CN105616404A - 阿比朵尔在抗丝状病毒感染中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了阿比朵尔在抗丝状病毒感染方面的应用。本发明包含阿比朵尔对丝状病毒感染的预防或治疗中的应用或与其他抗病毒药物的联合应用。

Description

阿比朵尔在抗丝状病毒感染中的应用

技术领域

本发明是关于阿比朵尔在抗丝状病毒感染方面的应用，属于医药技术领域。本发明包含阿比朵尔在抗丝状病毒预防或治疗中的单独或联合应用。

背景技术

丝状病毒科(Filoviridae)又称纤丝病毒，该科病毒只有一个属，即丝状病毒属(Filovirus)。丝状病毒是外形如丝状的包膜病毒，其基因组为单链负链RNA，该属是包括两种病毒，即埃博拉病毒(Ebolavirus,EBOV)和马尔堡病毒(Marburgvirus,MBV)，这两种病毒均为管制病毒，需要在生物安全4级(P-4)实验室操作完成[CentersforDiseaseControlandPrevention/NationalInstitutesofHealth.BiosafetyinMicrobiologicalandBiomedicalLaboratories.4thed.Washington,DC:U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,U.S.GovernmentPrintingOffice；1999.DHHSPublicationCDC93-8395.]。埃博拉出血热(Ebolahemorrhagicfever，EHF)由埃博拉病毒引起，是严重危害公共安全和人类健康的重大烈性传染病，致死率高达50％-90％[Sanchez,A.；Geisbert,TW.；Feldmann,H.Filoviridae:MarburgandEbolaviruses.In:Knipe,DM.；Howley,PM.,editors.Fieldsvirology.Philadelphia:LippincottWilliams&Wilkins；2006.1409-1448.]。马尔堡病毒也会引起出血热，死亡率达到50-80％[Nonfatalcaseswereunderreportedduetoanuncooperativecommunity；thus,themortalityvalueseemsoverestimated(WHOupdate,August24,2005]。丝状病毒是单链负链RNA病毒，有囊膜，表面有包膜糖蛋白GP，是唯一负责病毒进入宿主的病毒蛋白，中心为螺旋状核衣壳，包括基因组RNA及其他6种病毒蛋白[Feldmann,H.；Geisbert,TW.；Jahrling,PB.,etal.Filoviridae.In:Fauquet,C.；Mayo,MA.；Maniloff,J.；Desselberger,U.；Ball,LA.,editors.Virustaxonomy:VIIIthreportoftheinternationalcommitteeontaxonomyofviruses.2004.645-653.]。丝状病毒基因进化树如图5所示[SanchezA,TrappierSG,MahyBW,etal.ThevirionglycoproteinsofEbolavirusesareencodedintworeadingframesandareexpressedthroughtranscriptionalediting.ProcNatlAcadSciUSA1996；93:3602-3607]，其中埃博拉病毒的基因目前已确定5个亚型，分别为扎伊尔型(Zaire-EBOV)、苏丹型(Sudan-EBOV)、莱斯顿型(Reston-EBOV)、科特迪瓦型(Coted'lvoire-EBOV)和本迪布焦型(Bundibugyo-EBOV)，其中扎伊尔型恶性程度最强，死亡率90％以上。

埃博拉出血热和马尔堡出血热是人畜共患病，人类和灵长类动物普遍易感，主要爆发于非洲地区，美国、英国、瑞士和中东曾报道有输入病例。临床症状是突然高烧、头痛、肌痛、恶心呕吐、腹泻等，最终病人死于多器官出血衰竭、组织坏死[StreetherLA.Ebolavirus.BrJBiomedSci.1999.56(4):280-284.]。

目前尚无针对丝状病毒有效疫苗和治疗药物，主要是通过防范措施控制病毒扩散，密切监控疫情，对有出血症状的可疑病人进行隔离观察。治疗方法主要是辅助性的，包括平衡电解质、修复血小板以防止出血，由于埃博拉康复者的血清在治疗疾病中无显著作用，常用的抗病毒方法，如干扰素、利巴韦林均无效[HeinzFeldmann,ThomasWGeisbert.Ebolahaemorrhagicfever.Lancet.2011.377(9768):849-862.]，目前尚无特效治疗方法。

在针对丝状病毒药物研发方面[HeinzFeldmann,ThomasWGeisbert.Ebolahaemorrhagicfever.Lancet.2011.377(9768):849-862.]：(1)常规抗病毒治疗方法，如利巴韦林和干扰素均无效；(2)血清疗法，应用恢复期病人的血清用于病人的被动免疫治疗，结果没有定论；(3)反义RNA或干扰RNA疗法，在鼠类和非人灵长类中显示有疗效。但RNA干扰疗法受限于明确EBOV亚型序列的前提，无法应对疫情爆发早期的快速诊断；(4)针对EBOV凝血异常的症状，有报道来源于线虫的抗凝蛋白rNAPc2在治疗非人灵长类感染中有33％的疗效。

现有数据表明病人的生存率与病毒量密切相关，当病毒量低于10^4.5pfu/ml血液的病人存活率大大提高[GeisbertTW,HensleyLE,LarsenT,etal.PathogenesisofEbolahaemorrhagicfeverincynomolgusmacaques:evidencethatdendriticcellsareearlyandsustainedtargetsofinfection.AmJPathol.2003；163:2347–2370.]。因此，尽量降低病毒的复制速度，让宿主的先天和后天免疫应答来克服感染是抗丝状病毒药物研发的重要策略，阻断丝状病毒进入的抑制剂研发有重大意义。

以宿主为靶点进行抗病毒药物筛选是当前病毒学研究领域的热点。病毒的进入需要宿主蛋白的参与。针对丝状病毒进入宿主的过程，2005年和2011年分别发现细胞内含体/溶酶体中的组织蛋白酶B(CathepsinB)和NPC1蛋白(NiemannPickC1)是宿主应答丝状病毒侵入的关键因子。另外，2014年最新报道发现细胞膜表面的磷脂酰丝氨酸受体AXL也是重要的EBOV进入相关的宿主因子[KartikChandranetal.EndosomalProteolysisoftheEbolaVirusGlycoproteinIsNecessaryforInfection.Science.2005.308:1643-1645.]。

阿比朵尔(结构式I)是1993年首先由Trofimov等合成并报道[Trofimov,F.A.etal.,Synthesisofanewantiviralagent,arbidole.Pharm.Chem.J.1993.27,75–76.]，由前苏联Moscow-basedMasterlek^TM药厂研发的抗流感药物。该药物在前苏联(现俄罗斯)已应用超过20年，主要用于甲型和乙型流感病毒引起的呼吸道疾病[Boriskin,Y.S.,etal.,Arbidol:abroad-spectrumantiviralcompoundthatblocksviralfusion.2008.Curr.Med.Chem.15,997–1005.]。在我国阿比朵尔也作为人用药和兽药用于流感的预防和治疗[Berendsen,B.J.,etal.,Quantitativetraceanalysisofabroadrangeofantiviraldrugsinpoultrymuscleusingcolumn-switchliquidchromatographycoupledtotandemmassspectrometry.Anal.Bioanal.Chem.2012.402,1611–1623.]。

除抗流感病毒外，研究还发现阿比朵尔对多种RNA病毒感染都有阻断作用，如副粘病毒科的呼吸道合胞病毒[Shi,L.,etal.,AntiviralactivityofarbidolagainstinfluenzaAvirus,respiratorysyncytialvirus,rhinovirus,coxsackievirusandadenovirusinvitroandinvivo.Arch.Virol.2007.152,1447–1455.]、小核糖核酸病毒科的脊髓灰质炎病毒、鼻病毒和柯萨奇病毒[Brooks,M.J.,etal.,Antiviralactivityofarbidol,abroad-spectrumdrugforuseagainstrespiratoryviruses,variesaccordingtotestconditions.J.Med.Virol.2012.84,170–181.；Zhong,Q.,etal.,AntiviralactivityofArbidolagainstCoxsackievirusB5invitroandinvivo.Arch.Virol.2009.154,601–607.]、本扬病毒科的汉坦病毒[Deng,H.Y.,etal.,Efficacyofarbidolonlethalhantaanvirusinfectionsinsucklingmiceandinvitro.ActaPharmacol.Sin.2009.30,1015–1024.]、披盖病毒科的基孔肯亚病毒[Delogu,I.,etal.,InvitroantiviralactivityofarbidolagainstChikungunyavirusandcharacteristicsofaselectedresistantmutant.2011.AntiviralRes.90,99–107.]、肝DNA病毒科的乙型肝炎病毒[Zhao,C.,etal.,Synthesisandinvitroanti-hepatitisBvirusactivitiesofsomeethyl5-hydroxy-1H-indole-3-carboxylates.Bioorg.Med.Chem.2006.14,2552–2558]、黄病毒科的丙型肝炎病毒[Blaising,J.,etal.,Arbidolinhibitsviralentrybyinterferingwithclathrin-dependenttrafficking.AntiviralRes.2013.100,215–219.]和本扬病毒科的克里米亚-刚果出血热病毒[LisaOestereich,etal.,EvaluationofAntiviralEfficacyofRibavirin,Arbidol,andT-705(Favipiravir)inaMouseModelforCrimean-CongoHemorrhagicFever.2014.PLOSNeglectedTropicalDiseases.8,e2804.]。现在研究认为，阿比朵尔是通过干扰clathrin通路阻断病毒进入过程。虽然针对阿比朵尔对多种病毒感染有抑制作用，但经文献检索未见有对其抗丝状病毒(包括埃博拉病毒和马尔堡病毒)活性的报道。

本发明是基于应用埃博拉病毒感染模型对1600个上市药物进行普筛，发现阿比朵尔可阻断EBOV感染宿主细胞。我们又应用马尔堡病毒感染模型评价了阿比朵尔，发现该药物也可有效抑制马尔堡病毒的感染。我们判断阿比朵尔具有可阻断丝状病毒的感染的作用。

发明内容

本发明解决的技术问题是，提供阿比朵尔在制备预防或治疗抗丝状病毒的药物中的应用。

所述的丝状病毒包括但不限定于马尔堡病毒。

所述的丝状病毒包括但不限定于埃博拉病毒。

所述的埃博拉病毒为扎伊尔型、苏丹型、莱斯顿型、科特迪瓦型和本迪布焦型。优选为扎伊尔型、苏丹型。

具体而言，为解决的本发明的技术问题，采用如下技术方案：

本发明提供了如结构式(I)所示的阿比朵尔在预防或治疗抗丝状病毒的药物中的应用

上述的应用中，所述的药物是以结构式(I)所示的阿比朵尔作为有效成分的药物组合物

上述的应用中，所述的药物组合物还含有其它的抗病毒药。

上述的应用中，所述的丝状病毒包括埃博拉病毒和马尔堡病毒。

本发明再一方面还涉及以本发明化合物作为活性成份的药物组合物。该药物组合物可根据本领域公知的方法制备。可通过将本发明化合物与一种或多种药学上可接受的固体或液体赋形剂和/或辅剂结合，制成适于人或动物使用的任何剂型。本发明化合物在其药物组合物中的含量通常为0.1-95重量％。

本发明化合物或含有它的药物组合物可以单位剂量形式给药，给药途径可为肠道或非肠道，如口服、静脉注射、肌肉注射、皮下注射、鼻腔、口腔粘膜、眼、肺和呼吸道、皮肤、阴道、直肠等。

给药剂型可以是液体剂型、固体剂型或半固体剂型。液体剂型可以是溶液剂(包括真溶液和胶体溶液)、乳剂(包括o/w型、w/o型和复乳)、混悬剂、注射剂(包括水针剂、粉针剂和输液)、滴眼剂、滴鼻剂、洗剂和搽剂等；固体剂型可以是片剂(包括普通片、肠溶片、含片、分散片、咀嚼片、泡腾片、口腔崩解片)、胶囊剂(包括硬胶囊、软胶囊、肠溶胶囊)、颗粒剂、散剂、微丸、滴丸、栓剂、膜剂、贴片、气(粉)雾剂、喷雾剂等；半固体剂型可以是软膏剂、凝胶剂、糊剂等。

本发明化合物可以制成普通制剂、也制成是缓释制剂、控释制剂、靶向制剂及各种微粒给药系统。

为了将本发明化合物制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种赋形剂，包括稀释剂、黏合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂、助流剂。稀释剂可以是淀粉、糊精、蔗糖、葡萄糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、微晶纤维素、硫酸钙、磷酸氢钙、碳酸钙等；湿润剂可以是水、乙醇、异丙醇等；粘合剂可以是淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、微晶纤维素、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乙基纤维素、丙烯酸树脂、卡波姆、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇等；崩解剂可以是干淀粉、微晶纤维素、低取代羟丙基纤维素、交联聚乙烯吡咯烷酮、交联羧甲基纤维素钠、羧甲基淀粉钠、碳酸氢钠与枸橼酸、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠等；润滑剂和助流剂可以是滑石粉、二氧化硅、硬脂酸盐、酒石酸、液体石蜡、聚乙二醇等。

还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。

为了将给药单元制成胶囊剂，可以将有效成分本发明化合物与稀释剂、助流剂混合，将混合物直接置于硬胶囊或软胶囊中。也可将有效成分本发明化合物先与稀释剂、黏合剂、崩解剂制成颗粒或微丸，再置于硬胶囊或软胶囊中。用于制备本发明化合物片剂的各稀释剂、黏合剂、润湿剂、崩解剂、助流剂品种也可用于制备本发明化合物的胶囊剂。

为将本发明化合物制成注射剂，可以用水、乙醇、异丙醇、丙二醇或它们的混合物作溶剂并加入适量本领域常用的增溶剂、助溶剂、pH调剂剂、渗透压调节剂。增溶剂或助溶剂可以是泊洛沙姆、卵磷脂、羟丙基-β-环糊精等；pH调剂剂可以是磷酸盐、醋酸盐、盐酸、氢氧化钠等；渗透压调节剂可以是氯化钠、甘露醇、葡萄糖、磷酸盐、醋酸盐等。如制备冻干粉针剂，还可加入甘露醇、葡萄糖等作为支撑剂。

此外，如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂或其它添加剂。

本发明的发明人发现阿比朵尔可特异性的阻断丝状病毒感染宿主细胞。还可以和其他的抗病毒药物进行联合用药。

为达到用药目的，增强治疗效果，本发明的药物或药物组合物可用任何公知的给药方法给药。

本发明化合物药物组合物的给药剂量依照所要预防或治疗疾病的性质和严重程度，患者或动物的个体情况，给药途径和剂型等可以有大范围的变化。一般来讲，本发明化合物的每天的合适剂量范围为0.001-150mg/kg体重，优选为0.1-100mg/kg体重，更优选为1-60mg/kg体重，最优选为2-30mg/kg体重。上述剂量可以一个剂量单位或分成几个剂量单位给药，这取决于医生的临床经验以及包括运用其它治疗手段的给药方案。

本发明的化合物或组合物可单独服用，或与其他治疗药物或对症药物合并使用。当本发明的化合物与其它治疗药物存在协同作用时，应根据实际情况调整它的剂量。

有益技术效果

阿比朵尔已在临床使用，其安全性、药物代谢特性、毒副作用已经明确。而此次发现这个药物抗丝状病毒的新用途将可快速使其应用于高危病毒感染，缓解疫情。

附图说明

图1.埃博拉病毒和马尔堡病毒感染模型

图2.阿比朵尔阻断扎伊尔型埃博拉病毒感染活性。

图3.阿比朵尔阻断苏丹型埃博拉病毒感染活性。

图4.阿比朵尔阻断马尔堡病毒感染活性。

图5.丝状病毒基因进化树。

具体实施方式

实施例1.筛选模型的原理

丝状病毒进入宿主细胞是病毒感染的第一步，抑制病毒的进入就可有效阻断病毒感染。丝状病毒包膜表面的糖蛋白(Glycoprotein，GP)是丝状病毒进入过程的关键蛋白。

我们合成了扎伊尔型埃博拉病毒的包膜GP基因(EBOV-ZaireGP，GeneAccessionNo.L11365)、苏丹型埃博拉病毒包膜GP基因(EBOV-SudanGP,GeneAccessionNo.FJ968794.1)和马尔堡病毒包膜GP基因(MarburgGP,GeneAccessionNo.NC_001608.3)。通过共转染表达GP蛋白质粒和pNL4-3-Luc-R^-E^-，可获得丝状病毒GP为外壳包裹HIV核心的EBOV重组病毒EBOV-GP/HIV[ManicassamyB,WangJ,JiangH,RongL.ComprehensiveanalysisofebolavirusGP1inviralentry.JVirol.2005；79:4793-805.]和Marburg重组病毒MGP/HIV[ManicassamyB,WangJ,etal.CharacterizationofMarburgvirusglycoproteininviralentry.Virology.2007；358:79-88]。该病毒颗粒具有以下特点：1)病毒对宿主细胞的选择性取决于GP的特性；2)由于HIV载体上env、nef和vpr基因缺失，因此该病毒只能一次性进入宿主细胞并且不能复制，所以该病毒是安全的；3)该HIV载体上带有一个荧光素酶报告基因，因此被感染的细胞会表达荧光素酶，通过检测荧光素酶活性就可标示细胞被病毒感染的程度。模型构建结果见图1。

实施例2.实验方法

在本发明中应用了EBOV-Zaire(GeneAccessionNo.L11365)、EBOV-Sudan(GeneAccessionNo.FJ968794.1)和Marburg(GeneAccessionNo.NC_001608.3)对阿比朵尔抗丝状病毒感染进行药理活性评价：

重组病毒制备[ManicassamyB,WangJ,JiangH,RongL.ComprehensiveanalysisofebolavirusGP1inviralentry.JVirol.2005；79:4793-805.]：共转染2μgpcDNA3.1/EBOV-ZaireGP质粒(或2μgpcDNA3.1/EBOV-SudanGP质粒或2μgpcDNA3.1/MarburgGP质粒)和2μgpNL4-3-Luc-R^-E^-质粒至293T细胞，转染后48h收集上清，上清液经0.45μm滤膜过滤，该上清中含有EBOV-ZaireGP/HIV病毒颗粒(或EBOV-SudanGP/HIV病毒颗粒或MarburgGP/HIV病毒颗粒)，该重组病毒可用于感染。

感染[ManicassamyB,WangJ,JiangH,RongL.ComprehensiveanalysisofebolavirusGP1inviralentry.JVirol.2005；79:4793-805.]：感染前一天，按每孔6×10⁴个细胞的密度将293细胞接种到24孔板上。用DMSO溶解阳性对照化合物或待筛选化合物，感染前15分钟加入细胞培养液中，以DMSO溶剂作空白对照。加入适宜稀释度的病毒液感染细胞。感染48小时后，弃去上清，然后向被感染的细胞每孔加入50μl细胞裂解液(Promega)裂解细胞，将30μl荧光素酶底物(Promega)与20μl细胞裂解液混合后用FB15荧光检测器(Sirius)仪器测定细胞荧光素酶的相对活性，其活性的强弱反映了病毒的感染的水平。结果显示，阿比朵尔可有效抑制丝状病毒对宿主细胞的感染，结果见表1，量效曲线见图2-4。

表1阿比朵尔对EBOV-Zaire重组病毒感染的作用

Claims (6)

1.如结构式(I)所示的阿比朵尔在制备预防或治疗抗丝状病毒的药物中的应用

2.根据权利要求1的应用，其特征在于，所述的药物是以结构式(I)所示的阿比朵尔作为有效成分的药物组合物

3.根据权利要求2的应用，其特征在于，所述的药物组合物还含有其它的抗病毒药。

4.根据权利要求1-3中任一项的应用，其特征在于，所述的丝状病毒为埃博拉病毒。

5.根据权利要求4的应用，其特征在于，所述的埃博拉病毒为扎伊尔型、苏丹型、莱斯顿型、科特迪瓦型和本迪布焦型。

6.根据权利要求1-3任一项的应用，其特征在于，所述的丝状病毒为马尔堡病毒。