DE60213578T2

DE60213578T2 - Replikationsprozess des hepatitis c virus

Info

Publication number: DE60213578T2
Application number: DE60213578T
Authority: DE
Inventors: Czeslaw Wychowski; Gilles Duverlie; Jean Dubuisson; Andre Pillez
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Priority date: 2001-04-27
Filing date: 2002-04-25
Publication date: 2007-08-09
Anticipated expiration: 2022-04-26
Also published as: FR2824072A1; WO2002088338A2; ATE335073T1; US20040142320A1; US7655406B2; DE60213578D1; EP1381675A2; FR2824072B1; JP2004527252A; MXPA03009736A; US7314710B2; AU2002257890B2; CA2445596A1; ES2269684T3; NZ529037A; US20100159467A1; EP1381675B1; US20080220410A1; WO2002088338A3

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren der Replikation des Hepatitis-C-Virus. Die Erfindung betrifft auch ein Screening-Verfahren für Inhibitoren des Hepatitis-C-Virus.
Das Hepatitis-C-Virus oder HCV, das 1989 von Choos Arbeitsgruppe identifiziert wurde (Choo et al., 1989), ist das Hauptagens der Virusinfektionen, die lange Zeit Non-A-Non-B-Hepatitiden genannt wurden. Die Terminologie „Non-A-Non-B" wurde in den 70er Jahren eingeführt, um die Hepatitiden zu beschreiben, deren ätiologische Mittel, die noch nicht identifiziert sind, serologisch von den Hepatitiden A und B verschieden erscheinen, dank dem Einsatz immunologischer Tests (Feinstone et al., 1975; Prince et al., 1974).
Klinisch gesehen, ist die Infektion mit dem Hepatitis-C-Virus durch ein starkes Vorherrschen asymptomatischer Formen und der häufigen Entwicklung hin zur Chronizität gekennzeichnet.
Die molekulare Klonierung und Sequenzierung des Hepatitis-C-Virus wurden zuerst von Choo et al. (1988 und 1989) durchgeführt und von anderen Arbeitsgruppen bestätigt (Kato et al., 1990; Okamoto et al., 1992; Inchauspé et al., 1991). Die Sequenzanalyse des Genoms des HCV zeigt eine einzelne offene Lesephase, deren AUG-Initiator sich in der Position 342 des Genoms findet. Wie bei bestimmten positiven RNA-Viren ist die 5' nicht-kodierende Region von HCV in den Prozess der Translationsinitiation durch die Gegenwart einer internen Ribosomeneintrittsstelle oder IRES involviert (Tsukiyama-Kohara et al., 1992; Reynolds et al., 1995).
Die Konstruktion einer cDNA, die für die Gesamtheit des Polyproteins des Hepatitis-C-Virus kodiert, und ihre Expression in verschiedenen prokaryotischen oder eukaryotischen Vektoren haben die Präzisierung der Genomorganisation und die Charakterisierung der verschiedenen Proteine, die aus der Reifung des Polyproteins folgen, erlaubt. Verschiedene Prozesse der Spaltung dieses Polyproteins, die virale und zelluläre Proteasen involviert, erzeugen die strukturellen und nicht-strukturellen Proteine. Studien der in-vitro-Translation und in-vivo-Expression (Grakoui et al., 1993; Hijikata et al., 1991) haben es ermöglicht, die Reihenfolge anzugeben, in der die Proteine durch das Genom kodiert sind und die wie folgt schematisch dargestellt ist: H₂N-C-E₁-E₂-p7-NS2-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B-COOH.
Das erste Drittel des Genoms von Hepatitis C kodiert für die strukturellen Proteine C, E1, E2 und p7. Die verschiedenen Proteine der Strukturregion sind das Ergebnis der Mitwirkung von Proteasen zellulären Ursprungs.
Das C-Protein, das ein Molekulargewicht von ungefähr 21 kDa hat und 173 Aminosäuren enthält, ist das Kapsidprotein. Dieses Protein ist der Hauptbestandteil des Nukleokapsids von HCV. Die carboxyterminale Region, die sich zwischen den Aminosäuren 174 bis 191 befindet, stellt das Signalpeptid des E1-Glykoproteins dar. Diese Sequenz wird durch eine Signalase gespaltet. Das Kapsidprotein C mit sehr basischer Zusammensetzung aufgrund seines Reichtums an den Aminosäuren Arginin und Lysin (23,5% der Aminosäuren in der N-terminalen Region) könnte in die RNA-Protein-Wechselwirkungen involviert sein.
Die E1- und E2-Glykoproteine, die ein Molekulargewicht von 31 bzw. 70 kDa haben, stellen die Hüllglykoproteine dar. Sie sind Membran-Glykoproteine vom Typ I, sie haben jeweils eine hydrophobe Domäne an ihrem carboxyterminalen Ende. Außerdem haben sie jeweils eine hydrophobe Signalsequenz am N-terminalen Ende, die eine Translokation in das endoplasmatische Retikulum und eine Reifung dieser Proteine durch zelluläre Signalasen erlaubt. Die zwischen 174-191 enthaltenen Aminosäuren und die zwischen 371-383 enthaltenen Aminosäuren des Polyproteins des HCV entsprechen den Signalpeptiden der E1- und E2-Glykoproteine. Die letzte Aminosäure der Sequenz von E2 befindet sich in der Position 746 des Polyproteins des HCV und die letzte Aminosäure des E1-Glykoproteins ist in der Position 383 des Polyproteins, was bedeutet, dass das Signalpeptid des E2-Glykoproteins ein integraler Teil von E1 ist.
Zwischen E2 und dem NS2-Protein wurde ein kleines Protein p7 identifiziert, dessen Funktion noch nicht bekannt ist.
Die verbleibenden zwei Drittel des Genoms von HCV kodieren für die nicht-strukturellen Proteine NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A und NS5B.
Das NS2-Protein ist ein hydrophobes Protein mit 23 kDa, dessen N-terminale Aminosäure in der Position 810 und dessen C-terminale Aminosäure in der Position 1026 auf dem Polyprotein ist. Das NS2-Protein und das N-terminale Drittel von NS3 hätten eine Funktion der Protease, die eine Spaltung zwischen dem NS2- und NS3-Protein sicherstellt (Grakoui et al., 1993). Diese Protease wäre eine Zink-abhängige Metalloprotease. Diese Beobachtung basiert auf der Tatsache, dass die Aktivität dieses Proteins durch EDTA gehemmt und durch ZnCl₂ stimuliert würde. Das Histidin in der Position 952 und das Cystein in der Position 993 scheinen in die katalytische Aktivität dieses Enzyms involviert zu sein.
Das NS3-Protein ist ein Protein mit 70 kDa. Zwischen den Aminosäuren 1027 und 1657 des Polyproteins des HCV angeordnet, hat es zwei verschiedene funktionale Domänen: der N-terminale Teil des Proteins kodiert für eine Protease und die C-terminale Domäne für eine RNA-abhängige NTPase/Helikase.
Das NS4-Protein ist ein Protein, das ein scheinbares Molekulargewicht von 8 kDa hat. Es befindet sich auf dem Polyprotein zwischen den Aminosäuren 1658 und 1711. Seine Funktion wäre die Rolle eines Co-Faktors für eine NS3-Protease, da Studien gezeigt haben, dass die Spaltung der Verbindungen NS3/NS4A, NS4A/NS4B und NS4B/NS5A das NS4A-Protein erfordert. Dieses Protein beschleunigt auch die NS5A/NS5B-Spaltung, ohne unerlässlich zu sein.
Das NS4B-Protein des HCV, das ein Molekulargewicht von 27 kDa hat, hat bislang keine bekannte Funktion. Das NS4B-Protein befindet sich zwischen den Aminosäuren 1712 und 1972 der Polyproteins des HCV. Außerdem erscheint das NS4B-Protein als basisches Protein.
Das NS5A-Protein des HCV, das ein Molekulargewicht von 56 kDa hat, ist ein Protein, das mit dem NS5B-Protein wechselwirkt und wahrscheinlich an der Replikation des HCV teilhat. Das NS5A-Protein befindet sich zwischen den Aminosäuren 1973 und 2420 des Polyproteins des HCV vom Genotyp 1a. Gemäß den verschiedenen beobachteten Genotypen kann dieses Protein jedoch verschiedene Inserts an Aminosäuren umfassen: es umfasst also 466 Aminosäuren für den Genotyp 2a, 452 Aminosäuren für den Genotyp 3a, während es nur 466 Aminosäuren für den Genotyp 1a umfasst. Obwohl die Hauptfunktion dieses Proteins noch unbekannt ist, zeigt es doch einige Charakteristika. Die Expression eines 56-kDa-Proteins und eines 58-kDa-Proteins wurde beobachtet. Sie entspricht einer Phosphorylierung und einer Hyperphosphorylierung des NS5A-Proteins, die zur Produktion des 56- bzw. 58-kDa-Proteins führt.
Das NS5B-Protein, das ein Molekulargewicht von 68 kDa hat, befindet sich zwischen den Aminosäuren 2421 und 3011 des Polyproteins. Das Vorhandensein von Gly-Asp-Asp-Peptidmotiven oder GDD-Motiv, analog zu jenen, die in der Polypeptidsequenz der RNA-abhängigen RNA-Polymerasen zahlreicher RNA-Viren gefunden werden, erlaubt, dass das NS5B-Protein als Kandidat für die Funktion der Replikase vorgeschlagen wird.
Das Hepatitis-C-Virus scheint seine pathogene Wirkung ausschließlich in der Leber der infizierten Patienten oder Tiere zu entfalten (Negro et al., 1992). Versuche zur Viruspropagation auf menschlichen oder von Schimpansen stammenden Hepatozyten haben jedoch zu abortiven Zyklen geführt (Lanford et al., 1994). Andere Arbeiten, über die Seipp et al. (1997) berichten und die eine Infektion verschiedener Zelllinien (HuH7 und HepG2) oder Zellen porcinen Ursprungs (PK15) betreffen, haben die Möglichkeit einer Virusinfektion und Replikation aufgezeigt. Es ist derzeit schwierig, die Nutzung dieser Zellsysteme im Hinblick auf eine massive Virusproduktion ins Auge zu fassen. Die Replikation des viralen Genoms in den Lymphozyten des peripheren Bluts von Patienten, die an Hepatitis C leiden, oder in einer Subpopulation von Monozyten/Makrophagen von PBMC (peripheral blood mononuclear cells, mononukleäre Zellen des peripheren Blutes) wurde von verschiedenen Autoren beschrieben (Bouffard et al., 1992). Kürzlich haben aber Shimizu und seine Mitarbeiter gezeigt (Shimizu et al., 1992; Shimizu et al., 1994), dass die Replikation des HCV in einer Linie, die von einer lymphoblastischen T-Zell-Leukämie (Molt4-Zellen) stammte, oder in einer HPB-Ma-Zelllinie, die zuvor durch ein murines Retrovirus (murines Leukämievirus) infiziert wurde, stattfinden konnte. Ein infektiöser Zyklus wurde auch in letzteren Zellen reproduziert. Das Vermögen dieser Zellen, das virale Genom des HCV zu replizieren, hat die Einführung eines in-vitro-Neutralisationstests erlaubt (Shimizu et al., 1994). Daher wurde die Neutralisation des Virus nach der Inkubation mit bestimmten Sera von Patienten mit dem Verlust des Replikationsvermögens des HCV auf diesen Zelllinien in Verbindung gebracht. Außerdem waren die Autoren bei Verwendung der HPB-Ma-Zellinie auch in der Lage, die Reinfektion der Zellen durch das HCV und die Empfindlichkeit des Virus gegen Interferon zu zeigen (Shimizu et al., 1994).
Außerdem wurde kürzlich von den Arbeitsgruppen von C.M. Rice (Kolykhalov et al., 1997) und R.H. Purcell (Yanagi et al., 1997) gezeigt, dass es möglich ist, eine infektiöse cDNA des HCV zu rekonstituieren. Schimpansen, die eine intrahepatische Injektion von RNA erhielten, die von der vollständigen cDNA des HCV transkribiert war, waren in der Lage, nach einigen Wochen eine Infektion zu reproduzieren.
EP 1 043 399 betrifft ein Zellkultursystem des Hepatitis-C-Virus, das im Wesentlichen eukaryotische Zellen umfasst, die ein genetisches Material enthalten, das für das transfizierte HCV spezifisch ist, gekennzeichnet durch die Tatsache, dass die eukaryotischen Zellen humane Hepatomazellen sind und dass das für das transfizierte HCV spezifische genetische Material ein HCV-RNA-Konstrukt ist, das die HCV-spezifischen RNA-Segmente umfasst: 5'NTR, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B und 3'NTR sowie ein zusätzliches selektierbares Markergen (Selektionsgen). Die betreffenden Zellen sind humane Hepatomazellen HuH7 und der Genotyp des verwendeten Hepatitis-C-Virus ist der Genotyp 1b (Lohmann et al., 1997). Dieser Replikationsprozess ist jedoch auf den Genotyp 1a des HCV nicht anwendbar.
Das Hauptproblem bei der Untersuchung des Hepatitis-C-Virus (HCV) ist das Fehlen eines Zellsystems, das in der Lage ist, den viralen Zyklus des HCV zu reproduzieren. Es ist derzeit in der Tat schwierig, Hypothesen aufzustellen, um die Gründe dafür anzugeben. Die Möglichkeit, dass sich das Hepatitis-C-Virus auf bestimmten Zelllinien repliziert, wurde jedoch einige Male erwähnt (Kato und Shimotohno, 2000). Valli et al., Res. Virol., 1997, 148:181-186, zeigen die Verwendung von Vero-Zellen für die Replikation des HCV. Daraus ergibt sich, dass alle Kenntnisse, die in Bezug auf das Hepatitis-C-Virus erhalten wurden, insbesondere über seine Struktur, den Zusammenbau seiner Proteine und seine genomische Organisation, auf Studien der Translation der komplementären DNA des HCV basieren, die in vitro in einem azellulären System und in vivo in den Zellen in Kultur durchgeführt wurden. Daher sind die Mechanismen der Propagation und der viralen Replikation wenig bekannt. Blockierungen können auf verschiedenen molekularen Leveln vorkommen. Sie können auf dem Level der Adsorption der Viruspartikel und des Rezeptors, der Dekapsidation der Viruspartikel, der Expression des Genoms oder der Replikation stattfinden. Das durch die vorliegende Erfindung gelöste sachliche Problem ist also das Auffinden eines neuen Typs von Zellen für die Replikation des HCV. Die Lösung ist die Verwendung von Vero/G418-Zellen, wie sie bei der CNCM am 13. April 2001 unter der Nummer I-2659 hinterlegt wurden.
Einer der Aspekte der Erfindung ist also die Verwendung von Vero/G418-Zellen, wie sie bei der CNCM am 13. April 2001 unter der Nummer I-2659 hinterlegt wurden, die spezielle Zellfaktoren aufweisen, um die Replikation des Genoms des Hepatitis-C-Virus in diesen Zellen zu erlauben.
Einer der anderen Aspekte der Erfindung ist die Verwendung dieser Zellen für die Replikation sowie die Vermehrung und somit die Produktion des Hepatitis-C-Virus.
Einer der anderen Aspekte der Erfindung ist es, ein neues Verfahren der Replikation und Produktion des Genotyps 1a des Hepatitis-C-Virus durch Transformation von Vero/G418-Zellen, wie sie bei der CNCM am 13. April 2001 unter der Nummer I-2659 hinterlegt wurden, anzugeben.
Einer der anderen Aspekte der Erfindung ist die Verwendung dieser Zellen in einem neuen Screening-Verfahren für Anti-HCV-Mittel und somit die Bereitstellung von Inhibitoren des Hepatitis-C-Virus.
Die Erfindung betrifft sie Verwendung von Vero/G418-Zellen, wie sie bei der CNCM am 13. April 2001 unter der Nummer I-2659 hinterlegt wurden, die in der Lage sind, eine Prenylierung von Proteinen durchzuführen, die durch das Genome des Hepatitis-C-Virus (HCV) kodiert werden, wie die Prenylierung des NS5A-Proteins, für die Replikation und gegebenenfalls die Produktion des HCV oder abgeleiteter lebensfähiger Mutanten in einem geeigneten Kulturmedium.
Zahlreiche Proteine zellulären, aber auch viralen Ursprungs erfahren posttranslationale Modifizierungen, die ihre zelluläre Lokalisation orientieren. Einige dieser Proteine haben Fettsäure-Modifizierungen. Eine besonders interessante Modifizierung ist die Prenylierung, die der Alkylierung eines Cysteins durch eine Farnesyl- (15 Kohlenstoffatome) oder Geranylgeranyl-Gruppe (20 Kohlenstoffatome) entspricht, wobei diese Gruppen aus der Polymerisation von Mevalonsäure resultieren.
Das Vorhandensein von zwei Cysteinresten (CC) am carboxyterminalen Ende des NS5A-Proteins (Grakoui et al., 1993) lässt annehmen, dass dieses Protein durch Prenylierung modifiziert werden kann (Casey P. J., 1992). Die Prenyltransferasen können an das Cystein in der C-terminalen Position eine Farnesyl- bzw. Geranylgeranyl-Gruppe mit 15 bis 20 Kohlenstoffatomen anfügen, die aus der Polymerisation von Mevalonsäure stammen. Die Motive, die identifiziert wurden und für diese Modifizierungen verantwortlich sind, sind oft vom CAAX- oder CC-Typ, worin C Cystein, A eine aliphatische Aminosäure und X eine Aminosäure wie M (Methionin), S (Serin), Q (Glutamin) oder L (Leucin) ist.
Der Ausdruck „Replikation des HCV" bezeichnet den oder die molekularen Prozess(e), der (die) zur Synthese eines Strangs negativer Polarität führt (führen), der dazu dient, neue Stränge positiver Polarität hervorzubringen, die das genomische Material des HCV bilden.
Der Ausdruck „Produktion des HCV" bezeichnet die Möglichkeit für eine gegebene Zelle, infektiöse Partikel des Hepatitis-C-Virus zu reproduzieren (viraler Vermehrungszyklus).
Der Ausdruck „abgeleitete lebensfähige Mutanten" bezeichnet lebensfähige Varianten, die nur aus der Selektion des Replikons des HCV unter verschiedenen Selektionsdrü cken stammen können. Dieser Selektionsdruck muss die Selektion von Mutationen im Genom des HCV herbeiführen, die zu einer besseren Replikation, zu einer quantitativeren Expression der verschiedenen Proteine und als Folge davon zu einer besseren Resistenz der gegenüber dem Selektionsprodukt führen. Nur lebensfähige Mutationen, die eine Resistenz gegen den Selektionsdruck erlauben, werden betrachtet. Die anderen, nicht lebensfähigen Mutationen führen zum Tod der Zelle.
Der Ausdruck „in einem geeigneten Kulturmedium" bezeichnet das Medium, in welchem die Zelllinie am besten wachsen kann. Dieses Kulturmedium kann insbesondere das DMEM/10% FCS (fetales Kälberserum) Medium sein, ergänzt mit den notwendigen Elementen für die Selektion, beispielsweise Neomycin (G418) oder Hygromycin B.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung, wie oben definiert, von Vero/G418-Zellen, wie sie bei der CNCM am 13. April 2001 unter der Nummer I-2659 hinterlegt wurden. Diese Zellen stammen von der speziellen Zelllinie Vn5, die aus der Transformation einer Vero-Zelle durch das Resistenzgen gegen Neomycin resultiert. Diese Vn5- oder Vero/G418-Zellen werden von Frese et al. (1995) beschrieben.
Die Erfindung betrifft die Verwendung, wie oben definiert, von Vero/G418-Zellen, wie sie bei der CNCM am 13. April 2001 unter der Nummer I-2659 hinterlegt wurden, wobei diese Zellen durch eine Nukleinsäure transformiert sind, die das ganze oder einen Teil des Genoms des HCV oder vom HCV angeleiteter Mutanten enthält.
Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung können diese Zellen durch folgende Resistenzgene gegen Antibiotika transformiert sein: Bleomycin-, Phleomycin- oder Zeocinresistenzgen; oder Puromycin-, Hygromycin B- oder Neomycin-Resistenzgen.
Um diese Zellen zu transformieren, umfasst die verwendete Ribonukleinsäure die folgenden Teile des Genoms des HCV: die 5' und 3' nicht-kodierenden Regionen, einen Teil der Sequenzen, die für das Kapsidprotein C kodieren (Sequenz zwischen 50 und 100 Nukleotiden), und die Region, die für die nicht-strukturellen Proteine kodiert, nämlich NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A und NS5B oder NS3, NS4A, NS4B, NS5A und NS5B.
Die lebensfähigen Varianten des HCV resultieren vorteilhafterweise aus der Selektion des Replikons unter verschiedenen Selektionsdrücken. Dieser Druck bewirkt die Selek tion von Mutationen im Genom, die zu einer besseren Resistenz gegen das Selektionsprodukt führen.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung, wie oben definiert, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure ausgewählt ist aus:

– jenen, die für die strukturellen und nicht strukturellen Proteine des HCV kodieren, oder
– jenen, die für die nicht strukturellen Proteine des HCV kodieren, oder
– den Replikons, die ein Resistenzgen gegen ein Antibiotikum, insbesondere Hygromycin B, und eine Nukleotidsequenz, die für die nicht strukturellen Proteine des HCV kodiert, enthalten.

Eine Nukleinsäure, die für die strukturellen und nicht strukturellen Proteine des HCV kodiert, ist beispielsweise die Nukleotidsequenz SEQ ID NO: 2.
Eine Nukleinsäure, die für die nicht strukturellen Proteine des HCV kodiert, ist beispielsweise die Nukleotidsequenz SEQ ID NO: 1.
Unter den strukturellen Proteinen des HCV versteht man die Proteine, wie sie oben genannt sind, nämlich die Proteine C, E1, E2 und p7.
Unter den nicht strukturellen Proteinen des HCV versteht man die Proteine NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A und NS5B.
Der Ausdruck „Replikon, das ein Resistenzgen gegen ein Antibiotikum, insbesondere Hygromycin B, und eine Nukleotidsequenz, die für die nicht strukturellen Proteine des HCV kodiert, enthält" bezeichnet eine Nukleinsäure, die die 5' und 3' nicht-kodierenden Regionen des Genoms des HCV, einen Teil der Sequenz, die für das Kapsidprotein C des HCV kodiert, gefolgt von Nukleotidsequenzen, die für Hygromycin-B-Phosphotransferase (HPH) kodieren, und Nukleotidsequenzen, die für die Proteine NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A und NS5B kodieren, oben definiert (siehe 1), enthält.
Nachdem die Möglichkeit, alles oder einen Teil der Strukturproteine zu ersetzen, für andere positive RNA-Viren realisiert wurde und man derzeit über eine vollständige cDNA des HCV verfügt, wurde ein Replikon des HCV konstruiert, indem ein Teil der Sequenzen, die für das Kapsidprotein C kodieren, beibehalten wurde. Vom Team von Dr. Jackson (Reynolds et al., 1995) wurde gezeigt, dass diese Sequenzen eine wichtige Rolle bei der Translationsinitiation des HCV über IRES (interne Ribosomeneintrittsstelle) spielten. Zum Aufrechterhalten der Integrität der IRES und unter den Bedingungen des HCV wurde ein Teil der Sequenzen, die für das Kapsidprotein kodieren, konserviert. Die Sequenz der Strukturproteine wurde also durch die Sequenz substituiert, die für das Hygromycin-B-Resistenzgen kodiert. Durch diesen Ansatz ist es möglich, die Zellen unter Hygromycin-B-Selektionsdruck zu halten, um die resistenten Zellklone zu selektieren. Diese Ergebnisse können nur durch die Beibehaltung des Replikons in der Zelle erklärt werden. Es können jedoch andere Selektionsmarker verwendet werden, um diese Selektion zu erleichtern, wie Puromycin, Zeocin oder Bleomycin.
Die Erfindung betrifft die Verwendung, wie oben definiert, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen durch eine Nukleinsäure transformiert sind, die ausgewählt ist aus den Nukleotidsequenzen SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 und SEQ ID NO: 3.
Die Sequenz SEQ ID NO: 1 entspricht dem Teil der Sequenz des HCV vom Genotyp 1a, der für die nicht strukturellen Proteine kodiert, nämlich die Proteine NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A und NS5B.
Die Sequenz SEQ ID NO: 2 entspricht der gesamten Sequenz des HCV vom Genotyp 1a (strukturelle und nicht strukturelle Proteine).
Die Sequenz SEQ ID NO: 3 entspricht dem Replikon, das durch Fusion eines Hygromycin B-Resistenzgens mit dem Teil der Sequenz des HCV vom Genotyp 1a, der für die nicht strukturellen Proteine kodiert, erhalten wurde.
Die Erfindung betrifft die Verwendung, wie oben definiert, für die Replikation und gegebenenfalls die Produktion des HCV vom Typ 1a.
Der Genotyp vom Typ 1a von HCV wurde insbesondere von Peter Simmonds (2001) beschrieben.
Das Hauptcharakteristikum der HCV-Genotypen ist ihre Variabilität. Die Genome unterscheiden sich untereinander durch ihre Nukleotide mit einem Prozentsatz, der von 31 bis 34% variiert, was auch eine Variabilität der Aminosäuren mit sich bringt.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung, wie oben definiert, von Zellen, wie sie bei der CNCM am 13. April 2001 unter den Nummern I-2658 und I-2659 hinterlegt wurden.
Der Stamm, der unter der Nummer I-2659 registriert wurde, entspricht den Vero/G418 (Vn5) Zellen, wie oben definiert.
Der Stamm, der unter der Nummer I-2658 registriert wurde, entspricht Zellen Vero/G418+Replikon, die Vero/G418-Zellen sind, in welche die Sequenz SEQ ID NO: 3, wie oben definiert, inseriert wurde.
Eine Nukleotidsequenz, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie die SEQ ID NO: 1 umfasst oder daraus besteht, kann in der Erfindung verwendet werden.
Eine Nukleotidsequenz, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie die SEQ ID NO: 3 umfasst oder daraus besteht, kann in der Erfindung verwendet werden.
Ein rekombinanter Vektor, insbesondere Plasmid, Cosmid, Phage oder Virus-DNA, eine Nukleotidsequenz wie oben definiert enthaltend, kann in der Erfindung verwendet werden.
Ein rekombinanter Vektor, wie oben definiert, der die Elemente, die für die Expression der Polypeptide, die von den Nukleinsäuren, wie sie oben definiert sind, kodiert werden, in einer Wirtszelle notwendig sind, in den Vektor inseriert enthält, kann in der Erfindung verwendet werden.
Der oben definierte rekombinante Vektor kann insbesondere einen Promotor enthalten, der von der RNA-Polymerase der Wirtszelle erkannt wird, insbesondere einen induzierbaren Promotor, und gegebenenfalls eine Transkriptionssequenz, eine Terminationssequenz und gegebenenfalls eine Signal- und/oder Ankersequenz.
Ein rekombinanter Vektor, wie oben definiert, kann die Elemente enthalten, welche die Expression einer Nukleotidsequenz, wie oben definiert, als reifes Protein oder Fusionsprotein erlauben.
Ein Vektor, der für die Klonierung des HCV verwendet werden kann, ist der Vektor pGEM 3Zf (+) (Promega). Dieser Vektor enthält das Ampicillin-Resistenzgen, den Replikationsursprung des Plasmids und das intergene Fragment des Phagen f1. Außerdem sind die Fragmente des HCV unter die Kontrolle des T7 oder SP6 Promotors gebracht.
Eine Wirtszelle, insbesondere ausgewählt aus Bakterien, Viren, Hefen, Pilzen, Pflanzen oder Säugerzellen, wobei diese Wirtszelle transformiert ist, insbesondere mithilfe eines rekombinanten Vektors, wie oben definiert, kann in der Erfindung verwendet werden.
Die Wirtszelle, wie oben definiert, kann die regulierenden Elemente enthalten, welche die Expression einer der Nukleotidsequenzen, wie oben definiert, erlauben.
DH5α-Bakterien, vermarktet von der Firma Gifco, können verwendet werden. Diese Bakterien werden verwendet, um nach der Transfektion die pGEM3Zf Plasmide (Promega) zu amplifizieren, die die komplementären Sequenzen des HCV oder die Sequenzen des Replikons enthalten. Alle Plasmide, die Sequenzen des HCV enthalten, werden für die Transformation der DH5α-Bakterien verwendet. Die Sequenzen des HCV sind in diesem Bakterium stabil.
Die Zellen, die für die virale Produktion der rekombinanten Vakzinviren verwendet werden, können insbesondere die Tk- (siehe den experimentellen Teil I-3) oder die CV1L-Zellen sein.
Die rekombinanten Vakzinviren werden ausgehend von den pTM1-Plasmiden (Moss et al., 1990) produziert und nach der experimentellen Methode rekombiniert. Diese rekombinanten Viren enthalten die Sequenzen, die für das NS5A-Protein kodieren, oder Formen, die im N-terminalen Teil des NS5A-Proteins trunkiert sind.
Der Stamm der CV1-Zellen ist eine kontinuierliche Linie, die von AGMK-Zellen (Nierenzellen der Afrikanischen Grünen Meerkatze, African green monkey kidney) abgeleitet sind, und der CV1-L-Stamm resultiert aus einer Subklonierung des CV1-Stamms.
Die Erfindung betrifft jedwede transformierte Zelle, die gebildet ist durch eine Vero/G418-Zelle, hinterlegt bei der CNCM am 13. April 2001 unter der Nummer I-2659, die eine Nukleinsäure aufweist, die ausgewählt ist aus:

– jenen, die für die strukturellen und nicht strukturellen Proteine des HCV kodieren, oder
– jenen, die für die nicht strukturellen Proteine des HCV kodieren, oder
– den Replikons, die ein Resistenz-Gen gegen ein Antibiotikum, insbesondere Hygromycin B, und eine Nukleotidsequenz, die für die nicht strukturellen Proteine des HCV kodiert, enthalten.

Eine vorteilhafte Zelle gemäß der Erfindung ist eine Zelle, wie oben definiert, die dargestellt wird von einer Vero/G418-Zelle, hinterlegt bei der CNCM am 13. April 2001 unter der Nummer I-2659, umfassend ein Replikon, das von einer Nukleinsäure dargestellt wird, die ausgewählt ist aus jenen, die ein Resistenzgen gegen ein Antibiotikum, wie Hygromycin B, und eine Nukleotidsequenz, die für die nicht strukturellen Proteine des HCV, nämlich NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A und NS5B, kodiert, enthalten.
Eine vorteilhafte Zelle gemäß der Erfindung ist eine Zelle, wie oben definiert, die eine Nukleinsäure enthält, die ein Resistenzgen gegen ein Antibiotikum, wie Hygromycin B, und eine Nukleotidsequenz, die für die nicht strukturellen Proteine des HCV kodiert, umfasst, hinterlegt bei der CNCM am 13. April 2001 unter der Nummer I-2658.
Eine vorteilhafte Zelle gemäß der Erfindung ist eine Zelle, wie oben definiert, die dargestellt wird durch eine Vero/G418-Zelle, hinterlegt bei der CNCM am 13. April 2001 unter der Nummer I-2659, die eine Nukleinsäure enthält, die ein Resistenzgen gegen ein Antibiotikum, insbesondere Hygromycin B, und eine Nukleotidsequenz, die für die nicht strukturellen Proteine kodiert, umfasst, und die die Eigenschaft der Replikation des HCV bei einer Konzentration an Antibiotikum, insbesondere Hygromycin B, von 800 bis 1000 μg/ml hat.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren der Produktion des Hepatitis-C-Virus, welches Verfahren die Infektion von Vero/G418-Zellen, hinterlegt bei der CNCM am 13. April 2001 unter der Nummer I-2659, durch das Hepatitis-C-Virus und die Kultivierung dieser infizierten Zellen unter geeigneten Bedingungen umfasst.
Die Vero/G418-Zellen, wie sie bei der CNCM am 13. April 2001 unter der Nummer I-2659 hinterlegt wurden, +Replikon werden in einem ersten Schritt durch Infektion ausgehend von einem titrierten HCV-Stock geprüft, um zu bestimmen, ob diese Zelllinie infiziert werden kann und zur Produktion des Virus in der Lage ist.
Dann ist es nötig, die Sequenzen der funktionellsten Replikons zu klonieren, um sie in die vollständige cDNA des HCV zurückzubringen, und dann die Zellen Vero/G418, wie sie bei der CNCM am 13. April 2001 unter der Nummer I-2659 hinterlegt wurden, +Replikon oder die Zellen Vero/G418, wie sie bei der CNCM am 13. April 2001 unter der Nummer I-2659 hinterlegt wurden, zu transfizieren, um zu bestimmen, ob Infektivität und virale Produktion vorliegen.
Das funktionellste Replikon wird vorteilhafterweise von der Zelle erhalten, die der höchsten Hygromycin B-Konzentration widersteht. Das Wachstum der Zelle zeigt eine stärkere Expression des Hygromycin B-Resistenzgens an, das mit der Replikationseffizienz des Replikons verknüpft ist.
Die hier bestimmte Infektivität ist die Infektivität der komplementären DNA des HCV, d.h. die Möglichkeit der Rekonstitution infektiöser Viruspartikel nach der Transfektion der Zellen durch RNA, die aus der Transkription der cDNA des HCV resultiert. Das Virus ist dann in der Lage, in einer geeigneten Zellkultur zu propagieren und eine Menge an Viruspartikeln zu produzieren.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren der Replikation des Hepatitis-C-Virus durch Transformation von Vero/G418-Zellen, wie sie bei der CNCM am 13. April 2001 unter der Nummer I-2659 hinterlegt wurden, mit einer Nukleinsäure, wie oben definiert, um transformierte Vero/G418-Zellen, wie sie bei der CNCM am 13. April 2001 unter der Nummer I-2659 hinterlegt wurden, insbesondere jene, die am 13. April 2001 bei der CNCM unter der Nummer I-2658 hinterlegt wurden, zu erhalten, und Kultivieren dieser transformierten Zellen unter geeigneten Bedingungen.
Die Replikation des HCV kann nur in bestimmten Zellen stattfinden, deren Auswahl von Nutzen ist. Dazu verwendet man ein Replikon, die minimale Einheit der Replikation, das die Sequenzen des Hygromycin B-Resistenzgens enthält, inseriert anstelle der Sequenzen, die für die Strukturproteine des HCV kodieren. Die Möglichkeit bestimmter Zellen, in selektivem Medium (z.B. DMEM/10% FCS und Hygromycin B) zu wachsen, ist ein Zeichen der Replikation des Genoms des HCV, da das Hygromycin B-Resistenzgen durch das HCV eingebracht wird. Die Selektion resistenter Zellen bedeutet auch die Selektion der Genome des HCV, die in der Lage sind, in diesen Zellen zu replizieren. Daher ist die Replikation des HCV mit der Selektion der resistenten Zellen verknüpft.
Dieses Verfahren beruht somit auf einer Methode der Selektion von Zellen, die in der Lage sind, das Genom des HCV zu replizieren.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Produktion des Hepatitis-C-Virus durch Transformation von Vero/G418-Zellen, wie sie am 13. April 2001 bei der CNCM unter der Nummer I-2659 hinterlegt wurden, mit einer Nukleinsäure, die für die strukturellen und nicht strukturellen Proteine des HCV kodiert, durch Kultivieren der transformierten Vero/G418-Zellen unter geeigneten Bedingungen und Gewinnung der HCV-Partikel.
In einem ersten Schritt werden die Zellen, die unter Drücken von 1,5 bis 2,0 mg/ml Hygromycin B wachsen, selektiert, dann wird die gesamte RNA dieser Zellen extrahiert, um die RNA des HCV in DNA umzuwandeln. Diese wird dann in einem Vektor pGEM 3Zf (Promega) kloniert, in welchen nur die Sequenz, die für die nicht strukturellen Proteine des Replikons kodiert, an der Stelle und anstatt der vollständigen cDNA des HCV wiedereingeführt wird. So werden alle Variationen eingeführt, die für eine bessere Replikation des HCV in den verwendeten Zellen notwendig sind. Die erhaltene DNA wird dann in RNA umgewandelt, und diese RNA dient für die Transfektion der Zellen, um zu bestimmen, ob eine virale Produktion auf diesen Zellen möglich ist.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren für das Screening von Anti-HCV-Mitteln, die folgenden Schritte umfassend:

– das Zusammenbringen der auf ihre Anti-HCV Eigenschaften zu prüfenden Verbindung mit transformierten Zellen, die gebildet sind aus Vero/G418-Zellen, wie sie am 13. April 2001 bei der CNCM unter der Nummer I-2659 hinterlegt wurden, welche eine Nukleinsäure umfassen, die ausgewählt ist aus: • jenen, die für die strukturellen und nicht strukturellen Proteine von HCV kodieren, oder • jenen, die für die nicht strukturellen Proteine von HCV kodieren, oder • den Replikons, die ein Resistenz-Gen gegen ein Antibiotikum, insbesondere Hygromycin B, und eine Nukleotidsequenz, die für die nicht strukturellen Proteine von HCV kodiert, enthalten, und insbesondere mit Zellen, wie sie am 13. April 2001 bei der CNCM unter der Nummer I-2658 hinterlegt wurden,
– Extraktion der Gesamt-RNA aus diesen Zellen, und
– Analyse der eventuellen Verringerung der Syntheserate der RNA des HCV der genannten Zellen im Verhältnis zu einem Kontrollwert, der der Syntheserate der RNA des HCV der Zellen in Abwesenheit der geprüften Verbindung entspricht.

Die Vero/G418-Zellen, wie sie bei der CNCM am 13. April 2001 unter der Nummer I-2659 hinterlegt wurden, + Replikon, die bei Hygromycin B-Konzentrationen von 800 bis 2000 μg/ml wachsen, werden der Wirkung spezieller Inhibitoren von 3-Hydroxy-3-methylglutaryl-Coenzyme A-Reduktase, wie Mevastatin oder Lovastatin, unterworfen. Dann werden RNA-Extraktionen zu unterschiedlichen Zeitpunkten bei Zellen durchgeführt, die mit diesen Inhibitoren behandelt wurden. Die Synthese der RNA des HCV wird dann mittels RT-PCR in einem einzelnen Schritt unter Verwendung einer LightCycler (Roche) ge nannten Vorrichtung oder durch Hybridisierung der RNA auf Filtern unter Verwendung HCV-spezifischer radioaktiver Sonden analysiert.
Es kann auch das folgende System verwendet werden, welches die Reproduktion eines Replikons beinhaltet, das auch die Sequenzen enthält, die für das GFP-Protein kodieren, dessen Eigenschaft die natürliche Fluoreszenz bei einer bestimmten Wellenlänge ist. Außerdem wird dieses Protein mit einer relativ kurzen Halbwertszeit gewählt. Unter diesen Bedingungen ist es nicht erforderlich, die Zellen zu fixieren, und die Fluoreszenz kann in Realzeit beobachtet werden. Wenn ein wirksamer Inhibitor des HCV mit den Vero/G418+Replikon-Zellen in Kontakt gebracht wird und eine Hemmung der Synthese der RNA des HCV beobachtet wird, wird das auch auf der Stufe der Synthese der produzierten Proteine beobachtet und folglich an der Intensität der Fluoreszenz, die von dem GFP produziert wird. Da die Halbwertszeit des GFP sehr kurz ist, beobachtet man eine Verminderung bei der Fluoreszenz des GFP in den Zellen.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung von Vero/G418-Zellen, wie sie am 13. April 2001 bei der CNCM unter der Nummer I-2659 hinterlegt wurden, umfassend eine Nukleinsäure, die ausgewählt ist aus:

– jenen, die für die strukturellen und nicht strukturellen Proteine des HCV kodieren, oder
– jenen, die für die nicht strukturellen Proteine des HCV kodieren, oder
– den Replikons, die ein Resistenz-Gen gegen Hygromycin B und eine Nukleotidsequenz, die für die nicht strukturellen Proteine von HCV kodiert, enthalten, wobei das Verfahren die folgenden Schritte enthält: • Inserieren einer der Nukleotidsequenzen, wie oben definiert, in die Vero/G418-Zellen, • Aussetzen der so erhaltenen Zellen zunehmenden Konzentrationen, insbesondere 800 bis 1000 μg/ml, an Hygromycin B.

Die Erfindung betrifft Zellen, wie sie durch die Durchführung des Verfahrens, wie es oben definiert ist, erhalten werden
Beschreibung der Figuren
Die 1 ist ein Schema des Replikons des Genotyps 1a des Hepatitis-C-Virus. Dieses Replikon enthält die 5'- und 3'-Sequenzen, die den nicht-kodierenden Regionen des HCV entsprechen; die Nukleotidsequenz, die für einen Teil des Kapsidproteins (C') kodiert, d.h. die 246 Nukleotide (Aminosäuren 1 bis 82); die Nukleotidsequenz, die für das Hygromycin B-Phosphotransferase-Gen kodiert, welches das Selektionsgen ist (in dem Schema als Hygromycin^® bezeichnet); die Nukleotidsequenzen, die für die nicht strukturellen Proteine kodieren, NS2-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B entsprechend und als NS2→NS5B bezeichnet. Die Stelle Asp 718 ist eine der Restriktionsstellen, die in der Nukleotidsequenz des Kapsidproteins enthalten ist, die der Insertion der Sequenzen diente, die für das Selektionsgen kodieren. Die XbaI-Restriktionsstelle ist die Stelle, die zum Linearisieren der DNA vor der Transkription verwendet wird. Diese Stelle wird dann nach der Methode modifiziert, die im Teil „Materialien und Methoden" beschrieben ist.
Die 2A bis 2D zeigen die Immunfluoreszenz-Ergebnisse auf den Vero/G418+Replikon-Zellen. Die Vero/G418-Zellen werden auf Glasplättchen in Abwesenheit von Hygromycin B kultiviert (2D), und die Vero/G418+Replikon-Zellen werden in Gegenwart von Hygromycin B (800 μg/ml) kultiviert (2A, 2B und 2C). Diese Zellen werden dann nach den im Teil „Materialien und Methoden" beschrieben Methoden behandelt.
Die 2A entspricht der indirekten Immunfluoreszenz, die auf Vero/G418+Replikon-Zellen mithilfe eines gegen das Kapsidprotein C gerichteten monoklonalen Maus-Antikörpers erhalten wurde.
Die 2B entspricht der indirekten Immunfluoreszenz, die auf Vero/G418+Replikon-Zellen mithilfe eines Serum eines mit HCV infizierten Patienten erhalten wurde.
Die 2C entspricht der indirekten Immunfluoreszenz, die auf Vero/G418+Replikon-Zellen mithilfe eines polyklonalen Antikörpers, der im Kaninchen gebildet wurde und gegen das NS4-Protein gerichtet war, erhalten wurde.
Die 2D entspricht der indirekten Immunfluoreszenz, die auf Vero/G418-Zellen (Kontrollzellen) mithilfe eines polyklonalen Antikörpers, der im Kaninchen gebildet wurde und gegen das NS4-Protein gerichtet war, erhalten wurde.
Die 3A, 3B, 3C und 3D betreffen die Charakterisierung der Prenylierung des NS5A-Proteins des Hepatitis-C-Virus.
Die 3A zeigt das Ergebnis der Immunpräzipitationen, die mithilfe eines gegen das NS5A-Protein gerichteten polyklonalen Kaninchen-Antikörpers erhalten wurden und mit Zellextrakten durchgeführt wurden, die von Vero/G418 (oder Vn5) Zellen stammten, die entweder nur mit dem rekombinanten Vakzinvirus vTF7-3 (Linie 1) oder mit den rekombinanten Vakzinviren vTF7-3 und vvNS5A (Linie 2) infiziert waren, und markiert entweder in Gegenwart von H³ Mevalonsäure oder in Gegenwart von S³⁵ Methionin. Das immunpräzipitierte NS5A-Protein ist durch einen Pfeil angezeigt.
Die 3B zeigt das Ergebnis der Immunpräzipitationen, die mithilfe eines gegen das NS5A-Protein gerichteten polyklonalen Kaninchen-Antikörpers erhalten wurden und mit Zellextrakten durchgeführt wurden, die von Vn5 (Vero/G418) Zellen stammten, die mit den rekombinanten Vakzinviren vTF7-3 allein (Linie 1), vTF7-3 und vvNS5A.1a (Linie 2) und vTF7-3 und vvNS2-5B (Linie 3) infiziert waren. Die Gegenwart des NS5A-Proteins ist durch einen Pfeil angezeigt.
Die 3C zeigt das Ergebnis der Immunpräzipitationen, die mithilfe eines gegen das NS5A-Protein gerichteten polyklonalen Kaninchen-Antikörpers erhalten wurden und mit Zellextrakten durchgeführt wurden, die von Vn5 (Vero/G418) Zellen stammten, die mit den rekombinanten Vakzinviren vTF7-3 allein (Linie 1), vTF7-3 und vvNS5A.1a dl1 (Deletion der Aminosäuren, die sich zwischen den Positionen 1973 und 2100 befinden, Linie 2), vTF7-3 und vvNS5A.1a dl2 (Deletion der Aminosäuren, die sich zwischen den Positionen 1973 und 2073 befinden, Linie 3), vTF7-3 und vvNS5A.1a dl3 (Deletion der Aminosäuren, die sich zwischen den Positionen 1973 und 2001 befinden, Linie 4) und vTF7-3 und vvNS5A.1a (Linie 5) infiziert waren, und markiert entweder in Gegenwart von H³-Mevalonsäure oder in Gegenwart von S³⁵-Methionin. Die Position der verschiedenen trunkierten NS5A-Proteine ist durch eine Linie an der Seite der Figur angezeigt.
Die 3D zeigt das Ergebnis der Immunpräzipitationen, die mithilfe eines gegen das NS5A-Protein gerichteten polyklonalen Kaninchen-Antikörpers erhalten wurden und mit Zellextrakten durchgeführt wurden, die von Vn5 (Vero/G418) Zellen stammten, die mit den rekombinanten Vakzinviren vTF7-3 und vvNS5A vom Genotyp 1a, vTF7-3 und vvNS5A vom Genotyp 1b, die von zwei verschiedenen Patienten stammten (Linien 1 und 2), infiziert waren, und markiert in Gegenwart von Mevalonsäure H³. Die Position des NS5A-Proteins ist durch einen Pfeil angezeigt.
EXPERIMENTELLER TEIL
I- Die Prenylierung: Materialien und Methoden
1. Zellen und Erhaltungsbedingungen.
Vero/G418-Zellen: Die Vero/G418 (oder Vn5) Zellen (Frese et al., 1995) werden in einer dünnen Schicht in 10-mm-Schalen und in einem DMEM-Medium (Dulbecco's modifiziertes Eagle-Medium), das 10% fetales Kälberserum (FCS) enthält, kultiviert. Die Zellen können unter Neomycin-Druck bei 300 g/ml (Erhaltungswert für diese Zellen) kultiviert werden. Sie werden alle 5 oder 6 Tage durch eine Trypsin/Versen-Lösung (NaCl 8 g/l; KCl 0,4 g/l; Dextrose 1 g/l; NaHCO₃ 0,58 g/l; kristallisiertes Trypsin 0,045 g/l; Versen 0,2 g/l) abgelöst und 1–10⁶ Zellen werden in eine 100-mm-Schale transferiert, was einer 1/10-Verdünnung entspricht. Das Medium wird alle zwei oder drei Tage gewechselt.
2. Klonierung des Genoms des Hepatitis-C-Virus.
Unter Verwendung von Primern, die spezifisch für die Sequenz des Hepatitis-C-Virus sind, wurde eine cDNA nach der Methode von Gübler und Hoffman (Gübler und Hoffman, 1983) synthetisiert. Dann konnte dank der Primer mit bekannten Sequenzen das Genom von Hepatitis C durch die sogenannte „Nested Primer"-Methode (Mullis und Faloona, 1987) amplifiziert werden. DNA-Fragmente, die verschiedenen Regionen des Genoms von HCV entsprechen, sowie die Sequenzen, die den nicht-kodierenden Enden des Genoms des HCV entsprechen, wurden in einen pGEM 3Zf(+) Vektor (Promega) in die singuläre Restriktionsstelle Sma1 kloniert. Dieser Vektor enthält das Ampicillin-Resistenzgen, den Replikationsursprung des Plasmids und das intergene Fragment des Phagen f1. Außerdem werden die Fragments unter die Kontrolle des Promotors T7 am 5'-Ende des HCV oder SP6 am 3'-Ende des HCV gebracht. Alle diese Klone wurden mit überlappenden DNA-Sequenzen konstruiert, um die in vitro-Rekombinationen zu erleichtern. Nach totalen oder partiellen Verdauungen der DNA dieser verschiedenen Klone wurden Fragmente auf Agarose-Gel gereinigt und miteinander ligiert, um das Genom des Hepatitis-C-Virus zu rekonstituieren. Eine 9623 Nukleotide lange cDNA konnte so erzeugt werden.
3. Konstruktion rekombinanter pTM1 Plasmide und Produktion der rekombinanten Viren des entsprechenden Vakzins.
Verschiedene DNA-Fragments, die für die Proteine des HCV kodieren, und insbesondere das NS5A-Protein des HCV, wurden durch enzymatische Amplifizierung aus dem Genom des HCV (pG/HCV 1-9623) erzeugt. Diese DNA wurden an der EcoRI-Restriktionsstelle in die multiple Klonierungsregion des pTM1-Plasmids (Moss et al., 1990) kloniert. Diese Region ist unmittelbar stromab vom Promotor der RNA-Polymerase des Phagen T7 und der IRES (interne Ribosomeneintrittsstelle) des EMCV-Virus (Encephalomyocarditis virus) angeordnet.
Die entsprechenden rekombinanten Viren des Vakzins wurden durch homologe Rekombination nach dem von Kieny et al. (1984) definierten Prinzip erzeugt. Die rekombinanten Viren werden durch die Bildung von Plaques auf 143 B tk-Zellen (Thymidinkinasedefiziente Zellen, ATCC CRL-8303) in Gegenwart von Bromdesoxyuridin (50 μg/ml) gereinigt. Jeder Virus-Stock, der von einer isolierten Plaque stammt, wurde auf CV1-L-Zellen (Stamm, der aus der Subklonierung von Nierenzellen der Afrikanischen Grünen Meerkatze stammt) nach Infektion mit einer Multiplizität der Infektion (m.o.i., multiplicity of infection) von 1 Plaque-bildenden Einheit pro Zelle (PFU/Zelle) amplifiziert (Fourmillier et al., 1996).
4. Analyse der Proteine, die mithilfe der rekombinanten HCV-Vakzinviren exprimiert werden.
(³⁵S)-Markierung der Proteine: Vero/G418 (Vn5) Zellen wurden mit dem vTF7.3-Virus (Fuerst et al., 1986) allein infiziert oder mit diesem Virus und einem der rekombinanten Viren, die das NS5A-Protein von HCV exprimieren, co-infiziert, jeweils mit einer m.o.i. von 5 PFU/Zelle. Nach einer Stunde bei 37°C wird das Inokulum entfernt und durch DMEM-Medium, das 5% fetales Kälberserum enthält, ersetzt. 16 Stunden nach der Infektion werden die Zellen mit DMEM-Medium ohne Methionin gewaschen und dann in diesem Medium 1 bis 2 Stunden inkubiert, dann für 3 Stunden mit 100 μCi/ml (³⁵S) Methionin markiert (³⁵S-Protein Labeling Mix (NEN), Markierungslösung). Nach dieser Zeit wird das Medium entfernt und die Zellen werden dann mit PBS gewaschen und schließlich lysiert mithilfe eines Lysepuffers für zytoplasmatische Extraktion (50 mM Tris-HCl pH 7,5; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA; NP40 (oder Igepal) 1 % (Sigma); Na-Desoxycholat 0,1%; Aprotinin 10 μg/ml; TPCK (Sigma) und PMSF (Sigma), 20 μg/ml) oder für totale Extraktion durch eine Lyselösung, enthaltend: 50 mM Tris-HCl pH 7,5; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA; 0,5% NP40; 0,5% Na-Desoxycholat; 0,2% SDS; Aprotinin 10 μg/ml; TPCK und PMSF, 20 μg/ml. Die Proteine von HCV werden dann aus diesem Lysat mithilfe polyklonaler Kaninchen-Sera immunpräzipitiert, wie von Wychowski et al. (1985) beschrieben, und die Präzipitate wurden dann mittels SDS-PAGE analysiert.
(³H)-Mevalonsäure-Markierung der Proteine: Vero/G418 (Vn5) Zellen wurden mit dem vTF7.3-Virus (Fuerst et al., 1986) allein infiziert oder mit diesem Virus und einem der rekombinanten Viren, die das NS5A-Protein des HCV exprimieren, co-infiziert, jeweils bei einer m.o.i. von 5 PFU/Zelle. Nach 1 Stunde bei 37°C wird das Inokulum entfernt und durch DMEM-Medium ersetzt, enthaltend 10% fetales Kälberserum in Gegenwart von Mevastatin (100 μg/ml). Nach 4 Stunden werden 100 mCi/ml (³H) Mevalonsäure zu dem Medium zugegeben. Nach 18 Stunden nach der Infektion werden die Zellen mit DMEM-Medium gewaschen, das Medium wird entfernt, und die Zellen werden mit einer PBS-Lösung gewaschen, bevor sie mit einem Puffer lysiert werden, der enthält: 50 mM Tris-HCl pH 7,5; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA; 0,5% NP40; 0,5% Na-Desoxycholat; 0,2% SDS; Aprotinin 10 μg/ml; TPCK und PMSF, 20 μg/ml. Die Proteine des HCV werden dann aus diesem Lysat mithilfe polyklonaler Kaninchensera immunpräzipitiert, wie zuvor beschrieben, und die Präzipitate werden mittels SDS-PAGE analysiert.
II-Analysen des Replikons des HCV: Materialien und Methoden
1. Konstruktion des Replikons des HCV ausgehend von der komplementären DNA des HCV.
Ausgehend von dem Klon, der die Gesamtheit der Sequenz des HCV enthält (pG/HCV 1-9623), wurde anfänglich ein Replikon des HCV konstruiert, worin die Sequenzen, die für die strukturellen Proteine kodieren, durch die Sequenzen, die für Neomycin kodieren, substituiert wurden. Die DNA, die dem Neomycin-Gen entspricht, wurde zwischen den Asp718-Restriktionsstellen (Position 579 der Nukleotidsequenz des HCV vom Genotyp 1a) und der Eco47III-Restriktionsstelle (Position 2847 der Nukleotidsequenz des HCV vom Genotyp 1a) eingeführt. Ein DNA-Fragment, das der Sequenz entspricht, die für Neomycin kodiert, wurde amplifiziert mithilfe komplementärer Primer der Sequenz, die für Neomycin kodiert und am 5'- und 3'-Ende die Asp718- und Eco47III-Restriktionsstelle hat. Das amplifizierte Fragment wurde auf Low-Melting-Gel (Agarose-Gel mit niedrigem Schmelzpunkt) gereinigt, dann wurde dieses Fragment durch die genannten Restriktionsenzyme verdaut. Dieses Fragment wurde dann in das pG/HCV 1-9623-Plasmid integriert, deletiert von der Sequenz zwischen Asp718 und Eco47III. Die Sequenzen wurde so integriert, dass sie mit einem verbleibenden Teil der Sequenzen, die für das Kapsidprotein kodieren, und mit den Sequenzen, die für das NS2-Protein kodieren, in Phase waren. Aufgrund der Position der Eco47III Restriktionsstelle wurde jedoch der der terminale NH2-Teil von NS2 deletiert. Als Ergebnis wurden die vollständigen NS2-Sequenzen durch Amplifizieren der Gesamtheit der Sequenzen, die für NS2 kodieren, und eines Teils der Sequenz, die für das NS3-Protein kodiert, durch PCR rekonstituiert. Der Primer in 5'-Position der Sequenz enthält auch die Sequenzen der SpeI-Restriktionsstelle. Das DNA-Fragment wurde nach der üblichen Vorgehensweise amplifiziert und gereinigt, dann wurde es durch die SpeI-Enzyme und das Bst1107I-Enzym verdaut, wobei die Position der Stelle in der Position 3640 der Nukleotidsequenz des HCV vom Genotyp 1a ist. Schließlich wurde dieses Fragment zwischen den Restriktionsstellen SpeI und Bst1107I integriert. Das resultierende Plasmid pG/Neo 2-5B wurde erhalten. Dieses Plasmid enthält die 5' und 3' nicht-kodierenden Regionen, einen Teil der Sequenz, die für das Kapsidprotein C kodiert, die Sequenzen des Neomycin-Resistenzgens und die Gesamtheit der Sequenzen, die für die Region der nicht strukturellen Proteine des HCV kodieren. Es scheint in diesem Konstrukt, dass der Kapsid-Teil mit dem Neomycin-Resistenzgen und mit dem NS2-Produkt des HCV fusioniert ist. Die anderen Proteine des HCV werden normal durch Spaltungen produziert, die durch die zwei viralen Proteasen des HCV erfolgen. Da die Vero/G418-Zellen gegen Neomycin resistent sind, wurde das Plasmid pG/Neo 2-5B verwendet, um die Sequenzen, die für Neomycin kodieren, durch die Sequenzen zu substituieren, die für das Hygromycin B-Resistenzgen kodieren. Ein DNA-Fragment, das die Hygromycin B-Resistenz-Sequenzen sowie die Sequenzen der Asp718- und XbaI-Restriktionsstelle, die am 5'- bzw. 3'-Ende lokalisiert sind, enthält, wurde amplifiziert. Die XbaI-Stelle ist mit der SpeI-Stelle kompatibel, aber nach Hybridisierung werden die SpeI- und Xba1-Stelle nicht erzeugt. Die singuläre SpeI-Stelle verschwindet aus der Sequenz. Dieses DNA-Fragment wurde so zwischen der Asp718- und SpeI-Stelle des Plasmids pG/Neo 2-5B integriert. Nach Transformation und Selektion wurde ein pG/Hygro 2-5B-Plasmid erhalten, in dem die Sequenzen, die für das Neomycin-Resistenzgen kodieren, durch jene ersetzt wurden, die für das Hygromycin B-Resistenzgen kodieren, wobei die anderen Sequenzen in allen Punkten konserviert wurden.
2. Transkription der komplementären DNA des HCV in RNA
Transkription für die Transfektion: Für die Produktion von RNA in großem Maßstab wurde das Promega-Kit (Ribo MAX^TM Large Scale RNA Production System-T7) verwendet. Die DNA, die dem Replikon entspricht, wurde vorher linearisiert und die Enden „gebluntet". An das 3'-Ende des Genoms des HCV wurde eine Restriktionsstelle gebracht, damit nach dem Verdau durch das Restriktionsenzym Xba1 und Behandlung mit Mungobohnennuklease (Biolabs) (Kowalski et al., 1976) die überschüssigen Basen verdaut sind, was ab da dem authentischen Ende der RNA des HCV entspricht. Die Behandlung erfolgt mit 5 μg DNA. Nach Phenol- und Chloroform-Extraktion der DNA-Zubereitung wird die DNA durch Präzipitation mit Ethanol erhalten. Einmal zentrifugiert, wird die DNA in sterilem Wasser aufgenommen, das mit DEPC (Diethylpyrocarbonat) behandelt wurde, um jede Spur von RNase zu vermeiden. Die DNA kann dann in RNA transkribiert werden. Also werden in einem sterilen Eppendorfröhrchen 20 μl DNA (ungefähr 5 μg) supplementiert durch: 20 μl Wasser, behandelt mit DEPC, 20 μl 5 × Transkriptionspuffer (Hepes-KOH (pH 7,5) 400 nM, MgCl₂ 120 mM, Spermidin 10 mM, DTT 200 mM), 30 μl rNTPs (25 mM ATP, CTP, GTP, UTP), 10 μl Enzym-Mix (T7) (Promega), und die Mischung wird 2 bis 4 Stunden bei 37°C inkubiert. Sobald die DNA durch die T7 RNA-Polymerase transkribiert wurde, wird die DNA-Matrize durch 5 μl RQ1-DNase (RNase-frei) (Promega) für 15 bis 30 Minuten bei 37°C abgebaut. Es wird eine Phenol/Chloroform-Extraktion durchgeführt und die wässrige Lösung, die die RNA enthält, wird durch Zugabe von 1/10 3M Natriumacetat und 2 Volumina Ethanol präzipitiert. Nach einer Nacht wird zentrifugiert, um das RNA-Pellet zu gewinnen. Dieses wird dann mit einer 70%igen Ethanollösung gewaschen, dann leicht auf dem Tisch getrocknet, schließlich mit sterilem Wasser, das mit DEPC behandelt wurde, resolubilisiert. Die RNA wird anschließend bei –80°C gelagert.
Transkription für radioaktive Markierung: Es wird ein Promega Transkriptions-Kit verwendet. Die als Matrize für die Produktion radioaktiver RNA verwendete DNA stammt von DNA, die nach der PCR-Methode amplifiziert wurde und worin die Primer in 5'- oder 3'-Position die Sequenzen der Promotoren für die Bakteriophagen T7 oder SP6 enthalten, was die Produktion von RNA negativer oder positiver Polarität erlaubt, je nachdem, ob angestrebt wird, RNA positiver oder negativer Polarität von Replikons zu charakterisieren. Es ist nicht notwendig, die DNA, die mittels PCR produziert wurde, mit einem Restriktionsenzym zu linearisieren, da die Enden stumpf sind. Die DNA-Fragmente werden jedoch auf Low-Melting-Gel (Agarose-Gel mit niedrigem Schmelzpunkt) gereinigt, ehe sie transkribiert werden. 3 μl DNA (1-2 μg entsprechend) werden supplementiert durch 4 μl 5×-Transkriptionspuffer (Tris-HCl (pH 7,9 bei 25°C) 200 mM, NaCl 50 mM, MgCl₂ 30 mM, Spermidin 10 mM), 2 μl einer Lösung von DTT 100 mM, 0,5 μl RNasin (Inhibitor) (40 U/μl) (Blackburn und Moore, 1982), 4 μl einer Mischung von rNTPs (rATP, rUTP und rGTP, jeweils 2,5 mM) bei der rCTP weggelassen wurde, 5,5 μl Wasser, das mit DEPC behandelt wurde, 1 μl des Enzyms T7 Polymerase (20 U/μl) und 50 μCi lyophilisiertes dCTP αP³². Die DNA wird 1 Stunde bei 37°C transkribiert. Dann wird die DNA abgebaut, wie zuvor beschrieben, und die RNA wird präzipitiert und in Wasser, das mit DEPC behandelt wurde, resolubilisiert.
3. Elektroporationstechnik
Diese Technik wurde nach der Vorgehensweise ausgeführt, die von Liljeström et al. (1991) beschrieben wurde. Die für die Elektroporationen verwendete Vorrichtung ist ein BioRad-Produkt (BioRad Gene Pulsar mit Puls-Controller). Die Vero/G418-Zellen wurden auf 100-mm-Schalen gesät, in ein DMEM-Medium, das durch 10% fetales Kälberserum (FCS) supplementiert war, und sie wurden in Kultur belassen, bis eine Konfluenz von 80 bis 90% erreicht war. Es ist anzumerken, dass 5·10⁶ Zellen für jede Elektroporation notwendig sind. Folglich wird die Zahl der Schalen berechnet, um eine ausreichende Menge an Zellen verfügbar zu haben. Die Zellen, die elektroporiert werden sollen, werden mit einer PBS-Lösung gewaschen und werden dann mithilfe einer Trypsin-Lösung, die EDTA enthält, abgelöst. Diese Lösung wird entfernt, und nach einigen Minuten werden die Zellen, die sich ablösen, in DMEM/10% FCS Medium aufgenommen und 6 Minuten bei 800 UpM zentrifugiert. Die Zellen werden dann wieder aufgenommen und wieder gewaschen in einer PBS-Lösung, nach Zentrifugation wird das Zellpellet in einem Volumen PBS-Medium aufgenommen, sodass die End-Zellkonzentration 1·10⁷ Zellen/ml ist. Diese werden in Eis gelagert. In einer 0,2-mm-Elektroporationsküvette der Marke BioRad werden 500 μl der Zellsuspension zu 1·10⁷ Zellen/ml mit 30 μg RNA (RNA des Replikons) in Kontakt gebracht, und der gleiche Behälter wird in die Elektroporationsvorrichtung gebracht, die auf 1,75 kV und 25 μFD kalibriert wurde, während der Widerstandsregler auf der Unendlich-Position (∞-Knopf der Vorrichtung) war. Die Zellen empfingen so zwei Elektroschocks. Der Prozentsatz der Zellen, die diese Schocks überleben, ist 20 bis 30%. Nach diesen Schocks werden die Zellen in DMEM 10% FCS Medium aufgenommen und 10 Minuten bei Raumtemperatur gehalten, bevor sie erneut auf eine 100-mm-Schale gesät werden. Dann werden alle Schalen in einen CO₂-Inkubator bei einer Temperatur von 37°C gebracht. Sie sind dann bereit, um dem Hygromycin B-Selektionsdruck ausgesetzt zu werden.
4. Selektion der Hygromycin B-resistenten Zellen.
Die Vero/G418-Zellen, die in Gegenwart der RNA des HCV elektroporiert wurden und das Hygromycin B-Resistenzgen enthielten, wurden für einen zunehmenden Druck in Gegenwart von Hygromycin B verwendet. Nachdem sie, wie zuvor beschrieben, elektroporiert wurden, werden die Zellen anfangs auf 100-mm-Schalen gebracht. Nach 48 Stunden werden die Zellen einem niedrigen Hygromycin B-Druck von 100 μg/ml, dann 200 μg/ml ausgesetzt, bis sie Konfluenz erreichen. Dann werden sie durch die Wirkung der Trypsin/Versen-Mischung abgelöst und sie werden in 60-mm-Schalen transferiert, während der anfängliche Selektionsdruck beibehalten wird. Die Zellen werden für 5 bis 10 Passagen (variabel) bei dieser Konzentration gehalten, um die Zellpopulation zu stabilisieren. Die Subkultivierung erfolgt zuerst ungefähr alle 3 Wochen mit einer 1/2-Verdünnung der Zellen und einem Wechsel des Mediums alle 3 oder 4 Tage. Nach der Stabilisierung des Zellwachstums (Subkultivierung durchschnittlich alle 10 bis 15 Tage, wobei die Beobachtungen auch den allgemeinen Zustand der Zellen betreffen) werden sie zunehmenden Hygromycin B-Drücken ausgesetzt, in der Größenordnung von 50 bis 100 μg/ml, entsprechend den Umständen. Die Stabilisierung der Zelle geschieht oft nach 5 Passagen unter dem definierten Druck. Die gesamte RNA der Zellen, die unter Selektionsdruck wachsen, wurde extrahiert und einer RT-PCR (PCR mithilfe von Retrotranskriptase) in den 5' und 3' nicht-kodierenden Regionen unterworfen. Da sie sich als positiv erwiesen, wurde der Selektionsdruck aufrechterhalten und allmählich gesteigert. Studien durch indirekte Immunfluoreszenz erlaubten jedoch die Detektion der Proteine des HCV nicht. Die Detektion durch Immunfluoreszenz war nur für Zellen möglich, die unter Hygromycin B-Drücken von mehr als 600 μg/ml wachsen. Die Zellen wurden auch bei mittleren Selektionsdrücken eingefroren. Zellen, die unter einem Hygromycin B-Druck von 1000 μg/ml wachsen, sind derzeit verfügbar.
5. Zellen und Erhaltungsbedingungen.
Vero/G418/Replikon HCV-Zellen: Die Zellen werden in einer dünnen Schicht in 75-cm²-Flaschen und in einem DMEM-Medium, das 10% fetales Kälberserum (FCS) und Hygromycin B enthält, kultiviert. Die Hygromycin B-Konzentration hängt von der Selektion der Zelle ab. Letztere variiert von 200 bis 1000 μg/ml. Die 75-cm²-Flaschen werden normal mit 5·10⁶ Zellen gesät, was einer Verdünnung zur Hälfte entspricht, und sie werden 10 bis 15 Tage entsprechend ihrer Dichte gehalten. Zum Zeitpunkt ihrer Passage wird das Medium dieser Zellen entfernt und die Zellen werden zweimal mit einem Trypsin/Versen-Medium (NaCl 8 g/l, KCl 0,4 g/l, Dextrose 1 g/l, NaHCO₃ 0,58 g/l, kristallisiertes Trypsin 0,045 g/l, Versen 0,2 g/l) gewaschen. Die Zellen lösen sich nach einigen Minuten (2 bis 5 Minuten) sehr schnell ab. Diese Zellen werden dann in DMEM-Medium aufgenommen, das die geeignete Hygromycin B-Konzentration enthält, und die Zellen werden in zwei Flaschen verteilt. Man lässt die Zellen sich auf der Flasche fixieren und etablieren und das Medium wird bis 3 oder 4 Tage danach nicht gewechselt, dann jeden zweiten Tag, bis die gewünschte Zelldichte (8 bis 10·10⁶ Zellen/75-cm²-Flasche) erreicht ist.
6. Analyse der Proteine durch indirekte Immunfluoreszenz
Die Vero/G418-Zellen werden auf Glasplättchen in Abwesenheit von Hygromycin B kultiviert und die Vero/G418+Replikon-Zellen in Gegenwart von Hygromycin B (800 μg/ml). Nach 3-tägiger Kultur werden die Zellen in einer PBS-Lösung fixiert, die 4% Paraformaldehyd enthält. Die mit Paraformaldehyd fixierten Zellen werden dann mit einer Triton-X-100-Lösung behandelt, um die intrazelluläre Markierung zu begünstigen. Die Zellen werden dann mit spezifischen Antikörpern in Kontakt gebracht, die gegen verschiedene Proteine des HCV gerichtet sind, und in TBS (Tris-gepufferte Kochsalzlösung: 20 mM Tris-HCl pH 7,5; 137 mM NaCl; 2 mM EDTA) verdünnt. Diese Antikörper sind entweder monoklonale Antikörper, die gegen das Kapsid-, NS3- oder NS5-Protein gerichtet sind und in Mäusen gemacht werden, oder polyklonale Antikörper, die das NS4 oder NS5A oder B Protein erkennen und in Kaninchen gemacht werden, oder Anti-HCV-Antikörper, die von Patienten stammen, die mit HCV infiziert sind. Nach mehreren Spülungen werden die Zellen dann inkubiert mit einem sekundären Antikörper, der Rhodamin-gekoppelt (Anti-Maus-Immunglobuline, hergestellt in Kaninchen; DAKO) oder Fluorescein-gekoppelt (Anti-Maus-Immunglobuline, hergestellt in Eseln; Jackson) ist, oder sekundären Antikörpern, die Rhodamin- oder Fluorescein-gekoppelt sind und die Kaninchen-Immunglobuline oder humanen Immunglobuline erkennen. Die so markierten Zellen werden dann mit einem Fluoreszenzmikroskop (Zeiss) betrachtet und fotografiert (siehe 2).
7. Reinigung der RNA.
a) Nach der Methode, die im Promega-Kit beschrieben ist (SV Total RNA Isolation System Kit).
Die RNA-Reinigungen können mit 1,5·10³ bis 5·10⁶ Zellen durchgeführt werden. Die Extraktionen werden mit dem Promega-Kit (SV Total RNA Isolation System) durchgeführt und gemäß dem Promega-Manual beschrieben. Für adhärente Zellen wird das Medium entfernt und die Zellen werden zweimal mit einer Trypsin/Versen-Lösung gewaschen, sobald die Zellen abgelöst wurden. Sie werden dann in einem Kulturmedium aufgenommen und 5 Minuten bei 300 g zentrifugiert. Das Medium wird dann abgesaugt und die Zellen werden in einer PBS-Lösung aufgenommen und wie zuvor beschrieben rezentrifugiert. Das Medium wird abgesaugt und das Zellpellet kann entweder für die restlichen Arbeitsgänge behandelt oder bei –80°C gelagert werden. Die Reihenfolge des Protokolls entspricht der Beschreibung der Methode von Promega: das Zellpellet wird in 175 μl der Lyselösung (SV RNA-Lysepuffer, mit dem Kit geliefert: 4M GTC (Guanidinisothiocyanat); 10 mM Tris-HCl pH 7,5; 0,97% β-Mercaptoethanol) aufgenommen. Das Pellet wird dann dispergiert, indem es mehrmals pipettiert wird. Wenn die Zellkonzentration zwischen 1·10⁶ und 5·10⁶ Zellen ist, ist es erforderlich, die DNA zu brechen, indem man sie durch eine sehr feine Nadel schickt. 350 μl SV RNA-Verdünnungspuffer (Promega) werden dann zu den 175 μl der Lyselösung zugegeben. Es wird durch 3- bis 4-maliges Umkehren des Röhrchens gemischt und das Röhrchen wird dann in ein Wasserbad gebracht, das auf 70°C gebracht ist, und 3 Minuten inkubieren gelassen (diese Zeit darf nicht überschritten werden, damit kein Abbau der RNA riskiert wird). Es wird 10 Minuten bei 12000-14000 g bei 20-25°C zentrifugiert, und die Röhrchen, die mit dem Kit bereitgestellt werden, werden für die restlichen Arbeitsgänge verwendet. Außerdem ist es nötig, jedes Röhrchen für jede verwendete Präparation zu identifizieren und Handschuhe zu tragen, um RNase-Kontaminationen zu vermeiden. Die Lyselösung wird in ein anderes Zentrifugenröhrchen transferiert, und es muss verhindert werden, dass das Pellet wieder suspendiert wird. 200 μl Ethanol bei 95°C werden zu der wässrigen Lösung hinzugefügt. Es wird durch drei- oder viermaliges Pipettieren gemischt, dann wird diese Lösung auf eine Mikrosäule transferiert, die in dem Zentrifugenröhrchen enthalten ist, und eine Minute bei 12000-14000 g zentrifugiert. Die Mikrosäule wird aus dem Röhrchen entfernt, die in dem Sammelröhrchen vorhandene Flüssigkeit wird entfernt und die Mikrosäule wird dann wieder in das Originalröhrchen gebracht. 600 μl der RNA-Waschlösung werden auf die Mikrosäule gebracht (RNA-Waschlösung: 60 mM Kaliumacetat, 10 mM Tris-HCl pH 7,5 und 60% Ethanol). Es wird 1 Minute bei 12000-14000 g zentrifugiert. Das Sammelröhrchen wird wieder geleert und wie zuvor zurückgebracht. Für jede zu reinigende Präparation wird die folgende Lösung bereitet (und in dieser Reihen folge): 40 μl Gelber Puffer (22,5 mM Tris-HCl pH 7,5; 1,125 M NaCl; 0,0025% Gelber Farbstoff (Promega) (w/v), 5 μl 0,09M MnCl₂ und 5 μl Enzym DNase I. Die Mischung darf nicht gevortext werden, sondern muss langsam gemischt werden. Das Ganze wird in Eis gehalten, und wenn das Enzym aufgetaut werden muss, muss es auf Eis gelassen werden. 50 μl dieser Lösung werden auf die Membrane des Spin-Basket gebracht. Es ist nötig sicherzustellen, das die Lösung die ganze Membran bedeckt. Das wird 15 Minuten bei 20-25°C wirken gelassen (Tischtemperatur). Nach dieser Inkubationsdauer werden 200 μl einer Lösung zugesetzt, die die Enzymaktivität stoppt (SV DNase-Stopp-Lösung) (2M Guanidinisothiocyanat, 4 mM Tris-HCl pH 7,5 und 57% Ethanol). Die Mikrosäule wird 1 Minute bei 12000-14000 g zentrifugiert. 600 μl einer RNA-Waschlösung (SV RNA-Waschlösung) werden zugesetzt, und es wird 1 Minute bei 12000-14000 g zentrifugiert. 250 μl der RNA-Waschlösung werden zugesetzt. Es wird 2 Minuten bei maximaler Geschwindigkeit zentrifugiert. Ein Elutionsröhrchen des anfänglichen Kits wird für jede Präparation entnommen, und die Mikrosäule wird in ein anderes Zentrifugenröhrchen gebracht. 100 μl Wasser, das mit DEPC behandelt wurde, werden auf die Membran der Mikrosäule gebracht. Es wird 1 Minute bei 12000-14000 g zentrifugiert. Die RNA-Lösung ist im Elutionsröhrchen enthalten und wird bei –80°C gelagert.
b) Für größere Mengen RNA wird das Promega-Kit verwendet (Total RNA isolation system, Gesamt-RNA-Isolationssystem).
Die hier angegebenen Werte sind für 1·10⁷ Zellen zu verwenden. Die Präparation der Zellen erfolgt auf die gleiche Weise wie zuvor beschrieben. Das Prinzip der Extraktion der RNA basiert auf der Methode, die von Chomczynski und Sacchi (1987) beschrieben wurde und die Guanidiumthiocyanat verwendet. Das Zellpellet wird in 1,2 ml einer Denaturierungslösung aufgenommen, die enthält: 26 mM Natriumcitrat (pH 6,8), 0,5% N-Laurylsarcosin, 0,125 M β-Mercaptoethanol und 4M Guanidinthiocyanat. Die Lösung wird in zwei Eppendorfröhrchen getrennt, die also 600 μl der Lösung enthalten. Dann werden in jedes Röhrchen 60 μl 2M Natriumacetat gebracht und das Ganze wird langsam gemischt, indem die Röhrchen umgedreht werden (4 bis 5 Mal). Diese Lösung wird dann mit 600 μl Phenol:Chloroform:IAA (Isoamylalkohol) extrahiert und die Röhrchen werden für 15 Minuten in Eis gebracht. Nach dieser Zeit wird die wässrige Lösung durch Zentrifugation der Röhrchen für 30 Minuten bei 14000 UpM bei 4°C in einer Eppendorfvorrichtung gewonnen. Zu der wässrigen Lösung muss dann ein äquivalentes Volumen Isopropanol zugegeben werden, und nachdem gemischt wurde, wird das Ganze 15 Minuten bei –20°C gelassen. Es wird 30 Minuten bei 14000 UpM bei 4°C zentrifugiert, um das DNA-Pellet zu erhalten, der mit einer 75%igen Ethanollösung gewaschen wird. Es wird erneut zentrifugiert, das Ethanol wird entfernt, und das Pellet wird dann leicht trocknen gelassen, es wird in 50 μl RNase-freiem Wasser (behandelt mit DEPC) aufgenommen. Die gereinigten RNA-Lösungen können gemeinsam gesammelt werden. Die RNA werden dann bei –80°C gelagert.
c) Reinigung der RNA durch Cäsiumtrifluoracetat: CsTFA^TM (Pharmacia-Produkt)
Gesamt-RNA-Extrakte, die ausgehend von Zellen oder in bestimmten Fällen von Biopsien nach der klassischen Methode mit Guanidiumthiocyanat präpariert wurden, werden auch durch Zentrifugation auf Cäsiumtrifluoracetat (CsTFA) nach der Methode, die von Zarlenga und Gamble (1987) beschrieben wurde, gereinigt. Dies ermöglicht, dass eine RNA-Präparation erhalten wird, die frei von DNA, Proteinen und in bestimmten Fällen frei von Glykogen ist, für RNA, die aus Hepatozyten isoliert wurden. Die zuvor durch Guanidiumthiocyanat isolierte RNA wird dann auf CsTFA (Pharmacia) gereinigt. Die RNA wird in einer Lösung von CsTFA mit einer Dichte von 2,0 g/ml aufgenommen, um letztlich bei einer Konzentration von 1,65 g/ml zu sein, und BET (Ethidiumbromid) bei einer Konzentration von 0,5 μg/ml enthaltend. Die Lösung, in 5-ml-Polyallomer-Röhrchen (Beckman) enthalten, wird dann in einem SW 55 Ti-Rotor (Beckman) 44 Stunden bei 15°C und 200000 g zentrifugiert. Nach dieser Zentrifugationszeit wird die RNA entfernt und aus einer 0,3 M Natriumacetat-Lösung und aus 2 Volumina Ethanol bei –20°C während der Nacht präzipitiert. Dann wird zentrifugiert, um das RNA-Pellet zu erhalten, dieses Pellet wird mit 70%igem Ethanol gewaschen, und das Pellet wird getrocknet und die RNA wird in mit DEPC behandeltem Wasser aufgenommen. Andere Reinigungen sind nicht mehr erforderlich. Die so präparierte RNA kann für Amplifizierungen oder für Hybridisierungen auf Filtern verwendet werden.
8. Hybridisierung der Gesamt-RNA von Zellen, die das Replikon enthalten, durch radioaktive Sonden.
Präparation der Filter: Die Denaturierung der RNA erfolgt durch eine Glyoxal-Lösung, nach der Denaturierung werden dann die RNA durch Ansaugen auf Nitrocellulosefiltern fixiert (verwendete Vorrichtung BioDot SF von BioRad). Die wie zuvor beschrieben gereinigten RNA werden wie folgt behandelt: 22 μl RNA werden mit 9 μl einer 100 mM Natriumphosphat-Lösung (pH 7,0), 45 μl DMSO (Dimethylsulfoxid (Sigma)) und 13,2 μl einer 6M Glyoxal-Lösung (Sigma) gemischt. Das Ganze wird gemischt und zentrifugiert, um die gesamte Flüssigkeit zu sammeln. Die von der RNA und der Denaturierungslösung gebildete Mischung wird eine Stunde bei 50°C inkubiert, dann wird die Probe in Eis gekühlt. Zwei Volumina einer 20×SSC-Lösung (3 M NaCl; 0,3 M Natriumcitrat pH 7,0) werden dann zu jeder Probe vor ihrer Passage auf die Nitrocellulosemembran zugegeben, die im Voraus in einer 10×SSC-Lösung (1,5 M NaCl; 0,15 M Natriumcitrat pH 7,0) behandelt wird. Um verbleibendes Glyoxal zu entfernen, passiert das Filter eine auf 95°C erhitzte Lösung: 20 mM Tris-HCl, pH 8,0; 1 mM EDTA, und die unter leichtem Rühren auf Raumtemperatur gelassen wird. Jedes Filter wird dann für 1 bis 2 Stunden unter Vakuum in einen Ofen gebracht (bei 80°C).
Prähybridisierung und Hybridisierung der Filter: Das Filter wird in einen Kunststoffbeutel gebracht und die Prähybridisierungslösung (10 mM EDTA; 7% SDS; 0,5 M Na₂HPO₄, pH 7,2) wird zugegeben. Der Kunststoffbeutel wird verschlossen und das Ganze wird 5 Minuten bei 65°C in Prähybridisierung gelassen. Dann wird eine Ecke des Kunststoffbeutels abgeschnitten und die Prähybridisierungslösung wird entfernt. Die gleiche Lösung wird dann in den Beutel mit der radioaktiven Sonde bei 10⁶ cpm/ml gegeben. Der Inhalt wird dann 4 bis 24 Stunden bei 65°C in Hybridisierung gelassen.
Waschen der Filter: Es werden verschiedene Waschungen durchgeführt: zuerst 2 Waschungen für 5 bis 10 Minuten mit einer Mischung, die eine 2×SSC-Lösung (0,3 M NaCl; 0,03 M Natriumcitrat pH 7,0) und 0,1 % SDS enthält. Dann werden 2 Waschungen bei 50°C für 15 Minuten jeweils mit einer Mischung durchgeführt, die eine 0,1×SSC-Lösung (1,5·10^–2 M NaCl; 1,5·10^–3 M Natriumcitrat pH 7,0), 0,1% SDS enthält.
III- Verfahren zur Produktion von HCV durch Infektion
Dieses Verfahren ermöglich es zu prüfen, ob die Zellen, die das Replikon enthalten, HCV-Partikel durch Infektion produzieren können.
Derzeit gibt es kein Zellsystem, das in der Lage ist, das Hepatitis-C-Virus zu produzieren. Das Einführen von Zellen, die in der Lage sind, das Genom des HCV zu replizieren, involviert die Selektion von Faktoren, die auch die Vermehrung des Virus fördern. Wenn solche Zellen einmal eine Virusamplifikation ermöglicht haben, kann die Reinigung des Virus ins Auge gefasst werden sowie seine Inaktivierung für Impftests.
Um Zellen ausgehend von Stocks des Virus des Stamms H (Feinstone et al., 1981) (das ist der gleiche Stamm, wie er zum Klonieren der gesamten cDNA des HCV verwendet wurde) oder eines Virus, das von infizierten Patienten stammt, zu infizieren, werden Zellen vom Vero/G418-Typ (oder Vn5), Zellen vom Typ Vero/G418+Replikon unter Hygromycin B-Druck oder Zellen Vero/G418+Replikon ohne Hygromycin B-Druck verwendet. Diese Zellen werden in einem normalen Medium (DMEM/10% FCS) und ohne Hygromycin B gehalten, um die Wirkung des Replikons zu attenuieren. An dem Ausgangsvirus wird ein RT-PCR durchgeführt, was die Quantifizierung des Virusmaterials (Vorhandensein von RNA) ermöglicht, ohne gleichzeitig seinen infektiösen Charakter zu bestimmen. Die Zellen werden dann wie oben erwähnt durch die Viren infiziert. Die Zellen werden gehalten und zu verschiedenen Zeiten untersucht, um zu bestimmen, ob es eine Amplifizierung des genetischen Materials des HCV gibt. Dazu werden Probenahmen von Zellen durchgeführt und die gesamte RNA dieser Zellen wird extrahiert, um die RNA des HCV mittels RT-PCR oder durch Hybridisierung der RNA auf Filter zu quantifizieren. Ziel ist es außerdem zu lernen, on das Virus in der Lage ist, die Zellen zu lysieren oder ob es in der Zelle bleibt. Wenn es zu Zelllyse kommt, ist es ausreichend, die Zelllysate aufzunehmen, um andere Zellen zu infizieren. Die Quantifizierung des Virus kann dann nach verschiedenen in der Virologie verwendeten Methoden erfolgen. Wenn die Virusinfektion nicht zu einer Lyse der Zellen führt, kann außerdem die Vermehrung des HCV durch indirekte Immunfluoreszenz mithilfe von Antikörpern, die gegen Proteine des HCV gerichtet sind, erfolgen.
IV- Test der Infektivität der vollständigen cDNA des HCV, rekonstituiert mit den Sequenzen des Replikons, mittels Transfektion von Zellen.
Es ist nötig, die Sequenzen der funktionellsten Replikons zu reklonieren, d.h. jener, die die effizienteste Replikation zeigten, indem die Zelle sehr hohen Konzentrationen an Hygromycin B widerstehen konnte. Die RNA dieser Zellen werden nach den oben beschriebenen Methoden extrahiert. Die RNA der Replikons wird mittels RT-PCR in einem einzigen Schritt amplifiziert, damit die Gesamtheit der Variationen dem gleichen Molekül des Replikons entspricht. Die DNA wird sequenziert und die aus der Transkription der DNA resultierende RNA wird erneut transfiziert, um das Replikationsvermögen in den Zellen zu verifizieren. In der so erhaltenen DNA-Sequenz sind die Sequenzen, die dem Hygromycin B-Resistenzgen entsprechen, durch die Sequenzen substituiert, die für die Strukturproteine des HCV kodieren. Diese Sequenzen werden in einen Vektor kloniert, um in der Lage zu sein, RNA durch Transkription aus DNA zu produzieren. Diese cDNA dienen zur Produktion von RNA, um durch Elektroporation (siehe oben) die Vero/G418(oder Vn5) Zellen, die Vero/G418+Replikon-Zellen unter Hygromycin B-Druck oder die Vero/G418+Replikon-Zellen ohne Hygromycin B-Druck zu transfizieren. Die Identifikationstests werden dann wie oben beschrieben durchgeführt.
V- Verfahren zum Screening in Bezug auf Anti-HCV-Mittel
Da das Zellwachstum unter hohen Hygromycin B-Drücken von der Effizienz der Replika tion des Replikons des HCV abhängt, wurden verschiedene antivirale Mittel des HCV getestet, die entweder direkt oder indirekt die Replikation des HCV hemmen können.
Die Vero/G418+Replikon-Zellen und die Vero/G418(oder Vn5)-Kontrollzellen werden parallel der Wirkung verschiedener antiviraler Mittel und variierenden Konzentrationen ausgesetzt. Jede Wirkung auf die Replikation des Replikons hat notwendigerweise eine Auswirkung auf die Synthese der RNA des HCV und somit auf die Synthese der Proteine. Die gesamten RNA der Zellen, die der Wirkung der antiviralen Mittel ausgesetzt wurden, werden extrahiert, dann auf Filtern fixiert und schließlich mit Sonden hybridisiert, die für das HCV spezifisch sind. Da die Synthese der Proteine durch die Reduktion bei der Replikation beeinflusst wird, wird eine Markierung der Proteine durchgeführt und die Expression der verschiedenen Proteine wird durch Immunpräzipitation mithilfe von Antikörpern, die gegen für HCV spezifische Proteine gerichtet sind, untersucht.
Es kann auch ein Replikon verwendet werden, das in seiner Sequenz die Sequenzen enthält, die für GFP kodieren. Dazu wird ein GFP mit einer kurzen Halbwertszeit gewählt (Clontech). Die Regeneration dieses Proteins hängt von der Syntheserate ab, aber auch von der Replikation des Replikons. Inhibitoren, die auf die Replikation des HCV wirken, beeinflussen die Synthese der Proteine und folglich die des GFP-Proteins. Der Vorteil dieses Ansatzes besteht darin, dass es nicht nötig ist, die Zellen zu fixieren, um das GFP mittels Immunfluoreszenz zu detektieren, da es die Eigenschaft hat, bei bestimmten Wellenlängen natürlich zu fluoreszieren. Die Zellen, die das Replikon und das GFP enthalten und der Wirkung antiviraler Mittel ausgesetzt werden, können zu verschiedenen Zeitpunkten untersucht werden. Es können Fotos angefertigt werden und die Immunfluoreszenz des GFP kann dann analysiert werden. Jede Reduktion bei oder jedes Verschwinden von Immunfluoreszenz des GFP ist ein Beweis für die Wirkung der antiviralen Mittel des HCV.
VI- Untersuchung der Prenylierung des NS5A-Proteins des HCV vom Genotyp 1a und 1b:
Für diese Untersuchung wurden verschiedene rekombinante Vakzinviren verwendet. Sie exprimieren die Gesamtheit des NS5A-Proteins des HCV vom Genotyp 1a oder Genotyp 1b. Für letzteren Genotyp wurden die Sequenzen, die für das NS5A-Protein kodieren, von zwei Patienten, die mit dem HCV vom Genotyp 1b infiziert waren, amplifiziert. Bestimmte Konstrukte des NS5A-Proteins des HCV enthalten Deletionen der Proteinsequenz, die sich am aminoterminalen Teil des Proteins befinden. Diese verschiedenen re kombinanten Viren entsprechen: vvNS5A.1a dl1 (del 1973-2100 aa), vvNS5A.1a dl2 (del 1973-2073 aa) und vvNS5A.1a dl3 (del 1973-2001 aa). Die Aminosäuren, die im NS5A-Protein deletiert sind, sind in Klammern angegeben. Für eine höhere Genauigkeit wurde die Zahl, die der Position der Aminosäure in dem Polyprotein von HCV entspricht, beibehalten. Somit entspricht del 1973-2100 aa einer Deletion der Peptidsequenz zwischen den Aminosäuren 1973 und 2100 des Polyproteins des HCV. Diese Deletion des Proteins betrifft den aminoterminalen Teil des NS5A-Proteins. Außerdem wurde auch ein rekombinantes Vakzinvirus, vvNS2-5B, das die Proteine NS2 bis NS5B des HCV exprimiert, d.h. NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A und NS5B, verwendet.
Die so infizierten Zellen werden verwendet, um metabolische Markierungen entweder in Gegenwart von (H³) Mevalonsäure oder in Gegenwart von S³⁵-Methionin durchzuführen. Die für diese Markierungen verwendeten Vorgehensweisen sind nachstehend detailliert erläutert.
a) (H³) Mevalonsäure-Markierung der Proteine:
Vero/G418 (Vn5) Zellen wurden auf Platten mit 6 Vertiefungen (Costar) bei 10⁶ Zellen/Vertiefung und in ein DMEM-Medium (Dulbecco's modifiziertes Eagle-Medium), das 10% fetales Kälberserum (FCS) enthielt, gesät. Diese Zellen werden für 24 Stunden in einen CO₂-Inkubator bei 37°C gebracht. Sie werden dann mit dem vTF7.3-Virus (Fuerst et al., 1986) allein infiziert oder mit diesem Virus und einem der zuvor beschriebenen rekombinanten Viren, die das NS5A-Protein des HCV exprimieren, co-infiziert, jeweils bei einer m.o.i. von 5 PFU/Zelle. Nach einer Stunde bei 37°C wird das Inokulum entfernt und durch DMEM-Medium ersetzt (Dulbecco's modifiziertes Eagle-Medium), das 10% fetales Kälberserum und 100 μg/ml Mevastatin enthält, für eine 4-stündige Vorbehandlung, auf die folgend 100 μCi/ml (H³) Mevalonsäure zu dem Medium zugegeben werden. Nach 18 Stunden nach der Infektion werden die Zellen mit DMEM-Medium gewaschen, das Medium wird entfernt und die Zellen werden mit einer PBS-Lösung gewaschen, bevor sie mit einem Puffer lysiert werden, der enthält: 50 mM Tris-HCl pH 7,5; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA; 0,5% NP40; 0,5% Na-Desoxycholat; 0,2% SDS; Aprotinin 10 μg/ml; TPCK und PMSF, 20 μg/ml. Das NS5A-Protein des HCV wird dann aus diesem Lysat mithilfe eines polyklonalen Kaninchen-Serums, das gegen das NS5A-Protein gerichtet ist, nach der bereits beschriebenen Methode (Wychowski et al., 1985) immunpräzipitiert und das Präzipitat wird mittels SDS-PAGE analysiert. Das Ergebnis dieser Markierungen ist in den 3A, 3B, 3C und 3D angegeben. Die Mevalonsäure-Markierungen sind angezeigt durch: Mev.H³. In den 3A, 3B und 3C zeigen die Linien 1 das Ergebnis, das mit einem Lysat erhalten wurde, das von Zellen stammt, die durch das rekombinan te Virus vTF7.3 infiziert waren. Es handelt sich in diesem Fall um eine Kontrolle.
b) (S³⁵)-Markierung der Proteine:
Vero/G418 (Vn5) Zellen wurden mit den gleichen rekombinanten Viren wie zuvor erwähnt infiziert. Nach einer Stunde des Kontakts bei 37°C, wird das Inokulum entfernt und durch DMEM-Medium ersetzt, das 5% fetales Kälberserum enthält. 16 Stunden nach der Infektion werden die Zellen mit DMEM-Medium ohne Methionin gewaschen, 1 bis 2 Stunden in diesem Medium inkubiert und dann 3 Stunden mit 100 μCi/ml (³⁵S) Methionin (³⁵S-Protein Labeling Mix (NEN), Markierungslösung) markiert. Danach wird das Medium entfernt und die Zellen werden dann mit PBS gewaschen und schließlich mithilfe eines Lysepuffers lysiert, der enthält: 50 mM Tris-HCl pH 7,5; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA; 0,5% NP40; 0,5% Na-Desoxycholat; 0,2% SDS; Aprotinin 10 μg/ml; TPCK und PMSF, 20 μg/ml. Das NS5A-Protein des HCV wird dann aus Lysaten mithilfe von polyklonalem Kaninchen-Serum, wie von Wychowski et al. (1985) beschrieben, immunpräzipitiert und das Präzipitat wird mittels SDS-PAGE analysiert. Die S³⁵-Methionin-Markierungen sind in den 3A und 3C angegeben durch: Met.S³⁵. In den 3A und 3C geben die Linien 1 das Ergebnis an, das bei einem Lysat erhalten wurde, das von Zellen stammt, die durch das rekombinante Virus vTF7.3 infiziert und mit S³⁵-Methionin markiert waren. Es handelt sich in diesem Fall um eine Kontrolle.
Man stellt fest, dass das NS5A-Protein des HCV vom Genotyp 1a oder 1b in den Vero/G418 (Vn5)-Zellen (siehe 3A und 3D) prenyliert wird. Diese Prenylierung findet statt, wenn das NS5A-Protein allein exprimiert wird oder im Rahmen des Polyproteins (siehe 3B, Linien 2 bzw. 3). Die Prenylierung ist eine posttranslationale Modifizierung, die hauptsächlich das NS5A-Protein des HCV vom Genotyp 1a oder 1b betrifft und die anderen Genotypen betreffen kann.
Literatur

Blackburn P. und Moore S. (1982) The Enzymes, Vol. XV, Part. B, Academic Press, BY
Bouffard et al. (1992) The J. Infect. Diseases, 166, 1276-1280,
Casey P. J. (1992) Journal of Lipid Research, 33, 1731-1740,
Chomczynski und Sacchi (1987) Anal. Biochem, 162, 156-159,
Choo et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 2451-2455,
Choo et al. (1989) Science, 244, 359-362,
Feinstone et al. (1975) N. Engl. J. Med., 292, 767-770,
Feinstone et al. (1981) J. Infect. Dis., 144, 588-598,
Fourmillier et al. (1996) J. Gen. Virol., 77, 1055-1064,
Frese et al. (1995) J. Virol., 69, 3904-3909,
Fuerst et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 8122-8126,
Grakoui et al. (1993) J. Virol., 67, 1385-1395,
Grakoui et al. (1993) J. Virol., 67, 2832-2843,
Grakoui et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 10583-10587,
Gübler U. und Hoffman B. J. (1983) Gene, 25, 263-269,
Hijikata et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 5547-5551,
Inchauspé et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 10292-10296,
Kato und Shimotohno (2000) Curr Top Microbiol Immunol, 242, 261-278,
Kato et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 9524-9528,
Kieny et al. (1984) Nature, 312, 163-166,
Kolykhalov et al. (1997) Science, 277, 570-574,
Kowalski et al. (1976) Biochemistry, 15, 4457-4463,
Lanford et al. (1994) Virology, 202, 606-614,
Liljeström et al (1991) J. Virol., 65, 4107-4113,
Lohmann et al. (1997) Science, 285, 110-113,
Moss et al. (1990) Nature, 348, 91-92,
Mullis, K. B. und Faloona F. A. (1987) Meth. Enzymol., 155, 335-350,
Negro et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, 89, 2247-2251,
Okamoto et al. (1992) Virology, 188, 331-341,
Prince et al. (1974) Lancet, 2, 241-246,
Reynolds et al. (1995) The EMBO J., 14, 6010-6020,
Seipp et al. (1997) J. Gen. Virol., 2467-2476,
Shimizu et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 5477-5481,
Shimizu et al. (1994) J. Virol., 68, 1494-1500,
Shimizu et al. (1994) J. Virol., 68, 8406-8408,
Simmonds P. (2001) J. Gen. Virol., 82, 693-712,
Tsukiyama-Kohara et al. (1992) J. Virol., 66, 1476-1483,
Wychowski et al. (1985), Gene, 37, 63-71,
Yanagi et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 8738-8743,
Zarlenga und Gamble (1987) Analytical Biochemistry, 162, 569-574.

SEQUENZLISTE

Claims

Verwendung von Zellen, die einen Prenylierungsprozess von durch das Genom des Hepatitis-C-Virus (HCV) kodierten Proteinen, wie die Prenylierung des Proteins NS5A, bewirken können, für die Replikation und gegebenenfalls die Produktion von HCV oder von davon abgeleiteten lebensfähigen Mutanten in einem geeigneten Kulturmedium, wobei diese Zellen die Zellen Vero/G418 sind, wie sie bei der CNCM am 13. April 2001 unter der Nummer I-2659 hinterlegt wurden.
Verwendung gemäß Anspruch 1 von Vero-Zellen, die durch ein Resistenz-Gen gegen ein Antibiotikum, wie Neomycin, transformiert sind, wobei die Zellen durch eine Nukleinsäure transformiert sind, die das Genom des HCV oder von Mutanten, die von HCV abgeleitet sind, zur Gänze oder teilweise enthält.
Verwendung gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure ausgewählt ist aus: – jenen, die für die strukturellen und nicht strukturellen Proteine des HCV kodieren, oder – jenen, die für die nicht strukturellen Proteine des HCV kodieren, oder – den Replikons, die ein Resistenz-Gen gegen ein Antibiotikum, insbesondere Hygromycin B, und eine Nukleotidsequenz, die für die nicht strukturellen Proteine des HCV kodiert, enthalten.
Verwendung gemäß Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen durch eine Nukleinsäure transformiert sind, die ausgewählt ist aus den Nukleotidsequenzen SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2 und SEQ ID NO 3.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 für die Replikation und gegebenenfalls die Produktion von HCV Typ 1a.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 2 bis 5, von Zellen, wie sie bei der CNCM am 13. April 2001 unter der Nummer I-2658 hinterlegt wurden.
Transformierte Zelle, gebildet aus der Zelle Vero/G418, hinterlegt bei der CNCM am 13. April 2001 unter der Nummer I-2659, transformiert durch eine Nuklein säure, die ausgewählt ist aus: – jenen, die für die strukturellen und nicht strukturellen Proteine des HCV kodieren, oder – jenen, die für die nicht strukturellen Proteine des HCV kodieren, oder – den Replikons, die ein Resistenz-Gen gegen ein Antibiotikum, insbesondere Hygromycin B, und eine Nukleotidsequenz, die für die nicht strukturellen Proteine von HCV kodiert, enthalten.
Zelle gemäß Anspruch 7, gebildet aus der Zelle Vero/G418, hinterlegt bei der CNCM am 13. April 2001 unter der Nummer I-2659, transformiert durch ein Replikon, das gebildet ist durch eine Nukleinsäure, die ausgewählt ist aus jenen, die ein Resistenz-Gen gegen ein Antibiotikum, wie Hygromycin B, enthalten, und eine Nukleotidsequenz, die für die nicht strukturellen Proteine des HCV, insbesondere NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A und NS5B, kodiert.
Zelle gemäß einem der Ansprüche 7 oder 8, gebildet aus der Zelle Vero/G418, hinterlegt bei der CNCM am 13. April 2001 unter der Nummer I-2659, transformiert durch eine Nukleinsäure, enthaltend ein Resistenz-Gen gegen ein Antibiotikum, wie Hygromycin B, und eine Nukleotidsequenz, die für die nicht strukturellen Proteine des HCV kodiert, und bei der CNCM am 13. April 2001 unter der Nummer I-2658 hinterlegt.
Zelle gemäß einem der Ansprüche 7 bis 9, gebildet aus der Zelle Vero/G418, hinterlegt bei der CNCM am 13. April 2001 unter der Nummer I-2659, transformiert durch eine Nukleinsäure, enthaltend ein Resistenz-Gen gegen ein Antibiotikum, insbesondere Hygromycin B, und eine Nukleotidsequenz, die für die nicht strukturellen Proteine kodiert, und mit der Eigenschaft, das HCV bei einer Konzentration an Antibiotikum, insbesondere Hygromycin B, von 800 bis 1000 μg/ml zu replizieren.
Verfahren zur Herstellung des Hepatitis-C-Virus, das die Infektion der Zellen Vero/G418, wie sie bei der CNCM am 13. April 2001 unter der Nummer I-2659 hinterlegt wurden, mit dem Hepatitis-C-Virus und das Kultivieren der infizierten Zellen unter geeigneten Bedingungen umfasst.
Verfahren zur Replikation des Hepatitis-C-Virus durch Transformation von Zellen Vero/G418, wie sie am 13. April 2001 bei der CNCM unter der Nummer I-2659 hinterlegt wurden, entweder mit einer Nukleinsäure, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie die SEQ ID NO 1 oder die SEQ ID NO 3 enthält oder daraus gebildet ist, oder mit einer Nukleinsäure, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie die SEQ ID NO 2 enthält oder daraus gebildet ist, um die transformierten Vero/G418-Zellen zu erhalten, die am 13. April 2001 bei der CNCM unter Nummer I-2658 hinterlegt wurden, und Kultivieren der transformierten Zellen unter geeigneten Bedingungen.
Verfahren für die Herstellung des Hepatitis-C-Virus durch Transformation von Vero/G418-Zellen, wie sie am 13. April 2001 bei der CNCM unter der Nummer I-2659 hinterlegt wurden, mit einer Nukleinsäure, die für die strukturellen und nicht strukturellen Proteine des HCV kodiert, Kultivieren der transformierten Vero/G418-Zellen unter geeigneten Bedingungen und Gewinnung der HCV-Partikel.
Verfahren zum Screenen von Anti-HCV-Mitteln, das die folgenden Schritte umfasst: – das Zusammenbringen der auf ihre Anti-HCV-Eigenschaften zu prüfenden Verbindung mit transformierten Zellen, die gebildet sind aus Vero/G418-Zellen, wie sie am 13. April 2001 bei der CNCM unter der Nummer I-2659 hinterlegt wurden, welche durch eine Nukleinsäure transformiert wurden, die ausgewählt ist aus: • jenen, die für die strukturellen und nicht strukturellen Proteine von HCV kodieren, oder • jenen, die für die nicht strukturellen Proteine von HCV kodieren, oder • den Replikons, die ein Resistenz-Gen gegen ein Antibiotikum, insbesondere Hygromycin B, und eine Nukleotidsequenz, die für die nicht strukturellen Proteine von HCV kodiert, enthalten, und insbesondere mit Zellen, wie sie am 13. April 2001 bei der CNCM unter der Nummer I-2658 hinterlegt wurden, – Extraktion der Gesamt-RNA aus diesen Zellen, und – Analyse der eventuellen Verringerung der Syntheserate der RNA des HCV der genannten Zellen im Verhältnis zu einem Kontrollwert, der der Syntheserate der RNA des HCV der Zellen in Abwesenheit der geprüften Verbindung entspricht.
Verfahren zur Herstellung von Vero/G418-Zellen, wie sie am 13. April 2001 bei der CNCM unter der Nummer I-2659 hinterlegt wurden, transformiert durch eine Nukleinsäure, die ausgewählt ist aus: – jenen, die für die strukturellen und nicht strukturellen Proteine des HCV kodieren, oder – jenen, die für die nicht strukturellen Proteine des HCV kodieren, oder – den Replikons, die ein Resistenz-Gen gegen Hygromycin B und eine Nukleotid sequenz, die für die nicht strukturellen Proteine von HCV kodiert, enthalten, wobei das Verfahren die folgenden Schritte enthält: – Inserieren einer der Nukleotidsequenzen, die die SEQ ID NO 1 oder SEQ ID NO 3 enthalten oder daraus gebildet sind, in die Vero/G418-Zellen, wie sie am 13. April 2001 bei der CNCM unter der Nummer I-2659 hinterlegt wurden, – Aussetzen der so erhaltenen Zellen zunehmenden Konzentrationen, insbesondere 800 bis 1000 μg/ml, an Hygromycin B.
Zellen, wie sie durch die Durchführung des Verfahrens gemäß Anspruch 15 erhalten werden.