CN1276093C

CN1276093C - 一种检测丙肝病毒RdRp酶的方法，和载体以及用其转化的细胞株及应用

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Publication number: CN1276093C
Application number: CN 01114690
Authority: CN
Inventors: 李卫云
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2001-05-15
Filing date: 2001-05-15
Publication date: 2006-09-20
Anticipated expiration: 2021-05-15
Also published as: CN1385540A

Abstract

本发明公开了一种在细胞中检测丙肝病毒RdRp酶的方法，和检测丙肝病毒RdRp酶所构建的载体，以及用载体转化的细胞株及其应用。该方法包括制备含指示的重组载体并转染含T7噬菌体RNA多聚酶基因质粒的细胞株，通过将检测物加入已转染的细胞株来检测丙肝病毒RdRp。该方法可以快速筛选丙肝病毒RdRp的抑制剂，以便开发抗丙肝病毒的药物。使用这种方法也可以检测丙肝病毒RdRp突变体，该突变体可能有助于开发丙肝病毒疫苗。另外，这种检测方法可以用来监控细胞中丙肝病毒的感染和复制。它也是一种体外测定丙肝病毒感染滴度的简单方法。

Description

一种检测丙肝病毒RdRp酶的方法，和载体以及用其转化的细胞株及应用

本发明涉及一种检测丙肝病毒RNA依赖型RNA聚合酶(RdRp)的方法。具体地说，本发明涉及一种在细胞中检测丙肝病毒RdRp酶的方法，和检测丙肝病毒RdRp酶所构建的载体，以及用载体转化的细胞株及应用。该方法可以快速筛选丙肝病毒RdRp抑制剂，以便开发抗丙肝病毒的药物，使用这种方法也可以检测丙肝病毒RdRp突变体，该突变体有助于开发丙肝病毒疫苗。另外，这种检测方法可以用来监控细胞中丙肝病毒的感染和复制。它也是一种体外测定丙肝病毒感染滴度的简单方法。

正链RNA病毒包括许多细菌病毒、植物病毒和动物病毒。其中，丙肝病毒是丙型肝炎的致病病原体，目前尚没有疫苗来防止其感染，唯一的治疗药物干扰素即使与病毒唑结合使用，也只能在不到43％的医治患者上消除病毒(Lacet 1998年10月31日；NEJM 1998年11月19日)。为控制丙肝病毒这一流行病，需要丙肝病毒疫苗和更有效的抗丙肝病毒药物。而对于药物开发来说，必须有合适的药物筛选系统来筛选病毒复制的抑制剂。

RNA基因组的复制是体内丙肝病毒繁殖的关键步骤。病毒编码的RNA依赖型RNA聚合酶(RdRp)是这RNA复制过程所必需的。因而，丙肝病毒RdRp抑制剂将有效地抑制丙肝病毒复制。为了筛选丙肝病毒RdRp抑制剂，需要一种合适的RdRp活性检测系统。到目前为止，还没有针对丙肝病毒RdRp在细胞中进行检测的方法。

丙肝病毒RdRp是一种由NS5B(非结构蛋白5B)基因所编码的68KD酶，该基因位于病毒RNA基因组的3′末端，也叫做正链(+)RNA。丙肝病毒的RNA基因组一旦进入靶细胞如体内的大多数肝细胞和淋巴细胞，就被翻译成一个多聚蛋白，之后多聚蛋白又被剪切成多个复合蛋白，其中之一就是RdRp。然后，RdRp可以利用基因组RNA作为模板，合成一种叫做负链(-)RNA的中间物RNA，而它又是生产更多的正链RNA的模板，以便为子代病毒体提供基因组。不论是负链中间物的形成，还是最终的大规模生产基因组RNA，都依赖于RdRp的活性。

丙肝病毒RdRp的体外检测系统已有记载(Hagedorn等，1999年)。这些系统利用了大肠杆菌或昆虫细胞中所产生的重组体丙肝病毒RdRp。有一篇报道中利用了含活性丙肝病毒RdRp的哺乳动物细胞的裂解液(Heller等，1998)。而且，体外转录系统转录的短片段的RNA，也可以在含有四种核苷酸和重组RdRp的合适缓冲液里合成。可以对其中的一种或多种核苷酸进行修饰，使其含有标记(通常为放射性同位素)，以便在RNA凝胶上检测RdRp所合成的RNA产物。

这些体外检测方法用作丙肝病毒RdRp抑制剂的筛选方法时，或用于研究相关的丙肝病毒RdRp突变体时，存在一些严重的缺陷。第一，体外检测方法不能再现在生物活性细胞中所发生的相关的RdRp生理活性。例如，在体外检测中，所说的酶可能会利用不相关的RNA和相关的病毒RNA作为模板，而在体内，所说的酶可以将相关病毒RNA与细胞RNA区分开来，因为后者的复制将会导致引起细胞死亡的大量的双链RNA的复制。另外，丙肝病毒RdRp与细胞膜有关，这些细胞膜能为所说的酶发挥作用提供疏水的环境，体外检测无法再现与细胞膜相似的条件。很可能RdRp合成RNA时在体外的要求与在体内的要求不同，这意味着所描述的体外检测所测定的活性实际上不同于丙肝病毒在靶细胞中复制所依赖的活性。第二，这些检测方法要求用提纯的丙肝病毒RdRp，无论是重组型或天然型。然而，实际证明这种酶很难生产或提纯。经过许多努力都未能从感染的组织中提纯到足够数量的天然蛋白。在大肠杆菌或昆虫细胞中所生产的重组型RdRp可能缺少合适的实现它特殊功能的宿主表达和修饰系统，而这种修饰是其正常发挥作用所必需的。很难得到足够量的活性酶当然会使这些检测方法用于大规模的筛选受到限制。第三，这些检测方法麻烦又速度慢，很难做到工业化，而且，这些体外检测方法涉及许多成本昂贵的过程和仪器，例如体外转录、蛋白提纯以及放射性标记等，这使得它们对于较小的实验室和开发公司没有吸引力。

最近，开发了一种丙肝病毒复制子系统，并认为其具有评估抗丙肝病毒药物的前景(Lohmann等，1999)。但其复杂的实验步骤使其不可能成为高效检测的实用检测系统，而且从这种复制子系统所可能开发的筛选检测方法，也会检测到任何能够干扰亚基因组复制子的表达和复制过程的因素，而不只是特定的RdRp活性。这看似很有利，但事实上该系统的混杂性使筛选的药物没有特异性，并会抑制细胞的RNA代谢。

本发明的目的是提供了一种低成本、有针对性而且更为重要的是生理相关的方法，以检测丙肝病毒RdRp，该检测方法克服了现有检测方法中的所有上述缺点，方便，可靠。

本发明的另一个目的是提供一种检测丙肝病毒RdRp所构建的指示载体。

本发明的再一个目的是提供一种检测丙肝病毒RdRp而转染的细胞株。

本发明的再一个目的是提供一种检测丙肝病毒RdRp的方法，构建的载体和转染的细胞株在检测丙肝病毒RdRp抑制剂，丙肝病毒RdRp突变体并在监测丙肝病毒感染复制和感染滴度中的应用。

一种检测丙肝病毒RdRp的方法，该方法包括下列步骤：

a.制备含指示的重组载体，该载体含有在T3或T7或SP6噬菌体启动子控制下的全长丙肝病毒基因组DNA序列，且在丙肝病毒基因组NS5B编码区反方向插入受EMCV的IRES控制的GFP基因序列；

b.将步骤a制备的重组载体转染到已转染了正链RNA T7 RNA多聚酶基因的细胞株或能表达正链RNA T7 RNA多聚酶的细胞株；

c.筛选GFP和正链RNA T7 RNA多聚酶双阳性细胞为转化细胞株；

d.在转化细胞株中加入待检物；

e.检测GFP是否表达。

用分子克隆技术构建含有丙肝病毒基因组的指示重组载体，它在NS5B编码区域插入了携带指示表达单元的丙肝病毒基因组的指示质粒即pRep一绿。先将全长度丙肝病毒基因组克隆到pT7的多重克隆位点，再用Hpa I消化所得的质粒pT7-HCV，使之线性化，Hpa I可以识别只存在于NS5B编码区域内的序列GTTAAC。用Pst I和Bcl I进行消化，从质粒pIRES-eGFP(Clontech)中除去EMCV IRES-GFP表达序列盒。用Klenow和T4 DNA聚合酶把末端切平，之后通过末端连接酶将IRES-GFP序列盒连接到线性化的pT7-HCV上。转染细菌，选择含有IRES-GFP已反方向克隆到丙肝病毒NS5B编码区的载体pHCV-eGFP的细菌克隆，该载体于2001年4月19日保藏于武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏登记号为CCTCC M201016。

构建产生T7 RNA聚合酶的表达细胞系步骤是，在pT7pol基础上构建同时携带噬菌体T7聚合酶基因和选择标记neo^f基因的哺乳动物表达质粒pT7pol。然后用DOTAP转染试剂(Roche)将该质粒转染人类肝癌细胞系如HepG2或Huh7等。进行48小时的转染；将细胞置于400ug/ml G418的选择培养基中，G418将杀死那些不表达neo^f基因的细胞。在含G418的培养基中进行大约两周的选择之后，对抗生素有抗药能力的细胞在培养板上形成种群，并挑选出来，进一步扩增，每个种群的细胞用T7 RNA聚合酶的是否表达为指标进一步筛选。将细胞裂解，细胞提取物用可以专门识别T7聚合酶的抗体进行免疫沉淀和蛋白分析(westen analysis)。选择阳性克隆作为指定的稳定细胞系HepG2-T7或Huh7-T7。

用细胞系HepG2-T7或Huh7-T7作为起始细胞，来产生可以稳定型表达指示RNA的稳定细胞系。由于在pHCV-eGFP上没有选择标记，我们用共转染的方法来选择稳定转染的细胞。在转染到HepG2-T7或Huh7-T7细胞中之前，将等量的pHCV-eGFP和pHygro(携带潮霉素抗药基因的哺乳动物表达质粒)混合。在48小时转染后，用100ug/ml的潮霉素来选择细胞。进行10天的选择后，挑选出抗药种群。并进行扩增，采集部分细胞提取DNA和RNA。一对用专门放大GFP DNA序列的引物用于DNA PCR检测，以验证pHCV-eGFP的整合DNA序列的存在；另一对专门检测RT-PCR中丙肝病毒3’UTR RNA序列的mRNA的引物则被用于验证指示RNA正链的表达。选择对于DNA和RNA PCR均为阳性的细胞克隆，将其指定为稳定的细胞系Hep-G2-Indic或Huh7-Indic即为转化细胞株。

在转化细胞株中加入待检物，如携带RdRp基因复制的哺乳动物细胞，或丙肝病毒血清样品，或丙肝病毒RdRp抑制剂，检测GFP是否表达。绿色荧光细胞可以用许多细胞生物学方法进行检测，包括但不限于荧光显微术、荧光激活细胞分类分析术(FACS)和激光扫描。

利用分子克隆技术构建改造的病毒结构。这种名为pHCV-eGFP的指示结构包括全长度丙肝病毒基因组的DNA序列，并在NS5B编码区插入一异源DNA。全长度的指示序列为噬菌体启动子如T3、T7或Sp6启动子所控制。所说的插入片段是具有绿色荧光蛋白基因(GFP)的表达序列盒，并为脑心肌炎病毒(EMCV，encephalomyocarditius)的内部核糖体进入部位(IRES)所控制。表达序列盒在相对于丙肝病毒编码序列的反方向上插入，使得只有当指示RNA的负链产生时GFP才会被表达。当该指示结构转染到具有合适的，如T3、T7、Sp6等RNA聚合酶编码的表达质粒的靶细胞中时，全长度的指示序列将被转录，成为正链RNA，该正链RNA保留了RNA复制时所有必需的顺式作用RNA元件(位于所说序列的5’端和3’端)。然而，由于NS5B编码区域被损坏，将不会再生成有功能的RdRp，因而也就不会再出现RNA基因组的复制，导致没有负链RNA或荧光信号。如果所提供的丙肝病毒RdRp或任何其它能够复制指示序列的RdRp的话，或者通过表达质粒的共转染，或者通过病毒感染，指示可以被复制，得到负链RNA，而负链RNA又会作为从EMCV的IRES开始翻译GFP基因的模板。绿色荧光细胞可以用许多细胞生物学方法进行检测，包括但不限于荧光显微术、荧光激活细胞分类分析术(FACS)和激光扫描。

将指示质粒的DNA序列转录成正链RNA，需要T7 RNA聚合酶。T7 RNA聚合酶的来源包括但不限于：1)编码T7 RNA聚合酶的哺乳动物表达质粒；2)可以长期表达T7 RNA聚合酶的稳定细胞系；3)表达T7 RNA聚合酶的重组体痘病毒。

为了给T7 RNA聚合酶提供表达质粒，将pT7pol共转染到具有pHCV-eGFP的靶细胞中。T7聚合酶的表达和积累将启动指示序列的转录，为病毒RdRp合成提供启动底物：具有RNA复制所必须的顺式作用元件的正链RNA。或者，首先设计合适的靶细胞系，用pT7pol进行稳定转染，以表达T7 RNA聚合酶，然后用合适的抗生素进行选择。随后，这种稳定的细胞系用pHCV-eGFP进行转染，制得病毒基因组RNA。如果需要的话，这种单一的稳定细胞系可以进一步设计成稳定的表达指示序列。为了达到这个目的我们可以把pRep-Green和另一个在质粒pT7pol中携带一个编码不同生物抗性基因的质粒。由于用了对GFP基因特异性的引物通过DNA PCR或RT-PCR的方法扩增出来的指示序列的存在，则可筛选出抗性细胞。接着提供丙肝病毒RdRp，检测这种双重阳性细胞系的功效；一旦有效，它就可以作为检测的可再生源，叫做指示细胞系。携带T7聚合酶表达序列盒的重组体痘病毒，通常可以作为瞬间表达系统中高含量T7聚合酶的来源。然而，由于痘病毒是极端致细胞病的，它们通常不是这种检测方法的最佳选择，除非使用对细胞无毒的突变体病毒。

可以容易地对上述方法进行改进，以适应不同的研究或筛选的需要。例如，不论是指示序列还是噬菌体聚合酶编码序列，都可以结合到用于丙肝病毒感染/复制的、适当的靶细胞系的基因组中。这可以如此完成：将选择标记基因结合到上述结构中，并通过稳定转染将上述结构引入到细胞中，然后稳定转染的细胞进行抗生素选择。这些细胞具有稳定的底物供应如指示序列的正链RNA，只需要引入RdRp即可进行检测。很可能丙肝病毒序列的连续转录对细胞是有害的。在进行检测时可能需要可诱导的表达系统，以便为细胞供应底物，在用于监测丙肝病毒感染的情况下当丙肝病毒感染开始时。也可以对指示序列进行改造，以检测其它正链RNA病毒如脊髓灰质炎病毒、黄病毒和鼠疫病毒等的RdRp活性。

一种检测丙肝病毒RdRp酶用的重组载体，其特征是：该载体含有在T3或T7或SP6噬菌体启动子控制下的全长丙肝病毒基因组DNA序列，且在丙肝病毒基因组NS5B编码区反方向插入受EMCV的IRES控制的GFP基因序列；

用分子克隆技术构建含有丙肝病毒基因组的指示重组载体，它在NS5B编码区域插入了携带指示表达单元的丙肝病毒基因组的指示质粒即pRep一绿。先将全长度丙肝病毒基因组克隆到pT7的多重克隆位点，再用Hpa I消化所得的质粒pT7-HCV，使之线性化，Hpa I可以识别只存在于NS5B编码区域内的序列GTTAAC。用PstI和BclI进行消化，从质粒pIRES-eGFP(Clontech)中除去EMCV IRES-GFP表达序列盒。用Klenow和T4 DNA聚合酶把末端切平，之后通过末端连接酶将IRES-GFP序列盒连接到线性化的pT7-HCV上。转染细菌，选择含有IRES-GFP已反方向克隆到丙肝病毒NS5B编码区的载体pHCV-eGFP的细菌克隆，该载体于2001年4月19日保藏于武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏登记号为CCTCC M201016。

一种检测丙肝病毒RdRp酶活性用的转化细胞株，其特征是：该转化细胞株为肝癌细胞株，该细胞含有转染的重组载体CCTCC M201016，且含有正链RNA T7 RNA多聚酶基因或能表达正链RAN T7噬菌体RNA多聚酶。

检测丙肝病毒RdRp酶的方法可以快速筛选丙肝病毒RdRp抑制剂，以便开发抗丙肝病毒的药物。使用这种方法也可以检测丙肝病毒RdRp突变体，该突变体可能有助于开发丙肝病毒疫苗。另外，这种检测方法可以用来监控细胞培养基中丙肝病毒的感染和复制。它也是一种体外测定丙肝病毒感染滴度的简单方法。

此处所述的丙肝病毒RdRp在细胞中检测方法，与现有的检测方法相比，具有如下主要优点：1.该方法是针对体内丙肝病毒RdRp功能、生理上最相关的检测方法。检测可以在丙肝病毒天然靶细胞中进行，利用真实的丙肝病毒基因组RNA作为底物；检测的是天然环境中表达的天然RdRp，而不是非人类细胞所产生的重组体蛋白；不采用人工的底物或配制的缓冲液系统。2.该方法是一种细胞中的检测方法，可以很容易地进行放大，以适应工业规模筛选的要求，而不需要进行大的调整。3.该方法是针对性很强的方法。当用于鉴别抑制剂时，只有那些干扰RdRp从RNA复制RNA功能的药物才被识别。排除了生产中出现的抑制RNA代谢的非特异性抑制剂，从而可节省宝贵的时间和钱财。

术语“RdRp”是指RNA依赖型RNA聚合酶。

术语“正链RNA病毒”是指那些基因组RNA也是对病毒蛋白进行编码的信使RNA的病毒。

术语“突变RNA病毒”是指那些基因组RNA含有不同于野生型RNA病毒的核苷酸的RNA病毒。

术语“RNA复制”是指RdRp以RNA为模板合成RNA互被链的过程。这既包括从正链向负链的转化，也包括从负链向正链的转化。

术语“EMCV”为脑心肌炎病毒encephalomyocarditius的简写。

下面结合实施例对本发明作进一步详细的说明。

实施例①构建产生T7RNA聚合酶的表达细胞系HepG2-T7

生产表达T7 RNA聚合酶的细胞系的第一步是构建同时携带噬菌体T7聚合酶基因和选择标记neo^f基因的哺乳动物表达质粒。这个质粒在pT7pol基础上构建。用DOTAP转染试剂(Roche)将该质粒转染人类肝癌细胞系HepG2。进行48小时的转染，将细胞置于含400μg/ml G418的选择培养基中，G418将杀死哪些不表达neo^f基因的细胞。在含G418的培养基中进行两周的选择后，对抗生素有抗药能力的细胞在培养板上形成种群，并挑选出来进一步扩增。每个种群的细胞用T7 RNA聚合酶的是否表达来进一步筛选。将细胞冰冻裂解，细胞提取物用可以专门识别T7聚合酶的抗体进行免疫沉淀的蛋白质分析(Western analysis)。选择正克隆作为指定的稳定细胞系HepG2-T7。

实施例②构建表达T7 RNA聚合酶的细胞系Huh7-T7

生产表达T7 RNA聚合酶的细胞系的第一步是构建同时携带噬菌体T7聚合酶基因和选择标记neo^f基因的哺乳动物表达质粒。这个质粒在pT7pol基础上构建。用DOTAP转染试剂(Roche)将该质粒转染人类肝癌细胞系Huh7。进行48小时的转染，将细胞置于含350μg/ml G418的选择培养基中，G418将杀死哪些不表达neo^f基因的细胞。在含G418的培养基中进行两周的选择后，对抗生素有抗药能力的细胞在培养板上形成种群，并挑选出来进一步扩增。每个种群的细胞用T7 RNA聚合酶的是否表达来进一步筛选。将细胞冰冻裂解，细胞提取物用可以专门识别T7聚合酶的抗体进行免疫沉淀的蛋白质分析(Western analysis)。选择正克隆作为指定的稳定细胞系Huh7-T7。

实施例③构建含有丙肝病毒基因组的指示载体

用克隆技术构建含有HCV基因组的指示重组载体，它在NS5B编码区域插入了指示表达单元。先将全长HCV基因组克隆到pT7的多克隆位点，再用HpaI消化所得的质粒pT7-HCV，使之线性化，HpaI可以识别只存在于NS5B编码区域内序列GTTAAC。用PstI和BclI进行消化，从质粒pIRES-eFGFP(Clontech)中除去EMCV IRES-GFP表达单元。用Klenow和T4 DNA聚合酶把末端切平，之后通过末端连接将IRES-GFP表达单元连接到线性化的pT7-HCV上。将得到的质粒转染HB101细菌，用氨苄选择细菌克隆，其中IRES-GFP被反向方向克隆。在这个克隆中得到的质粒为pHCV-eGFP。

实施例④双阳性转化细胞株的建立

用细胞系HepG2-T7作为起始细胞来生产可以稳定组成表达指示基因RNA的稳定细胞系。由于在pHCV-eGFP上没有选择标记，我们用DOTAP共转染来选择稳定转染的细胞。在转染到HepG2-T7细胞之前，将20μg/ml等量的pHCV-eGFP和pHygro(携带潮霉素抗药基因的哺乳动物表达质粒)混合，再与10⁷个HepG2-T7细胞混合转染。在转染48小时后，用100μg/ml的潮霉素来选择细胞，10天后，挑选出抗药种群。在细胞被采集用于总的DNA和RNA提取前，将各个种群的细胞扩大培养。一对专门用于放大GFP DNA序列的引物做DNA PCR，以验证pHCV-eGFP的DNA整合序列的存在；另一对专门检测RT-PCR中HCV 3’UTR序列的mRNA的引物则被用于验证指示正链RNA的表达。选择对于DNA和RNA PCR均为阳性的细胞克隆，将其指定为稳定转化的双阳性细胞系HepG2-Indic。

实施例⑤双阳性转化细胞株的建立

用细胞系Huh7-T7作为起始细胞来生产可以稳定组成表达指示基因RNA的稳定细胞系。由于在pHCV-eGFP上没有选择标记，我们用DOTAP共转染来选择稳定转染的细胞。在转染到HepG2-T7细胞之前，将20μg/ml等量的pHCV-eGFP和pHygro(携带潮霉素抗药基因的哺乳动物表达质粒)混合，再与10⁷个Huh7-T7细胞混合转染。在转染48小时后，用100μg/ml的潮霉素来选择细胞，10天后，挑选出抗药种群。在细胞被采集用于总的DNA和RNA提取前，将各个种群的细胞扩大培养。一对专门用于放大GFP DNA序列的引物做DNA PCR，以验证pHCV-eGFP的DNA整合序列的存在；另一对专门检测RT-PCR中HCV 3’UTR序列的mRNA的引物则被用于验证指示正链RNA的表达。选择对于DNA和RNA PCR均为阳性的细胞克隆，将其指定为稳定转化的双阳性细胞系Huh7-Indic。

实施例⑥快速筛选丙肝病毒RdRp抑制剂

双阳性的肝癌细胞系可进一步改造来筛选HCV RdRp抑制剂。把pRdRp质粒转染到HepG2-Indic细胞，经过72小时的转染，根据对荧光激活细胞分析仪(FACS)对荧光的敏感度在分选前用PBS冲洗两次。有强荧光的细胞被分离并收集。用单细胞稀释来得到特异性的细胞克隆。这些再根据荧光敏感性分选。选择表达最强荧光的细胞种群指定为HepG2-Green。当这一细胞系扩增，在荧光显微镜下进行测定，100％的细胞显示强烈色绿色荧光为合格。

将HepG2-Green接种于96孔板，每个孔1.5×10⁴个细胞，培养24小时，形成60-70％单层，在孔中加入病毒唑的不同稀释浓度并8孔重复；细胞继续培养7天，在开始筛选时允许已有的绿色荧光蛋白自然降解，用倒置显微镜进行检测(实验室规模)，或用可以检测和记录荧光的荧光分光光度计(工业规模)。记录哪些绿色荧光为阳性的孔的数量和位置，并分辩出相应的候选抑制剂和浓度，将其进行进一步的分析，包括用同样的筛选过程进行一次验证实验。

实施例⑦检测丙肝病毒RdRp突变体

在活细胞中检测HCV RdRp的活性。有表达指示RNA能力的细胞系HepG2-Indic将用于检测系统。在pRdRp的基础上设计构建一个含有在CMV启动子控制下的HCV RdRpcDNA功能片断的哺乳动物表达质粒。RdRp基因突变通过定向位点突变进行，得到一系列pRdRp衍生质粒，这些质粒带有这个酶基因的各种突变。用pRdRp或其衍生质粒转染在细胞培养板中玻璃片上生长的HepG2-Indic细胞。经过48小时的转染，与4％的多聚甲醇(paraformaldehyde)固定，并在荧光显微镜下检测。绿色细胞的出现表明细胞内表达了有功能的HCVRdRp。当转染了一个含有编码无活性的酶的突变基因的质粒后，则不会检测到绿色细胞。这个突变型在转染细胞里的表达是否合适，可用抗RdRp的抗体用Western和免疫检测来确定。

实施例⑧监控细胞培养基中丙肝病毒的感染和复制

用HepG2-Indic细胞观测HCV的感染。10⁵个/ml细胞加到96孔板每孔100μl，培养24小时，将从病人血清中分高HCV制品，与4μg/ml的1，5-二甲基-1，5-二氮十二亚甲基聚甲溴化物(polybrene)混合后加入96孔板。病毒与细胞混合培养24小时，洗去病毒后再加200ml培养基。经过72小时培养，用甲醛的方法固定，检测。为了继续监测感染，再用有荧光功能的倒置显微镜直接观测活细胞。通过对绿色荧光细胞进行计数，这个指示细胞系则可用于检测HCV的滴度。这个方法不仅可检测血清样品，也可以检测其它通过细胞体外培养方法得到的病毒。

实施例⑨测定丙肝病毒感染滴度

用Huh7-Indice细胞测定丙肝病毒感染滴度。将Huh7-Indic细胞加到96孔板中，每孔1.2×10⁴个细胞，培养24小时后，加入丙肝病毒，在丙肝病毒加入前与4μg/ml的1，5-二甲基-1，5-二氮十二亚甲基聚甲溴化物(polybrene)混合，再温育24小时，洗去病毒后再加200μl新鲜培养基，用有荧光功能的倒置显微镜直接观测活细胞，通过对绿色荧光细胞进行计数，按常规的方法计算TCID₅₀为10⁴。

Claims

1.一种检测丙肝病毒RdRp酶的方法，该方法包括下列步骤：

a.制备含指示的重组载体，该载体含有在T3或T7或SP6噬菌体启动子控制下的全长丙肝病毒基因组DNA序列，且在丙肝病毒基因组序列的NS5B编码区反方向插入受EMCV的IRES控制的GFP基因序列；

b.将步骤a制备的重组载体转染已转染正链RNA T7 RNA多聚酶基因的细胞株或能表达正链RNA T7 RNA多聚酶的细胞株；

c.筛选GFP和正链RNA T7 RNA多聚酶双阳性细胞为转化细胞株；

d.在转化细胞株中加入待检物；

e.检测GFP是否表达。

2.根据权利要求1所述的检测丙肝病毒RdRp酶的方法，其特征是：含指示的重组载体为CCTCC M 201016。

3.根据权利要求1所述的检测丙肝病毒RdRp酶的方法，其特征是：细胞株为肝癌细胞株，该细胞含有转染重组载体CCTCC M 201016，且含有正链RNA T7 RNA多聚酶基因或能表达正链RNAT7噬菌体RNA多聚酶。

4.根据权利要求1所述的检测丙肝病毒RdRp酶的方法，其特征是：用DNA PCR验证pHCV-eGFP的DNA整合序列存在并筛选GFP阳性细胞，用RT-PCR验证正链RNA的表达，筛选RNA T7 RNA多聚酶阳性细胞，二者都是阳性细胞为转化细胞株。

5.一种检测丙肝病毒RdRp酶用的重组载体，其特征是：该载体含有在T7噬菌体启动子控制下的全长内肝病毒基因组DNA序列，且在丙肝病毒基因组序列NS5B编码区反方向插入受EMCV的IRES控制的GFP基因序列。

6.根据权利要求5所述的重组载体，其特征是：该载体为CCTCC M201016。

7.一种检测丙肝病毒RdRp酶活性用的转化细胞株，其特征是：细胞株为肝癌细胞株，该细胞含有转染重组载体CCTCC M201016，且含有正链RNA T7 RNA多聚酶基因或能表达正链RNA T7噬菌体RNA多聚酶。

8.权利要求1-4中任何一种检测丙肝病毒RdRp酶的方法在检测丙肝病毒RdRp抑制剂中的应用。

9.权利要求1-4中任何一种检测丙肝病毒RdRp酶的方法在检测丙肝病毒RdRp突变体中的应用。

10.权利要求1-4中任何一种检测丙肝病毒RdRp酶的方法在监测丙肝病毒感染复制和感染滴度中的应用。

11.权利要求5或6中所述任何一种重组载体在检测丙肝病毒RdRp抑制剂中的应用。

12.权利要求5或6中所述任何一种重组载体在检测丙肝病毒RdRp突变体中的应用。

13.权利要求5或6中所述任何一种重组载体在监测丙肝病毒感染复制和感染滴度中的应用。

14.权利要求7中所述转化细胞株在检测丙肝病毒RdRp抑制剂中的应用。

15.权利要求7中所述转化细胞株在检测丙肝病毒RdRp突变体中的应用。

16.权利要求7中所述转化细胞株在监测丙肝病毒感染复制和感染滴度中的应用。