DE60022083T2

DE60022083T2 - Neutralisierungsmittel für toxin der zur gattung clostridium gehörende mikroorganismen

Info

Publication number: DE60022083T2
Application number: DE60022083T
Authority: DE
Inventors: Masakazu Obihiro-shi NISHIMURA; Yoshio Obihiro-shi SHIMIZU
Original assignee: Japan Science and Technology Agency
Current assignee: Japan Science and Technology Agency
Priority date: 1999-11-29
Filing date: 2000-11-29
Publication date: 2006-03-30
Anticipated expiration: 2020-11-30
Also published as: US20060292247A1; US20030069396A1; US20050064050A1; CN1402718A; DE60022083D1; AU1648901A; EP1236724B1; CN1196693C; KR20030019299A; EP1236724A4; KR100509288B1; EP1236724A1; WO2001040213A1

Description

Technisches Gebiet
Die in der vorliegenden Anmeldung beschriebene Erfindung betrifft ein neutralisierendes Mittel für das Toxin von Clostridium-Mikroorganismen. Insbesondere betrifft die in der vorliegenden Anmeldung beschriebene Erfindung ein neutralisierendes Mittel für Clostridium-Mikroorganismen und Pharmazeutika oder Nahrungsmittel und Getränke, die dasselbe enthalten.
Stand der Technik
Seit alters ist bekannt, dass Tee, in der ganzen Welt regelmäßig getrunken, vielfältige Wirkungen besitzt. Parallel zum gegenwärtigen Gesundheitsboom haben die Möglichkeiten des Tees großes Interesse auf sich gezogen, und aktive Untersuchungen auf Gebieten wie Chemie und Medizin sind gegenwärtig im Gange.
Obwohl es verschiedene Teesorten gibt, einschließlich von Grünem Tee, Oolongtee und Schwarztee, werden Teeblätter generell von Camellia sinensis (L./O. Kuntze), einem immergrünen Baum aus der Theaceen-Gattung Camellia, gewonnen, und werden gemäß der Verarbeitungsverfahren unter verschiedenen Namen klassifiziert.
Teeblätter enthalten verschiedene Inhaltsstoffe, darunter organische Substanzen wie Proteine, freie Aminosäure, Koffein, Alkaloide, Polyphenole, Kohlenhydrate, organische Säuren, Fett, Farbstoffe wie Chlorophyll und Karotinoide und Vitamine, außerdem lösliche und unlösliche anorganische Substanzen. In Abhängigkeit vom Verarbeitungsverfahren der Teeblätter variieren diese Inhaltsstoffe stark, und die Inhaltsstoffe, die durch heißes Wasser extrahiert werden oder im Aroma enthalten sind, sind noch unterschiedlicher.
Tee enthält Catechin, das eine Art von Polyphenol ist, und Enzyme wie die Polyphenoloxidase, die die Catechine oxidieren. Grüner Tee wird erhalten, wenn die Enzyme durch Erhitzen in einem frühen Schritt der Verarbeitung der Teeblätter inaktiviert werden, während Schwarztee dadurch erhalten wird, dass den Enzymen ermöglicht wird, die Catechine vollständig zu oxidieren.
Grüner Tee wird als nicht-fermentierter Tee bezeichnet und dadurch erhalten, dass die Teeblätter zuerst durch Dampf oder Auslegen in Pfannen erhitzt werden, um die Enzyme wie die Polyphenoloxidase zu inaktivieren, und dann getrocknet werden. Die Hauptinhaltsstoffe des Grünen Tees sind Aminosäuren wie Theanin, Glutamat und Aspartat; Catechine wie Epigallocatechingallat, Epicatechingallat, Epigallocatechin und Epicatechin; Koffein; Zucker wie Saccharose, Glukose und Fructose; und Chlorophyll, die Ursache der grünen Farbe der Teeblätter. Farbe, Geschmack und Geruch Grünen Tees variieren in Abhängigkeit von den relativen Anteilen dieser Komponenten. Die Stoffe, die das Aroma des Grünen Tees enthalten, umfassen verschiedenartige Verbindungen wie Dimethylsulfid, Phenylethylalkohol, Benzylalkohol, β-Ionon, Nerolidol, 4-Vinylphenol, Pyrazine und Pyrrole, und bestimmen seinen Duft.
Schwarztee wird dagegen als fermentierter Tee bezeichnet und dadurch erhalten, dass die Teeblätter ausgebreitet werden und bei niedrigen Temperaturen ihr Wasser verdunsten, um die Enzyme zu aktivieren und die Blätter zu erweichen, gefolgt von Druckanwendung, um zur Förderung der Oxidation Inhaltsstoffe wie die Catechine der Luft auszusetzen. Die typische rotbraune Farbe schwarzen Tees geht auf Farbstoffe wie Theaflavin zurück, das durch die Oxidation von Catechinen wie Epicatechin und Epigallocatechin durch die Polyphenoloxidase gebildet wird; Thearubigin, ein Polymer, das durch die weitere Oxidation von Theaflavin gebildet wird; und hochmolekulare Oxidationspolymere, die durch noch weitergehende Oxidationspolymerisation von Thearubigin entstehen.
Obwohl rohe Teeblätter nur eine geringe Menge Alkohol enthalten, erhöht die Verarbeitung erheblich die Menge an Linallol, Geraniol, Methylsalicylat, Iononverbindungen, Lactonen, Trans-2-hexenal, einem Heißaromainhaltsstoff, der aus Zuckern und Aminosäuren gebildet wird, und so weiter.
Hinzu kommen verschiedene andere Arten von Tee, etwa gerösteter Grüner Tee und Roter Tee, die durch eine Nachbearbeitung von Grünem Tee hergestellt werden; Oolongtee, bekannt als halbfermentierter Tee; und solche, die andere Pflanzen enthalten. Jede Art enthält verschiedene Inhaltsstoffe, eine Vielzahl von Inhaltsstoffen, die mit heißem Wasser extrahiert werden, und verschiedene aromatische Inhaltsstoffe; die Wirkungen aller Inhaltsstoffe haben Aufmerksamkeit auf sich gezogen und werden mit Einsatz untersucht.
Insbesondere ist es in jüngerer Zeit wissenschaftlich nachgewiesen worden, dass Polyphenole wie Catechin, Tannin und Tannsäure verschiedene Wirkungen haben, zum Beispiel wirken sie antioxidativ, antibakteriell, hemmen den Anstieg von Cholesterin, Fetten, Blutdruck und Blutzucker und besitzen Antitumorwirkung. Verschiedene Produkte, die Catechine und Tannin enthalten, etwa gesunde Nahrungsmittel, Getränke, Arzneimittel, Deodorantien und antibakterielle Wirkstoffe, werden gegenwärtig beforscht und entwickelt.
Jedoch ist über die große Anzahl der im Tee zu findenden Inhaltsstoffe mit der Ausnahme von Catechin und Tannin sehr wenig bekannt. Insbesondere mit Blick auf die antibakteriellen Wirkungen ist es unklar, welche Art von Substanz gegen welchen speziellen Mikroorganismus oder gegen welches Toxin wirksam ist. Daher ist das Verständnis bislang auf die Tatsache beschränkt, dass Grüner Tee die höchste antibakterielle Wirkung besitzt; spezifische Komponenten, die eine neutralisierende Wirkung gegenüber spezifischen Bakterien aufweisen, müssen noch identifiziert werden.
Unter den verschiedenen Mikroorganismen, die den menschlichen Körper bedrohen, sind Clostridium botulinum und Clostridium tetani. Beide sind anaerobe Bakterien aus der Gattung Clostridium, im Erdboden reichhaltig vertreten, und es ist bekannt, dass die von ihnen produzierten Toxine ähnlich sind und fast gleiche Molekulargewichte besitzen. Die Toxine dieser Clostridium- Mikroorganismen haben lähmende Wirkungen auf das motoneurale Skelettmuskelsystem, die zu sehr hoher Mortalität führen, und Verhinderung der Infektion ist notwendig.
Clostridium botulinum bildet gegen Hitze und Desinfektionsmittel äußerst widerstandsfähige Sporen, wächst beispielsweise in Lebensmitteln, zwischen 3°C und 40°C bei einem pH-Wert von 4,5, ohne Sauerstoff, in der Anwesenheit von Wasser und Nährstoffen, und bildet Toxin. Die Latenzzeit des Bakteriums beträgt 12 bis 36 Stunden, aber das hergestellte Toxin ist ein mögliches Nervengift, das bei Aufnahme Müdigkeit, Schwindel und gastrointestinale Symptome wie Übelkeit und Erbrechen bewirkt, dann allmählich zu neuralen Problemen wie Kopfschmerzen, Sichtbeeinträchtigung, Schluckbeschwerden und Gehbeschwerden führt, im Ernstfall schließlich zu Atemnot und Tod.
Obwohl in Japan viele Fälle von Botulismus durch "Izushi"-Fisch ausgelöst werden, sind in den vergangenen Jahren viele Fälle durch importierte Flaschen- und Dosenlebensmittel, Schinken, Würste und ähnliches vorgekommen, und üblicherweise wird Botulismus-Antitoxin als Heilmittel verabreicht.
Clostridium tetani hingegen ist ein grampositiver Anaerobier, der nicht nur in Erdboden und Wasser existiert, sondern auch im menschlichen Darmtrakt. Dringt er jedoch durch eine verschmutzte äußere Wunde in den Körper ein, etwa Verletzungen infolge von Verkehrsunfällen, Schnitten durch Bambus, Holzsplitter oder alte Nägel, so wird ein Toxin hergestellt und ins Blut freigesetzt. Die Latenzzeit von Clostridium tetani beträgt normalerweise 1 bis 2 Wochen, und wenn das Toxin hergestellt wird, verursacht es von Anfang an neurale Symptome wie Kaumuskelkrampf und Risor sardonicus, die allmählich zu Verkrampfung und Versteifung aller Körpermuskeln führen, und ruft Atemnot hervor, die zum Tode führt. Die Mortalitätsrate infolge dieses Toxins liegt bei 70 bis 80 %.
Impfung ist das wirksamste Mittel zur Verhinderung von Tetanus und vorgeschrieben. Obwohl heute auch Kombinationsimpfungen durchgeführt werden, werden Erwachsene normalerweise mit Tetanustoxoid geimpft. Da jedoch eine Zusatzimpfung erforderlich ist, und bei einer Infektion mehr als fünf Jahre nach der ursprünglichen Impfung außerdem subkutane Injektion von Tetanustoxin erforderlich ist, sind nur relativ wenige Leute tatsächlich gegen Tetanus geimpft.
Daher werden Infektionen durch Clostrium-Mikroorganismen oftmals erst nach dem Auftreten der toxinbedingten Symptome erkannt, wodurch die Patienten in hohe Gefahr gebracht werden und sofortige medizinische Behandlung durch einen Arzt erforderlich gemacht wird.
Nahrungsmittelvergiftung ist auch in der Lebensmittelbranche besonders gefürchtet, und verschiedene Verfahren zur Sterilisierung und Desinfektion werden erprobt und verwendet. Jedoch verliert, wie oben beschrieben, Clostridium botulinum seine Giftigkeit erst nach einer langen Hitzebehandlung, die sich nicht für alle Arten von Nahrungsmitteln eignet. Außerdem bevorzugt Clostridium botulinum anaerobe Lebensbedingungen, wie sie in konservierten Nahrungsmitteln wie Flaschen- und Dosenkonserven vorliegen, was die Vorsorge noch mehr erschwert.
Ein anderes Problem besteht darin, dass, obwohl verschiedene neutralisierende Mittel und Desinfektionsmittel entwickelt werden, die meisten neutralisierenden Mittel und Desinfektionsmittel, die gegen diese Toxine hochwirksam sind, dazu tendieren, auch für den menschlichen Körper schädlich zu sein. In den vergangenen Jahren hat sich, namentlich infolge von Problemen wie Allergien, in der Bevölkerung eine Abneigung gegen Nahrungsmittelzusätze ausgebreitet, und Lebensmittel mit wenigen oder gar keinen Zusätzen werden bevorzugt.
Daher ist eine einfache und wirksame Methode, Clostridium-Mikroorganismen und die von ihnen hergestellten tödlichen Neurotoxine zuverlässig zu neutralisieren oder entfernen, bislang noch nicht bekannt.
Daher wurde die der vorliegenden Anmeldung gemäße Erfindung mit Blick auf die oben beschriebenen Fakten entwickelt. Das Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, die Probleme der konventionellen Technologien zu lösen und ein sicheres und handhabbares neutralisierendes Mittel zur Verfügung zu stellen, das gegen die von Clostridium-Mikroorganismen produzierten Toxine wirksam ist, wobei es Teeblattextrakte als wirksame Komponente verwendet.
Beschreibung der Erfindung
Die folgenden Erfindungen dienen der Lösung der Probleme der herkömmlichen Technologien.
In anderen Worten, die der vorliegenden Anmeldung gemäße Erfindung beschreibt zuerst ein neutralisierendes Mittel für von Clostridium-Mikroorganismen herrührende Toxine, das Thearubigin als wirksame Komponente enthält.
Zweitens beschreibt die der vorliegenden Anmeldung gemäße Erfindung für die obengenannte erste Erfindung ein neutralisierendes Mittel für von Clostridium-Mikroorganismen herrührende Toxine, wobei das Thearubigin eine Art von braunem Pigment ist, das in Teeblättern enthalten ist.
Drittens beschreibt die der vorliegenden Anmeldung gemäße Erfindung für die obengenannte erste und zweite Erfindung ein neutralisierendes Mittel für von Clostridium-Mikroorganismen herrührende Toxine, wobei das Thearubigin ein mit Wasser oder heißem Wasser erhaltener Extrakt von Teeblättern ist, und viertens das neutralisierende Mittel für von Clostridium-Mikroorganismen herrührende Toxine, wobei Thearubigin ein alkoholischer Extrakt von Teeblättern ist, erhalten nach Extraktion mit Wasser oder heißem Wasser.
Fünftens beschreibt die der vorliegenden Anmeldung gemäße Erfindung ein neutralisierendes Mittel für von Clostridium-Mikroorganismen herrührende Toxine, wobei das Thearubigin gemäß der ersten bis vierten Erfindung eine Art von oxidativem Polymer des Theaflavins ist, dargestellt in der folgenden chemischen Formel [1]
(worin R ein Wasserstoffatom oder eine Galloyl-Gruppe ist).
Sechstens beschreibt die der vorliegenden Anmeldung gemäße Erfindung ein neutralisierendes Mittel für von Clostridium-Mikroorganismen herrührende Toxine, wobei das Thearubigin gemäß der fünften Erfindung eine Art von oxidativem Polymer des Theaflavins ist, dargestellt in der folgenden chemischen Formel [2]
(wobei R' ein Wasserstoffatom oder eine Galloyl-Gruppe ist), mit einer Struktur der folgenden Formel [3]
(wobei R ein Wasserstoffatom oder eine Galloyl-Gruppe ist).
Siebtens beschreibt die der vorliegenden Anmeldung gemäße Erfindung ein Arzneimittel, das irgendeines der oben beschriebenen neutralisierenden Mittel für von Clostridium-Mikroorganismen herrührende Toxine enthält, und achtens, ein Nahrungsmittel oder Getränk, das irgendeines der oben genannten neutralisierenden Mittel für von Clostridium-Mikroorganismen herrührende Toxine als Zusatz enthält.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
1 ist ein Diagramm, das die Reaktion eines mit Clostridium botulinum infizierten motoneuralen Skelettmuskelsystems auf elektrische Reizung zeigt. Hier stellt IT die Muskelkontraktion bei elektrischer Reizung des Nervenstumpfs dar, DT die Muskelkontraktion bei direkter elektrischer Reizung des Skelettmuskelsystems, a das System, zu dem Botulismus-Neurotoxin zugegeben wurde (15 μl einer Lösung von Botulismus-Neurotoxin A (BoNT/A) mit einer Konzentration von 1 mg/ml wurde einem 20 ml-Reagenzglas zugesetzt, um eine Lösung von 1,5 nM zu erhalten), b das System, zu dem ein Gemisch von Botulismus-Neurotoxin und Thearubigin (15 μl einer Lösung von Botulismus-Neurotoxin A (BoNT/A) mit einer Konzentration von 1 mg/ml) zugesetzt wurde, und c das System, das nur Thearubigin (10 μl der Extraktlösung) zugesetzt wurde.
2 ist ein Diagramm, das die Reaktion des Nervenstumpfs des motoneuralen Skelettmuskelsystems auf elektrische Reizung in einem Reagenzglas, dem Tetanustoxin (330 μl einer Lösung Tetanustoxin (TeTx) mit einer Konzentration von 1 mg/ml wurden einem 20 ml-Reagenzglas zugesetzt, um eine Lösung von 4 μg/ml zu erhalten) zugesetzt wurde, zeigt. Hier stellt a das System dar, dem Tetanustoxin zugesetzt wurde, b stellt das System dar, dem ein Gemisch von Tetanustoxin (330 μl einer Lösung von Tetanustoxin mit einer Konzentration von 1 mg/ml) und Thearubigin (10 μl der Extraktlösung) zugesetzt wurde, und c stellt das System dar, dem nur Thearubigin (10 μl der Extraktlösung) zugesetzt wurde.
Beste Ausführungsform der Erfindung
Die Erfinder stellten fest, dass Schwarztee das Neurotoxin von Clostridium botulinum schwächt, und fanden durch umfangreiche Forschungen heraus, dass Thearubigin, das in Teeblättern enthaltene braune Pigment, das von Clostridium botulinum produzierte Toxin neutralisieren kann, und entwickelten die vorliegende Erfindung durch weitere Untersuchung dieser Befunde.
Wie zuvor beschrieben, ist die Anzahl der heute bekannten Inhaltsstoffe in Teeblättern enorm, aber das neutralisierende Mittel gemäß der vorliegenden Erfindung und Anmeldung für Toxine von Clostridium-Mikroorganismen enthält Thearubigin als wirksamen Inhaltsstoff. Hier ist der wirksame Inhaltsstoff, Thearubigin, als eine Art von braunem Farbstoff beschrieben worden, der in Schwarztee und ähnlichem vorkommt. Er ist auch als das oxidative Polymer von Theaflavin, der zuvor (Formel [1]) beschriebenen Verbindung, charakterisiert worden.
Es wird angenommen, dass Theaflavin und Thearubigin durch die Polyphenoloxidasevermittelte Oxidation von Catechinen in Teeblättern entstehen, und Thearubigin gilt als ein Poly mer, das aus einer solchen Oxidation hervorgeht. Obwohl die Struktur von Thearubigin nicht vollständig aufgeklärt ist, ist eine Verbindung mit der Struktur der folgenden chemischen Formel [3]
(wobei R eine Galloyl-Gruppe ist) von Katiyar et al. vorgeschlagen worden (Katiyar, S.K. und Mukhtar, H., Carcinogenesis 18, 1911-16 (1997)). Hier ist die Galloyl-Gruppe ein Substituent, der durch die folgende chemische Formel [4]
dargestellt wird.
Das erfindungsgemäße neutralisierende Mittel für Toxine von Clostridium-Mikroorganismen enthält das oben beschriebene Thearubigin als wirksamen Inhaltsstoff und kann präziser angegeben werden als der mit Wasser oder heißem Wasser zu erhaltende Extrakt von Teeblättern, insbesondere von Teeblättern, die braune Farbstoffe enthalten, wie Schwarztee. In diesem Fall ist der Extrakt bevorzugt aus fermentiertem Tee, erhalten durch Steigerung der enzymatischen Aktivität und Oxidation von Catechinen während der Verarbeitung der Teeblätter. Weiterhin ist unter den fermentierten Tees Schwarztee besonders bevorzugt. Weiterhin kann das erfindungsgemäße neutralisierende Mittel für Toxine von Clostridium-Mikroorganismen ein Extrakt aus Teeblättern wie beispielsweise aus geröstetem Grünen Tee sein, die durch nachträgliche Bearbeitung unfermentierten Tees erhalten wurden.
Extraktion mit Wasser oder heißem Wasser wird beispielsweise ausgeführt unter Verwendung von Wasser mit Umgebungstemperatur (ungefähr 10°C bis 30°C) oder von heißem Wasser (über 30°C bis zum Siedepunkt). Wirksamer wird die Extraktion mit heißem Wasser von 60°C oder mehr durchgeführt.
Nötigenfalls kann die extrahierte wässrige Phase unter Verwendung von Alkohol weiter extrahiert werden, gefolgt von Reinigung mit organischen Lösungsmitteln wie beispielsweise Estern.
Erfindungsgemäß werden insbesondere, wie in den nachfolgenden Beispielen beschrieben, die nach Extraktion mit Wasser oder heißem Wasser durch Alkohol, bevorzugt Alkohole wie Buta nol, Isopropanol, Isobutanol, Hexanol, vorzugsweise Butanol, extrahierten Inhaltsstoffe als geeignete neutralisierende Mittel dargestellt.
Obwohl das erfindungsgemäße Neutralisierungsmittel für Toxine von Clostridium-Mikroorganismen auf alle Arten von Clostridium-Mikroorganismen wirkt, ist es besonders wirksam zur Neutralisierung der Neurotoxine von Clostridium botulinum und Clostridium tetani. Im hier verwendeten Sprachgebrauch bezieht sich der Ausdruck "Neutralisierung" auf die Inhibition, Reduzierung und Vernichtung jedweder negativen Wirkung der Toxine, die von Mikroorganismen der Gattung Clostridium hergestellt werden.
Das erfindungsgemäße Neutralisierungsmittel für Toxine von Clostridium-Mikroorganismen kann beispielsweise verwendet werden, um Toxine von Clostridium-Mikroorganismen in mit Clostridium-Mikroorganismen kontaminierten Nahrungsmitteln zu entgiften, als Arzneimittel, Reinigungsmittel oder Desinfektionsmittel, das auf mit Clostridium-Mikroorganismen infizierte Wunden durch Ausbreiten, Sprayen oder Wischen aufgebracht werden kann.
Weiterhin kann das erfindungsgemäße Neutralisierungsmittel für die während des Herstellungsvorgangs verschiedener Lebensmittel zugesetzt und zur Vorsorge gegen durch Toxine von Clostridium-Mikroorganismen verursachte Lebensmittelvergiftung verwendet werden. Beispiele solcher Lebensmittel sind Konserven in Flaschen und Dosen, Schinken, Wurst, Kamaboko (Fischwurst), Izushi und Honig, aber sind nicht auf diese beschränkt. Weiterhin kann der Zusatz dieses Neutralisierungsmittels in jedem Schritt der Lebensmittelproduktion einschließlich Verarbeitung und Verpackung geschehen.
Da das im erfindungsgemäßen Neutralisierungsmittel für Toxine von Clostridium-Mikroorganismen enthaltene Thearubigin ein aus Teeblättern extrahierter natürlicher Farbstoff ist, ist das erfindungsgemäße Neutralisierungsmittel für Mensch und Umwelt unschädlich; daher ist es äußerst sicher und kann bevorzugt als Arzneimittel- oder Lebensmittelzusatz verwendet werden.
Die Ausführung der vorliegenden Erfindung wird in den folgenden Beispielen detaillierter beschrieben, wobei Bezug auf die beigefügten Zeichnungen genommen wird. Überflüssig zu sagen, das die anmeldungsgemäße Erfindung nicht auf die folgenden Beispiele beschränkt ist, und dass verschiedene Details verfügbar sind.
Beispiele
<Zubereitung 1> Abtrennung von Thearubigin durch Extraktion
90 ml kochendheißem Wasser wurden 12 g Schwarzteeblätter zugesetzt und 2 Minuten stehen gelassen, danach wurde durch einen Whatman No.2-Filter filtriert. 40 ml Chloroform wurden 40 ml des erhaltenen Extraktes zugesetzt, und nach 3 Minuten kräftigen Rührens wurde die wässrige Phase von der organischen Phase getrennt. 40 ml Ethylacetat wurden 40 ml der wässrigen Phase zugesetzt und 3 Minuten kräftig gerührt. Abermals wurden die wässrige und die organische Phase voneinander getrennt, und 1-Butanol wurde 40 ml der wässrigen Phase zugesetzt und für weitere 3 Minuten kräftig gerührt. Nur die organische Phase (1-Butanol-Schicht) wurde gewon nen und bis zur Trockne in einem Rotationsverdampfer eingedampft, um den Extrakt zu erhalten (Thearubigin = TRB). Das erhaltene Thearubigin wurde in 2 ml Wasser aufgelöst, um eine Thearubiginlösung zuzubereiten.
<Zubereitung 2> Herstellung lebender Präparate des motoneuralen Skelettmuskelsystems und Überprüfung der Skelettmuskelkontraktionen
Lebendpräparate des motoneuralen Skelettmuskelsystems wurden hergestellt und die Kontraktion des Skelettmuskels als Reaktion auf elektrische Reizung des Nervenstumpfs wurde im Reagenzglas bestätigt, ebenso die ähnliche Kontraktion des Skelettmuskels als Reaktion auf eine direkte elektrische Reizung des Skelettmuskels.
<Beispiel 1> Neutralisierende Wirkung von Thearubigin auf Botulismus-Neurotoxin
Botulismus-Neurotoxin (BoNT), ein Gemisch von BoNT und TRB, und TRB alleine wurden getrennt Reagenzgläsern zugesetzt, die die präparierten lebenden Exemplare des motoneuralen Skelettmuskelsystems enthielten.
1 zeigt die Reaktion des motoneuralen Skelettmuskelsystems auf elektrische Reizung (IT: Muskelkontraktion infolge elektrischer Reizung des Nervenstumpfs; DT: Muskelkontraktion bei direkter elektrischer Reizung des Skelettmuskels).
Muskelkonzentration infolge direkter elektrischer Reizung des Skelettmuskels wurde durch BoNT nicht inhibiert, aber Muskelkontraktion auf elektrische Reizung des Nervenstumpfs wurde inhibiert (1a).
Durch das Gemisch von BoNT und TRB wurde hingegen die Muskelkontraktion als Reaktion auf die elektrische Reizung des Nervenstumpfes nicht inhibiert (1b).
Weiterhin beeinflusste TRB alleine nicht die Kontraktion des Skelettmuskels (1c).
Hierdurch wurde bestätigt, dass Thearubigin das Botulismus-Neurotoxin neutralisiert. Weiterhin zeigte Thearubigin alleine keine Wirkung auf die Kontraktion motoneuraler Skelettmuskelsysteme.
<Beispiel 2> Neutralisierende Wirkung von Thearubigin auf Tetanustoxin
Auf ähnliche Weise wie in Beispiel 1 wurden Tetanustoxin (TeTx), beziehungsweise TeTx und TRB oder nur TRB lebenden Präparaten des motoneuralen Skelettmuskelsystems zugesetzt und die Reaktionen des motoneuralen Skelettmuskelsystems auf elektrische Reizung wurden verglichen.
2 zeigt die Reaktion des motoneuralen Skelettmuskelsystems auf elektrische Reizung. Muskelkontraktion infolge elektrischer Reizung des Nervenstumpfes wurde durch Zusatz von TeTx blockiert (2a), während sie auf die normale Weise geschah, wenn TeTx und TRB zugesetzt wurden (2b). Des Weiteren wurde Muskelkontraktion infolge elektrischer Reizung nicht durch TRB alleine blockiert (2c).
Auf diese Weise wurde nachgewiesen, dass Thearubigin auch auf Tetanustoxin eine neutralisierende Wirkung ausübt.
<Beispiele 3 und 4> und <Vergleichsbeispiele 1-4> Neutralisierende Wirkung von Teeblattextrakten auf Botulismus-Toxin
Auf ähnliche Weise wie in den Beispielen 1 und 2 wurde die Muskelkontraktion des motoneuralen Skelettmuskelsystems als Reaktion auf elektrische Reize zwischen Proben mit Heißwasserextrakten aus Schwarztee (Beispiel 3) und aus geröstetem Grünen Tee (Beispiel 4) zusammen mit BoNT sowie einer Probe mit BoNT alleine verglichen.
Des Weiteren wurde die Muskelkontraktion als Antwort auf elektrische Reizung des motoneuralen Skelettmuskelsystems auf gleiche Weise untersucht, wobei Grüner Tee (Vergleichsbeispiel 1), Tannsäure (Vergleichsbeispiel 2), Catechin (Vergleichsbeispiel 3) und Theaflavin (Vergleichsbeispiel 4) zusammen mit BoNT zugesetzt wurden.
Tabelle 1 zeigt die neutralisierende Wirkung jeder einzelnen Verbindung auf Botulismus-Neurotoxin. Tabelle 1: Neutralisierende Wirkungen der Inhaltsstoffe von Teeblattextrakten auf BoNT

+:: Neutralisierend wirksam
–:: Nicht neutralisierend wirksam

Die Systeme, denen Schwarztee, gerösteter Grüner Tee oder Thearubigin zugesetzt wurden, zeigten neutralisierende Wirkung auf BoNT, aber Grüner Tee, Tannsäure, Catechin und Theaflavin zeigten keine neutralisierende Wirkung. Insbesondere war die neutralisierende Wirkung auf BoNT in dem System, dem Schwarztee zugesetzt wurde, hoch. Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass Schwarzteeextrakte eine starke neutralisierende Wirkung auf Botulismus-Neurotoxin ausüben, und da Extrakte aus Schwarztee und geröstetem Grünen Tee, die neutralisierende Wirkungen ausüben, Thearubigine als mindestens eine Art von braunen Farbstoffen enthalten, wurde geschlussfolgert, dass diese eine neutralisierende Wirkung auf Botulismus-Neurotoxin ausüben.
<Beispiel 5> Neutralisierende Wirkung von Thearubigin auf Botulismus-Neurotoxin (2)
Eine Dosis von 100 μl (= 100 μg) Botulismus-Neurotoxin, mit einer Konzentration von 1 mg/ml in einem Natriumacetat-Kochsalz-Puffer aufgenommen (0,05 M Acetat, 0,2 M Natriumchlorid, pH 6,0) wurde jeder einzelnen Maus oral verabreicht. Gemischtes TRB (die oben extrahierte Lösung) wurde oral verabreicht, entweder ein gleiches Volumen (ein einfaches Volumen), ein doppeltes Volumen, ein vierfaches Volumen oder als Gemisch mit BoNT (Mischverhältnisse: 1, 2 und 4). Tabelle 2 zeigt die Ergebnisse. Tabelle 2: Überlebensrate von Mäusen bei oraler Gabe von BoNT und TRB

BoNT:: (100 μg = 100 μl)/Tier
TRB(n):: n·Thearubiginvolumen
BoNT:: Botulismus-Neurotoxin
/A, /B, /E:: A-, B-, E-Typ

Alle Mäuse, denen BoNT (Typen A, B und E) oral verabreicht wurde, starben. Dagegen überlebten 100 % der Mäuse, denen Gemische aus BoNT (Typen A, B und E) und TRB (4faches Volumen des BoNT) oral verabreicht wurden.
Da alle Mäuse, denen BoNT (Typ A) und ein gleiches Volumen TRB verabreicht wurden, starben, und 3 von 8 Mäusen, denen BoNT und doppelt soviel TRB verabreicht wurden, überlebten, wurde eine zuverlässige neutralisierende Wirkung von TRB auf BoNT beobachtet, wenn davon etwa das vierfache Volumen des Toxins verabreicht wurde. Hingegen überlebten alle Mäuse, denen TRB alleine oral verabreicht wurde, was zeigt, dass TRB in diesem Dosisbereich keine Toxizität aufweist.
Gewerbliche Anwendbarkeit
Wie oben im Einzelnen dargelegt, beschreibt die vorliegende Erfindung ein neutralisierendes Mittel für Toxine aus Clostridium-Mikroorganismen, das Toxine aus Clostridium-Mikroorganismen wie Clostridium botulinum und Clostridium tetani neutralisieren kann, gegenüber lebenden Organismen und der Umwelt äußerst sicher ist und leicht angewendet werden kann.

Claims

Neutralisierendes Mittel für von Clostridium-Mikroorganismen herrührende Toxine, das Thearubigin als seine wirksame Komponente beinhaltet.
Neutralisierendes Mittel für von Clostridium-Mikroorganismen herrührende Toxine nach Anspruch 1, wobei das Thearubigin wenigstens eine Art der braunfarbigen Pigmentkomponenten von Teeblättern ist.
Neutralisierendes Mittel für von Clostridium-Mikroorganismen produzierte Toxine nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Thearubigin ein Wasser- oder Heißwasserextrakt aus Teeblättern ist.
Neutralisierendes Mittel für von Clostridium-Mikroorganismen herrührende Toxine nach Anspruch 1 oder 2, wobei Thearubigin ein nach Extraktion mit Wasser oder Heißwasser erhaltener Alkoholextrakt aus Teeblättern ist.
Neutralisierendes Mittel für von Clostridium-Mikroorganismen herrührende Toxine nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Thearubigin eine Art der oxidativen Polymere von Theaflavin der allgemeinen chemischen Formel [1]
(worin R für ein Wasserstoffatom oder eine Galloyl-Gruppe steht) ist.
Neutralisierendes Mittel für von Clostridium-Mikroorganismen herrührende Toxine nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Thearubigin eine Art der oxidativen Polymere von Theaflavin der allgemeinen chemischen Formel [2]
(worin R' für ein Wasserstoffatom oder eine Galloyl-Gruppe steht) mit einer Struktur der folgenden Formel [3]
(worin R für ein Wasserstoffatom oder eine Galloyl-Gruppe steht) ist.
Neutralisierendes Mittel für von Clostridium-Mikroorganismen herrührende Toxine, erhältlich mit einem Verfahren, wobei man: fermentierte Teeblätter mit Wasser extrahiert; und den Wasserextrakt mit einem Alkohol extrahiert, wobei das Mittel Thearubigin beinhaltet.
Nahrungsmittel oder Getränk, welches das neutralisierende Mittel für von Clostridium-Mikroorganismen herrührende Toxine nach einem der Ansprüche 1 bis 7 als Zusatz beinhaltet.
Verwendung des neutralisierenden Mittels für von Clostridium-Mikroorganismen herrührende Toxine nach einem der Ansprüche 1 bis 7 als Zusatz für Nahrungsmittel.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die das neutralisierende Mittel für von Clostridium-Mikroorganismen herrührende Toxine nach einem der Ansprüche 1 bis 6 beinhaltet.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 10, wobei die Zusammensetzung eine topische pharmazeutische Zusammensetzung zur Anwendung an Wunden durch Streichen, Sprühen oder Wischen ist.
Neutralisierendes Mittel für von Clostridium-Mikroorganismen herrührende Toxine nach einem der Ansprüche 1 bis 7 oder pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 10 oder 11 zur Verwendung als Reinigungsmittel oder Desinfiziermittel zur Anwendung an Wunden, die mit Clostridium-Mikroorganismen und ihren Toxinen infiziert sind, durch Streichen, Sprühen oder Wischen.
Verwendung des neutralisierenden Mittels für von Clostridium-Mikroorganismen herrührende Toxine nach einem der Ansprüche 1 bis 7 zur Herstellung eines Medikaments zum Hemmen, Vermindern und Aufheben einer beliebigen negativen Wirkung der von Clostridium-Mikroorganismen herrührenden Toxine.