CN1414863A - Dna病毒感染的治疗 - Google Patents

Abstract

袢利尿剂和强心苷的协同组合在DNA病毒感染的治疗中有用。

Description

DNA病毒感染的治疗

本发明涉及抗病毒治疗，尤其涉及预防和治疗DNA病毒感染，如疱疹病毒感染。

疱疹病毒是DNA病毒，其在蛋白质结构中具有中央DNA核心。DNA带有复制病毒的遗传密码。病毒必须感染活细胞以复制。有许多病毒蛋白已被良好地表征，包括作为抗病毒化学治疗最终的靶的重要的酶。这些包括DNA复制所必需的DNA聚合酶和胸苷激酶。病毒DNA的复制对于病毒感染性是必需的。已知感染病毒在它们的复制过程中能够改变活细胞的天然离子平衡。

EP-A-0442 744公开了某种糖苷治疗单纯疱疹病毒和水痘带状疱疹病毒的用途。在本PCT申请的优先权日之后公开的WO 00/10574公开了袢利尿剂在反转录病毒的治疗中的用途，在该例中是治疗HIV感染。我们现在出乎意料地发现，与单独给予袢利尿剂或糖苷相比，糖苷和袢利尿剂的组合施用给出增强的效果。

根据本发明的一个方面，提供了治疗组合物，其在病毒感染的治疗中有用，其包含袢利尿剂和强心苷的协同组合。

在本发明的另一方面，提供了治疗病毒感染的方法，所述方法包括施用袢利尿剂和强心苷以发挥协同作用。

袢利尿剂可以选自多种已有的试剂。优选地，袢利尿剂是呋塞米、布美他尼、依他尼酸或托拉塞米中的一种或多种。根据我们的研究，袢利尿剂通过改变细胞离子浓度、细胞离子平衡、细胞离子环境和电势来介导其抗病毒作用。

呋塞米是邻氨基苯甲酸(anthrilic acid)衍生物，化学名为4-氯-N-糠基-5-氨磺酰邻氨基苯甲酸。它在中性pH下几乎不溶于水，然而在碱性中随意溶解。呋塞米通过抑制氯离子跨细胞膜转运而发挥其生理作用。呋塞米是作用时间短的袢利尿剂。其用于治疗由于肝功能衰竭、肾功能衰竭或心力衰竭引起的水肿，并治疗高血压。呋塞米的生物利用度在60％到70％之间，主要通过滤过和分泌以未改变的药物被排泄。呋塞米作用于Na⁺/K⁺/2Cl^-共转化子(cotransformer)。对于其利尿作用，其主要作用在肾中的亨勒袢的升枝。袢利尿剂显著促进K⁺排泄，使细胞内缺钾。这可能导致长期全身使用呋塞米的显著并发症，即低血清钾。我们认为正是该作用使袢利尿剂作为抗DNA病毒的试剂有用。

最近的证据提示，呋塞米的主要生物转化产物是葡糖苷酸。呋塞米广泛结合于血浆蛋白，主要是白蛋白。在健康个体中，血浆浓度在1-400mcg/ml的范围内，91-99％结合。在治疗浓度，未结合部分为2.3-4.1％。呋塞米的最终半衰期约为2小时，主要在尿中排泄。

强心苷可以是地高辛、洋地黄毒苷、甲地高辛、毛花苷C、海葱次苷、k毒毛花苷、黄夹次苷和毒毛花苷G中的一种或多种。洋地黄物种的植物(例如紫花洋地黄(digitalis purpura)、毛花洋地黄(digitalis lanata))含有强心苷，如已知共同属于洋地黄的地高辛和洋地黄毒苷。其他含有与洋地黄糖苷化学上相关的强心苷的植物经常也被称为洋地黄。因此术语洋地黄用于命名整个糖苷家族；糖苷由两部分组成，糖和强心苷。毒毛花苷G来自于非洲植物旋花羊角拗(Strophanthus gratus)，并且以静脉内形式出现(口服不吸收)，由于其更好的溶解性，它被许多实验室用于糖苷的研究。其作用方式实质上与地高辛相同。

在化学上，地高辛称为(3b，5b，12b)-3-[O-2，6-双脱氧-b-D-riob-己吡喃糖基-(1″4)-O-2，6-双脱氧-b-D-ribo-己吡喃糖基-(1″4)-2，6-双脱氧-b-D-ribo-己吡喃糖基]氧]-12，14-二羟基-卡-20-22)-烯内酯((3b，5b，12b)-3-[O-2，6-dideoxy-b-D-riob-hexopyranosyl-(1″4)-O-2，6-dideoxy-b-D-ribo-hexopyranosyl-(1″4)-2，6-dideoxy-b-D-ribo-hexopyranosyl]oxy)-12，14-dihydroxy-card-20-22)-enolide)。其分子式为C41H64O14，其分子量为780.95。地高辛以无气味的白色晶体存在，在高于230℃时熔化和分解。该药在水和醚中几乎不溶解；微溶于稀(50％)乙醇和氯仿中；在吡啶中随意溶解。

由于地高辛对于某些患者特别容易产生副作用，所以总是应该小心选择药物剂量，并随患者的临床症状进行调节。

在细胞水平，洋地黄通过抑制钠转运酶钠钾腺苷三磷酸酶Na/K ATPase)来发挥其主要作用；这是心肌电生理作用的直接原因，根据我们的理解，也是其抗DNA病毒活性的直接原因。由于细胞内钙的继发性变化，该活性也影响心肌收缩力。在很低的细胞内洋地黄浓度下，可以观察到因洋地黄激活Na/K ATPase而具有伴有降低的心收缩效率的反作用。

优选的组合是袢利尿剂呋塞米和强心苷地高辛。优选的浓度为：呋塞米1mg/ml，地高辛30mcg/ml。在短时间内分别施用两种活性成分也在本发明的范围内。

研究(包括X-射线微量分析)已经证明本发明的组合物的抗病毒DNA作用依赖于细胞内缺钾离子。简要地说，这些研究证明：

·钾的补充将恢复DNA合成；

·呋塞米和地高辛的组合使用与缺钾具有类似的作用；

·缺钾的水平足以保持正常细胞功能；

·缺钾没有细胞毒性作用。

因此，通过施用袢利尿剂和强心苷来改变细胞离子浓度、细胞离子平衡、细胞离子环境和电势，可能改变细胞代谢而不损害细胞，但病毒复制得到抑制。因此，我们确认，使用袢利尿剂和强心苷，通过抑制病毒DNA复制而在防止或控制病毒复制方面有益。已经证明其对DNA病毒HSV1和HSV2、CMV、VZV和假狂犬病病毒具有抗病毒功效。其他代表性病毒为微小病毒、乳多空病毒、腺病毒、嗜肝脱氧核糖核酸病毒和痘病毒。

本发明的组合物可以外用给药或内服给药。局部和全身施用可能最有用。可以使其配方适于缓释。本发明的非常优选的特征是配方组合物以局部施用。可以存在其它成分，条件是它们不破坏抗病毒活性，例如防腐剂。优选地，本发明提供呋塞米和地高辛的组合，其为在缓冲盐水中的局部施用配方，用于治疗角膜眼感染。就我们所知，现有的获得批准的化合物的组合用于治疗病毒感染尚无先例。

本发明的优选施用是局部浓度的袢利尿剂和强心苷用于高效治疗眼的病毒感染。人角膜的复发性疱疹感染是失明的最常见病毒原因。

使用带有，例如浸渍有袢利尿剂和强心苷的接触镜将是安全和有效的方法，用于产生高的细胞内浓度来预防或治疗疾病。将袢利尿剂和强心苷贮存施用于眼内将是适宜的用于治疗巨细胞病毒视网膜炎的方法，该疾病是导致患有艾滋病的患者失明的主要原因。

仅以举例方式，参照以下实施例，对本发明进行描述。

实施例1

用单纯疱疹病毒进行生物测定，以跟踪同时给予呋塞米(1mg/ml)和地高辛(30mcg/ml)的抗病毒活性。培养和测定方法根据Lennette和Schmidt(1979)所描述的用于单纯疱疹病毒和Vero细胞的方法进行，仅作微小改变。所用单纯疱疹病毒株：

1型单纯疱疹病毒株HFEM是Rockerfeller株HF(Wildy，1955)的衍生物；2型单纯疱疹病毒株3345，将阴茎分离物(Skinner等，1977)用作原型株。原型株在-80℃贮存直至需要。细胞培养物：

非洲绿猴肾细胞(vero)得自National Institute of BiologicalStandards and Control UK，且用作实施例中所有试验中的唯一细胞系。培养基：

细胞和病毒保存在格拉斯哥改良培养基中，该培养基具有10％胎牛血清。结果：hsv1的抑制

感染复数(病毒剂量)	呋塞米单独给药的作用	地高辛单独给药的作用	呋塞米和地高辛组合给药的作用效果
				高	-	-	+++
中	+	+	++++
				低	+	++	++++

本实施例证明，通过将低浓度呋塞米和糖苷贮备溶液施用于感染hsv1的Vero细胞，病毒活性几乎消除。在更高浓度下，病毒活性完全消失。该贮备溶液的抗病毒作用远远高于单独施用呋塞米或地高辛的作用。对于细胞外病毒没有直接杀病毒活性。

使用hsv2株重复这些试验，获得的结果几乎相同。

实施例2

使用1型疱疹病毒株kos，重复实施例1的方法。获得相似的结果。

实施例3

进行体外生物测定，来跟踪呋塞米和地高辛同时施用和单独施用时的抗病毒活性。

将组合物施用于不同类型的vero细胞(非洲绿猴肾细胞和BHK1细胞)，并用2型单纯疱疹病毒(3345株和180株)以低、中、高的感染复数(M0I)感染。病毒复制的抑制根据以下比例评分：

无抑制        -

20％抑制      +

40％抑制      ++

60％抑制      +++

80％抑制      ++++

100％抑制     +++++

T表示药物毒性。

以下结果是使用非洲绿猴肾细胞和2型单纯疱疹病毒株3345获得的：

低M0I HSV2	呋塞米0mg/ml	呋塞米.0.5mg/ml	呋塞米1.0mg/ml	呋塞米2mg/ml
					地高辛0mcg/ml	-	+	+++	T
地高辛15mcg/ml	-	+	+++	T
					地高辛30mcg/ml	+++	+++	+++++	T
地高辛45mcg/ml	T	T	T	T
					中M0I HSV2	呋塞米0mg/ml	呋塞米0.5mg/ml	呋塞米1.0mg/ml	呋塞米2mg/ml
地高辛0mcg/ml	-	+	+++	T
					地高辛15mcg/ml	-	+	+++	T
地高辛30mcg/ml	+	++	+++++	T
					地高辛45mcg/ml	T	T	T	T
高M0I HSV2	呋塞米0mg/ml	呋塞米0.5mg/ml	呋塞米1.0mg/ml	呋塞米2mg/ml
					地高辛0mcg/ml	-	-	++	T
地高辛15mcg/ml	-	-	+++	T
					地高辛30mcg/ml	-	-	+++++	T
地高辛45mcg/ml	T	T	T	T

在低的感染复数下，仅在施用30mcg/ml地高辛时，地高辛单独施用出现最大作用(+++)。

在低和中的感染复数下，施用1mg/ml呋塞米时，呋塞米单独施用出现最大作用(+++)。

当将袢利尿剂和强心苷同时施用于感染细胞时，使用30mcg/ml地高辛和1mg/ml呋塞米时，实现最大作用(+++++)。在低、中和高的感染复数下，hsv2复制都显示100％抑制。

使用其他vero细胞和2型单纯疱疹病毒株的组合获得类似的结果。

本实施例证明，单独施用呋塞米或地高辛，hsv2的复制没有得到最大抑制。然而，呋塞米和地高辛组合完全抑制hsv2复制。

Claims (8)

1.袢利尿剂和强心苷在DNA病毒感染的治疗中发挥协同作用的用途。

2.对于DNA病毒感染的治疗有用的治疗组合物，其包含袢利尿剂和强心苷的协同组合。

3.根据权利要求2的组合物，其适于局部施用。

4.根据权利要求2的组合物，其适于全身施用。

5.根据权利要求3的组合物，其包含1mg/ml袢利尿剂和30mcg/ml强心苷。

6.根据权利要求2的组合物，其适于眼内贮存施用。

7.根据前述任一权利要求的组合物，其中袢利尿剂是呋塞米。

8.带有，例如浸渍有袢利尿剂和强心苷的接触镜。