CN1480911A - 一种以树鼩为实验动物构建的视疲劳动物模型 - Google Patents
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Abstract
本发明属于医疗评价、检测技术领域,具体涉及一种通过迫使树鼩眼过用调节(正调节),使支配眼调节的副交感神经异常兴奋、交感神经的兴奋性发生相应改变、睫状肌和瞳孔括约肌持续性收缩,导致支配眼调节的交感与副交感双重神经的动态平衡失调,从而以实验手段构建的视疲劳树鼩动物模型。该模型用于研究视疲劳的发病机理、进行预防和治疗视疲劳的研究,尤其是用于筛选预防和治疗视疲劳的新药、用于筛选预防和治疗视疲劳的措施、用于客观评价预防和治疗视疲劳的方法。
Description
技术领域
本发明属于医疗评价、检测技术领域,具体涉及一种用于研究视疲劳发病机理、进行预防和治疗视疲劳研究的以树鼩(Tupaia Belangeris,TreeShrew)为实验动物构建的动物模型。
技术背景
视疲劳(asthenopia)又称眼紧张、眼疲劳(eye-strain,eye-fatigue)。中医称之为“肝劳”。asthenopia一词是由希腊语的表达法衍生而来的,原文意指“weak eye”(眼无力)。相关流行病学研究显示:随着信息交流方式变化和工作节奏加快,人群中视疲劳患者近年有逐渐增多的趋势,尤其在使用视频显示终端如计算机、电视、监视仪、电子游戏机的人群中。同时,近视眼患者中有66%的人表现为视疲劳,而远视眼患者中视疲劳症状的发生率更高。可见,视疲劳的发生率高、且呈上升趋势,并且不同程度地影响了患者的工作、学习和生活。因此,积极探索视疲劳的有效防治措施,是医药学界面临的重要课题之一。
由于视疲劳的发病机制有许多不明之处,也无有效的、理想的治疗方法,特别是目前没有视疲劳的动物模型,使医药学界难以对视疲劳进行深入系统的实验研究。因此,建立视疲劳的动物模型,是进一步深入研究视疲劳的发病机理、进行预防和治疗视疲劳的研究,尤其是筛选预防和治疗视疲劳的新药、筛选预防和治疗视疲劳的措施、客观评价预防和治疗视疲劳方法的前提和基础。
眼的正常调节是交感与副交感双重神经支配的动态平衡结果;当支配眼调节的交感与副交感双重神经的动态平衡失调时(主要表现为支配睫状肌和瞳孔括约肌的副交感神经异常兴奋),则会出现眼胀、头痛、头晕、眼眶胀痛等症状,即视疲劳的临床表现,导致眼痛、头痛等视疲劳的主要临床表现是由于过用调节(正调节),使睫状肌和瞳孔括约肌持续性收缩所致。由此可见,视疲劳的发生与支配眼调节的交感与副交感双重神经的动态平衡失调密切相关;过用调节,使睫状肌和瞳孔括约肌持续性收缩是视疲劳发生的重要原因。同时,研究还证实,过度的调节与青少年获得性近视的发生发展有密切的关系,故建立视疲劳的动物模型亦可为进行预防和治疗青少年获得性近视的研究提供重要的依据。
睫状肌和瞳孔括约肌是完成眼调节的生理基础,因此,构建视疲劳动物模型的实验动物应具有与人相似的睫状肌和瞳孔括约肌,视觉系统发育完善。本发明专利通过比较解剖学和组织病理学研究发现:树鼩属哺乳纲、灵长目、原猴亚目、树鼩下目、树鼩科,其解剖特点与猿猴接近,颅脑发达,视觉系统发育完善;其睫状肌的三种肌纤维均有分布、并且分布情况与人眼接近,睫状肌的肌动蛋白表达阳性;其瞳孔括约肌发育完善,肌动蛋白阳性表达分布均匀,是建立视疲劳动物模型的理想实验动物。但是迄今还没有以树鼩为实验动物来建立视疲劳动物模型,更无树鼩视疲劳动物模型的文献报道。本发明专利根据树鼩的解剖与生理特点,用迫使树鼩眼过用调节(正调节)的方法成功地建立了视疲劳树鼩动物模型。
众所周知,眼的调节是在交感与副交感神经兴奋后,其神经末梢释放神经递质,作用于细胞膜上的相应受体,再通过第二信使发生一系列生理生化反应而最终完成的。支配眼调节的副交感神经为胆碱能神经,释放的神经递质为乙酰胆碱,相应受体为胆碱能受体。眼处于正调节时必然伴随睫状肌和瞳孔括约肌的收缩,睫状肌和瞳孔括约肌是完成眼调节的生理基础,瞳孔括约肌上的受体为M-ACh受体,且大部分是M3-ACh受体亚型。而交感神经在眼的调节过程中也起着重要的作用,因为睫状肌的交感神经兴奋,睫状肌松弛引发副调节,这对维持眼调节时交感与副交感双重神经支配的动态平衡十分重要。已知在睫状肌中β受体密度较高,且大部分为β2型肾上腺素能受体(β2-AR),其第二信使为cAMP、cGMP。因此,睫状肌的β-AR(大部分为β2-AR)、瞳孔括约肌的M-ACh受体(大部分为M3-ACh受体),及其第二信使系统和神经递质是反映交感与副交感神经兴奋状态及其神经信号传导机制的一组重要的客观指标。但是至今还没有用睫状肌的β-AR(大部分为β2-AR)、瞳孔括约肌的M-ACh受体(大部分为M3-ACh受体),及其第二信使系统作为客观指标来评价视疲劳动物模型、筛选防治视疲劳的新药、评价防治视疲劳方法的文献报道。
发明内容
本发明专利的目的在于发明一种以树鼩为实验动物的视疲劳动物模型。
本发明提出一种以树鼩为实验动物的视疲劳动物模型,是通过迫使树鼩眼过用调节(正调节),使支配眼调节的副交感神经异常兴奋、睫状肌和瞳孔括约肌持续性收缩,交感神经的兴奋性发生相应改变,导致支配眼调节的交感与副交感双重神经的动态平衡失调,从而建立视疲劳树鼩的动物模型。
下面对发明作进一步详述,要求保护的范围并不限于实施方式本身。具体方法如下:
1.迫使树鼩眼过用调节(正调节)
选取适当的树鼩,迫使树鼩眼连续长时间处于过用调节(正调节)的状态。
2.检测支配眼调节的交感与副交感双重神经的兴奋状态
根据预试实验,在造模实验的早期、中期及后期(结束)时,分别处死树鼩,立即摘除双侧眼球,一部分眼球分别以10%甲醛、3%戊二醛固定,以备组织病理学研究;另一部分以生理盐水冲洗,显微手术镜下分离睫状体和虹膜,生理盐水冲洗后,滤纸吸干。将每只树鼩的睫状体和虹膜分别以锡箔密封、编号,电子天平称重后立即投入液氮中保存,以备检测睫状体中β-AR(大部分是β2-AR亚型)及虹膜中M-Ach受体(大部分是M3-ACh受体亚型)的最大结合容量(Rt)及平衡解离常数(KD)、cAMP和cGMP含量。
根据上述构建视疲劳树鼩动物模型的实验,比较分析其检测结果发现:①在实验的早期,树鼩睫状体中β-AR和虹膜中M-Ach受体的最大结合容量(Rt)及平衡解离常数(KD)与正常对照组比较差异均无统计学意义,表明支配树鼩眼调节的副交感神经与交感神经的受体均未发生明显变化,树鼩眼处于交感与副交感双重神经支配的生理平衡状态,如附图1-4。②在实验的中期,树鼩睫状体中β-AR的最大结合容量(Rt)和cAMP含量较正常对照组明显升高,cGMP含量较正常对照组明显下降,差异均有统计学意义;虹膜中M-Ach受体的平衡解离常数(KD)较正常对照组明显降低,即亲和力明显增强,cGMP含量较正常对照组明显升高,差异均有统计学意义,表明支配树鼩眼调节的副交感神经异常持续兴奋,交感神经的β-AR也发生上调,树鼩眼处于交感与副交感双重神经支配的高水平的动态平衡状态,如附图1、附图3、附图7-10。③在实验的后期,树鼩睫状体中β-AR的最大结合容量(Rt)及平衡解离常数(KD)、cAMP含量与正常对照组比较差异均无统计学意义,而cGMP含量较正常对照组明显升高,差异均有统计学意义;虹膜中M-Ach受体的最大结合容量(Rt)及cGMP含量较正常对照组明显升高,差异均有统计学意义,表明支配树鼩眼调节的副交感神经仍然异常持续兴奋,而交感神经的兴奋性下降,睫状肌与瞳孔括约肌持续性收缩,模型眼处于交感与副交感双重神经支配的动态平衡失调状态,即此时树鼩眼处于视疲劳,如附图1-10。④组织病理学研究也证实,在实验的后期模型组树鼩眼的睫状肌和瞳孔括约肌均处于收缩状态;同时,树鼩也表现出烦躁不安、回避用眼等相应的行为变化。
由此说明本发明专利以实验的手段建立了视疲劳树鼩动物模型。
附图说明附图1 模型组与正常对照组睫状体中β-AR的RT值变化比较。该图显示:正常对照组睫状体中β-AR的RT值变化曲线接近水平,其β-AR的RT值在实验的早、中、后三个时期比较差异均无统计学意义(P>0.05),表明正常对照组的饲养条件对树鼩睫状体中β-AR的RT值未产生明显影响。在实验的早期,模型组睫状体中β-AR的RT值与正常对照组接近,两组之间比较差异无统计学意义(P>0.05),表明此时支配树鼩眼调节的交感神经β-AR未发生明显变化;在实验的中期,模型组睫状体中β-AR的RT值明显上升、较正常对照组明显升高,差异有统计学意义(P<0.05),表明此时支配树鼩眼调节的交感神经β-AR发生上调;在实验的后期,模型组睫状体中β-AR的RT值明显回落,与正常对照组比较差异无统计学意义(P>0.05),与其在实验中期β-AR的RT值比较差异有统计学意义(P<0.05),表明此时支配树鼩眼调节的交感神经兴奋性较实验中期明显下降。附图2 模型组与正常对照组睫状体中β-AR的KD值变化比较。该图显示:正常对照组与模型组睫状体中β-AR的KD值变化曲线均基本接近。在实验的早、中、后期,各实验组睫状体中β-AR的KD值在两组之间比较差异均无统计学意义(P>0.05),表明支配树鼩眼调节的交感神经β-AR的KD值无明显变化。附图3 模型组与正常对照组虹膜中M-Ach受体的KD值变化比较。该图显示:正常对照组虹膜中M-Ach受体的KD值变化曲线接近水平,其M-Ach受体的KD在实验的早、中、后三个时期比较差异均无统计学意义(P>0.05),表明正常对照组的饲养条件对树鼩M-Ach受体的KD未产生明显影响。在实验的早期,模型组虹膜中M-Ach受体的KD值与正常对照组接近,两组之间比较差异无统计学意义(P>0.05),表明此时支配树鼩眼调节的副交感神经的受体未发生明显变化,提示其既有的M-Ach受体活化所引起的生理效应即可达到支配眼调节的副交感神经兴奋所致的调节作用;在实验的中期,模型组虹膜中M-Ach受体的KD值较正常对照组明显下降,差异有统计学意义(P<0.05),表明此时M-Ach受体亲和力明显增强,提示因副交感神经的异常持续兴奋,M-Ach受体通过增高其亲和力来达到副交感神经兴奋所致的调节作用;在实验的后期,模型组虹膜中M-Ach受体的KD值回升,与正常对照组比较差异无统计学意义(P>0.05),表明此时M-Ach受体的亲和力回落,结合附图4可知此时副交感神经的兴奋主要是通过M-Ach受体的RT值上调来实现的。附图4 模型组与正常对照组虹膜中M-Ach受体的RT值变化比较。该图显示:正常对照组虹膜中M-Ach受体的RT值变化曲线接近水平,其M-Ach受体的RT值在实验的早、中、后三个时期比较差异均无统计学意义(P>0.05),表明正常对照组的饲养条件对树鼩M-Ach受体的RT值未产生明显影响。在实验的早期,模型组虹膜中M-Ach受体的RT值与正常对照组接近,两组之间比较差异无统计学意义(P>0.05),表明此时支配树鼩眼调节的副交感神经的受体未发生明显变化;在实验的中期,模型组虹膜中M-Ach受体的RT值与正常对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05),结合附图3可知,此时副交感神经的兴奋主要是通过增高其亲和力来达到副交感神经兴奋所致的调节作用;在实验的后期,模型组虹膜中M-Ach受体的RT值明显升高,与正常对照组比较差异有统计学意义(P<0.05),而此时模型组虹膜中M-Ach受体的KD值回升、亲和力回落(附图3),表明此时副交感神经仍然持续异常兴奋,M-Ach受体反应水平的增高是通过RT值的上调实现的。附图5 模型组睫状体中β-AR与虹膜中M-Ach受体的RT值比较。该图显示:在实验早期至中期阶段,模型组β-AR的RT值明显升高,与之相对的M-Ach受体的RT值无明显变化;在实验中期至后期阶段,模型组β-AR的RT值逐渐回落,与之相对的M-Ach受体的RT值明显升高。结合附图1和附图3-4可知:①在实验的早期,支配树鼩眼调节的交感神经与副交感神经的受体均未发生明显变化,树鼩眼处于交感与副交感双重神经支配的生理平衡状态。②在实验的中期,M-Ach受体亲和力明显增高,支配树鼩眼调节的副交感神经异常持续兴奋;β-AR的RT值也明显升高,即交感神经的β-AR发生上调,树鼩眼处于交感与副交感双重神经支配的高水平的动态平衡状态。③在实验的后期,M-Ach受体的RT值明显升高,表明支配树鼩眼调节的副交感神经仍然异常持续兴奋;而β-AR的RT值较实验中期明显回落,即交感神经的兴奋性下降,此时模型眼处于交感与副交感双重神经支配的动态平衡失调状态。附图6 模型组睫状体中β-AR与虹膜中M-Ach受体的KD值比较。该图显示:树鼩β-AR的KD值大于10-9,表明β-AR受体与配基的亲和力较低;与之相对的M-Ach受体KD值小于10-9,也明显低于β-AR的KD值,表明M-Ach受体与配基的亲和力高,在支配眼发生调节的过程中,副交感神经占主导地位。同时,在实验的早、中、后期过程中,模型组睫状体β-AR的KD值呈现逐渐升高,然后逐渐下降的变化趋势,但各期模型组β-AR的KD值与正常对照组比较差异均无统计学意义(P>0.05)(附图2),表明支配树鼩眼调节的交感神经β-AR的KD值无明显变化;与之相对的M-Ach受体的KD值则呈现逐渐下降,然后逐渐上升的变化趋势,并且在实验中期模型组M-Ach受体的KD值与正常对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)(附图3),表明支配树鼩眼调节的副交感神经在实验中期其受体的亲和力明显增强。附图7 模型组与正常对照组睫状体中cAMP含量变化比较。该图显示:正常对照组睫状体中cAMP含量变化线接近水平,其cAMP含量在实验的早、中、后三个时期比较差异均无统计学意义(P>0.05),表明正常对照组的饲养条件对树鼩睫状体中cAMP含量未产生明显影响。在实验的早、中、后期过程中,模型组睫状体中cAMP含量呈现逐渐升高、至实验的中期达到高点,然后逐渐下降的变化趋势,其变化趋势与睫状体中β-AR的RT值变化一致(附图1),表明cAMP作为β-AR的第二信使所转导的反应一致。附图8模型组与正常对照组睫状体中cGMP含量变化比较。该图显示:正常对照组睫状体中cGMP含量变化线接近水平,其cGMP含量在实验各时期比较差异均无统计学意义(P>0.05),表明正常对照组的饲养条件对树鼩睫状体中cGMP含量未产生明显影响。在实验的早、中、后期过程中,模型组睫状体中cGMP含量呈现逐渐下降、至实验的中期达到低点,然后又逐渐升高,其变化趋势与cAMP相反(附图7)。二者的变化符合一般规律。附图9模型组与正常对照组虹膜中cAMP含量变化比较。该图显示:正常对照组和模型组的虹膜中cAMP含量变化线接近水平,其cAMP含量在实验的早、中、后三个期比较差异均无统计学意义(P>0.05),表明在本研究工作中虹膜的cAMP含量变化与M-Ach受体反应未呈现明显的关联性。附图10模型组与正常对照组虹膜中cGMP含量变化比较。该图显示:正常对照组虹膜中cGMP含量变化线接近水平,其cGMP含量在实验各时期比较差异均无统计学意义(P>0.05),表明正常对照组的饲养条件对树虹膜中cGMP含量未产生明显影响。在实验的早、中、后期过程中,模型组虹膜中cGMP含量呈现逐渐升高、至实验的中期达到高点,然后又逐渐回落,其变化趋势与M-Ach受体的反应性一致(附图3-4),表明在本研究工作中虹膜的cGMP含量变化与M-Ach受体反应呈现明显的关联性。
具体实施方式
实施例1
通过诱视物迫使树鼩眼过用调节(正调节)法:
选取成年树鼩,将双眼及全身状况正常的树鼩随机分为模型组和正常对照组。
正常对照组:树鼩置于安放有睡盒的笼中,睡盒开放,动物可自由出入。每日2次给食饮水。白昼正常光照;夜间无光照。
模型组:树鼩置于安放有睡盒的笼中,睡盒于每日白昼(7时~19时)关闭,树鼩只能在睡盒外活动,用活动诱视物对树鼩进行近距离持续诱视;树鼩笼具中的睡盒于夜间(19时~次日7时)开放,此段时间树鼩可进入睡盒内休息。每日投食给水2次。白昼正常光照;夜间无光照。
在实验结束时,处死树鼩,立即摘除双侧眼球,一部分眼球分别以10%甲醛、3%戊二醛固定,以备组织病理学研究;另一部分以生理盐水冲洗,显微手术镜下分离睫状体和虹膜,生理盐水冲洗后,滤纸吸干。将每只树鼩的睫状体和虹膜分别以锡箔密封、编号,电子天平称重后立即投入液氮中保存,以备检测睫状体中β-AR(大部分是β2-AR亚型)及虹膜中M-Ach受体(大部分是M3-ACh受体亚型)的最大结合容量(Rt)及平衡解离常数(KD)、cAMP和cGMP含量。
检测结果显示:模型组树鼩睫状体中β-AR的最大结合容量(Rt)及平衡解离常数(KD)与正常对照组比较差异均无统计学意义(P>0.05);虹膜中M-Ach受体的最大结合容量(Rt)及cGMP含量较正常对照组明显升高,差异均有统计学意义(P<0.05,P<0.01),表明支配树鼩眼调节的副交感神经仍然异常持续兴奋,而交感神经的β-AR未发生上调,模型眼处于交感与副交感双重神经支配的动态平衡失调状态。组织病理学研究也显示,模型组树鼩视疲劳动物模型眼的睫状体和瞳孔括约肌均处于收缩状态;同时,视疲劳树鼩动物模型也表现出烦躁不安、回避用眼等相应的行为变化。
实施例2
通过眼前安置眼罩发光II级管刺激器进行持续刺激,迫使树鼩眼过用调节(正调节)法:
选取成年树鼩,将双眼及全身状况正常的树鼩随机分为模型组和正常对照组。
正常对照组:树鼩置于安放有睡盒的笼中,睡盒开放,动物可自由出入。每日给食饮水2次。白昼正常光照;夜间无光照。
模型组:树鼩置于安放有睡盒的笼中,睡盒于每日白昼(7时~19时)关闭,树鼩只能在睡盒外活动,并在树鼩的眼前安置眼罩发光II级管刺激器进行持续刺激;树鼩笼具中的睡盒于夜间(19时~次日7时)开放,此时树鼩可进入睡盒内休息。每日投食给水2次。白昼正常光照;夜间无光照。
在实验结束时,分别处死正常对照组和模型组树鼩,立即摘除双侧眼球,一部分眼球分别以10%甲醛、3%戊二醛固定,以备组织病理学研究;另一部分以生理盐水冲洗,显微手术镜下分离睫状体和虹膜,生理盐水冲洗后,滤纸吸干。将每只树鼩的睫状体和虹膜分别以锡箔密封、编号,电子天平称重后立即投入液氮中保存,以备检测睫状体中β-AR(大部分是β2-AR亚型)及虹膜中M-Ach受体(大部分是M3-ACh受体亚型)的最大结合容量(Rt)及平衡解离常数(KD)、cAMP和cGMP含量。
检测结果和树鼩的行为、体征与实施例1一致。
实施例3
通过眼前安戴凹透镜,迫使树鼩眼过用调节(正调节)法:
选取成年树鼩,将双眼及全身状况正常的树鼩随机分为模型组和正常对照组。
正常对照组:树鼩置于安放有睡盒的笼中,睡盒开放,动物可自由出入。每日给食饮水2次。白昼正常光照;夜间无光照。
模型组:树鼩置于安放有睡盒的笼中,睡盒于每日白昼(7时~19时)关闭,树鼩只能在睡盒外活动,并在树鼩的眼前安戴凹透镜,迫使树鼩眼过用调节(正调节);树鼩笼具中的睡盒于夜间(19时~次日7时)开放,此时树鼩可进入睡盒内休息。每日投食给水2次。白昼正常光照;夜间无光照。
在实验结束时,分别处死正常对照组和模型组树鼩,立即摘除双侧眼球,一部分眼球分别以10%甲醛、3%戊二醛固定,以备组织病理学研究;另一部分以生理盐水冲洗,显微手术镜下分离睫状体和虹膜,生理盐水冲洗后,滤纸吸干。将每只树鼩的睫状体和虹膜分别以锡箔密封、编号,电子天平称重后立即投入液氮中保存,以备检测睫状体中β-AR(大部分是β2-AR亚型)及虹膜中M-Ach受体(大部分是M3-ACh受体亚型)的最大结合容量(Rt)及平衡解离常数(KD)、cAMP和cGMP含量。
检测结果和树鼩的行为、体征与实施例1一致。
Claims (10)
1.一种以树鼩为实验动物构建的视疲劳动物模型,其特征是:迫使树鼩眼连续长时间处于过用调节(正调节),致使支配眼调节的副交感神经异常持续兴奋,交感神经的兴奋性发生相应改变,模型眼处于交感与副交感双重神经支配的动态平衡失调状态。
2.根据权利要求1所述的动物模型,其特征是:用于视疲劳药理研究的动物模型。
3.根据权利要求1所述的动物模型,其特征是:用于筛选预防和治疗视疲劳的措施的动物模型。
4.根据权利要求1所述的动物模型,其特征是:通过诱视物迫使树鼩眼过用调节(正调节)构建的视疲劳动物模型。
5.根据权利要求1所述的动物模型,其特征是:通过眼前安置眼罩发光II级管刺激器进行持续刺激,迫使树鼩眼过用调节(正调节)构建的视疲劳动物模型。
6.根据权利要求1所述的动物模型,其特征是:通过眼前安戴凹透镜,迫使树鼩眼过用调节(正调节)构建的视疲劳动物模型。
7.根据权利要求1所述的动物模型,其特征是:以睫状体中β-AR(大部分是β2-AR亚型)的Rt值及KD值来评价支配眼调节的交感神经兴奋性。
8.根据权利要求1所述的动物模型,其特征是:以虹膜中M-Ach受体(大部分是M3-ACh受体亚型)的Rt值及KD值来评价支配眼调节的副交感神经兴奋性。
9.根据权利要求1所述的动物模型,其特征是:以睫状体中cAMP及cGMP含量来评价支配眼调节的交感神经兴奋性以及睫状肌的收缩与舒张状态。
10.根据权利要求1所述的动物模型,其特征是:以虹膜中cAMP及cGMP含量来评价支配眼调节的副交感神经兴奋性以及瞳孔括约肌的收缩与舒张状态。
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CNA031352294A CN1480911A (zh) | 2003-06-18 | 2003-06-18 | 一种以树鼩为实验动物构建的视疲劳动物模型 |
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Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN100371022C (zh) * | 2006-05-10 | 2008-02-27 | 李卫云 | 建立抗丙型肝炎病毒药物筛选实验动物模型的方法 |
CN105535997A (zh) * | 2016-01-14 | 2016-05-04 | 中国科学院昆明动物研究所 | 一种树鼩单纯疱疹病毒性角膜炎hsk模型的构建、评估方法及其应用 |
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2003
- 2003-06-18 CN CNA031352294A patent/CN1480911A/zh active Pending
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |