ES2834048T3 - Células deficientes en fucosilación - Google Patents

Abstract

Una célula que comprende un ácido nucleico que codifica una proteína GDP-4-ceto-6-desoxi-manosa-3,5- epimerasa-4-reductasa (FX), en donde la proteína FX comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 90 % idéntica a la SEQ ID NO: 1, en donde la proteína FX comprende una modificación en relación con la SEQ ID NO: 1, comprendiendo la modificación una sustitución con una Serina en la posición 289, y en donde la célula tiene una capacidad reducida para fucosilar una glucoproteína en comparación con una célula de tipo silvestre sin la modificación.

Description

DESCRIPCIÓN

Células deficientes en fucosilación

Campo

La invención se refiere a una enzima de mamífero modificada en la vía de la fucosilación, en donde las células que portan la enzima de mamífero modificada muestran una capacidad reducida para fucosilar una proteína y a células que comprenden una modificación genética que da como resultado una capacidad reducida para fucosilar una proteína. La invención incluye líneas celulares de mamíferos (p.ej., líneas CHO) que expresan proteínas, incluyendo anticuerpos, con fucosilación reducida en comparación con las líneas celulares de tipo silvestre. La invención también se refiere al control condicional de la fucosilación de proteínas.

Antecedentes

Las líneas celulares que son incapaces de fucosilar proteínas son conocidas en la técnica. Se conocen varios mutantes con pérdida de función que son incapaces de fucosilar proteínas, quizás de manera más notable determinados mutantes de células de ovario de hámster chino (CHO) seleccionados por su resistencia a determinadas lectinas. Tales líneas celulares se aíslan mediante selección repetida por la incapacidad de unirse a una lectina particular, p.ej., la lecitina de Lens culinaris, en presencia de un mutágeno. Se conocen otras líneas celulares supuestamente incapaces de fucosilar proteínas, p.ej., anticuerpos, véanse, p.ej., la Patente de EE.UU. N.° 7.425.466 y Patente de ^{E E . U u .} N.° 7.214.775 (a1,6-fucosiltransferasa, es decir, Mutante FUT8). El documento EP-A1-1,331,266 se refiere a células que producen composiciones de anticuerpos. Sigue existiendo una necesidad en la técnica de líneas celulares con capacidad reducida para fucosilar proteínas, en particular para células con capacidad de fucosilación reducida en ausencia de una desactivación génica y para células que fucosilan proteínas condicionalmente.

Sumario

En un aspecto, se proporciona una célula que comprende un ácido nucleico que codifica una proteína GDP-4-ceto-6-desoxi-manosa-3,5-epimerasa-4-reductasa (FX), en donde la proteína FX comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 90 % idéntica a la SEQ ID NO: 1, en donde la proteína FX comprende una modificación en relación con la SEQ ID NO: 1, comprendiendo la modificación una sustitución con una Serina en la posición 289, y en donde la célula tiene una capacidad reducida para fucosilar una glucoproteína en comparación con una célula de tipo silvestre sin la modificación. En una realización, la proteína FX comprende una modificación 289S y al menos una modificación seleccionada del grupo que consiste en 79S, 90K, 136L/211R y una combinación de las mismas.

También se divulga un ácido nucleico que codifica una secuencia de proteína FX modificada. En un caso específico, el ácido nucleico es un ADNc. También se divulga un vector de expresión o un vector de direccionamiento que comprende el ácido nucleico. En un caso, el ácido nucleico del vector de direccionamiento comprende un intrón. En un caso, el ácido nucleico del vector de direccionamiento comprende un ADNc que codifica la proteína FX modificada. En un caso específico, el vector de direccionamiento comprende una secuencia de direccionamiento que dirige el vector a un locus en un genoma humano, de primate no humano, de hámster, de ratón o de rata.

En un aspecto, se proporciona una célula que comprende un ácido nucleico que codifica una proteína GDP-4-ceto-6-desoxi-manosa-3,5-epimerasa-4-reductasa (FX), en donde la proteína FX comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 90 % idéntica a la SEQ ID NO: 1, en donde la proteína FX comprende una modificación en relación con la SEQ ID NO: 1, comprendiendo la modificación una sustitución con una Serina en la posición 289, y en donde la célula tiene una capacidad reducida para fucosilar una glucoproteína en comparación con una célula de tipo silvestre sin la modificación. En una realización, la célula no expresa o no expresa sustancialmente una proteína FX de tipo silvestre. En una realización específica, la célula no muestra más del 10%, no más del 5 %, no más del 2%, o no más del 1% de proteína FX de tipo silvestre en comparación con una célula que carece de la modificación.

En una realización, la célula que comprende la proteína FX modificada o el ácido nucleico expresa una glucoproteína que contiene Fc, en donde la célula fucosila no más del 90%, no más del 95 %, no más del 96 %, no más del 97 %, no más del 98%, o no más del 99% de la glucoproteína en comparación con una célula que carece de la modificación.

En un aspecto, la célula proporcionada comprende una modificación de un ácido nucleico que codifica una proteína FX, o que expresa una proteína FX con una modificación, en donde la célula carece o carece sustancialmente de la capacidad de fucosilar una glucoproteína a una primera temperatura, pero no carece o no carece sustancialmente de la capacidad de fucosilar la glucoproteína a una segunda temperatura.

En una realización, la primera temperatura es de aproximadamente 37 °C. En una realización, la segunda temperatura es de aproximadamente 34 °C.

En una realización, la capacidad de fucosilar la glucoproteína a la primera temperatura es de aproximadamente el 1 % a aproximadamente el 10 % de la capacidad de fucosilar la glucoproteína mostrada por una célula que carece de la modificación. En una realización, la capacidad de fucosilar la glucoproteína a la segunda temperatura es aproximadamente del 70 %, 80 %, 90 % o más en comparación con la capacidad de fucosilar la glucoproteína por una célula que carece de la modificación.

La modificación de la proteína FX empleada comprende una sustitución de aminoácidos que es 289S y que se puede proporcionar, por ejemplo, en combinación con cualquiera de las siguientes sustituciones de aminoácidos: 90K, 211R, 136L/79S y una combinación de las mismas.

En una realización, la proteína FX es de un primate no humano (p.ej., Macaca mulata), un ser humano, un ratón (p.ej., Mus musculus), una rata (p.ej., Rattus norvegicus), o un hámster (p.ej., Hámster chino, o Cricetulus griseus). En una realización específica, la proteína FX comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 6, y lleva una o más modificaciones (p.ej., sustituciones de aminoácidos) como se describe en el presente documento. La proteína FX es al menos un 90 % idéntica a la SEQ ID NO: 1 y la célula tiene una capacidad reducida para fucosilar una glucoproteína en comparación con una célula de tipo silvestre sin la modificación.

El ácido nucleico codifica una proteína FX que es al menos un 90 % o al menos un 95 % idéntica a la secuencia de la SEQ ID NO: 1, y comprende 289S y también puede comprender uno o más de los siguientes aminoácidos en una o más de las siguientes posiciones: 79S, 90K, 136L y 211R.

En una realización, el ácido nucleico codifica un FX que es al menos un 95 % idéntico a la FX de la SEQ ID NO: 2. En una realización específica, la FX tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2.

En una realización, la célula expresa una enzima de la vía de fucosilación de tipo silvestre seleccionada del grupo que consiste en GDP-manosa 4,6-deshidratasa (GMD), una GDP-p-L-fucosa pirofosforilasa (GFPP) de tipo silvestre, una a-1,6-fucosilltransferasa (FUT8) de tipo silvestre y una combinación de las mismas.

En un aspecto, la célula es una célula de mamífero capaz de fucosilar una proteína, en donde la célula comprende una modificación en un gen FX, en donde la modificación da como resultado al menos una reducción del 90 % en la capacidad de la célula para fucosilar una proteína en comparación con una célula que carece de la mutación o alteración.

En una realización, la reducción es aproximadamente el 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % en comparación con una célula de mamífero que no contiene la modificación.

En una realización, la comparación de una célula modificada de acuerdo con la invención y una célula que no comprende la modificación se realiza en las mismas o esencialmente en las mismas condiciones (p.ej., medios, temperatura, densidad celular, etc.).

En una realización, la célula se selecciona de COS, CHO, 293, BHK, HeLa, Vero, una de mamífero transfectada con genes de adenovirus, p.ej., AD5 E1, incluyendo, pero sin limitación, células retinianas humanas inmortalizadas transfectadas con un gen de adenovirus, p.ej., una célula PER.C6™ y una célula NSO. En una realización, la célula es una célula de ovario de hámster chino (CHO). En una realización específica, la célula CHO es una célula CHO K1.

La modificación es 289S. En una realización específica, la sustitución comprende 289S y una o más de 79S, 90K, 136Ly 211R.

En una realización específica, la sustitución de aminoácidos comprende L289S y uno o más de N79S, N90K, P136L y G211R.

En una realización, la célula comprende además al menos un ácido nucleico que codifica una proteína inmunoglobulina. En una realización específica, la proteína inmunoglobulina es una proteína humana o una proteína de ratón. En una realización específica, la proteína de inmunoglobulina comprende una cadena ligera de inmunoglobulina. En una realización específica, la proteína de inmunoglobulina comprende una cadena pesada de inmunoglobulina. En una realización, la cadena pesada de inmunoglobulina es de un isotipo IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4. En una realización, la cadena pesada de inmunoglobulina es un isotipo IgG1, p.ej., un isotipo IgG1 humano. En una realización, la región variable de la cadena pesada y/o ligera comprende una CDR humana, en otra realización, una CDR de ratón, en otra realización, una CDR humanizada de un ratón o un primate no humano.

En una realización, la célula comprende un ácido nucleico que codifica un dominio CH2 y un dominio CH3 de una cadena pesada de inmunoglobulina. En una realización, la cadena pesada de inmunoglobulina es de un isotipo IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4.

En una realización, la proteína es una proteína de unión a antígeno. En una realización específica, la proteína de unión a antígeno es un anticuerpo. En realizaciones específicas, el anticuerpo comprende una cadena pesada de un isotipo IgA, IgD, IgE, IgG o IgM. En una realización, la proteína de unión a antígeno es un anticuerpo del isotipo IgG1.

En una realización, la proteína es un anticuerpo y solamente aproximadamente el 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1% o 0,5% de la proteína de anticuerpo producida por la célula está fucosilada. En una realización, la cantidad de proteína de anticuerpo producida que está fucosilada se mide por desglucosilación durante la noche de la proteína de anticuerpo con PNGasa F seguida de análisis de oligosacáridos mediante HPLC en donde los oligosacáridos que contienen fucosilo se cuantifican mediante la integración del área máxima de glucano y, p.ej., la fucosilación de proteínas se calcula basándose en el área máxima de glucano. En una realización específica, los glucanos fucosilados se identifican mediante espectroscopía de masas.

En un aspecto, se proporciona un método para producir una proteína de unión a antígeno, comprendiendo el método: (a) proporcionar una célula de la invención; (b) introducir en la célula una secuencia del ácido nucleico que codifica una proteína de unión a antígeno; (c) mantener la célula en condiciones suficientes para expresar la secuencia del ácido nucleico para producir la proteína de unión a antígeno; y, (d) recuperar la proteína de unión a antígeno expresada por la célula.

En una realización, la proteína de unión a antígeno es un anticuerpo. En una realización específica, el anticuerpo se selecciona de un anticuerpo humano, un anticuerpo de ratón, un anticuerpo quimérico humano/de ratón y un anticuerpo de primate no humano.

En una realización, la célula es una célula de ovario de hámster chino (CHO).

En una realización, la reducción en la capacidad de la célula para fucosilar una proteína es del 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 99,5 % en comparación con una célula que carece de la modificación en el gen FX.

La modificación es 289S. En una realización, la modificación comprende 289S y al menos una de 79S, 90K, 136L y 211R.

En una realización, el gen de la fucosiltransferasa codifica una proteína que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 1, con la sustitución de aminoácidos L289S. En una realización, la modificación comprende L289S y al menos una de N79S, N90K, P136L y G211R.

En una realización, el anticuerpo o fragmento del mismo es un anticuerpo humano o fragmento del mismo. En una realización específica, el anticuerpo es un isotipo IgG1, p.ej., una IgG1 humana.

En una realización, el anticuerpo recuperado no tiene más de aproximadamente un 5 % de fucosilación en comparación con el mismo anticuerpo producido en una célula de tipo silvestre que carece de la modificación, en otra realización, no más del 4 %, 3 %, 2 %, 1% o 0,5% de fucosilación en comparación con el mismo anticuerpo producido en una célula de tipo silvestre que carece de la modificación.

En un aspecto, la célula proporcionada expresa una enzima de la vía de fucosilación de tipo silvestre seleccionada del grupo que consiste en GDP-manosa 4,6-deshidratasa (GMD), una GDP-p-L-fucosa pirofosforilasa (GFPP) de tipo silvestre, una a-1,6-fucosilltransferasa (FUT8) de tipo silvestre y una combinación de las mismas; en donde la célula comprende un gen FX modificado, en donde la célula tiene una capacidad reducida para fucosilar una glucoproteína en comparación con una célula que carece de la modificación del gen FX.

En una realización específica, la glucoproteína comprende un Fc. En una realización, la proteína es un anticuerpo. En una realización, la proteína comprende una secuencia de una IgG. En una realización específica, la secuencia de una IgG es una secuencia de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, o una combinación de las mismas. En una realización específica, la proteína es un anticuerpo y el anticuerpo comprende un Fc que tiene una secuencia de IgG1, IgG2, IgG3 y/o IgG4.

En una realización, la célula se selecciona de una célula CHO, COS, de retina humana (p.ej., PER.C6™), Vero o HeLa.

En un aspecto, se proporciona un método para preparar una glucoproteína con fucosilación reducida, comprendiendo el método:

(a) cultivar una célula de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde la célula expresa dicha proteína FX y una glucoproteína; y

b) aislar la glucoproteína de dicho cultivo.

En una realización, se proporciona un método para preparar una glucoproteína, que comprende cultivar una célula CHO que expresa glucoproteína en medio de cultivo en condiciones suficientes para que la célula CHO exprese la glucoproteína, y recuperar de la célula CHO o del medio de cultivo la glucoproteína expresada. En una realización, la glucoproteína expresada no está fucosilada en más de aproximadamente un 5 %. En una realización, no está fucosilada en más de aproximadamente un 4 %, 3 %, 2 %, 1 % o 0,5 %. En una realización específica, el porcentaje de fucosilación es un porcentaje molar de fucosa a glucano. En una realización específica, el porcentaje de fucosilación es un porcentaje molar de fucosa a glucoproteína. En una realización específica, la relación molar de proteína no fucosilada a fucosilada es de aproximadamente 0,90 a 0,10, aproximadamente de 0,91 a 0,09, aproximadamente de 0,92 a 0,08, aproximadamente de 0,93 a 0,07, aproximadamente de 0,94 a 0,06, aproximadamente de 0,95 a 0,05, aproximadamente de 0,96 a 0,04, aproximadamente de 0,97 a 0,03, aproximadamente de 0,98 a 0,02 o aproximadamente de 0,99 a 0,01.

En una realización, la glucoproteína comprende una región CH2 y CH3 de inmunoglobulina que tiene en la posición 297 (numeración EU) el siguiente resto de glucano: GlcNAc(1) unido a la glucoproteína a través del enlace N; Glc-NAc(1) -GlcNAc(2)-Manosa(1), en donde la manosa(1) lleva un primer y un segundo resto, en donde el primer resto consiste esencialmente en Manosa(2)-ManGlcNAc(3); y en donde el segundo resto consiste esencialmente en Manosa(3)-GlcNAc(4). En una realización, el resto de carbohidrato consiste además esencialmente en una Gal(1) unida a GlcNAc(4). En otra realización, el resto de carbohidrato consiste además esencialmente en una Gal(1) unida a GlcNAc(4) y un Gal(2) unida a GlcNAc(3).

En una realización, la glucoproteína fucosilada comprende un resto de glucano idéntico al resto de glucano no fucosilado descrito en el párrafo inmediatamente anterior a este párrafo, pero también lleva un resto de fucosa en GlcNAc(1).

En un aspecto, se proporciona una célula genéticamente modificada, en donde la modificación es para un gen FX y en donde la modificación da como resultado que la célula produzca un ARNm de FX que codifica una proteína FX que tiene al menos 289S; y la célula muestra una capacidad reducida para fucosilar una glucoproteína en comparación con una célula que carece de la modificación del gen FX. En otra realización, el ARNm codifica una proteína FX que además comprende al menos uno de 79S, 90K, 136L, 211R.

En la célula genéticamente modificada proporcionada, la modificación es para un gen FX, y la modificación altera un codón del gen FX de modo que el gen FX modificado codifica una proteína FX que comprende una serina en la posición 289 y puede comprender además al menos una de una lisina en la posición 90, una leucina en la posición 136 y/o una arginina en la posición 211.

En una realización, la célula expresa además una proteína que contiene Fc. En una realización, la proteína que contiene Fc es un anticuerpo.

En una realización, la célula glucosila la proteína que contiene Fc, pero no fucosila sustancialmente la proteína que contiene Fc glucosilada. En una realización específica, la fucosilación es aproximadamente no más del 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1% o 0,5 % de la fucosilación de la proteína que contiene Fc glucosilada en comparación con una célula que carece de la modificación del gen FX.

En una realización, la glucosilación comprende un grupo trimanosilo biantenario. En una realización, la relación molar de fucosa a grupo trimanosilo biantenario no es más de aproximadamente 1:20, 1:25, 1:33, 1:50, 1:100 o 1:200. En una realización, la relación molar de fucosa a grupo trimanosilo biantenario en la proteína que contiene Fc fucosilada no es más de aproximadamente 1:20, 1:25, 1:33, 1:50, 1:100 o 1:200.

En una realización, la proteína que contiene Fc es un anticuerpo, y la glucosilación comprende un resto de glucano en la posición 297 de Fc. En una realización, la relación molar de fucosa a resto de glucano no es más de aproximadamente 1:20, 1:20, 1:25, 1:33, 1:50, 1:100 o 200. En una realización, el resto de glucano comprende dos restos GlcNAc en tándem seguidos de un resto trimanosilo biantenario, en donde cada uno de los dos restos manosilo terminales del resto trimanosilo lleva un resto GlcNAc. En una realización, la relación molar de fucosa a GlcNAc en el glucano no es más de 1:80, 1:100, 1:133, 1:150, 1:200, 1:400 o 1:800.

También se divulga una célula de mamífero modificada que expresa ectópicamente una glucoproteína, en donde la modificación comprende una secuencia de un ácido nucleico de FX modificada, y la célula comprende una vía de rescate de fucosa y una vía de síntesis de fucosa de novo y expresa una proteína f Ut 8 funcional y una proteína GMD funcional, en donde la vía de síntesis de fucosa de novo es incapaz de fucosilar sustancialmente una glucoproteína debido a la modificación de la secuencia del ácido nucleico de FX a aproximadamente 37 °C, pero es capaz de fucosilar sustancialmente la glucoproteína a aproximadamente 34 °C.

Los aspectos y realizaciones individuales descritos en el presente documento están destinados a emplearse solos o en combinación con cualquier otro aspecto o realización, a menos que se indique expresamente lo contrario o a menos que el contexto rechace dicha combinación.

Breve descripción de las figuras

La FIG. 1 muestra una alineación MacVector™ para la secuencia de la proteína FX (de arriba a abajo) de mono (Macacoa mulatta), SEQ ID NO:3; ser humano, SEQ ID NO:4; ratón(Mus musculus), SEQ ID NO:5; rata (Rattus norvegicus), SEQ ID NO:6; CHO (Cricetulus griseus), SEQ ID NO:1; y CHO con una modificación L289S y N90K (línea celular denominada 8088), SEQ ID NO:2.

La FIG. 2 muestra histogramas de citometría de flujo de células 3033, 6066, 7077 y 8088 antes y después de la tinción con LCA.

La FIG. 3 muestra histogramas de citometría de flujo de células 4044-1 no teñidas e histogramas de células 4044­ 1,6069, 2020 y 2121 teñidas con LCA.

La FIG. 4 muestra histogramas de citometría de flujo de células 5055 no teñidas e histogramas de células 5055, 8088 y 1010 teñidas con LCA.

La FIG. 5 muestra histogramas de citometría de flujo de células 4044-1 y 6066-1 cultivadas a 37 °C y 34 °C antes y después de la tinción con LCA.

La FIG. 6 muestra histogramas de citometría de flujo de células 3033, 7077, 8088 y 1010 cultivadas en medio con y sin L-fucosa 5 mM, e histogramas de células 5055 cultivadas en medio sin L-fucosa. Todas las células se tiñeron con LCA.

La FIG. 7 muestra histogramas de citometría de flujo de células 8088 transfectadas de forma estable con pR4009, pR4010, pR4011 y células 5055.

La FIG. 8 muestra la separación de glucanos por HPLC para Ab 3.1 en células 8088 cultivadas a 37 °C en ausencia de una fuente de fucosa externa (fucosilación al 1,47 %).

La Fig. 9 muestra los resultados de espectrometría de masas para los glucanos de la Fig. 8; las estructuras de los glucanos se presentan a la derecha de cada pico. Los restos de GlcNAc están representados por cuadrados; los restos de manosa están representados por círculos; los restos de galactosa están representados por diamantes. La Fig. 10 muestra la separación de glucanos por HPLC para Ab 3.1 en células 8088 cultivadas a 37 °C en presencia de fucosa 10 mM (fucosilación al 95,22 %).

La Fig. 11 muestra los resultados de espectrometría de masas para los glucanos de la Fig. 10; las estructuras de los glucanos se presentan a la derecha de cada pico. Los restos de GlcNAc están representados por cuadrados; los restos de manosa están representados por círculos; los restos de galactosa están representados por diamantes; los restos de fucosa están representados por triángulos.

La FIG. 12 muestra la separación de glucanos por HPLC para Ab 3.2 en células 8088 cultivadas a 37 °C en ausencia de una fuente de fucosa externa (fucosilación al 5,73 %).

La Fig. 13 muestra los resultados de espectrometría de masas para los glucanos de la Fig. 12; las estructuras de los glucanos se presentan a la derecha de cada pico. Los restos de GlcNAc están representados por cuadrados; los restos de manosa están representados por círculos; los restos de galactosa están representados por diamantes. La Fig. 14 muestra la separación de glucanos por HPLC para Ab 3.2 en células 8088 cultivadas a 37 °C en presencia de fucosa 10 mM (fucosilación al 95,63 %).

La Fig. 15 muestra los resultados de espectrometría de masas para los glucanos de la Fig. 14; las estructuras de los glucanos se presentan a la derecha de cada pico. Los restos de GlcNAc están representados por cuadrados; los restos de manosa están representados por círculos; los restos de galactosa están representados por diamantes; los restos de fucosa están representados por triángulos.

La Fig. 16 resume los resultados de los estudios de espectrometría de masas en líneas celulares de tipo silvestre y de baja fucosilación. Los restos de GlcNAc están representados por cuadrados; los restos de manosa están representados por círculos; los restos de galactosa están representados por diamantes; los restos de fucosa están representados por triángulos.

Descripción

La invención no se limita a los métodos y condiciones experimentales particulares descritos, ya que dichos métodos y condiciones pueden variar. La terminología utilizada en el presente documento tiene el propósito de describir realizaciones particulares solamente y no pretende ser limitante, ya que la invención está abarcada por las reivindicaciones concedidas.

A menos que se definan de otro modo, todos los términos y expresiones utilizados incluyen los significados que los términos y las expresiones alcanzan en la técnica, salvo que se indique claramente lo contrario o sea claramente evidente a partir del contexto en donde se usa un término o expresión. Aunque en la práctica o prueba de la presente invención también se puede usar cualquier método y material similares o equivalentes a los descritos en el presente documento, a continuación, se describen métodos y materiales particulares.

La referencia al singular (p.ej., "un, una/o" o "el/la") pretende abarcar la referencia al plural, a menos que el contexto indique claramente que se excluye la referencia al plural.

El término "anticuerpo" incluye moléculas de inmunoglobulina que comprenden cuatro cadenas polipeptídicas, dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas mediante enlaces disulfuro. Cada cadena pesada comprende una región variable de cadena pesada (VH) y una región constante de cadena pesada (CH). La región constante de cadena pesada comprende tres dominios, CH1, CH2 y CH3. Cada cadena ligera comprende una región variable de cadena ligera (VL) y una región constante de cadena ligera (CL). Las regiones VH y VL pueden subdividirse además en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones marco conservadas (FR). Cada VH y VL comprende tres CDR y cuatro FR, dispuestas desde el extremo amino hasta el extremo carboxi en el siguiente orden: ^{F r 1 ,} CDR1, FR2, CDR2, FR3, ^{c D r 3 ,} FR4 (las CDR de cadena pesada pueden abreviarse como HCDR1, HCDR2 y HCDR3; las CDR de cadena ligera pueden abreviarse como LCDR1, LCDR2 y LCDR3. La expresión anticuerpo de "alta afinidad" se refiere a un anticuerpo que tiene una KD con respecto a su epítopo diana de aproximadamente 10-9 M o menor (p.ej., aproximadamente 1 x 10-9 M, 1 x 10-10 M, 1 x 10-11 M, o aproximadamente 1 x 10-12 M). En una realización, la ^{k D} se mide mediante resonancia de plasmón superficial, p.ej., BIACORE™; en otra realización, la KD se mide mediante ELISA.

La expresión "proteína de unión" incluye cualquier proteína que sea capaz de reconocer específicamente un compañero de unión. El reconocimiento específico generalmente requiere que la proteína de unión se una a su compañero de unión con una constante de disociación (KD) no superior a unos pocos micromolar y, en la mayoría de los casos, las proteínas de unión deseables se unen a sus compañeros de unión en el intervalo nanomolar, p.ej., en varias realizaciones del orden de menos de cien nanomolar. La mayoría de las proteínas de unión descritas en el presente documento también son proteínas que contienen Fc, es decir, comprenden un resto de unión fusionado con un Fc que comprende al menos una parte funcional de una región CH2 y ^{c H 3} de inmunoglobulina. Las proteínas de unión típicas son anticuerpos, anticuerpos multiespecíficos (p.ej., anticuerpos biespecíficos), inmunoadhesinas, trampas (p.ej., trampas de citocina tales como trampas de IL-1; trampa de VEGF, etc.). Las proteínas de unión típicas que no son anticuerpos llevan un resto de unión (p.ej., un receptor o fragmento del mismo, un ligando o fragmento del mismo, una variación en un dominio variable canónico de inmunoglobulina, etc.) y un resto de inmunoglobulina que frecuentemente comprende un dominio de inmunoglobulina CH2 y CH3 (o un fragmento del mismo que conserva una función efectora de Fc). Por tanto, las composiciones y métodos de la invención se pueden usar para producir proteínas de unión (p.ej., incluidas inmunoadhesinas y trampas) que llevan una región de inmunoglobulina que se une a un receptor Fc y/o que activa el complemento (p.ej., una región CH2 y CH3 funcionales) y por lo tanto es capaz de mediar en ADCC y/o CDC.

Los anticuerpos multiespecíficos pueden ser específicos para diferentes epítopos de un polipéptido diana o pueden contener dominios de unión a antígeno específicos para más de un polipéptido diana. Se pueden producir proteínas de unión multiespecíficas que son biespecíficas que comprenden dos brazos de inmunoglobulina, p.ej., en donde el primer brazo de una inmunoglobulina es específico para un primer epítopo y el segundo brazo de la inmunoglobulina es específico para un segundo epítopo. Otras proteínas de unión multiespecíficas incluyen aquellas en donde el segundo brazo lleva un resto de unión (un ligando o un receptor o fragmento de unión del mismo) que se une específicamente a una diana que es un compañero de unión proteico o no proteico.

La expresión "anticuerpo biespecífico" incluye un anticuerpo capaz de unirse selectivamente a dos o más epítopos. Los anticuerpos biespecíficos generalmente comprenden dos cadenas pesadas no idénticas, uniéndose cada cadena pesada específicamente a un epítopo diferente, ya sea en dos moléculas diferentes (p.ej., epítopos diferentes en dos antígenos diferentes) o en la misma molécula (p.ej., epítopos diferentes en el mismo antígeno). Si un anticuerpo biespecífico es capaz de unirse selectivamente a dos epítopos diferentes (un primer epítopo y un segundo epítopo), la afinidad de la primera cadena pesada por el primer epítopo será generalmente al menos de uno a dos o de tres o cuatro o más órdenes de magnitud menor que la afinidad de la primera cadena pesada por el segundo epítopo, y viceversa. Los epítopos unidos específicamente por el anticuerpo biespecífico pueden estar en la misma diana o en una diana diferente (p.ej., en la misma proteína o en una diferente). Se pueden producir anticuerpos biespecíficos, por ejemplo, mediante la combinación de cadenas pesadas que reconocen diferentes epítopos del mismo antígeno. Por ejemplo, las secuencias de los ácidos nucleicos que codifican secuencias variables de cadena pesada que reconocen diferentes epítopos del mismo antígeno se pueden fusionar con secuencias de los ácidos nucleicos que codifican las mismas regiones constantes de cadena pesada o diferentes, y dichas secuencias se pueden expresar en una célula que expresa una cadena ligera de inmunoglobulina. Un anticuerpo biespecífico típico tiene dos cadenas pesadas, teniendo cada una tres CDR de cadena pesada, seguidas de (N-terminal a C-terminal) un dominio CH1, una bisagra, un dominio CH2 y un dominio CH3, y una cadena ligera de inmunoglobulina que no confiere especificidad de unión al epítopo pero que puede asociarse con cada cadena pesada, o que puede asociarse con cada cadena pesada y que puede unirse a uno o más de los epítopos unidos por las regiones de unión al epítopo de cadena pesada, o que pueden asociarse con cada cadena pesada y permitir la unión de una o ambas cadenas pesadas a uno o ambos epítopos.

Un ejemplo de un formato de proteína de unión biespecífica emplea un primer dominio CH3 de inmunoglobulina (Ig) y un segundo dominio CH3 de Ig, en donde el primer y el segundo dominio CH3 de Ig difieren entre sí en al menos un aminoácido, y en donde al menos la diferencia de un aminoácido reduce la unión del anticuerpo biespecífico a la proteína A en comparación con un anticuerpo biespecífico que carece de la diferencia de aminoácido. En una realización, el primer dominio CH3 de Ig se une a la proteína A y el segundo dominio CH3 de Ig contiene una mutación que reduce o elimina la unión a la proteína A, tal como una modificación 435R (por numeración EU; 95R por numeración de exón IMGT). El segundo CH3 puede comprender además una modificación 436F (por numeración EU; 96F por numeración IMGT). Otras modificaciones que se pueden encontrar dentro del segundo CH3 incluyen 356E, 358M, 384S, 392N, 397M y 4221 (por numeración EU; 16E, 18M, 44S, 52N, 57M y 82I por numeración ^{I M g T ) .} En este formato, el primer dominio CH3 de Ig se fusiona con un primer resto de unión (p.ej., un primer dominio variable de Ig que se une específicamente a un primer epítopo), y el segundo dominio CH3 de Ig se fusiona con un segundo resto de unión (p.ej., un segundo dominio variable de Ig que se une específicamente a un segundo epítopo, en donde el primer y segundo epítopos son diferentes).

El término "célula" incluye cualquier célula que sea adecuada para expresar una secuencia de un ácido nucleico recombinante. Las células incluyen eucariotas (unicelulares o pluricelulares), células de levadura (p.ej., S. cerevisiae,

S. pombe, P. pastoris, P. methanolica, etc.), células vegetales, células de insectos (p.ej., SF-9, s F-21, células de insectos infectadas por baculovirus, Trichoplusia ni, etc.), células animales no humanas, células humanas, o fusiones de células tal como, por ejemplo, hibridomas o cuadromas. Las células que no comprenden naturalmente una vía de fucosilación pueden modificarse genéticamente para contener una (véase, p.ej., la Publicación de Solicitud de Patente de EE.UU. N.° 2010/0028951A1), y la célula puede modificarse para emplear un gen FX que se modifica como se describe en el presente documento.

En algunas realizaciones, la célula es una célula humana, de mono, de simio, de hámster, de rata o de ratón. En algunas realizaciones, la célula es eucariota y se selecciona de las siguientes células: CHO (p.ej., CHO K1, DXB-11

CHO, Veggie-CHO), COS (p.ej., COS-7), hámster sirio, mieloma de rata, mieloma de ratón (p.ej., SP2/0, NS0), célula retiniana, Vero, CV1, de riñón (p.ej., HEK293, 293 EBNA, MSR 293, MDCK, HaK, BHK, BHK21), HeLa, HepG2, WI38,

MRC 5, Colo205, HB 8065, HL-60, Jurkat, Daudi, A431 (epidérmica), CV-1, U937, 3T3, célula L, célula C127, MMT 060562, célula de Sertoli, célula BRL 3A, célula HT1080, una célula de mieloma humano, célula tumoral, una célula de linfoma humano (p.ej., una célula de Namalwa) y una línea celular derivada de una célula mencionada anteriormente. En algunas realizaciones, la célula comprende uno o más genes víricos, p.ej., la célula es una célula retiniana que expresa un gen vírico (p.ej., una célula p Er .C6™).

La expresión "proteína que contiene Fc" incluye anticuerpos, anticuerpos biespecíficos, inmunoadhesinas y otras proteínas de unión que comprenden al menos una parte funcional de una región CH2 y CH3 de inmunoglobulina. Una

"parte funcional" se refiere a una región CH2 y CH3 que puede unirse a un receptor Fc (p.ej., un FcyR o un FcRN) y/o que puede participar en la activación del complemento. Si la región CH2 y CH3 contiene deleciones, sustituciones y/o inserciones u otras modificaciones que la hacen incapaz de unirse a ningún receptor de Fc y también incapaz de activar el complemento, la región CH2 y CH3 no es funcional.

Las proteínas que contienen Fc pueden comprender modificaciones en los dominios de inmunoglobulina, incluyendo dónde las modificaciones afectan una o más funciones efectoras de la proteína de unión (p.ej., modificaciones que afectan la unión de FcyR, unión de FcRN y, por lo tanto, a la semivida y/o actividad CDC). Dichas modificaciones incluyen, pero sin limitación, las siguientes modificaciones y combinaciones de las mismas, con referencia a la numeración EU de una región constante de inmunoglobulina: 238, 239, 248, 249, 250, 252, 254, 255, 256, 258, 265,

267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 307, 308, 309, 311, 312, 315, 318, 320, 322,

324, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 340, 342, 344, 356, 358, 359, 360, 361, 362, 373, 375, 376, 378, 380, 382, 383, 384, 386, 388, 389, 419, 428, 430, 433, 434, 435, 437, 438 y 439. Por ejemplo, y no a modo de limitación, la proteína de unión puede mostrar una semivida en suero potenciada y tener una modificación en las posiciones 252, 254 y 256; o una modificación en 428 y/o 433 y/o 434; o una modificación en 250 y/o 428; o una modificación en 307 o 308 y 434.

El término "FX" se refiere a una proteína que muestra actividad GDP-4-ceto-6-desoximanosa-3,5-epimerasa-4-reductasa o a una secuencia de un ácido nucleico que codifica una proteína que tiene actividad GDP-4-ceto-6-desoximanosa-3,5-epimerasa-4-reductasa. La mayoría de los ejemplos descritos en el presente documento se refieren a una FX de C. griseus de tipo silvestre o a una Fx de C. griseus que está modificada de acuerdo con la invención.

Sin embargo, "FX" no se limita a hacer referencia a una célula CHO. Como se muestra en la FIG. 1, una alineación de secuencias FX de Macaca mulata, ser humano, Mus musculus, Rattus norvegicus revelan un grado de conservación muy alto, es decir, las secuencias de FX de varios organismos son muy, muy similares. Basándose en este alto grado de identidad, es de esperar que las pequeñas diferencias de secuencia que existen entre estas especies no afectarán sustancialmente a la actividad FX. Las diferencias entre la secuencia de FX de CHO (SEQ ID NO: 1) y las secuencias de mono (SEQ ID NO: 3), ser humano (SEQ ID NO: 4), ratón (SEQ ID NO: 5) y rata (SEQ ID n O: 6) incluyen lo siguiente: 5H, 8M, 21K, 37D, 51T, 55R, 59E, 62R, 93M, 106A, 107C, 138N, 161Y, 167S, 177Y, 201S, 202S, 202D, 212N, 225Q, 235S, 266H, 266N, 266S, 273T, 274S, 280F, 287S, 291T, 291S, 297C, 310D, 314E. Para la FX de CHO de tipo silvestre de 321 aminoácidos (SEQ ID NO: 1), cualquiera de las secuencias de FX de mono, ser humano, ratón y rata pueden recapitularse seleccionando entre 31 sustituciones diferentes, o 31/321 x 100 = 9,6 % de la secuencia de FX de CHO de tipo silvestre. Por tanto, una FX modificada de la invención incluye una FX de CHO de tipo silvestre

(p.ej., SEQ ID NO: 1) o una FX que tiene al menos un 90,4 % de identidad con una FX de CHO de tipo silvestre, y que también lleva una sustitución 289S y puede comprender además al menos una sustitución adicional seleccionada del grupo que consiste en N79S, N90K, G211R. Para menos desviaciones de la SEQ ID NO: 1, una FX modificada de la invención es al menos un 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % idéntica con la SEQ ID NO: 1 y lleva modificaciones L289S y puede comprender además al menos una modificación seleccionada del grupo que consiste en N79S, N90K, P136L, G211R. Una persona experta esperaría que una o más de una pequeña inserción o una o más de una pequeña eliminación que incluye al menos una de las posiciones 79, 90, 136 y 211 probablemente también proporcionen ventajas asociadas con una realización de la invención (p.ej., una célula que lleva el gen modificado mostraría una fucosilación reducida de una glucoproteína).

En una realización específica, la FX comprende una primera sustitución que es 289S y una o más de las segundas sustituciones.

La expresión "fucosilación baja" o "fucosilación reducida" se refiere a una capacidad disminuida o reducida de una

célula modificada para fucosilar una glucoproteína en comparación con una célula normal o de tipo silvestre. La glucoproteína puede ser una glucoproteína endógena. Más generalmente, la modificación del ácido nucleico se realiza en una célula que se usa para expresar una glucoproteína heteróloga, p.ej., una célula que expresa una proteína de unión (p.ej., un anticuerpo o anticuerpo biespecífico o una inmunoadhesina u otra glucoproteína que contiene Fc) de forma ectópica. Por ejemplo, una línea celular CHO o PERC.6™ modificada de acuerdo con la invención, que también expresa un anticuerpo humano, p.ej., un anticuerpo IgG1 humano.

En general, la referencia a "fucosilación baja" o "fucosilación reducida" con respecto a una glucoproteína no se refiere a una sola molécula de glucoproteína que tenga menos restos de fucosa unidos a ella. Más bien, se hace referencia a una preparación de glucoproteínas preparada a partir de células, y la preparación de glucoproteínas comprende una población de moléculas de glucoproteína individuales, teniendo los miembros de la población diferentes características de glucosilación. Con fines ilustrativos y no limitativos, para un anticuerpo IgG1 expresado en una célula CHO modificada de acuerdo con la invención, "baja fucosilación" o "fucosilación reducida" se refiere a un número menor de glucoproteínas individuales que tienen un resto de fucosa en un resto de GlcNAc unido a N de un glucano en la posición 297 del Fc. Dicha "fucosilación baja" o "fucosilación reducida" se puede caracterizar de una variedad de formas (véase en otra parte del presente documento), pero en cada caso se hace referencia a un número relativamente bajo (o reducido) de glucoproteínas de la población que tienen restos de fucosa en comparación con una población de la misma glucoproteína preparada en una línea celular que carece de una modificación de acuerdo con la invención.

A modo ilustrativo, si una glucoproteína preparada de acuerdo con la invención está fucosilada al 1 % en comparación con la misma glucoproteína preparada con una célula de tipo silvestre, solo el 1 % de las moléculas de proteína que contienen Fc están fucosiladas en la célula de la invención en comparación con la cantidad de fucosilación observada en una célula de tipo silvestre correspondiente (establecida arbitrariamente al 100 %, si todas las moléculas de proteínas que contienen Fc están fucosiladas o no en la célula de tipo silvestre en las mismas condiciones).

En una célula de "baja fucosilación" o "fucosilación reducida" de acuerdo con la invención, la fucosilación de una glucoproteína se reduce aproximadamente un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % en comparación con una célula que no contiene la modificación. En una realización específica, la reducción es aproximadamente el 99,1 %, 99,2 %, 99,3 %, 99,4 %, 99,5 %, 99,6 %, 99,7 %, 99,8 % o 99,9 % en comparación con una célula que no contiene la modificación. En otra realización específica, la reducción es aproximadamente el 98,1 %, 98,2 %, 98,3 %, 98,4 %, 98,5 %, 98,6 %, 98,7 %, 98,8 % o 98,9 % en comparación con una célula que no contiene la modificación. En otra realización específica, la reducción es aproximadamente el 97,1 %, 97,2 %, 97,3 %, 97,4 %, 97,5 %, 97,6 %, 97,7 %, 97,8 % o 97,9 % en comparación con una célula que no contiene la modificación. En otra realización específica, la reducción es aproximadamente el 96,1 %, 96,2 %, 96,3 %, 96,4 %, 96,5 %, 96,6 %, 96,7 %, 96,8 % o 96,9 % en comparación con una célula que no contiene la modificación. En otra realización específica, la reducción es aproximadamente el 95,1 %, 95,2 %, 95,3 %, 95,4 %, 95,5 %, 95,6 %, 95,7 %, 95,8 % o 95,9 % en comparación con una célula que no contiene la modificación. En otra realización específica, la reducción es aproximadamente el 94,1 %, 94,2 %, 94,3 %, 94,4 %, 94,5 %, 94,6 %, 94,7 %, 94,8 % o 94,9 % en comparación con una célula que no contiene la modificación.

Una preparación de glucoproteínas producida en una célula de acuerdo con la invención está fucosilada solo aproximadamente el 5 %, aproximadamente el 4 %, aproximadamente el 3 %, aproximadamente el 2 %, aproximadamente el 1 %, aproximadamente el 0,5 %, aproximadamente el 0,4 %, aproximadamente el 0,3 %, aproximadamente el 0,2%, o aproximadamente el 0,1% de la cantidad de fucosilación de la misma glucoproteína producida en una célula que no contiene la modificación.

Otra forma de caracterizar una preparación de glucoproteínas a partir de una célula de "baja fucosilación" o "fucosilación reducida" es mediante la relación de glucoproteína fucosilada a no fucosilada en la preparación de glucoproteínas producida por la célula. Por ejemplo, una preparación de glucoproteínas producida por una célula modificada tiene una relación de glucoproteína fucosilada:glucoproteína no fucosilada de aproximadamente 1:10 a 1:15, 1:15 a 1:20, 1:20 a 1:40, 1:40 a 1:60, 1:60 a 1:80, 1:80 a 1:100 o 1:100 a 1:150.

Otra forma de caracterizar una preparación de glucoproteínas a partir de una célula de "fucosilación baja" o "fucosilación reducida" es por el porcentaje en peso relativo de glucoproteína no fucosilada (en comparación con el total, es decir, glucoproteína fucosilada y no fucosilada). Por ejemplo, una preparación de glucoproteínas producida por una célula modificada tiene un porcentaje de glucoproteína no fucosilada que es aproximadamente el 90 %, aproximadamente el 95 %, aproximadamente el 96 %, aproximadamente el 97 %, aproximadamente el 98 %, aproximadamente el 99 %, o aproximadamente el 99,5 % en comparación con la misma preparación de glucoproteínas de una célula que carece de la modificación.

Otra forma de caracterizar una preparación de glucoproteínas a partir de una célula de "baja fucosilación" o "fucosilación reducida" es mediante la cantidad relativa de fucosa a glucano o la cantidad relativa de fucosa a componente de glucano de la preparación de glucoproteínas. Por ejemplo, en el caso de proteínas que contienen Fc (p.ej., anticuerpos), la glucosilación comprende un glucano en la posición 297 y el glucano comprende un resto trimanosilo biantenario. En una realización, la relación molar de fucosa a resto de glucano no es más de aproximadamente 1:20, 1:20, 1:25, 1:33, 1:50, 1:100 o 1:200. En una realización, la relación de fucosa al resto trimanosilo biantenario no es más de aproximadamente 1:20, 1:25, 1:33, 1:50, 1:100 o 1:200. En una realización, la relación molar de fucosa al resto trimanosilo biantenario en la proteína que contiene Fc fucosilada no es más de aproximadamente 1:20, 1:25, 1:33, 1:50, 1:100 o 1:200. En una realización, el resto de glucano comprende dos restos GlcNAc en tándem seguidos de un resto trimanosilo biantenario, en donde cada uno de los dos restos manosilo terminales antenarios del resto trimanosilo lleva un resto GlcNAc. En una realización, la relación molar de fucosa a GlcNAc en el glucano no es más de 1:80, 1:100, 1:133, 1:150, 1:200, 1:400 o 1:800.

En una realización, la cantidad de proteína de anticuerpo producida que está fucosilada se mide por desglucosilación durante la noche de la proteína de anticuerpo con PNGasa F seguida de análisis de oligosacáridos mediante HPLC en donde los oligosacáridos que contienen fucosilo se cuantifican mediante la integración del área máxima de glucano y, p.ej., la fucosilación de proteínas se calcula basándose en el área máxima de glucanos. La identidad (y composición) del glucano se puede determinar (y/o cuantificar) mediante cualquier método adecuado (p.ej., espectroscopía de masas).

La expresión "tipo silvestre" incluye la referencia a una célula o una actividad que no está modificada de acuerdo con la invención, p.ej., una célula que no contiene una secuencia del ácido nucleico FX modificada o una proteína FX modificada. La actividad de FX "de tipo silvestre" incluye referencia a cualquier parámetro de actividad (p.ej., actividad enzimática) que muestra un gen o proteína de FX natural o no modificados. Al comparar la actividad de "tipo silvestre" de una proteína FX y la actividad de una proteína FX modificada, la proteína FX "de tipo silvestre" y la proteína FX modificada se aíslan sustancialmente de la misma manera a partir de sustancialmente la misma fuente (p.ej., mismo tipo de célula, mismo organismo) y se comparan sustancialmente en las mismas condiciones. Al comparar la actividad de FX "de tipo silvestre" y la actividad de FX modificada entre células de tipo silvestre y células modificadas, la actividad de FX se mide preferentemente en condiciones sustancialmente iguales o sustancialmente similares, con una glucoproteína idéntica o sustancialmente idéntica.

Visión general

Se proporcionan secuencias del ácido nucleico y proteína FX modificadas, en donde la modificación da como resultado una célula que no puede soportar la fucosilación de proteínas en ausencia de una fuente de fucosa externa a un nivel en el que una célula que carece de la modificación puede soportar. Las células muestran una capacidad sustancialmente reducida para fucosilar glucoproteínas (en ausencia de una fuente de fucosa) a una temperatura debido a una alteración en una actividad enzimática de la vía de novo para la síntesis del sustrato para la fucosilación de glucoproteínas, GDP-L-fucosa. A otra temperatura (más alta), la reducción de la capacidad de la célula es mínima o insustancial.

La enzima GDP-4-ceto-desoxi-manosa-3,5,-epimerasa-4-reductasa (FX), participa en la vía de síntesis de GDP-L-fucosa de novo, formando GDP-L-fucosa a partir de GDP-4-ceto-6-desoximanosa. La GDP-L-fucosa resultante se puede utilizar por una célula para producir proteínas fucosiladas, incluyendo anticuerpos fucosilados. Debido a que la GDP-L-fucosa sintetasa participa en la vía de novo, la reducción en la fucosilación en células que carecen de suficiente actividad FX puede rescatarse por una vía de rescate. La vía de rescate requiere fucosa, sobre la que se actúa a través de la vía de rescate para formar GDP-L-fucosa, un sustrato para la fucosilación de proteínas.

Determinadas modificaciones en FX dan como resultado la incapacidad de una célula que tiene un gen FX modificado para mantener la fucosilación de proteínas en ausencia de una fuente de fucosa, de manera que una célula que lleva la enzima modificada y que expresa, p.ej., un anticuerpo recombinante, muestra una reducción sustancial en la capacidad de fucosilar el anticuerpo, en comparación con una célula de tipo silvestre que lleva el gen FX de tipo silvestre.

La incapacidad para mantener una tasa o nivel suficiente de fucosilación de proteínas debido a las modificaciones del gen FX descritas en el presente documento depende sustancialmente de la temperatura. En particular, las células que llevan un gen FX modificado muestran una incapacidad sustancial para mantener la fucosilación de las glucoproteínas a aproximadamente 37 °C (p.ej., 7 % de fucosilación de un anticuerpo de isotipo IgG1 humana), que se alivia sustancialmente a aproximadamente 34 °C (p.ej., 70 % de fucosilación del mismo anticuerpo; véase la Tabla 3). Las células que solo tienen un gen FX de tipo silvestre, por el contrario, no presentan una gran diferencia en la capacidad de mantener la fucosilación de glucoproteínas a 37 °C en comparación con 34 °C.

Vías De Novo y de Rescate hacia GDP-fucosa

La GDP-fucosa es un metabolito central en la vía de fucosilación de glucoproteínas; es el donante de fucosa en la fucosilación de glucoproteínas. Todas las fucosiltransferasas conocidas de interés que pueden fucosilar una glucoproteína que comprende un Fc usan GDP-fucosa. Por tanto, para la fucosilación eficaz de glucoproteínas, se debe generar una reserva suficiente de GDP fucosa y mantenerla a un nivel suficiente para igualar la producción de glucoproteínas.

Hay dos vías principales hacia GDP-fucosa: una vía de síntesis de novo y una vía de rescate. En muchas células de mamíferos, la GDP-fucosa puede producirse a partir de una fuente de carbono suministrada externamente (p.ej., glucosa) mediante una vía de fucosilación de novo. En la vía para la fucosilación de novo, la glucosa entra en la célula a través de un transportador y se convierte en D-manosa-1-fosfato. A continuación, la D-manosa-1-fosfato se convierte mediante la D-manosa-1-fosfato guanililtransferasa en GDP-manosa. La GDP-manosa se convierte en GDP-4-ceto-6-desoxi-manosa por la GDP manosa 4,6-deshidratasa (GMD). La GDP-4-ceto-6-desoxi-manosa se convierte en GDP-fucosa por la GDP-4-ceto-6-desoxi-manosa-3,5-epimerasa-4-reductasa (FX). La GDP-fucosa es un potente inhibidor de retroalimentación de la GMD. La GDP-fucosa ingresa al aparato de Golgi a través de un transportador de GDP-fucosa. Una vez en el Golgi, la GDP-fucosa es un sustrato para la a1,6-fucosiltransferasa, que fucosila glucoproteínas.

En muchas células de mamíferos, también existe una vía de rescate para generar GDP-fucosa a partir de fucosa suministrada externamente. En la vía de rescate, la fucosa se transporta al interior de la célula y se fosforila para formar fucosa-1-fosfato, que se puede convertir en GDP-fucosa. La GDP-fucosa se transporta al Golgi y está disponible como sustrato para la a1,6-fucosiltransferasa. El transporte de fucosa al interior de la célula es supuestamente por difusión facilitada y por transporte lisosómico, y la vía de rescate parece ser universal en células de mamíferos (véase, p.ej, Becker y Lowe (2003) Fucose: biosynthesis and biological function in mammals, Glycobiology 13(7):41R-53R).

Por tanto, en ausencia de una fuente de fucosa, las células fucosilan proteínas usando fucosa generada por la vía de síntesis de novo. En presencia de fucosa, las células fucosilan glucoproteínas utilizando fucosa transportada al interior de la célula. Por lo tanto, si la vía de síntesis de novo está bloqueada o dañada, la fucosilación de glucoproteínas todavía puede producirse, pero solo en presencia de una fuente de fucosa.

Las composiciones y métodos descritos permiten líneas celulares que proporcionan un bloqueo condicional en una vía para fucosilar una glucoproteína al proporcionar una célula genéticamente modificada que tiene una modificación en una secuencia del ácido nucleico de FX. En células que contienen tanto una vía de novo y una de rescate, las células proporcionan mayor versatilidad. En tales células en ausencia de una fuente externa de fucosa, la fucosilación de una glucoproteína puede reducirse sustancialmente a una temperatura, pero no reducirse sustancialmente a una segunda temperatura. Como alternativa, esencialmente las tasas o los niveles de fucosilación de glucoproteínas de tipo silvestre se pueden activar proporcionando una fuente externa de fucosa, independientemente de la temperatura a la que se mantenga la célula.

Modificaciones de FX

También se divulga un ácido nucleico aislado que codifica una secuencia de proteína FX modificada. El ácido nucleico aislado codifica una proteína FX que comprende la sustitución de aminoácidos 2895 y puede comprender además una modificación de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en 79S, 90K, 136L y 211R y cualquier combinación de las mismas. El ácido nucleico codifica una proteína FX que comprende una serina en la posición 289, en otro caso puede comprender además al menos uno de un 79S, 90K, 136L y/o 211R.

El ácido nucleico que codifica la proteína FX modificada se usa en cualquier forma adecuada. La idoneidad de la forma del ácido nucleico depende de su uso. Por ejemplo, las formas adecuadas incluyen un ADNc que se puede usar en un vector de expresión para la expresión extracromosómica en una célula, o que se puede integrar (en una ubicación específica o al azar) en el genoma de una célula. Las formas adecuadas también incluyen una secuencia genómica, que se modifica para codificar la sustitución o sustituciones descritas en el presente documento. Las formas adecuadas también incluyen, por ejemplo, una secuencia de direccionamiento (p.ej., uno o más brazos de direccionamiento) para dirigir el ácido nucleico a una ubicación específica en un genoma, p.ej., para reemplazar uno o ambos alelos de un gen FX natural. Las formas adecuadas incluyen vectores de direccionamiento que dirigen el ácido nucleico a una ubicación específica en una célula, p.ej., a un locus FX, para el reemplazo de una secuencia del ácido nucleico de FX endógena por una secuencia del ácido nucleico de FX de acuerdo con la invención. La modificación de una secuencia de FX endógena se puede realizar en uno o ambos alelos de la célula.

Líneas Celulares con Fucosilación Baja o Reducida

Se proporcionan composiciones y métodos para líneas celulares de baja fucosilación. Las composiciones incluyen ácidos nucleicos y proteínas que, cuando están presentes en una célula que carece o carece sustancialmente de una actividad FX natural o de tipo silvestre, confieren a la célula una capacidad reducida para fucosilar una glucoproteína, p.ej., una glucoproteína que contiene Fc como, p.ej., un anticuerpo. En diversas realizaciones, dichas células incluyen células que muestran una capacidad sustancialmente reducida para fucosilar una glucoproteína a una primera temperatura (p.ej., aproximadamente 37 °C), pero conservan la capacidad de fucosilar la glucoproteína a una segunda temperatura (p.ej., aproximadamente 34 °C). Por tanto, se proporcionan células que se pueden cultivar a una primera temperatura que inhibe la fucosilación, y las condiciones de crecimiento se pueden cambiar a una segunda temperatura que permite la fucosilación.

Pueden prepararse líneas celulares de baja fucosilación usando cualquier célula adecuada junto con las composiciones y métodos descritos en el presente documento. Por ejemplo, y no a modo de limitación, se puede utilizar cualquier línea celular comúnmente empleada en la fabricación de productos biofarmacéuticos. En el presente documento se describen determinados métodos y composiciones para hacer útiles dichas líneas celulares como líneas celulares de baja fucosilación; otros son obvios o fácilmente evidentes para los expertos en la materia a la luz de esta descripción. Se pueden modificar genéticamente células humanas (p.ej., HeLa, PERC.6™, etc.), células CHO, células de ratón, etc. como se describe en el presente documento para generar una línea celular útil. En el caso de las células CHO, p.ej., se puede preparar una línea celular de baja fucosilación útil modificando un solo alelo del gen FX debido a la observación de que la actividad de FX de CHO parece ser funcionalmente haploide. En el caso de otras células que muestran una diploidía funcional en el locus FX, por otro lado, pueden manipularse reemplazando un alelo FX con una secuencia del ácido nucleico de FX modificada como se describe en el presente documento y desactivando el segundo alelo (de tipo silvestre), o reemplazando ambos alelos FX con una secuencia del ácido nucleico de FX modificada como se describe en el presente documento.

Las células resultantes incluyen aquellas cuya actividad FX se caracteriza total o sustancialmente como baja fucosilación. Es decir, la célula no necesita estar completamente desprovista de una proteína FX de tipo silvestre o un gen FX de tipo silvestre; sin embargo, la célula, en una condición o un conjunto de condiciones apropiadas (p.ej., una temperatura seleccionada), debería ser incapaz o sustancialmente incapaz de fucosilar una glucoproteína (p.ej., una glucoproteína que contiene Fc) en cualquier lugar cercano al nivel al que una célula correspondiente con la actividad FX puede fucosilar la misma glucoproteína.

La comparación de una célula de acuerdo con la invención y una célula que no contiene la modificación se lleva a cabo en las mismas o esencialmente en las mismas condiciones (p.ej., medios, temperatura, densidad celular, etc.). Por ejemplo, en diversas realizaciones, la célula mostrará una capacidad para fucosilar no más del 10 % a no más del 1 % de la capacidad para fucosilar que muestra una célula de tipo silvestre. Esta comparación se puede hacer, por ejemplo, preparando una célula que tiene la modificación o modificaciones descritas en el presente documento, y comparando el nivel de fucosilación de una glucoproteína expresada por la célula (p.ej., expresión de un anticuerpo a partir de una construcción de expresión en la célula) al nivel de fucosilación de la misma glucoproteína expresada por una célula de tipo silvestre. Para la comparación, las células se cultivan a la misma temperatura y en las mismas condiciones. El nivel de fucosilación de la glucoproteína se puede determinar usando cualquier método analítico adecuado conocido en la técnica para cuantificar la cantidad de fucosa presente en una preparación de glucoproteínas.

Para determinar cuánta glucoproteína está fucosilada, la cantidad de fucosa se compara con la cantidad de glucoproteína total o con la cantidad de glucano obtenido de la proteína.

Líneas celulares deficientes en fucosilación

Se han aislado varias líneas de células de mamíferos que en conjunto son incapaces de fucosilar glucoproteínas. El desarrollo de líneas celulares deficientes en fucosilación se ha visto impulsado en gran medida por la necesidad de producir anticuerpos que carecen de fucosilación. Los anticuerpos que carecen de fucosilación pueden mediar la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC, por sus siglas en inglés) mucho mejor que los anticuerpos fucosilados, debido a la unión alterada a un receptor de Fc. Los anticuerpos que median mejor en la ADCC son, por tanto, muy deseables, particularmente anticuerpos que comprenden regiones variables que se dirigen a células tumorales. Por tanto, las células que son incapaces de fucosilar las glucoproteínas se utilizan ampliamente en el desarrollo y fabricación de anticuerpos para usos terapéuticos.

Se han desarrollado dos desactivaciones de la vía de fucosilación que dan como resultado la incapacidad de una célula para fucosilar una glucoproteína. La desactivación de la a1,6-fucosiltransferasa (FUT8) da como resultado la incapacidad de transferir GDP-fucosa a una glucoproteína. La eliminación de GDP-manosa 4,6-deshidratasa (GMD) da como resultado la incapacidad de producir GDP-4-ceto-6-desoxi-manosa a partir de GDP-manosa en la vía de novo.

Las desactivaciones de la fucosilación cadena abajo de la formación de GDP-fucosa, p.ej., desactivaciones de a1,6-fucosiltransferasa, no pueden recurrir a la vía de rescate para fucosilar glucoproteínas en presencia de una fuente externa de fucosa. Esto se debe a que el bloqueo está distal a la formación de GDP-fucosa, el metabolito en donde se encuentran las vías de novo y de rescate. Por lo tanto, alimentar a las células que tienen tal desactivación con fucosa no rescatará la fucosilación de glucoproteínas. Por tanto, las desactivaciones de la a1,6-fucosiltransferasa no ofrecen una ruta simple para manipular selectivamente la capacidad de una célula para fucosilar una glucoproteína.

Las desactivaciones de la fucosilación cadena arriba de la formación de GDP-fucosa, p.ej., desactivaciones de GMD, teóricamente puede recurrir a la vía de rescate para fucosilar glucoproteínas. Esto se debe a que el bloqueo se produce antes de la formación de GDP-fucosa. La alimentación de tales células con fucosa rescatará teóricamente la fucosilación de glucoproteínas. Las líneas celulares que contienen desactivaciones, sin embargo, carecen de versatilidad.

Los inventores han descubierto que una alteración selectiva de la vía de fucosilación de novo antes de la formación de GDP-fucosa generará una línea celular con un defecto que se rescata al proporcionar una fuente de fucosa, o se rescata manteniendo las células en condiciones que son permisivas para la fucosilación. Los inventores han modificado células para tener un defecto en la vía de novo cadena arriba de la GDP-fucosa y que se pueden cultivar en ausencia de fucosa en una primera condición y muestran una capacidad sustancialmente reducida para fucosilar una glucoproteína, mientras que, en una segunda condición, las células pueden fucosilar eficazmente una glucoproteína incluso en ausencia de una fuente externa de fucosa. Una línea celular particularmente versátil presenta la opción de activar o desactivar la fucosilación en la línea celular controlando la disponibilidad de una fuente externa de fucosa (o un precursor de fucosa adecuado) y/o el crecimiento de células en una condición que permita la fucosilación o en una condición deficiente en fucosilación.

Los inventores han alterado selectivamente la vía de novo para la síntesis de GDP-fucosa generando una secuencia del ácido nucleico de FX mutada. La proteína FX es una epimerasa-reductasa bifuncional que epimeriza los grupos C3 hidroxilo y C5 metilo de la manosa, formando GDP-4-ceto-6-desoxigalactosa. Una actividad reductasa dependiente de NADPH de la enzima bifuncional reduce entonces el resto ceto para formar GDP-fucosa. El gen FX está muy conservado, lo que se refleja en los altos grados de identidad y similitud en las proteínas FX. Véase, p.ej., Becker y Lowe (2003) Fucose: biosynthesis and biological function in mammals, Glycobiology, 13(7):41R-53R. Por tanto, los datos presentados en relación con las mutaciones de FX en células CHO son aplicables a las correspondientes modificaciones de FX en una amplia variedad de células.

La alteración selectiva de FX proporciona una versatilidad potenciada, que permite a un practicante desfavorecer, o inhibir, la fucosilación manteniendo un cultivo a una primera temperatura; pero permite la fucosilación manteniendo el cultivo a una segunda temperatura. En varias realizaciones esto se ilustra por un gen FX modificado, en donde la modificación comprende una modificación seleccionada del grupo que consiste en (para una proteína FX de CHO) L289S, N79S, N90K, P136L/G211R y una combinación de las mismas. En diversas realizaciones, la modificación de FX consiste esencialmente en una modificación seleccionada del grupo que consiste en L289S, L289S/N90K, L289S/G211R, L289S/P136L, L289S/N79S y una combinación de las mismas.

Tal como conocen los expertos en la materia, determinadas células que son diploides muestran fenotipos que reflejan la actividad de solamente uno de dos alelos en locus particulares, p.ej., las células CHO, y con respecto a esos locus, parecen ser funcionalmente haploides (o hipodiploides) desde una perspectiva fenotípica. En tales células, la modificación de incluso un solo alelo como se describe en el presente documento puede dar como resultado un fenotipo que esencialmente refleja la actividad del alelo modificado, incluso en los casos en que el fenotipo no es un fenotipo dominante. Por ejemplo, en células CHO, la modificación como se describe en el presente documento de un solo alelo probablemente dará como resultado un fenotipo FX esencialmente como se describe en el presente documento, supuestamente debido a la no expresión (o hipoexpresión) del alelo FX de tipo silvestre.

En diversas realizaciones, la FX es una FX que no es de una célula CHO, y la modificación comprende una modificación seleccionada del grupo que consiste en una modificación que corresponde en la FX que no es de CHO, a las modificaciones en CHO enumeradas anteriormente. Las modificaciones correspondientes se pueden identificar alineando la secuencia de la proteína FX de CHO con cualquier otra secuencia de FX de interés (con o sin huecos en la alineación) usando, p.ej., un algoritmo de alineación de secuencias múltiples de propósito general tal como ClustalW con parámetros predeterminados p.ej., para FX humana (Número de registro AAC50786) y de C. griseus (Número de registro AAM91926), utilizando MacVector™ v. 10.0.2, por pares: matriz de Gonnet a velocidad de alineación lenta, penalización por hueco abierto = 10,0, penalización por hueco extendido = 0,1; múltiple: Serie Gonnet, penalización por hueco abierto = 10,0, penalización por hueco extendido = 0,2, retraso divergente = 30%, distancia de separación por hueco = 4, sin separación por hueco final, penalizaciones específicas de resto y penalizaciones hidrófilas (restos hidrófilos GPSNDQEKR)).

En la práctica, alinear una secuencia sujeto con la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 1 y 3-6 en MacVector™ usando los parámetros predeterminados de alineación por pares identificará las posiciones correspondientes en la secuencia sujeto en las que realizar modificaciones en posiciones equivalentes a las posiciones N79, N90, P136, G211 y L289 en CHO.

Glucoproteínas

Las composiciones y métodos pueden usarse para modificar la capacidad de fucosilación de las células para lograr una baja fucosilación de cualquier glucoproteína de interés. Aunque la mayor parte de esta divulgación se refiere a las ventajas de la fucosilación reducida en anticuerpos, los beneficios de la invención no se limitan a los anticuerpos. Cualquier proteína de unión que lleve un Fc, y hay muchos, muchos tipos de dichas proteínas de unión, se pueden preparar usando las composiciones y métodos de la invención.

Una glucoproteína típica que se puede preparar con la invención es un anticuerpo (p.ej., un anticuerpo humano, de ratón, o humanizado) que está glucosilado y, en condiciones normales en una célula de tipo silvestre, fucosilado. Los ejemplos incluyen, a modo de ilustración y no a modo de limitación, anticuerpos humanos de los subtipos IgG1, IgG2 e IgG4. Las glicoformas de tales anticuerpos incluyen aquellas con un resto de glucano en la posición 297. Las glicoformas típicas en la posición 297 incluyen una GlcNAc ligada a N, seguida de un GlcNAc, seguida de un resto trimanosilo biantenario, seguido de (en cada uno de los dos restos manosilo del resto trimanosilo biantenario) uno o más restos GlcNAc, opcionalmente seguidos de un resto de galactosa en uno o más de los restos GlcNAc unidos a las antenas del resto trimanosilo biantenario. La fucosilación del glucano se produce normalmente en el resto GlcNAc inicial ligado a N, donde (normalmente) un único resto de fucosa se une a través de una fucosiltransferasa al anticuerpo 297-glucolado. En diversas realizaciones, la relación molar o el porcentaje o el grado de fucosilación del anticuerpo se mide con respecto a este resto de fucosa en relación con la cantidad (o moles) de anticuerpo y/o la cantidad (o moles) de glucano o sustituyente de glucano (p.ej., moles relativos de fucosa:anticuerpo, o de fucosa:GlcNAc o fucosa:manosa o fucosa:resto trimanosilo o fucosa:galactosa del glucano unido a 297, en una preparación de anticuerpos obtenida a partir de células de tipo silvestre o de células que comprenden una secuencia del ácido nucleico de FX modificada de acuerdo con la invención).

Líneas CHO de baja fucosilación

Se construyó una línea CHO de baja fucosilación a partir de células CHO K1 adaptadas para crecer en suspensión en un medio de biorreactor sin suero. La línea CHO (línea denominada 6066) contenía una sustitución L289S en el gen FX de CHO. En la línea celular se produjeron un anticuerpo recombinante que es una IgG1 humana que se une específicamente a un receptor de interleucina (Anticuerpo 1) y un anticuerpo recombinante que es una IgG1 humana que se une específicamente a una proteína de la superficie celular de una célula inmunitaria (Anticuerpo 2), y en una línea celular CHO correspondiente que carece de la modificación de FX (línea denominada 4044) como se describe en los ejemplos. Las células se cultivaron durante tres días en agitadores o durante 12 días en un biorreactor (cada uno a 37 °C).

Las células que llevaban la modificación del gen FX y expresaban el Anticuerpo 1 fucosilaron solo aproximadamente el 6,14 o 6,86 % (12 días) o aproximadamente el 7 u 8 % (tres días) del Anticuerpo 1, mientras que en ausencia de la modificación de FX, las células fucosilaron aproximadamente el 89,3 % (3 días) o aproximadamente el 85,8 % (12 días) (Tabla 1).

Las células que llevaban la modificación del gen FX y expresaban el Anticuerpo 2 fucosilaron solo aproximadamente el 3,6 % del Anticuerpo 2, mientras que en ausencia de la modificación del gen FX, las células fucosilaron aproximadamente el 95 % (3 días) o aproximadamente el 76,8 % (12 días) (Tabla 1).

Se preparó otra línea CHO de baja fucosilación a partir de células CHO K1 que contenían una modificación L289S y N90k del gen FX de CHO (línea denominada 8088). El Anticuerpo 1 expresado en estas células mostró solo aproximadamente un 0,96 % de fucosilación (3 días) o un 0,71% de fucosilación (12 días) (Tabla 2).

Otra línea CHO de baja fucosilación se produjo a partir de células CHO K1 (de células 6066-1, que tienen una modificación L289S del gen FX) que contenía una sustitución P136L (línea denominada 2121). Estas células expresaron el Anticuerpo 1 que solo se fucosiló el 0,82 % a los 3 días (Tabla 2).

Se produjeron otras dos líneas CHO de baja fucosilación a partir de células CHO K1 (de células 6066-1, que tienen una modificación L289S del gen FX) que contenía una sustitución N79S (líneas denominadas 2020 y 6069). Estas células expresaron el Anticuerpo 1 que solo se fucosiló el 0,94% a los 3 días (2020) o solo se fucosiló el 0,86 % a los 3 días (6069) (Tabla 2).

La dependencia de la temperatura de la fucosilación para el Anticuerpo 1 se probó usando las líneas celulares 4044­ 1 (sin modificación del gen FX) y la línea celular 6066-1 (modificación L289S del gen FX). La línea celular 6066-1 mostró solo un 7 % de fucosilación a 37 °C y aproximadamente un 70 % de fucosilación a 34 °C. La línea celular 4044­ 1 mostró aproximadamente la misma fucosilación (95-96 %) tanto a 37 °C como a 34 °C.

Se produjeron dos líneas celulares de baja fucosilación adicionales a partir de la línea celular 8088 (L289S y N90K) que expresaban dos anticuerpos diferentes para el mismo receptor del factor de crecimiento, Ab 3.1 y Ab 3.2. Después de cultivar durante tres días a 37 °C en presencia (vía de rescate) o ausencia (vía de novo) de fucosa, se determinó la composición de glucano y el contenido de fucosa del glucano. En ausencia de fucosa, las líneas celulares produjeron solo aproximadamente un 1,87 % o un 5,73 % de fucosilación, mientras que en presencia de una fuente de fucosa externa, la fucosilación se restauró al menos al 95,22 % o al 95,63 %.

Ejemplos

Ejemplo 1: Líneas celulares CHO

EN el presente documento, se describe una variedad de líneas celulares CHO, aisladas directa o indirectamente de células CHO K1.

Células RGC10. La línea celular CHO 3033 se generó a partir de células CHO K1 como se describe para las células RGC10 en la Patente de EE.UU. N.° 7.435.553. En resumen, las células CHO K1 se transfectaron de forma estable con el vector pTE158 y pcDNA6/TR (Invitrogen). Las células transfectadas se exploraron para determinar la expresión inducible por doxiciclina de hFcYR1 y se seleccionó un clon para dar lugar a la línea celular 3033. Se adaptaron células 3033 para que crecieran en cultivo en suspensión en Medio 3 sin suero.

Células 5055. Las células 5055 son células CHO K1 que se han adaptado para crecer en suspensión en medio de biorreactor sin suero, Medio 2.

Células 4044. Las células 4044 se obtuvieron de células RGC16 descritas en la Publicación de Solicitud de Patente internacional N.° WO 2008/151219 A1 presentada el 4 de junio de 2008, y la Publicación de Solicitud de Patente de EE.UU. N.° 2009/0124005A1 presentada el 4 de junio de 2008 y que contiene un casete con sitio lox en un locus de expresión y estabilidad potenciadas (EESYR, por sus siglas en inglés). El locus EESYR en 4044 tiene, de 5' a 3' en la cadena codificante, un sitio loxP, un promotor tardío de SV40, un gen de resistencia a puromicina, un promotor de CMV, un IRES, un gen eCFP, un sitio lox2272, un promotor de CMV, un gen DsRed y un sitio lox511. Las células 4044 contienen además un vector pcDNA6/TR transfectado de forma estable.

Otras células. La línea celular 7077 se obtuvo de células 3033 sin el uso de ácido nucleico recombinante exógeno. Las líneas celulares 6066, 8088 y 1010 se obtuvieron de células 4044 sin el uso de ácido nucleico recombinante exógeno.

Ejemplo 2: Producción de Anticuerpos Recombinantes en Células CHO

Vectores. Los vectores descritos en el presente documento tienen las características indicadas, donde la ubicación relativa de las características se presenta con respecto a la cadena codificante, enumerada de 5 'a 3'.

pR4000: un promotor de UbC humano, un gen que codifica la cadena pesada de Ab 2, un promotor tardío de SV40 y un gen de resistencia a higromicina.

pR4001: un promotor de UbC humano, un gen que codifica la cadena ligera de Ab 2, un promotor tardío de SV40 y un gen de resistencia a puromicina.

pR4002: un sitio LoxP, un promotor de CMV humano, un gen que codifica la cadena pesada de Ab 2, un promotor tardío de SV40 y un sitio Lox2272.

pR4003: un sitio Lox2272, un gen de resistencia a higromicina, un IRES, un gen EGFP, un promotor de CMV humano, un gen que codifica la cadena ligera de Ab 2 y un sitio Lox511.

pR4004: un promotor tardío de SV40 y el gen que codifica la Cre recombinasa (véase el documento WO 2008/151219A1).

pR4005: un sitio LoxP, un promotor de CMV humano, un gen que codifica la cadena ligera del Anticuerpo 1 (Ab 1), un promotor tardío de SV40 y un sitio Lox2272.

pR4006: un sitio Lox2272, un gen de resistencia a higromicina, un IRES, un gen EGFP, un promotor de CMV humano, un gen que codifica la cadena pesada de Ab 1 y un sitio Lox511.

pR4007: un sitio LoxP, un promotor de CMV humano, un gen que codifica la cadena ligera de Ab 1, un promotor tardío de SV40, un gen que codifica el extremo N de la proteína de resistencia a higromicina y un sitio Lox2272.

pR4008: un sitio Lox2272, un gen que codifica el extremo C de la proteína de resistencia a higromicina, un IRES, un gen EGFP, un promotor de CMV humano, un gen que codifica la cadena pesada de Ab 1 y un sitio Lox511.

pR4009: un sitio LoxP, un promotor tardío de SV40, un gen de resistencia a higromicina, un sitio interno de entrada al ribosoma (IRES), un gen EGFP, un promotor de CMV humano y un sitio Lox511.

pR4010: un sitio LoxP, un promotor tardío de SV40, un gen de resistencia a higromicina, un IRES, un gen EGFP, un promotor de CMV humano, el gen FX de tipo silvestre y un sitio Lox511.

pR4010: un sitio LoxP, un promotor tardío de SV40, un gen de resistencia a higromicina, un IRES, un gen EGFP, un promotor de CMV humano y el gen FX mutado que tiene las mutaciones L289S y N90K.

La capacidad de fucosilación en células CHO se estudió mediante tinción con LCA de la superficie celular y mediante análisis de anticuerpos recombinantes producidos a partir de células CHO. En un estudio, se utilizaron células 7077 como células hospedadoras para determinar la expresión del Anticuerpo 2 (Ab 2), un anticuerpo IgG1 humano contra un receptor de linfocitos B humano, siguiendo un método descrito en la Patente de EE.UU. N.° 7.435.553. En resumen, se transfectaron 1 x 107 células 7077 con el plásmido pR4000 (cadena pesada, resistencia a higromicina) y pR4001 (cadena ligera, resistencia a puromicina) usando Lipofectamine™ (Invitrogen, Carlsbad, CA). Los cultivos transfectados se seleccionaron con 400 microgramos/ml de higromicina y 10 microgramos/ml de puromicina cada uno durante dos semanas en medio F12 que contenía suero fetal de ternera al 10 %. Las células que sobrevivieron a la selección se agruparon y se adaptaron para que crecieran en suspensión en medio de biorreactor sin suero, Medio 2. La expresión de hFcyRI se indujo mediante la adición de doxiciclina al medio de cultivo durante tres días. Los cultivos inducidos se incubaron con 1 miligramo/ml de IgG de conejo durante 18 horas antes de la tinción con fragmento F(ab')² de un anticuerpo anti-Fc humano conjugado con FITC policlonal de cabra (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA). Las células se tiñeron durante 1 hora y después se lavaron dos veces con PBS antes del análisis por citometría de flujo en un clasificador de células MoFlo™ (Fort Collins, CO). Las células con intensidad de fluorescencia media de FITC en el 5 % superior de la población celular total se clasificaron en un conjunto y se denominaron células 7077-1. Las células 7077-1 se expandieron durante 10 días en Medio 2. Para producir Ab 2 recombinante, se sembraron células 7077-1 a 4 x 105 células/ml de Medio 2 en un matraz agitador a 37 °C. T res días después, se recogió el medio acondicionado y se purificó la proteína Ab 2 mediante cromatografía de afinidad con Proteína A.

Se utilizaron células CHO 4044 y 6066 como células hospedadoras para la expresión de Ab 2 y Ab 1, un anticuerpo IgG1 humano contra un receptor de citocinas humano. En resumen, para expresar Ab 2, 2 x 106 células 4044 y 2 x 106 células 6066 (cada una con un casete con sitio lox en un locus EESYR) se transfectaron cada una con pR4002 (cadena pesada en un casete con sitio lox), pR4003 (cadena ligera y resistencia a higromicina en un casete con sitio lox) y pR4004 (codifica Cre). Para expresar Ab 1, 2 x 106 células 4044 y 2 x 106 células 6066 se transfectaron cada una con pR4005 (cadena ligera en un casete con sitio lox), pR4006 (cadena pesada y resistencia a higromicina en un casete con sitio lox) y pR4004 (codifica Cre). Se seleccionaron células 4044 y 6066 transfectadas con 400 microgramos/ml de higromicina durante 10 días en medio F12 que contenía FCS al 10 %. Las células supervivientes se adaptaron para que crecieran en suspensión en Medio 1 sin suero durante siete días. Las células que se han sometido a un intercambio de casetes mediado por Cre en el locus EESYR expresaron EGFP pero no DsRed o ECFP. Las células positivas para EGFP pero negativas para DsRed y ECFP se recogieron mediante clasificación celular usando un clasificador MoFlo™. Las células obtenidas de 4044 que se transfectaron con los genes de Ab 2 y Ab 1 se denominaron células 4044-2 y 4044-1, respectivamente. Las células obtenidas de 6066 que se transfectaron con los genes de Ab 2 y Ab 1 se denominaron células 6066-2 y 6066-1, respectivamente. Se expandieron células 4044-2, 6066-2, 4044-1 y 6066-1 cultivando en Medio 2 durante siete días. Para producir anticuerpos recombinantes, las cuatro líneas celulares se sembraron a 4 x 105 células/ml de medio 2 en un matraz agitador a 37 °C. Tres días después, se recogieron los medios acondicionados y se purificaron los anticuerpos recombinantes en los mismos mediante cromatografía de afinidad con Proteína A.

Las células CHO 8088 y 1010 también se utilizaron como células hospedadoras para la expresión de Ab 1. En resumen, para expresar Ab 1, 2 x 106 células 8088 y 2 x 106 células 1010 se transfectaron cada una con pR4007 (cadena ligera y primera parte del gen de resistencia a higromicina en un casete con sitio lox), pR4008 (cadena pesada y segunda parte del gen de resistencia a higromicina en un casete con sitio lox) y pR4004 (que codifica Cre). Las células transfectadas que sobrevivieron a la selección con 400 microgramos/ml de higromicina se adaptaron para que crecieran en suspensión en Medio 1 sin suero. Las células que expresaban EGFP pero no DsRed o ECFP de 8088 y 1010 transfectadas se aislaron mediante clasificación de células en un MoFlo™ y se denominaron 8088-1 y 1010-1. Para producir proteína Ab 1, se sembraron células 8088-1 y 1010-1 en matraces agitadores a 4 x 105 células/ml. Tres días más tarde, se recogieron los medios de cultivo y el Ab 1 en los mismos se purificó mediante cromatografía con Proteína A.

Ejemplo 3: Análisis de Fucosilación de Anticuerpos

Las proteínas del anticuerpo IgG1 humano purificadas se desglucosilaron inicialmente con PNGasa F en condiciones desnaturalizadas (SDS al 0,5 %, TCEP 2 mM y se bloquearon con NP-40 al 1 %) en Tris 50 mM pH 8,0 con una relación proteína/enzima de 1 microgramo/0,1 mU a 37 °C durante la noche. A continuación, los glucanos liberados se derivatizaron de forma fluorescente con ácido antranílico a 80 °C durante 1 hora. Las muestras se limpiaron previamente para eliminar el exceso de reactivo de ácido antranílico con cartuchos Waters Oasis™ HLB. A continuación, se analizó la mezcla de oligosacáridos mediante HPLC de fase inversa, usando TFA al 0,5 % en ddH²O como fase móvil A y TFA al 0,045 % en acetontrilo al 90 %/ddH²O al 10 % como fase móvil B. Los glucanos se resolvieron en una columna Thermo Hypercarb™ (Thermo Fisher, Waltham, MA) (dimensión de 100 x 2,1, tamaño de partícula de 3 micrómetros) mediante la aplicación de un gradiente de 30 a 40 % de B durante 40 minutos. Las señales se detectaron utilizando un detector de fluorescencia con una longitud de onda de excitación de 230 nm y una longitud de onda de emisión de 425 nm. Un análisis adicional de los máximos de glucanos separados por HPLC mediante espectrometría de masas reveló que se separaron en dos grupos principales; glucanos biantenarios no fucosilados y glucanos biantenarios fucosilados. Dentro de cada grupo (fucosilados frente a no fucosilados), los glucanos se separaron además en formas de digalactosilo (G2), monogalactosilo (G1) o agalactosilo (G0). La integración del área máxima correspondiente a diferentes formas de glucanos permite la cuantificación de las poblaciones de cada glucano individual en el anticuerpo monoclonal.

Ejemplo 4: Secuenciación de los principales transcritos de FX, GMD, Transportador de GDP-fucosa y genes FUT8

Las proteínas codificadas por FX, GMD, transportador de GDP-fucosa y los genes FUT8 son componentes de la vía de fucosilación de novo. Se determinaron las secuencias del transcrito principal del gen FX en las líneas celulares CHO 5055, 4044-1, 7077-1, 6066-1, 2121, 2020, 6069, 1010 y 8088, y las secuencias del transcrito principal del gen GMD en las células 4044-1, 6066-1, 1010 y 8088. También se determinaron las secuencias de los trasncritos principales expresadas a partir del gen transportador FUT8 y GDP-fucosa en células 4044-1 y 6066-1.

En resumen, el ARN total se aisló de 5 x 106 células CHO utilizando Micro-Fast Track 2.0 Kit™ (Invitrogen, Carlsbad, CA). Los ADNc para los cuatro genes de fucosilación se sintetizaron a partir de ARN total utilizando Oligo-dT como cebador y SuperScript III First-Strand Synthesis System™ (Invitrogen). El ADNc de GMD se amplificó por PCR usando los cebadores 5'-ctacaatctt ggtgcccaga gc-3' ^{S e Q} ID NO: 7 y 5'-tccagttcag tttctgctgc g-3' SEQ ID ^{n O :} 8. El ADNc de FX se amplificó por PCR usando los cebadores 5'-ttccctgaca agaccaccta tcc-3' SEQ ID NO: 9 y 5'-tagttgtcgg tgaaccaggc ac-3' SEQ ID NO: 10. El ADNc del transportador de GDP-fucosa se amplificó por PCR usando los cebadores 5'-gatgaggaca gcaggaacaa gc-3' SEQ ID NO: 11 y 5'-agcactcttc tcaccctctt tgg-3' ^{S e Q} ID NO: 12. El ADNc de FUT8 se amplificó por PCR usando los cebadores 5'-agccaagggt aagtaaggag gacg-3' SEQ ID NO: 13 y 5'-ttgtagacag cctccatcct cg-3' SEQ ID NO: 14. Las ADN polimerasas utilizadas en las reacciones de PCR fueron una mezcla de 20 a 1 de Platinum Taq™ (Invitrogen) y Pfu clonada (Stratagene, La Jolla, CA). Los productos de PCR se purificaron después de la electroforesis en gel y se clonaron en el vector pCR2.1 TOPO™ (Invitrogen) siguiendo las instrucciones del fabricante. Los productos de ^{a D n} clonados se transformaron en células DH10B electrocompetentes. Se recogió un mínimo de tres colonias bacterianas de cada transformación para inocular tres cultivos líquidos que contenían LB y 100 microgramos/ml de ampicilina. Los ADN plasmídicos de estos cultivos se purificaron usando QIAprep Spin Miniprep Kit™ (Qiagen). Las secuencias de los productos de PCR clonados se determinaron utilizando los cebadores M13 ubicados en el vector y los correspondientes cebadores de PCR 5' y 3'. Estas secuencias se compararon con las secuencias de Genbank para el ARNm de FX (número de registro AF525365), GMD (número de registro AF525364), transportador de GDP-fucosa (número de registro AB222037) y FUT8 (número de registro BD359138) de C. griseus.

En las células 7077-1, 6066-1, 2121, 2020, 6069, 1010 y 8088 se identificaron mutaciones en las secuencias de transcritos de FX consenso que dan como resultado cambios de codones de la secuencia de referencia Genbank (AF525365) (Tabla 1 y 2). Las secuencias de los transcritos de GMD de las células 4044-1, 6066-1, 1010 y 8088 coincidían con las secuencias de GMD indicadas en GenBank (número de registro AF525364). Las secuencias del transportador de GDP-fucosa y los transcritos de FUT8 en las células 4044-1 y 6066-1 coincidían también con sus secuencias correspondientes indicadas en GenBank (números de registro AB222037 y BD359138).

Ejemplo 5: Fucosilación en líneas celulares CHO con una sola Mutación L289S en el Gen FX

La capacidad de fucosilación relativa en células 3033, 4044, 6066 y 7077 se estudió en primer lugar mediante la tinción de las células con la aglutinina lectina de Lens culinaris (LCA). En resumen, se incubaron 2 x 106 células 4044 y 6066 cada una con biotina-LCA (Vector Laboratories, Burlingame, CA) a 5 microgramos/ml durante una hora. Después de dos lavados con PBS, las células se incubaron con estreptavidina conjugada con ficoeritrina (Jackson ImmunoResearch) durante 30 minutos. A continuación, las células se lavaron una vez con PBS y se analizaron mediante citometría de flujo. Se tiñeron células 3033 y células 7077 con FITC-LCA durante una hora, se lavaron dos veces y se analizaron por citometría de flujo (Figura 2). Las células 3033, 4044, 6066 y 7077 se tiñeron todas con LCA. La intensidad de tinción con LCA en las células 6066 y 7077 fue significativamente más débil que la intensidad de tinción con LCA en las células 3033 y 4044 (Figura 2), lo que sugiere que hubo menos fucosilación de proteínas en las células 6066 y 7077 que en las células 3033 y 4044. Para examinar si las células 6066 y 7077 podrían usarse como células hospedadoras para la expresión de anticuerpos hlgG1 con bajo contenido de fucosa, las células 4044 y 6066 se transfectaron de manera estable con plásmidos de expresión para Ab 2 y Ab 1, y las células 7077 se transfectaron de manera estable con plásmidos de expresión para Ab 2 (véase el Ejemplo 2). Se produjeron Ab 2 y Ab 1 recombinantes a partir de las células transfectadas en cultivos en matraz agitador de tres días, así como en cultivos semicontinuos en biorreactor de doce días. Se purificaron Ab 2 y Ab 1 a partir del medio acondicionado y se determinaron los niveles de su fucosilación por HPLC (Tabla 1). Como se muestra en la Tabla 1, 7077-1, 6066-1 y 6066-2 produjeron anticuerpos recombinantes con un nivel de fucosilación entre el 3,6 % y el 8 % en agitadores y biorreactores a 37 °C.

Ejemplo 6: Fucosilación en líneas celulares CHO con Dos Cambios de Aminoácidos en el Gen FX

8088 y 1010 son dos líneas celulares aisladas de células 6066 sin el uso de ácido nucleico exógeno, recombinante.

6069, 2020 y 2121 son tres líneas celulares aisladas de células 6066-1 sin el uso de ácido nucleico exógeno, recombinante. Las secuencias del transcrito principal del gen FX se determinaron mediante RT-PCR (Tabla 2). Se encontró que estas cinco líneas celulares tenían la misma mutación L289S en las células 6066 y 7077. Los transcritos de FX en las cinco líneas celulares también llevan mutaciones que cambian un aminoácido además del cambio de L289S. Estas mutaciones se resumen en la Tabla 2. Las células 8088, 1010, 6069, 2020 y 2121 mostraron una unión reducida a LCA (FIG. 4), lo que sugiere una fucosilación de proteínas reducida en estas células.

Para examinar la capacidad de fucosilación en las células 8088 y 1010, el Ab 1 se produjo a partir de estas dos células hospedadoras mediante transfección estable. Los cultivos transfectados se seleccionaron con 400 microgramos/ml de higromicina durante dos semanas. Las células que eran resistentes a la higromicina se adaptaron para que crecieran en el Medio 1 en cultivos en suspensión. El Ab 1 recombinante se produjo en cultivos en matraces agitadores de tres días, así como en cultivos en biorreactores semicontinuos de doce días. El Ab 1 se purificó a partir del medio acondicionado y los niveles de fucosilación de Ab 1 se determinaron por HPLC (Tabla 2). Como se muestra en la Tabla 2, las células 8088 y 1010 transfectadas produjeron anticuerpo Ab1 recombinante con un nivel de fucosilación entre 0,53 % y 0,96 % en agitadores y biorreactores a 34 °C.

También se examinó la capacidad de fucosilación en células 6069, 2020, 2121 después de la purificación de la proteína Ab 1 producida en cultivos en matraces agitadores. La Tabla 2 muestra que estas tres líneas celulares produjeron Ab 1 con niveles de fucosilación que variaban de 0,82 % a 0,94 %.

Ejemplo 7: La capacidad de fucosilación en 6066-1 depende de la temperatura

El efecto de las temperaturas de cultivo sobre la fucosilación de proteínas en células 6066-1 se examinó mediante tinción con LCA y mediante análisis de fucosilación de la proteína Ab 1 producida a partir de estas células. La FIG. 5 muestra las tinciones con LCA de células 4044-1 y 6066-1 cultivadas tanto a 37 °C como a 34 °C. Las células 4044-1 cultivadas a 34 °C y 37 °C se tiñeron de manera similar mediante LCA. Las células 6066-1 cultivadas a 34 °C se unieron a LCA a un nivel que era significativamente mayor que las células 6066-1 cultivadas a 37 °C. La Tabla 3 muestra el nivel de fucosilación en la proteína Ab 1 producida a partir de células 4044-1 y 6066-1 en cultivos en matraces agitadores a 34 °C y 37 °C. Las células 4044-1 produjeron AB 1 con 96 % y 95 % de fucosilación cuando se cultivaron a 34 °C y 37 °C respectivamente. Por el contrario, las células 6066-1 produjeron Ab 1 con aproximadamente 70 % y 7 % de fucosilación a 34 °C y 37 °C respectivamente. Este resultado indica que el nivel de fucosilación en las células 6066-1 depende de la temperatura.

Ejemplo 8: Fucosilación de Células CHO Cultivadas en Medio Suplementado con L-fucosa

En células de mamífero, la GDP-fucosa puede producirse por la vía de síntesis de novo y la vía de rescate (Becker y Lowe (2003) Fucose: biosynthesis and biological function in mammals, Glycobiology, 13(7):41R-53R). En células cultivadas en medio de cultivo que carece de L-fucosa, la GDP-fucosa se produce por las proteínas GMD y FX a partir de GDP-manosa. En medio con L-fucosa, la GDP-fucosa se puede generar a partir de L-fucosa mediante la L-fucosa cinasa y la GDP-L-fucosa pirofosforilasa. La GDP-fucosa producida por cualquiera de las vías se transporta al aparato de Golgi a través del transportador de GDP-fucosa. En el Golgi, la proteína fucosiltransferasa FUT8 convierte la glucoproteína en proteínas fucosiladas con GDP-fucosa. Se examinó la capacidad de fucosilación de células 6066-2, 8088 y 1010 cultivadas en medio de cultivo con y sin L-fucosa 5 mM. Las células 6066-2 expresaron el anticuerpo Ab 2 y portaban la mutación L289S en los transcritos del gen FX (Ejemplo 2 y Tabla 1). Por análisis de HPLC de Ab 2 purificado, las células 6066-2 cultivadas en matraces agitadores produjeron AB 2 con fucosilación al 1,9 % en Medio 2 sin L-fucosa añadida. Por el contrario, Las células 6066-2 cultivadas en matraces agitadores produjeron Ab 2 con 93,5 % de fucosilación en Medio 2 complementado con L-fucosa 5 mM. Este resultado indica que la vía de rescate para la síntesis de GDP-fucosa, el transportador de GDP-fucosa y las proteínas FUT8 eran funcionales en las células 6066-2.

Se examinaron las capacidades relativas de fucosilación de células 3033, 5055, 7077, 8088 y 8088 cultivadas en Medio 2 con y sin L-fucosa 5 mM mediante tinción con LCA (FIG. 6). Las células 3033 y 5055 se unieron a niveles similares de LCA con y sin complementación con L-fucosa. Las células 7077, 8088 y 8088 unieron significativamente más LCA cuando se cultivaron en medios con L-fucosa 5 mM que en medios que carecían de L-fucosa. Este resultado sugiere que las células 7077, 8088 y 8088 tenían un transportador de GDP-fucosa funcional y una proteína FUT8 funcional.

Ejemplo 9: Fucosilación en 8088 Transfectadas con el Gen FX

Para confirmar que el nivel de fucosilación reducido observado en las células 8088 se debía al gen FX mutante (con mutaciones L289S y N90K), el gen FX de tipo silvestre y el gen FX mutante se expresaron en células 8088 mediante transfección estable y después se examinó la capacidad de fucosilación de las células transfectadas tiñendo las células con LCA. Como control, las células 8088 se transfectaron por separado con el vector pR4009 (casete con sitio lox que tiene gen de resistencia a higromicina y gen EGFP). Los vectores pR4010 y pR4011 contienen el gen FX de tipo silvestre y el gen FX L289S N90K colocado entre el promotor de CMV y el sitio Lox511 en pR4009, respectivamente. Las células 8088 transfectadas con pR4004 y pR4009, pR4010 o pR4011 se seleccionaron con 400 microgramos/ml de higromicina durante 14 días. Las células que se sometieron al intercambio de casetes mediado por Cre en EESYR expresaron EGFP pero no EYFP. Las células que eran positivas para EGFP pero negativas para EYFP se aislaron mediante clasificación celular. Después de la expansión en cultivo de tejidos a 34 °C, las células clasificadas se tiñeron secuencialmente con biotina-LCA y PE-estreptavidina. Las 8088 transfectadas con el vector pR4009 y pR4011 mostraron el mismo nivel de tinción con LCA. Por el contrario, las células 8088 transfectadas con pR4010 mostraron un nivel de tinción con LCA comparable al de las células 5055 (FIG. 7). En sumario, la proteína FX de tipo silvestre, pero no la proteína FX mutante L289S N90K, fue capaz de restaurar el nivel de fucosilación en células 8088 como se ensaya mediante tinción con LCA. Este resultado indica que el nivel de fucosilación más bajo en las células 8088 se debió a la mutación L289S N90K en la proteína FX en estas células.

Ejemplo 10: HPLC y Espectrometría de Masas de Glucanos: Ab 3.1 y 3.2

La línea celular 8088, la línea de CHO que tiene la modificación del gen FX que codifica una sustitución L289S y N90K en la proteína FX, se transfectó por separado con plásmidos que codifican cadenas pesadas (IgG1 humana) y ligeras (kappa humana) de dos anticuerpos humanos con diferentes regiones variables que se unen específicamente al mismo receptor del factor de crecimiento (Anticuerpo 3.1 y Anticuerpo 3.2). Las células que expresaban cada anticuerpo se cultivaron en Medio 2 en presencia y en ausencia de fucosa 10 mM durante 3 días a 37 °C, y los glucanos de los anticuerpos en cada conjunto de condiciones se aislaron e identificaron mediante espectroscopía de masas.

Las células 8088 que expresaban A3.1 en ausencia de fucosa produjeron tres máximos de glucanos principales en HPLC (FIG. 8), que representan tres glucanos no fucosilados diferentes en un espectro de masas que difería en la galactosilación terminal (FIG. 9) con aproximadamente 1,47 % de fucosilación. Las células 8088 que expresaban A3.1 en presencia de fucosa 10 mM produjeron tres máximos principales de glucanos en HPLC (FIG. 10), que representan tres glucanos fucosilados diferentes y un glucano no fucosilado en un espectro de masas (FIG. 11), con aproximadamente 95,22 % de fucosilación.

Las células 8088 que expresaban A3.2 en ausencia de fucosa produjeron tres máximos de glucanos principales en HPLC (FIG. 12), que representan tres glucanos no fucosilados diferentes en un espectro de masas que difería en la galactosilación terminal (FIG. 13) con aproximadamente 5,73 % de fucosilación. Las células 8088 que expresaban A3.2 en presencia de fucosa 10 mM produjeron tres máximos principales de glucanos en HPLC (FIG. 14), que representan tres glucanos fucosilados diferentes y un glucano no fucosilado en un espectro de masas (FIG. 15), con aproximadamente 95,63 % de fucosilación.

Los resultados del análisis de glucanos para células 8088 alimentadas con fucosa y no alimentadas con fucosa que expresaban el Anticuerpo 3.1 o el Anticuerpo 3.2 se resumen en la FIG. 16, agrupados de acuerdo con el tipo de glucano. Las columnas que indican el porcentaje de anticuerpos en una condición particular suman 100. Para el Ab 3.1, la fucosilación total en ausencia de fucosa 10 mM fue del 1,87 %; Para el Ab 3.2, la fucosilación total en ausencia de fucosa 10 mM fue del 5,73 % (súmense las columnas correspondientes en las últimas tres filas de la tabla de la FIG. 16). En presencia de fucosa 10 mM, la fucosilación total para Ab 3.1 fue del 95,22 %; en presencia de fucosa 10 mM, la fucosilación total para Ab 3.2 fue del 95,63 % (súmense las columnas correspondientes en las tres filas finales de la tabla de la FIG. 16). Estos datos establecen que las líneas celulares de baja fucosilación no fucosilan más de aproximadamente 1,87 % o 5,73 % en ausencia de fucosa, pero esa fucosilación se puede recuperar en presencia de fucosa hasta al menos aproximadamente un 95,22 % o 95,63 % de fucosilación.

Para el análisis de glucanos, se resuspendieron alícuotas de 100 microgramos de cada una de las dos muestras de anticuerpo (Anticuerpo 3.1 y Anticuerpo 3.2) en 45 microlitros de tampón de desnaturalización que contenía Tris 50 mM (pH 8,0), fns(2-carboxietil)fosfina (TCEP) 2,0 mM, SDS al 0,5 %. La proteína se desnaturalizó calentando a 80 °C durante 7 min. Los glucanos ligados a N en el anticuerpo se liberaron después de la incubación con 10 mU de PNGasa

Claims (16)

REIVINDICACIONES

1. Una célula que comprende un ácido nucleico que codifica una proteína GDP-4-ceto-6-desoxi-manosa-3,5-epimerasa-4-reductasa (FX), en donde la proteína FX comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 90 % idéntica a la SEQ ID NO: 1, en donde la proteína FX comprende una modificación en relación con la SEQ ID NO: 1. comprendiendo la modificación una sustitución con una Serina en la posición 289, y en donde la célula tiene una capacidad reducida para fucosilar una glucoproteína en comparación con una célula de tipo silvestre sin la modificación.

2. La célula de la Reivindicación 1, en donde la célula tiene una capacidad reducida para fucosilar una glucoproteína en ausencia de una fuente externa de fucosa, en comparación con una célula de tipo silvestre sin la modificación.

3. La célula de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde la proteína FX comprende además una segunda modificación en relación con la SEQ ID NO: 1, comprendiendo la segunda modificación una sustitución por Lisina en la posición 90.

4. La célula de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde la proteína FX comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos un 95 % idéntica a la SEQ ID NO: 1.

5. La célula de la reivindicación 3, en donde la proteína FX comprende un aminoácido idéntico a la SEQ ID NO: 1 excepto que tiene una Serina en la posición 289 y una Lisina en la posición 90.

6. La célula de la reivindicación 3, en donde la proteína FX comprende la SEQ ID NO: 2.

7. La célula de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde la célula es una célula de ovario de hámster chino (CHO).

8. La célula de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde la célula expresa dicha proteína FX y una glucoproteína.

9. La célula de la reivindicación 8, en donde la glucoproteína es un anticuerpo.

10. Un método para producir una glucoproteína con fucosilación reducida, comprendiendo el método:

(a) cultivar una célula de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde la célula expresa dicha proteína FX y una glucoproteína; y

b) aislar la glucoproteína de dicho cultivo.

11. El método de la reivindicación 10, en donde dicho cultivo comprende además cultivar la célula a una temperatura de 37 °C en ausencia de una fuente externa de fucosa.

12. El método de la reivindicación 10 u 11, en donde dicha glucoproteína comprende una región CH2 de inmunoglobulina y una región CH3 de inmunoglobulina.

13. El método de la reivindicación 12, en donde la glucoproteína es un anticuerpo.

14. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, en donde la célula es una célula de ovario de hámster chino (CHO).

15. El método de la reivindicación 11, en donde no más del 6 % de dicha glucoproteína está fucosilada.

16. El método de la reivindicación 15, en donde no más del 2 % de dicha glucoproteína está fucosilada.