CN102459603A - 岩藻糖基化缺陷型细胞 - Google Patents

岩藻糖基化缺陷型细胞 Download PDF

Info

Publication number
CN102459603A
CN102459603A CN2010800294912A CN201080029491A CN102459603A CN 102459603 A CN102459603 A CN 102459603A CN 2010800294912 A CN2010800294912 A CN 2010800294912A CN 201080029491 A CN201080029491 A CN 201080029491A CN 102459603 A CN102459603 A CN 102459603A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
fucosylation
fucose
places
albumen
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN2010800294912A
Other languages
English (en)
Other versions
CN102459603B (zh
Inventor
陈刚
D·布拉科夫
J·P·凡德尔
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Regeneron Pharmaceuticals Inc
Original Assignee
Regeneron Pharmaceuticals Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Regeneron Pharmaceuticals Inc filed Critical Regeneron Pharmaceuticals Inc
Publication of CN102459603A publication Critical patent/CN102459603A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN102459603B publication Critical patent/CN102459603B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/005—Glycopeptides, glycoproteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2866—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
    • C12Y101/01271—GDP-L-fucose synthase (1.1.1.271)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
    • C07K2317/41—Glycosylation, sialylation, or fucosylation
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

提供了编码FX蛋白的分离的核酸，所述FX蛋白具有：在79位具有丝氨酸，在90位具有赖氨酸，在136位具有亮氨酸，在211位具有精氨酸，在289位具有丝氨酸，及其组合。提供了具有编码修饰的FX蛋白的基因的细胞，其中所述细胞在第一温度显示出降低的使糖蛋白岩藻糖基化的能力，但是在第二温度显示出使糖蛋白岩藻糖基化的能力。提供了制备具有减少的岩藻糖基化的糖蛋白的方法和组合物。

Description

岩藻糖基化缺陷型细胞
技术领域
本发明涉及岩藻糖基化途径中的修饰的哺乳动物酶，其中携带该修饰的哺乳动物酶的细胞显示出降低的使蛋白质岩藻糖基化的能力；还涉及包含遗传修饰的细胞，所述遗传修饰导致降低的使蛋白质岩藻糖基化的能力。本发明包括表达相对于野生型细胞系而言具有减少的岩藻糖基化的蛋白、包括抗体的哺乳动物细胞系(例如CHO系)。本发明还涉及蛋白的岩藻糖基化的条件化控制。
背景技术
不能使蛋白质岩藻糖基化的细胞系是本领域已知的。不能使蛋白质岩藻糖基化的多种功能丧失性突变体是已知的，其中最著名的可能是就针对某些凝集素抗性而选择的某些中国仓鼠卵巢(CHO)细胞突变体。此类细胞系是这样分离的：在存在突变原的情况下，就结合特定凝集素例如兵豆(Lens culinaris)凝集素的无能性而重复进行选择。另外已知报道了其它的不能使蛋白质、例如抗体岩藻糖基化的细胞系，见，例如美国专利号7,425,466和美国专利号7,214,775(α1，6-岩藻糖基转移酶，即FUT8的突变体)。本领域仍然需要具有降低的使蛋白质岩藻糖基化的能力的细胞系，尤其是在不存在敲除的情况下具有降低的岩藻糖基化能力的细胞，以及条件化地岩藻糖基化蛋白质的细胞。
发明内容
在一个方面，提供了分离的经修饰的GDP-4-酮-6-脱氧-甘露糖-3，5-表异构酶-4-还原酶(FX)蛋白，其包含选自下列的修饰：79S，90K，136L，211R，289S及其组合。在一个实施方式中，FX蛋白包含289S修饰。在一个实施方式中，FX蛋白包含289S修饰和选自下列的至少一个修饰：79S，90K，136L，211R及其组合。
在一个方面，提供了编码修饰的FX蛋白序列的核酸。在具体的实施方式中，所述核酸是cDNA。在一个实施方式中，提供了包含所述核酸的表达载体或靶向载体。在一个实施方式中，靶向载体的核酸包含内含子。在一个实施方式中，靶向载体的核酸包含编码修饰的FX蛋白的cDNA。在具体的实施方式中，靶向载体包含使载体靶向人、非人灵长类、仓鼠、小鼠或大鼠基因组中的基因座的靶向序列。
在一个方面，提供了包含编码FX蛋白的核酸的修饰的细胞，或表达具有修饰的FX蛋白的细胞，其中所述细胞不表达或实质上不表达野生型FX蛋白。在具体的实施方式中，所述细胞相对于不含修饰的细胞而言显示出不超过10％、不超过5％、不超过2％或不超过1％的野生型FX蛋白。
在一个实施方式中，包含修饰的FX蛋白或核酸的细胞表达含有Fc的糖蛋白，其中所述细胞相对于不含修饰的细胞而言使不超过90％、不超过95％、不超过96％、不超过97％、不超过98％、或不超过99％的糖蛋白岩藻糖基化。
在一个方面，提供了包含编码FX蛋白的核酸的修饰的细胞，或表达具有修饰的FX蛋白的细胞，其中所述细胞缺乏或实质上缺乏在第一温度使糖蛋白岩藻糖基化的能力，但是不缺乏或实质上不缺乏在第二温度使糖蛋白岩藻糖基化的能力。
在一个实施方式中，第一温度是大约37℃。在一个实施方式中，第二温度是大约34℃。
在一个实施方式中，在第一温度使糖蛋白岩藻糖基化的能力是不含修饰的细胞显示出的使糖蛋白岩藻糖基化的能力的大约1％至大约10％。在一个实施方式中，在第二温度使糖蛋白岩藻糖基化的能力是不含修饰的细胞的使糖蛋白岩藻糖基化的能力的大约70％、80％、90％或更高。
在具体的实施方式中，FX蛋白修饰包含选自下列的氨基酸置换：90K，289S，211R，136L，79S及其组合。在具体的实施方式中，所述置换是289S。
在一个实施方式中，FX蛋白来自非人灵长类[例如，猕猴(Macacamulatta)]、人、小鼠[例如小家鼠(Mus musculus)]、大鼠[例如褐家鼠(Rattus norvegicus)]或仓鼠[例如中国仓鼠，或中国地鼠(Cricetulusgriseus)]。在具体的实施方式中，FX蛋白包含SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6的氨基酸序列，并且携带如本文描述的一个或多个修饰(例如氨基酸置换)。
在一个实施方式中，编码FX的核酸与SEQ ID NO：1的序列至少90％或至少95％同一，并且在一个或多个如下位置还包含一个或多个如下氨基酸：79S，90K，136L，211R和289S。
在一个实施方式中，编码FX的核酸与SEQ ID NO：2的FX至少95％同一。在具体的实施方式中，FX具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列。
在一个方面，提供了细胞，其中所述细胞包含引起该细胞的降低的使糖蛋白岩藻糖基化的能力的修饰，并且所述修饰包含FX基因的序列中突变或改变，其引起降低的使糖蛋白岩藻糖基化的能力。
在一个实施方式中，细胞表达选自下列的野生型岩藻糖基化途径酶：GDP-甘露糖4，6-脱水酶(GMD)、野生型GDP-β-L-岩藻糖焦磷酸化酶(GFPP)、野生型α-1，6-岩藻糖基转移酶(FUT8)及其组合。
在一个方面，提供了能使蛋白质岩藻糖基化的哺乳动物细胞，其中该细胞包含FX基因中的修饰，其中，相对于不含修饰或变异的细胞而言，所述修饰引起细胞的使蛋白质岩藻糖基化的能力降低至少90％。
在一个实施方式中，相对于不含修饰的哺乳动物细胞，降低是大约90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％。
在一个实施方式中，在相同或基本上相同的条件下(例如，培养基、温度、细胞密度等)比较根据本发明的修饰的细胞与不含修饰的细胞。
在一个实施方式中，细胞选自COS，CHO，293，BHK，HeLa，Vero，以腺病毒基因、例如AD5E1转染的哺乳动物，包括但不限于以腺病毒基因转染的永生化人类视网膜细胞，例如PER.C6TM细胞和NSO细胞。在一个实施方式中，细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。在具体的实施方式中，CHO细胞是CHO K1细胞。
在一个实施方式中，修饰选自下列氨基酸：79S，90K，136L，211R，289S，及其组合。在具体的实施方式中，置换包括289S。在另一个具体实施方式中，置换包括289S和下列一项或多项：79S，90K，136L，和211R。
在一个实施方式中，细胞包含FX基因，所述FX基因编码蛋白，所述蛋白包含SEQ ID NO：1的序列，所述SEQ ID NO：1的序列具有选自下列的一个或多个氨基酸置换：N79S，N90K，P136L，G211R，L289S，及其组合。在具体的实施方式中，氨基酸置换包括L289S和下列一项或多项：N79S，N90K，P136L和G211R。
在一个实施方式中，细胞还包括编码免疫球蛋白的至少一种氨基酸。在具体的实施方式中，免疫球蛋白是人蛋白或小鼠蛋白。在具体的实施方式中，免疫球蛋白包括免疫球蛋白轻链。在具体的实施方式中，免疫球蛋白包含免疫球蛋白重链。在一个实施方式中，免疫球蛋白重链是IgG1，IgG2，IgG3或IgG4同种型。在一个实施方式中，免疫球蛋白重链是IgG1同种型，例如，人IgG1同种型。在一个实施方式中，重链和/或轻链的可变区包含人CDR，在另一实施方式中，包含小鼠CDR，在另一实施方式中，包含小鼠或非人灵长类的人源化CDR。
在一个实施方式中，细胞包含编码免疫球蛋白重链的CH2和CH3结构域的核酸。在一个实施方式中，免疫球蛋白重链是IgG1，IgG2，IgG3或IgG4同种型。
在一个实施方式中，蛋白是抗原结合蛋白。在具体的实施方式中，抗原结合蛋白是抗体。在具体的实施方式中，抗体包含IgA，IgD，IgE，IgG或IgM同种型的重链。在一个实施方式中，抗原结合蛋白是IgG1同种型的抗体。
在一个实施方式中，蛋白是抗体，并且仅大约5％，4％，3％，2％，1％或0.5％的由细胞产生的抗体蛋白是岩藻糖基化的。在一个实施方式中，所产生的岩藻糖基化的抗体蛋白的量这样测定：使用PNGase F使抗体蛋白过夜去糖基化，然后通过HPLC进行寡糖分析，其中通过聚糖峰面积的积分定量含有岩藻糖基的寡糖，例如，基于聚糖峰面积计算蛋白岩藻糖基化。在具体的实施方式中，通过质谱鉴定岩藻糖基化的聚糖。
在一个方面，提供了用于制备抗原结合蛋白的方法，该方法包括：(a)提供能够使蛋白质岩藻糖基化的细胞，其中所述细胞包含FX基因中的修饰，该修饰导致细胞的使蛋白质岩藻糖基化的能力降低至少90％；(b)向细胞中导入编码抗原结合蛋白的核酸序列；(c)将细胞维持在足以表达该核酸序列以产生抗原结合蛋白的条件下；和(d)回收该细胞表达的抗原结合蛋白。
在一个实施方式中，抗原结合蛋白是抗体。在具体的实施方式中，抗体选自人类抗体、小鼠抗体、嵌合人类/小鼠抗体，和非人灵长类抗体。
在一个实施方式中，细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
在一个实施方式中，细胞的使蛋白质岩藻糖基化的能力相对于不含FX基因中的修饰的细胞降低91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或99.5％。
在一个实施方式中，修饰选自下列位置的氨基酸：79S，90K，136L，211R和289S。在一个实施方式中，修饰包括289S和下列至少一项：79S，90K，136L和211R。
在一个实施方式中，岩藻糖基转移酶基因编码包含SEQ ID NO：1的序列的蛋白，SEQ ID NO：1中具有选自下列的氨基酸置换：N79S，N90K，P136L，G211R和L289S。在一个实施方式中，修饰包括L289S和下列至少一项：N79S，N90K，P136L和G211R。
在一个实施方式中，抗体或其片段是人类抗体或其片段。在具体的实施方式中，抗体是IgG1同种型，例如人类IgG1。
在一个实施方式中，回收的抗体相对于在不含修饰的野生型细胞中产生的相同抗体，具有不超过大约5％的岩藻糖基化。在另一实施方式中，相对于在不含修饰的野生型细胞中产生的相同抗体，具有不超过4％，3％，2％，1％或0.5％的岩藻糖基化。
在一个方面，提供了表达选自下列的野生型岩藻糖基化途径酶的细胞：GDP-甘露糖4，6-脱水酶(GMD)、野生型GDP-β-L-岩藻糖焦磷酸化酶(GFPP)、野生型α-1，6-岩藻糖基转移酶(FUT8)及其组合；其中所述细胞包含修饰的FX基因，其中该细胞相对于不含FX基因修饰的细胞具有降低的使糖蛋白岩藻糖基化的能力。
在具体的实施方式中，糖蛋白包含Fc。在一个实施方式中，蛋白是抗体。在一个实施方式中，蛋白包含IgG的序列。在具体的实施方式中，IgG的序列是IgG1，IgG2，IgG3，IgG4序列，或其组合。在具体的实施方式中，蛋白是抗体并且抗体包含具有IgG1，IgG2，IgG3和/或IgG4序列的Fc。
在一个实施方式中，细胞选自CHO、COS、人类视网膜(例如PER.C6TM)、Vero或HeLa细胞。
在一个方面，提供了用于制备糖蛋白的方法，包括在哺乳动物细胞中表达糖蛋白，其中所述哺乳动物细胞表达修饰的FX基因。
在一个实施方式中，提供了用于制备糖蛋白的方法，包括：在足以使CHO细胞表达糖蛋白的条件下在培养基中培养表达糖蛋白的CHO细胞，并从CHO细胞或培养基中回收表达的糖蛋白。在一个实施方式中，表达的糖蛋白是不超过大约5％岩藻糖基化的。在一个实施方式中，是不超过大约4％，3％，2％，1％或0.5％岩藻糖基化的。在具体的实施方式中，岩藻糖基化百分率是岩藻糖相对于聚糖的摩尔百分率。在具体的实施方式中，岩藻糖基化百分率是岩藻糖相对于糖蛋白的摩尔百分率。在具体的实施方式中，非岩藻糖基化相对于岩藻糖基化蛋白的摩尔比例是大约0.90对0.10、大约0.91对0.09、大约0.92对0.08、大约0.93对0.07、大约0.94对0.06、大约0.95对0.05、大约0.96对0.04、大约0.97对0.03、大约0.98对0.02，或大约0.99对0.01。
在一个实施方式中，糖蛋白包含免疫球蛋白CH2和CH3区，在297位(EU编号)具有下列聚糖部分：通过N-连接结合于糖蛋白的GlcNAc(1)；GlcNAc(1)-GlcNAc(2)-甘露糖(1)，其中甘露糖(1)具有第一和第二部分，其中第一部分基本上由甘露糖(2)-ManGlcNAc(3)组成；并且其中第二部分基本上由甘露糖(3)-GlcNAc(4)组成。在一个实施方式中，碳水化合物部分进一步基本上包含结合于GlcNAc(4)的Gal(1)。在另一个实施方式中，碳水化合物部分进一步基本上包含结合于GlcNAc(4)的Gal(1)和结合于GlcNAc(3)的Gal(2)。
在一个实施方式中，岩藻糖基化的糖蛋白包含与本段前一段中描述的非岩藻糖基化的聚糖部分相同的聚糖部分，但还在GlcNAc(1)具有岩藻糖部分。
在一个方面，提供了经遗传修饰的细胞，其中所述修饰是对FX基因的修饰，并且其中所述修饰导致细胞产生编码具有至少下列一个氨基酸的FX蛋白的FX mRNA：79S，90K，136L，211R，289S；并且其中所述细胞显示出相对于不含FX基因修饰的细胞的降低的使糖蛋白岩藻糖基化的能力。在一个实施方式中，mRNA编码在289位包含丝氨酸的FX蛋白。在另一实施方式中，mRNA编码进一步包含至少下列之一的FX蛋白的mRNA：79S，90K，136L，211R。
在一个方面，提供了经遗传修饰的细胞，其中所述修饰是对FX基因的修饰，并且其中所述修饰改变FX基因的密码子，从而该修饰的FX基因编码具有至少下列之一的FX蛋白：位置79处的丝氨酸，位置90处的赖氨酸，位置136处的亮氨酸，位置211处的精氨酸，和位置289处的丝氨酸。在一个实施方式中，FX蛋白在位置289处包含丝氨酸，和下列至少一项：位置90处的赖氨酸，位置136处的亮氨酸，和/或位置211处的精氨酸。
在一个实施方式中，细胞还表达含有Fc的蛋白。在一个实施方式中，含有Fc的蛋白是抗体。
在一个实施方式中，细胞使包含Fc的蛋白糖基化，但实质上不使糖基化的含有Fc的蛋白岩藻糖基化。在具体的实施方式中，相对于不含FX基因修饰的细胞而言，岩藻糖基化不超过糖基化的含有Fc的蛋白的岩藻糖基化的大约5％，4％，3％，2％，1％或0.5％。
在一个实施方式中，糖基化包含双触角三甘露糖基基团。在一个实施方式中，岩藻糖相对于双触角三甘露糖基基团的摩尔比例不超过大约1∶20，1∶25，1∶33，1∶50，1∶100或1∶200。在一个实施方式中，岩藻糖相对于岩藻糖基化的含有Fc的蛋白中的双触角三甘露糖基基团的摩尔比例不超过大约1∶20，1∶25，1∶33，1∶50，1∶100或1∶200。
在一个实施方式中，含有Fc的蛋白是抗体，糖基化在Fc的位置297处包含聚糖部分。在一个实施方式中，岩藻糖相对于聚糖部分的摩尔比例不超过大约1∶20，1∶20，1∶25，1∶33，1∶50，1∶100或1∶200。在一个实施方式中，聚糖部分包含两个串联的GlcNAc残基、后跟双触角三甘露糖基部分，其中三甘露糖基部分的两个末端甘露糖基部分中的每一个都携带一个GlcNAc残基。在一个实施方式中，岩藻糖相对于聚糖中的GlcNAc的摩尔比例不超过1∶80，1∶100，1∶133，1∶150，1∶200，1∶400或1∶800。
在一个方面，提供了离原位表达糖蛋白的修饰的哺乳动物细胞，其中修饰包括修饰的FX核酸序列，并且该细胞包含岩藻糖挽救途径和从新(de novo)合成岩藻糖的途径，并表达功能性FUT 8蛋白和功能性GMD蛋白，其中，由于FX核酸序列的修饰导致所述的从新合成岩藻糖途径在大约37℃实质上不能使糖蛋白岩藻糖基化，但是在大约34℃能够实质上使糖蛋白岩藻糖基化。
本文描述的各个方面和实施方式旨在单独或与任何其它方面或实施方式组合使用，除非另有明确指明或除非此类组合是上下文所不允许的。
附图说明
图1显示了：从上到下为：猴子(Macacca mulatta)，SEQ ID NO：3；人，SEQ ID NO：4；小鼠(Mus musculus)，SEQ ID NO：5；大鼠(Rattusnorvegicus)，SEQ ID NO：6；CHO(Cricetulus griseus)，SEQ ID NO：1；具有L289S和N90K修饰的CHO(称作细胞系8088)，SEQ ID NO：2的FX蛋白序列的MacVectorTM比对。
图2显示了以LCA染色之前和之后，3033、6066、7077和8088细胞的流式细胞术图谱。
图3显示了未染色的4044-1细胞的流式细胞术图谱，和以LCA染色的4044-1、6069、2020和2121细胞的图谱。
图4显示了未染色的5055细胞的流式细胞术图谱，和以LCA染色的5055、8088和1010细胞的图谱。
图5显示了以LCA染色之前和之后，在37℃和34℃培养的4044-1和6066-1细胞的流式细胞术图谱。
图6显示了在含有和不含5mM L-岩藻糖的培养基中培养的3033，7077、8088和1010细胞的流式细胞术图谱，以及在不含L-岩藻糖的培养基中培养的5055细胞的图谱。所有的细胞都以LCA染色。
图7显示了以pR4009、pR4010和pR4011稳定转染的8088细胞的流式细胞术图谱，以及5055细胞的图谱。
图8显示了在不存在外部岩藻糖源的情况下在37℃生长的8088细胞中，就Ab 3.1通过HPLC分离的聚糖(1.47％岩藻糖基化)。
图9显示了图8的聚糖的质谱结果；聚糖的结构显示于每个峰的右侧。GlcNAc残基由方框表示；甘露糖残基由圆圈表示；半乳糖残基由菱形表示。
图10显示了在存在10mM岩藻糖源的情况下在37℃生长的8088细胞中，就Ab 3.1通过HPLC分离的聚糖(95.22％岩藻糖基化)。
图11显示了图10的聚糖的质谱结果；聚糖的结构显示于每个峰的右侧。GlcNAc残基由方框表示；甘露糖残基由圆圈表示；半乳糖残基由菱形表示；岩藻糖残基由三角形表示。
图12显示了在不存在外部岩藻糖源的情况下在37℃生长的8088细胞中，就Ab 3.2通过HPLC分离的聚糖(5.73％岩藻糖基化)。
图13显示了图12的聚糖的质谱结果；聚糖的结构显示于每个峰的右侧。GlcNAc残基由方框表示；甘露糖残基由圆圈表示；半乳糖残基由菱形表示。
图14显示了在存在10mM岩藻糖源的情况下在37℃生长的8088细胞中，就Ab 3.2通过HPLC分离的聚糖(95.63％岩藻糖基化)。
图15显示了图14的聚糖的质谱结果；聚糖的结构显示于每个峰的右侧。GlcNAc残基由方框表示；甘露糖残基由圆圈表示；半乳糖残基由菱形表示；岩藻糖残基由三角形表示。
图16总结了野生型和低岩藻糖基化细胞系的质谱研究结果。GlcNAc残基由方框表示；甘露糖残基由圆圈表示；半乳糖残基由菱形表示；岩藻糖残基由三角形表示。
具体实施方式
本发明不限于所描述的特定的方法和实验条件，因为这些方法和条件可以变化。本文使用的术语仅是为了描述具体实施方式的目的，不是意在限制，因为本发明包含于授权的权利要求中。
除非另有指明，否则所用的所有术语和词语具有该术语和词语在本领域中所具有的含义，除非明确指明了相反的情况或从该术语或词语所使用的上下文中清楚地可见相反的情况。现在描述了特定的方法和材料，但是类似于或等同于所描述的那些的任何方法和材料也可用于实施或测试本发明。所提及的所有公开物通过引用方式并入本文。
单数指称(例如“一种”或“该”)意在包括复数指称，除非上下文明确指明排除复数指称。
术语“抗体”包括免疫球蛋白分子，其包含4个多肽链：2个重链(H)和2个轻链(L)，通过二硫键相互连接。每个重链包含重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)。重链恒定区包含3个结构域：CH1、CH2和CH3。每个轻链包含轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)。VH和VL区可以进一步细分为被称作互补决定区(CDR)的高变区，更保守的、被称作框架区(FR)的区域散布其中。每个VH和VL包含3个CDR和4个FR，从氨基末端至羧基末端按照下列顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4(重链CDR可以简写为HCDR1、HCDR2和HCDR3；轻链CDR可以简写为LCDR1、LCDR2和LCDR3)。术语“高亲和性抗体”是指针对其靶表位具有大约10-9M或更低的KD的抗体(例如，大约1x 10-9M、1x 10-10M、1x 10-11M或大约1x 10-12M)。在一个实施方式中，通过表面等离子共振、例如BIACORETM测定KD；在另一实施方式中，通过ELISA测定KD。
词语“结合蛋白”包括能够特异性识别结合伴侣的任何蛋白。特异性识别一般需要结合蛋白以不高于数微摩尔的解离常数(KD)与其结合伴侣结合，在多数情况下，理想的结合蛋白以纳摩尔范围与其结合伴侣结合，例如在多个实施方式中为小于100纳摩尔的数量级。本文描述的多数结合蛋白也是含有Fc的蛋白，即，它们包含与Fc融合的结合部分，所述Fc至少包含免疫球蛋白CH2和CH3区域的功能部分。典型的结合蛋白为抗体，多特异性抗体(例如双特异性抗体)，免疫粘附素、捕获剂(traps)(例如细胞因子捕获剂，例如IL-1捕获剂；VEGF捕获剂等)。不是抗体的典型的结合蛋白携带结合部分(例如，受体或其片段、配体或其片段、常规的免疫球蛋白可变域上的变异等)和免疫球蛋白部分，所述免疫球蛋白部分通常包含CH2和CH3免疫球蛋白结构域(或保留Fc效应子功能的其片段)。因此，本发明的组合物和方法可用于制备结合蛋白(例如，包括免疫粘附素和捕获剂)，其携带结合Fc受体和/或激活补体的免疫球蛋白区域(例如功能性CH2和CH3区域)，从而能够介导ADCC和/或CDC。
多特异性抗体可以特异于一个靶多肽的不同表位，或者可以含有特异于多个靶多肽的抗原结合结构域。可以制备双特异性的多特异性结合蛋白，其包含2个免疫球蛋白臂，例如，其中免疫球蛋白的第一个臂特异于第一表位，免疫球蛋白的第二个臂特异于第二表位。其它的多特异性结合蛋白包括：其中第二个臂携带特异性结合靶标——蛋白或非蛋白结合伴侣——的结合部分(配体或受体或其结合片段)。
术语“双特异性抗体”包括能够选择性结合两个或两个以上表位的抗体。双特异性抗体一般包含2个不同的重链，每个重链特异性结合不同的表位——两个不同分子上的不同表位(例如两个不同抗原上的不同表位)或同一分子上的不同表位(例如，同一抗原上的不同表位)。如果双特异性抗体能够选择性结合两个不同表位(第一表位和第二表位)，则第一重链针对第一表位的亲和性一般比第一重链针对第二表位的亲和性低至少1至2或3或4或更多的数量级，反之亦可。由双特异性抗体特异性结合的表位可以在相同或不同的靶标上(例如在相同或不同的蛋白上)。可以通过例如组合识别同一抗原上的不同表位的重链来制备双特异性抗体。例如，可以将编码识别相同抗原上的不同表位的重链可变序列的核酸序列融合至编码相同或不同重链恒定区的核酸序列，可以在表达免疫球蛋白轻链的细胞中表达此类序列。典型的双特异性抗体具有2个重链，每个具有3个重链CDR，后跟(从N-末端至C-末端)CH1结构域、铰链区、CH2结构域和CH3结构域；还具有免疫球蛋白轻链，其不赋予表位结合特异性但是可以与每个重链结合，或者可以与每个重链结合并且可以结合重链表位结合区所结合的一个或多个表位，或者可以与每个重链结合并能使1个或2个重链与1个或2个表位结合。
双特异性结合蛋白的一个实例采用第一免疫球蛋白(Ig)CH3结构域和第二Ig CH3结构域，其中第一和第二Ig CH3结构域彼此相差至少1个氨基酸，并且其中至少1个氨基酸的差异降低双特异性抗体与蛋白A的结合(相对于不含氨基酸差异的双特异性抗体)。在一个实施方式中，第一Ig CH3结构域结合蛋白A，第二Ig CH3结构域含有突变，该突变降低或消除蛋白A的结合，例如435R修饰(根据EU编号；根据IMGT外显子编号则为95R)。第二CH3还可以包含436F修饰(根据EU编号；根据IMGT编号则为96F)。可以存在于第二CH3中的其它修饰包括356E，358M，384S，392N，397M和4221(根据EU编号；根据IMGT编号则为16E，18M，44S，52N，57M和82I)。在该形式下，第一Ig CH3结构域融合于第一结合部分(例如特异性结合第一表位的第一Ig可变结构域)，第二Ig CH3结构域融合于第二结合部分(例如特异性结合第二表位的第二Ig可变结构域，其中第一和第二表位是不同的)。
术语“细胞”包括适合于表达重组核酸序列的任何细胞。细胞包括真核细胞(单细胞或多细胞)、酵母细胞(例如酿酒酵母、粟酒裂殖酵母、巴斯德毕赤酵母、甲醇型毕赤酵母等)、植物细胞、昆虫细胞(例如SF-9、SF-21、杆状病毒感染的昆虫细胞、粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)等)、非人类的动物细胞、人类细胞或细胞融合物，例如杂交瘤或四源杂交瘤(quadroma)。天然不包含岩藻糖基化途径的细胞可以被遗传修饰以使其包含之(见，例如，美国专利申请公开号2010/0028951A1)，并且细胞可以被修饰以使用经过如本文所述经过修饰的FX基因。
在一些实施方式中，细胞是人、猴子、猿、仓鼠、大鼠或小鼠细胞。在一些实施方式中，细胞是真核细胞并且选自下列细胞：CHO(例如CHOK1、DXB-11CHO、Veggie-CHO)，COS(例如COS-7)，叙利亚仓鼠，大鼠黑素瘤，小鼠黑素瘤(例如SP2/0、NS0)，视网膜细胞，Vero，CV1，肾(例如HEK293，293EBNA，MSR 293，MDCK，HaK，BHK，BHK21)，HeLa，HepG2，WI38，MRC 5，Colo205，HB 8065，HL-60，Jurkat，Daudi，A431(表皮的)，CV-1，U937，3T3，L细胞，C127细胞，MMT 060562，Sertoli细胞，BRL 3A细胞，HT1080细胞，人黑素瘤细胞，肿瘤细胞，人淋巴瘤细胞(例如Namalwa细胞)和源自前述细胞的细胞系。在一些实施方式中，细胞包含一个或多个病毒基因，例如，细胞是表达病毒基因的视网膜细胞(例如PER.C6TM细胞)。
词语“含有Fc的蛋白”包括抗体、双特异性抗体、免疫粘附素和其它至少包含免疫球蛋白CH2和CH3区域的功能部分的结合蛋白。“功能部分”是指能够结合Fc受体(例如FcγR或FcRN)的CH2和CH3区域，和/或能够参与补体激活的区域。如果CH2和CH3区域包含删除、置换、和/或插入或使其不能结合任何Fc受体并且也不能激活补体的其它修饰，则该CH2和CH3区域不是功能性的。
含有Fc的蛋白可以在免疫球蛋白结构域中包含修饰，包括影响结合蛋白的一种或多种效应子功能的修饰(例如影响FcγR结合、FcRN结合，因而影响半衰期，和/或CDC活性的修饰)。此类修饰包括但不限于，下列修饰及其组合，根据免疫球蛋白恒定区的EU编号：238，239，248，249，250，252，254，255，256，258，265，267，268，269，270，272，276，278，280，283，285，286，289，290，292，293，294，295，296，297，298，301，303，305，307，308，309，311，312，315，318，320，322，324，326，327，328，329，330，331，332，333，334，335，337，338，339，340，342，344，356，358，359，360，361，362，373，375，376，378，380，382，383，384，386，388，389，398，414，416，419，428，430，433，434，435，437，438和439。例如但不限于：结合蛋白可以显示出延长的血清半衰期并在位置252，254和256具有修饰；或在428和/或433和/或434具有修饰；或在250和/或428具有修饰；或在307或308和434具有修饰。
术语“FX”是指显示出GDP-4-酮-6-脱氧甘露糖-3，5-表异构酶-4-还原酶活性的蛋白或编码具有GDP-4-酮-6-脱氧甘露糖-3，5-表异构酶-4-还原酶活性的蛋白的核酸序列。本文描述的多数实例是指野生型中国地鼠(C.griseus)的FX或根据本发明进行了修饰的中国地鼠FX。然而，“FX”不局限于就CHO细胞而言。如图1所示，猴子、人、小鼠、大鼠的FX序列显示出非常高度的保守性，即，来自多种生物的FX序列是非常非常相似的。基于该高度同一性，预期这些物种之间存在的微小的序列差异将不会对FX活性造成实质性影响。CHO FX序列(SEQ ID NO：1)和来自猴子的序列(SEQ ID NO：3)、人的序列(SEQ ID NO：4)、小鼠的序列(SEQ ID NO：5)和大鼠的序列(SEQ ID NO：6)之间的差异包括下列：5H，8M，21K，37D，51T，55R，59E，62R，93M，106A，107C，138N，161Y，167S，177Y，201S，202S，202D，212N，225Q，235S，266H，266N，266S，273T，274S，280F，287S，291T，291S，297C，310D，314E。对于321个氨基酸的野生型CHO FX(SEQ ID NO：1)而言，猴子、人、小鼠和大鼠的FX序列中的任一项都可以通过从31个不同置换或31/321x 100＝9.6％的野生型CHO FX序列中进行选择而概括。因此，本发明的修饰的FX包括野生型CHO FX(例如SEQ ID NO：1)或与野生型CHO FX具有至少90.4％同一性、并且还携带选自下列的置换的FX：N79S，N90K，G211R和L289S。与SEQ ID NO：1差异更小的本发明的修饰的FX与SEQ ID NO：1具有至少91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的同一性，并且携带选自下列的至少一个修饰：N79S，N90K，P136L，G211R和L289S，例如携带L289S修饰。本领域技术人员将预料到在位置79，90，136，211和289中的至少一个位置处的一个或多个小的插入或一个或多个小的删除将很可能提供与本发明的实施方式相关的优点(例如，携带修饰的基因的细胞将显示出降低的糖蛋白岩藻糖基化)。
在具体的实施方式中，FX包括第一置换289S和一个或多个第二置换。
术语“低岩藻糖基化”或“减少的岩藻糖基化”是指：相对于正常或野生型细胞，修饰的细胞的降低的或减少的使糖蛋白岩藻糖基化的能力。糖蛋白可以是内源糖蛋白。更通常而言，核酸修饰是在用于表达异源糖蛋白的细胞中进行的，例如离原位地表达结合蛋白(例如抗体或双特异性抗体或免疫粘附素或其它的含有Fc的糖蛋白)的细胞。例如，根据本发明修饰的CHO或PERC.6TM细胞系，其也表达人抗体，例如人IgG1抗体。
一般地，就糖蛋白所述的“低岩藻糖基化”或“减少的岩藻糖基化”不是指单一的糖蛋白分子上附着有较少的岩藻糖残基。相反，其是指从细胞制备而来的糖蛋白制备物，并且该糖蛋白制备物包含个体糖蛋白分子的群体，该群体中的成员具有不同的糖基化特征。为了解释而非限制性的目的，对于在根据本发明的修饰的CHO细胞中表达的IgG1抗体而言，“低岩藻糖基化”或“减少的岩藻糖基化”是指：在Fc的297位处的聚糖的N-连接的GlcNAc残基上具有岩藻糖残基的个体糖蛋白的数目较少。此类“低岩藻糖基化”或“减少的岩藻糖基化”可以通过多种方式表征(见本文其它地方所述)，但是在每种情况下都是指：相对于在不含根据本发明的修饰的细胞系中制备的相同的糖蛋白的群体，具有岩藻糖残基的糖蛋白群体的数目相对较低(或减少)。
举例而言，如果相对于通过野生型细胞制备的相同糖蛋白而言根据本发明制备的糖蛋白是1％岩藻糖基化的，则相对于在对应的野生型细胞中观察到的岩藻糖基化的量(人工设定为100％，无论在相同的条件下是否该野生型细胞中的所有的含有Fc的蛋白分子都是岩藻糖基化的)，在本发明的细胞中仅有1％的含有Fc的蛋白分子是岩藻糖基化的。
在根据本发明的“低岩藻糖基化”或“减少的岩藻糖基化”的细胞中，相对于不含修饰的细胞，糖蛋白的岩藻糖基化降低大约90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％。在具体的实施方式中，相对于不含修饰的细胞降低大约99.1％，99.2％，99.3％，99.4％，99.5％，99.6％，99.7％，99.8％或99.9％。在另一个具体实施方式中，相对于不含修饰的细胞降低大约98.1％，98.2％，98.3％，98.4％，98.5％，98.6％，98.7％，98.8％或98.9％。在另一个具体实施方式中，相对于不含修饰的细胞降低大约97.1％，97.2％，97.3％，97.4％，97.5％，97.6％，97.7％，97.8％或97.9％。在另一个具体实施方式中，相对于不含修饰的细胞降低大约96.1％，96.2％，96.3％，96.4％，96.5％，96.6％，96.7％，96.8％或96.9％。在另一个具体实施方式中，相对于不含修饰的细胞降低大约95.1％，95.2％，95.3％，95.4％，95.5％，95.6％，95.7％，95.8％或95.9％。在另一个具体实施方式中，相对于不含修饰的细胞降低大约94.1％，94.2％，94.3％，94.4％，94.5％，94.6％，94.7％，94.8％或94.9％。
相对于在不含修饰的细胞中制备的相同的糖蛋白中的岩藻糖基化的量，在根据本发明的细胞中制备的糖蛋白中仅有大约5％、大约4％、大约3％、大约2％、大约1％、大约0.5％、大约0.4％、大约0.3％、大约0.2％或大约0.1％的岩藻糖基化。
表征从“低岩藻糖基化”或“减少的岩藻糖基化”的细胞制备的糖蛋白制备物的另一种方式是通过从该细胞制备的糖蛋白制备物中的岩藻糖基化的糖蛋白与非岩藻糖基化的糖蛋白的比例。例如，从修饰的细胞制备的糖蛋白制备物具有大约1∶10至1∶15，1∶15至1∶20，1∶20至1∶40，1∶40至1∶60，1∶60至1∶80，1∶80至1∶100，或1∶100至1∶150的岩藻糖基化糖蛋白∶非岩藻糖基化糖蛋白的比例。
表征从“低岩藻糖基化”或“减少的岩藻糖基化”的细胞制备的糖蛋白制备物的另一种方式是通过非岩藻糖基化的糖蛋白的相对重量百分率(相对于总的，即岩藻糖基化的和非岩藻糖基化的糖蛋白)。例如，相对于从不含修饰的细胞制备的相同的糖蛋白制备物，从修饰的细胞制备的糖蛋白制备物具有大约90％，大约95％，大约96％，大约97％，大约98％，大约99％，或大约99.5％的非岩藻糖基化的糖蛋白。
表征从“低岩藻糖基化”或“减少的岩藻糖基化”的细胞制备的糖蛋白制备物的另一种方式是岩藻糖相对于聚糖的相对量或岩藻糖相对于糖蛋白制备物的聚糖成分的相对量。例如，在含有Fc的蛋白(例如抗体)的情况下，糖基化在位置297处包含聚糖，并且该聚糖包含双触角三甘露糖基部分。在一个实施方式中，岩藻糖与聚糖部分的摩尔比不超过大约1∶20，1∶20，1∶25，1∶33，1∶50，1∶100或1∶200。在一个实施方式中，岩藻糖与双触角三甘露糖基部分之比不超过大约1∶20，1∶25，1∶33，1∶50，1∶100或1∶200。在一个实施方式中，岩藻糖基化的含有Fc的蛋白中的岩藻糖与双触角三甘露糖基部分的摩尔比不超过大约1∶20，1∶25，1∶33，1∶50，1∶100或1∶200。在一个实施方式中，聚糖部分包含两个串联的GlcNAc残基，后跟双触角三甘露糖基部分，其中三甘露糖基部分的两个触角末端的甘露糖基部分的每一个都携带1个GlcNAc残基。在一个实施方式中，岩藻糖与聚糖中的GlcNAc的摩尔比不超过1∶80，1∶100，1∶133，1∶150，1∶200，1∶400或1∶800。
在一个实施方式中，所制备的岩藻糖基化的抗体蛋白的量这样测定：使用PNGase F使抗体蛋白过夜去糖基化，然后通过HPLC进行寡糖分析，其中通过聚糖峰面积的积分定量含有岩藻糖基的寡糖，例如，基于聚糖峰面积计算蛋白岩藻糖基化。可以通过任何合适的方法(例如质谱)测定(和/或定量)聚糖的身份(和成分)。
词语“野生型”包括提及未根据本发明进行修饰的细胞或活性，例如不含修饰的FX核酸序列或修饰的FX蛋白的细胞。“野生型”FX活性包括提及天然或未修饰的FX基因或蛋白显示出的活性(例如酶活性)的任何参数。在比较FX蛋白的“野生型活性”和修饰的FX蛋白的活性时，通过实质上相同的方式从实质上相同的来源(例如相同的细胞类型、相同的生物体)分离“野生型”FX蛋白和修饰的FX蛋白，并在实质上相同的条件下比较。在野生型细胞和修饰的细胞之间比较“野生型”FX活性和修饰的FX活性时，优选在实质上相同或实质上相似的条件下，使用相同或实质上相同的糖蛋白测定FX活性。
概述
提供了修饰的FX核酸和蛋白序列，其中所述修饰产生了这样的细胞：在不存在外源岩藻糖源的情况下，不能在不含修饰的细胞所能支持的水平支持蛋白质的岩藻糖基化。在一个温度，由于从新合成用于糖蛋白岩藻糖基化的底物GDP-L-岩藻糖的酶活性的破坏，细胞显示出实质上降低的使糖蛋白岩藻糖基化的能力(在不存在岩藻糖源的情况下)。在另一个温度(较高温度)，细胞的能力的降低是极小的或非实质性的。
酶GDP-4-酮-脱氧-甘露糖-3，5-表异构酶-4-还原酶(FX)参与GDP-L-岩藻糖的从新合成途径：从GDP-4-酮-6-脱氧甘露糖形成GDP-L-岩藻糖。得到的GDP-L-岩藻糖可被细胞利用以产生岩藻糖基化的蛋白，包括岩藻糖基化的抗体。由于GDP-L-岩藻糖合成酶参与该从新合成途径，可以通过救援途径拯救缺乏足够的FX活性的细胞中的岩藻糖基化的减少。救援途径需要岩藻糖，其通过救援途径作用而形成GDP-L-岩藻糖，其为蛋白质岩藻糖基化的底物。
FX中的某些修饰导致具有修饰的FX基因的细胞在不存在岩藻糖源的情况下不能支持蛋白质的岩藻糖基化，从而，相对于携带野生型FX基因的野生型细胞，携带修饰的酶并表达例如重组抗体的细胞显示出实质上降低的使抗体岩藻糖基化的能力。
在本文中描述的由于FX基因修饰而导致的不能支持足够速率或水平的蛋白质岩藻糖基化的能力实质上是温度依赖性的。特别地，携带修饰的FX基因的细胞在大约37℃显示出实质上不能支持糖蛋白岩藻糖基化(例如，人IgG1同种型抗体7％岩藻糖基化)，在大约34℃，该能力实质上恢复(例如相同抗体的70％岩藻糖基化；见表3)。相反，仅具有野生型FX基因的细胞在37℃和34℃不显示出支持糖蛋白岩藻糖基化能力上的大的差异。
产生GDP-岩藻糖的从新和救援途径
GDP-岩藻糖是糖蛋白岩藻糖基化途径中的中心代谢物；其是糖蛋白岩藻糖基化中的岩藻糖供体。所有已知的能够使包含Fc的糖蛋白岩藻糖基化的感兴趣的岩藻糖基转移酶都使用GDP-岩藻糖。因此，为了有效率地进行糖蛋白的岩藻糖基化，必须产生足够的GDP岩藻糖贮库并维持在足以匹配糖蛋白产生的水平。
主要有两个途径产生GDP-岩藻糖：从新途径和救援途径。在很多哺乳动物细胞中，可以通过从新岩藻糖基化途径从外部供应的碳源(例如葡萄糖)制备GDP-岩藻糖。在用于岩藻糖基化的从新途径中，葡萄糖通过转运子进入细胞，并且被转化为D-甘露糖-1-磷酸。然后，D-甘露糖-1-磷酸被D-甘露糖-1-磷酸鸟苷酰基转移酶转化为GDP-甘露糖。GDP-甘露糖被GDP甘露糖4，6-二水合酶(GMD)转化为GDP-4-酮-6-脱氧-甘露糖。GDP-4-酮-6-脱氧-甘露糖被GDP-4-酮-6-脱氧-甘露糖-3，5-表异构酶-4-还原酶(FX)转化为GDP-岩藻糖。GDP-岩藻糖是GMD的有力的回馈抑制剂。GDP-岩藻糖通过GDP-岩藻糖转运子进入高尔基体。一旦进入高尔基体，GDP-岩藻糖成为α1，6-岩藻糖基转移酶的底物，该酶使糖蛋白岩藻糖基化。
在很多哺乳动物细胞中，也存在用于从外部供应的岩藻糖产生GDP-岩藻糖的救援途径。在救援途径中，岩藻糖被转运至细胞并被磷酸化以形成岩藻糖-1-磷酸，后者可被转化为GDP-岩藻糖。GDP-岩藻糖被转运至高尔基体，并可作为α1，6-岩藻糖基转移酶的底物。岩藻糖向细胞的转运推测起来是通过易化扩散(facilitated diffusion)和通过溶酶体转运进行的，救援途径在哺乳动物中似乎是普遍的(见，例如Becker andLowe(2003)Fucose：biosynthesis and biological function inmammals，Glycobiology 13(7)：41R-53R)。
因此，在不存在岩藻糖源的情况下，细胞使用通过从新合成途径产生的岩藻糖使糖蛋白岩藻糖基化。在存在岩藻糖的情况下，细胞使用转运进入细胞的岩藻糖使糖蛋白岩藻糖基化。因此，如果从新合成途径被阻断或破坏，仍然可以发生糖蛋白的岩藻糖基化，但是仅在存在岩藻糖源的情况下。
通过提供具有FX核酸序列中的修饰的遗传修饰的细胞，本文描述的组合物和方法能够使细胞系提供糖蛋白岩藻糖基化途径的条件化阻断。在含有从新合成和救援途径这两者的细胞中，细胞提供增强的多面性(versatility)。在这样的细胞中，在不存在外部岩藻糖源的情况下，在一个温度时，糖蛋白的岩藻糖基化可以实质上降低，但是在另一温度时，不实质上降低。备选地，可以通过提供外部岩藻糖源开启基本上野生型的糖蛋白岩藻糖基化速率或水平，而与维持该细胞的温度无关。
FX修饰
提供了编码修饰的FX蛋白序列的分离的核酸。分离的核酸编码包含选自下列的氨基酸修饰的FX蛋白：79S，90K，136L，211R，289S，及其组合。在一个实施方式中，分离的核酸编码在位置289处包含丝氨酸的FX蛋白，在另一实施方式中，包含下列至少一项：79S，90K，136L和/或211R。
编码修饰的FX蛋白的核酸以任意合适的形式使用。核酸的合适的形式取决于其用途。例如，合适的形式包括可用于表达载体中的cDNA，以在细胞中在染色体外表达，或者可以整合(在特定位置或随机)进入细胞的基因组中的。合适的形式还包括基因组序列，其被修饰以编码本文描述的置换。合适的形式还包括例如靶向序列(例如一个或多个靶向臂)以将核酸靶向基因组中的特定位置，例如，替换天然FX基因的两个等位基因之一或二者。合适的形式包括靶向载体，其将核酸靶向细胞中的特定位置，例如靶向FX基因座，以便以根据本发明的FX核酸序列替换内源FX核酸序列。内源FX序列的修饰可以在细胞的两个等位基因之一或二者上进行。
具有低或减少的岩藻糖基化的细胞系
提供了用于低岩藻糖基化细胞系的组合物和方法。组合物包括核酸和蛋白，当存在于不含或实质上不含天然或野生型FX活性的细胞中时，赋予细胞降低的使糖蛋白(例如含有Fc的糖蛋白，例如抗体)岩藻糖基化的能力。在多个实施方式中，此类细胞包括：在第一温度(例如大约37℃)显示出实质上降低的使糖蛋白岩藻糖基化的能力、但是在第二温度(例如大约34℃)保持使糖蛋白岩藻糖基化能力的细胞。因此，提供了可以在抑制岩藻糖基化的第一温度生长的细胞，并且可以改变生长条件至允许岩藻糖基化的第二温度。
可以使用任何合适的细胞通过本文描述的组合物和方法制备低岩藻糖基化细胞系。例如但不限于：可以使用生物制药中通常使用的任何细胞系。本文描述了用于使此类细胞系成为有用的低岩藻糖基化细胞系的一些方法和组合物，其它的对于阅读本说明书的本领域技术人员而言是显而易见的或容易可见的。人类细胞(例如HeLa，PERC.6TM等)、CHO细胞、小鼠细胞等可以根据本文描述进行遗传修饰，以产生有用的细胞系。在CHO细胞的情况下，可以通过修饰FX基因的单一等位基因而制备有用的低岩藻糖基化细胞系，这是因为下列观察结果：CHO的FX活性似乎在功能上是单倍体的。另一方面，在FX基因座显示出功能上的二倍体的其它细胞的情况下，可以通过将一个FX等位基因替换为如本文描述的修饰的FX核酸序列并敲除第二个(野生型)等位基因或将两个FX等位基因都替换为如本文描述的修饰的FX核酸序列而操作细胞。
得到的细胞包括：FX活性完全或实质上表征为低岩藻糖基化的细胞。即，细胞无需完全缺失野生型FX蛋白或野生型FX基因；而是，在合适的条件或一组条件下(例如选择的温度)，细胞应该不能或实质上不能在接近完全具有正常FX活性的对应细胞所能使相同的糖蛋白岩藻糖基化的水平的任意水平使糖蛋白(例如，含有Fc的糖蛋白)岩藻糖基化。
根据本发明的细胞与不含修饰的细胞的对比在相同或基本上相同的条件(例如培养基、温度、细胞密度等)下进行。例如，在多个实施方式中，相对于野生型细胞显示的岩藻糖基化能力，细胞将显示出不超过10％至不超过1％的岩藻糖基化能力。这种对比可以这样进行：例如，制备具有如本文描述的修饰的细胞，将该细胞表达的糖蛋白的岩藻糖基化水平(例如从细胞中的表达构建体表达的抗体)与野生型细胞表达的相同糖蛋白的岩藻糖基化水平进行比较。为了进行对比，使细胞生长于相同温度的相同条件下。可以使用本领域已知的用于定量糖蛋白制备物中的岩藻糖含量的任何适宜的分析方法来确定糖蛋白的岩藻糖基化水平。
在确定有多少糖蛋白被岩藻糖基化时，将岩藻糖的量与总糖蛋白的量或与获自蛋白的聚糖的量进行对比。
岩藻糖基化缺陷型细胞系
已经分离了多种完全不能使糖蛋白岩藻糖基化的哺乳动物细胞系。对于缺乏岩藻糖基化的抗体的需求大大刺激了岩藻糖基化缺陷型细胞系的开发。相对于岩藻糖基化的抗体，缺乏岩藻糖基化的抗体能够更好地介导抗体依赖性的细胞介导的细胞毒性(ADCC)，这是由于与Fc受体的结合改变了。因此，更好地介导ADCC的抗体是高度理想的，尤其是包含靶向肿瘤细胞的可变区的抗体。因此，不能使糖蛋白岩藻糖基化的细胞广泛用于治疗用途的抗体的开发和制备。
已经开发了两个岩藻糖基化途径敲除，它们导致细胞不能使糖蛋白岩藻糖基化。敲除α1，6-岩藻糖基转移酶(FUT8)导致不能将GDP-岩藻糖转移至糖蛋白。敲除GDP甘露糖4，6-二水合酶(GMD)导致不能通过从新合成途径从GDP-甘露糖产生GDP-4-酮-6-脱氧-甘露糖。
GDP-甘露糖形成中的下游的岩藻糖基化敲除，例如α1，6-岩藻糖基转移酶的敲除，不能借助于救援途径在存在外部岩藻糖源的情况下使糖蛋白岩藻糖基化。这是由于阻断距离GDP-岩藻糖的形成较远，GDP-岩藻糖是从新合成和救援途径交汇处的代谢物。因此，以岩藻糖喂养具有此类敲除的细胞将不能挽救糖蛋白的岩藻糖基化。因此，α1，6-岩藻糖基转移酶的敲除不能提供选择性操作细胞使糖蛋白岩藻糖基化能力的简单途径。
理论上，GDP-岩藻糖形成中的上游的岩藻糖基化敲除，例如GMD敲除，能够借助于救援途径使糖蛋白岩藻糖基化。这是因为阻断发生于形成GDP-甘露糖之前。以岩藻糖喂养此类细胞理论上将挽救糖蛋白岩藻糖基化。但是，具有此类敲除的细胞系缺乏多面性(versatility)。
本发明人发现：选择性破坏形成GDP-岩藻糖之前的从新岩藻糖基化途径将产生具有缺陷的细胞系，该缺陷可通过提供岩藻糖源而被挽救，或者通过将细胞维持于允许进行岩藻糖基化的条件下而被挽救。本发明人对细胞进行了修饰，使其在GDP-岩藻糖上游的从新合成途径中具有缺陷，并且可以在不存在岩藻糖的情况下在第一条件下生长并且显示出实质上降低的使糖蛋白岩藻糖基化的能力，而在第二条件下，该细胞能够在不存在外部岩藻糖源的情况下有效地使糖蛋白岩藻糖基化。此类特别通用的细胞系提供了通过控制外部岩藻糖源(或合适的岩藻糖前体)的可利用性和/或使细胞在允许岩藻糖基化的条件或岩藻糖基化缺陷型条件下生长而开启或关闭细胞系中的岩藻糖基化的选择。
本发明人通过制备突变的FX核酸序列而选择性地破坏了用于GDP-岩藻糖合成的从新合成途径。FX蛋白是双功能性的表异构酶-还原酶，其使甘露糖的C3羟基和C5甲基表异构化，形成GDP-4-酮-6-脱氧半乳糖。然后，该双功能酶的NADPH依赖性还原酶活性将酮部分还原，形成GDP-岩藻糖。FX基因是高度保守的，这反映于FX蛋白的高度同一性和相似性。见，例如Becker and Lowe(2003)Fucose：biosynthesis andbiological function in mammals，Glycobiology，13(7)：41R-53R。因此，通过CHO细胞中的FX突变所呈现的数据适用于多种细胞中的对应的FX修饰。
选择性的FX破坏提供了增强的多面性(versatility)，这允许操作者通过在第一温度维持培养物而停止或抑制岩藻糖基化，但允许通过在第二温度维持培养物而进行岩藻糖基化。在多个实施方式中，这通过修饰的FX基因而例示，其中修饰包括选自下列的修饰(对于CHO FX蛋白而言)：L289S，N79S，N90K，P136L，G211R，及其组合。在多个实施方式中，FX修饰基本上包含选自下列的修饰L289S，L289S/N90K，L289S/G211R，L289S/P136L，L289S/N79S，及其组合。
如本领域技术人员已知，从表型的角度上讲，某些二倍体的细胞显示出的表型反映特定基因座的两个等位基因中的仅一个的活性(例如CHO细胞)，以及就那些在功能上表现为单倍体(或亚二倍体)的基因座而言。在此类细胞中，即使是如本文所述的单一等位基因的修饰也可产生基本上反映修饰的等位基因的活性的表型，即使是在表型不是显性表型的情况下。例如，在CHO细胞中，如本文描述的单一等位基因的修饰可能产生基本上如本文描述的FX表型，推测起来大概是由于野生型FX等位基因的不表达(或低表达)。
在多个实施方式中，FX是非CHO细胞的FX，并且修饰包括选自下列的修饰：非CHO FX中的对应于如上所列的CHO修饰的修饰。可以通过将CHO FX蛋白序列与任何其它感兴趣的FX序列进行比对(在比对中含有或不含空隙)来鉴定对应的修饰：使用例如一般目的的多序列比对算法，例如，使用缺省参数的ClustalW[例如，对于人(登记号AAC50786)和中国地鼠(登记号AAM91926)FX，使用MacVectorTM v.10.0.2，配对：Gonnet矩阵为低比对速率，开放空隙罚分＝10.0，延伸空隙罚分＝0.1；多重：Gonnet系列，开放空隙罚分＝10.0，延伸空隙罚分＝0.2，延迟分歧＝30％，空隙分割距离＝4，无末尾空隙分割，残基特异性罚分和亲水性罚分(亲水性残基GPSNDQEKR)。
在实际中，使用配对比对缺省参数，在MacVectorTM中将主题序列与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：1和3-6比对，将鉴定该主题序列中的进行修饰的对应位置：等同于CHO的N79，N90，P136，G211和L289位置。
糖蛋白
组合物和方法可用于修饰细胞的岩藻糖基化的能力，以实现任意目标糖蛋白的低岩藻糖基化。虽然本公开内容中大多数是指抗体中的减少的岩藻糖基化的益处，但是本发明的有益之处不限于抗体。可以通过本发明的组合物和方法制备任何携带Fc的结合蛋白，有很多很多类型的此类结合蛋白。
可以通过本发明制备的典型的糖蛋白是糖基化的、并且在正常条件下在野生型细胞中是岩藻糖基化的抗体(例如，人类、小鼠或人源化抗体)。实例包括，例如但不限于，IgG1、IgG2和IgG4亚型的人类抗体。此类抗体的糖形式包括在位置297处具有聚糖部分的那些。位置297处的典型的糖形式包括N-连接的GlcNAc，后跟GlcNAc，后跟双触角三甘露糖基部分，后跟(在双触角三甘露糖基部分的两个甘露糖基部分中的每一个之上)一个或多个GlcNAc残基，任选地后跟附着于双触角三甘露糖基部分的触角上的一个或多个GlcNAc残基上的半乳糖残基。聚糖的岩藻糖基化通常发生于N-连接的最初的GlcNAc残基，其中(通常而言)单一的岩藻糖残基通过岩藻糖基转移酶连接至297-糖基化抗体。在多个实施方式中，以该岩藻糖残基相对于抗体的量(或摩尔数)和/或聚糖或聚糖取代基的量(或摩尔数)来测定抗体的岩藻糖基化的摩尔比率或百分率或程度[例如，在获自野生型细胞或包含根据本发明所述的修饰的FX核酸序列的细胞的抗体制备物中，岩藻糖∶抗体、或岩藻糖∶GlcNAc或岩藻糖∶甘露糖或岩藻糖∶三甘露糖基部分或岩藻糖∶半乳糖(297-连接的聚糖中的)的相对摩尔数]。
低岩藻糖基化CHO系
从适应于在无血清的生物反应器培养基中悬浮生长的CHO K1细胞构建了低岩藻糖基化的CHO系。该CHO系(称作：系6066)在CHO FX基因中含有L289S置换。如实施例所述，在该细胞系以及不含FX修饰的对应的CHO细胞系(称作：系4044)中制备了重组抗体：特异性结合白细胞介素受体的人IgG1(抗体1)和特异性结合免疫细胞的细胞表面蛋白的人IgG1(抗体2)。在摇瓶中使细胞生长3天，或者在生物反应器中生长12天(各在37℃)。
携带FX基因修饰并表达抗体1的细胞仅使大约6.14％或6.86％(12天)或大约7％或8％(3天)的抗体1岩藻糖基化，而在不存在FX修饰的细胞中，岩藻糖基化为大约89.3％(3天)或大约85.8％(12天)(表1)。
携带FX基因修饰并表达抗体2的细胞仅使大约3.6％的抗体2岩藻糖基化，而在不存在FX基因修饰的情况下，细胞岩藻糖基化为大约95％(3天)或大约76.8％(12天)(表1)。
从含有CHO FX基因的L289S和N90K修饰的CHO K1细胞中制备了另一个低岩藻糖基化CHO系(称作：系8088)。这些细胞表达的抗体1显示出仅大约0.96％岩藻糖基化(3天)或0.71％岩藻糖基化(12天)(表2)。
从CHO K1细胞(从6066-1细胞，其具有L289S FX基因修饰)制备了另一种低岩藻糖基化CHO系，其含有P136L置换(称作：系2121)。这些细胞表达的抗体1在第3天仅有0.82％的岩藻糖基化(表2)。
从CHO K1细胞(从6066-1细胞，其具有L289S FX基因修饰)制备了另外两低岩藻糖基化CHO系，它们含有N79S置换(称作：系2020和6069)。这些细胞表达的抗体1在第3天仅有0.94％的岩藻糖基化(2020)或在第3天仅有0.86％的岩藻糖基化(6069)(表2)。
使用细胞系4044-1(无FX基因修饰)和细胞系6066-1(L289S FX基因修饰)测定了抗体1的岩藻糖基化的温度依赖性。细胞系6066-1在37℃仅显示出7％的岩藻糖基化，在34℃显示出大约70％的岩藻糖基化。细胞系4044-1在37℃和34℃都显示出大约相同的岩藻糖基化(95％-96％)。
从细胞系8088(L289S和N90K)制备了另外两种低岩藻糖基化细胞系，它们表达针对相同的生长因子受体的两种不同抗体：Ab 3.1和Ab3.2。在37℃在存在岩藻糖(救援途径)或不存在岩藻糖(从新合成途径)的情况下生长3天之后，测定聚糖的组成和聚糖的岩藻糖含量。在不存在岩藻糖的情况下，细胞系仅产生大约1.87％或5.73％的岩藻糖基化，而在存在外部岩藻糖源的情况下，岩藻糖基化恢复至至少95.22％或95.63％。
实施例
实施例1：CHO细胞系
本文描述了多种直接或间接分离自CHO K1细胞的CHO细胞系。
RGC10细胞：按照美国专利号7,435,553(通过引用方式并入本文)中针对RGC10细胞的描述，从CHO K1细胞产生CHO细胞系3033。简而言之，以载体pTE158和pcDNA6/TR(Invitrogen)稳定转染CHO K1细胞。就多西环素(doxycycline)可诱导的hFcγR1的表达筛选转染的细胞，选择一个克隆以产生3033细胞系。3033细胞适应于在无血清的培养基3(Medium 3)中悬浮培养。
5055细胞：5055细胞是适应于在无血清的生物反应器培养基2(Medium 2)中悬浮生长的CHO K1细胞。
4044细胞：按照2008年6月4日提交的国际专利申请公开号WO2008/151219A1以及2008年6月4日提交的美国专利申请公开号2009/0124005A1(二者通过引用方式并入本文)中的描述从RGC16细胞衍生4044细胞，其在增强的表达和稳定性(EESYR)基因座包含loxed盒(loxed cassette)。4044中的EESYR基因座从编码链的5’至3’包含：loxP位点、SV40晚期启动子、嘌呤霉素抗性基因、CMV启动子、IRES、eCFP基因、lox2272位点、CMV启动子、DsRed基因和lox511位点。4044细胞还包含稳定转染的pcDNA6/TR载体。
其它细胞：7077细胞系衍生自3033细胞：不使用外源重组核酸。6066、8088和1010细胞系衍生自4044细胞：不使用异源重组核酸。
实施例2：CHO细胞中重组抗体的产生
载体：本文描述的载体具有所指明的特征，其中特征的相对位置是就编码链而言，以5’至3’列举。
pR4000：人UbC启动子、编码Ab 2的重链的基因、SV40晚期启动子、潮霉素抗性基因。
pR4001：人UbC启动子、编码Ab 2的轻链的基因、SV40晚期启动子、嘌呤霉素抗性基因。
pR4002：LoxP位点、人CMV启动子、编码Ab 2的重链的基因、SV40晚期启动子、Lox2272位点。
pR4003：Lox2272位点、潮霉素抗性基因、IRES、EGFP基因、人CMV启动子、编码Ab 2的轻链的基因、Lox511位点。
pR4004：SV40晚期启动子和编码Cre重组酶的基因(见WO2008/151219A1，通过引用方式并入本文)。
pR4005：LoxP位点、人CMV启动子、编码抗体1(Ab 1)的轻链的基因、SV40晚期启动子、Lox2272位点。
pR4006：Lox2272位点、潮霉素抗性基因、IRES、EGFP基因、人CMV启动子、编码Ab 1的重链的基因、Lox511位点。
pR4007：LoxP位点、人CMV启动子、编码Ab 1的轻链的基因、SV40晚期启动子、编码潮霉素抗性蛋白的N末端的基因、Lox2272位点。
pR4008：Lox2272位点、编码潮霉素抗性蛋白的C末端的基因、IRES、EGFP基因、人CMV启动子、编码Ab 1的重链的基因、Lox511位点。
pR4009：LoxP位点、SV40晚期启动子、潮霉素抗性基因、内部核糖体进入位点(IRES)、EGFP基因、人CMV启动子、Lox511位点。
pR4010：LoxP位点、SV40晚期启动子、潮霉素抗性基因、IRES、EGFP基因、人CMV启动子、野生型FX基因、Lox511位点。
pR4011：LoxP位点、SV40晚期启动子、潮霉素抗性基因、IRES、EGFP基因、人CMV启动子、具有突变L289S和N90K的突变的FX基因。
通过细胞表面LCA染色并通过从CHO细胞产生的重组抗体的分析来研究CHO细胞的岩藻糖基化效率。在一项研究中，使用7077细胞作为表达抗体2(Ab 2)的宿主细胞，该抗体为针对人B细胞受体的人IgG1抗体，方法沿用了美国专利号7,435,553(通过引用方式并入本文)中描述的方法。简而言之，使用LipofectamineTM(Invitrogen，Carlsbad，CA)，以质粒pR4000(重链、潮霉素抗性)和pR4001(轻链、嘌呤霉素抗性)转染1x 107个7077细胞。以400μg/mL潮霉素和10μg/mL嘌呤霉素选择经转染的培养物：在含有10％胎牛血清的F12培养基中各进行2周。将经选择存活下来的细胞汇集在一起并使其适应于在无血清的生物反应器培养基2中悬浮生长。通过向培养基中加入多西环素，持续3天，而诱导hFcγRI的表达。将诱导的培养物与1mg/mL兔子IgG一起温育18小时，然后以山羊多克隆FITC缀合的抗人Fc抗体的F(ab’)2片段(Jackson Immunoresearch，West Grove，PA)染色。将细胞染色1小时，然后以PBS洗涤2次，然后通过流式细胞术在MoFloTM细胞分选仪(Fort Collins，CO)上分析。将具有总细胞群体的前5％的平均FITC荧光强度的细胞分选至一个汇集中，并命名为7077-1细胞。在培养基2中扩增7077-1细胞10天。为了产生重组Ab 2，将7077-1细胞以4x 105个细胞/mL接种于摇瓶中的培养基2中，置于37℃。3天后，收集条件化培养基，通过蛋白A亲和层析纯化Ab 2蛋白。
使用4044和6066CHO细胞作为宿主细胞以表达Ab 2和Ab1——针对人细胞因子受体的人IgG1抗体。简而言之，为了表达Ab 2，以pR4002(loxed盒中的重链)、pR4003(loxed盒中的轻链和潮霉素抗性)和pR4004(编码Cre)转染2x 106个4044和2x 106个6066细胞(各自在EESYR基因座具有loxed盒)。为了表达Ab 1，以pR4005(loxed盒中的轻链)、pR4006(loxed盒中的重链和潮霉素抗性)和pR4004(编码Cre)转染2x 106个4044和2x 106个6066细胞。以400μg/mL潮霉素选择经转染的4044和6066细胞：在含有10％FCS的F12培养基中进行10天。使存活下来的细胞适应于在无血清的培养基1中悬浮生长7天。在EESYR基因座经历了Cre-介导的盒交换的细胞表达EGFP但不表达DsRed或ECFP。使用MoFloTM分选仪通过细胞分选收集对于EGFP为阳性但对于DsRed和ECFP为阴性的细胞。以Ab 2和Ab 1基因转染的源自4044的细胞分别被称作4044-2和4044-1细胞。以Ab 2和Ab 1基因转染的源自6066的细胞分别被称作6066-2和6066-1细胞。通过在培养基2中培养使4044-2、6066-2、4044-1和6066-1细胞扩增7天。为了产生重组抗体，将4种细胞系以4x 105个细胞/mL接种于摇瓶中的培养基2中，置于37℃。3天后，收集条件化培养基，并通过蛋白A亲和层析纯化其中的重组抗体。
还使用8088和1010CHO细胞作为宿主细胞以表达Ab 1。简而言之，为了表达Ab 1，以pR4007(loxed盒中的轻链和潮霉素抗性基因的第一部分)、pR4008(loxed盒中的重链和潮霉素抗性基因的第二部分)和pR4004(编码Cre)转染2x 106个8088和2x 106个1010细胞。使经过以400μg/mL潮霉素选择而存活下来的经转染的细胞适应于在无血清的培养基1中的悬浮生长。通过在MoFloTM上进行细胞分选而从经转染的8088和1010细胞分离表达EGFP但不表达DsRed或ECFP的细胞，并分别称作8088-1和1010-1。为了产生Ab 1蛋白，将8088-1和1010-1细胞以4x 105个细胞/mL接种于摇瓶中。3天后，收集条件化培养基，并通过蛋白A层析纯化其中的Ab 1。
实施例3：抗体的岩藻糖基化分析
首先，在37℃，在变性条件下(0.5％SDS，2mM TCEP，并以1％NP-40封闭)，在pH 8.0的50mM Tris(其中蛋白/酶的比例为1μg/0.1mU)中，以PNGase F使纯化的人IgG1抗体蛋白进行去糖基化处理过夜。然后在80℃以邻氨基苯甲酸荧光地衍生释放的聚糖，持续1小时。以Waters OasisTM HLB筒将样品进行预清洁以除掉多余的邻氨基苯甲酸。然后通过反相HPLC，使用ddH2O中的0.5％TFA作为移动相A，90％乙腈/10％ddH2O中的0.045％TFA作为移动相B，分析寡糖混合物。在ThermoHypercarbTM(Thermo Fisher，Waltham，MA)柱(尺寸为100x 2.1，孔径为3μm)上，通过在40分钟内施以30％-40％B的梯度，使聚糖溶解。以230nm的激发波长、425nm的发射波长，使用荧光检测器检测信号。通过质谱进一步分析HPLC分离的聚糖的峰揭示出：它们分为两个主要的组：非岩藻糖基化的双触角聚糖和岩藻糖基化的双触角聚糖。在每个组内(岩藻糖基化的相对于非岩藻糖基化的)，聚糖进一步分为二半乳糖基(G2)、单半乳糖基(G1)或无半乳糖基(G0)形式。对应于不同聚糖形式的峰面积的积分允许定量单克隆抗体上的各个聚糖的群体。
实施例4：FX，GMD，GDP-岩藻糖转运子和FUT8基因的主要转录物的测序
由FX，GMD，GDP-岩藻糖转运子和FUT8基因编码的蛋白是从新岩藻糖基化途径中的成分。测定了CHO细胞系5055，4044-1，7077-1，6066-1，2121，2020，6069，1010和8088细胞中的FX基因的主要转录物的序列以及4044-1，6066-1，1010和8088细胞中的GMD基因的主要转录物的序列。还测定了4044-1和6066-1细胞中从FUT8和GDP-岩藻糖转运子基因表达的主要转录物的序列。
简而言之，使用Micro-Fast Track 2.0KitTM(Invitrogen，Carlsbad，CA)从5x 106个CHO细胞分离总RNA。使用Oligo-dT作为引物，使用SuperScript III First-Strand Synthesis SystemTM(Invitrogen)，从总RNA合成4个岩藻糖基化基因的cDNA。使用引物5’-ctacaatctt ggtgcccaga gc-3’SEQ ID NO：7和5’-tccagttcagtttctgctgc g-3’SEQ ID NO：8通过PCR扩增GMD cDNA。使用引物5’-ttccctgaca agaccaccta tcc-3’SEQ ID NO：9和5’tagttgtcggtgaaccaggc ac-3’SEQ ID NO：10通过PCR扩增FX cDNA。使用引物5’-gatgaggaca gcaggaacaa gc-3’SEQ ID NO：11和5’-agcactcttctcaccctctt tgg-3’SEQ ID NO：12通过PCR扩增GDP-岩藻糖转运子cDNA。使用引物5’-agccaagggt aagtaaggag gacg-3’SEQ ID NO：13和5’-ttgtagacag cctccatcct cg-3’SEQ ID NO：14通过PCR扩增FUT 8cDNA。PCR反应中使用的DNA聚合酶是20比1的Platinum TaqTM(Invitrogen)与克隆的Pfu(Stratagene，La Jolla，CA)的混合物。在凝胶电泳后纯化PCR产物，并根据生产商的说明书克隆进入pCR2.1TOPOTM载体(Invitrogen)。将克隆的DNA产物转化进入电感受态的DH10B细胞。从每个转化至少挑取3个细菌菌落，并接种含有LB和100μg/mL氨比西林的3个液体培养物。使用QIAprep Spin Miniprep KitTM(Qiagen)纯化这些培养物中的质粒DNA。使用位于载体上的M13引物和各自的5’和3’PCR引物测定克隆的PCR产物的序列。将这些序列与Genbank中的FX(登记号AF525365)、GMD(登记号AF525364)、GDP-岩藻糖转运子(登记号AB222037)和FUT8(登记号BD359138)mRNA序列(来自中国地鼠)进行比较。
鉴定了7077-1，6066-1，2121，2020，6069，1010和8088细胞中的导致相对于Genbank参考序列(AF525365)发生密码子改变的共有FX转录物序列中的突变(表1和2)。来自4044-1，6066-1，1010和8088细胞的GMD转录物的序列与GenBank中报道的GMD的序列(登记号AF525364)匹配。4044-1和6066-1细胞中的GDP-岩藻糖转运子和FUT8转录物的序列与它们各自在GenBank中报道的序列(登记号AB222037和BD359138)也匹配。
实施例5：具有FX基因中的单一L289S突变的CHO细胞系中的岩藻糖基化
首先通过以凝集素：兵豆凝集素(Lens culinaris agglutinin)(LCA)染色细胞研究了3033、4044、6066和7077细胞中的相对的岩藻糖基化程度。简而言之，以5μg/mL生物素-LCA(Vector Laboratories，Burlingame，CA)温育2x 106个4044和6066细胞1个小时。以PBS洗涤2次之后，以藻红蛋白缀合的链霉亲和素(Jackson ImmunoResearch)温育细胞30分钟。然后以PBS洗涤细胞1次，并通过流式细胞术分析。以FITC-LCA染色3033细胞和7077细胞1个小时，洗涤2次，并通过流式细胞术分析(图2)。通过LCA染色3033，4044，6066和7077细胞。6066和7077细胞上的LCA染色强度显著弱于3033和4044细胞上的LCA染色强度(图2)，这说明6066和7077细胞中的蛋白岩藻糖基化少于3033和4044细胞。为了检测6066和7077细胞是否可用作表达具有低岩藻糖含量的hIgG1抗体的宿主细胞，以Ab 2和Ab 1的表达质粒稳定转染4044和6066细胞，以Ab 2的表达质粒稳定转染7077细胞(见实施例2)。从3天的摇瓶培养物以及12天的补料分批式生物反应器培养物中的经转染的细胞生产重组Ab 2和Ab 1。从条件化培养基中纯化Ab 2和Ab 1，通过HPLC测定它们的岩藻糖基化水平(表1)。如表1所示，在37℃，在摇瓶和生物反应器中，7077-1、6066-1和6066-2细胞产生具有3.6％至8％的岩藻糖基化水平的重组抗体。
Figure BDA0000126932040000321
实施例6：具有FX基因中的两个氨基酸改变的CHO细胞系中的岩藻糖基化
8088和1010是分离自6066细胞的两个细胞系：不使用外源重组核酸。6069，2020和2121是分离自6066-1细胞的3个细胞系：不使用外源重组核酸。通过RT-PCR测定了FX基因的主要转录物的序列(表2)。发现这5个细胞系具有与6066和7077细胞中相同的L289S突变。除了L289S改变之外，所有这5个细胞系中的FX转录物还具有一个氨基酸改变。这些突变总结于表2。8088，1010，6069，2020和2121细胞显示出减少的与LCA的结合(图4)，这说明这些细胞中的蛋白岩藻糖基化降低。
为了测定8088和1010细胞中的岩藻糖基化程度，通过稳定转染从这两种宿主细胞中产生Ab 1。使用400μg/mL潮霉素选择经转染的培养物，进行2周。使抗潮霉素的细胞适应于在培养基1中的悬浮生长。在3天摇瓶培养物以及12天补料分批生物反应器培养物中生产重组Ab1。从条件化培养基纯化Ab 1，并通过HPLC测定Ab 1岩藻糖基化的水平(表2)。如表2所示，在34℃，在摇瓶和生物反应器中，转染的8088和1010细胞产生具有0.53％至0.96％的岩藻糖基化水平的重组Ab 1抗体。
在纯化了摇瓶培养物中产生的Ab 1蛋白之后，还测定了6069、2020、2121细胞中的岩藻糖基化程度。表2显示：这3种细胞系产生具有0.82％至0.94％的岩藻糖基化水平的Ab 1。
Figure BDA0000126932040000331
实施例7：6066-1中的岩藻糖基化程度是温度依赖性的
通过LCA染色并通过分析从6066-1细胞中产生的Ab 1蛋白的岩藻糖基化测定了培养温度对于这些细胞中的蛋白岩藻糖基化的影响。图5显示了在37℃和34℃生长的4044-1和6066-1细胞的LCA染色。在34℃和37℃生长的4044-1细胞被LCA染色的情况是相似的。在34℃生长的6066-1细胞与LCA的结合水平显著高于在37℃生长的6066-1细胞。表3显示了在34℃和37℃从摇瓶培养物中的4044-1和6066-1细胞产生的Ab 1蛋白的岩藻糖基化水平。当生长于34℃和37℃时，4044-1细胞分别产生具有96％和95％岩藻糖基化的Ab 1。与此相反，在34℃和37℃，6066-1细胞分别产生具有大约70％和7％岩藻糖基化的Ab 1。该结果说明6066-1细胞中的岩藻糖基化水平是温度依赖性的。
Figure BDA0000126932040000341
实施例8：在补充了L-岩藻糖的培养基中培养的CHO细胞的岩藻糖基化
在哺乳动物细胞中，GDP-岩藻糖可以通过从新合成途径和救援途径产生(Becker and Lowe(2003)Fucose：biosynthesis和biologicalfunction in mammals，Glycobiology，13(7)：41R-53R)。在生长于无L-岩藻糖的培养基的细胞中，GDP-岩藻糖是通过GMD和FX蛋白从GDP-甘露糖产生的。在含有L-岩藻糖的培养基中，可以通过L-岩藻糖激酶和GDP-L-岩藻糖焦磷酸化酶从L-岩藻糖产生GDP-岩藻糖。从任一途径产生的GDP-岩藻糖通过GDP-岩藻糖转运子被转运至高尔基体。在高尔基体中，岩藻糖基转移酶蛋白FUT8将糖蛋白转化为具有GDP-岩藻糖的岩藻糖基化的蛋白。检测了生长于含有和不含5mM L-岩藻糖的培养基中的6066-2、8088和1010细胞的岩藻糖基化程度。6066-2细胞表达Ab 2抗体并在FX基因转录物中携带L289S突变(实施例2和表1)。通过HPLC分析纯化的Ab 2表明：生长于摇瓶中的未添加L-岩藻糖的培养基2中的6066-2细胞产生具有1.9％岩藻糖基化的Ab 2。与此相反，生长于摇瓶中的补充了5mM L-岩藻糖的培养基2中的6066-2细胞产生具有93.5％岩藻糖基化的Ab 2。该结果说明：在6066-2细胞中，用于合成GDP-岩藻糖的救援途径、GDP-岩藻糖转运子和FUT8蛋白是有功能的。
通过以LCA染色检测了在含有和不含5mM L-岩藻糖的培养基2中生长的3033、5055、7077、8088和8088细胞的相对的岩藻糖基化程度(图6)。在补充和不补充L-岩藻糖的情况下，3033和5055细胞结合相似水平的LCA。当生长于含有5mM L-岩藻糖的培养基中时，7077、8088和8088细胞结合的LCA显著高于不含L-岩藻糖的培养基的情况。该结果说明7077、8088和8088细胞具有功能性的GDP-岩藻糖转运子和功能性的FUT8蛋白。
实施例9：以FX基因转染的8088细胞中的岩藻糖基化
为了确认在8088细胞中见到的降低的岩藻糖基化水平是由突变的FX基因(具有L289S和N90K突变)造成的，通过稳定转染而在8088细胞中表达了野生型FX基因和突变体FX基因，然后通过以LCA染色细胞测定经转染的细胞的岩藻糖基化程度。作为对照，另外以载体pR4009(具有潮霉素抗性基因和EGFP基因的loxed盒)转染8088细胞。载体pR4010和pR4011分别包含野生型FX基因和L289S N90K FX基因(置于pR4009中的CMV启动子和Lox511位点之间)。以pR4004和“pR4009、pR4010或pR4011”之一转染8088细胞，以400μg/mL潮霉素选择14天。经历在EESYR的Cre介导的盒交换的细胞表达EGFP但不表达EYFP。通过细胞分选来分离那些EGFP-阳性但是EYFP-阴性的细胞。在34℃在组织培养物中扩增之后，依次以生物素-LCA和PE-链霉亲和素染色经分选的细胞。以载体pR4009和pR4011转染的8088细胞显示出相同水平的LCA染色。与此相反，以pR4010转染的8088细胞显示出与5055细胞相当的LCA染色水平(图7)。总结起来：野生型FX蛋白能够恢复8088细胞中的岩藻糖基化水平，但L289S N90K突变体FX蛋白则不能：如LCA染色所测定。该结果说明8088细胞中降低的岩藻糖基化水平是由这些细胞中的FX蛋白中的L289S N90K突变造成的。
实施例10：聚糖的HPLC和质谱分析：Ab 3.1和3.2
分别以编码两种人类抗体(所述抗体具有特异性结合相同的生长因子受体的不同可变区，抗体3.1和3.2)的重链(人IgG1)和轻链(人κ)的质粒转染细胞系8088和具有编码FX蛋白置换L289S和N90K的FX基因修饰的CHO细胞系。在存在和不存在10mM岩藻糖的情况下，表达各个抗体的细胞在培养基2中在37℃生长3天，分离并通过质谱鉴定来自每组条件下的抗体的聚糖。
在不存在岩藻糖的情况下，表达A3.1的8088细胞在HPLC下产生3个主要的聚糖峰(图8)，这代表质谱上的3个不同的非岩藻糖基化的聚糖，它们的差别在于末端的半乳糖基化(图9)，具有大约1.47％的岩藻糖基化。在存在10mM岩藻糖的情况下，表达A3.1的8088细胞在HPLC下产生3个主要的聚糖峰(图10)，这代表质谱上的3个不同的岩藻糖基化的聚糖和1个非岩藻糖基化的聚糖(图11)，具有大约95.22％的岩藻糖基化。
在不存在岩藻糖的情况下，表达A3.2的8088细胞在HPLC下产生3个主要的聚糖峰(图12)，这代表质谱上的3个不同的非岩藻糖基化的聚糖，它们的差别在于末端的半乳糖基化(图13)，具有大约5.73％的岩藻糖基化。在存在10mM岩藻糖的情况下，表达A3.2的8088细胞在HPLC下产生3个主要的聚糖峰(图14)，这代表质谱上的3个不同的岩藻糖基化的聚糖和第4个微小量的非岩藻糖基化的聚糖(图15)，具有大约95.63％的岩藻糖基化。
在图16中总结了喂以岩藻糖和不喂以岩藻糖的表达抗体3.1或抗体3.2的8088细胞的聚糖分析结果，根据聚糖类型分组。标示了特定条件下的抗体百分率的列合计为100。对于Ab 3.1，在不存在10mM岩藻糖的情况下，总的岩藻糖基化是1.87％；对于Ab 3.2，在不存在10mM岩藻糖的情况下，总的岩藻糖基化是5.73％(图16的表的最后3行的对应列的合计)。在存在10mM岩藻糖的情况下，对于Ab 3.1，总岩藻糖基化是95.22％；在存在10mM岩藻糖的情况下，对于Ab 3.2，总岩藻糖基化是95.63％(图16的表的最后3行的对应列的合计)。这些数据证明：在不存在岩藻糖的情况下，低岩藻糖基化细胞系的岩藻糖基化不超过大约1.87％或5.73％，但是在存在岩藻糖的情况下，该岩藻糖基化可被恢复至至少大约95.22％或95.63％。
对于聚糖分析，将各100μg等份的两种抗体(抗体3.1和抗体3.2)样品重悬于含有50mM Tris(pH 8.0)，2.0mM三(2-羧乙基)磷化氢(TCEP)，0.5％SDS的45μL变性缓冲液中。通过在80℃加热7分钟使蛋白变性。在与10mU PNGase F和1％NP40在37℃过夜温育之后，抗体上的N-连接的聚糖被释放。通过加入200μL的衍生溶液[30mg/mL邻氨基苯甲酸(AA)和20mg/mL氰基硼氢化钠(在含有4％(w/v)乙酸钠和2％(w/v)硼酸的甲醇中)]并在80℃温育1小时，从而荧光标记所释放的聚糖。使用固相提取筒(OasisTM HLB筒，Waters Corp.)进一步从过量的试剂中分离AA衍生的聚糖，并洗脱进入200μL 5％的乙腈中。为了通过HPLC分离聚糖，使用了Thermo HypercarbTM柱(3μm，100x 2.1mm)，流速为0.15mL/min。流动相A是H2O中的0.05％TFA，流动相B是90％乙腈和10％H2O中的0.045％TFA。将10μL荧光衍生寡糖的等份与90μL H2O中的0.1％TFA混合并注射进入以25％流动相B预平衡的柱中。注射样品之后，在5分钟内将梯度增加至30％的B，然后在39分钟内再增加至43％的B，以获得分离的寡糖。在230nm的激发波长、450nm的发射波长，使用荧光检测器检测AA标记的聚糖。使用ShimadzuAximaTM MALDI-TOF系统进行AA标记的聚糖的质谱分析。在高速真空中干燥100μL衍生的聚糖并重悬于10μL 0.1％TFA中。使用NutipHypercarbTM进一步使浓缩的聚糖脱盐，并洗脱进入30μL 65％乙腈中的0.1％TFA中，并在高速真空下干燥。将冻干的聚糖重新溶解于2μL70％乙腈中的10mg/mL DHB(2，5-二羟基苯甲酸)中，并点染至MALDI平板。在线性阴性模式下收集光谱，在1500mu进行后提取，激光功率设定为最大功率(6mW)的60％-90％，在337nm的波长操作。
Figure IDA0000126932100000011
Figure IDA0000126932100000021
Figure IDA0000126932100000031
Figure IDA0000126932100000041
Figure IDA0000126932100000051
Figure IDA0000126932100000061
权利要求书(按照条约第19条的修改)
1.能够使糖蛋白岩藻糖基化的细胞，其中所述细胞包含修饰的GDP-4-酮-6-脱氧-甘露糖-3，5-表异构酶-4-还原酶(FX)基因，该基因具有编码与SEQ ID NO：1至少90％同一并且在289位包含丝氨酸的FX蛋白的修饰，并且其中当所述细胞在不存在外部岩藻糖源的情况下在37℃的温度生长时，不超过10％的糖蛋白被岩藻糖基化。
2.权利要求1的细胞，其中所述FX基因进一步包含编码在特定位置具有选自下列的氨基酸的FX蛋白的修饰：位置79处的丝氨酸、位置90处的赖氨酸、位置136处的亮氨酸、位置211处的精氨酸、及其组合。
3.权利要求1的细胞，其中所述FX蛋白与SEQ ID NO：1至少95％同一，并且在位置289处包含丝氨酸。
4.权利要求1的细胞，其中所述细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
5.权利要求1的方法，其中所述FX蛋白是仓鼠、小鼠、大鼠、猴子或人的FX蛋白。
6.权利要求1的细胞，其中所述细胞表达包含免疫球蛋白CH2区和免疫球蛋白CH3区的糖蛋白。
7.权利要求6的细胞，其中所述糖蛋白是抗体。
8.权利要求6的细胞，其中当所述细胞在不存在外部岩藻糖源的情况下在37℃的温度生长时，不超过6％的糖蛋白被岩藻糖基化。
9.权利要求8的细胞，其中当所述细胞在不存在外部岩藻糖源的情况下在37℃的温度生长时，不超过2％的糖蛋白被岩藻糖基化。
10.权利要求1的细胞，其中当所述细胞在不存在外部岩藻糖源的情况下在34℃的温度生长时，所述细胞使至少70％的糖蛋白岩藻糖基化。
11.权利要求1的细胞，其中当所述细胞在不存在外部岩藻糖源的情况下在34℃的温度生长时，所述细胞使至少90％的糖蛋白岩藻糖基化。
12.权利要求1的细胞，其中当所述细胞在存在外部岩藻糖源的情况下在37℃的温度生长时，所述细胞使至少70％的糖蛋白岩藻糖基化。
13.权利要求1的细胞，其中当所述细胞在存在外部岩藻糖源的情况下在37℃的温度生长时，所述细胞使至少90％的糖蛋白岩藻糖基化。
14.编码FX蛋白的分离的核苷酸序列，其中所述FX蛋白在位置289处包含丝氨酸，并且其中所述FX蛋白与SEQ ID NO：1至少90％同一。
15.权利要求14的分离的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列编码的FX蛋白还包含：位置79处的丝氨酸，或位置90处的赖氨酸，或位置136处的亮氨酸，或位置211处的精氨酸，或其组合。
16.权利要求14的分离的核苷酸序列，其编码与SEQ ID NO：1至少95％同一的FX蛋白。
17.权利要求1的细胞，还包括编码免疫球蛋白基因的核苷酸序列。
18.制备具有减少的岩藻糖基化的糖蛋白的方法，包括：
在37℃的温度，在不存在外部岩藻糖源的情况下，培养哺乳动物细胞，所述细胞包含FX基因，所述FX基因编码FX蛋白，所述FX蛋白在位置289处具有丝氨酸，其中所述FX蛋白与SEQ ID NO：1至少90％同一，其中所述细胞表达包含免疫球蛋白CH2区和免疫球蛋白CH3区的糖蛋白；和
从培养物中分离糖蛋白。
19.权利要求18的方法，其中所述FX基因编码在特定位置具有选自下列的氨基酸的FX蛋白：位置79处的丝氨酸、位置90处的赖氨酸、位置136处的亮氨酸、位置211处的精氨酸、及其组合。
20.权利要求18的方法，其中所述糖蛋白是抗体。

Claims (20)

1.能够使糖蛋白岩藻糖基化的细胞，其中所述细胞包含修饰的GDP-4-酮-6-脱氧-甘露糖-3，5-表异构酶-4-还原酶(FX)基因，该基因具有编码与SEQ ID NO：1至少90％同一并且在289位包含丝氨酸的FX蛋白的修饰，并且其中当所述细胞在不存在外部岩藻糖源的情况下在大约37℃的温度生长时，不超过大约10％的糖蛋白被岩藻糖基化。
2.权利要求1的细胞，其中所述FX基因进一步包含编码在特定位置具有选自下列的氨基酸的FX蛋白的修饰：位置79处的丝氨酸、位置90处的赖氨酸、位置136处的亮氨酸、位置211处的精氨酸、及其组合。
3.权利要求1的细胞，其中所述FX蛋白与SEQ ID NO：1至少95％同一，并且在位置289处包含丝氨酸。
4.权利要求1的细胞，其中所述细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
5.权利要求1的方法，其中所述FX蛋白是仓鼠、小鼠、大鼠、猴子或人的FX蛋白。
6.权利要求1的细胞，其中所述细胞表达包含免疫球蛋白CH2区和免疫球蛋白CH3区的糖蛋白。
7.权利要求6的细胞，其中所述糖蛋白是抗体。
8.权利要求6的细胞，其中当所述细胞在不存在外部岩藻糖源的情况下在大约37℃的温度生长时，不超过大约6％的糖蛋白被岩藻糖基化。
9.权利要求8的细胞，其中当所述细胞在不存在外部岩藻糖源的情况下在大约37℃的温度生长时，不超过大约2％的糖蛋白被岩藻糖基化。
10.权利要求1的细胞，其中当所述细胞在不存在外部岩藻糖源的情况下在大约34℃的温度生长时，所述细胞使至少70％的糖蛋白岩藻糖基化。
11.权利要求1的细胞，其中当所述细胞在不存在外部岩藻糖源的情况下在大约34℃的温度生长时，所述细胞使至少90％的糖蛋白岩藻糖基化。
12.权利要求1的细胞，其中当所述细胞在存在外部岩藻糖源的情况下在大约37℃的温度生长时，所述细胞使至少70％的糖蛋白岩藻糖基化。
13.权利要求1的细胞，其中当所述细胞在存在外部岩藻糖源的情况下在大约37℃的温度生长时，所述细胞使至少90％的糖蛋白岩藻糖基化。
14.编码FX蛋白的分离的核苷酸序列，其中所述FX蛋白在位置289处包含丝氨酸。
15.权利要求14的分离的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列编码的FX蛋白还包含：位置79处的丝氨酸，或位置90处的赖氨酸，或位置136处的亮氨酸，或位置211处的精氨酸，或其组合。
16.权利要求14的分离的核苷酸序列，其编码与SEQ ID NO：1至少95％同一的FX蛋白。
17.权利要求1的细胞，还包括编码免疫球蛋白基因的核苷酸序列。
18.制备具有减少的岩藻糖基化的糖蛋白的方法，包括：
在大约37℃的温度，在不存在外部岩藻糖源的情况下，培养哺乳动物细胞，所述细胞包含FX基因，所述FX基因编码FX蛋白，所述FX蛋白在位置289处具有丝氨酸，其中所述细胞表达包含免疫球蛋白CH2区和免疫球蛋白CH3区的糖蛋白；和
从培养物中分离糖蛋白。
19.权利要求18的方法，其中所述FX基因编码在特定位置具有选自下列的氨基酸的FX蛋白：位置79处的丝氨酸、位置90处的赖氨酸、位置136处的亮氨酸、位置211处的精氨酸、及其组合。
20.权利要求18的方法，其中所述糖蛋白是抗体。
CN2010800294912A 2009-06-02 2010-06-01 岩藻糖基化缺陷型细胞 Active CN102459603B (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US18340009P 2009-06-02 2009-06-02
US61/183,400 2009-06-02
US34885810P 2010-05-27 2010-05-27
US61/348,858 2010-05-27
PCT/US2010/036914 WO2010141478A1 (en) 2009-06-02 2010-06-01 Fucosylation-deficient cells

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN102459603A true CN102459603A (zh) 2012-05-16
CN102459603B CN102459603B (zh) 2013-11-06

Family

ID=42338231

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2010800294912A Active CN102459603B (zh) 2009-06-02 2010-06-01 岩藻糖基化缺陷型细胞

Country Status (17)

Country Link
US (8) US8409838B2 (zh)
EP (3) EP2808393B1 (zh)
JP (4) JP5744856B2 (zh)
KR (2) KR101441437B1 (zh)
CN (1) CN102459603B (zh)
AU (1) AU2010256753B2 (zh)
BR (1) BRPI1010035A2 (zh)
CA (1) CA2764370C (zh)
DK (3) DK2808393T3 (zh)
ES (2) ES2527173T3 (zh)
HK (3) HK1198180A1 (zh)
HU (1) HUE038596T2 (zh)
IL (1) IL216624A (zh)
PL (3) PL2438171T3 (zh)
SG (1) SG176251A1 (zh)
TW (1) TWI513818B (zh)
WO (1) WO2010141478A1 (zh)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016078466A1 (zh) * 2014-11-20 2016-05-26 中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所 用糖基工程酵母制备具有动物细胞糖基化修饰流感血凝素糖蛋白的方法
CN108431026A (zh) * 2015-11-02 2018-08-21 豪夫迈·罗氏有限公司 制备岩藻糖基化和去岩藻糖基化形式的蛋白质的方法
CN109153716A (zh) * 2016-01-06 2019-01-04 安口生物公司 调节单克隆抗体组合物中的非岩藻糖基化物类
CN112843234A (zh) * 2021-01-20 2021-05-28 四川大学华西第二医院 一种调控生物机体内gdp-甘露糖的浓度的装置
CN113166728A (zh) * 2018-08-29 2021-07-23 联合生物制药股份有限公司 去岩藻醣基化抗体及其制造

Families Citing this family (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20140161782A1 (en) 2008-06-09 2014-06-12 Targazyme, Inc. Augmentation of cell therapy efficacy including treatment with alpha 1-3 fucoslytransferase
JP5744856B2 (ja) 2009-06-02 2015-07-08 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッドＲｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． フコシル化欠損細胞
MX346663B (es) 2011-03-06 2017-03-27 Merck Serono Sa Lineas de celulas de bajo nivel de fucosa y usos de las mismas.
WO2013013013A2 (en) * 2011-07-21 2013-01-24 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for producing modified glycoproteins
TWI641687B (zh) 2012-05-29 2018-11-21 美商再生元醫藥公司 生產細胞株增強子
EP2722673B1 (en) 2012-10-17 2017-07-12 Hexal AG Improved method of mapping glycans of glycoproteins
AR095196A1 (es) 2013-03-15 2015-09-30 Regeneron Pharma Medio de cultivo celular libre de suero
US20160251410A1 (en) 2013-09-03 2016-09-01 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd. Compositions and methods for expressing recombinant polypeptides
US20150093782A1 (en) * 2013-10-01 2015-04-02 The University Of Wyoming Compositions and methods for reducing fucosylation of glycoproteins in insect cells and methods of use thereof for production of recombinant glycoproteins
EA035809B1 (ru) 2014-03-11 2020-08-14 Регенерон Фармасьютикалс, Инк. АНТИТЕЛА ПРОТИВ EGFRvIII И ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
EP3149034B1 (en) * 2014-05-30 2022-07-13 New England Biolabs, Inc. Deglycosylation reagents and methods
CN114540266A (zh) * 2014-07-07 2022-05-27 塔尔加泽梅股份有限公司 用于治疗用途的岩藻糖基化细胞的制备和冷冻干燥
TWI710573B (zh) 2015-01-26 2020-11-21 美商再生元醫藥公司 抗伊波拉病毒醣蛋白之人類抗體
TW202330904A (zh) 2015-08-04 2023-08-01 美商再生元醫藥公司 補充牛磺酸之細胞培養基及用法
MX2018009341A (es) 2016-02-03 2019-05-15 Oncobiologics Inc Formulaciones tamponadas para una mayor estabilidad de anticuerpos.
CN116515757A (zh) * 2016-04-20 2023-08-01 瑞泽恩制药公司 基于使用表达增强性基因座来制备抗体的组合物和方法
IL309065A (en) 2016-04-20 2024-02-01 Regeneron Pharma Preparations and methods for preparing antibodies based on the use of an expression-enhancing locus
EP3339444A1 (en) * 2016-12-20 2018-06-27 Mabxience Research, S.L. Method for obtaining a glycoprotein with an increased percentage of afucosylated glycans
TW202029981A (zh) 2018-10-29 2020-08-16 日商免疫生物研究所股份有限公司 抗hiv抗體及其製造方法
KR20230017815A (ko) 2020-05-26 2023-02-06 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. 항-sars-cov-2 스파이크 당단백질 항체 및 항원-결합 단편
CA3181026A1 (en) 2020-06-03 2021-12-09 Samit GANGULY Methods for treating or preventing sars-cov-2 infections and covid-19 with anti-sars-cov-2 spike glycoprotein antibodies
WO2022261021A1 (en) 2021-06-07 2022-12-15 Amgen Inc. Using fucosidase to control afucosylation level of glycosylated proteins
EP4359440A1 (en) 2021-06-22 2024-05-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-egfrviii antibody drug conjugates and uses thereof
US20230125469A1 (en) 2021-07-14 2023-04-27 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-SARS-CoV-2-Spike Glycoprotein Antibodies and Antigen-Binding Fragments
WO2023081434A2 (en) 2021-11-07 2023-05-11 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating or preventing sars-cov-2 infections and covid-19 with anti-sars-cov-2 spike glycoprotein antibodies
US20240010737A1 (en) 2022-03-02 2024-01-11 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Manufacturing process for high titer antibody

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1331266A1 (en) * 2000-10-06 2003-07-30 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd Cells producing antibody compositions

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2264166B1 (en) 1999-04-09 2016-03-23 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Method for controlling the activity of immunologically functional molecule
JP2001145488A (ja) 1999-11-19 2001-05-29 Natl Inst Of Advanced Industrial Science & Technology Meti シロイヌナズナ由来のｇｄｐ−４−ケト−６−デオキシ−ｄ−マンノース−３，５−エピメラーゼ−４−レダクターゼ遺伝子
FR2807767B1 (fr) 2000-04-12 2005-01-14 Lab Francais Du Fractionnement Anticorps monoclonaux anti-d
US6946292B2 (en) * 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
US20020150968A1 (en) 2001-01-10 2002-10-17 Wang Peng G. Glycoconjugate and sugar nucleotide synthesis using solid supports
EP1392859B1 (en) 2001-01-16 2006-05-10 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Isolating cells expressing secreted proteins
DE60232265D1 (de) 2001-10-25 2009-06-18 Genentech Inc Glycoprotein-zusammensetzungen
KR100585140B1 (ko) 2004-04-26 2006-05-30 삼성전자주식회사 와이어 본딩 장치 및 이를 이용한 반도체 패키지의 와이어본딩 방법
US20060223147A1 (en) * 2004-08-05 2006-10-05 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd., Process for producing glycoprotein composition
JP2008541770A (ja) 2005-06-03 2008-11-27 ジェネンテック・インコーポレーテッド 改変したフコシル化レベルを有する抗体の産生方法
DK2383297T5 (da) 2006-08-14 2022-07-04 Xencor Inc Optimerede antistoffer rettet mod CD19
CA2679732A1 (en) 2007-03-07 2008-09-18 Glycofi, Inc. Production of glycoproteins with modified fucosylation
DK2150617T3 (en) 2007-06-04 2015-01-12 Regeneron Pharma Regions with increased expression and stability
EP2311864A4 (en) 2008-08-13 2013-07-31 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd RECOMBINANT PROTEIN-S COMPOSITION
JP5744856B2 (ja) 2009-06-02 2015-07-08 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッドＲｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． フコシル化欠損細胞
MX346663B (es) 2011-03-06 2017-03-27 Merck Serono Sa Lineas de celulas de bajo nivel de fucosa y usos de las mismas.

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1331266A1 (en) * 2000-10-06 2003-07-30 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd Cells producing antibody compositions

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
《BMC Biotechnology》 20071130 Harue Imai-Nishiya et al. Double knockdown of alpha1,6-fucosyltransferase (FUT8) and GDP-mannose 4,6-dehydratase (GMD) in antibody-producing cells: a new strategy for generating fully non-fucosylated therapeutic antibodies with enhanced ADCC 84 1-20 第7卷, *
HARUE IMAI-NISHIYA ET AL.: "Double knockdown of α1,6-fucosyltransferase (FUT8) and GDP-mannose 4,6-dehydratase (GMD) in antibody-producing cells: a new strategy for generating fully non-fucosylated therapeutic antibodies with enhanced ADCC", 《BMC BIOTECHNOLOGY》, vol. 7, 30 November 2007 (2007-11-30), pages 84, XP002475274, DOI: doi:10.1186/1472-6750-7-84 *
代智等: "肝癌转移相关的核心岩藻糖基化蛋白质表达谱的研究", 《生物化学与生物物理进展》, vol. 32, no. 5, 31 December 2005 (2005-12-31), pages 442 - 448 *
吴兴中等: "岩藻糖糖链与肝癌细胞的迁移作用", 《生物化学与生物物理进展》, vol. 29, no. 6, 31 December 2002 (2002-12-31), pages 932 - 937 *

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016078466A1 (zh) * 2014-11-20 2016-05-26 中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所 用糖基工程酵母制备具有动物细胞糖基化修饰流感血凝素糖蛋白的方法
CN108431026A (zh) * 2015-11-02 2018-08-21 豪夫迈·罗氏有限公司 制备岩藻糖基化和去岩藻糖基化形式的蛋白质的方法
CN108431026B (zh) * 2015-11-02 2023-02-17 豪夫迈·罗氏有限公司 制备岩藻糖基化和去岩藻糖基化形式的蛋白质的方法
CN109153716A (zh) * 2016-01-06 2019-01-04 安口生物公司 调节单克隆抗体组合物中的非岩藻糖基化物类
CN113166728A (zh) * 2018-08-29 2021-07-23 联合生物制药股份有限公司 去岩藻醣基化抗体及其制造
CN112843234A (zh) * 2021-01-20 2021-05-28 四川大学华西第二医院 一种调控生物机体内gdp-甘露糖的浓度的装置
CN112843234B (zh) * 2021-01-20 2022-09-06 四川大学华西第二医院 一种调控生物机体内gdp-甘露糖的浓度的装置

Also Published As

Publication number Publication date
WO2010141478A1 (en) 2010-12-09
IL216624A0 (en) 2012-02-29
AU2010256753A1 (en) 2012-01-12
JP2015051021A (ja) 2015-03-19
KR20140039340A (ko) 2014-04-01
US11560550B2 (en) 2023-01-24
IL216624A (en) 2015-02-26
US20230295583A1 (en) 2023-09-21
KR101441437B1 (ko) 2014-09-25
US20190024129A1 (en) 2019-01-24
HK1198180A1 (zh) 2015-03-13
EP2438171A1 (en) 2012-04-11
DK2808393T3 (en) 2018-03-12
HK1163745A1 (zh) 2012-09-14
JP2016104045A (ja) 2016-06-09
EP2808393A2 (en) 2014-12-03
JP2012528594A (ja) 2012-11-15
US8409838B2 (en) 2013-04-02
HK1249547A1 (zh) 2018-11-02
EP3279326B1 (en) 2020-10-14
CA2764370C (en) 2018-08-21
EP2808393B1 (en) 2018-01-10
US9550823B2 (en) 2017-01-24
DK3279326T3 (da) 2020-12-21
TW201107469A (en) 2011-03-01
PL2808393T3 (pl) 2018-04-30
DK2438171T3 (en) 2015-01-26
TWI513818B (zh) 2015-12-21
EP2438171B1 (en) 2014-12-17
KR101641526B1 (ko) 2016-07-21
ES2527173T3 (es) 2015-01-21
HUE038596T2 (hu) 2018-10-29
JP5744856B2 (ja) 2015-07-08
US20130164786A1 (en) 2013-06-27
CN102459603B (zh) 2013-11-06
US20100304436A1 (en) 2010-12-02
EP3279326A1 (en) 2018-02-07
US20200080124A1 (en) 2020-03-12
SG176251A1 (en) 2011-12-29
US10006070B2 (en) 2018-06-26
CA2764370A1 (en) 2010-12-09
AU2010256753B2 (en) 2013-11-28
KR20120029443A (ko) 2012-03-26
JP6211642B2 (ja) 2017-10-11
EP2808393A3 (en) 2015-03-11
US20160090410A1 (en) 2016-03-31
US20170211115A1 (en) 2017-07-27
ES2661074T3 (es) 2018-03-27
JP2017006147A (ja) 2017-01-12
PL2438171T3 (pl) 2015-04-30
PL3279326T3 (pl) 2021-03-08
BRPI1010035A2 (pt) 2015-08-25
US9206455B2 (en) 2015-12-08
US20210254022A1 (en) 2021-08-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102459603B (zh) 岩藻糖基化缺陷型细胞
WO2000027885A1 (fr) Nouveau popypeptide chimerique
AU2015282354B2 (en) Fucosylation-deficient cells
AU2012100020A6 (en) Fucosylation-deficient cells
ES2834048T3 (es) Células deficientes en fucosilación
AU2014200152B2 (en) Fucosylation-deficient cells

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant