DE60210276T2

DE60210276T2 - Impfkomplex zur vorbeugung und behandlung von leishmaniasis

Info

Publication number: DE60210276T2
Application number: DE60210276T
Authority: DE
Inventors: Gerard Papierok; Serge Vicens; Jean-Loup Lemesre
Original assignee: Bio Veto Test SARL
Current assignee: Bio Veto Test SARL
Priority date: 2001-06-11
Filing date: 2002-05-30
Publication date: 2006-11-30
Anticipated expiration: 2022-05-31
Also published as: BRPI0210317B1; BR0210317A; DE60210276D1; CY1105309T1; BRPI0210317B8; WO2002100430A1; ES2260440T3; BRPI0210317C1; FR2825633B1; WO2002100430B1; EP1395282B1; EP1395282A1; US20060073170A1; ATE321568T1; FR2825633A1; PT1395282E

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft einen spezifischen, aus Exkretions-Sekretions-Antigenen von Leishmania zusammengesetzten immunmodulatorischen Komplex und dessen Anwendung bei durch pathogene intrazelluläre Mikroorganismen hervorgerufenen Infektionen beim Säuger, insbesondere beim Menschen, Kaniden, Feliden und Equiden.
Genauer gesagt, betrifft die vorliegende Erfindung einen therapeutischen Impfstoffkomplex für die Prävention oder die Behandlung von Leishmaniosen und durch pathogene intrazelluläre Mikroorganismen hervorgerufene Infektionen beim Säuger, insbesondere beim Menschen, Kaniden, Feliden und Equiden, wobei sich dieser Impfstoffkomplex vor allem dadurch auszeichnet, dass er aus Exkretions-Sekretions-Molekülen aus Amastigoten und/oder Promastigoten von Leishmania sp. zusammengesetzt ist, die in einem definierten axenischen und serumfreien Medium hergestellt werden.
Leishmaniosen stellen eine Gruppe endemischer, ja sogar epidemischer parasitärer Infektionen der tropischen und subtropischen Zonen dar. Die für diese Krankheiten verantwortlichen pathogenen Erreger sind die Leishmanien, begeißelte Protozoen aus der Klasse der Trypanosomatiden und der Gattung Leishmania. Diese Parasiten befallen zahlreiche Säugerarten, u.a. den Menschen und den Hund, die das hauptsächliche häusliche Reservoir dieser Krankheiten darstellen. Die Leishmanien werden durch den infizierenden Stich einer Mücke, des so genannten Phlebotoms, auf die verschiedenen Wirte übertragen. Neunzehn Leishmanienspezies sind potentiell in der Lage, den Menschen zu infizieren. Je nach der jeweiligen Leishmanienspezies und wirtspezifischen Faktoren (genetisch, immunologisch, etc.) rufen sie sehr unterschiedliche klinische Manifestationen hervor. Sie entwickeln sich hauptsächlich zu drei verschiedenen klinischen Formen: Kutan, mukokutan und viszeral, je nachdem, ob die Parasiten das mononukleäre phagozytische System der Haut, der Schleimhaut oder der Eingeweide befallen. Die Hautläsion kann am Inokulationspunkt des Parasiten lokalisiert bleiben und in benigner Form mit Spontanheilung verlaufen. Daneben kommen schwerere, durch diffus kutane und mukokutane Leishmaniosen hervorgerufene, sehr mutilierende und entstellende Krankheitsbilder vor.
Die viszerale Leishmaniose betrifft das mononukleäre Phagozytensystem zahlreicher Organe und Gewebe, insbesondere der Leber, der Milz und des Knochenmarks (Hepatomegalie und Splenomegalie). Unbehandelt verläuft sie tödlich.
Wie alle Krankheiten mit vektorieller Übertragung weisen die Leishmaniosen einen relativ einfachen Entwicklungszyklus auf, da dieser auf zwei Wirte, Säuger und Phlebotom, verteilt ist und zwei Hauptformen umfasst:

– eine begeißelte, so genannte promastigote Form, die im Verdauungstrakt des Vektors Phlebotom lebt, wo sie sich vermehrt, bevor sie ihre für den Säugerwirt infektiöse, auch metazyklisch genannte Form annimmt;
– eine unbegeißelte, so genannte amastigote Form, die im Säugerwirt, u.a. dem Hund und dem Menschen, existiert.

Das Phlebotom lebt in den heißen Klimazonen (warmes mediterranes oder tropisches Klima). Für seine Entwicklung benötigt es eine Temperatur von über 17°C (Idealtemperatur zwischen 22 und 25°C), eine feuchte Atmosphäre und windstille Wetterbedingungen.
Die suburbanen Zonen der Mittelmeerländer mit der dort vermehrten Anwesenheit von Hunden stellen die entsprechenden Umweltbedingungen für die Vermehrung der Phlebotome (Misthaufen, Bauernhöfe, Gärten, Holzverschläge, Mauern, bewässerte Rasen), was eine höhere Insektendichte in der Nähe von Haushunden und Menschen begünstigt.
Leishmaniosen stellen auch heute noch ein schwerwiegendes Problem für die Volksgesundheit dar, insbesondere in den Entwicklungsländern, und haben eine erhebliche Bedeutung als Studienobjekt und im Bereich der Grundlagen- und angewandten Forschung auf dem Gebiet der Immunphrophylaxe. 97 über vier der fünf Kontinente verteile Länder sind von Leishmaniosen betroffen. Ungefähr 18 Millionen Menschen leiden weltweit an dieser Parasitose, von der ca. 380 Millionen Menschen auf der ganzen Welt bedroht sind. Die Zahl der jährlichen Neuerkrankungen beträgt ca. 2 Millionen, wobei 90 % der Fälle auf Indien, den Sudan und Brasilien fallen. Vor 15 Jahren wurde das weltweite jährliche Auftreten auf 400.000 Fälle geschätzt (300.000 Fälle von kutaner Leishmaniose (LC) und 100.000 Fälle von viszeraler Leishmaniose (LV), mit einer Gesamtzahl von 12 Millionen klinischen Fällen und einer Risikopopulation von ca. 350 Millionen Menschen. Heute wird das weltweite jährliche Auftreten auf 1,5 bis 2 Millionen jährlicher Neuerkrankungen geschätzt, davon 1 bis 1,5 Millionen Fälle von LC und 500.000 Fälle von LV.
Wenn auch die Bevölkerung der tropischen und subtropischen Zonen in erster Linie von diesen Krankheiten betroffen ist, wird doch das Ansteckungsrisiko von Hunden und Menschen im Mittelmeerbecken oft unterschätzt. Die von Leishmania infantum verursachte viszerale Leishmaniose, die weit über die verschiedenen Kontinente der Alten Welt verbreitet ist, findet sich im gesamten Umkreis des Mittelmeerbeckens, mit einem Brennpunkt im Süden Frankreichs. Zwar scheinen Vektor wie auch Parasit im Süden Frankreichs besser an den Hund als an den Menschen adaptiert zu sein, jedoch steigt das Auftreten menschlicher Leishmaniose, das derzeit auf etwa 100 Fälle jährlich geschätzt wird, seit 10 Jahren stark an und wird durch die wachsende Anzahl immundeprimierter Personen weiterhin verstärkt.
Außerdem werden die Leishmaniosen als eine der bei AIDS auftretenden opportunistischen Krankheiten betrachtet. Man zählt ca. 1.500 Fälle von Koinfektion HIV/Leishmania im Süden Europas. Das sind 90 % der weltweit ermittelten Fälle, wobei Spanien mit ca. 60 % dieser Fälle am stärksten betroffen ist.
Hauptreservoir des Parasiten ist der Haushund. Die Leishmaniose des Hundes, eine im Mittelmeerraum häufig auftretende Krankheit, zeigt sich in verschiedenen klinischen Formen, die häufig zum Tod des Tieres führen. In bestimmten Gebieten des städtischen Umfeldes kann die Prävalenz der Leishmaniose des Hundes 30 % der Hundepopulation betreffen. Nach Berrahal et coll (Am. J.Trop.Med.Hyg, 1996, 55, 273-277) sind im Endemiegebiet 85 % der Hunde PCR (Polymerase-Kettenreaktion)-positif.
Derzeit existieren keine wirksamen immunprophylaktischen Mittel gegen diese Krankheiten. Die Therapie der Leishmaniosen bedient sich einiger verfügbarer Moleküle: fünfwertiges Antimon, Pentamidin, Pyrazolopyrimidine, Amphotericin B, Aminosidin. Allgemein scheint sich heute die Auffassung durchzusetzen, dass die Kombination Antimon + Pyrazolopyrimidine bei der Leishmaniose des Hundes als Mittel der Wahl anzusehen ist. Nichtsdestoweniger bleiben die behandelten Hunde trotz offensichtlicher klinischer Heilung infektiös.
Das bedeutet, dass die symptomatische Besserung nicht mit einer signifikanten Verringerung der Parasitenlast einhergeht und dass auch bei andauernder klinischer Heilung weiterhin ein epidemiologisches Risiko besteht. Diese Situation wird durch das Erscheinen von Chemoresistenzphänomenen weiter kompliziert.
Obwohl die Probleme der Chemoresistenz eine beträchtliche Therapieerschwernis darstellen, ist man immer noch nicht in der Lage, deren Prävalenz im Endemiegebiet zu bestimmen und sie bei den Patienten zu diagnostizieren. Ebenso sind die molekularen Grundlagen dieser im medizinisch wichtigen (d.h. amastigoten) Stadium des Parasiten induzierten Resistenz noch nicht bekannt.
Schließlich stellen die Fälle von Koinfektion AIDS/Leishmaniose ein ernstes Problem für die Volksgesundheit dar, da die verfügbaren Therapien bei AIDS-Kranken ebenso wie bei allen immundeprimierten Personen wenig wirksam sind.
Derzeit steht kein wirksamer Impfstoff für die Bekämpfung dieser Krankheiten zur Verfügung, und ihre Behandlung erfolgt notgedrungen über die Chemotherapie. Letztere ist leider aufgrund der langen, toxischen und kostspieligen Behandlungen gefährdet, die mit zahlreichen Rückfällen und dem Auftreten von Chemoresistenzphänomenen einhergehen. Es erscheint heute offensichtlich, dass die Behandlung dieser parasitären Krankheiten langfristig von der Entdeckung neuer therapeutischer Zielstrukturen und/oder Vakzine abhängt.
Die vorliegende Erfindung stellt einen Leishmania-spezifischen therapeutischen Impfstoffkomplex vor, dessen Wirkung auf der Immunantwort des infizierten Säugerwirts beruht.
Die zahlreichen Studien über Immunantworten im Verlauf von murinen Experimentalleishmaniosen haben die vorherrschende Rolle der zellvermittelten Immunität und das Vorliegen einer Dualität in der Immunantwort aufgezeigt. Grundsätzlich existieren zwei Arten von Reaktionen auf ein Zusammentreffen mit Leishmanien: die eine wird als "Sensibilität", die andere als "Resistenz" bezeichnet. Auf dem Umweg über die von ihnen abgesonderten Lymphokine begrenzen oder verstärken die verschiedenen Unterpopulationen der Lymphozyten T (CD4+) die Infektion. So wurde gezeigt, dass die Unterpopulation der T-Helfer-Lymphozyten Typ Th1 (Bildung von Gammainterferon und Interleukin 2) in der Lage war, die intrazellulären amastigoten Formen über den Umweg der Makrophagenaktivierung auszuschalten (Reiner S.L. et al., Annu Rev Immunol, 1995, 13, 151-177. Review). Umgekehrt ist die Unterpupulation der T-Helfer-Lymphozyten Typ Th2 (Bildung von Interleukin 4) für die Exazerbation der Krankheit verantwortlich.
Einige dieser Vorgänge laufen beim Menschen ähnlich ab. Beim Hund (natürlicher, für den Entwicklungszyklus von L. Infantum empfänglicher „Reservoir"-Wirt), ist die Dualität der Immunantwort wahrscheinlich. Nur eine von Pinelli et al. (Infect. immun., 62:229, 1994) angefertigte Studie über experimentell und natürlich mit L. infantum infizierte Tiere hat aufgezeigt, dass die Asymptomatik des Hundes (häufig anzutreffender klinischer Zustand) mit der Abwesenheit einer humoralen Reaktion und einer zellulär vermittelten Immunität vom Typ Th1 mit positiver Überempfindlichkeitsreaktion vom verzögerten Typ und erhöhten Interleukin-2- und Kachektin (TNF-α)-Werten in den biologischen Flüssigkeiten einherging.
Ein guter Impfstoffkandidat muss daher einem oder mehreren stark immunogenen parasitären Antigenen entsprechen, die in der Lage sind, entweder die Differenzierung der Lymphozyten Th2 zu blockieren (Gurunathan S et al., J.Exp Med, 1997 Oct 6, 186, 1137-1147) (den bei Fällen von Allergie routinemäßig praktizierten „Desensibilisierungs"-Behandlungen vergleichbares Interventionsverfahren) oder die Bildung von Lymphozyten Th1 zu begünstigen, die eine Schutzimmunität induzieren.
Die vorliegende Erfindung betrifft einen therapeutischen und präventiven Imstoffkomplex gegen Leishmania, der eine Impfkraft besitzt, die an die Anwesenheit von spezifischen Exkretions-Sekretions-Antigenen gegen Leishmania durch Aktivierung der Th1-Antwort gebunden ist.
Eine Impfung gegen Leishmanien in Betracht zu ziehen, ist auch heute noch problematisch. Zahlreiche Versuche werden unternommen, jedoch mit mäßigen und/oder widersprüchlichen Ergebnisseen. Genannt werden können die Verwendung lebender Parasiten, bestrahlter Parasiten und völlig abgetöteter Parasiten (Moreau Y et coll, 1994. Médecine et Armées, 22, 1, 89-93), die bei Mäusen und beim Menschen wechselnde Schutzgrade ergeben haben.
In den 80er Jahren wurden gereinigte Parasitenantigenextrakte beim Hund verwendet, die eine Exazerbation der Krankheit herbeiführten: Fraktion LIF2 und antiidiotypischer Impfstoff der Gruppe um Dr. Montjour. (CHAUVY, J << Essais d'immunotherapie sur une population canine en zone d'endémie leishmanienne >> thèse n°36.1993-OGUNKOLADE B.W et coll. Vet Parasitol, 1988, 28, 33-41). Andere Antigene wie die membranassoziierten Antigene gp63 und Lipophosphoglykan (MOREAU Y et coll. Médecine et Armées, 1994, 22, 1, 89-93) haben kein befriedigendes Ergebnis erbracht. Derzeit werden Versuche zu mehreren Molekülen angestellt, deren endgültiges Ergebnis noch aussteht. Als Beispiel zitieren wir das Hitzeschockprotein HSP83 von Leishmania major, das die Th1-Antwort und das Protein DP72 stimuliert Dennoch ermöglicht keines der derzeit verfügbaren Immunisierungsproteine einen ausreichenden Schutz oder ein in jedem Fall reproduzierbares Ergebnis.
Bis zum heutigen Tag wurde keine Arbeit mit Exkretions-Sekretions-Antigenen von Leishmania durchgeführt.
Die vorliegende Erfindung besteht in einem immunmodulatorischen Komplex unter Verwendung dieser Exkretions-Sekretions-Proteine mit einem Adjuvans, das entweder eine reproduzierbare Immunstimulation des T-Lyphozytensystems Typ Th1 oder eine Immunmodulation der Lymphozyten Typ Th2 hin zum Typ Th1 induziert.
Für viele Parasiten wie Plasmodium, Babesia, Trypanosoma, Toxoplasma oder Schistosoma wurde gezeigt, dass die Exkretions-Sekretions-Antigene (AES) eine hervorstechende Rolle beim Aufbau der Immunantwort des Wirts spielten. Die Leishmanien-AES scheinen in die Penetration des Makrophagen durch die Parasiten, die Hemmung proteolytischer lysosomaler Enzyme des Makrophagen und die negative Regulierung der Moleküle des Haupthistokompatibilitätskomplexes involviert zu sein (Alexander et Russel, Adv. Parasitol, 1992, 31, 175-254). Im Übrigen wurden Ansätze für Schutzimpfungen mit AES gegen verschiedene Parasitosen bei der Maus mit Erfolg in Angriff genommen (Quaissi et al, Parasitology, 1990, 100, 115-24; James et al., Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg., 1989, 83, 67-72; Précigout et al, Infect. Immun., 1991, 59, 2799-805; Darcy et al., Ann. Biol. Clin., 1989, 47, 451-7; Capron et al., Mem. Inst. Oswaldo Cruz., 1995, 90, 235-4).
Ihre Verwendung in der Impfung wurde jedoch dadurch erschwert, dass sie schwer zu produzieren waren und sich zahlreiche Serum- und/oder Zellkontaminanten auf der Kulturoberfläche befanden.
Das in der Patentanmeldung WO 94/26 899 beschriebene Kulturmedium ermöglicht eine teilweise Lösung dieser Schwierigkeiten und die Verfügung über eine ausgiebige, saubere und preiswerte Quelle für AES der ersten parasitären Leishmanien-Stadien.
Um aus der Kultur einen guten Ertrag an Leishmanien-Promastigoten und -Amastigoten zu erzielen, wurde das Kulturmedium des Patents WO 94/26 899 wie folgt modifiziert:

• Bei der Amastigoten-Kultur wurde die Beimengung von Schwefelverbindungen wie L-Cystein und/oder Nährprodukten wie Bathocuproin-Disulfonsäure unterlassen. Das Grundmedium MA1 mit den schwefeligen Komponenten ist folgendermaßen zusammengesetzt:

Je 1000 ml Medium MA1 werden 3 mM L-Cystein und 0,01 mM Bathocuproin-Disulfonsäure zugesetzt.
Das Medium MA1m (m für modifiziert) ist das Medium MA1 ohne L-Cystein und ohne Bathocuproin-Disulfonsäure, andererseits wurde das bovine Hämin durch mit 25 kilogray bestrahltes porcines Hämin in einer erheblich niedrigeren Konzentration ersetzt (0,003 mM).
Die Medien MA1 und MA1m wurden mit einem Stamm von Leishmania infantum MON1 beimpft, und ein Vergleich des Wachstumsverlaufs der Amastigoten wird durchgeführt (siehe 1).

• Bei der Promastigotenkultur besteht die Modifikation gegenüber dem Referenzmedium hauptsächlich in einer verringerten Konzentration der beiden Bestandteile (RPMI und Hämin) sowie der Zusetzung eines Antibiotikums (Gentamicin).

Dem ist hinzuzufügen, dass das bovine Hämin wie bei der Modifizierung des Mediums für die Amastigoten durch mit 25 kilogray bestrahltes porcines Hämin ersetzt wurde.
Die Medien MP und MPm wurden mit einem Stamm von Leishmania infantum MON1 beimpft, und ein Vergleich des Wachstumsverlaufs der Promastigoten wird vorgenommen (siehe 2).
Der erfindungsgemäß erhaltene Komplex enthält von den Promastigoten und/oder Amastigoten von Leishmaien sp. natürlich exkretierte Moleküle sowie ein Adjuvans, das hauptsächlich eine zellulär vermittelte Antwort induziert.
Diese Moleküle weisen mindestens ein gemeinsames Epitop auf einem oder mehreren Hauptproteinen auf. Ihr Molekulargewicht schwankt je nach Leishmanienspezies und jeweiligem Parasitenstadium zwischen 32 kDa und 200 kDa (3: Nachweis eines gemeinsamen Epitops bei den verschiedenen Leishmanienspezies durch den monoklonalen Antikörper F5. A : Extrakte Triton X-100 von Promastigoten, 1 et 2: L. amazonensis (45 kDa). 3 et 4: L. infantum (54 kDa). 5 : L. chagasi (36 kDa), B: AES von Promastigoten). Diese nativen Moleküle, die nicht aufgelistete Proteaseaktitäten exprimieren (4a : Proteaseaktivität (Elektrophoresegel mit Gelatine), 1 = Kontrollimpfstoffkomplex, 2 et 3 = untersuchter Impfstoffkomplex) nicht aufgelistet (weder Metallo-, noch Serin-, noch Cysteinprotease), weisen keinerlei Serum- oder Zellkontaminanten auf.
Die promastigoten oder amastigoten Formen werden in einem axenischen und serumfreien Medium kultiviert, das gemäß dem in der oben erwähnten Patentanmeldung WO 94/26 beschriebenen Verfahren mit der von der Anmelderin vorgenommenen Modifizierung vollständig beschrieben ist.
Die Kulturen werden mit 5·10⁵ Parasiten pro Milliliter Kulturmedium inokuliert. Nach der Inkubation werden die Parasiten durch tangentiale Filtration mit einer 0,16-μ-Polyethersulfonmembran entfernt, und das Filtrat wird durch tangentiale Filtration mit einem 3 kDa-Filter aus Polyethersulfon 100-fach konzentriert.
Jede lyophilisierte, nach einer Dosiswirkungsstudie (5, 6 und 7) festgelegte Dosis ist zusammengesetzt aus einem Lyophilisat von 100 μg Exkretions-Sekretions-Proteinen von Leishmanien und einem Verdünnungsmittel, bestehend aus 1 ml sterilem physiologischen Serum.
Die so erhaltene Zusammenstellung wird dem infizierten Säuger in Anwesenheit eines Adjuvans, vorzugsweise Muramyldipeptid, verabreicht.
Das Verhältnis Protein/Adjuvans liegt vorzugsweise zwischen 1 : 0,5 und 1 : 4.
Die am Hund durchgeführten Studien haben es ermöglicht, die optimale Impfdosis auf 200 μg Muramyldipeptid festzusetzen, wobei ab 100 μg infizierter Proteine eine beginnende Reaktion festzustellen war.
Der spezifische Wirkmechanismus des erfindungsgemäß erhaltenen Impfkomplexes wird mit Hilfe von klassischen Methoden ermittelt, die die Dosierung der Proteine, ihre Identifizierung und die Messung ihrer Proteaseaktivität ermöglichen (Techniken des Western Blot oder Immunoblotting und SDS-PAGE), weiterhin mit Hilfe von spezifischeren Methoden, die zeigen, dass die Wirkung des innovativen therapeutischen Impfstoffkomplexes entweder auf einer Immunstimulation des Lyphozytensystems Typ Th1 oder einer Immunmodulation des Typs Th2 hin zum Typ Th1 beruht.
Das Verfahren Western Blot ermöglicht den individuellen Nachweis von Proteinen, vor allem von amastigoten Exkretions-Sekretions-Proteinen (ESA) und promastigoten Exkretions-Sekretions-Proteinen (ESP) durch die Reaktion Antigen/Antikörper mit den entsprechenden Immunseren.
Für jeden untersuchten Säuger (z.B. den Hund) wird eine serologische Analyse mit ESA und ESP vorgenommen.
Die Proteine des Impfkomplexes werden zunächst durch diskontinuierliche Elektrophorese mit Polycrylamidgel (PAGE) in Anwesenheit von Dodecylnatriumsulfat (SDS) getrennt. Auf diese Trennung folgt eine elektrophoretische Übertragung der Proteine auf eine Nitrozellulosemembran gemäß dem Verfahren von Towbin et al. (Proc. Nath. Acad.Sci, 1979, 76, 4350-4354). Diese Proteine werden anschließend durch immunenzymatische Reaktion mittels eines monoklonalen Anti-ESP-Antikörpers nachgewiesen (4b: Western Blot, erhalten mit einem monoklonalen Anti-AES-Antikörper von Promastigoten, 4b1: Markerproteine (kDa), 4b2: zu kontrollierende ESP-Menge, 4b3: ESP-Referenzmenge).
An einer dem untersuchten Kandidaten, z.B. einem Hund, direkt entnommenen Probe wird eine parasitologische Untersuchung durchgeführt.
Ein Knochenmarksausstrich auf Folie wird ausgeführt. Sobald dieser Ausstrich in Methanol fixiert ist, wird er mit der May-Grünwald-Giemsa-Methode gefärbt und mit dem Immersionsmikroskop (× 1000) betrachtet.
Die Knochenmarksentnahmen werden im biphasischen Kulturmedium NNN ((Novy and Mac Neal, 1904, J. Infec. Dis., 1 :1-30) kultiviert, dessen flüssige Phase in RPMI 1640 besteht, dem 20 % dekomplementiertes fötales Kalbsserum zugesetzt wurde. Alle vier bis sechs Tage werden weitere Blindpunktionen vorgenommen. Die Kulturen werden regelmäßig 20 Minuten lang im Photonenmikroskop (× 400) betrachtet.
Die Parasitämien werden wie folgt quantifiziert:

+1. : unbewegliche, lichtbrechende, längliche Formen;
+ : 1 bis 5 bewegliche, promastigote Formen pro Feld;
++ : > 5 bewegliche, promastigote Formen pro Feld;
+++ : – konfluente Kultur.

Nachweis der Implikation einer zellulär vermittelten Immunität vom Typ Th1:
Leishmanien promastigoter Formen werden in nach den oben beschriebenen Methoden zusammengesetzten Kulturmedien kultiviert. Parasiten im Endstadium der exponentiellen Phase (6 bis 7 Tage) werden entnommen. Das parasitäre Sediment wird durch dreimaliges Zentrifugieren (2500 g, 15 Min, 4°C) mit PBS-Puffer gewaschen. Nach Feststellung der Lebensfähigkeit der Parasiten mit Hilfe eines Vitalfarbstoffes (Trypanblau) wird eine 2 × 10⁸ Parasiten pro ml enthaltende Suspension mit 0,01 Merthiolat enthaltendem PBS-Puffer inaktiviert (Pinelli et al., 1994, Infect. Immun., 62 229-235). So entstehen die Leishmanine für den Intradermalreaktionstest (JDR).
Der nachfolgend beschriebene Test auf Immunreaktion Typ Th1 wird an Hunden ausgeführt.
Die Hunde werden seitlich gelagert, und im Thoraxbereich wird vor dem Ellbogen eine leichte und nicht störende Schur von ungefähr 5 × 10 cm ausgeführt. Mit einem Filzstift werden vier Kreise mit je einem Durchmesser von 10 mm gezeichnet.
In die Mittelpunkte der Kreise werden 0,1 ml Lösung intradermal injiziert. Zwei Kreise erhalten eine Leishmanienlösung und die beiden anderen zur negativen Kontrolle eine Kochsalz-Merthiolatlösung. Die Ablesung der intradermalen Reaktion (IDR) wird 48 Stunden später mit einem Allergieteststreifen vorgenommen.
Der Test wird als positiv angesehen, wenn das Mittel der beiden festgestellten Indurationsdurchmesser größer als oder gleich 5 mm ist. Wenn ein Erythem ohne Induration festgestellt wird, wird der Test als negativ betrachtet (Pinelli et al., 1994, Infect. Immun., 62: 229-235 ; Marty et al.. 1994, Trans. Roy. Soc. Trop. Med. Hyg., 88, 658-659).
Anschließend wird ein Lymphozytenproliferationstest durchgeführt.
Die mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMC) der Hunde werden durch Zentrifugation (800 g, 20 min bei Umgebungstemperatur) über einen Ficollgradienten (Dichte 1,078) isoliert. Diese Zellen werden auf einer Kulturplatte mit 98 Vertiefungen in einer Konzentration von 2·10⁵ Zellen pro Vertiefung in Anwesenheit von 2 μg Concanavalin A (Sigma) pro ml, von 5 μg ESP pro ml oder 20 ml in der stationären Phase des Promastigotenwachstums (SP) abgelösten Oberflächenmolekülen pro Vertiefung und in Abwesenheit jeglichen Additivs in 200 ml RPMI-1640-Medium, das 5 komplementiertes fötales Kalbsserum, 2 mM L-Glutamin, 100 U Penizillin pro ml, 100 mg Streptomyzin pro ml enthält, kultiviert. Die optimale Antigen- und Mitogen-Konzentration wurde in vorhergehenden Versuchen ermittelt. Die PBMC werden 72 Stunden lang in einer feuchten Atmosphäre bei 37°C in Anwesenheit von 5 % CO₂ und anschließend 20 Stunden lang mit 0,5 μCi de ³H-Thymidin inkubiert. Die Zellen werden auf einen Filter geerntet, und die Radioaktivitätsaufnahme wird durch Flüssigkeitsszintillationszählung (Beta-Zähler) bestimmt. Alle Versuche werden dreifach ausgeführt.
Für die Messung der Zellproliferation wird auch eine schnellere und genauere immunhistochemische Methode mit BrdU (5-Bromo-2-Desoxyuridin), einem Strukturanalogon des Thymidins, verwendet (BrdU, cell proliferation detection kit III, Boehringer Mannheim, Deutschland). In unseren Versuchen wird das BrdU nach einer Inkubationszeit von 72 Stunden 18 Stunden lang zugesetzt. Die Zellen, die das BrdU in ihre DNA inkorporiert haben, sind in Anwesenheit eines monoklonalen Anti-BrdU-Antikörpers leicht zu finden.
Die Proliferationsreaktionen werden als Stimulationsindices ausgedrückt, die das Verhältnis des Proliferationsmittelwertes nach Stimulation zum Proliferationsmittelwert in Abwesenheit von Antigenen darstellen.
Die Lymphozytenproliferation wurde des weiteren durch Betrachtung im Photonenmikroskop bewertet (– : negativ; +/– : leichte Proliferation; + : geringe Proliferation an weniger als 5 Punkten pro mikroskopischem Feld; ++ : mittlere Proliferation an mehr als 5 Punkten; +++ : starke Proliferation).
Die Titrierung der leishmaniziden Aktivität der Monozyten wird nach der unten beschriebenen LEMESRE-Methode vorgenommen.
Für diesen Test werden die Monozyten und die Lymphozyten aus venösem Blut des Hundes isoliert. Die Monozyten werden 3 Tage lang mit 105 Zellen pro Vertiefung in Kulturkammern (Labteck) in komplettem RPMI-1640-Medium, das 25 mM HEPES, 2 mM L-Glutamin, 100 U Penizillin pro ml, 100 mg Streptomycin pro ml und 10 % inaktiviertes fötales Kalbsserum enthält, bei 37°C in einer feuchten Atmosphäre, die 5 % CO2 enthält, kultiviert. Nach dreitägiger Kultivierung werden die Makrophagen im kompletten RPMI-Medium gewaschen, frisches Medium wird zugesetzt, und sie werden, je nach Versuch, eine Nacht oder 5 Stunden lang bei 37°C dem Kontakt mit metazyklischen promastigoten Formen von L. Infantum in einem Verhältnis von 5 Parasiten pro Zellen ausgesetzt. Hierauf werden die Makrophagen mit frischem komplettem RPMI-Medium gewaschen, um nicht phagozytierte Parasiten zu entfernen. Die Zellen werden entweder allein oder in Anwesenheit von 5 μg ESP-Antigenen, in Anwesenheit von autologen Lymphozyten, in Anwesenheit von Oberflächenzellen einer Kokultur mit infizierten Makrophagen und autologen Lymphozyten und entsprechenden Kontrollzellen (geerntet nach 5 Stunden) inkubiert. Dies geschieht für eine Dauer von 48 Stunden bei 37°C in einer feuchten Atmosphäre mit 5 % CO₂. Die getrennt kultivierten Lymphozyten werden, wenn sie verwendet werden, gewaschen, gezählt und den Makrophagen in einem Verhältnis von 2 Lymphozyten pro Makrophage zugesetzt.
Nach 48-stündiger Inkubation werden die Zellen dreimal mit PBS-Puffer 0,01 M, pH 7,2, gewaschen, am Methanol fixiert und mit Giemsa gefärbt. Die leishmanizide Aktivität der Makrophagen wird mit dem Photonenmikroskop (1000×) durch Feststellung des Anteils an infizierten Makrophagen und der Anzahl der intakten amastigoten Formen pro 100 Zellen (2 × 200 Zellen werden zweifach beobachtet) bestimmt. Die Ergebnisse werden als prozentualer Inhibitionsanteil des Parasitenindex = 100 – (IP × 100) ausgedrückt. IP = Parasitenindex = [(mittlere Amastigotenzahl pro Makrophage in der behandelten Probe) × (mittlere Prozentzahl infizierter Makrophagen in der behandelten Probe)]/[(mittlere Amastigotenzahl pro Makrophage in der Kontrollprobe) × (mittlere Prozentzahl infizierter Makrophagen in der Kontrollprobe)].
Die Destruktionsaktivität der Monozyten bei Kontakt mit Leishmanien kann auch durch Bestimmung des Stickstoffmonoxyds (NO)erfolgen. Die NO-Synthese durch die Monozyten ist in der Tat ein Zeichen für die Zerstörung der Leishmanine durch von Zytokinen des Typs Interferon-gamma (IFNγ) aktivierten Monozyten.
NO besitzt eine hohe chemische Reaktivität. In Anwesenheit von Wasser und Sauerstoff wird dieses Molekül rasch auf stöchiometrische Weise oxydiert und bildet so Nitrite (NO2-) gemäß folgender Reaktion: 4NO° + O₂ + 2H₂O – 4NO₂ + 4H⁺
Die Nitrite häufen sich in den Medien an und können mit Hilfe der Griess-Methode leicht nachgewiesen werden.
Pro 50 μl zu untersuchende Oberflächenschicht werden 60 μl Griess A (Sulfanilamid 1 % in HCl 1,2N) et 60 μl Griess B (N-(1-naphtyl)-ethylenediamin) zugesetzt. Die kolorimetrische Reaktion entwickelt sich unter Ausschluss von Licht innerhalb von 2 Minuten.
Die bei 540 nM gemessenen optischen Dichten (OD) werden durch Subtraktion der OD korrigiert, die in den nur Kulturmedium enthaltenden Vertiefungen gemessen werden.
Die erhaltenen Werte werden auf eine Eichkurve (OD = f(NO₂) übertragen, die aufgrund von bekannten NO₂ Konzentrationen erstellt wurde.
Die folgende Tabelle zeigt die bei unseren Versuchen erhaltenen serologischen Reaktionen und den weiteren Verlauf der Parasitämie (Analysen durchgeführt 2 und 8 Monate nach dem Infektionstest).
Legende:

IF: Immunfluoreszenz (als positiv betrachtet, wenn der Titer > 1/100 liegt)
WB: Western Blot
ELISA: Cut-off-Wert = 0,300 in OD (optische Dichte)
Parasitämie: Kultur auf NNN-Medium – = kein Vorkommen ++ = mehr als 5 bewegliche promastigote Formen pro Feld

Die folgende Tabelle zeigt die erhaltenen Reaktionen zellulärer Art und den inhibitorischen Einfluss der Seren auf die Parasitenproliferation (Analysen durchgeführt 2 Monate nach dem Infektionstest).
Legende:

• IDR: Der Test auf intradermale Reaktion wird als positiv betrachtet (+), wenn die Induration 48 h nach der intradermalen Injektion > 5 mm ist
• Lymphoblastenproliferationstest: Die Ergebnisse werden durch Betrachtung im Photonenmikroskop und als Stimulationsindex ausgedrückt (in Klammern : Stimulationsindex des Kontrolltiers + Concanavalin A)
• + : geringe Proliferation ++ : mittlere Proliferation +++ : starke Proliferation
• Leishmanizide Aktivität der Monozyten: ausgedrückt als Prozentsatz der Hemmung des Parasitenindex
• NO-Dosierung:
• Inhibitorischer Einfluss des Serums: Ergebnisse ausgedrückt als Prozentsatz der Wachstumshemmung ND = Nicht determiniert

Inhibitorische Rolle der Exkretions-Sekretions-Antikörper als Antifaktoren der parasitären Entwicklung von L. Infantum:
Diese Versuche sollen einen eventuellen Hemmeffekt der Anti-ES-Antikörper auf die Proliferation und die Differenzierung der Parasiten in vitro zeigen.
100 μl zuvor inaktiviertes ((56°C, 45 min) Immunserum verschiedener Hundegruppen wird 30 Minuten lang bei Umgebungstemperatur mit 5 × 10⁶ metazyklischen promastigoten Formen in Kontakt gebracht. Vor und nach der Behandlung (vgl. oben) werden Viabilitätstests zur Feststellung der Mortalitätsrate vorgenommen. Die so behandelten Parasiten werden entweder bei 25°C in RPMI-1640-Medium, das 10 % FCS (fötales Kalbsserum) enthält, oder bei 37°C in MAA/2O-Medium (10⁶ Parasiten pro ml Medium) kultiviert. Die Proliferationskinetik der promastigoten sowie der amastigoten Formen wird durch tägliche Zählung der Zellen im Photonenmikroskop festgestellt. Die Ergebnisse werden ausgedrückt als Prozentsatz der Wachstumshemmung
Der innovatorische Charakter des erfindungsgemäßen Impfstoffkomplexes beruht nicht nur auf der Induzierung einer spezifischen Zellantwort vom Typ Th1, sondern auch auf der Produktion geringer Mengen sehr wirksamer Antikörper gegen Promastigoten und Amastigoten von Leishmania.
Bezüglich des Ablaufs der Studien wurden weitere besondere Techniken verwendet.
Methode des Infektionstests
Der Infektionstest besteht in der intravenösen Injektion von 10⁶ Promastigoten der metazyklischen Phase, die mit einem Komplement des gesunden Hundes behandelt wurden, und 5·10⁶ peritonealen Makrophagen des gesunden Hundes, die in vitro mit Amastigoten infiziert wurden.
Die Promastigoten und die infizierten Makrophagen werden in sterilem physiologischem Serum verdünnt, bis ein Endvolumen von 1,5 ml erreicht ist. Diese Mischung wird unmittelbar vor der Injektion vorgenommen.
Nachweis der Immunglobuline G2 (IgG2) bei ES-spezifischen Hunden
Dieser Nachweis wird mit der Western-Blot-Methode unter Verwendung eines Anti-Hund-IgG2-Konjugats und mit der ELISA-Methode gemäß der Mikrotitriertechnik von Kweider et al. vorgenommen (J.Immunol, 1987, 138, 299).
Der erfindungsgemäße Impfstoffkomplex kann auf verschiedene Arten verabreicht werden. Dennoch wird er vorzugsweise auf 4 Wegen verabreicht:

– durch subkutane Injektion
– durch intradermale Injektion
– durch intramuskuläre Injektion
– auf oralem Wege

Weitere Verabreichungsformen wie parenteral oder intravenös können ebenfalls angewandt werden.
Im Allgemeinen wird ein Impfstoff in injizierbarer Form angeboten, bestehend aus einem Anteil Lyophilisat, das mit einem Anteil Flüssigkeit oder Verdünnungsmittel wieder aufgelöst wird. Die für Prävention und Immuntherapie verwendeten Dosen variieren und unterscheiden sich auch je nach Injektionsmethode:

• subkutan und intramuskulär – Injektion einer Dosis (100 μg exkretierte sekretierte Proteine und 200 μg Adjuvans) bei Hunden jeder Rasse, jeden Alters und Geschlechts für eine präventive Wirkung. – Injektion von halben Dosen (50 μg exkretierte sekretierte Proteine und 100 μg Adjuvans) für die Immuntherapie von an Leishmaniose erkrankten Hunden
• intradermal – Injektion der halben Dosis bei Hunden für eine präventive Wirkung. – Injektion einer Viertel-Dosis bei an Leishmaniose erkrankten Hunden für eine therapeutische Wirkung.

Die Injektionsmethoden werden in den Beispielen zur Immuntherapie und Vakzination und in den Studien zur Unschädlichkeit wieder aufgeführt.
Die Studien zur Unschädlichkeit des Impfstoffkomplexes wurden an 30 Hunden durchgeführt.
Alle Hunde sind erwachsene, 1 bis 6 Jahre alte Beagles, 50 % männlich und 50 weiblich, und stammen aus nicht endemischem Gebiet. Diese Hunde sind völlig gesund und serologisch sowie im Test auf intradermale Reaktion (JDR) Leishmanianegativ.
Einige der Hunde erhalten Placebos. Parallel zur klinischen Nachbeobachtung wird eine Nachbeobachtung des spezifischen Immunstatus gegenüber dem Impfstoffkomplex durchgeführt (Demonstration der Induktion von zellulär und humoral vermittelter Immunität Typ Th1 nur bei den geimpften Hunden).
Ablauf der Versuche
Die Versuche werden gemäß BPL (Bonnes Pratiques de Laboratoire (Gute Laborpraxis)) und BPC (Bonnes Pratiques Cliniques (Gute Klinikpraxis)) durchgeführt.
Die Dosen werden subkutan injiziert.
Die Toleranz wird nachbeobachtet:
Direkte visuelle Untersuchung nach Verabreichung: Schmerz, Schwellung, erhöhte Temperatur und Pruritus 14 Tage lang täglich an der Einstichstelle.
Die allgemeine Toleranz wird ebenfalls nachbeobachtet: Es handelt sich um eine kurze tägliche Untersuchung mit Temperaturmessung, eine wöchentliche veterinärklinische Untersuchung einschließlich Palpation der Kniekehlen (Ganglien), Palpation des Abdomens, Nachbeobachtung von Arthritiden und Uveitiden und Gewichtskontrolle.
Die hämatologische und biochemische Nachuntersuchung (Kreatinin, Urea, Transaminasen) wird 3 Wochen nach jeder Impfinjektion durchgeführt.
Ergebnisse der Unschädlichkeitsstudie
Bei den 30 Hunden, darunter 7 Placebotiere, wurde keine allgemeine Störung beobachtet. Lediglich einige kleinere lokale Reaktionen sind zu berichten: geringfügiges Ödem an der Einstichstelle, mildes Erythem und leichter Pruritus. Diese Störungen sind gutartiger Natur und bilden sich innerhalb von 24 bis 48 Stunden spontan zurück. Sie sind für einen auf zellulär vermittelte Reaktion zielenden Impfstoff völlig normal.
Hinsichtlich der hämatologischen und biochemischen Nachbeobachtung ist keinerlei Anomalie festzustellen. Mit intradermaler Injektion bei 5 Hunden und intramuskulärer Injektion bei 5 Hunden wurden gleichartige Ergebnisse erzielt.
Der Impfkomplex stellt somit hinsichtlich seiner Unschädlichkeit kein Problem dar.
Spezifische Aktivierung der T-Lymphozyten Typ Th1
Parallel zur serologischen Nachbeobachtung per klassischer Immunfluoreszenz unter Verwendung von auf Objektträger aufgetragenen Promastigoten (serologische Referenzmethode bei kaniner Leishmaniose), die sich bei allen Hunden als schwach erweist, wird bei den 30 Hunden eine Untersuchung der zellulär vermittelten Antwort durch Lymphoblastenproliferationstest und durch Untersuchung der leishmaniziden Aktivität der Monozyten durchgeführt.
Die 7 Placebos induzieren keine antigenspezifische zelluläre Antwort auf den Impfstoff, dagegen zeigen die 23 geimpften Hunde sehr wohl eine Induktion des Th1-Systems, wobei insbesondere mit dem Kontrollindex (Concanavalin A) vergleichbare impfstoffkomplexspezfische Lymphozytenproliferationsindices auftreten, die von erhöhten Inhibitionsraten des parasitären Index (> 40 % bei einem Mittelwert von 60 % bei 23 geimpften Hunden) begleitet werden.
Der Impfstoffkomplex bewirkt demnach eine von Lymphozyten vermittelte Aktivierung der Monozyten gegen Leishmania, gleichzeitig hat er keine Wirkung auf das Th2-System.
Dosiswirkungsstudie über den Impfstoffkomplex
Diese Untersuchung hat das Ziel, die minimale Impfstoffdosis festzustellen, durch die eine wirksame Th1-Antwort induziert wird.
Zu diesem Zweck wurden 12 erwachsene, 1 bis 6 Jahre alte, aus nicht endemischem Gebiet stammende Beagles in 6 Gruppen à 2 Hunde unterteilt:

1. Gruppe: Placebo
2. Gruppe: Placebo + 200 μg Adjuvans
3. Gruppe: 25 μg exkretierte sekretierte Proteine und 50 μg Adjuvans
4. Gruppe: 50 μg exkretierte sekretierte Proteine und 100 μg Adjuvans
5. Gruppe: 100 μg exkretierte sekretierte Proteine und 200 μg Adjuvans
6. Gruppe: 200 μg exkretierte sekretierte Proteine und 400 μg Adjuvans

Diese Versuche werden gemäß BPL (Bonnes Pratiques de Laboratoire (Gute Laborpraxis)) und BPC (Bonnes Pratiques Cliniques (Gute Klinikpraxis)) durchgeführt.
Der Infektionstest besteht in einer intravenösen Infektion der Hunde mit Promastigoten der metazyklischen Phase und mit von diversen Amastigoten infizierten Monozyten.
Nach der 2. Injektion kann durch Untersuchung des Immunstatus bestätigt werden, dass die Hunde, die den Impfstoffkomplex erhalten haben, eine Th1-Antwort zeigen, wobei der Beginn einer maximalen Antwort in der Plateauphase bei 50 μg injizierten, exkretierten sekretierten Proteinen liegt. Dieses Plateauphänomen zeigt sich auch bei der Bestimmung der Lymphozytenproliferation und der Monozytenaktivität.
Das Diagramm in 5 zeigt die Ergebnisse der Dosis-Wirkungs-Studie: Untersuchung der Lymphoblastenproliferation in Abhängigkeit von der injizierten Impfstoffdosis.
Andererseits wird 2 Monate nach dem Infektionstest eine auf Knochenmarkspunktion basierende Parasitämieuntersuchung mit dem Referenzkulturmedium NNN (Novy and Mac Neal, J.Infect, Dis, 1904, 1.1-30) durchgeführt.
Die 4 Placebotiere und ein Hund, der 50 μg exkretierte sekretierte Proteine erhalten hat, zeigen eine positive Parasitämie.
Die Graphik in 6 zeigt die Ergebnisse der Dosis-Wirkungs-Studie: Untersuchung der Parasitämie 6 Wochen nach dem Infektionstest in Abhängigkeit von der injizierten Impfstoffdosis.
Spezifische, an das Th1-System gebundene Antikörper
Wie schon früher gezeigt, entspricht das Th1-System einer zellulär vermittelten Antwort mit Aktivierung von Makrophagen über die spezifische Zytokine produzierenden Lymphozyten. Darin besteht die Hauptrolle des erfindungsgemäßen Impfstoffkomplexes. Diese Zellantwort wird von einer geringen humoralen Antwort begleitet, die leicht mit Hilfe der klassischen Immunfluoreszenzmethode unter Verwendung eines mit Fluoreszein markierten Anti-IgG2-Konjugats nachgewiesen werden kann.
Nichtsdestoweniger zeigen einige frühere Arbeiten am Menschen (KAWANO.P et al., Parasite Immunol, 1995, 17, 451-458) und am Hund (NIETO C.G et al., Vet Immunol and Immunopathology, 1999, 67, 117-130), dass die IgG-Isotypen Marker für die immunitäre Th1/Th2-Dichotomie sein könnten. Genauer gesagt, zeigt ein an Leishmaniose erkrankter Hund mit aussagekräftigen klinischen Zeichen einen erhöhten Spiegel an Antikörpern hauptsächlich des Isotyps IgG1, während ein Hund ohne klinische Symptomatik spezifische Antikörper des Isotyps IgG2 aufweist. Die Hunde, die den erfindungsgemäßen Impfstoffkomplex erhalten haben, zeigen geringe Konzentrationen an für sekretierte exkretierte Proteine spezifischen IgG2, was der bevorzugten Expansion der T-Lymphozyten Typ 1 entspricht.
Das Diagramm in 7 zeigt die spezifische IgG2-Antwort der geimpften Hunde auf den Gegenstand der Erfindung bildenden Impfstoffkomplex in Abhängigkeit von der injizierten Impfstoffdosis (Methode ELISA auf Näpfchen).
IMMUNTHERAPEUTISCHE ERGEBNISSE
Gemäß Spezialisten wie PINELLI (PINELLI.E et al, Infect Immun, 1994, 62, 229-235) zeigen an Leishmaniose erkrankte, der Aktivierung des Lmphozytensystems Typ Th2 entsprechende Hunde eine erhöhte Antikörperantwort.
Diese erhöhte Antikörperproduktion entspricht der Hyperproteinämie und führt zur Bildung von Immunkomplexen, die eine Schädigung der Niere mit sich bringen (erhöhte Kreatinin- und Ureawerte im Blut).
Bei den Untersuchungen und Tests wurde deshalb versucht, durch intramuskuläre Verabreichung des Impfstoffkomplexes an das vollständige Krankheitsbild der Leishmaniose aufweisende Hunde eine Änderung in Richtung eines Th1-Zustands zu erzielen. Die Nachbeobachtung des Immunstatus und die klinische Beobachtung werden vor und nach der Behandlung durchgeführt.
Beispiel 1: Hund LOYD
Ein männlicher Hund der Rasse Epagneul Breton, LOYD, 6 Jahre alt, Besitzerin Frau C, weist sehr viele Hautläsionen sowie einen allgemeinen Schwächezustand und einen mageren Ernährungszustand auf. Dies alles deutet auf kanine Leishmaniose hin. LOYD lebt nahe Aix-en-Provence mitten im Endemiegebiet und verbringt den Großteil seiner Zeit im Freien. Er ist daher prädisponiert für Phlebotomenstiche.
Es handelt sich um Hautläsionen mehrerer Typen. Pusteln und Papeln an der Vorderseite des Kopfes; Erythem an der Flanke und auf der Innenseite der Ohren: Pruritus, Schuppen und Schorf an den Ellbogen.
Der Veterinär, Dr. DM, diagnostiziert Pemphigus foliaceus, begleitet von Leishmaniose. Diese Diagnose wird bestätigt durch direkte mikroskopische Beobachtung von Leishmanien an einer Hautprobe und eine Serumanalyse, die einen positiven Immunfluoreszenztiter von 1 : 1600 ergibt.
Eine klassische Behandlung mit Antimonsalzen und Kortikoiden bleibt acht Monate lang wirkungslos. Deshalb wurde mit einer Immuntherapie begonnen, bestehend aus 4-maliger intramuskulärer Injektion von 50 μg Impfstoffkomplex (1/2 Dosis). Die Abstände zwischen den Injektionen betrugen je 10 Tage.
Vor jeder Injektion wird durch Untersuchung des Immunstatus bestätigt, dass sich der Hund in einem Immunstatus Typ Th2 mit erhöhtem Antikörpertiter sowie negativen Tests auf Lymphoblastenproliferation und Monozytenaktivierung befindet.
Eine Woche nach der zweiten Injektion hat der Hund LOYD wieder Appetit und zeigt eine gewisse Vitalität. Dr. DM bemerkt eine leichte Besserung des Hautbildes.
Einen Monat nach der letzten Injektion zeigt LOYD wieder ein normales klinisches Erscheinungsbild, vor allem eine Gewichtszunahme von 1 kg und ein 80-prozentiges Verschwinden der Hautläsionen. Die Untersuchung des Immunstatus ergibt eine Abnahme des Anti-Leishmanien-Antikörpertiters, der im Immunfluoreszenztest auf 1 : 400 fällt. Parallel dazu zeigen die Monozyten wieder eine leishmanizide Aktivität (mit einer Inhibitionsrate des Parasitenindex gleich 75 %), und der Lymphoblastenproliferationstest fällt einwandfrei positiv aus.
Ein Parasitentest per Kultur auf NNN-Medium fällt negativ aus. 8 Monate nach der Behandlung zeigt der Hund LOYD gelegentlich Pemphigus foliaceus entsprechende Läsionen an der Vorderseite des Kopfes, die nach Behandlung mit Kortikoiden verschwinden. Die biologischen Analysen ergeben, dass sich LOYD immer noch in einem Immunstatus Th1 befindet.
Beispiel 2: Hund JAZZ
Ein männlicher Hund der Rasse Rottweiler, JAZZ, 5 Jahre alt, Besitzer Herr C, weist die spezifischen klinischen Zeichen der Leishmaniose auf. Laut Dr. GH: Vorliegen zahlreicher glänzender Schuppen, periokulare Depilation rechts, ulzeröse Läsionen an beiden vorderen Ellbogen und ein ausgeprägter Schwächezustand. Die biologischen Untersuchungen, insbesondere eine positive Serologie in Bezug auf Leishmaniose bei einem Immunfluoreszenzergebnis von 1 : 400 bestätigen die klinische Diagnose.
Eine Immuntherapie wird begonnen, bestehend aus 3-maliger intramuskulärer Injektion von 50 μg Impfstoffkomplex (1/2 Dosis). Die Abstände zwischen den Injektionen betragen je 10 Tage. Die Untersuchung des Immunstatus vor jeder Injektion zeigt, dass der Hund JAZZ ein Immunsystem Typ Th2 mit einer vom Knochenmark her stark positiven Parasitämie entwickelt.
Einen Monat nach der letzten Injektion gehen die klinischen Leishmania-Zeichen bei JAZZ zurück, und es zeigt sich vor allem eine Vernarbung der ulzerösen Läsionen, eine erhebliche Verringerung der Schuppen sowie eine fast nicht mehr vorhandene perioculare Depilation. Serologisch liegt im Immunfluoreszenztest immer noch ein Titer von 1 : 400 vor. Dagegen ergibt die Untersuchung der zellulären Antwort, dass sich JAZZ in einem aktiven Th1-Zustand mit positivem Lymphoblastenproliferationstest und leishmanizider Aktivität innerhalb der Makrophagen befindet.
Parallel dazu ist die Parasitämie in einen negativen Zustand übergewechselt (Knochenmarkskultur in NNN-Medium).
Die vorliegende Erfindung besteht daher in einem Impfstoff- und Therapiekomplex, der den Übergang von einem Immunstatus vom Typ Th2 mit erheblicher, die klinischen Manifestationen verstärkender Antikörperproduktion zu einem die Heilung herbeiführenden Immunstatus vom Typ Th1 induziert.
IMPFERGEBNISSE
Um die Wirksamkeit des erfindungsgemäßen Impfstoffkomplexes zu prüfen, wird dieser an 6 völlig gesunden Hunden getestet. Diese 6 Hunde weisen eine negative Serologie in Bezug auf Leishmaniose, eine negative Parasitämie sowie komplett negative Tests auf spezifische zelluläre Antwort auf Leishmania auf.
Diese 6 Hunde leben in einem völlig phlebotomenfreien Gebiet. Wir bilden 3 Hundegruppen, wovon jede ein männliches und ein weibliches Tier enthält.

• Kontrollgruppe (Placebos) – Kontrolle negativ: Hund LEO, Rasse Pointer, Geschlecht männlich. Alter 3 Jahre – Kontrolle nur Adjuvans: Hündin MUMA, Rasse Epagneul Breton, Geschlecht weiblich. Alter: 6 Jahre
• Mit Exkretions-Sekretions-Proteinen von Promastigoten (ESP) geimpfte Gruppe von Hunden – Hündin MINON, Rasse Braque de Weymar, Geschlecht weiblich. Alter: 2 1/2 Jahre. – Hund NOUGAT, Rasse Pointer, Geschlecht männlich. Alter: 2 1/2 Jahre.
• Mit Exkretions-Sekretions-Proteinen von Amastigoten (ESA) geimpfte Gruppe von Hunden – Hund LOUBARD, Rasse Epagneul Breton, Geschlecht männlich. Alter: 4 Jahre – Hündin MINA, Rasse Braque de Weymar, Geschlecht weiblich. Alter: 3 Jahre

Folgendes Impfschema wird angewandt:
Alle zwei Wochen wird eine klinische Nachbeobachtung der 6 Hunde vorgenommen. Die biologischen Analysen werden folgendermaßen schematisiert:
Die biologischen Analysen bestehen aus:

– biochemischen Analysen: Urea, Kreatin, Transaminasen
– hämatologische Analysen: Zählung, Formel
– Serologie zur Leishmaniose: quantitative Anti-Leishmania-Immunfluoreszenz, mittels der Western-Blot-Methode gegenüber den Exkretions-Sekretions-Antigenen und Bestimmung der spezifischen IgG2 nach ELISA-Methode.
– Tests auf zelluläre. Antwort: Tests auf Lymphoblastenproliferation, Untersuchung der Makrophagenaktivierung und Test IDR (intradermale Reaktion), Bestimmung von NO.
– Untersuchung der neutralisierenden Rolle der Anti-ES-Antikörper.

Zusätzlich zu diesen Analysen ist nach dem Infektionstest eine direkte mikroskopische Suche nach Leishmanien und eine Kultur aus Knochenmark auf NNN-Medium vorzunehmen.
Ergebnisse:
Klinische Nachbeobachtung:
Während der gesamten Studie ist keine wesentliche klinische Manifestation aufgetreten. Bei Hund LEO sind 2 Monate nach dem Infektionstest eine leichte Abmagerung und das Auftreten einiger Schuppen festzustellen.
Biologische Nachbeobachtung:

• Während der gesamten Studiendauer blieben die biochemischen und hämatologischen Parameter im Normalbereich.
• Serologie in Bezug auf Leishmaniose und Parasitämie

Vor jeder Injektion weisen die 6 Hunde eine negative Serologie und Parasitämie auf. Die folgende Tabelle zeigt die bei den Versuchen erhaltenen serologischen Reaktionen und den weiteren Verlauf der Parasitämie (Analysen durchgeführt 2 und 8 Monate nach dem Infektionstest).
Legende:

IF: Immunfluoreszenz (als positiv betrachtet, wenn der Titer ≥ 1/100 liegt)
WB: Western Blot
ELISA: Cut-off-Wert = 0,300 in OD (optische Dichte)
Parasitämie: Kultur auf NNN-Medium – = kein Vorkommen ++ = mehr als 5 bewegliche promastigote Formen pro Feld

– Nur die immunisierten Hunde weisen spezifische Antikörper gegen ESA und ESP (Western Blot), spezifische IgG2 (ELISA) sowie eine negative Parasitämie auf. Bei allen Hunden ist ein geringe Antikörperproduktion (1 : 200 gemäß IF) nach dem Infektionstest festzustellen.

Nur bei den Kontrolltieren (LEO und MUMA) zeigen sich eine positive Parasitämie sowie die Abwesenheit spezifischer IgG2-Antikörper gegen ES.

• Zellulär vermittelte Antwort

Vor jeder Injektion zeigen die 6 Hunde eine komplett negative zellvermittelte Antwort auf Leishmania infantum. Gemäß Tabelle II weisen nur die immunisierten Hunde positive Lymphoblastenproliferationstests und leishmanizide Aktivitäten innerhalb der Makrophagen sowie eine NO-Produktion durch Monozyten auf.
Die folgende Tabelle zeigt die erhaltenen Reaktionen zellulärer Art und den inhibitorischen Einfluss der Seren auf die Parasitenproliferation (Analysen durchgeführt 2 Monate nach dem Infektionstest).
Legende:

• IDR: Der Test auf intradermale Reaktion wird als positiv betrachtet (+), wenn die Induration 48 h nach der intradermalen Injektion ≥ 5 mm ist
• Lymphoblastenproliferationstest: Die Ergebnisse werden durch Betrachtung im Photonenmikroskop und als Stimulationsindices ausgedrückt (in Klammern Stimulationsindex des Kontrolltiers + Concanavalin A) + : geringe Proliferation ++ : mittlere Proliferation +++ : starke Proliferation
• Leishmanizide Aktivität der Monozyten: ausgedrückt als Prozentsatz der Hemmung des Parasitenindex
• NO-Dosierung:
• Inhibitorischer Einfluss des Serums: Ergebnisse ausgedrückt als Prozentsatz der Wachstumshemmung ND = Nicht determiniert
• Untersuchung der neutralisierenden Rolle der Anti-ES-Antikörper.

Diese Analyse, die für 1 Hund jeder Gruppe durchgeführt wurde (Tabelle II), bestätigt, dass die mit ES immunisierten Hunde im Gegensatz zu den Kontrolltieren sehr wirksame, die Proliferation sowohl der Promastigoten als auch der Amastigoten hemmende Antikörper aufweisen.
Diesen Analysen zufolge induziert der Impfstoffkomplex eine zellulär vermittelte Immunität vom schützenden Typ Th1. Dem hinzuzufügen ist die Induktion von spezifischen Antikörpern des Isotyps IgG2, die eine signifikative Inhibition der Leishmanienproliferation bewirken.

Claims

Therapeutischer Impfstoffkomplex für die Prävention oder die Behandlung von Leishmaniosen und durch pathogene intrazelluläre Mikroorganismen hervorgerufene Infektionen beim Säuger, insbesondere bei Menschen, Kaniden, Feliden und Equiden, dadurch gekennzeichnet, dass er zusammengesetzt ist aus: – einerseits Exkretions-Sekretions-Molekülen aus Amastigoten und/oder Promastigoten von Leishmania sp., die in axenischem und serumfreiem Medium folgender, vollständig beschriebener Zusammensetzung hergestellt werden: für die Amastigoten (Mengen pro 800 ml)
für die Promastigoten
und andererseits aus Muramyldipeptid.
Therapeutischer Impfstoffkomplex für die Prävention oder die Behandlung von Leishmaniosen und durch pathogene intrazelluläre Mikroorganismen hervorgerufene Infektionen beim Säuger nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Muramyldipeptid den Exkretions-Sekretions-Molekülen aus Promastigoten und/oder Amastigoten von Leishmania sp. in einem Verhältnis Protein-Adjuvans von 1:0,5 bis 1:4 zugegeben wird.
Therapeutischer Impfstoffkomplex für die Prävention oder die Behandlung von Leishmaniosen und durch pathogene intrazelluläre Mikroorganismen hervorgerufene Infektionen bei Kaniden nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Muramyldipeptid den Exkretions-Sekretions-Molekülen aus Promastigoten und/oder Amastigoten von Leishmania sp. in einem Verhältnis von 100 μg Protein pro 200 μg Muramyldipeptid zugegeben wird.
Therapeutischer Impfstoffkomplex für die Prävention oder die Behandlung von Leishmaniosen und durch pathogene intrazelluläre Mikroorganismen hervorgerufene Infektionen beim Säuger nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Exkretions-Sekretions-Moleküle mit Hilfe eines Verfahrens gewonnen werden, bei dem zum Zweck der Separation der Parasiten eine tangentiale Filtration mit einer 0,16-μ-Polyethersulfonmembran und danach mittels tangentialer Filtration mit einem 3 kDa-Filter aus Polyethersulfon eine Konzentration des Filtrats um einen Faktor 100 erfolgt.
Therapeutischer Impfstoffkomplex für die Prävention oder die Behandlung von Leishmaniosen und durch pathogene intrazelluläre Mikroorganismen hervorgerufene Infektionen beim Säuger nach einem der Ansprüche 1 bis 4, mit der Besonderheit, dass beim Säuger eine leishmanizide Wirkung der nach 48-stündiger Inkubation nach der Methode von LEMESRE zur Bestimmung der Inhibition des Parasitenindex messbaren parasiteninduzierten Monozyten herbeigeführt wird.
Therapeutischer Impfstoffkomplex für die Prävention oder die Behandlung von Leishmaniosen und durch pathogene intrazelluläre Mikroorganismen hervorgerufene Infektionen beim Säuger nach einem der Ansprüche 1 bis 5, mit der Besonderheit, dass beim Säuger eine zellulär vermittelte, von T-Lymphozyten, vorzugsweise von T-Lymphozyten vom Typ Th1 abhängige Immunaktivierung herbeigeführt wird.
Therapeutischer Impfstoffkomplex für die Prävention oder die Behandlung von Leishmaniosen und durch pathogene intrazelluläre Mikroorganismen hervorgerufene Infektionen beim Säuger nach einem der Ansprüche 1 bis 6, mit der Besonderheit, dass beim Säuger der Übergang von einem Immunstatus vom Typ Th2 zu einem Immunstatus vom Typ Th1 herbeigeführt wird.
Therapeutischer Impfstoffkomplex für die Prävention oder die Behandlung von Leishmaniosen und durch pathogene intrazelluläre Mikroorganismen hervorgerufene Infektionen beim Säuger nach einem der Ansprüche 1 bis 7, mit der Besonderheit, dass beim Säuger spezifische Antikörper, im besonderen spezifische Antikörper vom Isotyp IgG2 induziert werden.
Therapeutischer Impfstoffkomplex für die Prävention oder die Behandlung von Leishmaniosen und durch pathogene intrazelluläre Mikroorganismen hervorgerufene Infektionen beim Säuger nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Exkretions-Sekretions-Moleküle aus Promastigoten und/oder Amastigoten von Leishmania sp. beim Hund mindestens ein Epitop auf dem Hauptoberflächenprotein aufweisen.
Therapeutischer Impfstoffkomplex für die Prävention oder die Behandlung von Leishmaniosen und durch pathogene intrazelluläre Mikroorganismen hervorgerufene Infektionen beim Säuger nach einem der Ansprüche 1 bis 9, gekennzeichnet dadurch, dass einige Exkretions-Sekretions-Moleküle aus Promastigoten und/oder Amastigoten von Leishmania sp. nicht registrierte Proteinaseaktivitäten (weder Metallo- noch Serin- noch Cysteinproteinase) aufweisen.
Therapeutischer Impfstoffkomplex für die Prävention oder die Behandlung von Leishmaniosen und durch pathogene intrazelluläre Mikroorganismen hervorgerufene Infektionen beim Säuger nach einem der Ansprüche 1 bis 10, der in der Weise aufbereitet ist, dass er auf verschiedenen Wegen verabreicht werden kann: subkutan, interdermal, intramuskulär, intravenös, parenteral und oral.