태학적 특징 확인

본 발명자들은 상기 <실시예 2>에서 제작한 HpGAS1 유전자 파쇄 균주 및 HpGAS2 유전자 파쇄 균주의 형태적 특징을 확인하기 위하여 공초점 현미경과 광학 현미경으로 한세눌라 폴리모르파 야생형 DL1 균주와 비교하였다.

구체적으로, 한세눌라 폴리모르파 야생형 DL1 균주, HpGAS1 유전자 파쇄 균주 및 HpGAS2 유전자 파쇄 균주들을 각각 3 ml 포도당 2% 복합 배지에 200 rpm으로 37℃에서 16시간 동안 전 배양한 후 초기 OD₆₀₀ 값이 0.3이 되도록 50 ml 포도당 2% 복합 배지와 포도당 2% 최소 배지에 접종한 후 같은 조건으로 본 배양하였다. 48시간 뒤 정체기의 세포 배양액을 OD₆₀₀값이 10이 되도록 취한 후 13,000 rpm으로 10분 동안 4℃에서 원심분리한 후 상등액을 제거하고 세포를 얻었다. 상기 세포를 1xPBS로 두 번 세척한 후 칼코플로어 화이트(Calcofluor White, CFW) 용액(1 mg/ml) 100 ㎕로 15분 동안 상온에서 반응시켰다. 반응 후 1xPBS로 두 번 세척하고 1xPBS 100 ㎕로 세포를 푼 뒤 슬라이드에 10 ㎕을 올려 Excitation 405 nm, Emission 420-480 nm에서 2000 배율의 공초점 현미경 및 1000 배율의 광학 현미경을 이용하여 관찰하였다(도 8). 그 결과, HpGAS1 유전자 파쇄 균주는 세포의 형태가 원형이 되었고 야생형보다 그 크기가 두 배정도 커진 것이 관찰되었으며, 세포들이 다소 덜 분리되고 서로 뭉쳐있는 것을 확인할 수 있었다. 반면, HpGAS2 유전자 파쇄 균주는 야생형과 비슷한 모양을 보였다.

<1-2> HpGAS1 또는 HpGAS2 파쇄 균주의 생리적 특성 확인

본 발명자들은 상기 <실시예 2>에서 제작한 HpGAS1 유전자 파쇄 균주 및 HpGAS2 유전자 파쇄 균주의 생리적 특징을 세포벽 저해 물질에 대한 감수성을 통해 확인하였다.

구체적으로, HpGAS1 유전자 파쇄 또는 HpGAS2 유전자 파쇄에 의해 변화된 세포벽의 구조에 따른 세포벽 합성저해제 및 삼투교란제에 대한 감수성을 확인하기 위하여, 한세눌라 폴리모르파 DL1 야생형 균주, HpGAS1 파쇄 균주 및 HpGAS2 파쇄 균주들을 각각 3 ml 포도당 2% 복합 배지에 200 rpm으로 37℃에서 16시간 동안 전 배양하였다. 상기 배양한 균주들을 멸균수 1 ml에 처음 OD₆₀₀ 값을 1로 시작하여 연속적으로 1/10씩 희석하여 포도당 2% 복합 한천배지, 세포벽 합성 저해제인 3% 칼코플로어 화이트(Calcofluor White, CFW), 1% 콩고레드(Congo Red, CR) 및 삼투교란제인 0.01% 도데실 황산나트륨(Sodium Dodecyl Sulfate, SDS)이 각각 포함된 포도당 2% 복합 한천 배지에 1 ㎕씩 집적하여 37℃에서 이틀 또는 삼일 동안 배양하였고, 아울러, 열 스트레스에 대한 감수성을 확인하기 위해 포도당 2% 복합 한천배지에 집적하여 42℃에서 이틀 동안 배양하였다.

그 결과, 세포벽의 구조 변화로 인해 HpGAS1 유전자 파쇄 균주는 대조군에 비해 37℃와 42℃ 포도당 2% 복합 한천배지에서 생장이 저해되었으며, 세포벽 합성 저해제 감수성 배지 및 삼투교란제 감수성 배지에서도 야생형 또는 HpGAS2 파쇄 균주에 비해 생장이 저해되고 성장속도가 느려짐을 확인할 수 있었다(도 9의 1, 2 및 3).

<실험예 2> 유전자 파쇄 변이주의 총 단백질 분비능 확인

본 발명자들은 HpGAS1 유전자 파쇄 및 HpGAS2 유전자 파쇄에 따른 세포벽의 구조 변화에 의해 총 단백질 분비량이 증가하는지 확인하기 위하여 브래드포드 분석(Bradford assay) 방법으로 확인하였다.

구체적으로, 한세눌라 폴리모르파 DL1 야생형 균주, HpGAS1 유전자 파쇄 균주 및 HpGAS2 유전자 파쇄 균주를 3 ml 포도당 2% 복합 배지에 200 rpm으로 37℃에서 16시간 동안 전 배양한 후 50 ml 포도당 2% 복합 배지에 초기 OD₆₀₀ 값이 0.3이 되도록 접종하여 같은 조건으로 본 배양하였다. 배양 시간대 별로 배양액을 취하여 13,000 rpm으로 10분 동안 4℃에서 원심분리한 후 상등액을 확보하여 분비된 단백질 양을 브래드포드(protein assay dye reagent concentrate -BIORAD) 분석 방법으로 측정하였으며, bovine serum albumin (BSA)을 사용하여 스탠다드 커브를 그리고 측정된 단백질 양을 OD₆₀₀값으로 노말라이제이션 하였다. 그 결과, 야생형에 비하여 HpGAS1 유전자 파쇄 균주에서 시간 의존적으로 총 단백질 분비량이 늘어남을 확인하였고, 지수기의 후기를 넘어 정체기가 지날수록 총 분비된 단백질의 양이 확연히 차이가 나는 것을 확인하였다(도 10). HpGAS2 유전자 파쇄 균주는 야생형과 비슷한 단백질 분비량이 확인되었다.

<실험예 3> 유전자 파쇄 변이주의 외래 재조합 단백질 분비능 확인

<3-1> GOD 생산균주의 Glucose oxidase 분비능 확인

본 발명자들은 HpGAS1 유전자 파쇄 및 HpGAS2 유전자 파쇄에 의해 GOD 생산균주의 Glucose oxidase의 분비량이 증가하는지 확인하였다.

구체적으로, 야생형 GOD 생산균주 [H. polymorpha/pDLMOX-GOD(H)], HpGAS1 유전자 파쇄 균주[H. polymorpha ΔHpGAS1/pDLMOX-GOD(H)] 및 HpGAS2 유전자 파쇄 균주[H. polymorpha ΔHpGAS2/pDLMOX-GOD(H)]를 3 ml 포도당 2% 복합 배지에 200 rpm으로 37℃에서 16시간 동안 전 배양한 후, MOX 프로모터를 이용해 발현되는 해당 외래 재조합 단백질의 발현유도를 위해 메탄올 2% 복합 배지 50 ml에 초기 OD₆₀₀ 값이 0.3이 되도록 접종한 후 같은 조건으로 본 배양하였다. 그 후, OD₆₀₀ 값 2에 해당하는 배양액을 취한 후 13,000 rpm으로 10분 동안 4℃에서 원심분리하여 상등액을 확보하였다. 상기 상등액을 5x샘플 로딩 버퍼와 혼합하여 5분 동안 끓인 후 샘플을 절반씩 나눠서(즉, OD₆₀₀ 값 1에 해당하는 상등액) 8% SDS-PAGE 젤 두 조에 전기영동하였다. 젤 두 조 중 하나는 Coomassie Brilliant Blue R-250 Staining Solution(BIO-RAD)으로 염색하고 destaining 버퍼로 탈색하였다. 다른 젤은 PVDF 막으로 단백질을 옮긴 후 해당 PVDF 막을 5% 스킴 밀크 용액으로 차단하였으며, 1차 항체인 His-probe(Santa Cruz Biotechnology)를 1:1000으로 희석하여 2시간 동안 반응시켰다. 반응 후, TBST(50 mM Tris-HCl(pH 7.5), 150 mM NaCl 및 0.05% Tween 20) 용액으로 10분씩 3번 씻은 뒤 2차 항체인 Anti-Mouse IgG(Sigma)를 1:3000으로 희석하여 1시간 30분 동안 반응시켰다. 그 후, TBST 용액으로 10분씩 3번 씻어준 뒤 ECL advance^TM Western Blotting Detection Kit(Amersham^TM-GE Healthcare)으로 검출하였다.

그 결과, 염색한 젤에서는 전체적으로 HpGAS1 파쇄 균주의 샘플에서 단백질 밴드가 진하게 나와서 총 단백질이 많이 분비된 것을 확인할 수 있었으며, 웨스턴 블랏의 결과를 통해 100 KDa 부근에 Glucose oxidase가 발현된 것을 확인할 수 있었고 야생형과 HpGAS2 파쇄 균주보다 특히 HpGAS1 파쇄 균주의 샘플에서 많은 양의 GOD가 검출 되었다(도 11).

또한, 배양 상등액으로 분비된 Glucose oxidase의 활성을 GLUCOSE OXIDASE 분석 키트(MEGAZYME)로 측정한 결과, 야생형에 비해 HpGAS1 파쇄 균주의 배양 상등액에서 1.9배 증가함을 확인하였다(도 12). 따라서 야생형 균주에 비하여 HpGAS1 파쇄 균주에서 GOD 분비량이 늘어날 뿐만 아니라 활성형태로 분비가 잘 됨을 확인하였다. HpGAS2 파쇄 균주는 야생형과 비슷한 활성측정 값을 보였다.

<3-2> G3T8 균주의 사람 혈청 알부민(Human serum albumin) 분비능 확인

본 발명자들은 HpGAS1 유전자 파쇄 및 HpGAS2 유전자 파쇄에 의해 재조합 인간 혈청 알부민 (Human serum albumin, HSA) 생산균주의 HSA 분비량이 증가하는지 확인하였다.

구체적으로, 야생형 HSA 생산균주(H. polymorpha G3T8), HpGAS1 유전자 파쇄 균주(H. polymorpha G3T8 ΔHpGAS1) 및 HpGAS2 유전자 파쇄 균주(H. polymorpha G3T8 Δ HpGAS2)를 3 ml 포도당 2% 복합 배지에 200 rpm으로 37℃에서 16시간 동안 전 배양한 후 50 ml 메탄올 2% 복합 배지에 초기 OD₆₀₀ 값이 0.3이 되도록 접종한 후 같은 조건으로 본 배양한 후, 이때 HSA 발현을 유도하기 위하여 메탄올 2% 복합 배지를 사용하여 배양하였다. 그 후, OD₆₀₀ 값이 0.1이 되도록 배양액을 취한 후 13,000 rpm으로 10분 동안 4℃에서 원심분리하여 상등액을 확보하였다. 상기 상등액을 5x샘플 로딩 버퍼와 혼합하여 5분 동안 끓인 후 샘플을 절반씩 나눠서(즉, OD₆₀₀ 값 0.05에 해당하는 상등액) 10% SDS-PAGE 젤 두 조에 전기영동하였다. 젤 두 조 중 하나는 Coomassie Brilliant Blue R-250 Staining Solution(BIO-RAD)으로 염색하고 destaining 버퍼로 탈색하였다. 다른 젤 하나는 단백질을 PVDF 막으로 옮긴 후 해당 PVDF 막을 5% 스킴 밀크 용액으로 차단하였으며, 1차 항체인 Anti-Human Albumin antibody(Sigma)를 1:10000으로 희석하여 2시간 동안 반응시켰다. 반응 후, TBST(50 mM Tris-HCl(pH 7.5), 150 mM NaCl 및 0.05% Tween 20) 용액으로 10분씩 3번 씻은 뒤 2차 항체인 goat anti-rabbit IgG-HRP(Santa Cruz Biotechnology)를 1:5000으로 희석하여 1시간 30분 동안 반응시켰다. 그 후, TBST 용액으로 10분씩 3번 씻어준 뒤 ECL Western Blotting Detection Kit(Amersham^TM-GE Healthcare)으로 검출하였다.

그 결과, 염색한 젤에서는 전체적으로 HpGAS1 파쇄 균주의 샘플에서 단백질 밴드가 진하게 나와 총 단백질이 많이 분비된 것을 확인할 수 있었으며, 웨스턴 블랏의 결과를 통해 66 KDa 부근에 인간 혈청 알부민이 검출된 것을 확인할 수 있었고 HpGAS1 파쇄 균주의 샘플에서 야생형과 HpGAS2 파쇄 균주보다 많은 양의 HSA가 검출 되었다(도 13).

<실험예 4> 유전자 회복에 의한 기능 보완 확인

<4-1> HpGAS1 및 HpGAS2 유전자 파쇄 균주의 URA3 파쇄

본 발명자들은 상기 실험예와 같은 효과가 lacZ-URA3-lacZ 카세트에 의해 HpGAS1 가 파쇄되었기 때문인지 확인하기 위하여 유전자 회복에 의한 기능 보완 실험을 하고자 하여, 상기 유전자 파쇄 균주에서 lacZ-URA3-lacZ 카세트를 제거하였다.

구체적으로, lacZ-URA3-lacZ 제거용 카세트를 제작하기 위하여 한세눌라 폴리모르파 DL1 균주로부터 분리한 염색체 DNA를 주형으로 HpGAS1_N_Forward (서열번호 9) 및 HpGAS1_N_Reverse (서열번호 10)를 이용하여 HpGAS1의 N-말단 절편(537 bp)을, HpGAS1_C_Forward_GNR (서열번호 23) 및 HpGAS1_C_Reverse (서열번호 12)를 이용하여 HpGAS1의 N-말단 절편과 융합할 수 있는 HpGAS1의 C-말단 절편(524 bp)을 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 통해 얻었다. 상기 두 절편을 fusion PCR하여 lacZ-URA3-lacZ 제거용 카세트를 얻은 후 HpGAS1이 파쇄된 균주에 상동재조합을 통해 도입하여 URA3 유전자가 없는 균주만 생장 가능한 5-FOA 배지에서 생존가능한 URA3 유전자가 파쇄된 돌연변이주(H. polymorpha DL1 ΔHpGAS1 ΔURA3)를 얻었다(도 14).

<4-2> HpGAS1 , HpGAS2 및 ScGAS1 유전자 도입

본 발명자들은 HpGAS1, HpGAS2 및 ScGAS1 유전자가 각각 클로닝된 벡터를 제작하여 상기 HpGAS1 유전자 파쇄 균주(H. polymorpha DL1 ΔHpGAS1 ΔURA3)에 각각 도입하였다.

구체적으로, 한세눌라 폴리모르파 DL1 균주로부터 분리한 염색체 DNA를 주형으로 각각 서열번호 17 및 18, 서열번호 19 및 20의 프라이머를 이용하여 증폭한 HpGAS1, HpGAS2 유전자 카세트와 사카로마이세스 세레비지애 BY4741 균주로부터 분리한 염색체 DNA를 주형으로 서열변호 21 및 22의 프라이머를 이용하여 증폭한 ScGAS1 유전자 카세트를, 제한효소 MssⅠ을 처리한 pDLGUK 벡터에 평활 말단으로 클로닝 하였다(도 7의 1). pDLGUK 벡터는 염색체 DNA의 텔로미어 부근으로 무작위적으로 삽입할 수 있는 HARS 및 URA3 유전자를 가진 벡터로써, 형질전환체는 URA3 유전자가 삽입되기 때문에 SC-URA 최소배지에서 자라는 형질전환체를 얻을 수 있다. 상기 HpGAS1가 삽입된 벡터(pDLGUK-HpGAS1), HpGAS2가 삽입된 벡터(pDLGUK-HpGAS2), ScGAS1가 삽입된 벡터(pDLGUK-ScGAS1) 및 pDLGUK 공벡터를 URA3 유전자 및 HpGAS1가 파쇄된 한세눌라 폴리모르파 DL1 균주(H. polymorpha DL1 Δ HpGAS1 ΔURA3)에 각각 형질전환하였다.

그 결과, SC-URA 최소 배지에서 생장 가능한 벡터가 삽입된 형질전환체 H. polymorpha DL1 ΔHpGAS1 ΔURA3/pDLGUK-HpGAS1, H. polymorpha DL1 ΔHpGAS1 ΔURA3/pDLGUK-HpGAS2, H. polymorpha DL1 ΔHpGAS1 ΔURA3/pDLGUK-ScGAS1 및 H. polymorpha DL1 ΔHpGAS1 ΔURA3/pDLGUK를 얻을 수 있었다.

<4-3> 유전자 삽입 균주의 생리적 특성 확인

본 발명자들은 상기 실험예 <4-2>에서 도입한 유전자로 인한 생리적 특성을 고형배지상에 순차적으로 희석된 세포배양액을 집적배양하여 확인하였다.

구체적으로, 상기 실험예 <4-2>의 형질전환체의 생장을 비교하기 위하여 상기 벡터들로 각각 형질전환된 한세눌라 폴리모르파 균주들을 각각 3 ml 포도당 2% 복합 배지에 200 rpm으로 37℃에서 16시간 동안 전 배양하였다. 상기 배양한 균주들을 멸균수 1 ml에 처음 OD₆₀₀ 값을 1로 시작하여 연속적으로 1/10씩 희석하여 포도당 2% 복합 한천배지와 세포벽 합성 저해제인 3% 칼코플로어 화이트(Calcofluor White, CFW), 1% 콩고레드(Congo Red, CR) 및 삼투교란제인 0.01% 도데실 황산나트륨(Sodium Dodecyl Sulfate, SDS)이 각각 포함된 포도당 2% 복합 한천배지에 1 ㎕씩 집적하여 37℃에서 이틀 또는 삼일 동안 배양하였다. 또한, 열 스트레스에 대한 감수성을 확인하기 위해 포도당 2% 복합 한천배지에 집적하여 42℃에서 이틀 동안 배양하였다.

그 결과, HpGAS1 유전자를 보완한 균주는 야생형과 비슷한 생장 정도를 보였으며(도 9의 4), HpGAS2 유전자를 보완한 균주는 야생형보다는 느리지만 감수성 배지에서 생장함을 알 수 있었다(도 9의 5). 반면, 사카로마이세스 세레비지애의 GAS1 유전자인 ScGAS1 유전자를 보완한 균주는 생장 증대가 확인되지 않았으며, pDLGUK 공벡터가 도입된 균주와 같은 정도의 생장을 보였다(도 9의 6 및 7). 한편, 형질전환하지 않은 HpGAS1 파쇄균주 보다ScGAS1 발현 벡터나 pDLGUK 공벡터가 도입된 균주의 성장이 약간 증대된 것을 관찰할 수 있었는데 이는 비록 복합배지라도 야생형 한세눌라 폴리모르파 균주가 URA3 파쇄 균주보다 생장이 빠르다고 보고된 것과 같은 현상으로 판단되었다.

<실험예 5> 사카로마이세스 세레비지애( Saccharomyces cerevisiae )에서의 ScGAS1 돌연변이 기능보완 확인

<5-1> ScGAS1 유전자 파쇄 균주의 생장 확인

본 발명자들은 GAS1 유전자 파쇄에 의한 세포벽 약화에 의한 생장 저해를 사카로마이세스 세레비지애에서도 확인하였다.

구체적으로, 사카로마이세스 세레비지애 균주(S. cerevisiae BY4741)와 ScGAS1 파쇄 균주(S. cerevisiae BY4741 ΔScGAS1)를 3 ml 포도당 2% 복합 배지에 200 rpm으로 30℃에서 16시간 동안 전 배양하였다. 전 배양한 균주를 멸균수 1 ml에 OD₆₀₀ 값 1에서 연속적으로 1/10씩 희석한 뒤, 포도당 2% 복합 한천배지와 0.005% 콩고레드(Congo Red, CR) 및 0.01% 도데실 황산나트륨(Sodium Dodecyl Sulfate, SDS)이 각각 포함된 포도당 2% 복합 한천배지에 1 ㎕씩 집적하여 30℃에서 삼일 또는 사일 동안 배양하였다.

<5-2> HpGAS1 및 HpGAS2 유전자 삽입 균주의 생리적 특성 확인

본 발명자들은 사카로마이세스 세레비지애 균주를 이용하여 HpGAS1 및 HpGAS2 유전자의 기능을 확인하기 위하여 상기 유전자가 각각 클로닝된 벡터(YEp352ScGAPDHpt-HpGAS1, YEp352ScGAPDHpt-HpGAS2)를 제작하여 ScGAS1 파쇄 균주(S. cerevisiae BY4741 ΔScGAS1)에 각각 형질전환하였다.

구체적으로, 한세눌라 폴리모르파 DL1 균주로부터 분리한 염색체 DNA를 주형으로 각각 서열번호 17 및 18, 서열번호 19 및 20의 프라이머를 이용하여 증폭한 HpGAS1, HpGAS2 유전자 카세트를 제한효소 XbaⅠ으로 처리하고, 제한효소 XbaⅠ을 처리한 YEp352ScGAPDHpt 벡터에 클로닝 하였다(도 7의 2). YEp352ScGAPDHpt 벡터는 2 micron origin, URA3 유전자와 GAPDH 프로모터를 가진 벡터로써, 형질전환체는 URA3 유전자가 삽입되기 때문에 SC-URA 최소배지에서 형질전환체를 얻을 수 있다. 상기 HpGAS1가 삽입된 벡터(YEp352ScGAPDHpt-HpGAS1), HpGAS2가 삽입된 벡터(YEp352ScGAPDHpt-HpGAS2) 및 YEp352ScGAPDHpt 공벡터를 ScGAS1 파쇄 사카로마이세스 세레비지애 균주(S. cerevisiae BY4741 ΔScGAS1)에 각각 형질전환하였고 SC-URA 최소 배지에서 형질전환체를 얻어내어 희석한 세포배양액을 감수성 고형배지에 집적하여 생장을 비교하였다.

그 결과, HpGAS1 유전자를 보완한 ScGAS1 유전자가 파쇄된 사카로마이세스 세레비지애 균주(S. cerevisiae BY4741 ΔScGAS1/YEp352ScGAPDHpt-HpGAS1)는 야생형(S. cerevisiae BY4741)과 유사한 정도로 생장이 회복되었으며(도 15의 3), HpGAS2 유전자를 보완한 균주(S. cerevisiae BY4741 Δ ScGAS1/YEp352ScGAPDHpt-HpGAS2)도 야행성(S. cerevisiae BY4741)과 유사한 정도로 생장이 회복되었다(도 15의 4). 이를 통해 HpGAS2 유전자가 한세눌라 폴리모르파에서는 베타-1,3-글루카노실트랜스글라이코실레이즈의 기능을 부분적으로 보완하는 것과 달리 사카로 마이세스 세레비지애에서는 기능을 완전히 보완하는 것을 알 수 있다. 한편, YEp352ScGAPDHpt 공벡터가 도입된 대조군 균주도 ScGAS1 파쇄 균주와 생장의 차이가 없었는데, 이를 통해 사카로마이세스 세레비지애는 한세눌라 폴리모르파와 달리 URA3 유전자 있는 균주와 URA3 유전자 없는 균주의 생장차이가 없다는 것을 확인할 수 있었다(도 15의 5).

한국생명공학연구원

KCTC12220BP

20120524

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> HpGAS gene deleted yeasts and methods of producing recombinant proteins using them <130> 13p-04-24 <150> KR10-2012-0065686 <151> 2012-06-19 <160> 27 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1650 <212> DNA <213> Hansenula polymorpha <400> 1 atgatcttct cgtggaaaac gatcggcgcc ctctttggcg ccatgaccgc tgtggccaag 60 gccgcctccg acttcccaac catcgaagtt gttggaaaca aattctttta ctcgaacaac 120 ggatcccaat tctatattcg aggagtggcc taccaagccg acactgctct gaccaccaac 180 acgtcttttg tcgatcctct ggccgacaag accacctgcg aaagagacat tccttacctg 240 agggagctga acaccaatgt catcagagtg tatgctctgg atgccgacgc tgaccacagc 300 gactgcatgt cgctcttgca agacgcgggc atctatgtga ttgcggatct ttcgcagcct 360 aaactgtcga tctctaccac ggaccctgag tggtctgagg ccttgtacga gagatacacg 420 tctgtggtcg acgtgatgca gcagtacgac aacgtgcttg gattttttgc cggaaacgag 480 gtcatcacaa actcttccaa cactgacgcc gctccgttcg tcaaggctgc catcagagac 540 atgaagcagt acatgaagga caggggatac cgtaccattc cagtcggata ctctgcgaac 600 gacgactccg agaccagagt cgcctcggcc aactacttcg cctgcggaga tgaggacgag 660 agagccgatt tctatggtat caacatgtac gagtggtgcg gaagttcctc atttgaaacg 720 tccgggtacg aggacagaac caaggagttc tccaacctca caattcccgt cttcttctcc 780 gagtacggct gcaacaccat ccaacctaga aaattcaccg atgtccctac cctcttctcc 840 gacgagatga ccgacgtgtg gtccggaggc attgtgtaca tgtacttcga ggaggacaac 900 aactatggtc ttgtctctgc catcgacgac accaccgtaa gcaccatgac cgacttcaaa 960 tactactcgt ccgagatcaa caacgtgtcg ccaacctcag ccaccctcgc ctcggccagc 1020 agcaccgcca ccgagctgtc gtgtccaacc ggattcaagt actggaatgc gtccgacact 1080 ctaccgccaa cgccagaaga gactgtctgt gactgcatgg ctagctccct ttcgtgtgtt 1140 gtgtctgacg acgtcgacag cgcagactat gatgagctgt tcggaacggt gtgcggtctt 1200 gtcaactgcg atggcatctc cgccaacgga aagacaggca agtacggagc atactcgttc 1260 tgcagctcca aagacatgct ttcgttcgct ctaaacctgt actatttgga ccagaacgag 1320 gactccagcg cctgcgactt tgacggctct gccagcatcc agagtgccac caccgcatcg 1380 acctgctctt ctatcctgag cgccgcagga accgccggaa ccggcaccgt cagcggcgtc 1440 agcggctctg gctctggttc tggctctggt tctggctcca cagcatccgg ctccgggggc 1500 tcgtcgtctg ggtcctcctc aggttcttcg tccacatctt ccggatcgac atccaacagc 1560 gccgccgtta gatcgtacag ctcaaacagc tactacacca tcctggtttc tggcctgtgt 1620 gctgttggtg ctctggttgt tctgacaatg 1650 <210> 2 <211> 1611 <212> DNA <213> Hansenula polymorpha <400> 2 atgcagctaa aatctatcct ctcgctcacg ggcctgctct ccaccacgct ggctctgcct 60 accattgacg tggtgtccaa caagttcttc tattcgaaca acgggtccca attctatgtg 120 aaaggtgtcg cgtaccagaa gaacacagaa aatgctaccg acgacgcaac ctacgtcgat 180 ccgctcgctg acgaagagtc gtgcaagcga gacatcccgt acctacagaa tctgggaatc 240 aacgttatcc gggtgtatgc agtcgatgcc tccaaggacc atgacggatg catgtctctg 300 ctcgaggatg ctggaatcta tgtcatctcc gatctctcga ccccaaacga gtcgatcgag 360 accaccagtc catcctggac tgttgatctg tacaacaggt atgccacggt gatcgatatg 420 ttccaaagct acgacaacgt gctcggcttt tttgcaggta atgaggttat caccaacagg 480 accaacaccg acgctgctcc gttcgtcaag gccgccatta gagacatgaa gcagtacatg 540 aaggacaaca actacagaga cattccgatt ggctactcgg ccaacgacga 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1440 ggctccggct ctagttccgg ctccagctcc ggctccggct ctagcagctc cagctcctcg 1500 tcgtcctctg ccggcgcagg cgtcaacgct gtcccattgt cggctccaca actgggcctg 1560 ctctccttgt tctccacctt cttcttgggc ggactctcct acatccttat c 1611 <210> 3 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HpURA3_N_Forward primer <400> 3 cgggaattcc aacgaagcac atcaactgg 29 <210> 4 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HpURA3_N_Reverse_ZRF primer <400> 4 gaagctatgg tgtgtggggg atccgcacag agagacatgg gag 43 <210> 5 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HpURA3_C_Forward_ZRR primer <400> 5 gcaagctgga gaccaacatg ggatccgtcc tctactatgt cgatg 45 <210> 6 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HpURA3_C_Reverse primer <400> 6 cgggaattcg tttgttggag gtgaagtcg 29 <210> 7 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Zeo resistance_Forward primer <400> 7 cgcggatccc ccacacacca tagcttc 27 <210> 8 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Zeo resistance_Reverse primer <400> 8 cgcggatccc atgttggtct ccagcttgc 29 <210> 9 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HpGAS1_N_Forward primer <400> 9 tgcatgctga tgtggctg 18 <210> 10 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HpGAS1_N_Reverse_LUF primer <400> 10 agctcggtac ccggggatcc ccagacaggg caccgatt 38 <210> 11 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HpGAS1_C_Forward_LUR primer <400> 11 gcacatcccc ctttcgccag agatcgtcgt ccagcagc 38 <210> 12 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HpGAS1_C_Reverse primer <400> 12 tagacactgg acaggggg 18 <210> 13 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HpGAS2_N_Forward primer <400> 13 cccagaaatg cggtagaa 18 <210> 14 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HpGAS2_N_Reverse_LUF primer <400> 14 agctcggtac ccggggatcc cccgtgagcg agaggata 38 <210> 15 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HpGAS2_C_Forward_LUR primer <400> 15 gcacatcccc 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Claims

서열번호 1로 기재되는 HpGAS1 유전자가 결손된, 단백질 분비능이 향상된 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha) 변이 균주.
제 1항에 있어서, 상기 변이 균주는 기탁번호 KCTC12220BP로 기탁된 것을 특징으로 하는 변이 균주.
1) URA3 유전자 파쇄 카세트를 상동재조합을 통해 효모 균주에 도입하는 단계; 및
2) 상기 균주에 HpGAS1 유전자 파쇄 카세트를 형질전환한 후 상동재조합을 통해 염색체상의 HpGAS1 유전자를 파쇄하는단계를 포함하는 단백질 분비능이 향상된 효모 균주의 제조 방법.
제 3항에 있어서, 상기 URA3 유전자 파쇄 카세트는 HpURA3 유전자의 N 말단 절편, HpURA3 유전자의 C 말단 절편 및 Zeocin 저항성 유전자 (Zeo^R) 카세트를 이용하여 제작한 파쇄카세트인 것을 특징으로 하는 방법.
제 3항에 있어서, 상기 HpGAS1 유전자 파쇄 카세트는 서열번호 1로 기재되는 염기서열로 구성되는 HpGAS1 유전자의 N 말단 절편, HpGAS1 유전자의 C 말단 절편 및 lacZ-HpURA3-lacZ 카세트의 N-말단 절편, lacZ-HpURA3-lacZ 카세트의 C-말단 절편을 이용하여 제작한 파쇄카세트인 것을 특징으로 하는 방법.
1) 제 1항의 변이 균주에 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터를 도입시켜 재조합 효모 균주를 제조하는 단계; 및
2) 상기 재조합 효모 균주를 배양하는 단계를 포함하는 외래 재조합 단백질 생산 방법.
제 6항에 있어서, 상기 재조합 효모 균주는 한세눌라 속(Hansenula sp.)인 것을 특징으로 하는 방법.
제 6항에 있어서, 생물반응기(bioreactor)를 이용하여 상기 변이주를 대량 배양하는 단계를 추가로 포함하는 방법.